Analisis-multilocus-de-enterococcus-faecium-aislados-del-queso-de-ocosingo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
Análisis multilocus de Enterococcus faecium aislados del queso de Ocosingo 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA: 
JAZMÍN URRIETA VÁZQUEZ 
 
DIRECTOR DE TESIS 
MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
 
 
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., 2018 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
ii 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: José Pedraza Chaverri 
VOCAL: Profesor: Gloria Díaz Ruiz 
SECRETARIO: Profesor: Maricarmen Quirasco Baruch 
1er. SUPLENTE: Profesor: Martha Giles Gómez 
2° SUPLENTE: Profesor: Aleida Mina Cetina 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
Este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio 312 del Departamento de Alimentos y 
Biotecnología en el edificio E de la Facultad de Química de la Universidad Nacional 
Autónoma de México, bajo la tutoría de la Dra. Maricarmen Quirasco Baruch. 
Se reconoce el apoyo percibido por el proyecto DGAPA PAIIT IN222717: “Estudio y 
aplicaciones de las proteínas y péptidos obtenidas del metagenoma y bacterias de quesos 
tradicionales mexicanos”, junto con el Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado 
(PAIP-FQ) con la clave 5000-9102. 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Maricarmen Quirasco Baruch 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
Myrna Elena Olvera García 
SUSTENTANTE: 
Jazmín Urrieta Vázquez 
 
 
 
 
iii 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A Dios, por cuidarme en cada laboratorio y durante los años que pase en la facultad; por 
darme fuerza y valor para terminar una etapa más de mi vida. 
A mis padres, por ser mi alegría, mi motivación, por estar siempre a mi lado ayudándome 
a superar cada desafío, y alcanzar mis objetivos, por su apoyo, sus consejos, su amor, su 
paciencia, colaboración, ánimo y esfuerzos para que juntos termináramos esta carrera. 
A mi hermano, Ángel, por no permitir que me rindiera frente a la los problemas, por 
escuchar, y enseñarme a que el estudio no es lo único importante. 
A Yazmín, por ser mí amiga de toda la vida, por tu apoyo, enseñanzas y consejos. 
A Alejandro, por tu amistad, comprensión a los largo de la licenciatura, por tu paciencia y 
alegría. 
A Jesús, por tu amistad, concejos y especial apoyo en el término de la carrera. 
A mis amigos y compañeros de la facultad. Gracias por las recomendaciones, ánimos, 
y momentos alegres que hicieron posible sobrellevar tantos años. 
Al Dr. Díaz, por su tiempo, apoyo, consejos, disposición e interés en este trabajo. 
A la Dra. Maricarmen Quirasco Baruch, por permitirme ser parte de su grupo de trabajo, 
por la realización de esta Tesis y por enseñarme que la vida no siempre es fácil. 
A Myrna, por ser mi maestra, por enseñarme a trabajar en el laboratorio, por estar 
siempre dispuesta a ayudarme y contestar mis preguntas por más obvias que fueran. 
A los profesores, José Pedraza Chaverri y Gloria Díaz Ruíz, que formaron parte de mi 
jurado de examen, por su tiempo, recomendaciones y correcciones hechas para mejorar 
la presentación de este trabajo. 
A mis compañeros del laboratorio 312 por hacer que mi estancia fuera agradable, por 
ayudarme siempre y brindar al laboratorio su esencia. 
 
iv 
 
Análisis multilocus de Enterococcus faecium aislados del queso de Ocosingo 
Índice 
Resumen…………………………………………………………………………………..1 
1. Introducción ........................................................................................................ 3 
1.1 Bacterias ácido lácticas ........................................................................................................ 5 
1.2 El género Enterococcus ........................................................................................................ 6 
1.3 El género Enterococcus en alimentos y sus aplicaciones biotecnológicas .................. 8 
1.4 Enfermedades intrahospitalarias ......................................................................................... 9 
1.5 Factores de virulencia ......................................................................................................... 10 
1.6 Resistencia a antibióticos ................................................................................................... 12 
1.7 Tipificación por secuencias multilocus (MLST) ............................................................... 14 
2. Antecedentes ....................................................................................................... 17 
2.1 Queso .................................................................................................................................... 17 
2.2 Quesos mexicanos genuinos ............................................................................................. 17 
2.3 Queso bola ............................................................................................................................ 18 
2.4 Enterococcus en el queso Cotija ....................................................................................... 20 
3. Justificación ........................................................................................................ 22 
4. Hipótesis .............................................................................................................. 22 
5. Objetivos .............................................................................................................. 23 
5.1 General .................................................................................................................................. 23 
5.2 Particulares ........................................................................................................................... 23 
6. Metodología ......................................................................................................... 24 
6.1 Caracterización del microorganismo objeto de estudio ................................................. 25 
6.2 Conservación de la cepa .................................................................................................... 25 
6.3 Caracterización fenotípica .................................................................................................. 25 
6.4 Extracción del ADN ............................................................................................................. 26 
6.5 Amplificación de 7 genes altamente conservados por PCR punto final ...................... 27 
6.6 Análisis de MLST de Enterococcus faecium ................................................................... 29 
v 
 
6.7 Detección de genes de virulencia por PCR punto final ................................................. 29 
6.8 Prueba de resistencia a antibióticos por inhibición......................................................... 31 
7. Resultados ........................................................................................................... 32 
7.1 Caracterización de las cepas de E. faecium ................................................................... 32 
7.2 Análisis MLST ....................................................................................................................... 39 
7.3 Estructura poblacional de E. faecium (Análisis de las ST obtenidas de las cepas 
aisladas del queso bola) ............................................................................................................46 
7.4 Factores de virulencia ......................................................................................................... 55 
7.5 Resistencia a los antibióticos ............................................................................................. 57 
8. Reflexión final ...................................................................................................... 61 
9. Conclusiones ....................................................................................................... 63 
12. Bibliografía ......................................................................................................... 64 
13. Anexo .................................................................................................................. 71 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
vi 
 
Índice de figuras y tablas 
 
Figuras 
 
Figura 1. Distribución epidemiológica de los 3197 aislados que conforman la base 
de datos de E. faecium hasta Octubre del 2017. ..................................................... 5 
Figura 2. Queso bola de Ocosingo, Chiapas. ....................................................... 19 
Figura 3. Diagrama de flujo para la elaboración del queso bola. .......................... 20 
Figura 4. Diagrama general del trabajo. ............................................................... 24 
Figura 5. Crecimiento característico de E. faecium en medio KAA. ..................... 33 
Figura 6. Tinción de Gram de E. faecium. ............................................................ 33 
Figura 7. Crecimiento de las cepas E. faecium bajo tratamiento térmico a 60°C por 
30 minutos. ............................................................................................................ 36 
Figura 8. Evaluación de la capacidad de hidrolisis de sales biliares. ................... 38 
Figura 9. Gel de agarosa al 1% (p/v) obtenido del ADN extraído para las cepas de 
E. faecium. ............................................................................................................ 38 
Figura 10a Gel de agarosa de PCR punto final obtenido para los genes: adk, 
purK, ddl, gyd y gdh de la cepa 3 de E. faecium. .................................................. 40 
Figura 11. Geles de agarosa de PCR punto final obtenidos para los genes: purk, 
ddl y gdh de las cinco cepas de E. faecium. ......................................................... 41 
Figura 12. Alineamiento de las secuencia para el gen gdh de la cepa 9 con su 
referencia (tomada de la base de datos). .............................................................. 45 
Figura 13. Alineamiento entre el alelo gdh perteneciente a la cepa 9, con el alelo 
existente designado por la base de datos como gdh 12. ...................................... 46 
Figura 14. Dendograma de la estructura poblacional de E. faecium; ubicadas las 
STs del queso bola y del queso Cotija. ................................................................. 47 
Figura 15. Fuentes de los aislamientos reportados por la base de datos que 
integran las STs que comparten 4 de los 7 alelos con la ST130 (Frecuencias-
Porcentaje). ........................................................................................................... 50 
Figura 16. Captura de pantalla de las variantes alélicas presentes para cada gen 
dentro de los aislados de alimentos de E. faecium el 1/11/2017. .......................... 53 
Figura 17. Productos de la reacción de PCR para los factores de virulencia 
evaluados: cylA, esp y asa1. ................................................................................. 56 
Figura 18. Prueba de resistencia a antibióticos por difusión en disco de las cepas 
9, 6 y 3 de E. faecium. ........................................................................................... 60 
 
 
vii 
 
 
Tablas 
 
Tabla 1. Lista de cebadores para los genes a evaluar por MLST. ........................ 28 
Tabla 2. Lista de cebadores para cada factor de patogenicidad. .......................... 30 
Tabla 3. Resultados de la tinción de Gram y prueba de catalasa de las cepas de 
E. faecium. ............................................................................................................ 34 
Tabla 4. Evaluación del crecimiento de las cepas de E. faecium bajo condiciones 
extremas de temperatura, pH y osmolaridad......................................................... 35 
Tabla 5. Concentración de ADN de las cepas aisladas de E. faecium. ................ 39 
Tabla 6. Concentración de los amplicones obtenidos, para los siete genes 
empleados en el MLST, de las cepas de E. faecium aisladas del queso bola. ..... 42 
Tabla 7. Alelos descritos por la base de datos del MLST con fecha de última 
actualización Octubre del 2017. ............................................................................ 43 
Tabla 8. Perfiles alélicos de las cepas de E. faecium asiladas del queso bola de 
Ocosingo. .............................................................................................................. 43 
Tabla 9. Secuencias tipo asignada a cada una de las cepas de E. faecium. ........ 44 
Tabla 10. Secuencias tipo relacionadas con el CC5. ............................................ 49 
Tabla 11. Secuencias tipo obtenidas de las cepas de E. faecium aisladas del 
queso Cotija y queso bola. .................................................................................... 52 
Tabla 12. Secuencias tipo y perfil alélico que conforman el CC17. ...................... 53 
Tabla 13. Frecuencia de los alelos presentes en las secuencias tipo de ambos 
quesos en relación con los aislados de alimentos que integran la base de datos. 54 
Tabla 14. Presencia de los genes (cylA, esp y asa1) que codifican para factores 
de virulencia en las cepas de E. faecium del queso Cotija y el queso bola. .......... 57 
Tabla 15. Antibióticos evaluados en las cepas de E. faecium aisladas del queso 
bola y queso Cotija. ............................................................................................... 59 
 
1 
 
Resumen 
Las bacterias del género Enterococcus son microrganismos que se encuentran 
ampliamente distribuidos en la naturaleza, y tienen como hábitat predominante el 
tracto gastrointestinal de seres humanos, animales e insectos; una vez liberados al 
medio ambiente a través de sus heces, son capaces de colonizar diversos nichos 
debido a su extraordinaria aptitud para resistir o crecer en ambientes hostiles 
extraentéricos, como condiciones extremas de pH, temperatura y osmolaridad. 
Además, se suelen encontrar en agua, en el suelo, en las plantas y vegetales, así 
como en alimentos de origen animal específicamente en alimentos fermentados, 
tales como embutidos y quesos (Giraffa, 2003). 
Dentro del grupo de bacterias ácido lácticas (BAL), el género Enterococcus es el 
más controvertido, y contrario a las BAL más estudiadas no son reconocidos 
generalmente como seguros (GRAS) (Eaton y Gasson, 2001). Debido a su 
carácter dual, se pueden considerar de uso positivo en la elaboración de quesos; y 
por otra parte, patógenos para los seres humanos debido a su reciente 
surgimiento como causante de infecciones nosocomiales. 
El objetivo del presente trabajo fue llevar a cabo una caracterización fenotípica y 
genotípica de cepas de Enterococcus faecium aisladas del queso bola proveniente 
de Ocosingo, municipio de Chiapas, México, por medio de un método de 
tipificación molecular, a fin de diferenciar cepas dentro de una misma especie 
debido al carácter dual que presentan. Se evaluaron cinco cepas de E. faecium, 
las cuales demostraron poseer las características de cultivo propias de la especie: 
ser poco tolerantes a pH ácidos, tolerantes a temperaturas de pasteurización 
(60°C por 30 minutos), capaces de crecer en presencia de sales biliares con baja 
capacidad de hidrólisis. 
Por medio del análisis de tipificación porsecuencias multilocus (MLST por sus 
siglas en inglés), se determinó la presencia de nuevos alelos: para los genes gyd 
(53) y pstS (123 y 124) los cuales generaron tres nuevas secuencias tipo (STs): 
ST1293, ST1294 y ST1295. Asimismo, se obtuvo una ST previamente descrita en 
2 
 
la base de datos, la ST130; todas ellas no pertenecientes al complejo clonal de 
alto riesgo 17 (CC17). Del mismo modo, se evaluó su capacidad de resistencia a 
antibióticos, algunas cepas presentaron resistencia a eritromicina, penicilina, 
tetraciclina y vancomicina; antibióticos a los cuales se les considera como de 
resistencia adquirida. En cuanto a la presencia de genes que codifican para 
factores de virulencia evaluados: esp, asa1 y cylA fueron negativos. 
En conclusión, se encontró relación alélica entre las STs del queso bola con las 
presentes en la base de datos asociadas a alimentos, así como con las del queso 
Cotija evaluado por Guzmán en 2015. Los perfiles alélicos de las cepas de origen 
alimentario por su tipificación genotípica, las hacen diferentes al CC17, atribuido a 
cepas causantes de infecciones en pacientes hospitalizados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1. Introducción 
 
El género Enterococcus pertenece al grupo de las bacterias ácido lácticas (BAL); 
éste incluye cerca de 50 especies, entre las que Enterococus faecalis, 
Enterococcus faecium y Enterococcus durans son las especies más 
frecuentemente encontradas en alimentos y hábitats relacionados (Giraffa, 2003; 
Bonacina et al., 2016). Son microorganismos que forman parte importante de la 
microbiota ambiental, alimentaria y clínica. De acuerdo con la cepa, se consideran 
como iniciadores o adjuntos, probióticos, causantes de deterioro u organismos 
patógenos (Bhardwaj et al., 2008). Los enterococos desempeñan un importante 
papel benéfico en el desarrollo de características organolépticas propias de 
diversos productos fermentados tradicionales europeos, como quesos artesanales 
y productos cárnicos. Además, son productores de un grupo de péptidos 
antimicrobianos sintetizados ribosomalmente (bacteriocinas), conocidas como 
enterocinas, las cuales pueden inhibir el crecimiento de bacterias patógenas lo 
que les otorga un efecto como agentes bioconservadores de alimentos. Este 
género posee capacidades promotoras de la salud, al estimular el sistema 
inmunitario, ayudar a la digestión y mantener la microbiota intestinal balanceada. A 
ello se debe su uso como probiótico (Franz et al., 2007; Bonacina et al., 2016). 
Sin embargo, durante las dos últimas décadas, los enterococos que anteriormente 
eran considerados como organismos de impacto clínico mínimo, han surgido como 
importantes patógenos nosocomiales (Giraffa, 2002). El creciente interés en la 
epidemiología de estas bacterias se debe a la presencia y expresión de factores 
de virulencia, así como de la resistencia a los antibióticos de algunas cepas 
capaces de colonizar y / o causar enfermedades en pacientes hospitalizados en 
todo el mundo (Gomes et al., 2008). Los enterococos no sólo son intrínsecamente 
resistentes a varios antibióticos, sino que también se caracterizan por su 
capacidad única y potente de transferir material genético (Giraffa, 2002). El 
surgimiento de cepas de enterococos resistentes a glicopéptidos y otros 
antibióticos, así como el hallazgo de características de virulencia tanto en los 
4 
 
aislados clínicos como en cepas aisladas de alimentos, hacen cuestionable la 
presencia de este género en los alimentos (Foulquié-Moreno et al., 2006). 
Existe una base de datos internacional de linajes genéticos de E. faecium, la cual 
es un poderoso recurso para el estudio epidemiológico a nivel mundial, para el 
reconocimiento y seguimiento de la propagación interhospitalaria de cepas 
virulentas, clonas multirresistentes así como de las epidemias. La técnica 
empleada para conformar la base de datos es la tipificación por secuencias 
multilocus (MLST por sus siglas en inglés), la cual se basa en la identificación de 
alelos de secuencias de ADN pertenecientes a fragmentos internos de genes 
altamente conservados (Homan et al., 2002). En el caso de E. faecium, la mayoría 
de los aislados recuperados del medio hospitalario se agruparon dentro de un 
linaje designado como complejo clonal 17 (CC17), el cual está conformado por 
tres linajes procedentes de secuencias tipo (ST) 17, 18, y 78; éstos han adquirido 
progresivamente diferentes resistencias a los antibióticos como: ampicilina y 
vancomicina, además de factores de virulencia (Homan et al., 2002; Willems et al., 
2012). 
 
Cabe mencionar, que más de la mitad de los aislados que conforman la base de 
datos del MLST de E. faecium se han identificado a partir de muestras con un 
origen epidemiológico no clínico, como: de seres humanos sanos, cerdos, aves y 
animales domésticos (Figura 1) (Willems et al., 2009; Freitas et al., 2010). 
5 
 
 
Figura 1. Distribución epidemiológica de los 3197 aislados que conforman la base de datos de E. 
faecium hasta Octubre del 2017. 
Fuente: https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_efaecium_isolates. 
1.1 Bacterias ácido lácticas 
Las bacterias ácido lácticas (BAL) son bacilos y cocos Gram-positivos, 
principalmente quimioorganótrofas, no formadoras de endoesporas, catalasa 
negativas y productoras de ácido láctico como único o principal producto de 
fermentación. Los miembros de este grupo carecen de transportadores de 
electrones, por lo que no llevan a cabo fosforilación oxidativa, y por lo tanto 
obtienen su energía exclusivamente mediante fosforilación a nivel de sustrato. Se 
denominan anaerobias aerotolerantes debido a que todas crecen 
anaeróbicamente y la mayoría no son sensibles al O2 por lo que pueden crecer en 
su presencia. Los diversos géneros de BAL se definen con base en su morfología 
celular, filogenia y tipo de metabolismo fermentativo (Madigan et al., 2009). El 
grupo está compuesto por: Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, 
Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactobacillus, Lactococcus, 
Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, 
Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella (Salmínen et al., 1998). 
Una importante diferencia entre los subgrupos de BAL es el patrón de productos 
que genera como consecuencia de la fermentación de azúcares. Uno de estos 
6 
 
subgrupos, el denominado homofermentativo, produce ácido láctico como único 
producto de fermentación. El otro, denominado heterofermentativo, produce otros 
compuestos, fundamentalmente etanol y CO2, así como lactato (Madigan et al., 
2009). 
1.2 El género Enterococcus 
En 1930, Rebecca Lancefield ubicó a los enterococcos como Streptococcus del 
grupo D, y en 1984 Schleifer y Kilpper-Bälz demostraron mediante estudios de 
hibridación DNA-DNA, DNA-RNA y secuenciación del rRNA16S, que 
Streptococcus faecalis y Streptococcus faecium manifestaban características 
diferentes a otros miembros del género Streptococcus, y que por lo tanto tendrían 
que formar parte de otro género, al que finalmente denominaron Enterococcus 
(Garza-Velasco, 2015). 
El género Enterococcus es el grupo más controvertido dentro de las BAL. Son 
bacterias esféricas Gram-positivas, de entre 0.6 a 2.0 µm, con una temperatura 
óptima de crecimiento de 35°C; son cocos catalasa-negativa, no formadoras de 
esporas, oxidasa negativos, anaerobios facultativos, homofermentativos que se 
reproducen individualmente, en parejas o en cadenas. Los enterococos se 
consideran comensales del tracto gastrointestinal y se les aísla a partir de 
ambientes adversos, debido a su diseminación a través del excremento de 
humanos y animales. Algunos factores intrínsecos permiten su supervivencia 
durante períodos prolongados, E. faecalis y E. faecium son capaces de crecer en 
medios que contienen hasta un 6.5% de NaCl, a temperaturas entre 10 y 45°C y 
soportar su exposición a 60°C hasta por 30 minutos.Adicionalmente, se 
desarrollan en medios con sales biliares al 4%, en amplios intervalos de pH, entre 
4-9, y se adaptan con relativa facilidad a niveles comúnmente letales de 
detergentes, lo que les permite desarrollarse en sitios insólitos, inclusive los 
nosocomios (Garza-Velasco, 2015). La mayoría de las especies de enterococos 
puede hidrolizar la esculina en presencia de sales biliares al 40% (Franz et al., 
2003; Foulquié-Moreno et al., 2006). La pared celular de la mayoría de las 
especies contiene un ácido glicerol teicoico, conocido como antígeno D. Sin 
7 
 
embargo, no todas las especies de Enterococcus poseen el antígeno del grupo D 
(Garza-Velasco, 2015; Franz et al., 1999). 
Dentro de las diferentes especies de Enterococos presentes en los productos 
lácteos, E. faecalis y E. faecium son las especies de mayor importancia (Giraffa, 
2002; Giraffa, 2003). Éstas pueden establecerse y sobrevivir en ambientes de 
procesado de alimentos durante largos periodos. 
 
El recuento de enterococos tiene pocas aplicaciones a la hora de establecer 
criterios microbiológicos para garantizar la seguridad sanitaria de los alimentos, 
pero puede aplicar en casos específicos como indicador de eficiencia germicida, 
aplicable para conocer la calidad higiénica de productos tratados de manera 
moderada con calor, congelación y salazón; indicador de contaminación fecal. En 
playas, es de 200 enterococos en 100 mililitros de agua, criterios de calidad 
establecidos como rangos de protección a la población usuaria; indicador de 
manejo higiénico para identificar prácticas deficientes de fabricación. La presencia 
de gran número de enterococos en los alimentos, excepto en los fermentados por 
cepas específicas de estos microorganismos, implica prácticas sanitarias 
inadecuadas o bien exposición del producto a condiciones que pudieran permitir la 
multiplicación masiva de bacterias no deseables (Doyle et al., 2001; Hernández, 
2016). 
En general, actualmente se considera que no existe un criterio fenotípico definido 
para diferenciar de manera confiable el género Enterococcus y el de otros 
microrganismos Gram positivos. Por razones prácticas, la identificación presuntiva 
del género Enterococcus suele fundamentarse en la suma de los siguientes 
resultados (Garza-Velasco, 2015): 
a) Cocos Gram positivos. 
b) Catalasa negativa. 
c) Capacidad para desarrollarse en un medio con un 6.5% de NaCl. 
d) Capacidad de crecimiento en un medio con azida de sodio al 0.04%. 
e) Capacidad de hidrólisis de esculina. 
8 
 
1.3 El género Enterococcus en alimentos y sus aplicaciones 
biotecnológicas 
 
Los Enterococos poseen aplicaciones importantes en la industria láctea, están 
presentes en una gran variedad de quesos como cultivos no iniciadores, 
especialmente en quesos artesanales producidos en el sur de Europa y 
elaborados con leche bronca o pasteurizada. Participan en el desarrollo de 
características sensoriales durante su maduración, así mismo se han usado como 
cultivos adjuntos. 
La influencia positiva de los enterococos en los quesos se debe a aspectos 
bioquímicos específicos como la actividad lipolítica, proteolítica y utilización del 
citrato, los cuales dan origen a la generación de compuestos aromáticos volátiles. 
Además, en algunos enterococos de origen lácteo se ha descrito la producción de 
bacteriocinas (enterocinas) promotoras de la inhibición de patógenos y control del 
deterioro de alimentos, como son: Listeria monocytogenes, Staphylococcus 
aureus, Vibrio cholerae, Clostridium spp. y Bacillus spp. (Giraffa, 2003). 
La presencia de enterococos en productos lácteos se ha considerado por largo 
tiempo como el resultado de las condiciones antihigiénicas durante su 
procesamiento; sin embargo, en general no están relacionadas de manera directa 
con la contaminación fecal (Giraffa, 2003). Su presencia se puede explicar, debido 
a su amplia capacidad de crecimiento y tolerancia en condiciones adversas, su 
incorporación al alimento a través del agua, equipos y tanques de almacenamiento 
(Foulquié-Moreno et al., 2006). 
Algunas cepas de E. faecium con aplicaciones de uso probiótico, incluyen a E. 
faecium SF 68, la cual parece ser clínicamente eficaz en el diagnóstico y la 
prevención de diarrea asociada al uso de antibióticos y en el tratamiento de la 
diarrea en niños, acortando la duración del cuadro agudo en adultos. Por otro lado, 
la cepa E. faecium CRL 183 en combinación con Lb. helveticus subsp. Jugurti se 
aplicó en el desarrollo de un nuevo producto fermentado a base de soya con 
algunas propiedades potenciales, una de ellas la disminución del 43% en la 
9 
 
síntesis del colesterol en estudios in vitro. Además, estudios de la cepa probiótica 
de E. faecium PR88 en ensayos clínicos humanos, condujo al alivio de los 
síntomas del síndrome del intestino irritable. Esta misma cepa fue usada en la 
elaboración de queso Cheddar como cultivo adjunto, y al ser comparada con el 
control, se observó una mayor proteólisis y niveles de compuestos volátiles 
durante todo el proceso de maduración a 8°C, así como una viabilidad del queso 
por 9-15 meses (Folquie-Moreno et al., 2006; Giraffa, 2003). 
Sin embargo, la selección de cepas de enterococos para formar parte en la 
elaboración de alimentos es una tarea difícil. Si bien algunas cepas están bien 
caracterizadas, la aparición y el aumento de enterococos asociados a 
enfermedades humanas y sus múltiples resistencias a los antibióticos plantean 
gran preocupación con respecto a su uso como probióticos (Foulquié-Moreno et 
al., 2006). 
1.4 Enfermedades intrahospitalarias 
 
Los datos epidemiológicos revelan que la gran mayoría de las infecciones 
hospitalarias asociadas a enterococos fueron causadas por E. faecalis, pero desde 
comienzos de los años noventa la presencia de E. faecium en infecciones 
nosocomiales alcanzó casi su paridad. Dichas cepas muestran con mayor 
frecuencia multirresistencia y resistencia adquirida a antibióticos que incluyen la 
ampicilina y vancomicina (Willems et al., 2012). Han surgido como importantes 
patógenos de adquisición intrahospitalaria, especialmente en pacientes 
inmunocomprometidos y en unidades de cuidados intensivos. En numerosos 
estudios epidemiológicos se ha demostrado que los enterococos pueden 
trasmitirse de persona a persona, frecuentemente a través de las manos de 
trabajadores sanos del hospital o del instrumental clínico. Se les ha asociado con 
infecciones nosocomiales, tales como bacteremia, endocarditis, infecciones 
intraabdominales, de vías urinarias y del sistema nervioso central. (Giraffa, 2002; 
Cercenado, 2011; Garza-Velasco, 2015; Kim et al., 2016). 
10 
 
La Organización Mundial de la Salud (OMS), en colaboración con la División de 
Enfermedades Infecciosas de la Universidad de Tübingen, Alemania, clasifica a E. 
faecium como un microorganismo de prioridad elevada, dentro del listado 
elaborado de las bacterias para las que se necesitan urgentemente nuevos 
antibióticos, esto es debido a su resistencia creciente a los antimicrobianos; 
clasificación basada en una técnica de análisis de decisiones de múltiples criterios. 
Los criterios tomados para esta asignación fueron: el grado de letalidad provocado 
por la infección; el requerimiento o no de hospitalización larga, debida al 
tratamiento; la frecuencia con que se presenta resistencia a los antibióticos 
existentes; la facilidad con la que se transmiten entre animales, de animales a 
personas y entre personas; si las infecciones provocadas pueden o no prevenirse 
(por ejemplo, mediante una buena higiene y vacunación); cuántas opciones 
terapéuticas quedan; y si se están investigando y desarrollando nuevos 
antibióticos para tratar las infecciones que causan (OMS(a)). 
Cabe mencionar, que para que las cepas de enterococos sean consideradas 
seguras y de uso probiótico, deben presentar ausencia de factores de virulenciay 
no ser capaces de adquirirlos (Bhardwaj et al., 2008). 
1.5 Factores de virulencia 
 
Un factor de virulencia es una molécula que le permite a un microorganismo 
patógeno causar una enfermedad al hospedero a través de la toxicidad e 
invasividad (Madigan et al., 2009). Los factores de virulencia están presentes en 
aislados clínicos; sin embargo, estudios realizados en aislados de alimentos 
revelan que algunos los albergan (Bhardwaj et al., 2008). 
Dentro de los factores de virulencia descritos para los enterococos se encuentran: 
la sustancia de agregación (SA), gelatinasa, citolisina / hemolisina, proteína 
superficial enterocócica (Esp) y recientemente la hialuronidasa las primeras cuatro 
son encontradas principalmente en E. faecalis, mientras que las dos últimas son 
específicas de E. faecium (Vankerckhoven et al., 2004). Los rasgos de virulencia 
en los enterococos incluyen la adherencia al tejido del huésped, invasión y 
11 
 
formación de abscesos, resistencia y modulación de los mecanismos de defensa 
del huésped y producción de enfermedad (Giraffa, 2002). La presencia de 
enterococos en una infección está asociada a la terapia antimicrobiana; ya que 
ésta favorece la selección de clonas resistentes (Garza-Velasco, 2015). 
La SA codificada por el gen asa1, se aloja en el plásmido (pAD1), es una proteína 
que permite la transferencia de plásmidos, facilita la adhesión y supervivencia en 
las células humanas (Vankerckhoven et al., 2004; Garza-Velasco, 2015). 
Su participación en la conjugación de plásmidos inicia cuando las bacterias que 
fungen como receptoras potenciales liberan al medio ciertos péptidos, 
denominados feromonas, que promueven la movilización de diversos plásmidos, 
desde los enterococos donadores hacia ellas. Las células enterocócicas que ya 
poseen un determinado plásmido, detienen la elaboración de la feromona 
específica homóloga, pero continúan secretando otras que inducen su 
apareamiento con las clonas que cuentan con moléculas plasmídicas de las que 
aquéllas carecen. Entre los plásmidos inducibles por las feromonas, destaca el 
pAD1 uno de los principales generadores de SA y el pCF10 que confiere, además, 
resistencia a tetraciclina (Garza-Velasco, 2015). 
La citolisina es la única enterocina de tipo lantibiótico; es una bacteriocina de dos 
péptidos y ambas subunidades estructurales contienen residuos de lantionina. La 
citolisina actúa frente a células eucariontes (eritrocitos) y bacterias Gram positivas. 
Los genes que la codifican están albergados en plásmidos e integrados al 
cromosoma bacteriano. Constituidos por dos componentes: cyl (L) y el activador 
(A). El operón de citolisina lo integran cinco genes: cyl (L1), cyl (L2), cyl (M) y cyl 
(B) necesarios para la expresión del componente (L); por otro lado, cyl A es 
necesario para la expresión del componente (A). Este último desempeña 
funciones patogénicas relevantes, provocando la ruptura de las membranas 
pertenecientes a glóbulos rojos y otras células de mamíferos, e inclusive de otras 
bacterias, fungiendo como bacteriocinas (Vankerckhoven et al., 2004; Garza-
Velasco, 2015). El fenotipo hemolítico se asocia más frecuentemente con 
12 
 
enterococos de aislados clínicos que ambientales, considerando a la hemolisina 
como contribuyente de la virulencia bacteriana (Franz et al., 2007). 
La proteína de superficie enterocócica (Esp), es una proteína asociada a la pared 
celular; factor de virulencia presente tanto en E. faecalis como en E. faecium. 
Favorece la adhesión a células epiteliales, la formación de biopelículas y la 
evasión de la respuesta inmune. Es codificada por un gen localizado en una isla 
de patogenicidad, la cual puede albergar múltiples factores de virulencia (Torres et 
al., 2009; Quiñones et al., 2009). 
Se ha observado relación entre la presencia del gen esp y una variación en el gen 
de mantenimiento purK (subunidad deshidrogenasa); variación empleada por el 
MLST para tipificar E. faecium vancomicina resistentes (Willems et al., 2001). Este 
alelo puede ser usado como marcador epidemiológico en el control de infecciones 
(Camargo et al; 2006). 
En las diferentes fuentes de aislamiento: muestras clínicas, animales de granja y 
alimentos, los enterococos de origen clínico revelaron mayor presencia en cuanto 
a factores de virulencia que los de alimentos, de acuerdo con los estudios 
realizados por Sharifi et al. (2012). 
1.6 Resistencia a antibióticos 
 
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por microorganismos que 
matan o inhiben el crecimiento de otros microorganismos. La resistencia a los 
antibióticos se produce cuando las bacterias mutan, ya sea debido a una mutación 
en la secuencia de bases del genoma o mediante mecanismos de intercambio de 
material genético a través de plásmidos y transposones. Esta resistencia dificulta 
el tratamiento de las infecciones causadas, incrementando los costos médicos, la 
estancia hospitalaria y el aumento de la mortalidad (Madigan et al., 2009; OMS(b)). 
El aumento de las infecciones enterocócicas adquiridas en los hospitales se puede 
deber al incremento del uso de antibióticos de amplio espectro y al uso 
indiscriminado de antibióticos como promotores del crecimiento en animales 
13 
 
utilizados para la alimentación. Éstos parecen haber creado grandes depósitos de 
resistencia a antibióticos transferible a diversos ecosistemas fuera de los 
hospitales (Giraffa, 2002). 
Los Enterococcus presentan dos tipos de resistencia a los antibióticos tanto la 
resistencia natural (intrínseca) como la resistencia adquirida (extrínseca). Los 
antibióticos a los que poseen resistencia intrínseca son: cefalosporinas, β-
lactámicos, sulfonamidas, aminoglucósidos y bajos niveles de clindamicina; 
mientras que los ejemplos de resistencia adquirida incluyen: resistencia al 
cloranfenicol, eritromicina, altos niveles de β-lactamamicos, fluoroquinolonas, 
tetraciclinas y glicopéptidos tales como la vancomicina (Bhardwaj et al., 2008). 
Dentro de estas resistencias adquiridas a antibióticos, los enterococos resistentes 
a vancomicina son posiblemente la preocupación más grande que ha surgido 
dentro en las infecciones clínicas, como causantes de infecciones nosocomiales 
en todo el mundo, con incidencia variable según el área geográfica y las 
instituciones hospitalarias; ya que ésta es considerada como uno de los 
antibióticos de último recurso cuando la mayoría de los otros antibióticos fallan en 
el tratamiento de las infecciones causadas por bacterias Gram positivas; y que por 
motivos de estrategia sólo debía recurrirse para combatir casos especiales de 
resistencia (Giraffa 2002; Khan et al., 2005). 
Actualmente, en el género Enterococcus, se conocen cinco genes que regulan la 
resistencia adquirida a vancomicina: vanA, vanB, vanD, vanE y vanG. Los 
enterococos con genotipo vanA son generalmente resistentes a vancomicina y 
teicoplanina mientras que los genotipos vanB, vanD, vanE y vanG suelen 
asociarse a grados moderados de resistencia a vancomicina y sensibilidad a 
teicoplanina, siendo los fenotipos VanA y Van B los de mayor importancia clínica 
(Giraffa, 2002; Bhardwaj et al., 2008; Sharifi et al., 2012). 
No obstante, la presencia de resistencia a los antibióticos no es un suceso 
exclusivo de los ambientes clínicos, sino que también son fácilmente detectables 
en cepas de enterococos aislados de alimentos. Estudios epidemiológicos han 
14 
 
permitido establecer una fuerte relación entre el uso de antibióticos en las crías de 
animales y el brote de cepas resistentes en los alimentos derivado de los mismos, 
y posteriormente en el tracto gastrointestinal de humanos (Castro et al., 2004). 
Por lo tanto, el control de la presencia de enterococos en los alimentos es 
importante, constituyendo un reto especial debido a su naturaleza, amplia 
distribución y estabilidad en el entorno extra entérico (Franz et al.,1999). 
1.7 Tipificación por secuencias multilocus (MLST) 
 
El conocimiento alcanzado respecto a la epidemiología de los patógenos 
nosocomiales, revela que son unos pocos grupos clonales los responsables de la 
mayoría de los brotes en varios países. Por lo que, el control de las infecciones 
nosocomiales han dejado de ser una cuestión a resolver por un programa local, 
surgiendo la necesidad de tener en cuenta la colaboración entre laboratorios; se 
creó así el desarrollo de sistemas informáticos que permiten el monitoreo de 
patógenos con alta capacidad de diseminación y multirresistencia. Al ser de gran 
importancia, se requiere de una correcta identificación bacteriana a nivel de 
especie (López-Cerero et al., 2013). 
Los métodos más útiles incluyen el análisis del ADN cromosomal (con enzimas de 
restricción) y la técnica de PFGE (Electroforesis en gel de campo pulsado), así 
como la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y RAPD-PCR (DNA 
polimórfico modificado al azar). Por su efectividad, las dos últimas técnicas se 
consideran las más adecuadas para el análisis de los brotes asociados a 
Enterococcus vancomicina resistentes; sin embargo, dentro de sus limitaciones 
están: el costo elevado del equipo, lo laborioso del estudio y el tiempo necesario 
de análisis, además de que no son adecuados para determinar el grado de 
relación epidemiológica. 
El MLST, representa la técnica más adecuada para el estudio de especies a nivel 
cepa y el análisis de evolución genética. Esta técnica analiza la variabilidad alélica 
en secuencias conservadas, con la ventaja de asociar cada alelo a un código 
15 
 
numérico que es perfectamente exportable y almacenable. Además, se pueden 
generar algoritmos matemáticos (eBURST) que establezcan las relaciones entre 
las clonas. Actualmente se encuentran disponibles en línea 27 perfiles MLST de 
especies de bacterias, como: Bacillus cereus, Campylobacter jejuni y Helicobacter 
pylori, por mencionar algunas (López-Cerero et al., 2013; Garza-Velasco, 2015). 
El MLST es un método de caracterización de distintas cepas dentro de una misma 
especie; implica la secuenciación de varios genes de mantenimiento básico celular 
de un organismo determinado y compara sus secuencias con los genes 
equivalentes de otra cepa del mismo organismo. Los genes de mantenimiento 
básico codifican funciones esenciales de las células y se localizan frecuentemente 
en el cromosoma y no en los plásmidos. De cada gen se amplifican por PCR entre 
500 a 600 pb aproximadamente, a las que posteriormente se les realizará la 
secuenciación. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se comparan y observan 
las diferencias, cada diferencia, o variante de secuencia, es considerada como un 
nuevo alelo del gen y se le asigna un número. Por tanto, a cada cepa se le asigna 
una serie de números que constituyen su perfil alélico; en otras palabras, su 
tipificación de secuencia multilocus. En la técnica del MLST dos cepas con 
secuencias idénticas en un determinado gen tendrán asignado el mismo número 
alélico para dicho gen, y dos cepas con secuencias idénticas en todos sus genes 
tendrán el mismo perfil alélico y, por tanto, se considerarán idénticas según este 
método. El grado de relación entre los distintos perfiles alélicos se representa en 
forma de un dendograma, gráfico representativo de este tipo de análisis (Madigan 
et al., 2009). 
En microbiología clínica, la técnica del MLST ha permitido diferenciar entre cepas 
de un mismo patógeno. Esto es algo muy importante porque ciertas cepas de una 
misma especie pueden ser inofensivas, mientras que otras pueden ser patógenas 
e incluso mortales. El MLST también es muy importante para estudios 
epidemiológicos, para rastrear una cepa virulenta de un determinado patógeno 
conforme se extiende por una población, y para estudios medio ambientales; 
definir la distribución geográfica de las distintas cepas. Sin embargo, el MLST no 
16 
 
es útil para comparar organismos más allá del nivel de especie; su nivel de 
resolución es excesivo para proporcionar información significativa respecto a 
grupos de mayor nivel, es decir, género o familia. (Madigan et al., 2009). 
Los análisis mediante MLST también han revelado algunos patrones interesantes 
en bacterias, donde se muestran muy pocas variaciones en el análisis y en otros 
organismos una gran variabilidad, lo cual implica que han experimentado un flujo 
mayor de trasferencia horizontal de genes, o bien que sus genes acumulan 
mutaciones a un ritmo mayor (Madigan et al., 2009). 
El estudio de la estructura poblacional de E. faecium ha revelado la asociación del 
complejo clonal 17 (CC17), con distintos huéspedes y nichos ecológicos; siendo la 
mayoría provenientes de aislados clínicos resistentes a antibióticos. Se propuso 
que estos linajes genéticos se originaron por la presión selectiva de los hospitales 
y se han ido seleccionando de otras poblaciones (Torres et al., 2009; Burgos et al., 
20014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
2. Antecedentes 
2.1 Queso 
 
El queso es un alimento universal que se produce a partir de leche de diversas 
especies de mamíferos. Es una forma de conservación de los dos componentes 
insolubles de la leche: la caseína y la materia grasa (Alais, 1985). El queso es el 
resultado de la concentración selectiva de la leche por coagulación de las 
caseínas. Estas atrapan a la mayor parte de la grasa y una pequeña porción del 
azúcar de la leche (lactosa), el agua y de las proteínas del suero (albúminas y 
globulinas); la mayor parte del agua y de las sustancias solubles en la misma se 
eliminan con el suero durante la manipulación que se efectúa con la cuajada, en 
una proporción distinta en cada variedad de quesos (Dumais, 1991). 
El agua que queda retenida en el queso desempeña un papel muy importante: es 
esencial para el desarrollo de microorganismos y determina la velocidad de las 
fermentaciones y de la maduración, el tiempo de conservación, la textura del 
queso y el rendimiento del proceso de elaboración. La materia grasa influye en la 
textura, el sabor, el rendimiento y en el color del queso. La lactosa es el sustrato 
para la formación de ácido láctico y, por lo tanto, interviene en la coagulación de la 
leche, el desuerado y la textura de la cuajada, y también en el crecimiento de los 
microorganismos. La caseína coagulada constituye la base de la pasta quesera y 
en su degradación se originan diversos compuestos aromáticos. Las proteínas del 
suero que quedan incluidas en la cuajada contribuyen al valor nutritivo del queso y 
tienen mucha importancia en el proceso de maduración. Los minerales participan 
en la coagulación de la leche e influyen sobre el desuerado y la textura del queso 
(Dumais, 1991). 
2.2 Quesos mexicanos genuinos 
 
En la actualidad, se producen en México cerca de cuarenta variedades de quesos 
genuinos, de los cuales el queso Cotija y el queso bola de Ocosingo forman parte. 
18 
 
Algunos gozan de una amplia difusión y altos volúmenes de producción, otros 
solamente se conocen y consumen en ciertas regiones. 
Se denominan quesos mexicanos genuinos, a aquellos que derivan de México y 
poseen una fuerte raíz histórica nacional, ya que se elaboran desde los tiempos de 
la colonia, o datan de décadas más recientes; fabricados dentro del territorio 
nacional por mexicanos y elaborados a partir de leche de vaca o de cabra, 
fundamentalmente cruda, con el empleo mínimo de aditivos: cuajo, sal y 
eventualmente CaCl2. Son el resultado de su propia historia, cultura y saber-hacer. 
El queso Cotija de la Sierra de Jalmich (Jalisco y Michoacán), es el primer queso 
mexicano genuino que logró una marca colectiva, la cual se denomina queso 
Cotija “Región de Origen”. Por otro lado, los quesos que han obtenido una marca 
colectiva territorial son: el queso bola de Ocosingo (Chiapas), el queso poro de 
Tabasco y, recientemente (2013), elqueso crema de Chiapas. 
Muchos quesos genuinos, en la actualidad, no tienen patrones muy claros de 
elaboración, no están estandarizados, ni pueden usarse como referencia o 
prototipo de los quesos de su especie para producirse de manera independiente. 
Aún más, en la mayoría de los casos, ni siquiera existe una norma técnica oficial 
que se aplique en el ámbito nacional. Así, la variabilidad en los productos y en los 
procesos de elaboración es la regla. 
Es claro entonces que la mayor parte de los quesos mexicanos genuinos tiene su 
origen en la producción artesanal; es decir, en un proceso de manufactura que 
emplea relativamente mucha mano de obra y escasa maquinaria, cuyos procesos 
no son estandarizados, los cuales manejan bajos volúmenes de producción y cuya 
tecnología normalmente es obsoleta, aunque funcional (Cervantes, et al., 2013). 
2.3 Queso bola 
 
El queso bola es un queso atípico dentro de los quesos mexicanos; y se elabora 
en el municipio de Ocosingo en el estado de Chiapas. Es una bola dura, con 
diámetro de entre 8 y 12 cm, y un peso entre 400 g y 1 Kg aproximadamente; se 
19 
 
elabora con leche cruda de vaca de doble propósito, cruza de cebú y pardo suiza. 
Es considerado como un queso doble, integrado por una pasta resultado del 
cuajado mixto (por cuajo y acidez natural) madurado por 21 días; y un forro creado 
a partir de dos capas de pasta hilada caliente de leche descremada, que al 
enfriarse forma una corteza de caseína muy consistente, a manera de una dura 
cáscara, que encierra la pasta del queso propiamente dicho (Figuras 2 y 3) 
(Cervantes et al., 2013). 
 
Este queso es fabricado solamente por unos cuantos queseros artesanales, cuyo 
conocimiento técnico ha pasado por tradición oral y práctica de generación en 
generación (Villegas de Gante et al, 2014). 
En el 2016, Grajales y Ramos en proceso de la Universidad de Ciencias y Artes de 
Chiapas aislaron cepas de Enterococcus faecium del queso bola de Ocosingo, las 
cuales se identificaron mediante la secuenciación del gen ADNr 16S. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Queso bola de Ocosingo, Chiapas. 
(Villegas de Gante et al, 2014). 
b) 
20 
 
 
Figura 3. Diagrama de flujo para la elaboración del queso bola. 
(Cervantes et al., 2013). 
2.4 Enterococcus en el queso Cotija 
 
Estudios realizados por nuestro grupo de trabajo se enfocaron en el análisis del 
queso Cotija, uno de los principales quesos mexicanos genuinos. Producto 
elaborado a partir de leche bronca y entera, no adicionado con cultivos iniciadores, 
sin la aplicación de tratamiento térmico y de mínimo 3 meses de maduración 
(Cervantes et al., 2013). 
Dentro de estos estudios, Guzmán en el 2015 realizó una caracterización de las 
cepas de E. faecium provenientes de queso Cotija “Región de Origen”, utilizando 
técnicas de tipificación MLST, con el fin de diferenciarlas de las STs que integran 
el complejo clonal asociado a hospitales, y determinar la existencia de un complejo 
clonal asociado a alimentos. 
Los resultados obtenidos, además del enriquecimiento de la base de datos con 
aislados de alimentos, revelaron que las cepas aisladas del queso no se 
21 
 
encuentran relacionadas con las clonas asociadas a un origen hospitalario. Para 
este análisis se seleccionaron siete cepas, de las cuales tres se identificaron 
presuntivamente como E. faecium mediante PCR punto final especie – específica 
como: cepas QD-2, Q E-2 y QG-5. Las cuatro restantes se aislaron y se 
caracterizaron por otro miembro del grupo de trabajo (Bravo, 2008), se 
identificaron como: cepas B, C, D y G. Estas siete cepas fueron incluidas en el 
estudio de evaluación de inocuidad de Enterococcus spp. por Olvera-García en 
2013; en éste, se llevó a cabo la evaluación del potencial de virulencia, mediante 
la detección y evaluación de la expresión de genes que codifican para factores de 
virulencia como: citolisina, proteína de superficie enterocócica y sustancia de 
agregación; enterocinas (A y AS-48) y peptidoglucano hidrolasas (AtlA); asimismo 
se evaluó la resistencia al antibiótico vancomicina usando la concentración mínima 
inhibitoria (MIC) recomendada por el Committee for Clinical Laboratory Standards 
(NCCLS) que es de 256 µg/mL, y una segunda concentración previamente 
descrita en el grupo de trabajo (20 µg/mL) por Bravo en 2008. Los resultados 
revelaron que ninguna cepa tiene capacidad de crecer en presencia de las 
concentraciones evaluadas del antibiótico vancomicina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
3. Justificación 
 
E. faecium es una bacteria que puede vivir en condiciones ambientales adversas, 
lo que le permite prevalecer y estar ampliamente distribuido en la naturaleza, 
incluyendo en alimentos fermentados de manera natural. Sin embargo, es capaz 
de adquirir factores de virulencia y genes de resistencia a antibióticos, lo que ha 
generado cepas multirresistentes de origen nosocomial consideradas como un 
problema de salud emergente a nivel mundial. 
Lo que se busca en el presente trabajo es encontrar las posibles semejanzas entre 
las cepas de E. faecium aisladas de quesos artesanales mexicanos, conocer si 
existe relación con otras cepas aisladas de alimentos y saber la relación de éstas 
con el complejo clonal de alto riesgo (CC17) asociado a aislados de origen 
nosocomial. Para lo cual cepas aisladas del queso bola de Ocosingo se evaluarán 
mediante un método de tipificación molecular (MLST) capaz de diferenciar cepas 
dentro de una misma especie. 
4. Hipótesis 
Los Enterococcus faecium aislados del queso bola de Ocosingo se encontrarán 
alejados del complejo clonal al que pertenecen las cepas patógenas, y en su lugar 
tendrán relación con las cepas aisladas de alimentos. 
 
 
 
 
 
23 
 
5. Objetivos 
5.1 General 
Tipificar cepas de E. faecium aisladas del queso bola de Ocosingo. 
5.2 Particulares 
 Caracterizar fenotípicamente las cepas de E. faecium, en términos de: 
capacidad de crecimiento a diferentes temperaturas, valores de pH, 
concentración de NaCl y de sales biliares. 
 Caracterizar genotípicamente, mediante la amplificación y purificación de 
siete genes de mantenimiento (atpA, ddI, purk, gyd, pstS y adk) para 
realizar la tipificación por MLST. Análisis para definir estructura poblacional. 
 Evaluar la presencia de factores de virulencia y resistencia a antibióticos. 
 
 
 
 
 
 
24 
 
6. Metodología 
Figura 4. Diagrama general del trabajo. 
 
La metodología planteada se divide en tres etapas (Figura 4): etapa 1) La 
caracterización fenotípica de las cepas, la cual se evaluó primeramente por la 
tinción de Gram, presencia de la enzima catalasa, capacidad de hidrolisis de sales 
biliares, capacidad de crecimiento bajo ciertas condiciones de temperatura, 
salinidad y pH, así como la caracterización genotípica a través del análisis MLST 
basado en el análisis de secuencia de siete fragmentos de ADN; etapa 2) Se 
efectúo el análisis del potencial de patogenicidad a través de la amplificación de 
genes codificantes para factores de virulencia como son: asa 1, esp y cylA; etapa 
3) Se evaluó la resistencia a antibióticos. 
 
25 
 
6.1 Caracterización del microorganismo objeto de estudio 
Se cuenta con cinco cepas aisladas del queso bola de Ocosingo Chiapas, 
secuenciadas e identificadas por el gen marcador ADNr 16S como E. faecium 
(cepas registradas como 10, 9, 6, 3 y 2), las cuales se reactivaron en medio 
selectivo MRS (de Man, Rogosa y Sharpe; Oxoid, Basingstoke) a 37°C por 24 h. 
Posteriormente se realizaron tinciones de Gram para verificar su morfología 
microscópica. Además, se cultivaron en placas de medio selectivo y diferencial, 
Kanamicina-esculina-azida de sodio (KAA-Oxoid), las cuales se incubaron a 37°C 
por 24 h. A partir del crecimiento de colonias características de Enterococcus 
(circulares, blancas o grises con un diámetro de alrededor de 2 mm, rodeadas de 
zonasnegras de al menos 1 cm de diámetro), se realizó la prueba de catalasa 
usando peróxido de hidrógeno al 30% (v/v). 
Fundamento del medio Kanamicina-Esculina-Azida de Sodio (KAA): el agar 
Esculina-Azida de Sodio es un medio selectivo cuando se usa un suplemento de 
kanamicina y se emplea para aislamiento de Enterococcus en alimentos. El medio 
contiene los componentes inhibitorios de kanamicina y azida de sodio. También 
contiene un sistema indicador para detectar el crecimiento de estreptococos 
hidrolizantes de esculina. Se forman colonias con áreas negras alrededor de las 
colonias debido a la formación de compuestos fenólicos de hierro, productos de la 
hidrólisis de esculina y Fe2+ (Mac Faddin, 2003; The OXOID Manual, 2006). 
6.2 Conservación de la cepa objeto de estudio 
Se reactivaron las cepas en tubos con 5 mL de MRS e incubaron por 5 h a 37°C y 
250 rpm. Posteriormente se transfirieron a viales criogénicos con 600 µL de cultivo 
y 300 µL de glicerol al 80% (v/v), con una concentración final de glicerol del 27% y 
se almacenaron a -20°C. 
6.3 Caracterización fenotípica 
 
De las cajas con medio KAA se tomó una asada y las bacterias se inocularon en 
medio MRS para evaluar su capacidad de crecimiento: a 37°C, 45°C y 4°C, así 
26 
 
como en 6.5 % de NaCl, 3% de sales biliares y un rango de pH 4 a 9, el cual se 
ajustó con HCl y NaOH concentrados. Se incubaron en estático a 37°C y se 
midieron a las 24 y 48 h, estos experimentos se realizaron por triplicado, la 
presencia de turbidez en el medio de cultivo indicaba un crecimiento positivo. 
Por otro lado, se evaluó la capacidad de hidrólisis de sales biliares en placas de 
MRS con agar a una concentración de 0.5% (m/v) de sales biliares (glicolato de 
sodio y taurocolato de sodio) y CaCl2 0.37% (m/v), incubadas en jarra bajo 
condiciones de anaerobiosis (oxoid anaerobic system; Basingstoke Reino Unido) 
por 48 h a 37°C. Para ello, se reactivaron las cepas objeto de estudio, tomando 20 
µL de cada glicerol, con el propósito de llevar a cabo un cultivo en 5 mL de MRS a 
37°C por 24 h. De estos tubos se tomaron alicuotas de 100 µL para su crecimiento 
final en 5 mL de MRS a 37°C por 4 h; preparación de la cual se tomaron 20 µL 
para su absorción en el agar dispuesto para la prueba de la hidrólisis de sales 
biliares. Se cuantificó cualitativamente su capacidad de hidrólisis con base al 
tamaño de la zona de precipitación alrededor de las colonias (Franz et al., 2001). 
Asimismo se verificó su capacidad de supervivencia al calentamiento a 60°C por 
30 min en un baño maría (Stabletemp); posterior a ello se realizó extensión en 
placa, para la cual se tomaron 50 µL de cultivo y se incubó a 37°C durante 48 
horas, tiempo al cual se realizó una cuenta de UFC (unidades formadoras de 
colonia) / mL presentes en la placa, para determinar las células viables. 
6.4 Extracción del ADN 
 
Cada una de las cepas se reactivó en 5 mL de medio MRS durante 24 h a 37°C, 
posteriormente se tomó 1 mL de cada cultivo y se inoculó en matraces con 50 mL 
de medio MRS para después incubar por 16 h a 37°C. Para la extracción de ADN 
se empleó el estuche Fast ID Genomic DNA Extraction (Genetic ID, EUA), 
siguiendo las instrucciones del proveedor. Una vez obtenido el ADN de cada cepa 
se cuantificó y se evaluó su calidad, mediante la relación de la absorbancia 260 y 
280 nm, utilizando el espectrofotómetro con el uso de microplacas Take3 Epoch 
(Bio Tek, EUA). Para verificar la integridad del ADN extraído se realizó 
27 
 
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), teñido con bromuro de etidio al 0.1%. 
Para aquellas extracciones cuya concentración era baja, se empleó el 
concentrador de ADN (Modelo DNA plus-VRMini, marca Heto), para reducir su 
volumen a la mitad. 
6.5 Amplificación de 7 genes altamente conservados por PCR punto 
final 
Para cada cepa se amplificaron siete genes altamente conservados: atpA (ATP 
sintasa, subunidad alfa), ddI (Ligasa D-alanina:D-alanina), purK (subunidad 
deshidrogenasa), gyd (gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa), pstS 
(transportador ABC), adk (adenilato cinasa) y gdh (glucosa-6-fosfato 
deshidrogenasa); usando los cebadores respectivos (Tabla 1) (Homan et al., 
2002). 
Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 50 µL con las siguientes 
concentraciones finales: amortiguador Phusion (1x), cebador directo y reversa (0.2 
µM), desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) (0.2 mM), Phusion High Fidelity 
polimerasa 0.625 u/ µL y ADN 100 ng/µL. 
La polimerasa Phusion HighFidelity es una enzima de alta fidelidad usada para 
aplicaciones que requieren alta precisión durante la amplificación del ADN, tales 
como clonación, secuenciación o mutagénesis sitio dirigidas 
(http://www.thermofisher.com); en este estudio fue necesaria su aplicación debido 
a la amplificación y posterior secuenciación de genes, en busca de mutaciones 
puntuales, por lo que se requería de bajas tasas de error durante la amplificación. 
Las condiciones de la reacción fueron: desnaturalización inicial a 98°C durante 30 
s, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 98°C durante 10 s, alineamiento o 
hibridación a 50°C durante 30 s, y polimerización o extensión a 72°C durante 15s; 
y una extensión final a 72°C durante 10 minutos. 
 
 
28 
 
Tabla 1. Lista de cebadores para los genes a evaluar por MLST. 
Gen Cebador Secuencia 5’-3´ 
Tamaño de 
amplicón (pb) 
adk 
(adenilato cinasa) 
adk1 
adk2 
TATGAACCTCATTTTAATGGG 
GTTGACTGCCAAACGATTTT 
437 
atpA 
(ATP sintasa, 
subunidad alfa) 
atpA1 
atpA2 
CGGTTCATACGGAATGGCACA 
AAGTTCACGATAAGCCACGG 
556 
ddl 
(Ligasa D-alanina: 
D-alanina) 
ddl1 
ddl2 
GAGACATTGAATATGCCTTATG 
AAAAAGAAATCGCACCG 
465 
gdh 
(glucosa-6-fosfato 
deshidrogenasa) 
gdh1 
gdh2 
GGCGCACTAAAAGATATGGT 
CCAAGATTGGGCAACTTCGTCCCA 
530 
gyd 
(gliceraldehido-
3fosfato 
deshidrogenasa) 
gyd1 
gyd2 CAAACTGCTTAGCTCCAATGGC 
 CATTTCGTTGTCATACCAAGC 
395 
purK 
(subunidad 
deshidrogenasa) 
purKn1 
purKn2 
CAGATTGGCACATTGAAAG 
 TTCATTCACATATAGCCCG 
492 
pstS 
(transportador 
ABC) 
pstS1 
pstS2 
TTGAGCCAAGTCGAAGCTGGAG 
 CGTGATCACGTTCTACTTCC 
538 
(Homan et al., 2002). 
Después de la amplificación, los productos de la PCR se examinaron mediante 
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v), teñidos con bromuro de etidio al 
0.1%, empleando como marcador de peso molecular una escala de ADN de bajo 
peso molecular (Thermo Físher Scientific). Una vez corroborada la amplificación y 
peso correspondiente, se realizó una purificación con el estuche DNA Clean & 
ConcentratorTM-5 (Zymo Research, Irvine, CA, EUA). Para los genes que 
presentaron más de una banda, se realizó su purificación de banda con el estuche 
Gene Jet Gel Extraction (Thermo Físher Scientific; Lituania, Unión Europea), en 
29 
 
ambos casos se siguieron las indicaciones del proveedor. La concentración de los 
productos se cuantificó utilizando el espectrofotómetro para microplacas Epoch 
Take3 (Bio Tek, EUA); para su posterior secuenciación en Macrogen Inc. (Seúl, 
Corea del Sur), mediante el método Sanger. 
6.6 Análisis de MLST de Enterococcus faecium 
 
Una vez recibidos los resultados de la secuenciación, se llevó a cabo el 
alineamiento utilizando el programa en línea MultAlin 
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). Cada amplicón obtenido se alineó con el 
cebador directo e indirecto y la secuencia de referencia provista por la base de 
datos en (http://efaecium.mlst.net/), con el fin de obtener una secuencia consenso. 
Obtenida la secuencia consenso, se comparó con las presentes en la base de 
datos la cual asignó un número de alelo en caso de coincidir con alguna ya 
existente. En caso contrario, es necesario consultar al curador para la asignación 
e incorporación del nuevo alelo a la base. A la combinación de los siete valores de 
los alelos agrupados en un orden determinado (atpA, ddl, gdh, purk, gyd, pstS, 
adk) se le denominaperfil alélico (genotipo), al cual le es asignado un número de 
secuencia tipo (ST). Una vez determinada la ST para cada cepa, se realizó el 
diagrama de estructura poblacional bajo el algoritmo eBURST, el cual está 
diseñado para datos generados por MLST. Éste se representa como un diagrama 
radial, centrado en el genotipo fundador, donde todos los miembros asignados al 
mismo grupo comparten alelos idénticos en 6 de los 7 loci. 
6.7 Detección de genes de virulencia por PCR punto final 
 
La detección de los genes que codifican para factores de virulencia se realizó a 
través de reacciones de PCR punto final con los cebadores específicos descritos 
por Vankerckhoven et al. (2004), para los siguientes genes: asa 1, esp y cylA, los 
cuales codifican para sustancia de agregación, proteína de superficie de 
enterococos y citolisina A del operón cyl, respectivamente (Tabla 2 ). Las cepas 
30 
 
que se emplearon como control positivo son: la cepa ATCC 29212 para el gen 
asa1, Enterococcus faecalis cepa A para el gen esp, y la cepa de Enterococcus 
faecalis NCIMB-700585 para cylA. 
Las condiciones de la reacción fueron: desnaturalizacion inicial a 95°C durante 3 
min, seguida de 30 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 30 s, alineamiento 
o hibridación, dependiendo de la Tm del gen a amplificar durante 45 s (Tabla 2) y 
polimerización o extensión a 72°C durante 1 min, y una extensión final a 72°C 
durante 10 min. 
Tabla 2. Lista de cebadores para cada factor de patogenicidad. 
Gene Cebador Secuencia 5’-3´ 
T. de 
hibrida
-ción 
°C 
Tamaño 
del 
amplicón 
(pb) 
asa1 
(Sustancia de 
Agregación) 
asa1 
asa2 
GCACGCTATTACGAACTATGA 
TAAGAAAGAACATCACCACGA 
46 375 
cylA 
(Citolisina) 
cylA1 
cylA2 
TGGATGATAGTGATAGGAAGT 
TCTACAGTAAATCTTTCGTCA 
49 517 
esp 
(Proteína de 
superficie 
enterococcica) 
esp1 
esp2 
AGATTTCATCTTTGATTCTTGG 
AATTGATTCTTTAGCATCTGG 
41 510 
(Eaton y Gasson, 2001; Vankerckhoven et al. 2004). 
La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 25 µL usando (1x) de 
amortiguador Pfu+ MgSO4, (0.2 mM) de dNTPs, 50 ng de ADN para cada muestra, 
0.625 U/µL de Pfu polimerasa (Thermo Físher Scientific), (0.2 µM) de cebadores 
para cylA, esp, y (0.1 µM) para asa. 
Después de la amplificación, los productos de PCR se examinaron mediante 
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p/v) teñidos con bromuro de etidio 0.1%. 
Los geles se examinaron en un transiluminador (Hoefer UVTM, EUA). 
31 
 
6.8 Prueba de resistencia a antibióticos por inhibición 
Se reactivaron las cepas objeto de estudio, y de cada una se realizó una dilución 
de 10-1 con solución salina (NaCl al 0.85%), de éstas se tomaron 20 µL, 
respectivamente y se inocularon en 10 mL de MRS con agar al 0.8%; esto se virtió 
sobre cajas petri previamente preparadas con 15 mL de MRS al 1% de agar. Se 
realizó la evaluación de resistencia y susceptibilidad a cada antibiótico mediante la 
tecnica de difusion de disco; para ello, se añadiéron concentraciones conocidas 
del antibiótico en discos de papel filtro, que se colocaron en la superficie del agar. 
Las cajas se dividieron de acuerdo al número de antibioticos a evaluar. 
Los antibioticos evaluados fueron: aminoglucósidos (kanamicina 8 µg/mL, 
espectinomicina 1 mg/mL, estreptromicina 1 mg/mL), macrolidos (eritromicina 8 
µg/mL), β-lactámicos (ampicilina 16 µg/mL, penicilina 8 µg/mL), glucopéptido 
(vancomicina 32 µg/mL) y tetracilcina 16 µg/mL se incubaron a 37°C durante 24 h. 
Estas concentraciones son especificas e inhibitorias para E. faecium, reportadas 
por el CLSI (2015). 
Durante la incubación, el agente difunde desde el papel filtro al agar, 
estableciendo un gradiente; la concentración del agente disminuye a medida que 
aumenta la distancia al papel filtro y alacanzando a una determinada distancia del 
disco, a la que se le conoce como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI); y es 
a partir de este punto que se presenta crecimiento microbiano, pero en la 
proximidad del disco se presenta una inhibición, esto en caso de ser el 
microorganismo susceptible. Método útil para ensayar la sensibilidad en 
patógenos a los antibióticos, basado en el crecimiento microbiano (Madigan et al., 
2009). 
 
 
 
32 
 
7. Resultados 
 
7.1 Caracterización de las cepas de E. faecium 
 
A partir de las 5 cepas aisladas del queso bola de Ocosingo, Chiapas, 
identificadas como E. faecium, mediante el análisis de ADNr 16S, por Grajales y 
Ramos (2016) se procedió a su reactivación en caldo MRS, medio selectivo para 
el crecimiento abundante de bacterias ácido lácticas, debido a que éstas se 
encontraban crioconservadas a -20°C. Posteriormente, se comprobó su pureza 
mediante su aislamiento en un medio selectivo y diferencial (KAA). Este medio es 
selectivo dada la presencia del antibiótico kanamicina, y diferencial debido a la 
capacidad de hidrólisis de la esculina formando un halo negro alrededor de las 
colonias con crecimiento característico de Enterococcus (colonias puntiformes, 
convexas, de color gris a blanco, con textura butirosa) (Figura 5). Como parte de 
la caracterización fenotípica, se realizó una tinción de Gram para cada una de las 
cepas, observando cocos y diplococos Gram positivos (Figura 6). Otra de las 
pruebas realizadas comprobó la ausencia de la enzima catalasa, dando negativo 
al entrar en contacto con el peróxido de hidrogeno (30% v/v) por parte de todas las 
cepas; prueba característica de este género y de las BAL. Esta enzima entra en 
contacto con el (H2O2), forma oxígeno y agua, en caso de ser positiva su presencia 
(Madigan et al., 2009) (Tabla 3). 
33 
 
 
Figura 5. Crecimiento característico de E. faecium en medio KAA. 
 
 
Figura 6. Tinción de Gram de E. faecium. 
 
 
 
34 
 
Tabla 3. Resultados de la tinción de Gram y prueba de catalasa de las cepas de E. faecium. 
Cepa 
Morfología 
microscópica 
Prueba 
catalasa 
Gram 
10 Cocos Negativo G+ 
9 Cocos Negativo G+ 
6 Cocos Negativo G+ 
3 Cocos Negativo G+ 
2 Cocos Negativo G+ 
 
Los Enterococcus se caracterizan por tener la capacidad de crecer en ambientes 
desfavorables (entre 10 y 45°C) además, pueden sobrevivir por lo menos 30 
minutos a 60°C. Asimismo pueden proliferar en un intervalo de pH entre 4.0 y 9.0, 
así como en NaCl al 6.5%, y tener la capacidad de hidrolizar la esculina en 
presencia de 3 % de sales biliares (Giraffa, 2003; Foulquie-Moreno et al., 2006). 
Características que los distinguen de otros cocos Gram positivos como los 
estreptococos y lactococos. Estas características justifican su continua presencia 
en una amplia variedad de alimentos fermentados (Giraffa, 2003). 
Por lo anterior, se evaluó cualitativamente su capacidad de crecimiento bajo 
dichas condiciones. Para los rangos de temperatura y concentración de sales se 
obtuvieron resultados positivos; sin embargo, en cuanto a su crecimiento en el 
rango de pH evaluado, se observó una disminución de éste a pH 5 con ausencia 
del mismo a pH 4, con un crecimiento más favorable a pH básico (Tabla 4). 
 
 
 
 
35 
 
Tabla 4. Evaluación del crecimiento de las cepas de E. faecium bajo condiciones extremas de temperatura, 
pH y osmolaridad. 
Cepa 
/Condición 
10 9 6 3 2 
45°C + + + + + 
4°C (48 h.) + + + + + 
Sales Biliares 
al 3% 
+ + + + + 
NaCl al 6.5% + + + + + 
pH9 + + + + + 
pH8 + + + + + 
pH7 + + + + + 
pH6 + + + + + 
pH5 + + + + + 
pH4 - - - - - 
Se muestra el análisis por triplicado. Crecimiento a 24 h a menos que se indique lo contrario. 
Así mismo, se evaluó cualitativamente su tolerancia a una temperatura de 
pasteurización lenta (60°C por 30 minutos); prueba en la que, posterior a la 
extensión en placa e incubación, se observó la supervivencia de todas las cepas 
(Figura 7). Además, se realizó un conteo de colonias en el que se obtuvieron 
3000, 1320, 520, 400 y 180 UFC/mL para las cepas 3, 10, 6, 2 y 9, en el orden 
respectivo. 
36Figura 7. Crecimiento de las cepas E. faecium bajo 
tratamiento térmico a 60°C por 30 minutos. 
 
 
 
Cepa 9 Cepa 10 
Cepa 6 Cepa 3 
Cepa 2 
37 
 
Las cepas con capacidades probióticas incluyen características fisiológicas y 
propiedades funcionales promotoras de la salud, como son la inhibición de 
microorganismos patógenos, el fortalecimiento de la mucosa intestinal, el aumento 
de la respuesta inmune y la reducción de los niveles de colesterol en sangre. 
Estos últimos se han relacionado con la capacidad de las bacterias de hidrolizar 
las sales biliares (HSB). Esta actividad está mediada por varias bacterias 
intestinales Gram positivas, incluyendo miembros del género Enterococcus. La 
desconjugación de las sales biliares por acción de la enzima coloilglicina hidrolasa 
(E.C. 3.5.1.24), liberan glicina y/o taurina de la cadena lateral del núcleo esteroide. 
Se plantea que la desconjugación de las sales biliares puede contribuir a reducir 
los niveles de colesterol debido a que los ácidos biliares libres pueden ser 
excretados más fácilmente del tracto gastrointestinal que las sales biliares 
conjugadas. Si se produce una mayor pérdida fecal de ácidos biliares como 
resultado de la HSB, puede aumentar la demanda de colesterol como precursor de 
la nueva síntesis de sales biliares, lo que a su vez puede reducir los niveles de 
colesterol (Franz et al., 2001). 
Debido a lo anterior, se realizó una evaluación en cuanto a la capacidad de 
hidrólisis de sales biliares (HSB) de las cepas del queso bola, las cuales fueron 
capaces de crecer en presencia de las sales biliares (excepto la cepa 9) y tuvieron 
baja capacidad HSB, al mostrar un ligero precipitado (Figura 8). 
Estos resultados preliminares indican que poseen una baja actividad HSB. Se 
tomó como referencia el estudio realizado por Franz et al. (2001), el cual muestra 
la capacidad e incidencia de la HSB; en él participaron 117 cepas de enterococos 
aislados de alimentos y se clasificaron en función al tamaño de la zona de 
precipitación generada, con la mayor incidencia de actividad por parte de E. 
faecalis (81%) seguida por E. faecium (50%) y E. durans (44%). 
38 
 
 
Figura 8. Evaluación de la capacidad de hidrolisis de sales biliares. 
 
Se sugiere confirmar estos resultados por un método analítico, como la 
determinación de taurina o glicina por HPLC. 
Una vez verificada la pureza y características fenotípicas propias de las cepas de 
E. faecium, se realizó la extracción del ADN, (Figura 9); mostrando rendimientos 
suficientes en cuanto a calidad y cantidad (Tabla 5). 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Gel de agarosa al 1% (p/v) obtenido del ADN extraído para las cepas de E. faecium. 
La M denota el marcador molecular (GeneRuler 1 kb), a continuación, las cepas 10, 9, 6, 3 y 2. 
10,000 pb 
M 10 9 6 3 2 
39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7.2 Análisis MLST 
 
Las cinco cepas aisladas del queso bola se analizaron mediante el método de 
tipificación molecular MLST enfocado a E. faecium (http://efaecium.mlst.net/); 
(Homan et al., 2002); para ello, se llevaron a cabo las reacciones de PCR punto 
final con los cebadores reportados en http://efaecium.mlst.net/misc/info.asp, a fin 
de amplificar siete genes de mantenimiento básico celular. En todas las cepas, 
cada gen fue amplificado y secuenciado con el cebador directo e inverso. Las 
secuencias obtenidas se subieron a la base de datos de E. faecium 
(http://efaecium.mlst.net/) para la asignación de alelos a cada locus y generar así 
la secuencia tipo (ST). El análisis de agrupación de las STs fue desarrollado a 
partir de la base de datos del MLST y el algoritmo eBURST. 
Para saber si la reacción había trascurrido eficientemente, los amplicones se 
visualizaron a través de electroforesis en geles de agarosa. Cuando los 
amplicones son corridos en el gel, deben ser cargados junto con un marcador 
molecular que contenga un número de segmentos de ADN conocidos, lo que 
facilitará su identificación y si su tamaño corresponde. El tamaño se otorga debido 
al número de pares de bases (pb) del amplicón (Tamay et al., 2013). 
Tabla 5. Concentración de ADN de las cepas aisladas de E. faecium. 
Cepa ng/µL 
Relación 
A 260 / A 280 
10 44.979 2.238 
9 71.602 2.236 
6 34.901 2.012 
3 99.815 2.091 
2 13.829 1.981 
40 
 
Se obtuvieron los amplicones esperados para cada gen, se observó la presencia 
de una banda de tamaño correspondiente al número de pares de bases (pb) de 
referencia (Figura 10(a, b, c) y 11a). En caso de observarse más de una banda, se 
procedió a purificar la banda de interés, seleccionada por su tamaño (Figuras 11b 
y 11c). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10a Gel de agarosa de PCR punto final obtenido para los genes: adk, purK, ddl, gyd y gdh de la cepa 
3 de E. faecium. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 b 
Figura 10b y 10c. Geles de agarosa de PCR punto final obtenidos para los alelos: pstS y atpA de la cepa 3 
de E. faecium. 
 
1031 
900 
800 
700 
600 
500 
400 
 
 
 M adk purk ddl gyd gdh 
 437pb 492pb 465pb 395pb 530pb 
 M 6 3 
538 pb 
pstS 
 
 M 3 
556 pb 
atpA 
 
10 c 
41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Geles de agarosa de PCR punto final obtenidos para los genes: purk, ddl y gdh de las cinco cepas 
de E. faecium. 
 
Se puede observar en la Figura 11a el gel de agarosa para el amplicón del gen 
purK con un peso de 492 pb; posteriormente en la Figura 11b se muestra el gel 
de agarosa para el amplicón del gen ddl de 465 pb; finalmente en la Figura 11c se 
puede visualizar el gel de agarosa para el amplicón del gen gdh de 530pb. 
Una vez obtenidos los amplicones, se realizó una purificación con el propósito de 
eliminar los subproductos de la reacción efectuada, como son: cebadores y 
dNTPs; en caso de realizar purificación de banda, ésta sirve además para eliminar 
la agarosa, todos ellos factores que afectan la secuenciación. Las concentraciones 
obtenidas se muestran en la Tabla 6, las cuales fueron adecuadas en cantidad y 
calidad para la secuenciación. 
M 10 9 6 3 2 M 9 6 3 2 
ddl 
M 9 6 10 2 3 
gdh 
430pb 
492 pb 
a) 
purK 
 
465 pb 
b) 
c) 
42 
 
Tabla 6. Concentración de los amplicones obtenidos, para los siete genes empleados en el MLST, de las 
cepas de E. faecium aisladas del queso bola. 
 
 
 
 
 
 
Obtenida la secuencia de los fragmentos internos de los siete genes: atpA (ATP 
sintasa, subunidad alfa), ddI (Ligasa D-alanina: D-alanina), purK (subunidad 
deshidrogenasa), gyd (gliceraldehido-3 fosfato deshidrogenasa), pstS 
(transportador ABC) y adk (adenilato cinasa), se realizó su alineamiento con una 
secuencia de referencia tomada de la base de datos respectiva al gen a alinear, 
para mantener el tamaño del amplicón marcado por la referencia, ya que las 
secuencias obtenidas son más grandes a las marcadas por la base de datos y el 
programa limita su reconocimiento. Cabe mencionar que para cada gen existen un 
número limitado de alelos, los cuales se identifican con un número (Tabla 7). 
 
 
Gen Cepa ng/µl Gen Cepa ng/µl Gen Cepa ng/µl 
purK 
10 81.090 
adk 
10 51.641 
pstS 
10 44.807 
9 88.463 9 95.791 9 45.981 
6 873.322 6 83.228 6 41.257 
3 52.984 3 29.616 3 28.421 
2 100.842 2 129.005 2 39.521 
gdh 
10 39.861 
ddl 
10 68.363 
9 43.551 9 34.548 
6 52.504 6 54.714 
3 13.665 3 18.053 
2 49.005 2 37.592 
atpA 
10 47.914 
gyd 
10 44.127 
9 16.618 9 52.557 
6 39.737 6 35.023 
3 20.262 3 36.851 
2 27.520 2 37.353 
43 
 
Tabla 7. Alelos descritos por la base de datos del MLST con fecha de última actualización Octubre del 
2017. 
Locus Alelos 
atpA 105 
ddl 97 
gdh 86 
purk