Analisis-mutacional-del-gen-nr3c4-en-individuos-46xy-con-insensibilidad-a-los-androgenos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
ANÁLISIS MUTACIONAL DEL GEN NR3C4 EN INDIVIDUOS 
46,XY CON INSENSIBILIDAD A LOS ANDRÓGENOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 B I Ó L O G O 
 P R E S E N T A : 
 ERICK ALEJANDRO ESPINOZA OROZCO 
 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
DR. LUIS RAMOS TAVERA 
2015 
 
 
 
Lourdes
Texto escrito a máquina
Ciudad Universitaria, D. F.
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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DEDICATORIA 
A mi madre, Silvia Orozco Ruiz. 
A mis hermanos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Bioquímica 
hormonal del Departamento de Biología de la Reproducción del Instituto 
Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán (INCMNSZ) y fue 
apoyado por CONACyT (No. de proyecto CONACYT CB2011-166408-M, No. 
de Becario 19937). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
A Dios, a la patria y al Rey, pero sobre todo quisiera 
agradecer a mi familia por ser la fuerza que siempre me 
impulsa a seguir adelante y por estar conmigo de manera 
incondicional. 
 
Mi más sincero agradecimiento al Dr. Luis Ramos Tavera, 
por toda su enseñanza, conocimiento y apoyo en la 
elaboración del presente trabajo de tesis. 
 
Al comité sinodal que me hizo el honor de revisar el 
presente trabajo y darme su acertada opinión, comentario, 
sugerencias y correcciones. 
 
A mis compañeros de laboratorio por su apoyo y compañía. 
Y a mis compañeros de carrera y buenos amigos. 
 
 
ÍNDICE 
 RESUMEN……………………………….………………………………..1-2 
1. INTRODUCCIÓN………….…………………………..………………...3-18 
1.1. Desarrollo Sexual Masculino………....………………………….3-4 
1.2. Andrógenos…………………………..………………………........5-8 
1.3. Mecanismos de Acción de los Andrógenos.…...………..........9-11 
1.4. Receptor de Andrógenos.…………………...……...……........12-16 
1.5. Síndrome de Insensibilidad a Andrógenos……..…………...17-18 
2. JUSTIFICACIÓN….………………………………………………….........19 
3. OBJETIVOS………………………………………………………………..20 
4. METODOLOGÍA….…………………………………………………....21-28 
4.1. Pacientes…….……………………………………………………..21 
4.2. Extracción del DNA genómico………………....…..…………22-23 
4.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)...…....………23-25 
4.4. Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla (SSCP)…..26 
4.5. Purificación de DNA por Electroelución....….....………………...27 
4.6. Secuenciación del gen NR3C4.........………...……………..........28 
5. RESULTADOS…………………………………………………………29-34 
6. DISCUSIÓN………………………………………………………….....35-38 
7. APÉNDICE...............................................................................................39-42 
8. REFERENCIAS………………………………………………………...43-58 
 
1 
 
RESUMEN 
El Síndrome de Insensibilidad a Andrógenos (AIS) es un desorden 
con un gran espectro de anomalías fenotípicas en la diferenciación sexual y 
se clasifica dentro de los Desordenes del Desarrollo Sexual (DSD) en 
individuos con cariotipo 46,XY. La etiología básica del AIS está ligada a una 
pérdida en la función del Receptor de Andrógenos (RA), originada por 
mutaciones en el gen NR3C4. 
En el presente estudio se analizó la región codante del gen NR3C4 de 
dos pacientes diagnosticados clínicamente con AIS. El estudio se inició con 
la extracción de DNA genómico y con la amplificación por Reacción en 
Cadena de la Polimerasa (PCR) de los ocho exones que conforman el gen 
NR3C4. Los amplicones fueron sometidos al análisis del Polimorfismo 
Conformacional de Cadena Simple del DNA (SSCP) en geles de 
poliacrilamida (5.4% y 8% con y sin glicerol) y al análisis de secuenciación. 
Los resultados obtenidos mediante los ensayos de SSCP revelaron 
cambios en la movilidad electroforética en el exón 6 del paciente 1 y en el 
exón 8 del paciente 2 a una concentración de poliacrilamida 5.4% con 
glicerol y 5.4% sin glicerol, respectivamente. En el paciente 1 el análisis de 
secuenciación del exón 6 permitió caracterizar una transición de timina a 
citocina (T>C) en la posición 2374 del DNA, la cual generó una sustitución 
de amino ácido (a.a.) en el codón 792 de serina (TCT) a prolina (CCT). En el 
paciente 2 el análisis de secuenciación del exón 8 permitió caracterizar una 
transición de adenina a guanina (A>G) en la posición 2716 del DNA con 
2 
 
cambio de lisina (AAG) a ácido glutámico (GAG) en el codón 906. Ambas 
mutaciones fueron presentadas en el dominio de unión al ligando (DUL) del 
RA, el cual es importante para la especificidad y afinidad de unión a los 
andrógenos. 
Estos resultados incrementan el número de mutaciones en el gen 
NR3C4 y permiten elucidar los efectos moleculares del RA en la 
diferenciación sexual masculina para la elaboración de un mapa estructura-
función del RA, el cual provee información útil para establecer una 
correlación genotipo-fenotipo correspondiente del AIS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1. Desarrollo Sexual Masculino 
El desarrollo sexual masculino inicia con el establecimiento del sexo 
cromosómico 46,XY, proceso que tiene lugar en el momento de la 
fertilización. Determinado el sexo cromosómico, el siguiente paso es la 
formación del primordio gonadal bipotencial y su determinación hacia los 
testículos (Val y Swain, 2005). La señalización inicial de la determinación 
testicular es la agregación de las células de pre-Sertoli (derivadas del 
mesonefro adyacente) alrededor de las células germinales para formar los 
cordones sexuales primarios a partir de la sexta y séptima semana de 
gestación. Los cordones sexuales primarios proliferan y se introducen 
profundamente en la médula gonadal para formar los túbulos seminíferos. Al 
final de la novena semana de gestación, el mesénquima que separa los 
túbulos seminíferos da lugar a las células intersticiales; las cuales se 
diferencian a células de Leydig (Hughes, 2001). 
En presencia del cromosoma Y, los testículos se desarrollan bajo la 
expresión de los genes SRY (sex-determining region Y cromosome) y SOX9 
(SRY-related HMG-box gene 9). Ambos genes inducen la diferenciación de 
las células de Sertoli, encargadas de secretar la hormona anti-Mülleriana 
(AMH) (Koopman et al. 2001; Sekido et al. 2004; Kanai et al. 2005). La AMH 
se une a las células mesenquimáticas que rodean a los conductos de Müllery hacen que las células secreten una factor paracrino que induce la 
apoptosis de las células epiteliales de los conductos de Müller (trompas de 
4 
 
Fallopio, útero y tercio superior de la vagina) alrededor de la octava semana 
de gestación (Allard et al. 2000; Hughes, 2001). Entre la novena y décima 
tercera semana de gestación, inicia la diferenciación de los conductos de 
Wolff (epidídimo, conductos deferentes y vesículas seminales) debido a la 
secreción de testosterona (T) por las células de Leydig del testículo fetal 
(Sinisi et al. 2003; Sajjad, 2010). En tejidos periféricos, la T es transformada 
a dihidrotestosterona (DHT) por la enzima 5α-reductasa tipo 2 (Wilson, 2001) 
y es responsable del desarrollo del seno urogenital (uretra y próstata), así 
como la masculinización de los genitales externos a nivel embrionario 
(Wilson et al. 2002; Sajjad, 2010). 
El desarrollo sexual masculino finaliza con el descenso testicular y 
ocurre en dos fases morfológicamente distintas: migración transabdominal y 
descenso inguino-escrotal. Durante la fase transabdominal, los testículos se 
trasladan a través la cavidad abdominal hasta situarse junto al anillo inguinal 
interno y se completa hacia la décima quinta semana de gestación. Este 
descenso transabdominal es dependiente de la secreción por las células de 
Leydig de la hormona similar a la insulina tipo 3 (INSL-3), encargada de 
regular el desarrollo del gubernaculum testis. La fase inguino-escrotal tiene 
lugar entre la vigésimo séptima y trigésima semana de gestación y 
corresponde a la migración de los testículos a través del canal inguinal hacia 
el escroto. Se ha observado que esta fase es altamente andrógeno-
dependiente (Rey y Grinspon, 2011; Jääskeläinen, 2012). 
 
 
 
 
5 
 
1.2. Andrógenos 
Los andrógenos (T y DHT) son hormonas esteroides sexuales que 
contribuyen a la diferenciación del sistema reproductor masculino durante la 
embriogénesis (Hughes, 2001). En adultos, las hormonas esteroides 
sexuales son esenciales para el mantenimiento de la espermatogénesis 
(Maqdasy et al. 2013), la regulación de las gonadotropinas y el desarrollo de 
los caracteres sexuales secundarios (Brinkmann, 2001). 
La T es secretada en las células de Leydig y biosintetizada a partir del 
colesterol (Haider, 2004). La secreción es controlada por un mecanismo de 
retroalimentación negativa que involucra a la hormona luteinizante (LH). La 
LH unida a su receptor transmembranal activa la señalización por proteínas 
G para inducir la adenilato ciclasa (AC) involucrada en la formación de 
adenosin monofosfato cíclico (AMPc) (Ascoli et al. 2002; Midzak et al. 2009). 
La acumulación intracelular de AMPc induce la activación de la proteína 
cinasa dependiente de adenosin (PKA) y a la fosforilación de la proteína 
reguladora de la esteroidogénesis aguda (StAR), la cual facilita el 
movimiento del colesterol a la membrana interna de las mitocondrias para 
iniciar la esteroidogénesis (Stocco et al. 2005; Manna et al. 2009) (ver fig. 1). 
 
 
 
 
 
6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Regulación aguda de la biosíntesis de T en células de Leydig. El esquema 
representativo muestra el efecto agudo de la hormona luteinizante (LH) en la cascada de 
señalización dependiente de Adenosin Monofosfato cíclico (AMPc). 
 
 
 
 
 
α
 β/y 
GDP 
GDP GTP 
α
 
GTP AC 
ATP AMPc 
R R 
C C 
PKA 
AMPc R 
StAR 
COLESTEROL 
PREGNENOLONA 
∆4 
∆5 
 
R-LH 
LH 
P450scc 
CÉLULA LEYDIG 
OH 
COLESTEROL 
7 
 
La primera etapa en la biosíntesis de T es la conversión del colesterol 
a pregnenolona. Esta conversión involucra tres distintas reacciones 
químicas, hidroxilación en el carbono 22, hidroxilación en el carbono 20 y la 
ruptura oxidativa del enlace C20-22. Estas reacciones son catalizadas por el 
citocromo P450scc (CYP11A1) (Miller, 2002). La pregnenolona 
biosintetizada puede transformarse fuera de la mitocondria por dos vías 
diferentes denominadas ∆4 y ∆5 (ver fig. 2). En la vía ∆4, la pregnenolona es 
transformada a progesterona por la enzima 3β-HSD tipo 2 (HSD3B2) que 
cataliza la conversión del grupo 3β-hidroxilo en un grupo ceto por oxidación 
y la isomerización del doble enlace en el carbono 4. La progesterona es 
hidroxilada en el carbono 17 para formar 17α-hidroxiprogesterona, esta 
reacción es catalizada por el citocromo P450c17 (CYP17A1) que también 
cataliza la ruptura del enlace C17-20 (actividad 17,20 liasa) para sintetizar 
androstendiona, la cual es reducida en el grupo 17-ceto esteroide por acción 
de la enzima 17β-HSD tipo 3 (HSD17B3) para formar T (Hanukoglu, 1992; 
Payne y Hales, 2004; Miller y Auchus, 2011). En la vía ∆5, la pregnenolona 
es metabolizada a 17α-hidroxipregnenolona para formar 
dehidroepiandrosterona (DHEA) mediante el citocromo P450c17 (CYP17A1) 
(Miller, 2002) y produce T vía androstendiol por acción de la enzima 17βHSD 
tipo 1 (HSD17B3) y 3βHSD tipo 2 (HSD3B2) (Payne y Hales, 2004; Miller y 
Auchus, 2011). 
La T biosintetizada es secretada al torrente sanguíneo y acarreada 
por la globulina transportadora de hormonas esteroides sexuales (SHBG) y 
la proteína de unión a andrógenos (ABP) (Michels y Hoppe, 2008). 
8 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Vía ∆4 y ∆5 para la biosíntesis de T en células de Leydig. Las rutas indican las 
enzimas necesarias para la formación de andrógenos a partir de pregnenolona. 
C=O 
CH3 
OH 
C=O 
O 
CH3 
C=O 
CH3 
O 
O 
O 
O 
C=O 
CH3 
OH 
O 
OH 
OH 
OH 
OH 
PREGNENOLONA 
∆4 ∆5 
PROGESTERONA 
 
17α-HIDROXIPROGESTERONA 
ANDROSTENDIONA 
OH 
TESTOSTERONA 
17α-HIDROXIPREGNENOLONA 
OH 
DEHIDROEPIANDROSTERONA 
ANDROSTENDIOL 
3β-HSD 2 
 
P450c17 
17, 20 liasa 
17β-HSD 3 
17β-HSD 1 
17, 20 liasa 
P450c17 
 
3β-HSD 2 
 
9 
 
1.3. Mecanismos de Acción de los Andrógenos 
En las células blanco, los andrógenos sintetizados atraviesan las 
membranas biológicas por difusión pasiva, en donde se unen 
intracelularmente al receptor de andrógenos (RA) mediante puentes de 
hidrógeno y uniones hidrofóbicas de Van der Waals (Gobinet et al. 2002). En 
el citoplasma el RA se encuentra en una conformación inactiva y asociado a 
proteínas de choque térmico (HSP), como HSP90 y HSP70 (Pratt et al. 
2004). La unión de los andrógenos al RA modifica la estructura del receptor 
a una conformación activa lo que genera una disociación de las HSP 
(Bennett et al. 2010). En este momento el receptor sufre múltiples 
fosforilaciones en diferentes residuos de serina (16, 81, 94, 256, 308, 424, 
650) (Kuiper y Brinkmann, 1995; Zhou et al. 1995; Gioeli et al. 2002), una 
translocación nuclear (Jenster et al. 1993; Georget et al. 1997) y una 
dimerización (Forman y Samuels, 1990; Wong et al. 1993; Centenera et al. 
2008). 
El complejo andrógeno-RA como homodímero activa la transcripción 
de genes andrógenos-dependientes por unión directa a secuencias 
palindrómicas de DNA específicas denominadas elementos de respuesta a 
andrógenos (ERA, 5´-AGAACANNNTGTTCT-3´), las cuales se localizan río 
arriba de la región promotora de estos genes (Claessens et al. 2001; Verrijdt 
et al. 2003). Después de la unión a los ERA, el RA recluta múltiples factores 
transcripcionales (TFIID, B, F, E, H) y requiere de la RNA polimerasa II (pol 
II) para iniciar la transcripción (Roeder, 1996; Dvir et al. 2001; Lee y Chang, 
2003). En esta etapa el control transcripcional por el RA es modulado por 
10 
 
interacciones con un grupo de proteínas coreguladoras para aumentar 
(coactivador) o disminuir (corepresor) la transcripción (Heinlein y Chang, 
2002). Estas proteínas coreguladoras tienen unión en las regiones de 
activación transcripcional (AF1 y AF2) de los dominios del RA (Glass y 
Rosenfeld, 2000; Heinlein y Chang, 2002; Lee y Chang, 2003). Después de 
latranscripción y procesamiento del transcripto primario, el RNA mensajero 
maduro (mRNA) sale al citoplasma donde se ensambla a ribosomas 
citoplasmáticos y factores de iniciación para la formación de nuevas 
proteínas (ver fig.3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Mecanismos moleculares de la acción de andrógenos en la célula blanco. El 
esquema representativo muestra la unión de los andrógenos al RA hasta la transcripción de 
genes. 
 
T 
T 
 
T 
5α-R 2 
 
V 
RA 
CÉLULA BLANCO 
 
T T 
TFIID 
TFIIB 
TFIIF-RNA pol II 
TFIIE 
TFIIH 
COREGULADORES 
DHT 
ERA 
NÚCLEO 
MADURACIÓN 
SEXUAL EN LA 
PUBERTAD 
VIRILIZACIÓN 
GENITALES 
EXTERNOS 
DIFERENCIACIÓN 
DE LOS CONDUCTOS 
DE WOLFF 
ESPERMATOGÉNESIS 
REGULACIÓN DE LAS 
GONADOTROPINAS 
HSP 
P P P P 
P 
12 
 
1.4. Receptor de Andrógenos 
El RA es una proteína que pertenece a la familia de factores 
transcripcionales dependientes del ligando, agrupado con el receptor de 
estrógenos (RE), el receptor de glucocorticoides (RG), el receptor de 
progesterona (RP) y el receptor de mineralocorticoides (RM) (Gronemeyer y 
Laudet, 1995). Este grupo de proteínas están relacionadas por la homología 
de su secuencia de aminoácidos (a.a.), la cual contiene una región de unión 
al DNA altamente conservada. Además activan la transcripción de genes 
blanco mediante elementos de respuesta a hormonas esteroides (ERE) 
(Gronemeyer y Laudet, 1995; Thornton y Kelley, 1998). 
El gen del RA (NR3C4) se encuentra localizado en la región 
pericéntrica del cromosoma X en la posición q11-q12 de monotremas, 
marsupiales y mamíferos euterios (Lubahn et al. 1988; Chang et al. 1988; 
Spencer et al. 1991) (ver fig. 4a). El gen NR3C4 está constituido por ocho 
exones designados de la A-H o 1-8 y separados por siete intrones. La región 
codante es de 2757 pares de bases (pb) que codifican para una proteína de 
919 a.a. con un peso molecular de 114 kDa (Quigley et al. 1995) (ver fig. 
4b). 
La región promotora del gen NR3C4 está localizada aproximadamente 
a 1100 pb en dirección 5´ del codón de inicio de la traducción. El análisis de 
secuencia de esta región ha demostrado que el gen NR3C4 no presenta las 
típicas cajas TATA o CAAT. No obstante esto, contiene secuencias ricas en 
13 
 
GC, en donde pueden unirse al factor de transcripción SP1 (Tilley et al. 
1990; Faber et al. 1993). 
El RA está estructuralmente dividido en cuatro dominios funcionales: 
un dominio N-terminal (DNT, 1-537 a.a.) que es variable y específico de 
cada receptor, un dominio de unión al DNA (DUD, 538-625 a.a.) altamente 
conservado, una región bisagra (626-669 a.a.) y un dominio de unión al 
ligando (DUL, 670-919 a.a.) (Quigley et al. 1995) (ver fig. 4c). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Representación esquemática del receptor de andrógenos (RA), en el que se indica 
la posición en el cromosoma X (a), la organización estructural del gen (b) y la proteína (c). 
14 
 
El exón 1 codifica para el DNT y comprende más de la mitad del RA. 
Contiene una región de activación transcripcional independiente del ligando 
(AF1) que se encarga de regular la actividad transcripcional de genes blanco 
(McEwan, 2004). Además presenta un número amplio de a.a. 
homopoliméricos que son altamente polimórficos (Faber et al. 1989). Uno de 
ellos, la región de poliglutaminas (codificado por el triplete CAG) localizada 
cerca del extremo amino-terminal con un promedio de 21 ± 2 residuos de 
glutamina. La región de poliprolinas que se localizan aproximadamente entre 
los a.a. 372-379 y no varía en tamaño. Particularmente, estas regiones de 
a.a. pueden ser importantes para la regulación transcripcional por interacción 
proteína-proteína con otros factores de transcripción (Geber et al. 1994). 
Los exones 2 y 3 codifican para el DUD que es responsable de la 
unión a los ERA del gen blanco (Claessens et al. 2001; Verrijdt et al. 2003) y 
está involucrado en la dimerización del receptor (Glass, 1994). La integridad 
estructural y funcional del DUD lo conforman dos dedos de zinc, formados 
cada uno por cuatro residuos de cisteínas conservadas unidas de forma 
tetraédricas a un ión de Zn+2 (ver fig. 5) (Gelmann, 2002). El primer dedo de 
zinc, codificado por el exón 2, es responsable de la unión a los ERA por 
reconocimiento específico de bases mediante una extensión de cinco a.a. 
(GSCKV) denominada “caja-P”, la cual determina la especificidad de unión al 
gen blanco. Dentro del segundo dedo de zinc, codificado por el exón 3, se 
encuentra una región de cinco a.a. (ASRND) denomida “caja-D” que 
estabiliza la unión del complejo por interacciones hidrofóbicas con el primer 
15 
 
dedo para regular la dimerización del receptor durante su asociación con el 
DNA (Claessens et al. 2001; Centenera et al. 2008). 
 
Figura 5. Integridad estructural del DUD. Dedos de zinc formados cada uno por cuatro 
residuos de cisteínas unidas de forma tetraédricas a un ión de Zn+2 (Tomado de: Centenera et 
al. 2008). 
Entre el dominio de unión al DUD y el DUL se localiza la región 
bisagra, codificada por la región 5´ del exón 4. Contiene las señales de 
internalización nuclear (NLS), las cuales regulan la transferencia del RA 
desde el citoplasma a los sitios de acción en el núcleo (Jenster et al. 1993; 
Tanner et al. 2004). Una vez expuestas las NLS, la serina 650 de la región 
bisagra es fosforilada por cinasas para mediar la translocación del RA al 
núcleo; además esta serina es requerida para la actividad transcripcional del 
RA (Zhou et al. 1995). Haelens et al. determinaron que los a.a. 629-636 de la 
región bisagra también son importantes en la localización nuclear, 
interacción con proteínas e interacción amino y carboxilo terminal (N-/C-
terminal) (Haelens et al. 2007). Asimismo, la región bisagra está involucrada 
en la degradación proteosomal del RA, mediante una secuencia de a.a. 
denominada PEST (rico en prolinas (P), ácido glutámico (E), serina (S) y 
16 
 
treonina (T)) localizada entre los a.a. 638 y 658 (Tanner et al. 2004; Bennet 
et al. 2010). 
El extremo 3´ del exón 4 y los exones 5 al 8 codifican el DUL, 
localizado en la región carboxilo-terminal. La integridad estructural del DUL 
la conforman 12 α-hélices (H1-H12) y dos cadenas β antiparalelas (S1 y S2) 
(Matias et al. 2000). Contiene una región de activación transcripcional 
denominada AF2, cuya actividad de transactivación depende de la unión al 
ligando. Esta región es importante para la unión de proteínas coactivadoras 
con secuencias conservadas LXXLL (Bevan et al. 1999, He et al. 2004). La 
función principal del DUL es la especificidad y afinidad de unión a los 
andrógenos. Asimismo, el DUL regula la asociación a HSP, la dimerización y 
la señalización de localización nuclear por interacción con el DNT 
(Centenera et al. 2008; Heinlein y Chang, 2002). 
Posterior a la clonación del cDNA del gen NR3C4 de humanos 
(Lubahn et al. 1988, 1989; Chang et al. 1988) se han descrito una gama de 
mutaciones estructurales y recopiladas en la base de datos 
http://www.androgendb.mcgill.ca (Gottlieb et al. 2012). Las mutaciones 
identificadas comprenden desde deleciones e inserciones (Vilchis et al. 
2003) a mutaciones de una sola base que introduce codones de terminación 
prematuros o cambios de a.a., asimismo se han reportado mutaciones 
intrónicas o aberraciones en el empalme del mRNA (Gottlieb et al. 1996). 
Las mutaciones en el gen NR3C4 han sido asociadas al Síndrome de 
Insensibilidad a Andrógenos, un tipo de desorden 46,XY que se manifiesta 
con anormalidades en la diferenciación sexual masculina. 
http://www.androgendb.mcgill.ca/
17 
 
1.5. Síndrome de Insensibilidad a Andrógenos 
El Síndrome de Insensibilidad a Andrógenos (AIS) es un desorden 
con un gran espectro de anomalías fenotípicas en la diferenciación sexual y 
que se clasifica dentro de los Desordenes del Desarrollo Sexualen 
individuos con cariotipo 46,XY (46,XY DSD) (Mendonca et al. 2009; Barbaro 
et al. 2011; Ono y Harley, 2013). 
La etiología básica del AIS está ligada a una pérdida en la función del 
RA, originada por mutaciones en el gen NR3C4 y que se hereda de manera 
recesiva ligado al cromosoma X (Sultan et al. 2002). Las mutaciones 
reportadas en el gen NR3C4 han sido clasificadas dentro de dos subgrupos 
clínicos basados en el fenotipo genital: Síndrome de Insensibilidad a 
Andrógenos Completa (CAIS) y Síndrome de Insensibilidad a Andrógenos 
Parcial (PAIS) (Quigley et al. 1995). 
El CAIS, conocido anteriormente como feminización testicular, se 
caracteriza por presentar nula actividad en el RA, por lo que generalmente 
se desarrolla un fenotipo femenino a pesar de la presencia de un cariotipo 
46,XY. Los individuos afectados manifiestan genitales externos femeninos 
en ocasiones con poco desarrollo de clítoris, labios mayores o menores y 
vagina en fondo de saco ciego. Además presentan testículos en posición 
bilateral intra-abdominal o en el canal inguinal por lo que frecuentemente 
presentan hernias antes de la pubertad o amenorrea primaria después de la 
pubertad y en la mayoría de los casos carecen de vello púbico, axilar y acné 
18 
 
(Quigley et al. 1995; Hughes y Deeb, 2006; Oakes et al. 2008; Hughes et al. 
2012). 
El PAIS tiene una expresión fenotípica altamente variable que implica 
una respuesta biológica a los andrógenos en términos del desarrollo genital 
masculino. Los individuos presentan dos fenotipos, uno predominantemente 
femenino con clitoromegalia, fusión labial posterior y ginecomastia de grados 
variables y otro predominantemente masculino con hipospadias 
penoescrotales, genitales externos reducidos (micropene) y un escroto bífido 
(Quigley et al. 1995; Hughes y Deeb, 2006; Hughes et al. 2012). 
Endocrinológicamente, los pacientes con AIS presentan un 
incremento de T y LH comparado con el rango de normalidad para el sexo 
masculino. El incremento de LH, como consecuencia de la insensibilidad 
hipotálamo-hipofisaria a los andrógenos produce un incremento de la 
producción de T y estrógenos por las células de Leydig (Brinkmann, 2001; 
Hughes y Deeb, 2006). La producción de AMH por las células de Sertoli se 
mantiene normal; aunque, en algunos casos de CAIS, se han descrito restos 
Müllerianos y síntesis inadecuada de AMH (Van et al. 2003). Mientras que el 
desarrollo de estructuras Wolffianas (epidídimo y vasos deferentes) puede 
generarse debido a una actividad residual del RA (Hannema et al. 2004). 
 
 
 
19 
 
 
 
 
 
2. JUSTIFICACIÓN 
Los DSD son un conjunto de anomalías congénitas en las cuales el 
sexo cromosómico, gonadal o fenotípico es anormal. El AIS es la causa más 
común de los DSD en individuos 46,XY y se caracteriza por una falta de 
respuesta a los andrógenos en las células blanco debido a una falla en el 
funcionamiento del RA, originada por mutaciones en el gen NR3C4. Los 
pacientes con AIS constituyen un modelo natural para elucidar los efectos 
moleculares del RA en la diferenciación sexual masculina para la 
elaboración de un mapa estructura-función del RA, el cual provee 
información útil para poder establecer una correlación genotipo-fenotipo 
correspondiente del AIS. 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. OBJETIVO 
Determinar y caracterizar mutaciones en el gen NR3C4 en individuos 
46,XY con DSD y asociarlas como causa molecular de AIS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
4. METODOLOGÍA 
4.1. Pacientes 
En este trabajo se estudiaron dos pacientes con DSD 46,XY 
asociados a AIS. El paciente 1 de 33 años de edad manifiesta amenorrea 
primaria con desarrollo mamario en Tanner V, genitales externos femeninos 
y ausencia de vello axilar y púbico. El paciente refiere presentar dos 
hermanas con amenorrea primaria. El ultrasonido revela ausencia de útero. 
Los niveles de T sérica fueron de 5.2 pg/mL, LH 33.2 muI/mL, FSH 10.5 
muI/mL, estradiol 16.2 pg/mL. 
El paciente 2 de 7 meses de edad presenta ambigüedad genital 
desde el nacimiento sin antecedentes de consanguinidad. El paciente 
presenta micropene e hipospadias penoescrotales con testículos palpables 
en bolsas hipoplásicas. La cistouretrografía mostró una vejiga normal con 
orina residual y con uretra corta de características femeninas. Niveles 
normales de T (195 pg/mL), LH y FSH. 
 
 
 
 
 
22 
 
4.2. Extracción del DNA genómico 
Se extrajo DNA genómico a partir de sangre periférica de individuos 
control y de individuos 46,XY DSD asociados a AIS, mediante la técnica de 
Sacarosa-Tritón. Se tomaron 10 mL de sangre en tubos cónicos estériles de 
50 mL con 200 µL de etilendiamina tetra acetato (EDTA) al 0.5 Molar (M) (pH 
8). Los tubos se colocaron sobre hielo y se agregaron 35 mL de solución fría 
de Sacarosa Tritón 2X. La mezcla se llevó a 50 mL con agua destilada-
desionizada (ddH2O), se mezcló por inversión y se dejaron reposar durante 
10 minutos (min). Posteriormente se centrifugaron a 1000 xg por 15 min a 4 
°C. El sobrenadante se decantó y se conservó el precipitado. 
Los precipitados obtenidos se suspendieron en 3 mL de solución de 
Lisis Nuclear, 108 µL de Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al 20% y 100 µL de 
proteinasa K. Se mezclaron y se colocaron en una incubadora con agitador 
(Incubator Shaker II 136400, Boekel, Industries Inc.) a 50 °C durante un 
mínimo de 2 horas (hrs). Terminada la incubación se transfirió el contenido 
en tubos cónicos estériles de 15 mL, se agregó a cada tubo 1 mL de NaCl 
saturado y se agitó vigorosamente durante 15 segundos (seg). 
Posteriormente se centrifugaron a 1000 xg durante 15 min. El sobrenadante 
se transfirió a tubos cónicos estériles de 15 mL utilizando una pipeta de 
plástico estéril desechable para cada tubo, se agregaron 2 volúmenes de 
etanol absoluto y se mezcló por inversión hasta que el DNA precipitó. 
El DNA precipitado se extrajo con una pipeta Pasteur estéril, se lavó 
con etanol al 70% durante 30 seg y se dejó secar por aproximadamente 30 
23 
 
seg. El DNA seco se introdujo en tubos de microcentrífuga de 500 µL con 
200 µL de amortiguador Tris-EDTA (TE) (pH 7.6). El DNA aislado se dejó 
disolver a temperatura ambiente y se cuantificó espectrofotométricamente 
mediante el equipo Synergy HT, BiotekR y el programa Gen 5 1.11 (260 
nm=concentración y 260/280=pureza). (Ver apéndice A). 
4.3. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
El DNA obtenido se utilizó como templado para amplificar los ocho 
exones que conforman el gen NR3C4 mediante PCR, utilizando 
oligonucleótidos específicos para cada uno de los exones (ver Tabla 1). Los 
oligonucleótidos fueron diseñados en el programa PrimerQuest 
(http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/) de acuerdo a la 
secuencia reportada por Lubahn et al. 1989 con algunas modificaciones. 
Las reacciones de PCR se realizaron en tubos de 0.5 mL de pared 
delgada que contenían: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 2 µM de cada 
desoxiribonucleótido trifosfato (dNTPs), 10 µM de cada oligonucleótido (5´y 
3´), 2.0 U de DNA Taq polimerasa (Perkin Elmer, Branchburg, NJ, USA), 1.5 
mM de MgCl2, 1% v/v de dimetil sulfóxido (DMSO), 0.3 µL [α-32P] (3000 
Ci/mmol; 1Ci=37 MBq) y 1.5 µL de DNA de cada muestra. La reacción se 
llevó a un volumen final de 25 µL con ddH2O. Esta mezcla fue sometida a 
una desnaturalización inicial a 94 °C por 1 min, seguido de 30 ciclos de 
amplificación a 94 °C por 30 seg, alineamiento entre 58 °C y 65 °C 
(dependiendo del exón, ver Tabla 1) por 30 seg y extensión a 72 °C por 30 
seg mediante el equipo Veriti 96 Well Thermal Cycler, Applied Biosystems. 
http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/
24 
 
Finalizadas las reacciones de PCR, el tamaño de los amplicones 
fueron determinados sometiendo los productos a electroforésis a 100 Volts 
(V) en geles de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (ver apéndice B) 
ycomparadas con un marcador de peso molecular (MPM) de 100 pb para 
confirmar la talla esperada (entre 200 y 300 pb). En cada pozo del gel se 
depositaron alícuotas de 5 µL de los productos de PCR y fueron mezclados 
con 3 µL del amortiguador de carga. La visualización de los geles se llevó 
acabo en un transluminador de rayos Ultra-Violeta (UV) (Molecular Imager, 
ChemiDoc XRS+Imaging System, BioRadR, programa ImageLab 4.1). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
25 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la amplificación de cada exón del gen NR3C4, con 
sus respectivas temperaturas de alineamiento (Tm). La amplificación del exón 1 se realizó en 
4 reacciones independientes. 
 
 
 
Exón Secuencia Temperatura (Tm) 
1/A 5´GCC TGT TGA ACT CTT CTG AGC 
GCT GTG AAG GTT GCT GTT CCT C 3´ 
65 °C 
1/A 5´CAC AGG CTA CCT GGT CCT GG 
CTG CCT TAC ACA ACT CCT TGG C 3´ 
65 °C 
1/A 5´GCT CCC ACT TCC TCC AAG GAC 
CGG GTT CTC CAG CTT GAT GCG 3´ 
65 °C 
1/A 5´GTC GCG TAC CAG AGT CGC GAC TAC 
CTG GGA TAG GGC ACT CTG CTC ACC 3´ 
65 °C 
2/B 5´AGG TTA ATG CTG AAG ACC 
TT TGA TAG GGC CTT GCC A 3´ 
58 °C 
3/C 5´GTT TGG TGC CAT ACT CTG TCC AC 
CTG ATG GCC ACG TTG CCT ATG AA 3´ 
58 °C 
4/D 5´GGA GTT TAG AGT CTG TGA CCA GG 
GAT CCC CCT TAT CTC ATG CTC CC 3´ 
58 °C 
5/E 5´CAA CCC GTC AGT ACC CAG ACT G 
AGC TTC ACT GTC ACC CCA TCA C 3´ 
58 °C 
6/F 5´CTC TGG GTC TAT TGG TAA ACT TCC 
GTC CAG GAG CTG GCT TTT CCC TA 3´ 
60 °C 
7/G 5´CTT TCA GAT CGG ATC CAG CTA TCC 
CTC TAT CAG GCT GTT CTC CCT GAT 3´ 
62 °C 
8/H 5´GAG GCC ACC TCC TTG TCA ACC CTG 
GGA ACA TGT TCA TGA CAG ACT GTA C 3´ 
60 °C 
26 
 
4.4. Análisis del Polimorfismo Conformacional de Cadena Sencilla 
(SSCP) 
Para identificar posibles mutaciones en el gen NR3C4 se realizaron 
los ensayos de SSCP (Orita et al. 1989). Se tomó 1 µL de los productos 
amplificados por PCR y se mezclaron con 14 µL de amortiguador de carga 
para SSCP. Las muestras fueron desnaturalizadas a 94°C por 5 min 
(Thermal Cycler 480, Perkin Elmer) y sometidas a electroforésis en geles de 
poliacrilamida a diferentes concentraciones (5.4% y 8%) (30 x 40 x 0.03 cm). 
La electroforésis se llevó a cabo a 200 V durante 16 hrs en cámaras 
electroforéticas verticales utilizando como solución de corrida Tris- ácido 
bórico-EDTA 0.5X (TBE). Para obtener una mayor sensibilidad en la 
detección de mutaciones en el estudio de SSCP se realizó una electroforésis 
a 250 V en geles de poliacrilamida 5.4% y 8% con glicerol. (Ver apéndice C). 
Terminada la electroforésis, los geles se transfirieron en papel 
Whatman 3MM y fueron secados durante 1 hr a 75°C (Slab Gel Dryer 4050, 
SAVANT). Los geles fueron expuestos en una pantalla para radioisótopos 
(Molecular Imager FXTM, Imaging screen-K, BioRadR) por 3 hrs y analizados 
en un escáner de imágenes (PMI Personal Molecular Imager, BioRadR, 
programa QuantityOne 4.6). 
 
27 
 
4.5. Purificación de DNA por Electroelución 
Los exones con alteraciones (patrón de corrimiento electroforético 
diferente a los controles) fueron amplificados nuevamente mediante PCR. 
Los amplicones se sometieron a electroforésis en un gel de agarosa al 1% 
teñido con bromuro de etidio. Terminada la electroforésis, los amplicones 
con el tamaño esperado fueron cortados del gel. Los fragmentos de gel se 
colocaron en membranas de diálisis (previamente lavadas con ddH2O y 
equilibradas con amortiguador TBE 0.5X) y se adicionaron 300 µL de 
amortiguador TBE al 0.5X. Las membranas se sometieron a una 
electroelución durante 15 min a 100 V utilizando como solución de corrida 
TBE 0.5X. El DNA obtenido se depositó en columnas AmiconR Ultra-4 de 30 
kD. Se adicionaron 2 mL de ddH2O a las columnas y se centrifugaron a 4000 
xg por 10 min a 4 °C. 
El DNA purificado fue analizado en un gel de agarosa al 1% teñido 
con bromuro de etidio y cuantificado espectrofotométricamente mediante el 
equipo Synergy HT, BiotekR y el programa Gen 5 1.11 para verificar su 
concentración y pureza (260 nm=concentración y 260/280=pureza). 
 
 
 
 
28 
 
4.6. Secuenciación del gen NR3C4 
Los exones purificados con alteraciones fueron analizados mediante 
secuenciación (secuenciador automático ABI-PRISM 310 Genetic Analyzer; 
Applied Biosystems, Foster City, CA) usando el estuche de secuenciación 
BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems). Las secuencias obtenidas 
fueron comparadas con las secuencias de los controles y con la secuencia 
de referencia (NM_000044.2) obtenida en el NCBI (National Center for 
Biotechnology). Las mutaciones encontradas fueron confirmadas en ambos 
sentidos al menos dos veces en dos reacciones de PCR independientes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
5. RESULTADOS 
El análisis mutacional de la región codante del gen NR3C4 en 
pacientes 46,XY DSD asociados a AIS se inició con la amplificación 
mediante PCR de cada uno de los exones que conforman el gen. Esto se 
llevó a cabo usando una serie de oligonucleótidos específicos diseñados a 
partir de la secuencia intrónica adyacente a la zona de corte y empalme de 
cada exón. Los productos de PCR sometidos a ensayos electroforéticos en 
geles de agarosa al 1% y comparados con un MPM de 100 pb demostraron 
la amplificación de cada uno de los exones y un tamaño esperado entre 200 
y 300 pb similar a los controles (ver fig. 6). A partir de esto se descartó la 
presencia de una deleción o inserción grande de nucleótidos en el DNA. 
 
Figura 6. Esquema representativo de 6 de los 8 exones de uno de los pacientes con AIS (P) e 
individuos controles (C). MPM de 100 pb. 
 
 
MPM 
MPM MPM C C P P P P P P 
30 
 
Los productos de PCR fueron analizados mediante ensayos de SSCP 
en geles de poliacrilamida a diferentes concentraciones (5.4% y 8% con y sin 
glicerol). Los resultados revelaron alteraciones en la movilidad electroforética 
sólo en algunos de los exones analizados del gen NR3C4 de los pacientes 
diagnosticados clínicamente con AIS. El paciente 1 diagnosticado 
clínicamente con CAIS presentó una alteración en el exón 6, a una 
concentración 5.4% con glicerol (ver fig. 7). Mientras que el paciente 2 
diagnosticado clínicamente con PAIS presentó una alteración en el exón 8 a 
una concentración 5.4% sin glicerol (ver fig. 8). 
El análisis de secuenciación nucleotídica de los exones alterados 
determinaron dos diferentes mutaciones puntuales con sustitución de a.a. El 
paciente 1 con alteración en el exón 6 presentó una transición de timina a 
citocina (T>C) en la posición 2374 del DNA, la cual generó un cambio en el 
codón 792 de serina (TCT) a prolina (CCT) (ver fig. 9). Mientras que el 
paciente 2 con alteración en el exón 8 presentó una transición de adenina a 
guanina (A>G) en posición 2716 del DNA con cambio de lisina (AAG) a 
ácido glutámico (GAG) en el codón 906 (ver fig. 10). Ambas mutaciones se 
presentaron en el DUL dentro de las α-helices 6 y 12 respectivamente (ver 
fig. 11). Los resultados experimentales obtenidos se encuentran resumidos 
en la tabla 2. 
 
 
31 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Patrón de migración electroforética del exón 6 del gen NR3C4 del paciente 1 con 
CAIS (P1) e individuos control (C). SSCP en gel de poliacrilamida a una concentración 
5.4% con gicerol. 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Patrón de migración electroforética del exón 8 del gen NR3C4 del paciente 2 con 
PAIS (P2) comparado con el patrón de migración de la madre (M) e individuos control (C). 
SSCP en gel de poliacrilamida a una concentración 5.4% sin gicerol. 
P2 
P1 C C 
C C C C M 
32 
 
I) Secuencia control 
 
 
 
 
II) Secuencia mutada 
 
 
 
 
 
Figura 9. Análisis de secuenciación nucleotídica del exón 6 del gen NR3C4. I) Secuencia de 
DNA parcial de un individuo normal utilizado como control. II) Secuencia de DNA parcial 
del paciente 1 con CAIS. Se indica mediante una flecha la posición de sustitución del 
nucleótido. 
 
 
 
 
TCT-CCT 
33 
 
III) Secuencia controlIV) Secuencia mutada 
 
 
 
 
 
Figura 10. Análisis de secuenciación nucleotídica del exón 8 del gen NR3C4. III) Secuencia 
de DNA parcial de un individuo normal utilizado como control. IV) Secuencia de DNA 
parcial del paciente 2 con PAIS. Se indica mediante una flecha la posición de sustitución del 
nucleótido. 
 
 
 
AAG-GAG 
34 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Modelo tridimencional del DUL del RA. El esquema representativo muestra la 
ubicación de las sustituciones de a.a. reportadas dentro de las 12α-hélices que comprenden el 
DUL. La mutación S792P (círculo verde) se encuentra localizada en la α-hélice 6, mientras 
que la mutación K906E (círculo amarillo) se localiza en la α-hélice 12. Modelo por Dr. JH 
Wu. (http://androgendb.mcgill.ca/). 
Tabla 2. Resumen de las mutaciones determinadas mediante los ensayos de SSCP y el 
análisis de secuenciación del gen NR3C4 en sujetos con AIS. 
 
 
 
Codón Mutación Cambio 
a.a 
DNA 
genómico 
cDNA Exón Fenotipo 
TCT-CCT p.Ser792Pro S792P 3489 T>C c.2374T 6/F CAIS 
AAG-GAG p.Lys906Glu K906E 3831 A>G c.2716A 8/H PAIS 
 
S792P 
 
K906E 
http://androgendb.mcgill.ca/
35 
 
6. DISCUSIÓN 
La diferenciación sexual y el mantenimiento de la función reproductiva 
en individuos 46,XY depende conjuntamente de la biosíntesis de andrógenos 
(Vilchis et al. 2010; Chávez et al. 2001, 2014) y de la presencia de un RA 
funcional, codificado por el gen NR3C4. Asimismo, la determinación y 
caracterización de mutaciones en el gen NR3C4 en humanos es muy 
importante ya que permite elucidar las bases moleculares que subyacen la 
heterogeneidad bioquímica y clínica del AIS (Quigley et al. 1995). 
Actualmente más de 800 mutaciones en el gen NR3C4 causantes del 
AIS han sido descritas y recopiladas en la base de datos 
http://www.androgendb.mcgill.ca (Gottlieb et al. 2012). Aproximadamente 
dos tercios de los defectos moleculares han sido mutaciones puntuales con 
sustitución de un a.a. y comúnmente identificadas en el DUL y en el DUD. 
Alrededor del 28% son mutaciones que introducen codones de terminación 
prematura, así como pequeñas deleciones o inserciones de 1 a 4 pb (Vilchis 
et al. 2003) y generalmente este tipo de mutaciones han sido reportadas en 
el DNT. Un menor porcentaje se atribuye a mutaciones intrónicas o 
aberraciones en el empalme del mRNA, así como deleciones o inserciones 
grandes de nucleótidos en el DNA, las cuales son mayormente asociadas a 
fenotipos de CAIS (Jääskeläinen, 2012; Gottlieb et al. 2012). Por otra parte, 
se han encotrado casos de AIS asociados a un mosaicismo somático en el 
gen NR3C4 (Holterhus et al. 1997; Gottlieb et al. 2001; Köhler et al. 2005). 
Asimismo, Adachi et al. reportaron un caso especial de AIS debido a la 
http://www.androgendb.mcgill.ca/
36 
 
deficiencia de un coactivador esencial para la función óptima del RA (Adachi 
et al. 2000). 
En el presente estudio se identificaron y caracterizaron dos 
mutaciones puntuales no reportadas en la literatura. En los ensayos de 
SSCP (fig 7-8) se pueden observar las bandas diferenciales asociadas a la 
aparición de las mutaciones en los exones 6 y 8 del gen NR3C4. Ambas 
mutaciones son localizadas dentro del DUL. Diversos reportes han 
mencionado que mutaciones en el DUL pueden inducir anormalidades en la 
unión a los andrógenos, la dimerización del receptor, la actividad 
transcripcional y las interacciones del RA con sus coreguladores (Chávez et 
al. 2001; Raicu et al. 2008). 
El paciente 1 presentó una mutación de novo de Ser792→Pro en el 
exón 6 del gen NR3C4 (fig. 9). Esta mutación originó en el paciente un 
fenotipo característico de CAIS, lo que indica que esta posición es de 
relevancia funcional para el RA. Algunos reportes han señalado que 
mutaciones en esta región son mayormente asociadas con CAIS, debido a 
que a.a. en estos sitios pueden contribuir con la estabilidad relativa de la 
cavidad de unión al ligando (Rosa et al. 2002; Raicu et al. 2008). Es 
probable que la mutación identificada generó una desorganización 
conformacional debido a la rigidez de la estructura cíclica del residuo prolina 
que impide establecer puentes de hidrógeno con otros a.a. que mantienen la 
estabilidad relativa en la cadena polipéptidica (Mongan et al. 2002; Raicu et 
al. 2008). Esto es consistente con la observación de mutaciones de 
sustitución de a.a. por prolina dentro del DUL son asociadas a fenotipos de 
37 
 
CAIS (Mongan et al. 2002; Rosa et al. 2002; Jääskeläinen et al. 2006a; 
Raicu et al. 2008). 
El paciente 2 presentó la mutación Lys906→Glu en el exón 8 del gen 
NR3C4 (fig 10). En este caso la capacidad de unión al ligando al parecer no 
fue totalmente anulada, ya que el paciente desarrolló cierto grado de 
virilización. Es posible que la mutación esté asociada a alteraciones 
cualitativas (incremento en la velocidad de disociación e inestabilidad 
térmica) y pueda conducir indirectamente a una disminución en la actividad 
transcripcional de genes andrógeno-dependientes. El residuo Lys906 se 
localiza dentro de la α-hélice 12 del DUL, la cual es importante para la 
interacción N-/C-terminal (He et al. 1999; He y Wilson, 2002). Mutaciones 
reportadas dentro α-hélice 12 del DUL han demostrado una alteración en la 
interacción N-/C-terminal y una rápida disociación del ligando (He et al. 
1999; Thompson et al. 2001; Jääskeläinen et al. 2006b). Asimismo, 
evidencias experimentales han determinado que la interacción N-/C-terminal 
no sólo es importante para mantener la estabilidad del complejo andrógeno-
receptor; sino también es esencial para la activación transcripcional 
(Callewaert et al 2003), la dimerización y el reclutamiento de proteínas 
coreguladoras (Lim et al. 2000; He et al. 2001; Ghali et al. 2003; Quigley et 
al. 2004). Por lo tanto, la interacción N-/C-terminal puede ser un mecanismo 
importante para explicar la patogenicidad de este paciente. 
Estos resultados incrementan el número de mutaciones en el gen 
NR3C4 y determinan sitios de alta incidencia mutacional (hotspots). Además 
sirven como punto de partida para realizar los estudios funcionales que 
38 
 
permitirán confirmar los mecanismos y patologías de las diversas formas del 
AIS, así como los cambios estructurales en el RA (Audi et al. 2010). El 
conocimiento de la relación estructura-función del RA provee información útil 
para poder establecer un tratamiento y asignamiento del sexo (Sultan et al. 
2002), así como una correlación genotipo-fenotipo correspondiente del AIS 
(Boehmer et al. 2001). Sin embargo, a pesar del número de mutaciones 
reportadas en el gen NR3C4 la relación genotipo-fenotipo no ha sido 
determinada, debido a que se ha visto que mutaciones idénticas pueden 
mostrar fenotipos muy variables, incluso dentro de una misma famila (Rodien 
et al. 1996; Holterhus et al. 2000; Boehmer et al. 2001); por otro lado, 
diferentes mutaciones pueden dar el mismo fenotipo. Esto sugiere que otros 
factores están contribuyendo en la variabilidad fenotípica, tales como las 
diferencias funcionales de las proteínas coreguladoras (Zenteno et al 2002; 
Deep et al. 2005). 
En conclusión, la caracterización de nuevas mutaciones en el gen 
NR3C4 sirve como herramienta para poder establecer la correlación 
genotipo-fenotipo correspondiente del AIS, lo que permite adicionar nuevas 
perspectivas para nuestro entendimiento del papel del RA en la acción de 
andrógenos y como consecuencia en los efectos moleculares en la 
diferenciación sexual. 
 
 
 
39 
 
APÉNDICE A: Amortiguadores y soluciones para la extracción de DNA 
Etilendiamina tetra acetato (EDTA) 
Na2EDTA 0.5 M………….186.1 g 
Llevar a pH de 8.0 y aforar a 1 L. Esterilizar en autoclave. 
Amortiguador Tris-EDTA (TE) 
Tris-HCl 10mM …………....1mL 
EDTA 1mM ……………..0.2 mL 
Llevar a 100 mL con ddH2O. Mezclar por inversión. 
Solución de lisis nuclear 
Tris-Base 10 mM…………1.21 g 
NaCl 400 mM……………..23.4 g 
Na2EDTA2 mM ………….0.75 g 
Llevar a pH de 8.2 y aforar a 1 L. Esterilizar en autoclave. 
Sacarosa-Tritón 2X 
Sacarosa 0.64 M ……….219.0 g 
Tris-Base 0.02 M ………...2.42 g 
MgCl2 0.01 M ……………..0.95 g 
Tritón X100 (2%) ………... 20 mL 
Llevar a un pH de 7.6 y aforar a 1 L. Esterilizar por filtración. Almacenar la 
solución a 4 °C. 
40 
 
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) 
SDS (20%).………………200 g 
ddH2O………………………1 L 
Esterilizar por filtración. 
Proteinasa K 
Pesar 5 mg y disolver en 1 mL ddH2O. Guardar alícuotas de 500 µL a -20 °C. 
(Estable 6meses). 
NaCl saturado 
NaCl ………………….. 350 g 
Llevar a 500 mL con ddH2O. Esterilizar en autoclave. 
 
APÉNDICE B: Preparación de gel de agarosa al 1% 
Pesar 1 g de Agarosa y disolverla en 100 mL de solución TBE 0.5X (ver 
apendice C) mediante calentamiento. Dejar enfriar hasta aproximadamente 
40 °C y agregar 0.7 µL de bromuro de etidio, mezclar y vaciar en el molde de 
la cámara de electroforésis horizontal; previamente montada y puesto el 
peine. Dejar solidificar. Después de la solidificación, quitar el peine y 
enjuagar los pozos con solución TBE 0.5X hasta cubrir el gel. 
 
 
 
41 
 
APÉNDICE C: Amortiguadores y soluciones para el estudio de SSCP 
Amortiguador de carga para SSCP 
Formamida………………..95% v/v 
EDTA………………………..20 mM 
Azul de bromofenol…….0.05% p/v 
Llevar al 100% con ddH2O 
Amortiguador Tris, Acido bórico, EDTA (TBE) 
TBE 5X Cf (1X) 1 L 
Tris-base (89 mM) 54 g 
Ácido bórico (89 mM) 27.5 g 
EDTA 0.5 M (2 mM) 20 ml 
Esterilizar por filtración. Almacenar la solución a temperatura ambiente. 
Acrilamida:bisacrilamida 
Acrilamida 29 % 
N,N´-metilen-bis-acrilamida 1% 
Llevar a pH 6-6.5 y aforar a 100 mL. Esterilizar por filtración y almacenar a 
temperatura ambiente. 
Persulfato de Amonio (10% m/v) 
Pesar 0.1 g de persulfato de amonio (PSA) y diluido en 1 ml de ddH2O. 
 
42 
 
 
 
Preparación de geles de poliacrilamida 
Tabla 3. Preparación del gel de poliacrilamida 5.4 y 8% sin glicerol a un volumen 
total de 70 mL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Preparación del gel de poliacrilamida 5.4% y 8% con glicerol a un volumen 
total de 70 mL. 
Gel de poliacrilamida con glicerol 
Reactivos Volumen total 70 mL 
5.4% 8% 
ddH2O 35.9 mL 29.85 mL 
Glicerol 7.0 mL 7.0 mL 
TBE 5X 14.0 mL 14.0 mL 
Acril/bis (29:1) 12.6 mL 18.66 mL 
PSA* 10% 0.49 mL 0.49 mL 
TEMED 24.5 µL 25 µL 
 
 
 
 
Gel de poliacrilamida sin glicerol 
Reactivos Volumen total 70 mL 
5.4% 8% 
H2Odd 42.9 mL 36.89 mL 
Glicerol ----------- ---------- 
TBE 5X 14.0 mL 14.0 mL 
Acril/Bis (29:1) 12.6 mL 18.66 mL 
PSA 10% 0.49 mL 0.49 mL 
TEMED 24.5 µL 25 µL 
43 
 
 
 
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	Portada
	Índice
	Resumen
	1. Introducción
	2. Justificación
	3. Objetivo
	4. Metodología
	5. Resultados
	6. Discusión
	Apéndice 
	Referencias