Analisis-proteomico-de-la-lnea-celular-Sk-Br-3-de-cancer-de-mama-con-previa-separacion-por-isoelectroenfoque-preparativo

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 Facultad de Estudios Superiores Iztacala 
 
 ANÁLISIS PROTEÓMICO DE LA LÍNEA CELULAR SK-BR-3 
 DE CÁNCER DE MAMA, CON PREVIA SEPARACIÓN 
 POR ISOELECTROENFOQUE PREPARATIVO 
 
 TESIS 
 Que para obtener el título de Bióloga 
 Presenta 
 Liliana Isabel López Garrido 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
Dedico este trabajo a mis papás, gracias por guiarme en toda esta trayectoria, por 
su cariño, su comprensión, por anteponer los estudios sobre otros gustos, pero 
sobre todo por su amor. Este trabajo es para ustedes. 
 
Y también se lo dedico a mi abuelita Celia que siempre ha sido una madre para 
mí, por todo su amor, por sus cuidados, por sus buenos deseos y por ser un 
ejemplo de vida a seguir. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi papá por el interés y compromiso para con mis estudios y por ayudarme en 
mis buenos y malos momentos, porque ves más allá de lo fundamental. 
 
A mi mamá porque me comprendes bien por ser tan similar a mí, por el amor que 
siempre me has dado, por esa enseñanza de ayudar a otros y el calor que le 
brindas a nuestro hogar. 
 
Gracias Sam porque sabes hacerme sonreír, siempre me has acompañado y eres 
parte fundamental de mi vida. 
 
Gracias Lalito por todo tu amor, mi vida, porque eres parte clave de este primer 
éxito y de los que vienen, por entenderme y apoyarme para lograr lo que me 
propongo, por esa energía que me transmites para realizarlo y por jugar esta 
aventura de la vida a mi lado. 
 
Agradezco especialmente al Dr. Juan Pedro ya que aparte de ser un excelente 
guía en el desarrollo de este proyecto, es una excelente persona y porque gracias 
a su apoyo, comprensión y amistad puedo completar esta etapa de mi vida. 
 
Gracias especiales a Mary por tu orientación en el laboratorio, tu amistad y 
disponibilidad de ayudarme, eres una persona sobresaliente tanto en lo personal, 
como en lo laboral. 
 
A los integrantes del laboratorio por ser para mí como una familia y no sólo un 
lugar de trabajo Karlita, Antonio, Igor, Benito, Paola, Mike, Fabiola, César, Carlitos, 
Erika, Roberto y José Carlos por su buena relación conmigo, por su sincera ayuda 
y más por su amistad porque me enseñaron que pueden encontrarse buenos 
amigos dejando atrás la idea de que la ciencia es un lugar inhóspito y competitivo. 
 
 
 
Gracias a mi mejor amigo Miau, porque eres una luz en mi camino, sé que cuento 
contigo indudablemente, gracias por animarme en los malos ratos, por todos esos 
buenos momentos y los que nos faltan, eres mi elemento secreto para lograrlo 
todo. Y a Tita, gracias por tu cariño, por tu confianza y por el buen equipo que 
hacemos los tres. 
 
Gracias a Chewy, Dafne y Mariana Pesi porque cómo imaginar una vida sin tantas 
risas y buenos ratos; Chewy porque aparte de la increíble persona que eres, 
siempre estás al pendiente de mí y me das el consejo adecuado; Daf y Pesi 
porque aparte de los buenos momentos, son unas excelentes amigas, gracias por 
permanecer en mi vida. 
 
Gracias a mis amiguis de la carrera Pelusa, Rita, Lupita y Tere porque fue 
indispensable su simpleza y trabajo para lograr cada etapa de la carrera y de una 
manera tan divertida como lo fue, son como hermanas para mí. 
 
Y a mis amigos de la carrera del grupo 2 que la hicieron más especial con sus 
simplezas Esleban, Ramsés, Ana, Fanny, Geovanni, César, Armando, Jhon y 
Polin por ustedes nunca dejé ese grupo. Y a los no tan viejos amigos Karlita, 
Mariana y toda la bola de fiesteros de Biología. 
 
A mi familia materna por ser una familia unida, a mi tía Irma por encaminarme y a 
todos mis primos, gracias a Nelly y Roso por su cercanía y cariño y a Chango por 
siempre estar conmigo y compartir el mismo sueño de la Biología. 
 
A mi familia paterna porque son parte de mi vida y mi fortaleza, gracias a mis 
primos Chucho, Genaro, Nelly, Roberto, Saúl, Tomy y Beto tanto por distraerme 
de los problemas y ayudarme con ellos, como por esa divertida actitud ante la 
vida. 
 
Todos son parte importante de mi vida y agradezco a Dios por ponerme en este 
preciso lugar con esta maravillosa gente y por darme la salud, fortaleza y el apoyo 
necesario para poder realizar mis metas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradezco las participaciones del Instituto de Ciencia y Tecnología del Distrito 
Federal (ICyTDF) por su apoyo al proyecto ICyTDF-J.L.A., y al Consejo Nacional 
de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por su apoyo al proyecto número 113674 
para la realización de esta Tesis Profesional, ambos bajo la responsabilidad del 
Dr. Juan Pedro Luna Arias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de Abreviaturas 
BAX Proteína X asociada a Bcl-2 
BCA Ácido bicinconínico 
Bcl-xl Linfoma de linfocitos B-extra largos 
Bcl-2 Linfoma 2 de linfocitos B 
BRCA1 Breast Cancer 1 
BRCA2 Breast Cancer 2 
CaMa Cáncer de mama 
CaCu Cáncer cérvico uterino 
CDIS Carcinoma ductal in situ 
CDKs Cinasas dependientes de ciclinas 
CLIS Carcinoma lobular in situ 
DTT: Ditiotreitol 
EGFR Factor de crecimiento epidérmico 
ESI Ionización por electro-spray 
ER Receptor de estrógenos 
erbB-2 / Her2 Receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico 
FGFs Factor de crecimiento de fibroblastos 
IEF: Isoelectroenfoque 
IAA: Iodoacetamida 
 kV Kilovoltio 
kD kiloDalton 
MALDI TOF-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight- time of 
flight. (Desorción/ionización láser asistida por matriz tiempo de 
vuelo - tiempo de vuelo). 
 
 
mA Miliamperios 
MS-MS Espectrometría de masas en tándem 
NCBI Centro Nacional para Información Biotecnológica 
NFKB Factor Nuclear kapa-potenciador-de cadena-ligera de linfocitos 
B 
NGF Factor de crecimiento de nervios 
NP40 Detergente nonidet P40 
m/z Masa-carga 
pI: Punto isoeléctrico 
p75 NTR Receptor de neurotrofina p75 
SK-BR-3 Línea celular que sobre-expresa el producto génico erbB2 
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato 
sódico 
TDLUs Unidades lobuladas del conducto terminal 
TrkA Receptor tipo 1 de la tirosina cinasa neurotrófica 
UniProt Fuente universal de proteínas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Índice de Figuras 
Figura 1. Anatomía de la mama ………………………………………..……………………………... 4 
Figura 2. Mortalidad por tumores malignos de mama en México…………….…. ……………..… 5 
Figura 3. Proporción de mujeres que recibieron tamizaje para cáncer de mama …………….... 8 
Figura 4. Tumor no invasivo del estadio I…………………………………………………………….. 11 
Figura 5. Estadio IIB del tumor……………………………………………………………...........…...... 12 
Figura 6. Estadio IIIB cáncer de mama inflamatorio…………………………………….………….. 13 
Figura 7. Metástasis…………………………………………………………………………………….. 15 
Figura 8. A. Principales componentes de un espectrómetro de masas 
 B. Esquema de MALDI TOF-TOF……………………………………….…………..…...... 28Figura 9. Vista interna del espectrómetro de masas 4800 Plus MALDI 
TOF/TOF™ analyzer…………………………..…………………………………………….………… 30 
Figura 10. Células de la línea celular SK-BR-3 40x…………………………………….……….… 43 
Figura 11. Curva patrón para obtener la cuantificación…………………………………..……… 44 
Figura 12. Gel de poliacrilamida del extracto total de proteína de SK-BR-3….…..………..…… 45 
Figura 13. a) Enfoque y b) Extracción de las proteínas en el MiniRotofor………………..……… 46 
Figura 14. Fracciones del MiniRotofor contra pH…………………..……………............................. 47 
Figura 15. Geles SDS_ PAGE de las 20 fracciones resultantes del IEF por MiniRotofor...…… 48 
Figura 16. Gel de poliacrilamida del extracto total de proteínas de SK-BR-3……………............ 50 
Figura 17. MicroRotofor BioRad……………………………………………………………………… 51 
 
 
Figura 18. Gradiente de pH de las fracciones obtenidas en el MicroRotofor…………..………… 52 
Figura 19. Enfoque de las fracciones obtenidas por el MicroRotofor……………………..………. 52 
Figura 20. Espectro de masa de las proteínas de la muestra 1 del sistema 
MiniRotofor……………………………………………………………………………………………...… 54 
Figura 21. Espectro de masa de las proteínas de la muestra 
obtenidas por el sistema MicroRotofor………………………………………………………………… 55 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10.2 Índice de Cuadros 
 
Cuadro 1. Muestra 1 del MiniRotofor (ProteinPilot) …………….…………………………………....…56 
Cuadro 2. Muestra 2 del MiniRotofor (ProteinPilot) ……………………………..…………………...…56 
Cuadro 3. Muestra 3 del MiniRotofor (ProteinPilot) ……………………………………..…….……..…57 
Cuadro 4. Muestra 4 del MiniRotofor (ProteinPilot) ……………………………………..……………...57 
Cuadro 5. Muestra 1-10 del MicroRotofor (ProteinPilot)……………………………………………..…57 
Cuadro 6. Función de las proteínas identificadas por ProteinPilot del 
MiniRotofor y MicroRotofor………………………………………………………………………….…...…59 
Cuadro 7. Muestra 1 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificados por MASCOT….………..60 
Cuadro 8. Muestra 2 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificados por MASCOT.…………..62 
Cuadro 9. Muestra 3 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT ………..…62 
Cuadro 10. Muestra 4 de 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT ………….….63 
Cuadro 11. Muestra 5 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT ……..…..63 
Cuadro 12. Muestra 6 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT….……....63 
Cuadro 13. Muestra 7 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT …..…..…65 
Cuadro 14. Muestra 9 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificados por MASCOT ……....…65 
Cuadro 15. Muestra 10 de las 10 fracciones del MicroRotofor identificadas por MASCOT ……......65 
Cuadro 16. Función de las proteínas del MicroRotofor Identificadas por MASCOT ……………...…66 
Cuadro 17. Muestra 1 del MiniRotofor (MASCOT)…….………………………………………………. ..72 
Cuadro 18. Muestra 2 del MiniRotofor (MASCOT)…………………………………………................ ..72 
Cuadro 19. Muestra 3 del MiniRotofor (MASCOT)……………………………………….…...………. ..73 
Cuadro 20. Muestra 4 del MiniRotofor (MASCOT)…………………….…………………….....……... ..73 
Cuadro 21. Función de las proteínas del MiniRotofor identificadas por MASCOT …………..……...74 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
Capítulo 1. 
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………….…….…….1 
 
Capítulo 2. 
2. MARCO TEÓRICO…………………………………………………………………….3 
2.1 Cáncer de mama.……………………………………………………………………3 
2.1.1 Cáncer de mama y estructuras…………………………………………………3 
2.1.2 Estadísticas…………………….………………………………………………….4 
2.1.3 Cultura de prevención…………….……………………………………………...6 
2.1.4 Estadios del cáncer de mama….….…………………………………………….8 
2.1.5 Genes, hormonas y otros factores……………………………………………..15 
2.4 Factores de riesgo…………………………………………………………..…...21 
2.2 Proteómica y biomarcadores........................................................................24 
2.3 Isoelectroenfoque preparativo.....................................................................25 
2.4 Espectrometría de masas.……………………………………………..….…...26 
2.4.1 MALDI TOF-TOF………………………………………………………..……….26 
 
Capítulo 3. 
3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………...……………31 
 
Capítulo 4. 
4. OBJETIVOS……………………………………………………………………...……32 
4.1 Objetivo general………………………………………………………………….32 
4.2 Objetivos particulares……………………………………………………………32 
 
 
 
Capítulo 5. 
5. MATERIALES Y MÉTODOS.............................................................................33 
5.1. Cultivo celular de la línea SK-BR-3…………………………...………………….33 
5.2 Extracción de proteínas totales de la línea celular SK-BR-3……………….…34 
5.3 Preparación de la muestra para el isoelectroenfoque por los sistemas 
MiniRotofor y MicroRotofor……………………………………………………………..34 
5.3.1 Isoelectroenfoque preparativo mediante el sistema MiniRotofor…..………..36 
5.3.2 Isoelectroenfoque preparativo mediante el sistema MicroRotofor…………..38 
5.4 Análisis por espectrometría de masas (MALDI-TOF TOF)………………..……42 
 
Capítulo 6. 
6. RESULTADOS……………………………………………………………………….43 
6.1 Obtención del extracto total de proteínas de la línea celular SK-BR-3……..…43 
6.2 Preparación de la muestra para el sistema MiniRotofor…………………….….44 
6.2.1 Isoelectroenfoque por el sistema MiniRotofor……………………………..…..45 
6.3 Preparación de la muestra para el sistema MiniRotofor…………………….….49 
6.3.1 Isoelectroenfoque por el sistema MicroRotofor.…………………………….…50 
6.4 Identificación de proteínas de la línea celular SK-BR-3 por espectrometría 
de masas MALDI TOF-TOF…………………………………………………………….53 
6.5 Identificación de proteínas mediante el programa ProteinPilot.……………..…56 
6.5.1 Proteínas de las fracciones del MiniRotofor identificadas mediante 
ProteinPilot…………………………………………………………………………….….56 
6.5.2 Proteínas de las fracciones del MicroRotofor identificadas mediante 
ProteinPilot ………………………………………………………………………….……57 
6.5.3 Función de las proteínas identificadas por ProteinPilot……………………....59 
6.6 Identificación de proteínas mediante el programa MASCOT……………….….60 
6.6.1 Proteínas del MicroRotofor identificadas por MASCOT ...……………………60 
6.6.2 Función de las proteínas del MircroRotofor identificadas por MASCOT....…66 
6.6.3 Proteínas obtenidas por el MiniRotofor e identificadas por MASCOT...…....72 
 
 
6.6.4 Función de las proteínas obtenidas por el MiniRotofor e identificadas por 
MASCOT………………………………………………………………………………….73 
 
Capítulo 7. 
7. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………..75 
 
Capítulo 8. 
8. CONCLUSIONES……………………………………………………………………79 
 
Capítulo 9. 
9. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………..81 
 
Capítulo 10. 
10. LITERATURA CITADA.……...……………..……………………………………..82 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resumen 
 
El cáncer más común en mujeres es el cáncer de mama siendo éste la primera 
causa de muerte en mujeres por cáncer en México. Este padecimiento continúa en 
aumento debido a la constante interacción con factores de riesgo. La proteómica 
es una de las vías para diagnosticarlo, ya que con el estudio de las proteínas se 
pueden encontrar marcadores moleculares que ayuden en el diagnóstico oportuno 
de dicha enfermedad. De la línea celular SK-BR-3, que proviene de un 
adenocarcinoma de mama, se realizó la extracción de proteínas totales y mediante 
la técnica de isoelectroenfoque preparativo mediante el sistema MiniRotofor y el 
sistema MicroRotofor, en los que se enfocaron las proteínas a su respectivo pI; se 
obtuvieron geles de acrilamida para verificarlo y cada fracción del IEF se comparó 
contra sus valores de pH. Posteriormente se obtuvieron péptidos, para su posterior 
análisis por espectrometría de masas en tándem (MS/MS) e identificación de 
dichas proteínas, por comparación con 2 programas bioinformáticos. En total se 
logró la identificación de 51 proteínas, siendo más eficiente el sistema 
MicroRotofor. 
 
PALABRAS CLAVE: Cáncer de Mama; SK-BR-3; IEF; Marcadores moleculares.Abstract 
 
The most common cancer in women is breast cancer. It is the first cause of 
mortality in women by cancer in México. Number of cases of breast cancer is 
continuously increasing by the constant interaction with risk factors. Many genes 
are altered in cancer, and therefore their proteins. The study of the altered proteins 
in cancer could help to find some specifics proteins that could be used as 
biomarkers for an early diagnosis of this disease. Nowadays, hundreds of proteins 
are identified by Proteomics, a science which uses techniques for the separation of 
proteins and peptides, and identify them by mass spectrometry. In this thesis, we 
used SK-BR-3 cells, a cell line that comes from a breast adenocarcinoma, to 
solubilize total proteins and reduce the complexity of sample by using the 
Isoelectric Focusing (IEF) technique with the MiniRotofor and MicroRotofor 
systems. In these systems, proteins migrate to their respective isoelectric point, 
and are collected in fractions according the pH gradient used. The composition of 
each fraction was determined by SDS-PAGE, as its pH. Finally, polypeptides from 
each fraction were trypsin digested and identified by tandem mass spectrometry. In 
total, there was achieved the identification of 51 polypeptides, being the most 
efficient the MicroRotofor separation system. 
 
Key Words: Breast Cancer; SK-BR-3; Isoelectric Focusing; Biomarkers. 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
Existen muchas enfermedades que afectan a la humanidad. Algunas de ellas son 
causa de elevadas tasas de mortalidad a nivel mundial; tal es el caso del cáncer, 
que es la acumulación de numerosas y frecuentemente desconocidas alteraciones 
que causan proliferación celular, inestabilidad genética y la adquisición de un 
fenotipo tisular crecientemente invasivo y resistente (Bertucci et al., 2006). 
 
El cáncer más común en mujeres actualmente es el cáncer de mama; éste a su 
vez es la segunda neoplasia más frecuente en el mundo. La mama de la mujer, en 
comparación con miembros de otras especies, se diferencia por el desarrollo de 
unidades lobuladas del conducto terminal (TDLUs, del inglés “Terminal Duct 
Lobular Units”), que están situadas comúnmente en la tercera parte más externa 
del disco mamario y al final de la axila; de estas unidades se derivan los tipos de 
cáncer de mama más comunes, que son los carcinomas invasivo ductal y lobular. 
En lo que respecta al desarrollo del cáncer y su progresión, la ruta normal a 
cáncer en estructuras epiteliales, pasa a través de varias etapas involucrando 
diferentes grados de hiperplasia que llevan a carcinoma in situ, posteriormente 
desarrollándose en un cáncer oculto y finalmente en un cáncer invasivo clínico 
(Dickson y Lippman, 1994). 
 
El cáncer de mama tiene alta incidencia sobre todo en los países industrializados, 
siendo éste la causa de muerte de aproximadamente el 20% de las mujeres con 
cáncer. En las áreas subdesarrolladas presenta un crecimiento aun mayor que en 
los países desarrollados; las causas de dicho aumento están relacionadas con 
factores de riesgo como la transición demográfica, particularmente con los hábitos 
reproductivos, como la procreación tardía, la reducción del número de hijos, la 
ausencia del hábito de amamantar y los propios hábitos de la vida moderna como 
la alimentación grasosa y rica en proteínas y demás características de vida de los 
centros urbanos (Hernández et al., 1998). 
 
2 
 
Una de las vías para estudiar este padecimiento es mediante la genómica, aunque 
parece no ser adecuada como la única plataforma pronóstica y predictiva del 
cáncer de mama; por lo cual la proteómica es clave en el manejo de la 
oncogénesis, siendo la oncoproteómica una nueva forma de abordar los 
problemas oncológicos, ya que a través del análisis masivo de proteínas, se puede 
entender mejor el papel que éstas juegan en el proceso salud-enfermedad 
(Abramovitz y Brian, 2006). 
 
Las proteínas son moléculas anfotéricas que tienen carga positiva, negativa o 
neutra, dependiendo del pH que las rodea. El punto isoeléctrico pI de una proteína 
es el valor de pH de los alrededores de la proteína en los cuales ésta tiene carga 
neta de cero; el isoelectroenfoque pone a las proteínas en un gradiente de pH y al 
aplicar un campo eléctrico, éstas migrarán hasta alcanzar su pI. De esta manera 
se disminuye la complejidad de la muestra (Simpson, 2003). 
 
Asimismo, la identificación de nuevos marcadores para diferenciar las células 
neoplásicas de las normales, permitirá un entendimiento más profundo de la 
patología, así como la definición de nuevos blancos terapéuticos. La introducción 
de la espectrometría de masas en combinación con la identificación de proteínas 
por medio de la bioinformática, ha permitido a la proteómica emerger como una 
valiosa herramienta para el descubrimiento de marcadores moleculares (Belkoura 
et al., 2003). 
 
2. MARCO TEÓRICO 
 
2.1 Cáncer de Mama 
 
El cáncer de mama (CaMa) es una neoplasia. Las neoplasias se caracterizan por 
una proliferación celular descontrolada y acelerada, dada por mutaciones en 
genes encargados de la supresión o estimulación del ciclo celular. Actualmente es 
la principal causa de muerte en mujeres por cáncer, donde cientos de miles 
3 
 
mueren al año en todo el mundo; sin embargo, no es una enfermedad exclusiva de 
la mujer, también en los hombres se presenta pero con mucha menor incidencia 
(Calderón et al., 2009). 
 
2.1.1 Cáncer de Mama y Estructuras 
 
Anatómicamente, cada mama tiene entre 15 y 20 secciones llamadas lóbulos, que 
comprenden secciones más pequeñas llamadas lobulillos, éstos a su vez terminan 
en docenas de bulbos minúsculos que pueden producir leche (Figura 1). Los 
lóbulos, los lobulillos y los bulbos están conectados por tubos delgados llamados 
conductos o ductos por los que se transporta la leche al pezón. Tanto en el tejido 
de los lóbulos como en el de los ductos se puede desarrollar un tumor; éstos se 
clasifican como carcinoma in situ, si el tumor permanece dentro del conducto o 
lobulillo y carcinoma infiltrante o invasivo, si el tumor se disemina fuera del 
conducto o lobulillo. Hay racimos de ganglios linfáticos cerca de la mama en la 
axila (debajo del brazo), sobre la clavícula y en el pecho los cuales también son 
blancos para el desarrollo del cáncer de mama (Calderón op cit, 2009). 
 
 
Fig. 1 Anatomía de la mama que muestra los lóbulos, ductos, vasos y ganglios linfáticos (Tomada 
de NCI, 2010). 
4 
 
2.1.2 Estadísticas 
 
El cáncer de mama ha evolucionado como una de las principales causas de 
mortalidad en las mujeres; cada año se diagnostican en el mundo más de un 
millón de casos y fallecen por esta causa 548 mil mujeres. En Estados Unidos por 
ejemplo, se detectan anualmente 180,000 nuevos casos y 30,000 muertes 
(Calderón et al., 2009). 
 
Sin embargo, el perfil de esta enfermedad está cambiando; ya que habiendo 
surgido en las regiones más desarrolladas del planeta, ahora está afectando de 
manera creciente a las mujeres de los países de menores recursos, ya que 
actualmente más del 55% de las muertes por cáncer de mama se presentan en los 
países de ingresos bajos y medios. Para el 2020 se estima que alrededor del 70% 
de los casos de esta enfermedad se presentarán en el mundo en desarrollo 
(Frenk, 2009). 
 
Particularmente en México, 57.4% de su población son mujeres (INEGI, 2011); la 
distribución de la mortalidad por estado sugiere que el cáncer de mama ha crecido 
en nuestro país y afecta tanto a los estratos medios, pobres y se concentra 
también en las regiones más ricas del país. El cáncer de mama es muy común 
entre mujeres de 30 a 59 años de edad en 11 de los 32 estados de la República, 
la mayoría de los cuales son de los más acaudalados y cuentan con mayor 
disponibilidad de servicios de salud. En esta lista se incluye a la Ciudadde 
México, que representa alrededor del 20% de la población mexicana y también 
algunos de los estados de escasos recursos del país como Veracruz (Knaul et al., 
2009). En 1993 el número de nuevos casos de cáncer de mama registrados fue de 
5,739 (de los cuales 20% recaen en el estado de Nuevo León). El promedio de 
mortalidad en México por CaMa es de 10.5 / 100 000 mujeres; siendo los estados 
del norte los que presentan una mayor incidencia Coahuila (16.1), Nuevo León 
(15.9), Sonora (14.5), Chihuahua (14.1) y Baja California (13.5) (Calderón, op cit.). 
 
5 
 
Esta patología en la actualidad es la causante de un mayor número de muertes en 
México, comparado con el cáncer cérvico-uterino, y afecta a mujeres adultas de 
todas las edades y niveles de ingreso. Por lo que actualmente es la primera causa 
de muerte entre las mujeres mexicanas adultas de 30 a 54 años de edad (Knaul, 
et al., 2009). 
 
 
Fig. 2. Mortalidad por tumores malignos de mama en México por grupo de edad. 1995-2007. Tasas 
ajustadas por edad por 100 000 mujeres presentadas a edad promedio (Tomada de Knaul, et al., 
2009). 
 
Según datos del Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática (INEGI), 
en 1990 ocurrieron 2,230 decesos atribuibles al cáncer de mama, lo que 
representó el 1.67% del total de defunciones ocurridas en mujeres de 25 años y 
más. En 1994 dicha cifra fue de 2,785 (1.90%) muertes y para 1998 aumentó a 
3,380 (2.1%) fallecimientos. Esto significa que en ese último año murieron por 
cáncer de mama casi nueve mujeres cada día, lo que representa la muerte de una 
mujer cada dos horas aproximadamente. 
 
Las tasas de mortalidad por cáncer mamario estandarizadas por edad entre 1990 
y 1998 muestran en México una tendencia creciente; la de 1990 fue de 13.16 por 
100,000 mujeres de 25 años y más; en 1998 aumentó a 15.12 por el mismo 
denominador. En ese sentido, de continuar las condiciones actuales, es decir, un 
crecimiento lento pero constante de la mortalidad por cáncer de mama, la 
 
6 
 
tendencia permite prever que la tasa de mortalidad por este tipo de cáncer, para el 
nivel nacional, seguirá incrementándose en el grupo de mujeres de 25 años y más 
[ (NOM) 041-SSA2-2002]. 
 
El cáncer de mama afecta tanto a mujeres jóvenes como a mujeres de mayor 
edad y una gran proporción de este padecimiento en los países en desarrollo –en 
muchos hasta 50%– ocurre en mujeres menores de 54 años (Frenk, 2009). 
Estadísticamente la posibilidad de desarrollar esta enfermedad es 1 en 20,000 
para mujeres menores de 25 años y este riesgo incrementa a 1 en 9 en mujeres 
mayores a 79 años (Calderón et al., 2009). 
 
2.1.3 Cultura de la Prevención 
 
La Organización Mundial de la Salud (OMS) refiere a la detección temprana del 
cáncer como la única medida cuyo resultado se refleja en un incremento del 
tiempo de sobrevida y la reducción de la mortalidad por este padecimiento. Las 
estrategias son la prevención primaria y la secundaria. La primera, que modifica el 
riesgo, tiene un impacto limitado ya que la mayoría de los factores para este 
cáncer no son modificables; así, los esfuerzos del sistema de salud deben 
enfocarse en la prevención secundaria (o detección temprana), la cual permite un 
pronóstico favorable en el tratamiento de esta enfermedad. En los países 
desarrollados se han aplicado programas poblacionales que promueven el 
autoexamen y la exploración clínica de mama; en algunos, como EUA y Canadá, 
se ha promovido activamente la mastografía. 
 
Pese al ligero incremento del diagnóstico en México los datos son alarmantes, ya 
que se ha estimado que más del 80% de los casos de cáncer que se detectan en 
México se encuentran en etapa avanzada, porque la detección temprana es poco 
frecuente. Los datos disponibles sugieren que sólo entre 5 y 10% de los casos en 
México se detecta en las fases iniciales de la enfermedad, en comparación con el 
50% en Estados Unidos (Knaul et al., 2009). 
7 
 
 
Asimismo, un estudio de 256 mujeres mexicanas con diagnóstico de cáncer de 
mama reveló que en 90% de los casos fueron ellas mismas las que identificaron 
su padecimiento y sólo 10% se diagnosticó en etapa I. El mismo estudio también 
mostró que sólo 30% de las mujeres se practicó la autoexploración, e incluso que 
un porcentaje todavía menor lo hizo de manera adecuada. 
 
Pese a que las tasas de prevención son todavía muy bajas, algunos datos indican 
que se ha incrementado el uso del tamizaje (Figura 3). La más reciente Encuesta 
Nacional de Salud incluía una pregunta para saber si las mujeres habían acudido 
a un centro de salud para cualquier tipo de estudio de cáncer de mama en el año 
anterior a la encuesta. Estos datos muestran que 12% de las mujeres de 40 a 69 
años de edad se había sometido a un examen clínico (incluida la mamografía) en 
el año 2000, en tanto que para el año 2006 el porcentaje fue de 22%. Dicho 
incremento se observó en todas las edades, pero fue mayor a los 45 y más años 
(Frenk, 2009). 
 
Lo anterior permite reconocer un cambio positivo derivado de una mayor 
conciencia en lo que a esta enfermedad se refiere sobre todo en las mujeres de 
mayor edad (Frenk, 2009). 
8 
 
 
Fig. 3. Proporción de mujeres por edad que recibieron tamizaje para cáncer de mama (exploración 
clínica de mama o mamografía) en un periodo de 12 meses en México 2000 y 2006 (Tomada de 
Knaul, et al., 2009). 
 
 
2.1.4 Estadios del Cáncer de Mama 
 
El cáncer de mama se diagnostica y clasifica de acuerdo a etapas (0 a IV); para lo 
cual se deben considerar tres factores importantes: el tamaño del tumor, el estado 
ganglionar y la metástasis. 
 
El primero es el tamaño del tumor primario, ésta es una de las principales 
características de diferenciación, seguida por el estado ganglionar el cual indica la 
presencia o ausencia de células cancerosas en los ganglios linfáticos. Esto ayuda 
a definir la etapa del cáncer de mama y la metástasis, que se refiere a que las 
células cancerígenas han migrado desde la mama afectada a través del torrente 
sanguíneo a otras zonas del cuerpo: tejido blando (como el tejido de la mama 
opuesta, ganglios linfáticos lejanos o piel) u órganos como el hígado, pulmones, 
huesos, etc. (NCI, 2010). 
 
Los estadios 0, I, y II son consideradas cáncer de mama temprano. 
 
Estadio 0 (carcinoma in situ) 
9 
 
 
Existen 2 tipos: 
 Carcinoma Ductal in situ (CDIS) 
 Carcinoma Lobular in situ (CLIS) 
 
El carcinoma ductal in situ (CDIS) consiste en células epiteliales de mama 
malignas que están presentes y proliferan en el epitelio ductal, confinadas por la 
membrana basal y por lo tanto, no invaden el estroma subyacente. El carcinoma 
ductal in situ también ocurre en hombres y representa 3.5% al 7% de todos los 
casos del cáncer de mama en hombres para 1985, mientras que en esta década 
aumentó a 14%, en una proporción 200% mayor a la esperada, por lo que la tasa 
de incremento en incidencia ha sido mayor para CDIS que cualquier otro tipo de 
cáncer de mama en hombres. 
 
En general existen 2 subtipos de CDIS de acuerdo a la presencia o ausencia de 
necrosis comedo; esta clasificación se da también con base en que presentan 
diferente apariencia en una mamografía y a su potencial maligno. 
 
 El tipo de necrosis comedo del CDIS es diagnosticado cuando al menos un 
ducto se llena y expande a lo largo, con células notablemente atípicas y tiene 
abundante necrosis del lumen central; este material necrótico está parcialmente 
calcificado y así puede ser reconocido en una mamografía como calcificaciones 
lineales y ramificadas. 
 
 El tipo de necrosis no comedo el cual también presenta necrosis aunque 
menos prominente y no es propenso a calcificación (NCI, 2010). 
 
 
Especímenes de CDIS tienen muchas alteraciones a nivel genético molecular; la 
sobreexpresión de erbB-2 sucede en 46% a 60% de los casos, mayormente en el 
tipo de necrosis comedo; encontraste, esta sobreexpresión ocurre sólo en 20% a 
10 
 
25% de los casos de cáncer de mama invasivos. Aunque cabe mencionar que 
algunos casos de cáncer de mama invasivos que expresan erbB-2 parecen haber 
derivado de CDIS preexistentes. 
 
 
En CDIS están presentes: 1) mutaciones del gen p53, más comúnmente en el tipo 
de necrosis comedo; 2) desequilibrio alélico (pérdida de la frecuencia de un alelo) 
del gen BRCA1 que ha sido encontrado en 74% de los casos de tumor; 3) también 
ha sido descrita la pérdida de heterocigosidad en el tumor en un locus reportado 
que muestra pérdidas alélicas en cánceres invasivos, así como también un 
oncogén en 11q13, que corresponde al síndrome cancerígeno hereditario de 
Neoplasia Endócrina Múltiple Tipo 1, el cual está presente en cerca del 90% en 
este tipo de lesiones malignas de mama (Fonseca, 1997). 
 
El carcinoma lobular in situ (CLIS) es una lesión microscópica donde se 
encuentran células anormales en forma de proliferación lobulillar no infiltrante. La 
incidencia media del CLIS es del 2% y no presenta necrosis. La edad media de 
presentación oscila entre 45 y 49 años y un 60-89% de los casos se diagnostica 
en mujeres premenopáusicas. 
 
El padecer de carcinoma lobular in situ en una mama aumenta el riesgo de 
padecer de cáncer en la otra mama. En un estudio realizado durante el 
seguimiento de casos por este padecimiento, se ha observado un aumento de la 
incidencia de carcinoma infiltrante bilateral, por lo que se le ha considerado un 
factor de riesgo del carcinoma infiltrante. En un estudio retrospectivo realizado en 
4,730 casos de cáncer de mama, de las 90 pacientes con CLIS un 27% de los 
casos presentaban significativamente mayor número de afectación bilateral, 
mientras que sólo 2% correspondió a los carcinomas ductales infiltrantes y 7% a 
los lobulillares infiltrantes (Muñoz et al., 1994). 
 
11 
 
La lesión provoca la distensión de los ácinos; éstos aumentan tanto en número 
como en tamaño, así como globalmente el lobulillo. Los ácinos del lobulillo 
afectado están envueltos por haces de reticulina como expresión de la reacción 
estromal desmoplásica. La luz en el lobulillo puede persistir, por lo que su 
ausencia no constituye un criterio diagnóstico. El tratamiento recomendado tras su 
diagnóstico por biopsia es el seguimiento con exploración clínica y mamografia 
para la detección del carcinoma infiltrante en fase precoz (Muñoz, et al., 1994). 
 
Estadio I 
 
En el estadio I, el cáncer se ha formado. El tumor mide dos cm o menos y no se 
ha diseminado fuera de la mama (Figura 4) (NCI, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 4. Tumor no invasivo del Estadio I (Tomada de NCI, 2010). 
 
 
Estadio IIA 
 
 No hay presencia de tumor en la mama, pero el cáncer se encuentra en los 
ganglios linfáticos axilares (los ganglios linfáticos debajo del brazo); o 
 el tumor mide más dos cm o menos y se ha diseminado hasta los ganglios 
linfáticos axilares; o no se ha diseminado hasta los ganglios linfáticos axilares. 
12 
 
 
 
Estadio IIB 
 
El tumor: 
 Mide más de dos centímetros, pero no más de cinco centímetros y se ha 
diseminado hasta los ganglios linfáticos axilares; o no se ha diseminado hasta los 
ganglios linfáticos axilares (Figura 5) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 5. Estadio IIB del cáncer de mama con un tumor entre 2 y 5 cm de tamaño (Tomada de NCI, 
2010). 
 
 
Estadio IIIA 
 
 No se encuentra un tumor en la mama. El cáncer se encuentra en los 
ganglios linfáticos axilares que están unidos entre sí o a otras estructuras; o el 
cáncer se puede haberse diseminado hasta los ganglios linfáticos cercanos al 
esternón (NCI, 2010). 
13 
 
 El tamaño del tumor es variable ya que puede medir dos centímetros o 
menos, entre dos centímetros y cinco centímetros, o más de cinco centímetros 
(NCI, 2010). 
 
Estadio IIIB 
 
En el estadio IIIB, el tamaño del tumor es variable y el cáncer: 
 Se ha diseminado hasta la pared del pecho o a la piel de la mama (Figura 
6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 6. Estadio IIIB Cáncer de mama inflamatorio, cuando se ha diseminado hasta la piel de la 
mama (Tomada de NCI, 2010). 
 
Estadio IIIC 
 
Puede no haber signos de cáncer en la mama o el tumor puede tener cualquier 
tamaño y puede haberse diseminado hasta la pared del pecho o a la piel de la 
mama (NCI, 2010). 
 
Asimismo, el cáncer: 
 Se ha diseminado hasta los ganglios linfáticos por arriba o debajo de la 
clavícula; y 
14 
 
 Puede haberse diseminado hasta los ganglios linfáticos de las axilas o 
hasta los ganglios linfáticos cercanos al esternón. 
Cuando el cáncer se ha diseminado hasta la piel de la mama, se le llama cáncer 
de mama inflamatorio. 
 
El cáncer de mama en estadio IIIC se divide en estadio IIIC operable y estadio IIIC 
no operable. En el estadio IIIC operable, el cáncer: 
 Se encuentra en 10 o más ganglios linfáticos de la axila; o 
 Se encuentra en los ganglios linfáticos debajo de la clavícula; o 
 Se encuentra en ganglios linfáticos de la axila y en los ganglios linfáticos 
cercanos al esternón. 
 
En el estadio IIIC no operable del cáncer de mama, el cáncer se ha diseminado 
hasta los ganglios linfáticos por arriba de la clavícula. 
 
Estadio IV 
 
En el estadio IV, el cáncer se ha diseminado hasta otros órganos del cuerpo 
(Figura 7) con mayor frecuencia hasta los huesos, los pulmones, el hígado o el 
cerebro (NCI, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 7. Metástasis a varias regiones del cuerpo (Tomada de NCI, 2010). 
 
15 
 
2.1.5 Genes, Hormonas y Otros Factores 
 
La señalización de los factores de crecimiento, son cruciales para el desarrollo de 
la patología. Los eventos moleculares que conducen a la carcinogénesis de 
células epiteliales de mama, suponen la modificación en la estructura y expresión 
de genes oncogénicos y supresores de tumor (tales como myc, ErbB2 y p53), 
llevando a un crecimiento desequilibrado caracterizado por elevado ritmo de 
proliferación y eventual migración. 
 
Estas modificaciones genéticas también confieren una habilidad a sobrevivir al 
estrés ambiental ya que normalmente desencadenaría en apoptosis. Sin embargo, 
los tumores mamarios se desarrollan lentamente; se ha estimado que para el logro 
de un tumor de 1 cm desde la célula originaria se requiere de un periodo de 6-8 
años. 
 
Protooncogenes en Cáncer de Mama 
 
erbB2 
 
El protooncogén erbB2 se localiza en el cromosoma 17q21 y codifica a un receptor 
de tirosina cinasa transmembranal; forma parte de una familia de 4 miembros: del 
factor de crecimiento epidérmico (EGFR, erbB2, erbB3 y erbB4) (Bowcock, 1999). 
La amplificación de este oncogén se puede observar en 20-33% de tumores 
mamarios invasivos y la sobreexpresión puede detectarse en 44% de los mismos, 
si bien sólo 12% tiene una alta intensidad. En tumores humanos se han detectado 
cambios genéticos que incluyen la amplificación del gen erbB2, que conllevan a la 
sobreexpresión del receptor Tirosina cinasa, lo cual promueve la activación 
constitutiva de dicho receptor y la coexpresión de ligandos erbB y receptores en 
tumores, proceso que conduce al desarrollo del cáncer (Hynes y MacDonald, 
2009). 
16 
 
Las alteraciones presentes en erbB2 en el cáncer ductal invasivo (IDC) primario 
pueden ser mantenidas durante la progresión a enfermedad metastásica, 
sugiriendo por tanto, su rol potencial en etapas avanzadas de la evolución tumoral 
mamaria, lo cual explica la relación entre las alteraciones de erbB2 y marcadores 
de agresividad tumoral. En un estudio se analizó por hibridación fluorescente in 
vitro reportando que la amplificación de erbB2 era un factor de predicción 
independiente de mal resultado clínico (Bowcock, 1999). 
 
Existe una asociación entre este oncogén y el grado histológico III, la hormono-
independencia, la actividad proliferativa y la resistenciaa ciertas terapias. No está 
plenamente aceptado su valor pronóstico, aunque algunos autores lo han 
demostrado en los casos sin y con afectación ganglionar, así como cuando su 
positividad se asocia a la del EGFR. 
 
También se sabe por trabajos recientes que la sobreexpresión de este oncogén se 
asocia, entre otros hechos, con una mayor expresión del factor de crecimiento del 
endotelio vascular (VEGF), que interviene en la desregulación de las interacciones 
ciclina D1/Cdk4/6 del ciclo celular y que se interrelaciona con la ciclooxigenasa 2 y 
la prostraglandina E2, ejerciendo un efecto proinflamatorio y antiapoptótico, lo cual 
abre nuevas perspectivas fisiopatológicas (Hynes y MacDonald, 2009). 
 
c-Myc 
 
Es un factor de transcripción involucrado en la regulación de actividades celulares 
tales como proliferación, diferenciación, así como apoptosis. El gen c-myc 
localizado en el cromosoma 8q24, es amplificado en aproximadamente 20-30% de 
los casos de cáncer de mama, pero correlaciona muy poco con la expresión de c-
Myc tanto en los niveles de proteína como en los de mRNA; la amplificación del 
gen c-myc ha sido detectada en Carcinomas Ductales in situ (DCIS); sin embargo, 
los genes Ciclina D1 y erbB2 son amplificados con una mayor frecuencia. Es de 
interés mencionar que alteraciones en c-Myc mientras se encuentran presentes en 
17 
 
algunos cánceres de mama primarios, no siempre se detectan en la 
correspondiente metástasis a los nódulos linfáticos, indicando por tanto un rol 
potencial en el comienzo y promoción previo a la invasión, aunque no siempre 
(Bowcock, 1999). 
 
Ciclina D1 
 
El gen ccnd1/bcl/prad1 codifica para la proteína Ciclina D1 la cual, cuando se 
asocia con algún complejo dependiente de Ciclina (CDKs), controla la progresión 
del ciclo celular hacia G1/S vía fosforilación de la proteína pRB. La sobreexpresión 
de esta proteína está presente en 35-50% de los casos. Sin embargo, en algunos 
estudios se analizaron 248 tumores en etapa I y II y no se encontró valor 
pronóstico para la sobreexpresión de la Ciclina D1. También ha sido asociada con 
la positividad del receptor de estrógenos (ER) (Bowcock, op cit). 
 
Bcl-2 
 
El gen bcl-2 codifica para una proteína mitocondrial interna involucrada en la 
supresión de la apoptosis; Bcl-2 es expresada normalmente en el tejido mamario 
(>95% de las células). Su sobreexpresión puede deberse a alteraciones en p53 ya 
que normalmente bcl-2 se encuentra reprimido por dicha proteína antioncogénica. 
A su vez un exceso de bcl-2 puede suprimir a la proteína c-Myc encargada de 
inducir apoptosis bajo ciertas condiciones. La proteína Bcl-2 tiene una doble 
función, facilitar la proliferación celular y suprimir la apoptosis por ejemplo la 
sobreexpresión de Bax lleva a la apoptosis mientras que el producto de Bcl-XL 
tiende a inhibirla (Bowcock, op cit). 
 
El oncogén ras 
 
El incremento de la expresión de ras ha sido descrito en cientos de tumores 
humanos. El protooncogén ras y también las formas mutantes del gen pueden 
18 
 
producir transformación celular, e incluso cuando se realiza una transfección del 
oncogén ras, parece estimular la movilidad celular endotelial la cual, es esencial 
para la formación de microvasculatura, con la que se le permite al tumor 
diseminarse a sitios metastáticos distantes. Las proteínas Ras juegan diversos 
roles en la transducción de señales extracelulares, las cuales afectan la 
proliferación celular, la diferenciación y la regulación de la dinámica del 
citoesqueleto (Bowcock, 1999). 
 
p53 
 
Al antioncogén p53 se le ha clasificado como supresor de tumores debido a dos 
funciones básicas, detiene o revierte el crecimiento descontrolado de una célula 
transformada ya que detiene el ciclo celular en la fase G1, lo que permite la 
reparación del DNA antes de ser replicado o favorece la apoptosis de dichas 
células manteniendo su concentración elevada, con lo que se inhibe la expresión 
de bcl-2 y se estimula la expresión del gen proapoptótico bax el cual se inserta a la 
membrana mitocondrial resultando en la liberación del citocromo c y otros factores 
proapoptóticos de la mitocondria. 
 
Es llamado también el guardián del genoma, por lo que de encontrarse dañado se 
inhiben ciertas formas de apoptosis y se permite la proliferación de células 
defectuosas que favorecen la aparición de una neoplasia. Parte de su importancia 
radica en que alteraciones en p53 a nivel de proteína o DNA han sido detectadas 
en 25-50% o 15-35%, respectivamente. En cáncer de mama, de igual manera se 
sabe que alteraciones tempranas pueden ser mantenidas durante la progresión a 
lesiones de mama más avanzadas (Bowcock, op cit). 
 
BCRA1 
 
El gen Breast Cancer 1 al igual que Breast Cancer 2 comparten patrones similares 
de expresión y funciones potenciales, ambos juegan un papel substancial en el 
19 
 
cáncer de mama hereditario. BRCA1 posee una región carboxi-terminal que 
contiene un dominio común a muchas proteínas involucradas en la reparación del 
ADN; este dominio se llama BRCT (Bowcock, 1999). A nivel molecular, las 
pacientes con alteraciones en el gen BRCA1 tienen una alta frecuencia de 
mutaciones en p53 y menor sobreexpresión del gen her2/Neu. Todos estos 
hallazgos incluyen tanto factores pronósticos favorables como adversos (Bowcock, 
1999). 
 
BRCA2 
 
Casi todos los casos de cáncer mamario en hombres se deben a defectos en 
BRCA2. La pérdida de heterocigosidad en tumores con cáncer asociados a 
BRCA2 apoya el rol de este gen como supresor de tumores. Está también 
involucrado en la regulación de la expresión génica y en el control de la 
proliferación celular (Bowcock, op cit). 
 
Hormonas y otros factores 
 
Las hormonas también participan en el progreso de la enfermedad. En la 
progresión de esta enfermedad se subraya la importancia de la regulación 
endócrina y parácrina del crecimiento de las células cancerígenas en el desarrollo 
del tumor, ya que en verdad, dicho crecimiento está bajo el control de hormonas 
estrogénicas (el estradiol y la progesterona). 
 
Los estrógenos son necesarios para el desarrollo de células normales, pero 
también para algunas células cancerígenas, por lo cual se han desarrollado 
estrategias antiestrógenos para bloquear su crecimiento como el Tamoxifén, que 
es el antiestrógeno más usado en los tratamientos de cáncer de mama, tanto así 
que el primer marcador biológico para uso de rutina fueron los receptores de 
estradiol y progesterona; sin embargo, algunas células no dependen del estrógeno 
para su crecimiento y su agresividad es mucho mayor. 
20 
 
 
Además de las hormonas, el crecimiento de las células de cáncer de mama, 
puede ser regulado por varios factores de crecimiento que controlan la 
proliferación, migración y apoptosis. Por ejemplo, el EGF, que estimula la 
proliferación de células cancerígenas, mientras que otros factores como el 
inhibidor del factor de crecimiento derivado-mamario (MDGI) inhibe el crecimiento 
(Hondermarck et al., 2002). 
 
Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs), que son producidos por las 
mismas células cancerosas, estimulan tanto la proliferación como la migración de 
las células de cáncer mamario, son polipéptidos involucrados en el control de la 
proliferación, diferenciación, migración y sobrevivencia de las células por lo que la 
sobreexpresión de FGF-2, así como de sus receptores ha sido reportado en un 
porcentaje significativo de tumores de mama (Hondermark, op cit). 
 
2.1.6 Factores de Riesgo 
 
Entre 1965 y 2005 la esperanza de vida al nacer, en los países en vías de 
desarrollo, se incrementó de 50 a 65 años. Esto ha hecho que las mujeres de 
estos países estén alcanzando edades en las que es más común desarrollar 
cáncer de mama. Los cambios demográficos en los estilos de vida que se 
produjeron en las últimas décadas, por ejemplo en la mayoría de los países deAmérica Latina incrementaron la exposición de sus poblaciones a los riesgos 
asociados al cáncer de mama en particular, como la ampliación del acceso a 
servicios sanitarios, las mejoras en la nutrición y el incremento en las coberturas 
de vacunación, lograron un descenso de la mortalidad infantil que aunado a 
campañas de planificación familiar dio paso a una reducción en el número de 
hijos, lo que se considera un factor de riesgo así mismo se dio un incremento en la 
expectativa de vida 55-70 años en la cual las mujeres son más propensas a dicha 
enfermedad (Frenk, 2009). 
 
21 
 
También existen factores reproductivos, como el embarazo temprano, que parece 
proporcionar cierta protección. Sin embargo, un número creciente de embarazos 
posee un efecto protector independiente de la edad al primer parto; también se ha 
encontrado una disminución en el riesgo de cáncer mamario, con un número 
creciente de meses de lactancia, ya que durante la lactancia los niveles de 
estrógenos son bajos y por tanto se disminuye el riesgo del cáncer de mama 
asociado al receptor de estrógenos. 
 
La edad avanzada es uno de los más grandes factores de riesgo, 
estadísticamente es importante desde el final del tercer decenio de vida y alcanza 
su máxima expresión durante el sexto decenio de edad; particularmente, tiene una 
frecuencia elevada de cáncer en grupos de población avanzada; sin embargo, en 
1998 en México, 48% de todos los casos presentados eran de temprana aparición 
(35 años de edad o diagnosis más temprana). Muchos estudios han demostrado 
que el cáncer de mama en pacientes jóvenes (early onset breast cancer (EOBC)) 
tienen un curso clínico más agresivo que en pacientes mayores. Se piensa que los 
tumores en mujeres jóvenes son biológicamente diferentes y presentan 
frecuentemente un alto índice de proliferación y menor diferenciación histológica. 
En general, los pacientes con EOBC tienen un corto tiempo libre de enfermedad y 
un reducido tiempo de sobrevivencia (Calderón et al., 2009). 
 
La menarquia está también asociada con un riesgo incrementado de cáncer 
mamario, dicho riesgo disminuye aproximadamente 20% por cada año de demora 
de ésta; cabe mencionar que la edad en la menstruación ha disminuido 
progresivamente en la mayoría de los países, principalmente con la mejora en la 
nutrición y el control de las enfermedades infecciosas (Hernández et al., 1998). De 
igual forma, el riesgo aumenta en mujeres cuya menopausia fisiológica ocurre 
después de los 50 años de edad; así como también el uso prolongado de 
anticonceptivos orales a una edad temprana puede producir un aumento en el 
riesgo para las mujeres más jóvenes (Torres, 1994). 
 
22 
 
En los factores dietarios existe una fuerte correlación positiva entre la magnitud del 
cáncer de mama y el consumo de grasa de origen animal, sobre todo en mujeres 
obesas; de la misma forma el consumo de carne roja se asoció con un incremento 
del riesgo, en parte por su contenido de aminas heterocíclicas, dado que son 
potentes mutágenos y carcinógenos que actúan como un iniciador en el proceso 
de carcinogénesis mamaria, siendo la grasa un promotor de crecimiento tumoral. 
 
El consumo de sustancias nocivas para la salud también está asociado con el 
cáncer de mama. En el caso del tabaco, existe una relación con el estado 
menopáusico; es así que las mujeres premenopáusicas presentan un riesgo 
menor relativo de 0.9 veces mayor. Mientras que las postmenopáusicas mostraron 
un incremento significativo de riesgo de un 80%; asimismo, existe una interacción 
multiplicativa significativa entre la ingestión de alcohol y la terapia de reemplazo 
con estrógenos exógenos en mujeres postmenopáusicas (Hernández et al., 1998). 
 
En lo que respecta al factor hereditario, menos del 10% de los casos de cáncer de 
mama genético se heredan, es decir la mayoría de mujeres diagnosticadas no 
tienen una alteración en los genes de predisposición a dicho cáncer; sin embargo 
se menciona que el riesgo de una mujer es dos o tres veces más alto cuando hubo 
cáncer mamario en su familia (Dairkee, 2000). Por otro lado, los casos bilaterales 
del padecimiento en cuestión determinan en los descendientes una elevación de 
seis a nueve veces el riesgo normal y los casos nuevos se observarán en épocas 
más tempranas de la vida (Torres, 1994). En individuos con tumores de mama 
familiares, una mutación heredada en una copia del gen p53, BRCA1 o BRCA2 se 
distribuye a través de las células del cuerpo. Tal mutación se considera como 
acontecimiento que predispone al cáncer de mama, probablemente a través de un 
cambio adicional en la copia normal, no transformada del gen (Dairkee, op cit). 
 
Aproximadamente del 5% al 10% de las mujeres con cáncer de mama, tienen una 
madre o hermana con la misma patología y más del 20% tiene un historial familiar, 
esto es una primera y segunda generación de parientes que lo presentan. 
23 
 
Mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 son los responsables del 90% de los 
casos hereditarios (Calderón et al., 2009). En general, menos del 1% de la 
población (cerca de 1.4 millones de personas) reportan un historial familiar de 
cáncer de mama u ovárico, donde lo apropiado es remitirlos a pruebas genéticas 
de susceptibilidad a cáncer y asesoramiento genético. En el caso de los hombres 
con la patología 40% se asocian con una historia familiar positiva. Pruebas 
genéticas, comerciales están disponibles desde 1996 e identifican individuos que 
portan una mutación hereditaria del gen BRCA1/2, los cuales pueden estar en un 
alto riesgo de cáncer (Hall et al., 2008). 
 
2.2 Proteómica y Biomarcadores 
 
La proteómica se encarga del estudio del proteoma, que se define como la 
totalidad de las proteínas expresadas en las células bajo ciertas condiciones. El 
surgimiento de nuevas tecnologías permite la facilidad en la comprensión del 
análisis de genomas, transcriptomas y proteomas en salud y enfermedad. 
 
Estas tecnologías han demostrado el poder de la medicina molecular para 
discriminar entre los subtipos de enfermedad que no son reconocibles por los 
criterios de la patología tradicional y en la identificación específica de los eventos 
genéticos involucrados en la progresión a cáncer. 
 
Las proteínas están frecuentemente sujetas a cambios como cortes proteolíticos o 
modificaciones postraduccionales, tales como fosforilaciones o glicosilaciones 
podrían creerse un problema; sin embargo, la ventaja en búsquedas proteómicas 
involucradas en la progresión a cáncer o biomarcadores, utilizando análisis por 
espectrometría de masas, es que éstas se pueden caracterizar estando o no 
modificadas (Pothur et al., 2002). 
 
Aún más, en los análisis de proteínas por espectrometría de masas también se 
pueden hacer comparaciones cualitativas o cuantitativas con lo que se obtiene un 
24 
 
mayor conocimiento de la mecánica celular, que no se logra con otras 
metodologías, como por ejemplo, en la expresión diferencial de mRNA, donde no 
siempre se correlaciona éste con las concentraciones reales de proteínas. De 
igual forma en el desarrollo de biomarcadores basados en la genómica, sigue 
siendo un reto interpretar los mejores datos y adaptar estos resultados a una 
aplicación en particular. 
 
Por lo cual los biomarcadores de proteínas actualmente son una de las 
herramientas críticas en la detección, diagnóstico, tratamiento, monitoreo y 
pronóstico de una enfermedad. Los biomarcadores son moléculas biológicas que 
indican el estado fisiológico y también el cambio durante el proceso de una 
enfermedad. La importancia de un biomarcador recae en su habilidad de proveer 
de una oportuna identificación de la enfermedad y de fácil detección (Pothur et al., 
2002). 
 
Posterior a la extracción de proteínas de células en cultivo o de biopsias los 
análisis proteómicos conjuntan diferentes tecnologías para la separación de 
proteínas, comoseparación por punto isoeléctrico seguido de espectrometría de 
masas, se puede lograr una mayor identificación de proteínas ya que se disminuye 
la complejidad de la muestra y se pueden detectar proteínas que aunque se 
encuentren en menor proporción, pudieran ser candidatas a biomarcadores. 
 
2.3 Isoelectroenfoque Preparativo 
 
Las proteínas son moléculas anfotéricas que tienen carga positiva, negativa o 
neutra, dependiendo del pH que las rodea, de tal forma que la separación de las 
proteínas se puede realizar de acuerdo a su punto isoeléctrico (pI), esto es el valor 
de pH de los alrededores de la proteína en los cuales ésta tiene carga neta de 
cero; a valores de pH sobre su punto isoeléctrico, una proteína posee una carga 
negativa, y a valores de pH por debajo del punto isoeléctrico la proteína tiene una 
carga neta positiva. El isoelectroenfoque pone a las proteínas en un gradiente de 
25 
 
pH creado por anfolitos, que acompañado de un campo eléctrico, logra que las 
proteínas migren a su pI. (Simpson, 2003). 
 
El isoelectroenfoque de las proteínas usando el mini o micro Rotofor, se realiza de 
forma líquida, pudiendo ser conservada la actividad de las proteínas en 
condiciones no-desnaturalizantes; o en condiciones desnaturalizantes, como 
cuando se usan detergentes, agentes caotrópicos para mantener solubles las 
proteínas, evitando así su precipitación y anfolitos para la creación del gradiente. 
Asimismo, el aparato se mantiene en constante rotación para evitar que la 
gravedad afecte el enfoque. 
 
El enfoque se lleva a cabo en un lapso de 2-3 horas a voltaje elevado y 
manteniendo constante los watts; una vez concluido, por succión al alto vacío se 
extraen las fracciones que contienen a las proteínas ya en su punto isoeléctrico, y 
se separan. Dicho enfoque puede corroborarse en un gel SDS-PAGE y teñirse con 
nitrato de plata que es más sensible. Cada fracción se digiere con tripsina y se 
quitan las sales antes de su análisis por espectrometría de masas. Para el caso 
del MiniRotofor se obtienen 20 fracciones de 1 mL aproximadamente cada una, 
mientras que para el MicroRotofor se obtienen 10 fracciones de un volumen 
mucho menor (250 µL aproximadamente). 
 
2.4 Espectrometría de Masas 
 
2.4.1 MALDI-TOF-TOF 
 
Las interfases más comunes son entre la fuente de MALDI (desorción/ionización 
de la matriz asistida por láser) y un analizador de masas de tiempo de vuelo o 
“time of flight” (TOF), esta unión funciona bien ya que la separación por cargas 
iónicas es predominantemente formada con MALDI y porque los analizadores TOF 
tienen un amplio intervalo de masa (de 100 Da a >250,000 Da). El principio de 
MALDI se basa en pulsos de láser que se disparan sobre una placa que contiene 
26 
 
la mezcla del analito no volátil, previamente cristalizado por una matriz conjugada 
con ácidos orgánicos (comúnmente en una matriz de ácido alfa ciano-4-
hidroxicinámico) que diluyen y aíslan al analito, previniendo su agregación. 
 
Dicha placa con la muestra se posiciona en una región al alto vacío del 
espectrómetro de masas y es irradiada con pulsaciones de láser (usualmente 355 
nm), esto permite a la matriz, absorber fuertemente la energía en la región 
ultravioleta en la longitud de onda del láser formando una densa nube de gas de la 
matriz y el analito donde la energía es transferida de la matriz al analito. 
 
Durante esta etapa los analitos son protonados o (desprotonados) por un proceso 
resultado de las colisiones entre el analito neutral y los iones de la matriz 
excitados, llevándose a cabo la transferencia de protones (a este proceso se le 
conoce como desorción). 
 
En el TOF posterior a la producción de iones por MALDI una diferencia de 
potencial (típicamente 20 a 30 kV) acelera todos los iones hacia un tubo de campo 
libre de flujo (el analizador) donde ocurre la separación por tiempo de vuelo, el 
analizador mide el tiempo requerido de los iones generados en la fuente en llegar 
al analizador y golpear en el detector. (Figuras 8 y 9) (Kicman et al., 2007). 
 
El principio está basado en un ión de masa m salido de la fuente de ionización con 
una carga z y un potencial de aceleración V y como todos los iones son 
acelerados con el mismo potencial entonces todos ellos tienen la misma energía 
cinética. 
 
Separadamente, los iones cargados con una masa más grande tendrán una 
velocidad de vuelo menor en el tubo, comparado con aquéllos que tengan una 
masa menor y por tanto se separan de acuerdo a sus velocidades. Los iones de 
un rango de masa- carga (m/z) son seleccionados por la primera sección TOF 
después son fragmentados en la celda de colisión que se encuentra entre los dos 
27 
 
TOF y posteriormente, las masas de los fragmentos son separados en una 
segunda sección TOF, después son dirigidos hacia el detector el cual escanea los 
fragmentos generando un espectro de masas en tándem (Aebersold y Mann, 
2003). 
 
Posteriormente, las proteínas se identifican por lo que se conoce como mapeo de 
péptidos, esto es comparando los espectros de masa resultantes, lista de masas 
de péptidos experimentales contra una lista con masas de péptidos conocidas, 
una base de datos como (UniProtKB o nrNCBI) para lograr así la identificación de 
las proteínas en cuestión (con programas como Protein Pilot o Mascot). Los 
análisis proteómicos de cáncer de mama se realizan por dos principales objetivos, 
el descubrir nuevos marcadores moleculares y que éstos puedan emplearse en el 
diagnóstico y tratamiento de dicha patología. 
 
 
Fig. 8 A. Principales componentes de un espectrómetro de masas. B. Esquema de MALDI- TOF 
TOF (Modificada de Aebersold y Mann, 2003). 
A 
B 
28 
 
 
MALDI- TOF TOF donde TOF1 selecciona los iones, la celda de colisión que se 
incorpora entre las dos secciones los fragmenta al analito y TOF2 los separa, 
luego el reflector compensa las pequeñas diferencias en la energía cinética de los 
iones y después los dirige a un detector que amplifica y cuenta los iones que 
llegan generando su espectro de masa (Figura 8) (Aebersold y Mann, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 9. Vista interna del espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF™ 4800 Analyzer (Tomado del 
catálogo 4800 Plus MALDI TOF/TOF™ Analyzer de Applied Biosystems). 
29 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
La tasa de crecimiento de casos de cáncer de mama sigue en aumento, así como 
la tasa de mortalidad. Esto se debe principalmente a que la detección temprana de 
este padecimiento es poco frecuente, ya que se incrementa sobre todo en países 
en vías de desarrollo, donde más del 80% de los casos que se detectan ya se 
encuentran en etapa avanzada y tan sólo entre 5 y 10% de los casos se detectan 
en las fases iniciales de la enfermedad. La poca detección temprana se debe entre 
otros factores, a la baja cultura de prevención de esta enfermedad, la falta de 
exámenes de autoexploración de la mama, mastografías, entre otras; pero sobre 
todo a los escasos e inespecíficos métodos de diagnóstico a nivel molecular. 
 
La mayoría de los marcadores tumorales actuales, no son útiles en el diagnóstico 
oportuno, ya que ciertos marcadores como por ejemplo erbB2, el cual a pesar de 
ser el oncogén más frecuentemente activado en cáncer de mama no se encuentra 
sobreexpresado en las etapas tempranas de la enfermedad, por lo cual es más 
bien usado en el pronóstico y control evolutivo del tumor. Razón por la cual es 
necesaria la estandarización de técnicas, para la búsqueda de nuevos 
biomarcadores capaces de mejorar el diagnóstico de los diferentes tipos de cáncer 
de mama, en sus diferentes estadios; además que dichos biomarcadores pueden 
ser en un futuro los nuevos blancos terapéuticos contra esta enfermedad. 
30 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 Objetivo General 
 
Identificar proteínas de la línea celular SK-BR-3 derivada de cáncer de mama 
medianteproteómica, previa separación por isoelectroenfoque preparativo. 
 
 
4.2 Objetivos Particulares 
 
 Extraer las proteínas totales de la línea celular SK-BR-3. 
 Realizar la separación de las proteínas de acuerdo a su punto isoeléctrico 
por medio del MiniRotofor y el MicroRotofor. 
 Verificar la fracción del gradiente de pH obtenido por el MiniRotofor y el 
MicroRotofor. 
 Identificar las proteínas por espectrometría de masas en un sistema MALDI 
TOF-TOF. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
En el presente trabajo se utilizaron dos equipos distintos para realizar la 
separación por isoelectroenfoque preparativo de las proteínas de la línea SK-BR-
3, el sistema MiniRotofor y el sistema MicroRotofor. La principal diferencia radica 
en el volumen de la muestra que manejan para el caso del MiniRotofor se requiere 
que la muestra esté contenida en 20 mL mientras que para el sistema 
MicroRotofor se maneja la muestra en un volumen de 3 mL con esto último se 
facilita el manejo de la muestra. 
 
5.1 Cultivo celular de la línea SK-BR-3 
 
Se cultivó la línea celular tumorogénica transformada SK-BR-3 proveniente de un 
adenocarcinoma de mama, en medio McCoy´s 5a con 1.5 mM de L-glutamina y 
2.2 g/L de NaHCO3, suplementado con 10% de suero fetal de bovino, ampicilina y 
estreptomicina 10,000U piruvato de sodio 100 mM y un cocktail de aminoácidos no 
esenciales 10 mM que se incubó a una temperatura de 37°C y una atmósfera 
húmeda de CO2 al 5%. Para realizar la expansión del cultivo, se hicieron dos 
lavados con PBS estéril al 1%, seguido del desprendimiento de las células con 0.5 
mL de tripsina. 
 
Las células se cosecharon a partir de 4 botellas de 25 cm2 (con aproximadamente 
4 millones de células cada una) al llegar a una confluencia del 90%, 
desprendiéndolas con verseno al 5% y centrifugándolas durante 5 min en una 
centrífuga “Clinical Centrifuge” a 1500 rpm; después se retiró el sobrenadante y la 
pastilla resultante se congeló con nitrógeno líquido para su conservación. 
32 
 
 
5.2 Extracción de proteínas totales de la línea celular SK-BR-3 
 
La extracción de proteínas totales de la línea celular SK-BR-3 de la muestra 
preparada para el sistema MiniRotofor se realizó, por medio de una preparación 
de buffer de lisis (Urea 6 M, NP40 al 0.05% y buffer Tris 100 mM pH 7.8), del cual 
se tomaron 500 µL para disolver la pastilla de proteínas. Posteriormente se sonicó 
la mezcla a 60% de amplitud en un sonicador Cole Parmer Instruments CV188, 3 
veces durante diez segundos con intervalos de reposo de 30 s en hielo; finalmente 
se centrifugó el extracto de proteínas a 13,000 x g por 10 min a temperatura 
ambiente obteniendo el sobrenadante el cual se guardó a -80°C hasta su uso. 
 
Mientras que para la extracción de proteínas totales de la línea celular SK-BR-3 de 
la muestra para el sistema MicroRotofor se usó un buffer de lisis (Urea 7M, 
Tiourea 2M, NP40 0.1% y Tris 100 mM pH 7.8) seguido de la incubación con 
benzonasa (que es una endonucleasa para remover el DNA/RNA de la muestra). 
Se usaron 40 u contenidas en 2 µL, se dejó entonces incubar por 4 h a 37°C y se 
obtuvo el sobrenadante centrifugando a 13,000 x g por 10 min seguido por la 
sonicación previamente descrita. 
 
5.3 Preparación de la muestra para el isoelectroenfoque por los sistemas 
MiniRotofor y MicroRotofor 
 
Deslipidación de Proteínas 
En el caso del extracto total de proteínas que se usaron para el isoelectroenfoque 
por el sistema MicroRotofor, se le quitaron los lípidos de la muestra para que no 
interfirieran en la cuantificación y en la preparación para su identificación por 
espectrometrías de masas. Se agregaron por cada 50µL de muestra: 200 µL de 
metanol y se agitó, de igual forma se añadieron 50 µL de cloroformo, seguido de 
agitación por vórtex, luego se adicionaron 150 µL de H2O inyectable seguido de 
agitación y se centrifugaron a 13,000 xg durante 10 min. 
33 
 
Se observaron 2 fases y se retiró el sobrenadante, en seguida se adicionaron 150 
µL de metanol y se agitó por vórtex, se centrifugaron a 13,000 xg durante 10 min, 
se desechó el sobrenadante y a las pastillas resultantes se les realizó una 
segunda deslipidación, seguido por la concentración de las muestras en el 
concentrador (Concentrator Savant Instrument Inc. SVC100H) a 45°C 
posteriormente cada muestra se resuspendió en 50 µL de cloruro de guanidina y 
bicarbonato de amonio 6M. 
 
Cuantificación de Proteínas Totales de la Línea Celular SK-BR-3 
 
Por el método de Lowry en microplacas de ELISA, se realizó la cuantificación de la 
muestra de proteínas totales para su posterior uso en el isoelectroenfoque por el 
sistema MiniRotofor, haciendo diluciones 1:5, 1:10 y 1:20 de la muestra de 
proteínas de SK-BR-3 y una curva de calibración con albúmina sérica bovina 
(BSA) 1 mg/mL; de 1 – 10 µg. Se tomó la lectura de la absorbencia en un lector de 
placas de Elisa y el promedio de la cuantificación de las diluciones permitió 
determinar la cantidad de proteína contenida en la muestra en µg/µL. Mientras que 
para la cuantificación de la muestra de proteínas totales para su posterior uso en 
el sistema MicroRotofor se empleó el kit de ensayo de proteínas por Micro BCA de 
Thermo Scientific y se tomó la absorbencia en un espectrofotómetro 
BioPhotometer, el cual realiza automáticamente la curva de calibración de BSA 
obteniendo directamente la cuantificación de la muestra en µg/mL. 
 
Geles de Poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE) 
 
Para visualizar el patrón de proteínas se realizaron geles de poliacrilamida SDS-
PAGE al 12% con cassettes de 1.5 mm de ancho (Mini-Protean Tetra Cell de 
BioRad) del extracto total de proteínas (Ansubel et. Al, 1994), donde la alícuota de 
la muestra se mezcló con buffer de Laemmli 2X en una proporción 1:1 y fue 
calentada en ebullición por 2 min, por lo que el gel se corrió bajo condiciones 
desnaturalizantes. Se depositaron 4 µL de marcador de peso molecular sin teñir y 
34 
 
10 µg de las muestras de la línea celular SK-BR-3. Se corrió en una fuente de 
poder de BioRad Power Pac 3000 a 100 V. Posteriormente, se tiñó con Azul de 
Coomassie durante 10 min en agitación continua y se destiñó en agitación con 
solución desteñidora durante 30 min para visualizar las bandas hasta que el fondo 
estaba casi transparente. 
 
Reducir/Alquilar/Reducir 
 
La muestra se redujo con ditiotreitol para evitar interacciones en los enlaces 
disulfuro de las proteínas y la iodoacetamida (IAA) se usó para además de alquilar 
el exceso de ditiotreitol (DTT) alquila los grupos thiol de las proteínas, evitando así 
su agregación durante el isoelectroenfoque. Se redujo-alquilo-redujo una alícuota 
de 1 mg de proteína de la línea celular SK-BR-3, tanto para el MiniRotofor como 
para el MicroRotofor. Primero se redujo con 5 µl de ditiotreitol (DTT) 200 mM, 
mezclando por vórtex y se incubó por 1 h. Posteriormente se añadieron 20 µL de 
Iodoacetamida 200 mM, se mezcló por vórtex y se dejó alquilando la mezcla de 
proteínas por 1 h. Nuevamente se añadieron 20 µL de (DTT), esta vez para 
consumir la IAA que no reaccionó y se mezcló por vórtex, incubando la reacción a 
durante 1 h. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente (Kinter 
y Sherman, 2000). 
 
5.3.1 Isoelectroenfoque preparativo mediante el sistema MiniRotofor. 
 
Se realizó el isoelectroenfoque preparativo en el MiniRotofor Cell de BioRad, para 
lo cual primero se lavaron cada una de las piezas con detergente neutro Extrán y 
se dejaron en incubación en NaOH 0.1 M por 1 h y se ensambló el MiniRotofor de 
acuerdo al manual de BioRad. 
 
En el armado se prepararon dos cassettes de ensamble, cada cual con su 
respectiva solución amortiguadora, el de ácido orto-fosfórico 0.1 M contenía a la 
membrana de intercambio catiónico, y el cassette con solución amortiguadora de 
35 
 
hidróxido de sodio0.1 M que contenía la membrana de intercambio aniónico; 
dichas membranas se dejaron equilibrar previamente en sus respectivas 
soluciones amortiguadoras, durante toda la noche y fueron empleadas para 
separar la muestra del electrolito, ya que la membrana de intercambio catiónico se 
encontraba cargada negativamente y de forma contraria, la membrana de 
intercambio aniónico cargada positivamente, repelía los iones positivos 
previniendo con esto la contaminación de la solución amortiguadora y de la 
muestra. 
 
Ya armado el sistema, se le inyectaron 20 mL de una solución que contenía 1 mg 
de la muestra preparada del extracto total de proteínas, urea 7 M, tiourea 2 M y 
1.5% de anfolitos pH 3-10 (BioRad). Se corrió a 10 Watts durante 3.5 h 
manteniendo la temperatura a 4°C con un recirculador externo llegando a 1685 V 
en fuente de poder BioRad Power Pac 3000. 
 
Una vez transcurrido el tiempo del enfoque, para poder obtener las fracciones se 
conectó el MiniRotofor a una fuente de vacío, haciendo que la muestra fuera 
succionada por unas mangueras hacia los tubos recolectores; obteniendo así 20 
fracciones de 1 mL cada una. 
 
Para corroborar el enfoque de las proteínas se midió el pH a cada fracción 
mediante una dilución de 75 µL de la fracción en 2 mL de H2Od para incrementar 
su volumen y permitir su lectura en el potenciómetro Beckman, para 
posteriormente obtener su valor real aplicando la siguiente fórmula: 
 
pH real= -log[10-pH x (Vf/Vi)] 
 
5.3.2 Isoelectroenfoque preparativo mediante el sistema MicroRotofor 
 
Para separar por punto isoeléctrico la compleja muestra de proteínas totales de la 
línea celular SK-BR-3, se utilizó el sistema MicroRotofor ensamblando el aparato 
36 
 
de acuerdo al manual de MicroRotofor Liquid – Phase IEF CEll de BioRad. Se 
usaron membranas de intercambio iónico para crear un gradiente de 
concentración de los iones correspondientes en los respectivos extremos de la 
cámara de enfoque de la muestra. La mayor concentración de iones negativos 
estaba cercana a la membrana de intercambio catiónico y la más alta 
concentración de iones positivos estaba cercana a la membrana de intercambio 
aniónico. Para formar dicha concentración de iones se agregó hidróxido de sodio 
al 0.1 M en el cassette del electrodo del cátodo que contenía la membrana de 
intercambio aniónico y de igual forma, ácido ortofosfórico H3PO4 0.1 M en el 
cassette del electrodo del ánodo que contenía la membrana de intercambio 
catiónico, 
 
Se inyectaron en la cámara de enfoque 3 mL de una solución que contenía 700 µg 
de la muestra de proteína de SK-BR-3, urea 7 M, tiourea 2 M, 0.1 % de detergente 
NP40, así como una mezcla de anfolitos al 1.5% pH 3-10 de BioRad y anfolitos al 
3% de pH 5-7 de BioRad, estos últimos para establecer el gradiente de pH durante 
el enfoque. Se selló la cámara de enfoque sin ninguna burbuja y se corrió el 
isoelectroenfoque a 1 Watt constante, por 3 h a una temperatura de 15 a 20°C. 
El voltaje fue ascendiendo gradualmente, concluyendo el isoelectroenfoque 
después de 3 h con un voltaje final de 405 V 2.2 mA y 1 Watt que se mantuvo 
constante; posteriormente se obtuvieron las 10 fracciones de aproximadamente 
300 µL cada una, de acuerdo al punto isoeléctrico de las proteínas en el área de 
extracción del MicroRotofor por succión al vacío. 
 
Para verificar el gradiente de pH creado por los anfolitos, se midió el pH con un 
potenciómetro haciendo una dilución de 50 µL de cada fracción en 1950 µL de 
H2O desionizada seguido por cálculos para obtener el valor real de pH como se 
describió previamente. 
 
 
 
37 
 
Geles de Poliacrilamida al 12 % 
 
Para confirmar el enfoque de las proteínas, se realizaron 3 geles de poliacrilamida 
al 12%, para las 20 fracciones resultantes del IEF por el sistema MiniRotofor y 2 
geles de poliacrilamida al 12% para las 10 fracciones resultantes del MicroRotofor 
sin ningún tratamiento de precipitación de proteínas. Para lo cual se utilizó el 
equipo Mini-Protean Tetra Cell de BioRad como se describió previamente; para el 
marcador de peso molecular sin teñir, se realizó una dilución 1:10 con H2O de la 
cual se tomaron 2 µL se agregaron 2 µL de buffer de Laemmli 2X y se calentó 
durante 10 s esto dado que los geles se tiñeron con nitrato de plata que es más 
sensible; de igual forma las 20 fracciones resultantes del MiniRotofor y las 10 
fracciones del MicroRotofor previamente calentadas como se describió con 
anterioridad, fueron cargadas en los geles de poliacrilamida al 12% 
respectivamente y se sometieron a 100 V. 
 
Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata 
 
Posteriormente, los 3 geles de poliacrilamida del MiniRotofor y los 2 geles del 
MicroRotofor fueron teñidos con nitrato de plata y se utilizaron 100 mL de cada 
solución para cada gel; primero se fijaron las proteínas con una mezcla de etanol- 
ácido acético- agua en relación 3:1:6 durante 30 min. Se realizó una fijación 
adicional y una reducción con glutaraldehído 0.5% y tiosulfato de sodio (Na2S2O3) 
0.1%, respectivamente, en una solución de etanol 30% en tampón con acetato de 
sodio (NaCH3COO) 0.4 M, pH 6.0 durante 30 min (100 mL). Sucesivamente se 
lavó con agua desionizada por 3 h con cambios cada 15 min. Se tiñó con una 
solución de nitrato de plata (AgNO3) 0.1% en metanol 3%, conteniendo 25 µL de 
formaldehído por cada 100 mL durante 30 minutos. Se enjuagó rápidamente con 
agua desionizada (100 mL). Se reveló con una muestra de carbonato de sodio 
(Na2CO3) 2.5% conteniendo 40 µL de formaldehído por cada 100 mL, de 6-10 min 
(100 mL) y se detuvo la reacción con ácido acético (CH3COOH) 5% durante 10 
min (100 mL). Se hicieron 2 lavados adicionales con agua desionizada durante 10 
38 
 
min y se realizó un tratamiento con glicerol 10% durante 15 min seguido de un 
lavado con agua desionizada por 10 min se tomaron fotos y se secaron. 
 
Posteriormente a las 20 fracciones resultantes del isoelectroenfoque se unieron 
cada 5 fracciones consecutivas, dando así un total de 4 muestras, esto para un 
mejor manejo de las muestras y dado que el uso del espectrómetro de masas es 
limitado. 
 
Precipitación de las Proteínas con ácido tricloroacético 
 
Para recuperar la baja concentración de proteínas en solución, retirar los anfolitos 
usados en el IEF y en el caso del sistema MiniRotofor disminuir el volumen de las 
muestras, se realizó una precipitación de proteínas con ácido tricloroacético. A 
cada una de las 4 muestras del MiniRotofor y a cada una de las 10 fracciones del 
MicroRotofor se les agregó 1 parte de desoxicolato de sodio 20 mg/ml por cada 
200 partes de muestra (dilución final de detergente 1/200), al nuevo volumen se le 
agregó un volumen de TCA concentrado (100%) por cada 9 volúmenes de 
muestra (1/9) y se dejaron incubar por 30 min en hielo. Posteriormente, se 
centrifugaron por 10 min a 13,000 xg y se lavaron con etanol al 70% centrifugando 
por 5 min a 13,000 xg y se retiró el sobrenadante; de igual forma se realizó un 
segundo lavado a todas las muestras y se resuspendió la pastilla de cada una con 
50 µL de cloruro de guanidina 6 M (Ozols, 1990). Por último, cada fracción se 
sonicó tres veces como se describió anteriormente. 
 
Para el caso de las cuatro muestras del MiniRotofor, se eliminaron los lípidos de la 
misma forma que se describió previamente, con la finalidad de que no interfirieran 
en la identificación de proteínas por espectrometría de masas. 
 
 
 
 
39 
 
Generación de péptidos mediante tripsina 
 
Se usó tripsina para cortar en las uniones lisina-arginina de las proteínas de 
ambas muestras (MiniRotofor y MicroRotofor) y generar péptidos ya que por 
facilidad el espectrómetro de masas trabaja con péptidos y no con proteínas. Para 
permitir la acción de la enzima, se diluyó la concentración de cloruro de guanidina 
de 6 M a 0.85 M con 350 µL de H2O inyectable. Se le agregaron