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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA DE GASES BIDIMENSIONAL PARA LA DETERMINACIÓN DE HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍLICOS EN MATERIAL PARTICULADO ATMOSFÉRICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: Q U Í M I C A PRESENTA MARISOL ROMERO MARTÍNEZ MÉXICO, D.F. 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: Presidente profesor: Francisco Rojo Callejas Vocal profesor: José de Jesús García Valdés Secretario profesor: Omar Amador Muñoz 1er. Suplente profesora: María de la Paz Orta Pérez 2° Suplente profesora: Silvia Citlalli Gama González Sitio donde se desarrolló el tema: Laboratorio de Especiación Química de Aerosoles Atmosféricos y Desarrollo de Métodos Analíticos, Grupo de Mutagénesis Ambiental, Centro de Ciencias de la Atmósfera, UNAM. ASESOR DEL TEMA: DR. OMAR AMADOR MUÑOZ SUPERVISOR TÉCNICO: Q. ALFONSO ENRIQUE HERNÁNDEZ LÓPEZ SUSTENTANTE: MARISOL ROMERO MARTÍNEZ Agradecimientos Académicos Al Dr. Omar Amador Muñoz por la asesoría en el uso del cromatógrafo de gases, tratamiento de datos, dirección del proyecto, sugerencias, comentarios y apoyo. Al Dr. Francisco Arenas Huertero y al proyecto HIM/2011/008 del Hospital Infantil de México Federico Gómez por la beca otorgada y el financiamiento para llevar a cabo el estudio. Al Dr. Arón Jazcilevich Diamant y a los proyectos 23600 de CONACYT-SEMARNAT, PAPIIT IN16810-3 de la UNAM por el apoyo parcial para desarrollar este estudio. Al Dr. Rafael Villalobos y Pietrini por permitirme realizar la tesis en el Grupo de Mutagénesis Ambiental. Al Q. Enrique Hernández López por la asesoría y supervisión técnica en el tratamiento de las muestras, uso de equipos, material de laboratorio, uso del software y análisis de datos. A la M. en C. Brenda Liz Valle Hernández por la asesoría técnica, a la Q. Maribel Hernández por su apoyo en el desarrollo experimental, a los químicos Graciela Santos, Griselda Maya, Jairo Vázquez, Yesica Flores y Estela Flores por su asesoría técnica y en el uso del software. Al M. en C. Francisco Rojo Callejas y al Dr. José de Jesús García Valdés por la revisión del presente trabajo y por sus oportunos comentarios. ÍNDICE 1. RESUMEN ........................................................................................................................................... 1 2. ANTECEDENTES .................................................................................................................................. 3 2.1 CONTAMINACIÓN ......................................................................................................................................... 3 2.2 AEROSOL ATMOSFÉRICO ................................................................................................................................ 3 2.3 MATERIAL PARTICULADO ............................................................................................................................... 3 2.3.1 Composición del material particulado ............................................................................................. 4 2.4 HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS ..................................................................................................... 5 2.5 ANÁLISIS QUÍMICO DE AEROSOLES ATMOSFÉRICOS .............................................................................................. 8 2.6 EXTRACCIÓN ASISTIDA POR ULTRASONIDO ......................................................................................................... 8 2.7 MÉTODOS DE SEPARACIÓN ............................................................................................................................. 8 2.8 CROMATOGRAFÍA ......................................................................................................................................... 9 2.9 CROMATOGRAFÍA DE GASES ............................................................................................................................ 9 2.9.1 Parámetros cromatográficos ......................................................................................................... 10 2.10 CROMATOGRAFÍA MULTIDIMENSIONAL ......................................................................................................... 13 2.11 CROMATOGRAFÍA DE GASES MULTIDIMENSIONAL ............................................................................................ 14 2.12 CROMATOGRAFÍA DE GASES BIDIMENSIONAL COMPLETA ................................................................................... 14 2.12.1 Instrumentación ........................................................................................................................... 17 2.12.1.1 Columnas ............................................................................................................................................... 17 2.12.1.2 Modulación ............................................................................................................................................ 18 2.12.1.3 Detección ............................................................................................................................................... 23 2.12.2 Generación y visualización de datos ............................................................................................ 25 2.8 VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO .......................................................................................................... 26 2.8.1 Exactitud ........................................................................................................................................ 27 2.8.2 Sesgo .............................................................................................................................................. 27 2.8.3 Recuperación ................................................................................................................................. 27 2.8.4 Precisión ......................................................................................................................................... 27 2.8.5 Sensibilidad .................................................................................................................................... 28 2.8.6 Selectividad .................................................................................................................................... 28 2.8.7 Especificidad .................................................................................................................................. 28 2.8.8 Linealidad ....................................................................................................................................... 29 2.8.9 Límite de detección ........................................................................................................................ 29 2.8.10 Límite de cuantificación ...............................................................................................................30 2.8.11 Rango ........................................................................................................................................... 30 2.8.12 Intervalo lineal ............................................................................................................................. 30 2.8.13 Robustez ...................................................................................................................................... 31 3. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 32 3.1 GENERAL .................................................................................................................................................. 32 3.2 PARTICULARES ........................................................................................................................................... 32 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL ........................................................................................................... 33 4.1 SEPARACIÓN DE FAMILIAS ORGÁNICAS POR CGXCG .......................................................................................... 33 4.1.1 Preparación de disoluciones estándar para el análisis cualitativo por CGxCG ............................. 33 4.1.2 Optimización de las condiciones del CGxCG ................................................................................... 34 4.2 ANÁLISIS INSTRUMENTAL CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE HAP POR CGXCG Y CG-EM ...................................... 36 4.2.1 Curvas de calibración ..................................................................................................................... 36 4.2.2 Análisis cualitativo de HAP............................................................................................................. 44 4.2.3 Análisis cuantitativo ....................................................................................................................... 45 4.2.3.1 Factor de respuesta relativo .................................................................................................................... 45 4.2.3.2 Homocedasticidad de las varianzas ......................................................................................................... 45 4.2.3.3 Precisión .................................................................................................................................................. 46 4.2.3.4 Recta de regresión ponderada................................................................................................................. 47 4.2.3.5 Límites de detección y de cuantificación ................................................................................................. 48 4.2.3.6 Intervalo de trabajo y rango .................................................................................................................... 49 4.2.3.7 Linealidad................................................................................................................................................. 49 4.3 CUANTIFICACIÓN DE HAP EN MUESTRAS DE PM2.5 POR CGXCG Y CONFIRMADOS POR CG-EM ................................ 49 4.3.1 Muestreo ........................................................................................................................................ 49 4.3.2 Procedimiento de extracción ......................................................................................................... 50 4.3.3 Análisis cualitativo ......................................................................................................................... 51 4.3.4 Análisis cuantitativo ....................................................................................................................... 51 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................... 52 5.1 SEPARACIÓN DE FAMILIAS ORGÁNICAS POR CGXCG .......................................................................................... 52 5.1.1 Comparación de la sensibilidad entre CG y CGxCG ........................................................................ 57 5.1.2 Comparación de la resolución entre CG y CGxCG .......................................................................... 59 5.2 ANÁLISIS INSTRUMENTAL CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE HAP POR CGXCG Y CG-EM ......................................... 60 5.2.1. Análisis cualitativo de los HAP ...................................................................................................... 60 5.2.2 Análisis cuantitativo de los HAP ..................................................................................................... 73 5.2.2.1 Evaluación de la homocedasticidad de las varianzas ............................................................................... 75 5.2.2.2 Precisión .................................................................................................................................................. 79 5.2.2.2.1 Precisión de los FRR en el mismo nivel de calibración ...................................................................... 79 5.2.2.2.2 Precisión de los factores de respuesta relativos (FRR) en toda la regresión ..................................... 81 5.2.2.3 Curvas de calibración ponderadas ........................................................................................................... 83 5.2.2.4 Límites de detección y de cuantificación ................................................................................................. 85 5.2.2.5 Intervalo lineal de trabajo........................................................................................................................ 87 5.2.2.6 Linealidad................................................................................................................................................. 88 5.3 HAP EN PM2.5 .......................................................................................................................................... 91 5.3.1 Identificación por CGxCG y CG-EM ................................................................................................. 91 5.3.2 Cuantificación de HAP en PM2.5 ..................................................................................................... 95 5.3.2.1 Muestras no fortificadas .......................................................................................................................... 95 5.3.2.2 Muestras fortificadas ............................................................................................................................... 96 6. CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 101 7. RECOMENDACIONES ...................................................................................................................... 102 ANEXO I. VERIFICACIÓN DE LA BALANZA ANALÍTICA .............................................................................. 103 8. REFERENCIAS .................................................................................................................................. 104 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Composición representativa de las partículas suspendidas ............................................................ 5 Figura 2. Efecto de algunos HAP en el ADN .................................................................................................. 6 Figura 3. Pico cromatográfico .................................................................................................................... 12 Figura 4. Comparación entre cromatografía de gases mutidimensional y cromatografía de gases bidimensional completa. ...................................................................................................................15 Figura 5. Distribución de oxi-HAP en el plano bidimensional de acuerdo a su interacción con cada columna ......................................................................................................................................................... 16 Figura 6. Modulador de barrido de dos etapas ........................................................................................... 19 Figura 7. Funcionamiento del modulador de circuito. ................................................................................ 21 Figura 8. Arreglo instrumental de la CGxCG .............................................................................................. 25 Figura 9. Generación y visualización de cromatogramas por CGxCG. .......................................................... 26 Figura 10. Curva de calibración .................................................................................................................. 31 Figura 11. Preparación de disoluciones ...................................................................................................... 33 Figura 12. Optimización de las condiciones en el sistema bidimensional .................................................... 35 Figura 13. Preparación de las disoluciones “stock” para cada HAP ............................................................. 36 Figura 14. Preparación de las disoluciones de trabajo ................................................................................ 40 Figura 15. Preparación del estándar interno .............................................................................................. 42 Figura 16. Preparación de las curvas de calibración para los HAP ............................................................... 43 Figura 17. Diagrama experimental del proceso de extracción ..................................................................... 50 Figura 18. Concentración de las muestras con N2 grado cromatográfico ..................................................... 51 Figura 19. Cromatogramas unidimensionales empalmados de las familias orgánicas .................................. 56 Figura 20. Cromatograma modulado de la mezcla compleja con 79 compuestos orgánicos ........................ 56 Figura 21. Cromatograma bidimensional de la mezcla compleja con 79 compuestos orgánicos .................. 56 Figura 22. Representación tridimensional del cromatograma por CGxCG de la separación de 79 compuestos orgánicos .......................................................................................................................................... 57 Figura 23. Blanco fortificado CG - CGxCG. .................................................................................................. 58 Figura 24. Espectro de masas del naftaleno ............................................................................................... 62 Figura 25. Espectro de masas del acenaftileno ........................................................................................... 62 Figura 26. Espectro de masas del acenafteno ............................................................................................. 62 Figura 27. Espectro de masas del fluoreno ................................................................................................. 63 Figura 28. Espectro de masas del fenantreno ............................................................................................. 63 Figura 29. Espectro de masas del antraceno .............................................................................................. 63 Figura 30. Espectro de masas del 2-metilantraceno .................................................................................. 64 Figura 31. Espectro de masas del 1-metilantraceno ................................................................................... 64 Figura 32. Espectro de masas del 4,5-metilenfenantreno ........................................................................... 64 Figura 33. Espectro de masas del 9-metilantraceno ................................................................................... 65 Figura 34. Espectro de masas del 3,6-dimetilfenantreno ............................................................................ 65 Figura 35. Espectro de masas del fluoranteno ............................................................................................ 65 Figura 36. Espectro de masas del pireno .................................................................................................... 66 Figura 37. Espectro de masas del 9,10-dimetilantraceno ............................................................................ 66 Figura 38. Espectro de masas del tripticeno ............................................................................................... 66 Figura 39. Espectro de masas del benzo[a]fluoreno ................................................................................... 67 Figura 40. Espectro de masas del benzo[a]antraceno ................................................................................. 67 Figura 41. Espectro de masas del Criseno .................................................................................................. 67 Figura 42. Espectro de masas del trifenileno .............................................................................................. 68 Figura 43. Espectro de masas del benzo[b]fluoranteno .............................................................................. 68 Figura 44. Espectro de masas del benzo[k]fluoranteno .............................................................................. 68 Figura 45. Espectro de masas del 7,12-dimetilbenzo[a]antraceno .............................................................. 69 Figura 46.Espectro de masas del benzo[e]pireno ....................................................................................... 69 Figura 47. Espectro de masas del benzo[a]pireno ...................................................................................... 69 Figura 48. Espectro de masas del perileno ................................................................................................. 70 Figura 49. Espectro de masas del indeno[1,2,3-cd]pireno........................................................................... 70 Figura 50. Espectro de masas del dibenzo[a,h]antraceno .......................................................................... 70 Figura 51. Espectro de masas del dibenzo[a,c]antraceno ........................................................................... 71 Figura 52. Espectro de masas del benzo[ghi]perileno ................................................................................. 71 Figura 53. Espectro de masas del estándar interno (1-bromo-2-nitrobenceno) ........................................... 71 Figura 54. Cromatograma de iones totales de los HAP del nivel 8 (30 ng µL -1 ) de la curva de calibración analizados por GC-EM ....................................................................................................................... 72 Figura 55. Cromatograma bidimensional de los HAP del nivel 4 de la curva de calibración (15 ng µL -1 ). ...... 72 Figura 56. Curva de calibración del benzo[a]antraceno .............................................................................. 73 Figura 57. Gráfico de residuales de la curva de calibración ......................................................................... 74 Figura 58. Curva de calibración del tripticeno ............................................................................................ 75 Figura 59. Precisión de las inyecciones para el fluoreno ............................................................................. 80 Figura 60. Cromatograma bidimensional del extracto fortificado de Merced ..............................................93 Figura 61. Cromatograma bidimensional del extracto no fortificado de Merced ......................................... 93 Figura 62. Cromatogramas tridimensionales del extracto de Merced fortificado y no fortificado ............... 93 Figura 63. Cromatograma bidimensional del extracto fortificado de San Agustín ........................................ 94 Figura 64. Cromatograma bidimensional del extracto no fortificado de San Agustín ................................... 94 Figura 65. Cromatogramas tridimensionales del extracto de San Agustín fortificado y no fortificado ......... 94 Figura 66. Blanco fortificado ...................................................................................................................... 95 Figura 67. Blanco no fortificado ................................................................................................................. 95 Figura 68. HAP en el extracto orgánico de Merced (Centro) ....................................................................... 99 Figura 69. HAP en el extracto orgánico de San Agustín (Noreste) ............................................................ 100 ÍNDICE DE TABLAS Tabla I. Clasificación de partículas de acuerdo a su tamaño ......................................................................... 4 Tabla II. Estructura de algunos HAP estudiados por la IARC y sus pesos moleculares ................................... 7 Tabla III. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna ............................................................. 9 Tabla IV. Algunas fases estacionarias que se utilizan en CGxCG ................................................................. 18 Tabla V. Tipos de moduladores .................................................................................................................. 22 Tabla VI. Concentraciones de los compuestos empleados para el análisis cualitativo ................................ 34 Tabla VII. Condiciones instrumentales por CGxCG ...................................................................................... 34 Tabla VIII. Curva de calibración planteada para cuantificar HAP en PM2.5 ................................................... 36 Tabla IX. Disoluciones individuales “stock” de los HAP ............................................................................... 37 Tabla X. Masa y concentración de los HAP en la disolución madre (DM). .................................................. 39 Tabla XI. Masa y concentración de los HAP en la disolución de trabajo I (DT1). ......................................... 41 Tabla XII. Masa y concentración de los HAP en la disolución de trabajo 2 (DT2). ........................................ 42 Tabla XIII. Preparación de los niveles de concentración de la curva de calibración. .................................... 43 Tabla XIV. Concentración de los HAP a los diferentes niveles de concentración ......................................... 44 Tabla XV. Separación de las diferentes familias de compuestos por CG y CGxCG ........................................ 52 Tabla XVI. Tiempos de retención para el análisis cualitativo en la primera y segunda dimensiones, iones principales y secundarios. ................................................................................................................. 54 Tabla XVII. Comparación de la sensibilidad entre CGxCG y CG .................................................................... 58 Tabla XVIII. Cálculo de la resolución .......................................................................................................... 59 Tabla XIX. Determinación del número de platos teóricos (N) y compuestos teóricamente separables (nc) . 60 Tabla XX. Análisis cualitativo de los HAP .................................................................................................... 61 Tabla XXI. Residuales................................................................................................................................. 74 Tabla XXII. Evaluación de las varianzas para el tripticeno .......................................................................... 75 Tabla XXIII. Evaluación de la homocedasticidad de las varianzas ................................................................ 76 Tabla XXIV. Precisión de los FRR para cada nivel de calibración del benzo[ghi]perileno ............................... 80 Tabla XXV. Precisión del método ............................................................................................................... 81 Tabla XXVI. Determinación de los porcentajes de los coeficientes de variación de los factores de respuesta relativos del acenafteno en toda la regresión instrumental ................................................................ 82 Tabla XXVII. Coeficiente de variación de los factores de respuesta relativos de los HAP ............................. 82 Tabla XXVIII. Cálculo para determinar la regresión lineal ponderada del fluoranteno ................................. 83 Tabla XXIX. Parámetros de regresión lineal ponderada .............................................................................. 84 Tabla XXX. Determinación de la desviación estándar de la regresión lineal ponderada ............................... 84 Tabla XXXI. Parámetros de las curvas de calibración ponderadas instrumentales de los HAP por CGxCG-DILL ......................................................................................................................................................... 85 Tabla XXXII. Límites de detección instrumentales y de cuantificación ponderados de los HAP por CGxCG- DILL................................................................................................................................................... 86 Tabla XXXIII. Intervalos de trabajo y rango instrumentales para los HAP determinados por CGxCG-DILL..... 87 Tabla XXXIV. Cálculos para determinar el coeficiente de determinación del perileno ................................. 88 Tabla XXXV. Evaluación de la linealidad de las curvas de calibración instrumentales de los HAP determinados por CGxCG-DILL .......................................................................................................... 89 Tabla XXXVI. Cálculos para el ANOVA del perileno ..................................................................................... 90 Tabla XXXVII. Análisis de varianza para el benzo[a]pireno .......................................................................... 90 Tabla XXXVIII. Evaluación de la linealidad instrumental a través del análisis de varianza para los HAP ........ 91 Tabla XXXIX. HAP presentes en las muestras reales identificados por CG-EM ............................................. 92 Tabla XL. Concentraciones de los HAP en los extractos orgánicos de Merced ............................................ 98 Tabla XLI. Concentraciones de los HAP en los extractos orgánicos de San Agustín ..................................... 99 Tabla XLII. Verificación del 31-Jul-12 ........................................................................................................ 103 Tabla XLIII. Verificación del 01-Ago-12 ..................................................................................................... 103 Resumen 1 1. RESUMEN La composición química de los aerosoles orgánicos atmosféricos es compleja, su elucidación permite el seguimiento de fuentes de emisión, así como la evaluación de los efectos en la salud humana y en el clima (Goldstein et al. 2008). Dicha complejidad aumenta el tratamiento de la muestra para identificar y cuantificar inequívocamente a los analitos de interés. La cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas ha sido una de las técnicas utilizadas ampliamente para el análisisde compuestos orgánicos en los aerosoles (Dean 1998), sin embargo cuando la matriz es muy compleja, es posible tener falsos-positivos. La cromatografía de gases bidimensional (CGxCG) surge como una alternativa al tratamiento exhaustivo de la muestra, ya que la pre-purificación se realiza en línea. Esta técnica incrementa la resolución y la sensibilidad en al menos un orden de magnitud con respecto a la cromatografía de gases (CG) convencional (Phillips & Liu 1991). El objetivo del presente trabajo fue optimizar las condiciones de separación por CGxCG con detector de ionización de llama para la determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos en material particulado menor a 2.5 µm (PM2.5). Se utilizó un arreglo ortogonal que consistió en una columna no polar (5 % fenil – 95 % polidimetil siloxano) y una polar (50 % fenil – 50 % polidimetil siloxano). Los parámetros optimizados fueron: periodo de modulación 4000 ms, inicio de modulación 4.5 min, pulso de modulación 150 ms, flujo del gas acarreador 4 mL min-1 y rampa de temperatura 5 °C min-1. Estas condiciones se aplicaron para separar 79 compuestos mezclados en una disolución estándar. Se prepararon curvas de calibración para 29 hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) a partir de disoluciones “stock” de cada uno (1 mg mL-1), así como disoluciones madre y de trabajo, en un intervalo de concentración entre 0.5 ng µL-1 y 30 ng µL-1. Se adicionó 1-bromo-2-nitrobenceno como estándar interno. Se evaluaron parámetros de validación del sistema cromatográfico como linealidad, límites de detección, límites de cuantificación, precisión y selectividad. Para evaluar el método en muestras reales, se extrajo material particulado ≤ 2.5 µm colectado el 1, 5, 9, 17 y 31 de diciembre de 2006, al Noreste y Centro de la Ciudad de México, durante 24 h en colectores de altos volúmenes a 1.13±10 % m3 min-1. Las partículas se colectaron en filtros de fibra de vidrio recubiertos con teflón (20 x 25 cm), se utilizaron dos décimos por cada día de muestreo. Para Resumen 2 evaluar eficiencia y tener un criterio adicional de identificación, los filtros se fortificaron con la disolución madre. Los HAP presentes en dicha mezcla y completamente resueltos se cuantificaron por el método de estándar interno. Las condiciones establecidas por CGxCG permitieron la separación de 70 compuestos. Para los HAP, los coeficientes de variación de los tiempos de retención relativos en la primera dimensión oscilaron entre 0.17 % (acenafteno) y 0.22 % (benzo[a]antraceno), mientras que en la segunda dimensión entre 0.87 % (benzo[a]fluoreno) y 4.19 % (perileno). Los coeficientes de correlación de las curvas de calibración se encontraron entre 0.989 (acenafteno) y 0.999 (benzo[a]pireno) (p<0.05). Los límites de detección oscilaron entre 0.11 ng µL-1 (benzo[ghi]perileno) y 2.16 ng µL-1 (benzo[e]pireno), mientras que los límites de cuantificación oscilaron entre 0.38 ng µL-1 (benzo[ghi]perileno) y 5.70 ng µL-1 (benzo[e]pireno). Los intervalos de trabajo se encontraron entre 0.38 y 31.32 ng µL-1. Se separaron, identificaron y cuantificaron 8 HAP y 2 grupos de HAP en los extractos orgánicos de las PM2.5. La CGxCG mostró un aumento en la sensibilidad contra la CG entre 2.8 y 11 veces, para el perileno y el benzo[a]perileno respectivamente. Al tener un segundo parámetro de separación la resolución se vio incrementada considerablemente para compuestos que coeluían en la primera dimensión, por otro lado la capacidad máxima de ambas dimensiones fue de 332 compuestos teóricamente separables y 30 para la segunda dimensión mientras que la CGxCG generó 9894 compuestos teóricamente separables. Antecedentes 3 2. ANTECEDENTES 2.1 Contaminación Desde el punto de vista físico, la contaminación atmosférica se define como la impurificación de la misma por introducción y permanencia temporal de energía o materia gaseosa, líquida o sólida, ajenas a su composición normal o en proporción claramente superior a ésta (Puigcerver y Carrascal 2008). Los contaminantes del aire se pueden clasificar como criterio y no criterio; los primeros han sido objeto de evaluaciones con el fin de establecer niveles permitidos que protejan el ambiente, la salud y el bienestar de la población, entre los que figuran el material particulado, ozono, monóxido de carbono, óxidos de azufre, óxidos de nitrógeno y plomo. Aunque los no criterio no poseen dichos límites, algunos también deben medirse debido a sus propiedades tóxicas (INE 2010, EPA 2012). 2.2 Aerosol atmosférico El aerosol atmosférico está conformado por partículas sólidas y/o líquidas (a excepción del agua) suspendidas en el aire, éste es ubicuo, se genera por procesos tanto naturales como antropogénicos. La composición del aerosol atmosférico depende de diversos factores, como fuentes de emisión, condiciones geográficas y climáticas y la reactividad atmosférica (Amador- Muñoz et al. 2010). Se conoce que los aerosoles tienen un rol importante en la atmósfera por sus efectos en la salud, la calidad del aire, la visibilidad y el clima (Ansari 2009, CCSP 2009). 2.3 Material particulado En diciembre de 1952, un serio episodio de contaminación ocurrió en Londres con gran impacto en la percepción pública de la contaminación en el aire, se estima que causó alrededor de 4000 muertes; las concentraciones de humo negro excedieron los 1600 μg m-3 (Harrison y Yin 2000, Bell et al. 2004). A partir del análisis de dicho episodio, se demostró correlación significativa entre la mortalidad y la cantidad de material particulado, dadas las tasas de hospitalización por enfermedades cardiacas y respiratorias (Schwartz y Marcus 1990, Bell y Davis 2001). Extractos orgánicos de material particulado inyectados en ratones mostraron efectos cancerígenos (Epstein et al. 1979). Antecedentes 4 El tamaño de las partículas está vinculado directamente con el potencial para ocasionar problemas a la salud, de él dependen la capacidad de penetración y de retención en diversas regiones de las vías aéreas respiratorias; así como el tiempo de residencia en la atmósfera y por ende la dosis de exposición de la población (NOM-025-SSA1-1993 2005). Las partículas pueden clasificarse de acuerdo con su diámetro aerodinámico en tres categorías como se indica en la tabla I. Tabla I. Clasificación de partículas de acuerdo a su tamaño (EPA 2010) Descripción EPA Tamaño de partícula Fuentes de emisión Gruesas 2.5 µm< d.a. ≤ 10 µm Partículas primarias emitidas directamente a la atmósfera tanto por fenómenos naturales como por actividades antropogénicas. Finas 0.1 µm <d.a. ≤ 2.5 µm Generadas por reacciones químicas en la atmósfera, a partir de la quema de combustibles (vehículos de motor, generación de energía, quema de leña, instalaciones industriales). Ultrafinas d.a. ≤ 0.1 µm Originadas por procesos de combustión y fuentes metalúrgicas. d.a. – diámetro aerodinámico Los pasajes nasales protegen el tracto respiratorio de ciertos contaminantes ambientales al filtrar el aire inhalado (Calderón et al. 1998), sin embargo las partículas con diámetros entre 2.1 µm y 10 µm se retienen en faringe, tráquea y bronquios, mientras que las de diámetros menores a los 2.1 µm pueden llegar hasta los alveolos (Cecinato et al. 1999). La exposición crónica a contaminación aérea induce un crecimiento anormal de la células, deteriorando las defensas respiratorias contra agentes infecciosos, siendo un factor asociado con problemas cardiopulmonares y de cáncer pulmonar (Lemos et al. 2002, Pope et al. 2002). 2.3.1 Composición del material particulado El material particulado es una mezcla compleja de partículas constituidas por carbono, compuestos inorgánicos (entre los que se encuentran metales pesados, óxidos, sulfatos, nitratos y ácidos), material de origen biológico(residuos de plantas, animales y esporas) y compuestos orgánicos (tales como alcanos, ácidos grasos, hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), HAP oxigenados (oxi-HAP) y ácidos dicarboxílicos) (HEI 2002, Neusüss et al. 2000). La especiación química de la materia orgánica extraída (MOE) permite el seguimiento de fuentes de emisión y la Antecedentes 5 evaluación de los efectos en la salud humana y el clima (Goldstein et al. 2008). (). La figura 1 muestra esquemáticamente la composición del material particulado. Figura 1. Composición representativa de las partículas suspendidas 2.4 Hidrocarburos aromáticos policíclicos Los padecimientos a la salud pueden generarse por la presencia de compuestos orgánicos en las partículas atmosféricas como son los HAP o sus derivados oxigenados o nitrados. Se ha demostrado que algunos compuestos de esta familia tienen potencial cancerígeno (Harvey 1997, IARC 2010). Una vez en el organismo, los HAP pueden asociarse con el ácido desoxirribonucleico (ADN) y formar intermediarios denominados aductos. Si el ADN se ve modificado en su estructura antes de su replicación provocará mutaciones en las células (figura 2), lo que puede llevar a la formación de tumores (Peltonen 2004, Phillips 1983). Un estudio efectuado por el “Children's Environmental Health Center” reveló que 40 % de los niños nacidos de madres expuestas a HAP durante el embarazo presentaban daños en la estructura del ADN (Perera et al. 2005). Existe evidencia epidemiológica que relaciona la presencia de HAP con problemas de cáncer de pulmón (principalmente cuando la vía de exposición es por inhalación), piel y vejiga (Boffetta et al. 1997). PM 1O Metales Polvo Carbono orgánico Sal marina Nitratos Polen Esporas PM 2.5 Sulfatos Nitratos Amonio Carbono orgánico Carbono elemental Metales Antecedentes 6 Figura 2. Efecto de algunos HAP en el ADN Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son un grupo de compuestos orgánicos semivolátiles, formados por dos o más anillos aromáticos fusionados, en estructuras lineares o angulares (EPA 2011). Pueden formarse en cualquier proceso de pirólisis por la combustión incompleta de combustibles fósiles o compuestos con carbono e hidrógeno. En las ciudades se emiten principalmente por automóviles, industrias, quema al aire libre (basura, llantas, plásticos, etc.), así como por el humo de tabaco y de forma natural por los incendios forestales y la emisión en volcanes (Badger 1962, Raymond 2005). Estos compuestos son contaminantes ubicuos. Los perfiles diurnos en áreas urbanas muestran una elevada concentración en las primeras horas de la mañana. Más de 100 HAP se han identificado en el material particulado, la localización de esos compuestos depende de las fuentes de emisión y de las condiciones meteorológicas (Schauer et al. 2003). Algunas estructuras de HAP se muestran en la tabla II. Antecedentes 7 Tabla II. Estructura de algunos HAP estudiados por la IARC (2010) y sus pesos moleculares (g mol-1) Naftaleno Antraceno Fenantreno Trifenileno 128.17 178.23 178.23 228.28 Criseno Fluoranteno Pireno Benzo[a]antraceno 228.23 202.25 202.25 228.23 Reteno Benzo[a]pireno Benzo[e]pireno Benzo[k]fluoranteno 234.34 252.31 252.31 252.31 Benzo[a]fluoreno Benzo[b]fluoranteno Benzo[ghi]perileno Coroneno 216.27 252.31 276.33 300.35 Perileno Indeno[1,2,3-cd]pireno Fluoreno Acenafteno 252.31 276.33 166.22 154.21 Acenaftileno Dibenzo[a,h]antraceno Tripticeno Benzo[j]flouranteno 152.19 278.35 254.33 252.31 Antecedentes 8 2.5 Análisis químico de aerosoles atmosféricos El análisis de compuestos orgánicos en muestras ambientales es en general un procedimiento complicado que involucra gran cantidad de etapas que pueden involucrar el uso de una técnica de separación y de detección. La precisión y la exactitud de un resultado no sólo depende del método de separación sino que involucran una serie de operaciones previas al análisis, entre las que figuran el muestreo, el almacenamiento, el pre-tratamiento de la muestra, la extracción de la muestra y si es necesario una eliminación de interferentes o su preconcentración (Dean 1998). 2.6 Extracción asistida por ultrasonido La extracción es un método de preparación de muestra fundamental, el principal objetivo es separar al analito de interés de la matriz de la muestra utilizando un disolvente o calor, este proceso debe ser eficiente y preferentemente selectivo. Los disolventes empleados por los diversos métodos de extracción pueden ser líquidos orgánicos, fluidos supercríticos o líquidos supercalentados (Smith 2003). La extracción asistida por ultrasonido se utiliza para transferir compuestos orgánicos de una matriz a un disolvente por el fenómeno de cavitación (expansión y contracción de burbujas microscópicas) producida en este último por el paso de una onda ultrasónica. Durante el ciclo de expansión, también conocido como rarefacción, las burbujas se forman con vapor del disolvente, durante el ciclo de compresión el gas interno se comprime generando un aumento significativo de la temperatura y presión, resultando en el colapso de la burbuja que forma una onda de choque a través del disolvente (Paniwnyk et al. 2001). 2.7 Métodos de separación Al estudiar mezclas complejas, puede ocurrir que varios de los constituyentes contribuyan al valor de la respuesta que se observa al aplicar la técnica de medición elegida. La eliminación de la influencia de las especies interferentes se convierte en una parte crítica de la operación analítica, la solución más general a este problema consiste en la segregación física real del analito de las sustancias interferentes, este procedimiento se conoce con el nombre de separación. Todos los procedimientos de separación comparten un principio común, se basan en la distribución selectiva de los componentes de la muestra entre dos fases distintas (Pickering 1980). Antecedentes 9 2.8 Cromatografía La cromatografía es una técnica de separación ampliamente utilizada para identificar y determinar los compontes químicos de mezclas complejas; todas éstas tienen en común el uso de una fase estacionaria y una fase móvil. La fase móvil es un líquido o un gas, la fase estacionaria es normalmente un líquido viscoso enlazado químicamente a las paredes de un tubo capilar o a la superficie de las partículas sólidas empaquetadas en la columna. Los componentes de la mezcla se hacen pasar a través de la fase estacionaria mediante la corriente de una fase móvil gaseosa o líquida, la separación se fundamenta en las distintas velocidades de migración de los componentes de la muestra (Skoog 2008, Harris 2003). Tabla III. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna (Skoog 2008) Clasificación general Método específico Fase estacionaria Tipo de equilibrio Cromatografía de líquidos (LC) (fase móvil: líquida) Líquido-Líquido, o reparto Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos inmiscibles Líquido-fase unida químicamente Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Líquido-sólido o adsorción Sólido Adsorción Intercambio iónico Resina de intercambio iónico Intercambio iónico Exclusión por tamaño Líquido en los intersticios de un sólido polimérico Distribución/exclusión Cromatografía de gases (GC) (fase móvil: gas) Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre un gas y un líquido Gas-fase unida químicamente Especies orgánicas enlazadas a una superficie sólida Distribución entre el líquido y la superficie enlazada Gas sólidoSólido Adsorción Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) (fase móvil: fluido supercrítico) Especies orgánicas enlazadas a un superficie sólida Distribución entre el fluido supercrítico y la superficie enlazada 2.9 Cromatografía de gases Los HAP y otros contaminantes presentes en el aerosol atmosférico se encuentran en mezclas complejas, la especiación química de muestras atmosféricas requiere de una separación suficiente para su análisis (Phillips et al. 1999), que generalmente se realiza por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (Gosink 1975), dicho acoplamiento genera análisis con un gran poder de resolución y sensibilidad. En cromatografía de gases, la muestra se volatiliza y se inyecta en la columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de un gas inerte, generalmente He, N2 o H2, que Antecedentes 10 no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportarlo a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases: la cromatografía gas-sólido y la cromatografía gas - líquido, que tiene mayor aplicación en diversas áreas. Esta última se basa en la distribución del analito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquida inmovilizada (sílice fundida) sobre la superficie de un sólido inerte (un polímero conocido como poliimida) (Harris 2003). 2.9.1 Parámetros cromatográficos . A partir de los cromatogramas, se derivan parámetros que se correlacionan con descripciones de proceso moleculares que tienen lugar durante la separación, a continuación se describen algunos de éstos (Rubinson y Rubinson 2001, Skoog 2003, Mc Nair y Miller 2009): Tiempos de retención El tiempo de retención, tr (min), es el tiempo que tarda un compuesto en eluir, por otro lado el tiempo muerto, designado como tM (min), es el tiempo que tarda en eluir un compuesto que no se retiene en la fase estacionaria. El tiempo de retención ajustado, (min), de un soluto es la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto: Ecuación 1 Volumen de retención El volumen de retención, , es el volumen de fase móvil que ha fluido a un tiempo de retención, que se obtiene multiplicando el tr por el flujo del gas acarreador. Ecuación 2 Donde: Volumen de la fase móvil a un tiempo de retención, mL Flujo del gas acarreador , mL min-1 Constante de distribución La constante termodinámica de equilibrio, Kc (adimensional), para la distribución de la especie A entre las fases estacionaria y móvil, es un parámetro que ayuda a determinar la velocidad con la que un soluto pasa a través de una columna cromatográfica; mientras más grande sea esta Antecedentes 11 constante, mayor será la adsorción en la fase estacionaria. La ecuación que define este parámetro es: [ ] [ ] Ecuación 3 Donde: [ ] Concentración de la especie A en la fase estacionaria, mol L -1 [ ] Concentración de la especie A en la fase móvil, mol L -1 La constante de distribución puede dividirse en dos partes, la relación de volúmenes de las fases, y el factor de retención, k’: Ecuación 4 Ecuación 5 Donde: Volumen de la fase estacionaria, mL Volumen de la fase móvil, mL Factor de retención El factor de retención (adimensional), también llamado factor de capacidad, describe las velocidades de migración de los solutos, para una especie A, se expresa como: Ecuación 6 Se puede demostrar que: Ecuación 7 Donde: Volumen de la fase móvil para un compuesto no retenido, mL Volumen ajustado de la fase móvil para un soluto, mL Factor de separación El factor de separación, (adimensional), anteriormente conocido como selectividad, determina la relación de los factores de retención entre dos picos adyacentes dada como: Ecuación 8 Antecedentes 12 El factor de separación representa la interacción relativa entre dos solutos y la fase estacionaria y se utiliza para expresar la magnitud de las interacciones intermoleculares así como su similitud o diferencia. En la práctica indica que tan difícil es separar dos solutos, mientras mayor sea , más eficiente es la separación. Número de platos teóricos Para un soluto que eluye de una columna de longitud L, el número de platos teóricos, N (adimensional), en toda la columna es la longitud, L (m), dividida entre la altura del plato. La anchura de una curva gaussiana está directamente relacionada con la varianza 2. En esta relación se tiene que =wb/4, la longitud se puede expresar en unidades de tiempo: ( ) ( ) Ecuación 9 Altura del plato teórico Este nombre está tomado de la teoría de destilación en la que la separación se efectúa en pasos discretos llamados platos, la capacidad de una columna para separar componentes de una mezcla mejora al disminuir la altura del plato. La eficiencia de la columna aumenta cuanto mayor es el número de platos teóricos N, y cuanto menor es la altura del plato, H (m), dada como: Ecuación 10 Donde: Longitud de la columna, m Resolución Al pasar por la columna cromatográfica, los solutos tienden a distribuirse en forma gaussiana, con desviación estándar . Las formas habituales de medir el ancho de banda son el ancho de la base wb 1/2, medida a una altura igual a la mitad de la altura del pico, h1/2, y el ancho de la base, wb, medida entre los cortes de las tangentes trazadas en los flancos de mayor pendiente como se muestra en la figura 3. Figura 3. Pico cromatográfico Antecedentes 13 Donde: Altura del pico cromatográfico, cuentas La resolución, Rs (adimensional), es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos, para dos picos adyacentes A y B, la resolución se expresa como: Ecuación 11 Capacidad máxima La capacidad máxima de un proceso cromatográfico, representa el número de compuestos que pueden separarse en el espacio unidimensional o eje de tiempo de elusión, con un valor de resolución específico (Jandera 2011): ( √ ) ( ) Ecuación 12 Dónde: Volumen de retención del primer compuesto, mL Volumen de retención del último compuesto, mL Número de platos teóricos del último compuesto eluido La cromatografía de gases presenta limitaciones cuando la matriz es muy compleja, por ejemplo las muestras ambientales pueden llegar a contener entre 150 y 250 compuestos relevantes (Phillips et al. 1999) y el poder de separación de una columna cromatográfica no es suficiente debido al insuficiente número de platos teóricos que presenta cualquier columna, generando una coelusión de compuestos, que provoca falsos positivos en la identificación e inexactitud en la cuantificación (Xu et al. 2003, Górecki et al. 2003). Para ello, es necesario un tratamiento exhaustivo de la muestra que elimina interferencias o bien el empleo de más de una técnica o mecanismo de separación comola cromatografía multidimensional o bidimensional. 2.10 Cromatografía multidimensional Al utilizar técnicas acopladas, los componentes de la mezcla eluyen en distintos tiempos de retención, la resolución que pueda alcanzarse depende fuertemente de las diferencias entre los mecanismos. Cada mecanismo acoplado se denomina dimensión, por tanto la Antecedentes 14 multidimensionalidad se refiere al acoplamiento de distintos mecanismos de separación (de Geus et al. 1997, Ramos et al. 2009). La cromatografía multidimensional tiene su origen en la cromatografía de capa fina, inicialmente se utilizó para la separación de péptidos derivados de la hidrólisis ácida en lana (Consden et al. 1949) y para la separación de terpenos (Kirchner et al. 1951). Los ejemplos más comunes de esta técnica son: cromatografía de gases acoplada a cromatografía de gases (CG-CG), cromatografía de líquidos acoplada a cromatografía de gases (CL-CG) y cromatografía de líquidos acoplada a cromatografía de líquidos (CL-CL) (Brokl et al. 2010). Los sistemas multidimensionales ofrecen mayor capacidad de resolución, debido al aumento en el número de compuestos teóricamente separables. Éstos ofrecen más de un parámetro para la caracterización y la identificación de los componentes de la muestra considerando que para sistemas lineales sólo se tiene un mecanismo, en un procedimiento n-dimensional cada mecanismo de separación representa un parámetro distinto, lo que hace su separación mucho más eficiente (Giddings 1995). 2.11 Cromatografía de gases multidimensional La cromatografía de gases multidimensional (CGMD) consiste en el acoplamiento de dos o más columnas con selectividades distintas (Ragunathan et al. 1993). La principal limitación de esta técnica es que una fracción, en el mejor de los casos algunas fracciones (“heart cuts”) eluidas de la primera columna se seleccionan para la posterior separación en la siguiente columna. Este tipo de separación es útil cuando se requiere separar específicamente algunos compuestos, pero cuando se necesita el análisis completo de una muestra la CGMD requiere demasiado tiempo y es un proceso complicado (Adahchour et al. 2008). En este tipo de sistemas, la continua transferencia de compuestos puede generar el traslape de algunos compuestos, resueltos previamente en la primera dimensión. La capacidad máxima de estos sistemas es igual a la suma de la capacidad máxima de la primera dimensión (nc1) y la segunda dimensión (nc2) multiplicada por el número (x) de fracciones transferidas (Ramos 2009): ( ) Ecuación 13 2.12 Cromatografía de gases bidimensional completa La cromatografía de gases bidimensional completa (CGxCG) es un método de análisis multidimensional (Phillips et al. 1995) y es sin duda una de las innovaciones más revolucionarias Antecedentes 15 en la cromatografía de gases desde su introducción. En contra parte a la CGMD, todos los compuestos que eluyen de la primera columna pasan periódicamente a una segunda columna de distinta polaridad, en pequeñas fracciones y unidas por un modulador térmico. De esta manera, toda la muestra se somete a dos mecanismos de separación independientes (Mondello et al. 2008). En un sistema ideal CGxCG la capacidad máxima es igual al producto de las capacidades máximas de ambas columnas (Ramos 2009): ( )( ) Ecuación 14 Por ende, al aumentar la capacidad máxima de un sistema existe un incremento en el número de platos teóricos y la resolución de los compuestos. La figura 4, muestra esquemáticamente el aumento en el número de platos teóricos que proveen la CGMD y la CGxCG. Figura 4. Comparación entre a) cromatografía de gases mutidimensional y b) cromatografía de gases bidimensional completa. Un sistema de separación bidimensional se puede definir como ortogonal cuando los parámetros y/o las propiedades medidas en la primera dimensión son independientes de las medidas en la segunda (Schoenmakers et al. 2003). Como consecuencia, la distribución de compuestos en la primera dimensión no correlaciona con la distribución en la segunda (Liu et al. 1995); por ejemplo la combinación entre cromatografía de líquidos y electroforesis proveen una separación ortogonal porque los dos métodos se basan en dferentes principios de retención (Monning et al. 1991). Se han identificado dos maneras para lograr ortogonalidad, la primera consiste en utilizar dos mecanismos de separación distintos, la segunda se refiere a la variación de las condiciones de operación de la segunda dimensión en función del progreso de la primera dimensión, este enfoque exige que las condiciones de operación sean fácilmente ajustables (Venkatramani et al. 1996). En CGxCG generalmente se acopla una columna no polar en la primera dimensión y una Antecedentes 16 columna de carácter polar para la segunda; mientras que en la primera, la separación se da en función de la volatilidad de los compuestos, en la segunda, la separación es función de la polaridad (Phillips et al. 1991). Liu et al. (1995) desarrollaron un procedimiento para la estimación de la ortogonalidad en sistemas bidimensionales evaluando parámetros como la resolución, la capacidad máxima de separación y los factores de capacidad en ambas dimensiones. Evidentemente el grado de ortogonalidad dependerá de que tan eficiente es la correlación entre las fases estacionarias, por tanto no puede asumirse que todas las separaciones efectuadas por CGxCG sean completamente ortogonales, más bien debe considerarse el grado de ortogonalidad (Ryan et al. 2005). Una característica importante de la CGxCG es la posibilidad de obtener cromatogramas estructurados, en donde todos los compuestos se distribuyen de acuerdo a sus propiedades químicas en el espacio de retención. Los picos de los compuestos homólogos se distribuirán en una banda de elución que permitirá su identificación (Semard et al. 2009) (figura 5). Figura 5. Distribución de oxi-HAP en el plano bidimensional de acuerdo a su interacción con cada columna Antecedentes 17 2.12.1 Instrumentación 2.12.1.1 Columnas En los análisis por CGxCG, es necesario que el sistema sea ortogonal, esto se logra cuando las columnas tienen diferentes mecanismos de separación en la primera y segunda dimensiones. Cada mecanismo de separación se basa en las distintas propiedades fisicoquímicas. De esta forma si la primera columna es no polar, la segunda debe ser polar. Mientras la separación en la primera se basa en las fuerzas de dispersión de acuerdo a la volatilidad de los analitos, eluyendo primero los compuestos con menor punto de ebullición, la separación en la segunda se fundamenta en la interacción con la fase a través de puentes de hidrógeno, interacciones de tipo π-π, efectos estéricos, entre otros. En esta última la elución es extremadamente rápida, haciéndola esencialmente isotérmica. Esto implica que los compuestos no separados en la primera dimensión debido a la similitud en sus puntos de ebullición, serán separados en la segunda, por la interacción con la fase estacionaria, eluyendo primero los compuestos con menor polaridad; lo que vuelve al método ortogonal. El otro arreglo menor empleado es el polar-no polar, en el que la primera separación se lleva a cabo por interacciones intermoleculares y en la segunda por presión de vapor (Dallüge et al. 2003, Korytár et al. 2006). Las dimensiones de la primera columna varían de 15 a 60 m de longitud, con un diámetro interior de 0.25 a 0.53 mm y un espesor de película 0.25 a 1 µm, cuyo tiempo de análisis típico es de 1 a 2 h. Para la segunda columna las dimensiones van de 0.5 a 2 m de longitud, diámetro interior de 0.1 mm y espesor de película de0.1 µm, con tiempos de análisis de 2 a 8 segundos por cada corte del modulador. Cuando un compuesto pasa de la primera a la segunda columna experimenta una aceleración en la interface debido a la diferencia en los diámetros interiores, que resulta en un aumento de la velocidad lineal del gas acarreador (Phillips et al. 1995). La fase estacionaria de la primera columna con dimetilpolisiloxano puede contener un cierto porcentaje de sustituyentes más polares para que se considere como no polar, la fase estacionaria de la segunda columna puede ser polietilenglicol, metilpolisiloxano o ciclodrextrina, cada una con distintos sustituyentes (Korytár et al. 2006, Semard et al. 2009) (tabla IV). Antecedentes 18 Tabla IV. Algunas fases estacionarias que se utilizan en CGxCG (Korytár et al. 2006, Semard et al. 2009) Código Fase Columnas utilizadas en la primera dimensión DB-1, HP-1, VF-1ms 100 % polidimetilsiloxano HT-5 5 % fenil-metilpolisiloxano HT-8 8 % fenil-metilpolisiloxano DB-Dioxina 44 % metil, 28 % fenil, 20 % cianopropil, 8 % polioxietileno- polisiloxano LC-50 50 % líquido cristalino-metilpolisiloxano BGB-172 25 % 2,3,6-ter-butildimetilsilil-β-ciclodextrina Columnas utilizadas en la segunda dimensión BPX-5 5 % difenil polidimetil siloxano HT-8 8 % difenil polidimetil siloxano DB-17 50 % difenil polidimetil siloxano 007-65HT 65 % difenil polidimetil siloxano OV 1701, DB-1701 14 % cianopropil difenil polidimetil siloxano BPX-70 70 % cianopropil difenil polidimetil siloxano SP-2340 100 % biscianopropil polisiloxano 007-210 50 % trifluoropropil metilpolisiloxano LC-50 50 % líquido cristalino metilpolisiloxano 2.12.1.2 Modulación El modulador se considera el corazón del sistema CGxCG. La función del modulador es fraccionar, preconcentrar y reinyectar porciones provenientes de la primera columna en la segunda columna, la modulación en CGxCG contribuye al aumento de la sensibilidad siendo 4 a 5 veces mayor comparada con la CG convencional (Lee et al. 2001, Quinto-Tranchida et al. 2011), esto se debe al enfoque que reciben los analitos provenientes de la primera columna, lo que provoca que el ancho de las señales reduzca y se incremente su altura. Actualmente existen varios tipos de moduladores en el mercado, basados en flujos y en temperatura (Semard et al. 2009), éstos últimos son aquellos que utilizan una diferencia de temperatura con respecto al horno del cromatógrafo que puede ser positiva o negativa. Antecedentes 19 La primera vez que se reportó la CGxCG (Liu y Phillips 1991) se utilizó un modulador de desorción térmica (DT) de una fase. La primera y la segunda columna tenían como interfase un segmento de una columna capilar recubierta con pintura conductiva que generaba calentamiento eléctrico, esto funcionaba como trampa para los efluentes de la primera dimensión y permitía su paso a la segunda columna. Sin embargo este diseño presentó algunas desventajas, la principal fue la quema de la interfase. Años más tarde se desarrolló el primer modulador comercial, un modulador térmico de barrido desarrollado por la compañía Zoex ®, que consistió en un calentador ranurado que gira por un eje y una columna capilar de menor diámetro interior como interfase entre ambas dimensiones. La modulación se llevaba a cabo de la siguiente forma (Ledford et al. 2000): a) Los solutos de la primera columna se acumulaban al interior de la primera parte del modulador capilar a la temperatura del horno. b) Antes de ocurrir la saturación, el calentador que se encontraba a mayor temperatura que el horno, gira sobre la dirección en contra del flujo, generando un “heart cut” (figura 6a). c) La fracción acumulada se desplazaba rápidamente y se removilizaba con el gas acarreador, que se movía más rápido que el calentador y se sometía a una fuerza de desaceleración y compresión en un punto del modulador capilar, por delante del calentador. d) En la última fase, la banda enfocada pasaba a la segunda dimensión por el paso del calentador encima de la parte que iba en la dirección del flujo (figura 6b). Figura 6. Modulador de barrido de dos etapas Antecedentes 20 Con la introducción de moduladores criogénicos hubo un declive en el uso de moduladores térmicos de barrido, debido a que este tipo de modulación provocaba que algunas muestras se degradaran (Liu et al. 1990). Posteriormente se desarrolló un sistema longitudinal de modulación criogénica (SLMC), basado en un crioenfoque con CO2, en donde se mostró ausencia de descomposiciones significativas de la muestra (Liu et al. 1996, Marriott et al. 1997). a) El modulador enfocaba a los compuestos provenientes de la primera columna utilizando CO2. b) Posteriormente, se movía en dirección contraria al flujo del gas acarreador, para dejar expuestos a los compuestos al calor del horno, generando una rápida termodesorción y removilizando los compuestos a la segunda columna rumbo al detector. Sin embargo los moduladores que utilizan CO2 difícilmente enfocan compuestos volátiles (≤C5), Pursch et al. (2003) propusieron un sistema basado en el uso de nitrógeno para la criogenización, que utiliza un propulsor frío y otro caliente, que enfoca compuestos volátiles como propano o butano. Ledford y Billesbach (2000) hicieron modificaciones a este diseño: mientras el gas criogénico fluye constantemente, el propulsor caliente envía gas periódicamente para obtener una modulación de dos etapas sin partes movibles, eventualmente también fue modificado y comercializado por Zoex Corporation® llamándolo “modulador en circuito”. Este tipo de modulador emplea propulsión fría y caliente, es decir es de dos etapas. Se forman circuitos con un segmento de la columna capilar que coinciden con la trayectoria de la corriente fría: a) El propulsor frío (tubo de acero alojado dentro de otro tubo también de acero, para crear aislamiento esencial para la introducción del sistema criogénico en el horno del cromatógrafo) se activa periódicamente, para enfocar a los compuestos provenientes de la primera columna. b) Posteriormente, el propulsor caliente, que se encuentra colocado a 90° del propulsor frío, se activa para removilizar a los analitos y pasarlos a la segunda columna. Antecedentes 21 Figura 7. Funcionamiento del modulador de circuito. a) Se muestra la salida continua de gas frío (CO2) que inmoviliza a los analitos (enfoque), b) Salida periódica del gas caliente que removiliza a los analitos (N2), c) Sostenedor de la segunda columna. 1. Propulsor de gas frío, 2. Propulsor de gas caliente, 3. Chorro de gas frío, 4. Chorro de gas caliente, 5. Segunda columna, 6. Sostenedor de la columna, 7. Parte exterior del circuito formado por la fase estacionaria. El primer modulador a base de flujo se introdujo a finales de la década de 1990 (Bruckner et al. 1998), en donde la modulación ocurría debido al control del flujo del gas acarreador usando una o más válvulas. La válvula no inyecta los eluyentes de forma completa a la segunda columna, sino que los pasa periódicamente; como resultado, existe una disminución en la sensibilidad con respecto a los moduladores térmicos, sin embargo es altamente repetible. Posteriormente se desarrolló un modulador que ocupa el diferencial de flujo de modulación, el flujo en la segunda columna se mantiene 20 veces por encima del que posee la primera columna; dicho sistema está constituido por una válvula con 6 puertos para colectar el efluente de la primera columna e inyectarlo en la segunda columna a través de un circuito interior que se llena con el efluente y lo transfiere cuando la válvula se conecta en posición de inyección (Seeley et al.2000). La tabla V muestra los tipos de moduladores más comunes. Antecedentes 22 Tabla V. Tiposde moduladores Modulador Características/observaciones Referencia Desorción térmica 2E-Primer modulador CGxCG (Liu y Phillips 1991) Barrido térmico 2E- Primer modulador comercial (Phillips y Ledford 1996) Desorción térmica E-filamento calentador de cobre de Geus et al. 1997) Sistema longitudinal de modulación criogénica 2E-Primer modulador criogénico, se utilizó CO2, líquido para enfriar (Kinghorn y Marriott 1998) Barrido térmico + propulsión fría 2E-Calentamiento móvil y enfriamiento estático, el CO2 se enfriaba a -55 °C pasando por un refrigerante inmerso en un baño de hielo seco y etanol. (Ledford y Billesbach 2000) 2 propulsores calientes + 2 propulsores fríos 2E- Primer modulador estático criogénico, se utilizó N2 para enfriar. (Ledford 2000) 2 propulsores fríos 2E- Modulador criogénico estático, utiliza CO2 para enfriar (Beens et al. 2001) Sistema longitudinal de modulación criogénica- diseño de modulador 2E-Modulador criogénico móvil, utiliza CO2 (Beens et al. 2001) Un propulsor caliente + un propulsor caliente 2E- Modulador criogénico en circuito/ el N2 se utiliza para calentar y para enfriar (este gas pasa por un refrigerante inmerso en N2 líquido) (Ledford et al. 2009) Dos propulsores fríos + dos filamentos como propulsores calientes 2E- Modulador criogénico rotatorio; utiliza CO2 para enfriar (Hyötyläinen et al. 2002) Modulador de trampa con sorbente 2E-Trampa capilar de acero inoxidable llena con un sorbente (Harynuk y Górecki 2002). Un propulsor frío 2E-Modulador criogénico estático, utiliza CO2 para enfriar (Adahchour et al. 2003) Dos propulsores calientes + un propulsor frío 2E- Modulador en circuito criogénico, calienta una sección utilizando aire. (Harynuk y Górecki 2003). Dos propulsores fríos 2E- Modulador estático criogénico, utiliza N2 para enfriar (Pursch et al. 2003) Arreglo de desorción térmica Modulador térmico de diez etapas (Burger et al. 2003) Un propulsor frío 2E- Modulador criogénico rotatorio, utiliza CO2 líquido para enfriar (Kalio et al. 2003) Flujo detenido E-Válvula rotatoria que transfiere los analitos y modulador criogénico que utiliza N2 (Harynuk y Górecki 2004) Flujo detenido 2E- Una válvula solenoide fuera del horno, genera pulsos de presión a través (Goldstein et al. 2008) Antecedentes 23 del punto de unión entre la dos dimensiones, utiliza un crioenfoque para preconcentrar la muestra Desorción térmica E-Calentamiento eléctrico y tubo modulador con refrigerante gaseoso (aire) (Libardoni et al. 2005) Desorción térmica E- Calentamiento eléctrico y tubo de modulación con un refrigerante líquido (Libardoni et al. 2006) Dos propulsores fríos 2E- Modulador estático con aire comprimido para el enfriamiento (Pizzutti et al. 2009) Micro desorción térmica 2E-Micromodulador, con calentamiento y enfriamiento para micro CGxCG (Kim et al. 2010) 2E= dos etapas, E= una etapa 2.12.1.3 Detección Debido al diámetro interno de la segunda columna y a la velocidad de separación de los picos modulados, la base de los mismos es del orden de 80-600 ms y en algunos casos hasta 45 ms (Adahchour et al. 2003). El tiempo en el que los analitos llegan al detector es corto, en consecuencia la frecuencia de adquisición debe ser por lo menos de 50 Hz (Phillips et al. 1999). Detección por ionización de llama Considerando que se requieren por lo menos 10 puntos por cada señal para describir con precisión su forma gaussiana, son pocos los detectores que pueden utilizarse en CGxCG, siendo uno de ellos el detector de ionización de llama (DILL) (Górecki et al. 2003). Los sistemas que utilizan este tipo de detección se caracterizan por tener velocidades de adquisición de 50 a 300 Hz (Been et al. 1997). El detector cuenta con un quemador donde el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y aire para su encendido eléctrico, la mayoría de los compuestos orgánicos cuando se pirolizan a la temperatura de la llama producen iones que conducen electricidad, generando una diferencia de potencial, la corriente que resulta se dirige para su medida hacia un amplificador operacional de alta impedancia (Skoog 2001). Este detector posee alta sensibilidad, respuesta uniforme a los hidrocarburos y un amplio intervalo lineal, donde su respuesta es proporcional a la masa de carbono-hidrógeno presente en la muestra (Jorgensen et al. 1990), por lo que comúnmente se emplea para el análisis de alcanos, iso-alcanos, alquenos, naftas e hidrocarburos aromáticos (Blomberg et al. 2002). Antecedentes 24 Detectores selectivos Otro tipo de detector que también se emplea es el de captura de electrones (DCE), el que ofrece gran selectividad a moléculas que contienen halógenos, carbonilos conjugados, nitrilos, nitrocompuestos y compuestos organometálicos, pero es relativamente insensible a los hidrocarburos, alcoholes y cetonas. El gas que entra en el detector se ioniza por los electrones de gran energía emitidos por una lámina que contiene 63Ni radioactivo, los electrones formados son atraídos por un ánodo, produciendo una pequeña corriente continua, cuando llegan moléculas del analito con gran electroafinidad, captan algunos electrones y el detector responde modificando la frecuencia de los impulsos de voltaje entre el ánodo y el cátodo. Este detector posee elevada sensibilidad y puede detectar en el orden de femtogramos (Harris 2003, Semard et al. 2009). La detección por emisión atómica, consiste en una fuente de plasma usualmente operada con helio y un espectrómetro óptico que mide la emisión atómica en función del tiempo (Quimby et al. 1989), se ha utilizado en la detección selectiva de compuestos en CGxCG, principalmente aquellos que contienen nitrógeno y azufre en muestras petroquímicas (van Stee et al. 2003). El detector de nitrógeno-fósforo, es un detector de ionización de llama modificado, especialmente sensible a compuestos que contienen nitrógeno y fósforo. Los iones tales como NO2 -, CN- y PO2 - se generan y entran en contacto con una bola de vidrio que contiene Rb2SO4 ubicada en la punta de un mechero (Harris 2003). Espectrometría de masas La CGxCG acoplada a espectrometría de masas (EM) es una herramienta poderosa y muy prometedora, provee de parámetros independientes para la identificación de compuestos. Las tres partes básicas de un espectrómetro de masas son la fuente de ionización, el analizador y el transductor/detector. La muestra en forma gaseosa se ioniza entre dos placas cargadas, los iones se aceleran mediante una diferencia de potencial y se focalizan utilizando campos eléctricos o rendijas, los iones acelerados pasan desde la fuente de ionización a uno de los numerosos tipos posibles de analizadores de masas, en donde se separan a los iones en función de su relación masa/carga (m/z), de modo que diversos tipos de iones llegan al transductor a diferentes tiempos, esta pequeña corriente de iones se amplifica mediante el transductor que normalmente es un multiplicador de electrones (Rubinson y Rubinson 2004). El único requerimiento para utilizar un espectrómetro de masas acoplado al sistema bidimensional es que el sistema tenga una velocidad de adquisición suficientemente rápido para registrar las señales moduladas (Shellie et al. 2003), Antecedentes 25 desafortunadamente la mayoría de los espectrómetros de masas no cumplen con este requisito para detectar todos los picos estrechos que se obtienen por CGxCG (Górecki et al. 2003). Una opción para este problema es el empleo del tiempo de vuelo que se basa en el hecho de que los iones con la misma energía, pero diferentes masas viajan con distintas velocidades. Básicamente, los iones formados en la fuente de ionización se aceleran por un campo electrostático
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