Aplicacion-de-un-diseno-factorial-2^3-para-el-desarrollo-de-la-separacion-de-trimetoprim-y-sulfametoxazol-contenidos-en-tabletas

Vista previa del material en texto

~ 1 ~ 
 
 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
 
 
 
 
FACUTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 Aplicación de un Diseño Factorial 23 para 
el desarrollo de la separación de trimetoprim y 
sulfametoxazol contenidos en tabletas. 
 
 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLOGO 
 
P R E S E N T A: 
 
I S S A C L E O N M O N R O Y 
 
 
 
 
México D.F 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 ~ 2 ~ 
 
Jurado Asignado 
 
 
Presidente: LAURO MISAEL DEL RIVERO RAMIREZ 
 
 
Vocal: RICARDO RODRIGUEZ SAENZ 
 
 
Secretario: JUAN MANUEL RODRIGUEZ 
 
 
1er Suplente: MARIA DE LOURDES MAYET CRUZ 
 
 
2do Suplente: KENNETH RUBIO CARRASCO 
 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLO EL TEMA: 
Laboratorio 112 Edificio E Facultad de Química UNAM 
 
 
 
 
 
RODRIGUEZ SAENZ RICARDO 
___________________________________________________________________ 
Asesor de Tesis: 
 
 
 
 
RUBIO CARRASCO KENNETH 
___________________________________________________________________ 
Supervisor Técnico: 
 
 
 
 
LEON MONROY ISSAC 
___________________________________________________________________ 
Sustentante: 
 
 
 
 ~ 3 ~ 
Agradecimientos 
 
 
 
 
A la Facultad de Química 
 
Por haber sido mí casa durante 5 años y donde me forme personal y 
profesionalmente. 
 
 
 
A mis Profesores 
 
Porque ustedes me han formado y me han transmitido el conocimiento para 
desarrollarme profesionalmente. 
 
 
 
Al M en F Ricardo Rodríguez Sáenz: 
 
Por haberme compartido sus conocimientos y por el gran apoyo brindado para la 
realización de este proyecto. 
 
 
 
A la M en C Kennet Rubio Carrasco: 
 
Por haberme acompañado incondicionalmente antes y durante la realización del 
proyecto, por el apoyo y por la gran amistad brindada. 
 
 
 
Gracias 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 4 ~ 
Dedicatoria 
 
 
 
Agradezco a mí mejor Amigo, Maestro y Señor por su amor y su misericordia, 
porque sé que sin el nada de esto podría ser posible: 
 Gracias Jesucristo. 
 
 
 
 
A mis Padres: 
 
Por ser los vasos que Dios ha utilizado para guiarme en mi camino y han hecho de 
mi una persona feliz, por apoyarme en cada decisión que he tomado e impulsarme 
en los momentos buenos y no tan buenos de la vida para alcanzar mis metas y 
sueños, a si como darme la libertad de elegir mi camino y forma de vida. 
 
Por su amor incondicional, por su esfuerzo, por su tiempo, por su dedicación y 
confianza: Gracias y que Dios los bendiga siempre. 
 
 
 
A Paula y Gerardo: 
 
Por su amor y por su compañía que ha sido vital todos estos años, gracias porque 
ustedes me enseñaron que unidos todo lo podemos alcanzar. 
 
 
A José Emiliano y José Eduardo: 
 
Porque a pesar de su corta edad me han enseñado grandes y maravillosas cosas 
que solo se les revelo a ellos, a los niños. Dios los bendiga mis mejores amigos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 5 ~ 
 
INDICE 
Introducción ............................................................................................................................. 8 
Objetivos ............................................................................................................................... 10 
Objetivo .............................................................................................................................. 10 
Objetivos Particulares. ..................................................................................................... 10 
CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................... 12 
1.0 Generalidades ............................................................................................................ 12 
1.1 Trimetoprim (TMP) .................................................................................................... 13 
1.1.1 Descripción .............................................................................................................. 13 
1.1.2 Sinónimos ................................................................................................................ 14 
1.1.3 Mecanismo de Acción ........................................................................................... 14 
1.1.4 Resistencia .............................................................................................................. 15 
1.2 Sulfametoxazol (SMZ) .............................................................................................. 15 
1.2.1 Descripción .............................................................................................................. 15 
1.2.2 Sinónimos ................................................................................................................ 16 
1.2.3 Mecanismo de acción ............................................................................................ 16 
1.2.4 Resistencia .............................................................................................................. 17 
1.3 Combinación Trimetoprim/Sulfametoxazol ............................................................ 18 
1.3.1 Farmacodinamia ..................................................................................................... 18 
1.3.2 Farmacocinética ..................................................................................................... 20 
CAPÍTULO 2 ......................................................................................................................... 22 
2.0 Diseño de experimentos 23 ...................................................................................... 22 
2.1 Espectroscopia UV-VIS ............................................................................................ 24 
2.1.1 Transiciones electrónicas ..................................................................................... 27 
2.1.2 Aplicaciones de la espectrofotometría UV (Cuantitativas) ............................... 28 
2.2 Cromatografía ............................................................................................................ 31 
2.3 Cromatografía en capa fina (CCF).......................................................................... 31 
2.3.1 Reveladores ............................................................................................................ 34 
2.3.2 Frente de referencia ............................................................................................... 35 
2.3.3 Factores que influyen en una separación por cromatografía de capa fina ... 36 
 
 ~ 6 ~ 
2.4 Validación de métodos analíticos ........................................................................... 36 
2.4.1 Definiciones de los términos del proceso de validación. .................................37 
CAPÍTULO 3 ......................................................................................................................... 41 
3.0 Desarrollo Experimental ........................................................................................... 41 
3.1 Preparación de soluciones ....................................................................................... 43 
3.2 Procedimiento ............................................................................................................ 45 
3.3 Procedimiento general ............................................................................................. 47 
3.4 Planteamiento del diseño experimental ................................................................. 48 
3.5 Aleatorización de los experimentos ........................................................................ 49 
3.6 Análisis de la Separación ......................................................................................... 49 
3.7 Comprobación de las condiciones de separación ................................................ 50 
3.8 Validación ................................................................................................................... 50 
3.8.1 Especificidad del método ...................................................................................... 50 
3.8.2 Linealidad del sistema y precisión del sistema. ................................................ 51 
3.8.3 Precisión del Método. ............................................................................................ 51 
CAPÍTULO 4 ......................................................................................................................... 52 
4.0 Resultados y Discusión de Resultados ................................................................. 52 
4.1 Resultados para Cromatografía en capa fina CCF (Parte 1) Metodología 
General .............................................................................................................................. 52 
4.3 Diseño Factorial 23 por el método de Contrastes Absorbancia (abs) a 287nm
 ............................................................................................................................................ 64 
4.4 Diseño Factorial 23 por el método de Contrastes Diámetro de la mancha (mm)
 ............................................................................................................................................ 72 
4.5 Cálculos para Obtener el % de Recuperación del TMP. ......................................... 79 
4.6 Cuestionando al modelo .......................................................................................... 81 
4.7 Diseño Factorial 23 por el método de Contrastes % Recuperación ................. 86 
4.8 Condiciones óptimas ................................................................................................. 93 
4.9 Discusión Final del Diseño Experimental .............................................................. 95 
5.0 VALIDACIÓN................................................................................................................. 97 
5.1 Especificidad .............................................................................................................. 97 
5.2 Linealidad del Sistema y Precisión del Sistema ................................................. 100 
 
 ~ 7 ~ 
5.3 Precisión del Método ............................................................................................... 104 
5.4 Exactitud ................................................................................................................... 105 
CAPÍTULO 6 ....................................................................................................................... 108 
Conclusiones................................................................................................................... 108 
Apéndices ........................................................................................................................ 109 
Bibliografía ...................................................................................................................... 114 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 8 ~ 
Introducción 
 
 
En el análisis de Medicamentos, lo ideal es utilizar técnicas analíticas 
que sean simples, rápidas, sencillas, económicas y que además cumplan con 
los criterios de precisión, exactitud, especificidad y reproducibilidad, 
principalmente. Sin embargo debido a la complejidad de algunos 
medicamentos o principios activos, tras su desarrollo las técnicas de análisis 
precisas, exactas y especificas, no siempre resultan rápidas, sencillas y 
económicas como se quisiera. 
 
Dentro de las causas que complican el análisis de medicamentos, esta 
la presencia de más de un principio activo en las formas farmacéuticas. Esto 
obliga, por lo general, a buscar primeramente un método de separación para 
poder realizar una determinación cuantitativa individual de los activos 
presentes. 
 
Actualmente en muchas disciplinas la metodología del diseño 
experimental tienen una amplia aplicación, por ello una de las formas de 
aprender acerca de cómo funcionan los sistemas o procesos es considerar a 
la experimentación como parte del proceso científico. 
 
El diseño experimental es un medio de importancia crítica dentro de 
las ciencias. También se emplea extensamente en el desarrollo de nuevos 
procesos. La aplicación de técnicas de diseño experimental en una fase 
temprana del desarrollo de un proceso puede dar por resultado: 
 
 Mejora el rendimiento del proceso. 
 
 ~ 9 ~ 
 Menor variabilidad y mayor apego a los requerimientos nominales u 
objetivo. 
 Menor tiempo de desarrollo. 
 Menores costos globales. 
 
Los métodos de diseño experimental también tienen un cometido 
importante en las actividades del diseño técnico, en las cuales se desarrollan 
nuevos productos y se mejoran otros existentes. Algunas aplicaciones del 
diseño experimental en el diseño técnico son: 
 
 Evaluación y comparación de configuraciones de diseño básicas. 
 Evaluación de materiales alternativos. 
 Selección de parámetros de diseño de modo que el producto funcione 
bien con una amplia variedad de condiciones de campo (de uso real); 
esto es de modo que el producto sea consistente (Robusto). 
 
El uso del diseño experimental en estas áreas puede dar por resultado 
productos con mayor confiabilidad y mejor funcionamiento en el campo, 
menores costos, y menor tiempo de diseño y desarrollo del producto. (Diseño 
y análisis de experimentos. Douglas C. Montgomery Ed. Iberoamericana S.A 
de C.V. Cap. 1 pág. 3) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 10 ~ 
Objetivos 
 
Objetivo 
 
Aplicar el Diseño Factorial 23 para investigar el efecto de los Factores A (pH), 
B (No. De Extracciones) y C (Tiempo de Agitación) en la separación de 
Trimetoprim y Sulfametoxazol contenidos en tabletas, por medio de una 
extracción Liquido – Líquido, en donde la fase orgánica es cloroformo y a la 
acuosa se le modifica el pH, probando la eficaz separación, mediante 
cromatografía en capa fina (CCF) y la cuantificación se llevará a cabo por 
Espectrofotometría UV. 
 
Objetivos Particulares. 
 
1.- Evaluar el efecto de los factores A (pH), B (Número de Extracciones) y C 
(Tiempo de Agitación) sobre la separación de Trimetoprim (TMP) y 
Sulfametoxazol (SMZ) tomando como respuesta la CCF y la 
espectrofotometría UV. 
 
2.- Obtener el modelo matemático y estadístico que relaciona las respuestas 
con los factores. 
 
3.- Por medio del modelo definir las condiciones óptimas de A (pH), B 
(Número de Extracciones) y C (Tiempo de Agitación) para llevar a cabo dichaseparación. 
 
4.- Demostrar experimentalmente que el método de análisis propuesto 
cumple con los parámetros de validación establecidos. 
 
 
 ~ 11 ~ 
Se toma como referencia la práctica descrita en el manual de Laboratorio de 
Desarrollo analítico16 realizándose las siguientes mejoras: 
 
1.- Se incluye el protocolo de cada uno de los tratamientos del Diseño 
Factorial. 
 
2.- Se incluye la evaluación espectrofotométrica de cada uno de los 
tratamientos del Diseño Factorial. 
 
3.- Se incluye la gráfica espectrofotométrica de cada uno de los tratamientos 
del Diseño Factorial. 
 
4.- Se incluye el Diseño menos agresivo con el medio ambiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 12 ~ 
CAPÍTULO 1 
 
 
1.0 Generalidades 
 
El Trimetoprim y Sulfametoxazol (TMP y SMZ) son fármacos que 
cuentan con propiedades antimicrobianas y son útiles contra infecciones por 
bacterias gran positivas y gran negativas. Dichas bacterias necesitan 
coenzimas de ácido fólico para la síntesis de purinas y pirimidinas, las cuales 
son los precursores del DNA, RNA y otros compuestos necesarios para el 
crecimiento, maduración y replicación de las células. Cuando en una célula 
hay una ausencia del ácido fólico, estas no pueden crecer ni reproducirse. 
 
Algunos fármacos como las Sulfas y algunos de sus derivados son 
inhibidores de la síntesis del ácido fólico. Este tipo de compuestos se 
originaron a partir del colorante de prontosilio, que al principio de los años 
30´s demostró su eficacia ante enfermedades infecciosas donde el agente 
etiológico era el “Streptococo hemolítico” porque el cuerpo lo biotransforma 
en una Sulfanilamida, pero con el tiempo algunas de las bacterias 
desarrollaron resistencia a este tipo de antibióticos disminuyendo su eficacia 
y como consecuencia su prescripción, pero con el descubrimiento de su 
efecto sinérgico con una diaminopirimidina llamada TMP se renovó el interés 
en las sulfonamidas.1 
 
Derivado de este efecto sinérgico en la década de los años 70´s a esta 
combinación se le denomina Cotrimoxazol. 
 
 
 ~ 13 ~ 
 
1.1 Trimetoprim (TMP) 
 
El TMP es un potente reductor de la dihidrofolato reductasa ya que 
posee un espectro antibacteriano similar al de las Sulfonamidas, No obstante 
el TMP habitualmente se administra con Sulfametoxazol (Cotrimoxazol), 
dado que las Sulfonamidas actúan en la bacteria en una etapa más temprana 
de la vía metabólica. 
 
 
 Fig 1 Acción de las Sulfonamidas (Sulfametoxazol) y 
de Trimetoprim sobre la síntesis del ácido fólico en las bacterias
2 
 
1.1.1 Descripción3 
 
Cristales o polvo blanco a color crema; inodoros, de sabor amargo, 
punto de fusión entre 199 – 203 °C. Este principio activo cuenta con un pKa 
de 7.10 ± 0.05. 
 
 
 
 
 
 ~ 14 ~ 
 
 
Fig 2 Trimetoprim C14H16N4O3 (290.32) 
1.1.2 Sinónimos 
 
 2,4 Diamino-5-(3,4,5-Trimetoxibencil)pirimidina; 5-[(3,4,5-
Trimetoxifenil) metil] 2,4- pirimidinadiamina 
 
Tabla 1 Solubilidad 
 
Solubilidad mg/mL a 25°C 
Benceno 0.02 
Agua 0.4 
Isopropanol 1.2 
Acetona 3.5 
Etanol 95% 8.1 
Metanol 12.1 
Cloroformo 18.5 
Propilenglicol 25.7 
Alcohol Bencílico 72.9 
Dimetilacetamida 136.6 
 
1.1.3 Mecanismo de Acción 
 
El TMP es un derivado de la diaminopirimidina que ejerce su acción al 
interferir en el metabolismo del ácido fólico, impidiendo la transformación de 
dihidrofolato en tetrahidrofolato, por inhibición de la enzima dihidrofolato 
reductasa. La ausencia de este, detiene la síntesis de metionina y de las 
 
 ~ 15 ~ 
bases purinícas y pirimídicas que conforman a los ácidos nucléicos. La 
enzima dihidrofolato reductasa posee una mucho mayor afinidad por el TMP 
que por el sustrato natural del mamífero, explicando a si la toxicidad selectiva 
del fármaco. 
 
1.1.4 Resistencia 
 
Aunque el espectro antibacteriano del TMP es similar al del SMZ, el 
TMP es de 20 a 50 veces más potente que la sulfonamida. En las bacterias 
Gram negativas la resistencia se debe a la presencia de una alteración en la 
enzima dihidrofolato reductasa, la cual tiene una menor afinidad por el TMP. 
 
1.2 Sulfametoxazol (SMZ) 
 
El Sulfametoxazol es una sulfonamida de amplio espectro, su acción 
es bacteriostática. Tiene similitud química con el ácido p-aminibenzoico 
(PABA) por lo que inhibe competitivamente a la dihidropteroato sintetasa, 
enzima bacteriana responsable de la incorporación del PABA en ácido fólico 
para formar ácido dihidrofólico, evitando a si la síntesis de ácidos nucleicos, 
que son la base fundamental de la célula bacteriana. 
1.2.1 Descripción 
 
Polvo cristalino blanco, ligeramente opaco o amarillento; 
prácticamente inodoro; estable al aire; punto de fusión de 168-172°C. Este 
activo cuenta con un pKa de 1.69 ± 0.07 y 5.81 ±0.05. 
 
 
 ~ 16 ~ 
 
Fig 3 Sulfametoxazol C10H11N3O3S (253,28) 
 
1.2.2 Sinónimos 
 
 4-amino-N-(5-metilsoxazol-3-il)-bencenosulfonamida: 3-Sulfanilamido-
5-metilsoxazol; N-(5-metil-3-isoxazolil)sulfanilamida. 
 
Tabla 2 Solubilidad 
 
Solubilidad (mg/mL) a 25°C 
Agua 0.5 
Cloroformo 2.3 
Éter Etílico 2.7 
Isopropanol 8.8 
NaOH 0.1N 16.0 
Metanol 90.3 
Etanol 95% 37.8 
 
1.2.3 Mecanismo de acción 
 
Una gran variedad de bacterias son impermeables al ácido fólico y 
como consecuencia dependen de su capacidad de sintetizar folato a partir de 
PABA (ácido p-aminobenzóico), pteridina y glutamato. Por otro lado el cuerpo 
 
 ~ 17 ~ 
humano no tiene la capacidad de sintetizar ácido fólico, por ello es necesario 
incluir esta vitamina en la dieta diaria. 
 
Por su semejanza estructural con el PABA, las sulfonamidas compiten 
por el sustrato con la enzima sintetasa de dihidropteroato. Esto priva a las 
células de cofactores indispensables para la síntesis de purina, pirimidina y 
aminoácidos. 
 
1.2.4 Resistencia 
 
Todos los organismos que sintetizan ácido fólico, son susceptibles a la 
acción de las sulfas, sin embargo estas pueden desarrollar resistencia por 
transferencia de plásmidos o mutaciones al azar, en general la resistencia es 
irreversible y se deba a cualquiera de las siguientes posibilidades: 
 
 Alteración enzimática: La afinidad de la sulfa por la enzima 
sintetasa dihidropteroato puede disminuir debido a mutaciones que esta 
puede sufrir, por ello el fármaco se convierte en un convertidor menos eficaz 
del PABA. 
 
 Menor Captación: La permeabilidad de la sulfas pueden disminuir 
en algunas cepas resistentes. 
 
 Incremento de la síntesis del PABA: Un incremento en la 
producción del PABA por parte de la bacteria mediante selección o mutación, 
puede superar la inhibición de sintetasa dihidropteroato. 
 
 
 ~ 18 ~ 
 
1.3 Combinación Trimetoprim/Sulfametoxazol 
 
A la combinación de Trimetoprim con Sulfametoxazol se le conoce 
como Cotrimazol, esta combinación de principios activos inhibe los pasos 
secuenciales en la formación del ácido tetrahidrofólico; la sulfonamida 
(Sulfametoxazol) inhibe la formación del ácido dihidrofólico y el Trimetoprim 
inhibe la conversión de dihidrofolato al ácido tetrahidrofólico y, por ende, a 
ácido folínico. 
 
También esta combinación se utiliza como profiláctico primario y 
medicamento terapéutico para infecciones de vías respiratorias superiores 
(amigdalitis y faringitis), vías respiratorias inferiores (Bronquitis, influenza, 
neumonía), infecciones de oído nariz y garganta, infecciones genitourinarias, 
renales, de sistema digestivo, piel, tejido blando y oculares. 
 
La concentración mínima inhibitoria de Sulfametoxazol disminuye 
cuando se utiliza junto con Trimetoprim, que por ser elque posee mayor 
potencia se utiliza en menor proporción 1:5 (TMP/SMZ) en preparados 
comerciales. 
 
1.3.1 Farmacodinamia 
 
El Cotrimazol (TMP y SMZ) comercialmente se encuentra disponible 
en varias formas farmacéuticas; en suspensión, tabletas o en solución 
intravenosa, en cada una de ellas encontramos diferentes dosis, sin embargo 
se ha observado que la vía oral es por la que se absorbe con mayor facilidad. 
Concentraciones de 1.1µg/mL de TMP y de 20.3µg/mL de SMZ en plasma 
 
 ~ 19 ~ 
son alcanzadas tras a ver administrado una dosis simple oral de doble 
potencia de cada uno de estos fármacos. Una administración intravenosa de 
80 mg de TMP y 400 mg de SMZ cada 12 h mantiene los niveles máximos 
plasmáticos de 5.9 µg/mL de TMP y de 178 µg/mL de SMZ.3 
 
Comercialmente se han desarrollado preparaciones de TMP y SMZ 
que son caracterizadas por tener una relación (1:5) de TMP y SMZ; esto 
debido a que el volumen de distribución del TMP es de (2L/Kg) superior a la 
de SMZ que su volumen de distribución es de (300mL/Kg) por que el TMP 
tiene propiedades lipofílicas. Esta relación fija proporciona niveles 
plasmáticos máximos de TMP y SMZ alrededor de 1:15 a 1:22,4 que se 
encuentran dentro del rango óptimo de actividad antibacterial de múltiples 
microorganismos. La concentración en tejidos de los fármacos puede variar 
ampliamente. TMP y SMZ penetra bien en los tejidos tanto en la presencia o 
en la ausencia de inflamación. 
 
En el fluido cerebro espinal, los niveles pueden variar de 13% a 53% 
para TMP y de 19% a 63% para SMZ. La difusión de el SMZ en el fluido 
cerebro espinal es lento, las concentraciones máximas ocurren 6 h después 
de la administración.5 Las concentraciones de TMP en algunos de los fluidos 
corporales como la saliva, orina, esputo, fluidos vaginales, bilis entre otros, 
suelen ser superiores comparados con los de SMZ en los mismos fluidos. 
 
Sesenta u ochenta por ciento de TMP es excretado por la orina dentro 
de 24 h, ya sea como fármaco inalterado o como metabolito urinario 
biológicamente inactivo. El SMZ es metabolizado en gran medida y sometido 
a una acetilación y glucoronidación en el hígado. 
 
 
 ~ 20 ~ 
Estos fármacos cuentan relativamente con una vida media larga, 
siendo de 11 h para TMP y de 9 h para SMZ, por ello la administración de 
estos fármacos sucede cada 8-12 h.6 
 
Cuando la orina se vuelve más alcalina, la excreción del SMZ 
aumenta, debido a que es un ácido débil, por el contrario si la orina se vuelve 
ácida, la excreción de TMP se dará con mayor facilidad.7 
 
1.3.2 Farmacocinética 
 
El Trimetoprim se absorbe rápidamente después de su administración 
oral en aproximadamente 2 h. Se distribuye rápidamente en la mayor parte 
de los tejidos corporales, pasando incluso la barrera hematoencefálica y 
placentaria. Su eliminación ocurre básicamente por medio del metabolismo y 
su vida media es de alrededor de 10 h. 
 
Las reacciones de biotransformación incluyen: 
 
 Oxidación (El grupo metileno se oxida y pasa a ser un grupo 
hidroximetileno) 
 n-Oxidación 
 O-desmetilación 
 Hidroxilación 
 Conjugación con ácido Glucorónico o Sulfato. 
 
El espectro antibacteriano del Trimetoprim es notablemente amplio. 
Muestra una buena acción contra diversas bacterias gran positivas 
(Staphylococcus sp, Streptococcus pneumoniae, Corynebacterium 
 
 ~ 21 ~ 
diptheriae) y algunas bacterias gram negativas (Haemophilus influenzae; 
Brucilla; Yersinia enterocolitica; Escherichia coli; Vibrio cholerae; especies de 
Klebsiella, Salmonella, Shigella y Proteus). 
 
Algunas de las de las reacciones adversas más frecuentemente 
reportadas para el trimetoprim son de tipo dermatológico, como por ejemplo 
la dermatitis exfoliativa. Son también frecuentes los trastornos 
gastrointestinales (malestar epigástrico, náuseas, vómitos). 
 
Las alteraciones hematológicas (trombocitopenia, leucopenia, anemia 
hemolítica, etc.) son raras a menos que el paciente presente factores de 
riesgo previos, como la deficiencia de folatos. El trimetoprim puede ocasionar 
un aumento moderado y transitorio de los niveles de enzimas hepáticas y de 
bilirrubina, así como también de los niveles séricos de creatinina. 
 
Aunque se reporta neurotoxicidad (cefaleas, depresión, alucinaciones, 
etc.), estas manifestaciones podrían depender más de la sulfamida asociada. 
 
El Sulfametoxazol se absorbe rápida y adecuadamente en el aparato 
digestivo. Se distribuye fácilmente en el organismo. Se biotransforma 
rápidamente. Cerca del 15% se encuentra presente en la sangre como 
productos acetilados. Arriba del 25% de la dosis se excreta sin modificación 
en la orina ácida y este porcentaje se eleva hasta el 40% o más en la orina 
alcalina. Cuando se administra con Trimetoprim su biotransformación no 
sufre alteración. 
 
 
 
 
 
 ~ 22 ~ 
CAPÍTULO 2 
 
 
2.0 Diseño de experimentos 2
3 (8) 
 
El diseño de experimentos se basa en plantear un experimento con la 
finalidad de obtener datos apropiados, que pueden ser analizados mediante 
métodos estadísticos, con el objeto de producir conclusiones válidas y 
objetivas. 
 
Hay tres principios básicos en el diseño de experimentos, los cuales 
son: La obtención de réplicas, aleatorización y análisis por bloques. 
 
La réplica se refiere a una repetición del experimento básico que le 
permita al investigador obtener una estimación de error experimental, dicha 
estimación es fundamental para determinar si las diferencias en los datos 
obtenidos son significativas. 
 
La aleatorización es fundamental para cancelar o disminuir de manera 
significativa los efectos de los factores extraños que pudiesen hacerse 
presente. 
 
El análisis por bloques se realiza para incrementar la precisión del 
experimento. 
 
Para llevar a cabo un diseño y el análisis de un experimento es 
necesario: 
 
 
 ~ 23 ~ 
Comprender y plantear el problema: Es necesario un planteamiento 
claro del problema ya que esto contribuye de forma sustancial a un mejor 
conocimiento del fenómeno y de la solución final del problema. 
 
Elegir factores y niveles: Es obligación del investigador llevar a cabo 
una investigación minuciosa de los factores que varían durante el 
experimento, los intervalos de dicha variación y los niveles específicos a los 
cuales se hará el experimento. Es de gran envergadura que en nuestra 
investigación se consideren todos los factores que puedan afectar la 
respuesta estudiada. 
 
Seleccionar la variable de respuesta: Al seleccionar la respuesta o 
variable dependiente se debe contar con la seguridad de que la respuesta 
que estamos midiendo nos da información útil acerca del proceso de estudio. 
 
Elegir el diseño experimental: Para poder elegir el tipo de diseño 
que se llevará a cabo, es necesario considerar el tamaño de la muestra 
(número de replicas) y el orden adecuado de cada ensayo. 
 
Realización del experimento: Debido que los errores en el proceso 
anulan la validez experimental, es necesario vigilar el proceso 
cuidadosamente para asegurar que todo se realice conforme a lo planeado. 
 
Análisis de datos: En este punto se emplean los métodos 
estadísticos de modo que los resultados y conclusiones sean lo más 
objetivos posible. 
 
Conclusiones y recomendaciones: Una vez que se han analizado 
 
 ~ 24 ~ 
los datos, estos deben de arrojar conclusiones validas y prácticas. En esta 
fase del diseño de experimentos a menudo son útiles los métodos gráficos. 
 
2.1 Espectroscopia UV-VIS 
 
Desde hace años se ha usado el color como ayuda para reconocer las 
sustancias químicas; al remplazar el ojo humano por otros detectores de 
radiación se puede estudiar laabsorción de sustancias, no solamente en la 
zona del espectro visible, sino también en ultravioleta e infrarrojo. 
 
Se denomina espectrofotometría a la medición de la cantidad de 
energía radiante que absorbe en un sistema químico en función a su longitud 
de onda de la radiación, y a las mediciones a una determinada longitud de 
onda. 
 
La teoría ondulatoria de la luz propone la idea de que un haz de luz es 
un flujo de cuantos de energía llamados fotones; la luz de una cierta longitud 
de onda está asociada con los fotones cada uno de los cuales posee una 
cantidad definida de energía. 
 
En otras palabras, todos lo átomos y moléculas son capaces de 
absorber energía, de acuerdo a ciertas limitaciones relacionadas con su 
estructura. La espectroscopia de absorción se encarga del estudio de las 
dependencias que existen entre el tipo y cantidad de radiación absorbida por 
una molécula con su estructura, a si como de la relación entre la cantidad de 
radiación adsorbida con el número de moléculas presentes. 
 
Es conveniente describir a la luz a la vez de en términos de partículas 
 
 ~ 25 ~ 
y ondas. Las ondas de la luz constan de campos eléctricos magnéticos, que 
oscilan en planos perpendiculares entre sí. 
 
Los términos útiles para describir una onda de luz, son: 
 
Longitud de onda (λ): Es la distancia entre crestas de dos ondas (sus 
unidades más comunes son los nanómetros 1nm= 10-9 m=10A=1µm). 
 
Frecuencia (ѵ): Es el número de oscilaciones completas de una onda 
en un segundo. La unidad de la frecuencia es el inverso de los segundos 
(s-1). 
Una oscilación por segundo se llama herzio (Hz). Una frecuencia de 
106 s-1 es, por tanto, de 106 Hz o un megahertzio MHz. 
 
La relación entre frecuencia y longitud de onda es: ѵλ = C donde C es 
la velocidad de la luz (2,998x108 m/s) en el vacío. 
 
Para longitudes de onda en el visible la mayoría de las sustancias 
tienen n > 1 (n = índice de refracción) de modo que la luz visible se propaga 
más lentamente a través de la materia que en el vacío. Cuando la luz 
atraviesa dos medios con diferentes índices de refracción, la frecuencia 
permanece constante, pero varia de longitud de onda. 
 
Debido a campo eléctrico asociado con la luz de una partícula 
cargada, como un electrón, colocada en la ruta de una onda de luz, 
experimentará una fuerza y será capaz de absorber energía del campo 
eléctrico de la onda de luz. Si el electrón de una molécula absorbe energía 
del campo eléctrico de una onda de luz, pasará de un nivel energético menor 
(Estado basal o fundamental) a otro mayor (Estado excitado) en la molécula. 
 
 ~ 26 ~ 
Sin embargo, no todas las frecuencias de luz suelen ser absorbidas por 
electrones moleculares. 
 
Desde el punto de vista de energía es más conveniente concebir la luz 
como partículas (fotones), al hacer esta consideración cada fotón tendrá 
asociada una cantidad definida de energía, la cual solo depende de su 
frecuencia, entonces: 
 
E = hv = hc/λ 
h = Constante de Planck 
ѵ = Frecuencia 
λ = Longitud de onda 
c = Velocidad de la luz 
 
Una condición necesaria para que la luz de una frecuencia dada sea 
absorbida por una molécula en su estado basal es que cumpla con la 
relación: 
 
Ee-Eb = hv 
Donde: 
Ee = Energía del estado excitado. 
Eb = Energía del estado basal 
 
Es decir la diferencia entre los dos niveles energéticos debe ser igual 
a la energía del fotón absorbida, si esta condición no se cumple, se dice que 
entonces la molécula es transparente a la luz de esta frecuencia. 
 
 
 ~ 27 ~ 
 
2.1.1 Transiciones electrónicas 
 
El estado energético en el cual todos los electrones están en los 
orbitales de menor energía posible, se le denomina estado energético basal. 
La promoción de un electrón desde un orbital que está ocupado en el estado 
basal a uno que normalmente está desocupado, en el mismo estado, resulta 
en la formación de un estado electrónicamente excitado de la molécula. Al 
salto de energía de un nivel de estado basal a otro estado excitado se le 
conoce como transición. 
 
Las transiciones electrónicas de moléculas, que involucran la 
absorción de la luz de las regiones visibles y de ultravioleta cercano (750-
400nm y 400-200nm) respectivamente son llamados transiciones singulete. 
 
De acuerdo a al tipo de transición electrónica, la molécula absorberá 
luz de acuerdo a su longitud de onda particular y dependerá del tipo de 
orbitales presentes en la molécula, siendo de mayor importancia para la 
región UV-Vis, los electrones de los orbitales externos. 
 
Las moléculas que absorben en la región UV-Vis cuentan con 
importantes tipos de electrones que son: 
 
Electrones de enlace sencillo (σ). Para formar un nuevo orbital σ3 en la 
molécula, cada átomo contribuye con un orbital, los dos electrones que 
ocupan este nuevo orbital, pueden provenir uno de cada átomo (Enlace 
covalente) o ambos del mismo átomo (enlace covalente coordinado), por lo 
que se requiere de gran energía para proveerlos a orbitales desocupados, 
por lo tanto su absorción tendrá lugar en el UV lejano. 
 
 ~ 28 ~ 
 
Electrones en orbitales (π). Forman parte de los dobles y triples 
enlaces, los cuales son más débiles que los σ, por lo que se requiere de 
menos energía para excitarlos, por ello son responsables de la absorción de 
las moléculas en el UV-Vis. 
 
Los electrones n son conocidos como electrones de no enlace como 
los de oxígeno, azufre, nitrógeno y halógenos. Debido a que estos electrones 
están en un nivel energético mayor, que los σ o π, se consideran 
contribuyentes potenciales de rasgos espectrales distintos de las moléculas 
que los poseen. 
 
Cada molécula cuenta de manera asociada en sus orbitales 
moleculares de baja energía, varios de alta energía, los cuales se les 
denomina orbitales de antienlace, debido a que se encuentran desocupados 
en ausencia de las fuentes energéticamente perturbadoras. 
 
2.1.2 Aplicaciones de la espectrofotometría UV (Cuantitativas) 
 
El análisis cuantitativo es una de las aplicaciones de la 
espectrofotometría en donde se encuentran bandas con picos definidos 
dentro de un margen estrecho de longitudes de onda en el espectro. Este 
análisis se basa principalmente en dos leyes principales: la ley de Lamber y 
la ley de Beer. 
 
La ley de Lamber establece que para una concentración dada en un 
sistema adsorbente, la intensidad trasmitida es inversamente proporcional a 
la longitud de onda, es decir, que a medida que incrementa una de ellas, la 
 
 ~ 29 ~ 
otra disminuye exponencialmente. 
 
La ley de Beer establece que dada una longitud de onda la intensidad 
trasmitida disminuye exponencialmente con el aumento de la concentración 
del sistema, es decir, la relación también es inversamente proporcional. 
 
Cuando las dos leyes se combinan, el resultado es la ley da lamber – Beer, 
la cual se define como sigue: 
 
A= k b c 
 
Donde: 
 
k Es una constante de proporcionalidad que es independiente del 
paso de la luz e intensidad de la radiación incidente (Absortividad), 
pero depende de la temperatura, disolvente, estructura molecular del 
soluto y de la longitud de onda. Sus unidades dependen de b y c. 
 
b Es el paso óptico y normalmente se expresa en cm. 
 
c Es la concentración de la muestra y normalmente se expresa en 
mol/L (M) cuando c se encuentra dada en (M), la constante k se 
cambia por el símbolo ε. 
 
ε Es la absortividad molar (o coeficiente de extinción) y tiene como 
unidades M-1 cm-1, y a si el producto εbc es adimensional. La 
absortividad molar es la característica de una sustancia que nos dice 
cuanta luz absorbe a una longitud de onda determinada.~ 30 ~ 
La ecuación se podría rescribir de la siguiente manera: 
 
Aλ= ελb c 
 
Porque A y ε dependen de la longitud de onda de la luz. La cantidad ε 
es simplemente el coeficiente de proporcionalidad entre la Absorbancia y el 
producto bc. Cuando mayor es la absortividad molar, mayor es la 
Absorbancia. 
 
La ecuación de la ley de Lamber-Beer representa una línea recta que 
puede construirse experimentalmente determinando las absorbancias de 
varias soluciones con diferentes concentraciones sucesivas de una especie 
adsorbente. Las lecturas deben hacerse bajo las mismas condiciones de 
disolución, temperatura y longitud de onda. Cuando se representa la 
Absorbancia en función de la concentración, se obtiene lo que se denomina 
curva de calibración. De esta curva se obtiene el intervalo que se ajusta a la 
ecuación de Lamber-Beer (que es una línea recta), en donde la pendiente de 
la recta representa la absortividad. 
 
La aplicación cuantitativa de la ecuación de Lamber-Beer se obtiene al 
determinar la Absorbancia de una solución de concentración desconocida e 
interpolarlo en la curva de calibración de la sustancia correspondiente, o 
despejando a c de la ecuación de la ley de Beer y sustituyendo los valores 
de A, k y b. 
 
Existen otras aplicaciones de la ley de Lamber-Beer, las cuales son: 
 
 Determinación de estequiometrias complejas. 
 
 ~ 31 ~ 
 Determinación de las constantes de equilibrio. 
 Monitoreo de la cinética de degradación de un fármaco. 
 Validación de métodos analíticos 
 
2.2 Cromatografía9 
 
La cromatografía es un método analítico empleado ampliamente en la 
separación, identificación y determinación de los componentes químicos en 
mezclas complejas, de hecho a nivel mundial no hay ningún otro método o 
técnica tan eficiente y de aplicación general como la cromatografía. 
 
Mikhail S. Tswett fue un botánico ruso que en el año de 1906 
descubrió la cromatografía al pasar diferentes disoluciones que contenían 
pigmentos vegetales a través de columnas de vidrio empacadas con 
carbonato de calcio dividido finamente. Las especies separadas aparecían 
como bandas coloreadas en la columna, lo cual explica el nombre que se 
escogió para el método (del griego chroma, que significa “color”, y graphein, 
que significa “describir”). 
 
La cromatografía es la técnica mediante la cual los componentes de 
una mezcla se separan en base a las velocidades a las cuales son pasados 
a través de una fase estacionaria cuando son transportados por una fase 
móvil ya se líquida o gaseosa. 
 
2.3 Cromatografía en capa fina (CCF) 10 
 
La cromatografía en capa fina es una técnica cualitativa y de 
separación rápida de pequeñas cantidades de muestra y se basa en el 
 
 ~ 32 ~ 
principio de reparto entre las dos fases. Al igual que otras cromatografías, 
consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: 
la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la 
fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la 
afinidad por la fase estacionaria. 
 
La adsorción en la fase estacionaria (FE) se lleva a cabo por la acción 
de fuerzas electrostáticas que se dan cuando la sustancia de interés y el 
disolvente entra en contacto con la FE. Los adsorbentes más comúnmente 
utilizados en la FE son: 
 
 Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones) 
 Oxido de Aluminio ó Alúmina (ácida, neutra ó básica) 
 Tierra Silícea 
 Celulosa (Nativa o micro-cristalina) 
 Poliamidas 
Estos adsorbentes deber tener las siguientes características: 
 
 Tamaño de Partícula 
 Volumen de Poro - Diámetro de Poro - Área Superficial 
 Homogeneidad 
 Pureza 
 
Dentro de de las principales aplicaciones de la cromatografía en capa 
fina, podemos mencionar que es una técnica eficiente para: 
 
 Establecer si dos compuestos son idénticos. 
 
 ~ 33 ~ 
 Determinar el número de componentes de la muestra. 
 Determinar el disolvente adecuado para una separación 
cromatográfica en columna. 
 Monitorear la separación de una mezcla por cromatografía en 
columna. 
 Seguir el proceso de una reacción. 
 Como criterio de pureza. 
 
La fase móvil puede estar compuesta de uno o más eluyentes, esto 
dependerá de la naturaleza del compuesto de interés y de su polaridad. Los 
eluyentes más comunes empleados en cromatografía de capa fina son: 
 
 Éter de petróleo 
 Tolueno 
 Diclorometano 
 Acetato de Etilo 
 Ciclohexano 
 Tetracloruro de carbono 
 Éter dietílico 
 Cloroformo 
 Acetona 
 Isopropanol 
 Etanol 
 Metanol 
 Ácido Acético 
 Agua 
 
 
 ~ 34 ~ 
2.3.1 Reveladores11 
 
Las manchas de color son, por supuesto inmediatamente visibles; las 
incoloras pueden revelarse por mediante: 
 
Luz UV: Se aprovecha la propiedad de algunos compuestos de 
absorber luz ultravioleta, se puede usar una fase estacionaria impregnada 
con un indicador fluorescente (F254 o F366), el número que aparece como 
subíndice nos indica la longitud de onda de excitación del indicador utilizado. 
 
Yodo: Se introduce la placa a una cámara que contenga cristales de 
yodo, aprovechando la propiedad de algunos compuestos de formar 
complejos coloridos que van de café a amarillos. 
 
El roció de la placa con una solución de agua/H2SO4 1:1 (dentro de un 
compartimento especialmente protegido y bajo la campana de extracción). 
 
 Dicho procedimiento también se puede llevar a cabo con una solución 
concentrada de sulfato cérico. 
 
Calentamiento: Se coloca la placa sobre una parrilla de 
calentamiento o sobre un mechero hasta carbonizar los compuestos. 
 
Existen otros métodos de revelado, disponibles principalmente a base 
de reactivos químicos, sin embargo, no es muy común su uso, debido a que 
este tipo de reactivos son específicos para algunos grupos funcionales. 
 
 
 
 
 ~ 35 ~ 
2.3.2 Frente de referencia12 
 
Rf es el registro que se define como la distancia que recorre el 
compuesto de interés en la placa desde el punto de aplicación hasta el 
frente del eluyente. 
 
Este valor se expresa como una fracción decimal y depende de las 
condiciones en las cuales se corre la muestra (tipo de adsorbente, eluyente, 
a si como las condiciones de la placa, temperatura, vapor de saturación etc.). 
 
 
 
 
Este factor es de gran utilidad si se requiere seleccionar el tipo de 
eluyente adecuado para la separación de compuestos: 
 
 Si el rf < 0.5 el eluyente es de muy baja polaridad para la 
separación 
 Si el rf = 0.5 el eluyente es ideal para la separación. 
 Si el rf > 0.5 el eluyente es de muy alta polaridad para la 
separación. 
 
 
 
 
 
 ~ 36 ~ 
2.3.3 Factores que influyen en una separación por cromatografía de 
capa fina 
 
Temperatura: a menor temperatura las sustancias se adsorben más 
en la fase estacionaria. 
 
La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire. 
Limpieza de las placas. Muchas placas están contaminadas con 
grasa o agentes plastificantes o adhesivos. 
Pureza de los disolventes. 
 
2.4 Validación de métodos analíticos13,14 
 
Para saber si el método que se emplea en el análisis de materia prima 
o de producto terminado es confiable y efectivo, es necesario contar con 
evidencia documentada que demuestre que el método está cumpliendo con 
la función para la cual fue diseñado, además asegurar que dicho 
comportamiento es consistente. 
 
El mecanismo mediante el cual queda establecida la capacidad y 
confiabilidad de dichos métodos se llama “Validación de métodos analíticos” 
el cual se define como El proceso mediante el cual se demuestra por 
estudios de laboratorio que la capacidaddel método satisface los requisitos 
para la aplicación analítica deseada.13 
 
El objetivo del procedimiento analítico puede entenderse claramente al 
determinar las características que deben evaluarse durante la validación, las 
cuales se esquematizan a continuación: 
 
 ~ 37 ~ 
 
Fig 4 Estructura del proceso de Validación 
14
 
 
2.4.1 Definiciones de los términos del proceso de validación. 
 
Especificidad 
 
Es la capacidad de un método analítico para obtener una respuesta 
debida únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la 
muestra. 
 
 
Linealidad del Sistema 
 
La linealidad de un sistema o de un método es la habilidad para 
asegurar que los resultados obtenidos directamente o por medio de una 
transformación matemática definida, son proporcionales a la concentración 
del analito, dentro de un intervalo determinado. 
 
Precisión 
 
Es el grado de concordancia entre resultados analíticos individuales 
cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes porciones de 
 
 ~ 38 ~ 
una muestra homogénea del producto o de una referencia. La precisión 
consta de dos componentes: 
 
 Repetibilidad: La determinación expresada como la DER consiste en 
mediciones múltiples de una muestra por el mismo analista bajo las 
mismas condiciones analíticas. Para fines prácticos frecuentemente se 
combina con la prueba de exactitud y se considera como un estudio 
independiente. 
 
 Reproducibilidad: La reproducibilidad expresa la precisión entre 
diferentes laboratorios o analistas. 
 
Precisión Intermedia 
 
Medida de la precisión de los resultados de un método de ensayo en 
condiciones diferentes de analista / observador, día, equipos, lotes de 
reactivos dentro del mismo laboratorio. 
 
Exactitud 
 
Es la concordancia entre un valor obtenido empleando el método y el 
valor de referencia. 
 
Limite de detección 
 
Es la concentración mínima del analito en una muestra que puede ser 
detectada, pero no necesariamente cuantificada bajo las condiciones de 
operación establecidas. 
 
 
 
 
 ~ 39 ~ 
Limite de Cuantificación 
 
Es la concentración mínima del analito, que puede ser determinada 
con precisión y exactitud aceptables, bajo las condiciones de operación 
establecidas. 
 
Tolerancia 
 
Es la reproducibilidad de los resultados analíticos obtenidos, por el 
análisis de la misma muestra bajo diferentes condiciones normales de 
operación como pueden ser: equipos, columnas, etc. 
 
Robustez 
 
Es la capacidad del método analítico de mantener su desempeño al 
presentar variaciones pequeñas pero deliberadas en los parámetros 
normales de operación del método. 
 
La robustez y la tolerancia son conceptos diferentes ya que el primero 
se refiere a la influencia de los factores internos del método, mientras que la 
tolerancia se refiere a los factores externos al método. 
 
La tabla 3 enlista las características de Validación más importantes de 
acuerdo a los diferentes tipos de procedimientos analíticos. Estas 
características son las consideradas en los procesos analíticos más 
comunes, pero pueden existir excepciones en casos particulares. (ICH 
Q2A).15 
 
 
 
 
 
 ~ 40 ~ 
 
Tabla 3 Características de la validación para cada tipo de Método Analítico. 
(ICH Harmonized Tripartita Guideline, ICH Q2A, Text on Validation on Analytical Procedures, 
1995) 
 
 
CARACTERISTICAS Tipos de Análisis 
Pruebas de 
identificación 
Pruebas de 
Impurezas 
Valoración 
Cuantitativo Limites 
Exactiud - + - + 
Precisión 
Repetibilidad - + - + 
Precisión Intermedia - (+)1 - (+)1 
Especificidad 
(Selectividad)2 
+ + + + 
Limite de Detección - (-)3 + - 
Limite de Cuantificación - + - - 
Linealidad - + - + 
Rango Lineal - + - + 
 
Característica normalmente no evaluada ( - ) 
Característica normalmente evaluada ( + ) 
1
 En casos donde la reproducibilidad ha sido determinada, la precisión intermedia no es 
necesaria. 
2
 La carencia de especificidad de un método analítico puede ser compensada por otro 
soporte del método analítico. 
3
 Puede necesitarse en algunos casos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 41 ~ 
CAPÍTULO 3 
 
 
3.0 Desarrollo Experimental 16-21 
 
Para mejorar la respuesta analítica y aplicar un diseño factorial 23, se 
estudiarán los factores que pueden modificar la separación de los analitos 
por medio de la extracción y como consecuencia la respuesta de los solutos 
en la determinación espectrofotométrica y cromatográfica, los cuales son: 
 
 pH de la Fase Acuosa (HCl 0.2N ; NaOH 0.2N) 
 Número de Extracciones Clorofórmicas 
 Tiempo de Agitación (min) 
 
Reactivos: 
 Cloroformo R.A 
 Metanol R.A 
 Hidróxido de Amonio R.A 
 Ácido Clorhídrico R.A 
 Hidróxido de Sodio R.A 
 Solución de HCl 0.2 N 
 Solución de NaOH 0.2 N 
 Cromatoplacas de Silice: Cromatofolios de gel de sílice 60F254 para 
cromatografía en capa fina de 20 x 20cm y 0.2mm de espesor. 
 Estándar Secundario de TMP Pureza: 100.0% Proveedor Pronaquim 
Lote: 200812349; Fabricante: Shandong. 
 Estándar Secundario de SMZ Pureza 100.0% Proveedor Moléculas 
Finas; Lote: 38321108; Fabricante: Virchow. 
 
 ~ 42 ~ 
 
Equipos y Condiciones Experimentales: 
 
 Balanza Analítica 
Santorius Modelo: BP2105 Serie: FCACM02 
 10 Matraces Volumétricos de 25 mL 
 
 Agitador Vortex 
Genie VWR Scientific Serie: 2-177318 
 10 matraces Volumétricos de 50 mL 
 
 Espectrofotómetro UV 
Shimadzu UV-1601 Serie: 800555 
 4 Embudos de Separación de 125 mL 
Kinax Serie: 29098-F 
 Micropipeta de 100 – 1000µL  2 Matraces volumétricos de 1L 
 
 1 Probeta de Vidrio de 10 mL  5 Pipetas Pasteur 
 
 1 Probeta de Vidrio de 20 mL  2 Celdas de Cuarzo para UV 
 
 2 Probetas de Vidrio de 50 mL  2 Frascos para desechos 
 
 1 Nave de Vidrio  Mortero de porcelana con pistilo 
 
 1 Espátula de Metal  5 Vasos de pp de 250 mL 
 
 Parrilla de Calentamiento: Barnstead 
Thermolyne Modelo: SP131635 Serie: 
1316067009216 
 7 Pipetas volumétricas de 1 mL 
 
 
 ~ 43 ~ 
3.1 Preparación de soluciones 
 
Hidróxido de sodio 0.2 N. 
Pesar 8 g de hidróxido de sodio aproximadamente, disolver con agua 
destilada y llevar al aforo de 1000 mL con agua destilada. 
 
Ácido clorhídrico 0.2 N. 
En un matraz aforado de 1000 mL con un poco de agua destilada, 
agregar 17 mL de ácido clorhídrico, mezclar y disolver para llevar al aforo 
con agua destilada. 
 
Fase móvil para CCF: 
Mezclar, cloroformo, metanol e Hidróxido de amonio concentrado en 
proporciones de 91.5:7.5:1, respectivamente, es decir las proporciones son: 
183 mL de Cloroformo, 15 mL de Metanol y 2 mL de Hidróxido de amonio, 
para un volumen total de 200 mL. 
 
Estándar de Referencia de Trimetoprim de 1 mg/mL en cloroformo para 
CCF. 
En un Matraz Volumétrico de 10 mL pesar 10 mg del estándar de 
Trimetoprim (considerar la pureza del estándar), agregar 5 mL de cloroformo 
aproximadamente, agitar y disolver, llevar al aforo con cloroformo. Esta 
solución contiene 1 mg/mL de Trimetoprim. Esta solución es la solución 
Stock. 
 
 
 
 
 ~ 44 ~ 
Estándar de Referencia de Trimetoprim de 20 µg/mL en metanol 
De la solución de 1 mg/mL de Trimetoprim en cloroformo tomar una 
alícuota de 1 mL y transferirlos a un matraz de 50 mL, mezclar y llevar al 
aforo con metanol. 
 
Estándar de Referencia de Sulfametoxazol de 1 mg/mL en cloroformo 
para CCF 
En un matraz volumétrico de 10 mL pesar 10 mg del estándar de 
Sulfametoxazol (considerar la pureza del estándar), agregar 5 mL de 
cloroformo agitar, disolver y llevar al aforo con el mismo disolvente. 
 
Estándar de Referencia de Sulfametoxazol de 20 µg/mL en metanol 
De la solución de 1 mg/mL de Sulfametoxazol, tomaruna alícuota de 
1 mL y transferirlos a un matraz de 50 mL, mezclar y llevar al aforo con 
metanol. 
 
Preparación de la solución Stock de TMP. 
En un matraz aforado de 100mL pesar aproximadamente con 
exactitud 20mg de estándar de referencia (secundario) de trimetoprim, 
disolver y llevar a volumen con metanol R.A. Concentración final 200 µg/mL. 
 
Curva de Calibración de TMP. 
A partir de la solución Stock preparar soluciones con los siguientes 
niveles de concentración: 12, 16, 20, 24 y 28µg/mL. Como se indica en la 
Tabla 4. 
 
 
 ~ 45 ~ 
Tabla 4. Curva de Calibración de trimetoprim (TMP) 
 
Nivel 
% 
Alícuota 
Stock (mL) 
Llevar a 
Volumen (mL) 
Concentración 
µg/mL 
Concentración 
real µg/mL 
60 3 50 12 12.0 
80 4 50 16 16.0 
100 5 50 20 20.0 
120 6 50 24 24.0 
140 7 50 28 28.0 
 
3.2 Procedimiento 
 
El Diseño Experimental propuesto (Tabla 5) tiene dos niveles que se 
codifican como -1 para el nivel bajo y +1 para el nivel alto y tres factores los 
cuales se describieron anteriormente. 
 
 
Tabla 5 Factores y niveles 
 
Codificado A B C 
 pH Numero de 
extracciones 
Tiempo de 
Agitación (min) 
-1 1.0 
HCl 0.2 N 
1 1 
1 13.0 
NaOH 0.2 N 
3 3 
 
 
 
 
 
 
 ~ 46 ~ 
Tabla 6 Diseño factorial 
 
Tratamiento 
Secuencia 
de prueba 
No. Exp 
Aleatorio 
A B C 
(mm) 
Resp
1 
(abs) 
Resp 
2 
(mg) 
Resp 
3 
(%) 
Resp 
4 
R
e
p
lic
a
 1
 
t1 1 9 -1 -1 -1 
t2 2 3 1 -1 -1 
t3 3 6 -1 1 -1 
t4 4 16 1 1 -1 
t5 5 1 -1 -1 1 
t6 6 15 1 -1 1 
t7 7 2 -1 1 1 
t8 8 12 1 1 1 
R
e
p
lic
a
 2
 
t1 9 10 -1 -1 -1 
t2 10 7 1 -1 -1 
t3 11 4 -1 1 -1 
t4 12 8 1 1 -1 
t5 13 14 -1 -1 1 
t6 14 5 1 -1 1 
t7 15 13 -1 1 1 
t8 16 11 1 1 1 
 
La tabla 6 muestra el diseño factorial 2
3
 completo para este diseño, 
en el cual se indican los 16 experimentos a realizar. 
 
Donde: 
(abs): Absorbancia de la muestra a una λ de 287 nm 
(mm): Diámetro de la mancha de TMP en la CCF. 
(mg): Miligramos de Activo recuperado. 
(%): Porcentaje de Activo recuperado. 
 
 
 ~ 47 ~ 
3.3 Procedimiento general 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pesar el equivalente a 25mg de 
TMP y transferirlos a un embudo de 
separación 
Agregar 50 mL de la fase acuosa
* 
Realizar la Extracción agregando 
Cloroformo
** 
Agitar el embudo de separación 
manualmente
*** 
y Dejar
 
separa las fases
 
Juntar los extractos clorofórmicos de cada embudo de separación en un matraz 
aforado de 25mL y llevar a volumen con cloroformo. La concentración de TMP es 
aproximadamente 1mg/mL 
Realizar una CCF de cada una de las soluciones, tomando 20 µL de alícuota de 
cada solución y 20 µL de alícuota del estándar para cada placa. 
Preparar un Estándar de TMP que contenga una concentración de 1mg/mL 
Pesar 20 tabletas en una balanza 
analítica y pulverizar hasta polvo 
fino en un mortero 
Parte 1 
 
 
 ~ 48 ~ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
*De acuerdo al diseño de Experimentos: Nivel +1: HCL 0.2 N (pH 1) y Nivel -1: NaOH 0.2N (pH 13)
 
**De acurdo al diseño de Experimentos Nivel +1: 3 Extracciones ( 7 mL) y Nivel -1: 1 Extracción (21 
mL)
 
***De acuerdo al diseño de Experimentos Nivel +1: 3 min de agitación manual y Nivel -1: 1 min de 
agitación manual 
 
Figura 5 Esquema de la metodología general 
 
3.4 Planteamiento del diseño experimental 
 
De acuerdo con los factores antes descritos, proponer el diseño 
experimental 23, con el cual se busca evaluar el efecto de A (pH), B (Número 
de extracciones) y C (Tiempo de agitación) en la separación de Trimetoprim 
y Sulfametoxazol contenidos en tabletas además de mejorar la respuesta 
Transferir exactamente 1 mL de la solución de 1mg/mL a un matraz aforado de 50 
mL y evaporar a sequedad en baño maría 
Reconstituir y llevar a volumen con Metanol. La concentración final es de 20 µg/mL 
Leer en el espectrofotómetro UV a una λ de 287 nm 
Parte 2 
Obtener la grafica del espectro de 200 nm a 300 nm tomando la 
lectura cada 5 nm y el máximo reportarlo tomando la lectura cada 
nm apartir de 280 a 290 nm 
 
 
 ~ 49 ~ 
espectrofotométrica y cromatográfica de los analitos de interés. 
 
3.5 Aleatorización de los experimentos 
 
Para que la respuesta no se vea afectada por el sesgo, es necesario 
aleatorizar los 16 experimentos, los cuales se muestran en la Tabla 5. 
 
Dicha aleatorización se llevó a cabo por medio de una hoja de Excel, 
en donde se colocó la secuencia de prueba (es el orden que se seguirá en la 
experimentación) y el No. De experimento (El experimento aleatorizado a 
realizar). 
 
3.6 Análisis de la Separación 22 
 
Una vez realizados los experimentos y obtenidos los resultados de 
diámetro de la mancha y absorbancia, determinar el % de Recuperación de 
TMP para cada tratamiento en ambas réplicas con la siguiente fórmula: 
 
 
 
 
Posteriormente llevar a cabo el análisis del diseño factorial 23, para 
obtener los modelos, análisis gráficos y análisis de varianza de las tres 
respuestas a evaluar para determinar qué factores tienen efecto significativo 
 
 
 ~ 50 ~ 
en el proceso de separación y posteriormente establecer las condiciones de 
separación y determinar las condiciones finales de desarrollo de 
metodología analítica, considerando los lineamientos que marca la FEUM 9ª 
Edición para la prueba de la valoración de trimetoprim en tabletas, con el 
criterio de 93.0% a 107.0%. 
 
3.7 Comprobación de las condiciones de separación 
 
Preparar 5 muestras, mediante pesadas independientes, bajo los 
criterios definidos en el apartado anterior y siguiendo el esquema general de 
preparación de muestras, sí del CV de las determinaciones es menor ò 
igual a 3, proceder a la validación del método. 
 
3.8 Validación 
 
3.8.1 Especificidad del método 
 
En el espectrofotómetro ultravioleta visible, realizar un barrido de la 
solución estándar blanco del cloroformo y de muestra previamente extraída 
de la concentración de 100% en la región de 260 a 310 nm, la longitud 
máxima se encuentra aproximadamente a 287 nm. 
 
Criterio de aceptación: No debe haber interferencia por parte del 
disolvente en la longitud de onda de 287  5 nm. El espectro de absorción de 
estándar y muestra, se semejan en máximos y mínimos. 
 
 
 ~ 51 ~ 
 
3.8.2 Linealidad del sistema y precisión del sistema. 
 
Preparar por triplicado 3 curvas de calibración. Leer y registrar las 
absorbancias de las soluciones a 287 nm. La solución estándar de 100% ( 
20 µg/mL) leer por sextuplicado. 
 
Criterio de aceptación: Coeficiente de determinación r2 ≥ 0.9800 y 
coeficiente de variación ≤ 3.0 %.13 
 
3.8.3 Precisión del Método. 
 
Se evaluó la precisión del método a partir del análisis por quintuplicado por 2 
analistas diferentes en dos días diferentes, considerando un % de 
Recuperación del 93.0 al 107.0 % y un CV de las 10 determinaciones ≤ 3.0% 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 52 ~ 
CAPÍTULO 4 
 
4.0 Resultados y Discusión de Resultados 
4.1 Resultados para Cromatografía en capa fina CCF (Parte 1) 
Metodología General 
 
 
Estándares Secundarios 
 
Figura del Sistema cromatográfico en donde se muestra a los estándares 
secundarios de TMP y SMZ en metanol como disolvente. 
 
STD de TMP = (10,25 mg/10 mL) (1 mL/50 mL) (1000 µg/1 mg) = 20.5 µg/mL 
 
STD de SMZ = (10,17 mg/10 mL) (1 mL/50 mL) (1000 µg/1 mg) = 20.3 µg/mL 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 53 ~ 
Tratamiento1 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 1.0; B 
= 1 Extracción (20 mL de Cloroformo CHCl3); C = 1 min de agitación manual. 
 
Tratamiento 2 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 13.0; 
B = 1 Extracción (20 mL de Cloroformo CHCl3); C = 1 min de agitación manual. 
 
 
 
 ~ 54 ~Tratamiento 3 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 1.0; B 
= 3 Extracciones (7 mL c/u con Cloroformo CHCl3) C = 1 min de agitación manual. 
 
Tratamiento 4 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 13.0; 
B = 3 Extracciones (7 mL c/u con Cloroformo CHCl3) C = 1 min de agitación manual. 
 
 
 
 ~ 55 ~ 
Tratamiento 5 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 1.0; B 
= 1Extracción (20 mL con Cloroformo CHCl3) C = 3 min de agitación manual. 
 
Tratamiento 6 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 13.0; 
B = 1 Extracción (20 mL con Cloroformo CHCl3) C = 3 min de agitación manual. 
 
 
 
 ~ 56 ~ 
Tratamiento 7 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 1.0; B 
= 3 Extracciones (7 mL c/u con Cloroformo CHCl3) C = 1 min de agitación manual. 
 
Tratamiento 8 Replica 1 y 2 
 
Las condiciones bajo las cuales se corrió la cromatoplaca son: A (pH) 13.0; 
B = 3 Extracciones (7 mL c/u con Cloroformo CHCl3) C = 1 min de agitación manual. 
 
 
 ~ 57 ~ 
Lo que se logra apreciar en las cromatoplacas es únicamente la 
mancha correspondiente al TMP en ambas replicas, las cuales fueron 
tratadas con NaOH 0.2 N a pH 13.0, debido a que a estos valores de pH se 
favorece el pKa del activo. 
 
Tabla 10 Resultados para Diámetro de la mancha de Trimetoprim (mm) 
 
Tratamiento A (pH) B (n-Ext) C (t.ag) Replica 1 Replica 2 
1 1,0 1,0 1,0 0 0 
2 13,0 1,0 1,0 3,6 3,0 
3 1,0 3,0 1,0 0 0 
4 13,0 3,0 1,0 3,4 3,0 
5 1,0 1,0 3,0 0 0 
6 13,0 1,0 3,0 3,6 4,0 
7 1,0 3,0 3,0 0 0 
8 13,0 3,0 3,0 4,0 2,7 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 58 ~ 
4.2 Resultados Extracción del Activo TMP (Parte 2) Metodología General 
 
 
0.182 nm es la absorbancia máxima que se presentó a una λ = 287 nm La 
concentración del estándar de TMP es 20 µg/mL 
 
 
0.728 nm es la absorbancia que se presentó a una λ = 287 nm. La 
concentración del estándar de SMZ es 20 µg/mL 
 
0 
0.1 
0.2 
0.3 
0.4 
0.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Estandar TMP 
Estandar TMP 
-0.1 
0.1 
0.3 
0.5 
0.7 
0.9 
1.1 
1.3 
1.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Estandar SMZ 
 
 
 ~ 59 ~ 
Tratamiento 1 Replica 1 y 2 
 
 
 
Tratamiento 2 Replica 1 y 2 
 
 
-0.1 
0.1 
0.3 
0.5 
0.7 
0.9 
1.1 
1.3 
1.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 1 SMZ Replica 1 
Replica 2 
0 
0.05 
0.1 
0.15 
0.2 
0.25 
0.3 
0.35 
0.4 
0.45 
0.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 2 TMP Replica 1 
Replica 2 
 
 
 ~ 60 ~ 
Tratamiento 3 Replica 1 y 2 
 
 
 
Tratamiento 4 Replica 1 y 2 
 
-0.1 
0.1 
0.3 
0.5 
0.7 
0.9 
1.1 
1.3 
1.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 3 SMZ Replica 1 
Replica 2 
0 
0.05 
0.1 
0.15 
0.2 
0.25 
0.3 
0.35 
0.4 
0.45 
0.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 4 TMP Replica 1 
Replica 2 
 
 
 ~ 61 ~ 
 
Tratamiento 5 Replica 1 y 2 
 
 
Tratamiento 6 Replica 1 y 2 
 
 
-0.1 
0.1 
0.3 
0.5 
0.7 
0.9 
1.1 
1.3 
1.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 5 SMZ Replica 1 
Replica 2 
0 
0.05 
0.1 
0.15 
0.2 
0.25 
0.3 
0.35 
0.4 
0.45 
0.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 6 TMP Replica 1 
Replica 2 
 
 
 ~ 62 ~ 
Tratamiento 7 Replica 1 y 2 
 
 
Tratamiento 8 Replica 1 y 2 
 
-0.1 
0.1 
0.3 
0.5 
0.7 
0.9 
1.1 
1.3 
1.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 7 SMZ Replica 1 
Replica 2 
0 
0.05 
0.1 
0.15 
0.2 
0.25 
0.3 
0.35 
0.4 
0.45 
0.5 
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 
Tratamiento 8 TMP Replica 1 
Replica 2 
 
 
 ~ 63 ~ 
En la tabla 12 se muestran los resultados obtenidos para Absorbancia (abs) y 
diámetro de la mancha en (mm) empleando el diseño factorial 23 descrito con 
anterioridad en este trabajo. 
 
Tabla 11 Resultados del diseño experimental 
 
Tratamiento 
Secuencia 
de prueba 
No. Exp 
Aleatorio 
A B C 
(mm) 
Resp 
1 
(abs) 
Resp 
2 
(mg) 
Resp 
3 
(%) 
Resp 
4 
R
e
p
lic
a
 1
 
t1 1 9 -1 -1 -1 0.0 0.718 0.0 0.0 
t2 2 3 1 -1 -1 3.6 0.172 77.5 96.9 
t3 3 6 -1 1 -1 0.0 0.640 0.0 0.0 
t4 4 16 1 1 -1 3.4 0.189 85.1 106.4 
t5 5 1 -1 -1 1 0.0 0.638 0.0 0.0 
t6 6 15 1 -1 1 3.6 0.167 75.3 94.1 
t7 7 2 -1 1 1 0.0 0.627 0.0 0.0 
t8 8 12 1 1 1 4.0 0.178 80.2 100.3 
R
e
p
lic
a
 2
 
t1 9 10 -1 -1 -1 0.0 0.636 0.0 0.0 
t2 10 7 1 -1 -1 3.0 0.151 68.0 85.1 
t3 11 4 -1 1 -1 0.0 0.605 0.0 0.0 
t4 12 8 1 1 -1 3.0 0.146 65.8 82.3 
t5 13 14 -1 -1 1 0.0 0.422 0.0 0.0 
t6 14 5 1 -1 1 4.0 0.113 50.9 63.6 
t7 15 13 -1 1 1 0.0 0.645 0.0 0.0 
t8 16 11 1 1 3 2.7 0.146 65.8 82.2 
 
 
 
 
 
 
 
 ~ 64 ~ 
4.3 Diseño Factorial 23 por el método de Contrastes Absorbancia 
(abs) a 287nm 
 
Objetivos: 
1) Obtener el modelo matemático 
2) Analizar gráficamente la respuesta y determinar si hay efecto 
significativo de los factores por medio del análisis de varianza 
Donde los factores experimentales que se evaluaron son: 
 
Codificado A (pH) B (n-Ext) C (t Ag) 
-1 1 1 1 
+1 13 3 3 
 
Hipótesis nula: Hipótesis Alterna: 
 H0 = E1 = 0 H1 = E1 ≠ 0 
 
HO: El efecto de los factores es cero y H1: El efecto de los factores es 
diferente de cero. 
 
Las hipótesis se contrastan contra cero, dado que el objetivo es 
detectar si los factores tienen un efecto significativo sobre la respuesta, los 
resultados se muestran en la Tabla 15. 
 
En la tabla 13 se muestran los resultados obtenidos 
experimentalmente para la respuesta absorbancia (abs) a 287 nm. 
 
 
 
 
 
 ~ 65 ~ 
Tabla 12 Resultados Experimentales para Absorbancia (abs) 
 
 A B AB C AC BC ABC I II TOTALES 
(i) - - + - + + - 0.718 0.636 1.354 
a + - - - - + + 0.172 0.151 0.323 
b - + - - + - + 0.640 0.605 1.245 
ab + + + - - - - 0.189 0.146 0.335 
c - - + + - - + 0.638 0.422 1.060 
ac + - - + + - - 0.167 0.133 0.280 
bc - + - + - + - 0.627 0.645 1.272 
abc + + + + + + + 0.178 0.146 0.324 
 
Tabla 13 Tabla de signos Absorbancia 
 
 A B AB C AC BC ABC TOTALES 
I 1 - - + - + + - 1.354 
a 2 + - - - - + + 0.323 
b 3 - + - - + - + 1.245 
ab 4 + + + - - - - 0.335 
c 5 - - + + - - + 1.060 
ac 6 + - - + + - - 0.280 
bc 7 - + - + - + - 1.272 
abc 8 + + + + + + + 0.324 
 
∑ (+) 1.262 3.176 3.073 2.936 3.203 3.273 2.952 
 
∑ (-) 4.931 3.017 3.120 3.257 2.990 2.920 3.241 
CONTRASTE 
-3.669 0.159 
-
0.047 -0.321 0.213 0.353 
-
0.289 
EFECTO 
-0.459 0.020 
-
0.006 -0.040 0.027 0.044 
-
0.036 
COEFICIENTE 
-0.229 0.010 
-
0.003 -0.020 0.013 0.022 
-
0.018 
 
 
 
 
 
 ~ 66 ~ 
 
Tabla 14. Anova para abs 
 
 A B AB C AC BC ABC 
SC 0.841 0.002 0.000 0.006 0.003 0.008 0.005 
∑x2 3.293 (∑x)2 38.353 SCtot = 0.896 
SCfv 
= 
0.865 
 
Tabla 15. Análisis de varianza abs 
F.V g.l SC SCM Fo F0.05,1,8 
a 1 0.841 0.841 220.11 4.49 
b 1 0.002 0.002 0.41 4.49 
ab 1 0.000 0.000 0.04 4.49 
c 1 0.006 0.006 1.68 4.49 
ac 1 0.003 0.003 0.74 4.49 
bc 1 0.008 0.008 2.04 4.49 
abc 1 0.005 0.005 1.37 4.49 
Residual 8 0.031 0.004 
Total 15 0.896 0.060 
 
Al examinar la tabla de análisis de varianza encontramos que para el 
factor A (pH) F0 = 220.11 valor mayor que F0.05,1,8 de tablas = 4.49 por lo que 
se rechaza la hipótesis nula se concluye que con un 95% de confianza que el 
efecto de los factores es significativo sobre la respuesta, por ello la hipótesis 
alterna se acepta 
 
Ecuación del Modelo: 
 
y=bo+b1A+b2B+b3AB+b4C+b5AC+b6BC+b7ABC 
 
Tabla 16. Coeficientes de regresión para (abs) 
 
Constante= 0.387 
A (pH) = -0.229 
B (n-extracciones) = 0.010 
 
 
 ~ 67 ~ 
C (T. Agitación) = -0.020 
AB = -0.003 
AC = 0.013 
BC = 0.022 
ABC = -0.018 
 
Sustituimos los valores de los coeficientes y de los factores 
codificados en la ecuación del modelo para obtener las respuestas. Tabla 17. 
Por lo tanto el modelo para (ABS) es: 
 
Y = (0.387) – (0.229*A) + (0.010*B) – (0.003*A*B) – (0.020*C) + (0.013*A*C) + 
(0.022 *B*C) – (0.018 *A* B*C) 
 
Ecuación del modelo: y=bo+b1A+b2B+b3AB+b4C+b5AC+b6BC+b7ABC 
 
Al sustituir los diferentes valores codificados de cada factor de la 
ecuación, se encontró que: 
 
A pH 13 (Codificado = 1) 
B n-Extracciones 3 (Codificado = 1) 
C T. agitación 1 min (Codificado = -1) 
 
Ejemplo del cálculo de codificación para pH: 
 
 
 
 
 ~ 68 ~ 
A continuación en la tabla 17 se detalla un ejemplo de cómo se 
obtuvieron las respuestas, sustituyendo cada uno de los valores codificados 
para cada factor. 
Y = (0.387) - (0.229*1) + (0.010*1) - (0.003 *1 * 1) - (0.020*-1) + (0.0133 * 1*-1) + 
(0.022*1 *-1) – (0.018 *1 *1 *-1) = 0.1677 = 0.168 
 
Tabla 17 Algoritmo para Absorbancia. 
 
A B C bo b1 b2 b3 b4 b5 b6 b7 RESPUESTA 
-1 -1 -1 0.387 0.229 -0.010 -0.003 0.020 0.013 0.022 0.018 0.677 
1 -1 -1 0.387 -0.229 -0.010 0.003 0.020 -0.013 0.022 -0.018 0.162 
-1 1 -1 
0.387 0.229 0.010 0.003 0.020 0.013 
-
0.022 -0.018 0.623 
1 1 -1 
0.387 -0.229 0.010 -0.003 0.020 -0.013 
-
0.022 0.018 0.168 
-1 -1 1 
0.387 0.229 -0.010 -0.003 
-
0.020 -0.013 
-
0.022 -0.018 0.530 
1 -1 1 
0.387 -0.229 -0.010 0.003 
-
0.020 0.013 
-
0.022 0.018 0.140 
-1 1 1 
0.387 0.229 0.010 0.003 
-
0.020 -0.013 0.022 0.018 0.636 
1 1 1 
0.387 -0.229 0.010 -0.003 
-
0.020 0.013 0.022 -0.018 0.162 
 
De acuerdo con lo anterior se concluye que el efecto del factor pH es 
significativo para la extracción del TMP de la tableta con un nivel de 
confianza del 95%. 
 
 
 ~ 69 ~ 
 
Fig. 6 Gráfica de Cubo para (abs) 
 
 
Análisis gráfico: 
Mediante este análisis, podemos conocer como varía la respuesta a 
partir del vértice I hacia los diferentes vértices del cubo. 
 
1.- El efecto de los factores A, B y C en su nivel más bajo es positivo 
para la separación de TMP y SMZ, solo que debido al pH de la fase acuosa 
el pKa del SMZ se ve favorecido ya que el valor de absorbancia obtenido es 
cercano al del estándar de SMZ. 
 
2.- El efecto de a es positivo, debido a que hubo un cambio en la 
respuesta al aumentar el nivel del factor A; por lo tanto hay separación del 
TMP y SMZ, debido a que el aumento del valor de pH la fase acuosa 
favorece el pKa del TMP, ya que el valor de abs obtenido se acerca al valor 
del Estándar de TMP. 
 
 
 
 ~ 70 ~ 
3.- El efecto de b es positivo para la separación de TMP y SMZ, solo 
que debido al pH de la fase acuosa el pKa del SMZ se ve favorecido, ya que 
el valor de abs obtenido es cercano al valor del estándar de SMZ. 
 
4.- El efecto de c es positivo para la separación de TMP y SMZ, solo 
que debido al pH de la fase acuosa el pKa del SMZ se ve favorecido, ya que 
el valor de abs obtenido es cercano al valor del estándar de SMZ. 
 
5.- El efecto de ab es positivo debido a que hubo un cambio en la 
respuesta al aumentar el nivel de los factores A y B, por lo tanto hay 
separación del TMP y SMZ, solo que en esta ocasión el aumento del valor de 
pH de la fase acuosa y del número de extracciones favorecieron el pKa del 
TMP, ya que el valor de abs obtenido se acerca al valor del Estándar de 
TMP. 
 
6.- El efecto de ac es positivo debido a que hubo un cambio en la 
respuesta al aumentar el nivel de los factores A y C, por lo tanto hay 
separación del TMP y SMZ, solo que en esta ocasión el aumento del valor de 
pH de la fase acuosa y del tiempo de agitación favorecieron el pKa del TMP, 
ya que el valor de abs obtenido se acerca al valor del Estándar de TMP. 
 
7.- El efecto de bc es positivo para la separación de TMP y SMZ, solo 
que debido al pH de la fase acuosa y al tiempo de agitación el pKa del SMZ 
se ve favorecido, ya que el valor de abs obtenido es cercano al valor del 
estándar de SMZ 
 
8.- El efecto de abc es positivo debido a que hubo un cambio en la 
respuesta al aumentar el nivel de los factores A, B y C, por lo tanto hay 
 
 
 ~ 71 ~ 
separación del TMP y SMZ, solo que en esta ocasión el aumento del pH de 
la fase acuosa, el aumento del número de extracciones y el aumento del 
tiempo de agitación favorecieron el pKa del TMP, ya que el valor de abs 
obtenido se acerca al valor del Estándar de TMP. 
 
Se logra observar que en todos los efectos de los factores hay 
separación del TMP y SMZ, solo que se favorece la extracción del TMP al 
observar un cambio en la respuesta producida por un aumento en el nivel del 
factor A. 
 
Si no se produce este aumento en el nivel del factor A, se favorece la 
extracción del SMZ, ya que en ambos casos el pKa de ambas sustancias se 
ve favorecido. 
 
Este factor que tiene un efecto significativo sobre la respuesta 
analítica como lo demostró con anterioridad en análisis de varianza. 
 
Nota: La absorbancia del estándar de TMP en solución clorofórmica y 
de concentración aproximadamente de 20 µg/mL y a una longitud de onda de 
287 nm es de aproximadamente 0.182 nm. 
 
Sin embargo para una solución de SMZ bajo las mismas condiciones 
de concentración y de longitud de onda, la absorbancia obtenida es de 0.728 
nm. 
 
 
 
 
 ~ 72 ~ 
4.4 Diseño Factorial 23 por el método de Contrastes Diámetro de 
la mancha (mm) 
 
Objetivos: 
1) Obtener el modelo matemático 
2) Analizar gráficamente la respuesta y determinar si hay efecto 
significativo de los factores por medio del análisis de varianza 
Donde los factores experimentales que se evaluaron son: 
 
Codificado A (pH) B (n-Ext) C (t Ag) 
-1 1 1 1 
+1 13 3 3 
 
Hipótesis nula: Hipótesis Alterna: 
 H0 = E1 = 0 H1 = E1 ≠ 0 
 
HO: El efecto de los factores es cero y H1:El efecto de los factores es 
diferente de cero. 
 
Las hipótesis se contrastan contra cero, dado que el objetivo es 
detectar si los factores tienen un efecto significativo sobre la respuesta, los 
resultados se muestran en la Tabla 20. 
 
En la tabla 18 se muestran los resultados obtenidos 
experimentalmente para la respuesta Diámetro de la mancha (mm). 
 
 
 
 
 ~ 73 ~ 
Tabla 18 Resultados Experimentales para Diámetro de la mancha (mm) 
 
 A B AB C AC BC ABC I II TOTALES 
(i) - - + - + + - 0 0 0 
a + - - - - + + 3.6 3 6.6 
b - + - - + - + 0 0 0 
ab + + + - - - - 3.4 3 6.4 
c - - + + - - + 0 0 0 
ac + - - + + - - 3.6 4 7.6 
bc - + - + - + - 0 0 0 
abc + + + + + + + 4 2.7 6.7 
 
Tabla 19 Tabla de Signos Diámetros de la mancha (mm) 
 
 A B AB C AC BC ABC TOTALES 
I 1 - - + - + + - 0 
a 2 + - - - - + + 6.6 
b 3 - + - - + - + 0 
ab 4 + + + - - - - 6.4 
c 5 - - + + - - + 0 
ac 6 + - - + + - - 7.6 
bc 7 - + - + - + - 0 
abc 8 + + + + + + + 6.7 
 
∑ (+) 27.300 13.100 13.100 14.300 14.300 13.300 13.300 
 
∑ (-) 0.000 14.200 14.200 13.000 13.000 14.000 14.000 
CONTRASTE 27.300 -1.100 -1.100 1.300 1.300 -0.700 -0.700 
EFECTO 3.413 -0.138 -0.138 0.163 0.163 -0.087 -0.087 
COEFICIENTE 1.706 -0.069 -0.069 0.081 0.081 -0.044 -0.044 
 
 
 
 
 
 ~ 74 ~ 
 
Tabla 20. Anova para Diámetros de la mancha (mm) 
 
 A B AB C AC BC ABC 
SC 46.581 0.076 0.076 0.106 0.106 0.031 0.031 
∑x2 94.770 (∑x)2 745.290 
SCtot 
= 48.189 
SCfv 
= 47.004 
 
Tabla 21. Análisis de varianza para diámetros de la mancha (mm) 
F.V g.l SC SCM Fo Ft 
A 1.00 46.58 46.58 314.47 4.49 
B 1.00 0.08 0.08 0.51 4.49 
AB 1.00 0.08 0.08 0.51 4.49 
C 1.00 0.11 0.11 0.71 4.49 
AC 1.00 0.11 0.11 0.71 4.49 
BC 1.00 0.03 0.03 0.21 4.49 
ABC