Aportaciones-de-la-secuenciacion-de-alto-rendimiento-a-la-biomedicina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
APORTACIONES DE LA SECUENCIACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO A 
LA BIOMEDICINA-TRABAJO MONOGRÁFICO DE ACTUALIZACIÓN 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO 
 
 
 
 
 PRESENTA 
 AARÓN ELIEZER LÓPEZ LÓPEZ 
CIUDAD DE MÉXICO, A 13 DE AGOSTO DEL 2018. 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: NANCY MONROY JARAMILLO 
VOCAL: ALBERTO ORTEGA VÁZQUEZ 
SECRETARIO: GEORGINA HERNÁNDEZ MONTES 
1er. SUPLENTE: LIZBETH ESMERALDA GARCÍA VELÁZQUEZ 
2° SUPLENTE: ALBERTO GRACÍA LOZANO 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: RED DE APOYO A LA INVESTIGACIÓN 
(UNAM) 
 
ASESOR DEL TEMA: DRA. GEORGINA HERNÁNDEZ MONTES _________________________ 
 
 
SUSTENTANTE: AARÓN ELIEZER LÓPEZ LÓPEZ __________________________ 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
RESUMEN…………………………………………………………………………….....1 
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….........4 
OBJETIVOS……………………………………………………………………………..6 
1.Secuenciación de alto rendimiento y medicina personalizada…………………..7 
 1.1 Antecedentes…………………………………………………………….….........9 
 1. 2 Secuenciadores comerciales…………………………………………............12 
 1.3. Aplicaciones de la tecnología de secuenciación……………….………......19 
2. Secuenciación de genoma y variación………………….…………..…………...20 
 2.1 Variación genómica y cáncer………………………………………….…...23 
 3. Metagenómica………………………………………………………………..…....27 
 3.1 Secuenciación del microbioma………………………….……………….....28 
 3.2 Microbioma humano……………………………………………………….....31 
 3.3 Correlación entre salud y microbioma…………………………………..….36 
 4.Transcriptómica……………………………………….……….……………....….55 
 4.1 Transcriptómica y cáncer………………………….……………….........….58 
 4.2 Transcriptómica y enfermedades cardiovasculares……….......…..….....67 
 4.3 Transcriptómica y diabetes……………………………………...…..….…..71 
 5. Epigenómica……..………………………………...………………....…..…......74 
 5.1 Epigenómica y cáncer……………...…………………………...…………...79 
 5.2 Fármacos que actúan sobre el epigenoma……...…………...….....….….80 
 6. Alcances de la medicina de precisión…………………………..….....……….82 
 6.1 Medicina de precisión en México…………………………..……….……...85 
DISCUSIÓN…………………………...….………………..………………..…...…….89 
CONCLUSIONES………….…………...………………...………………..……….....93 
BIBLIOGRAFÍA…………………………………………...…………………….…..….94 
 
 
 
1 
 
 
RESUMEN 
La medicina de precisión ha presentado un crecimiento exponencial en años 
recientes. La secuenciación del genoma humano fue un gran salto en el 
conocimiento biológico el cual abrió un nuevo panorama para la investigación en 
ciencias de la salud. Esto motivó el desarrollo de nuevas tecnologías de 
secuenciación que facilitarán considerablemente la secuenciación del material 
genético, no solo del ser humano, sino de prácticamente cualquier especie. 
Las tecnologías de secuenciación de nueva generación han abierto un nuevo 
camino a investigadores sobre la etiología y pronóstico de una gran cantidad de 
enfermedades de componente genético, principalmente cáncer, diabetes tipo 1 y 2 y 
enfermedades cardiovasculares entre otras. Gracias a estas nuevas plataformas, 
hoy en día es posible obtener una cantidad de datos considerable en períodos de 
tiempo relativamente bajos, y por un costo bastante inferior al que representaba 
secuenciar hace algunos años. 
Por ello, el objetivo de este trabajo es realizar una revisión exhaustiva del impacto 
de las tecnologías de secuenciación de nueva generación en el área de la 
biomedicina, principalmente en las áreas metagenómica,transcriptómica, 
epigenómica y variantes a nivel de genoma, ya que todas ellas se basan en la 
secuenciación como principal herramienta para generar datos bioinformáticos. 
El desarrollo de nuevas tecnologías de secuenciación, también ha permitido la 
caracterización de una gran cantidad de genomas, incluso a nivel de poblaciones 
completas. Esto ha facilitado la identificación de variantes de riesgo que 
predisponen a la aparición y desarrollo de ciertas enfermedades, como es el caso 
del cáncer de mama. Hoy en día es posible obtener un panorama más global del 
genoma, ya que por lo regular, hay más de un gen que se encuentra afectado para 
que pueda observarse la enfermedad en un individuo con predisposición genética. 
Además la secuenciación de alto rendimiento ha facilitado de manera considerable 
la identificación de nuevas variables de riesgo, asociadas a diversas enfermedades, 
y sobre todo en distintas poblaciones. 
Gracias a la secuenciación del metagenoma, se ha observado la influencia de la 
microbiota en la etiología de diversas enfermedades humanas, entre las cuales 
destacan el cáncer y la diabetes tipo 1 y 2. Diferentes especies microbianas 
producen metabolitos cuyo impacto puede afectar de manera considerable la salud 
 
2 
 
del hospedero. Por ejemplo, algunas especies interviene con el metabolismo de 
estrógenos al desconjugar los ácidos biliares primarios, permitiendo la reabsorción 
de estrógenos,los cuales se sabe están implicados en la aparición de diversos tipos 
de cáncer, como es el cáncer de endometrio. En el caso de la diabetes, algunas 
especies bacterianas pueden promover la autoinmunidad contra las células beta 
pancreáticas, al proporcionar un entrenamiento poco adecuado para el sistema 
inmune de niños en desarrollo, aumentando las posibilidades de que el infante 
presente diabetes tipo 1. Más aún, la caracterización del microbioma también ha 
permitido plantear el uso de este como un posible biomarcador para enfermedades, 
ya que en el caso de la diabetes, o bien en pronósticos para el cáncer, ya que se 
observa un aumento o disminución en determinadas especies bacterianas, lo cual 
puede correlacionarse con el desarrollo de la enfermedad. Incluso, se ha planteado 
el uso o modificación de la microbiota como posible herramienta terapéutica. 
La transcriptómica por su parte, se enfoca en el estudio del material genético 
transcrito de una célula, o bien de un organismo completo. Esto resulta de gran 
utilidad para la investigación en el cáncer, donde las células malignas se 
caracterizan por presentar un patrón transcriptómico aberrante. Sin embargo, el 
estudio de la transcriptómica no solo se limita a esta enfermedad, sino que también 
ha permitido la caracterización de diversos tipos de transcritos que pueden estar 
involucrados en la etiología de otras enfermedades, como ocurre en las 
enfermedades cardiovasculares y diabetes. Algunos tipos de RNA están 
involucrados en la respuesta a daño vascular, mientras que otros se especula tiene 
una función importante en el metabolismo de la insulina y glucosa. 
La epigenómica, es el estudio de la expresión modificable del genoma. Típicamente, 
las células no utilizan en su totalidad su material genómico, por lo que se requieren 
de sofisticados mecanismos de silenciamiento y/o activación de genes para que 
todacélula lleve adecuadamente sus funciones. Para conocer las regiones del 
genoma que están sujetas a modificaciones covalentes,se requiere de enfoques 
epigenéticos. Hoy en día los dos principales son la secuenciación con bisulfito y 
ChiP-seq. Enfermedades como el cáncer, presenta alteraciones importantes en el 
 
3 
 
epigenoma, principalmente debidas al silenciamiento de genes supresores de 
tumores, y /o al activación de oncogenes. Además, es importante la adecuada 
caracterización de las regiones genómicas sujetas al silenciamiento o activación de 
genes, ya que esto también ha permitido el diseño de nuevos fármacos que actúan 
a nivel de epigenoma, restablecido el equilibrio en la regulación covalente de genes. 
Es por ello que cada día hay más iniciativas que buscan apoyar el desarrollo de la 
medicina de precisión a nivel mundial, ya que la medicina de precisión promete un 
gran avance en las ciencias de la salud para la humanidad. 
La medicina de precisión ha permitido una mejor caracterización genómica de las 
poblaciones de distintos países alrededor del mundo y México no es la excepción. El 
alto porcentaje de mestizaje en este país, proporciona un nuevo reto para la 
medicina de precisión, pues muchas de las variables de riesgo reportadas han sido 
detectadas en poblaciones caucásicas, asiáticas o de afrodescendientes, por lo que, 
poblaciones indígenas y mestizas en menor grado, han permanecido poco 
estudiadas en el contexto genómico, lo que abre un nuevo panorama para la 
medicina de precisión en este país. 
A pesar de los nuevos obstáculos que ahora se presentan en el desarrollo integral 
de la medicina de precisión, es importante destacar la gran cantidad de información 
que ha sido generada en los últimos años gracias a la investigación sistemática e 
implementación de estas nuevas tecnologías. Si bien hoy en día, aún no es del todo 
asequible la implementación de la medicina personalizada en el área clínica, gracias 
al desarrollo en la investigación, cada vez se vuelve más fácil imaginar este nuevo 
enfoque. 
 
 
 
 
 
 
 
4 
 
 
INTRODUCCIÓN 
La secuencia de bases nitrogenadas del DNA contiene la información necesaria 
para que todo organismo realice sus funciones vitales. Por ello, para poder 
comprender y modificar esta información, la secuenciación del ADN se ha vuelto 
indispensable para la investigación biomédica en décadas recientes. 
El primer método de secuenciación químico enzimático fue desarrollado por 
Frederick Sanger y colaboradores en el año de 1977. Este método contribuyó de 
manera significativa al desarrollo de las ciencias biológicas en décadas posteriores. 
Gracias a esta técnica, fue posible completar la secuencia del genoma humano en 
el año 2003. 
Las tecnologías posteriores al método de Sanger se consideran de segunda 
generación, ya que éstas tienen mayor rendimiento y los costos de secuenciación 
son considerablemente más bajos. Poco después, se logró eliminar el paso de 
amplificación, así como la monitorización en tiempo real en los equipos más 
modernos de secuenciación. Esto dio lugar a las tecnologías de tercera generación, 
siendo estas últimas el estado del arte en la tecnología de secuenciación actual. 
Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento han permitido abordar 
problemas biológicos desde una perspectiva global. Una de las aplicaciones más 
prometedoras de estas tecnologías es en el campo de la medicina personalizada, la 
cual busca diagnosticar y pronosticar el curso de diferentes enfermedades con base 
en la información genómica del paciente, en conjunto con los demás datos clínicos. 
Gracias a los nuevos equipos de secuenciación, es posible secuenciar el genoma 
de una gran cantidad de organismos, que de otro modo serían imposibles de 
caracterizar. Esto ha facilitado nuestra comprensión de la participación de la 
microbiota en los diferentes estados de salud. La secuenciación del alto rendimiento 
también ha facilitado la caracterización del transcriptoma, por lo que hoy en día 
conocemos un panorama más amplio de la gran cantidad de transcritos que hay en 
la célula, y cómo influyen en los diferentes estadios del desarrollo, los cuales 
también son cruciales para conocer la etiología de diversas enfermedades. Más 
aún, hoy en día es posible caracterizar el epigenoma. A excepción del zigoto 
totipotencial y las células de línea germinal, las células humanas, no requieren de 
su información genómica completa, por lo que los mecanismos de silenciamiento de 
genes son cruciales para su adecuado desarrollo y supervivencia. Finalmente, los 
 
5 
 
equipos de secuenciación de nueva generación han permitido detectar una gran 
cantidad de variantes genómicas en individuos de una misma población, las cuales 
podrían estar implicadas en la etiología y desarrollo de diversas enfermedades. 
A pesar de que este desarrollo tecnológico ha revolucionado por completo nuestra 
forma de abordar las preguntas en biomedicina y ha generado una gran cantidad de 
información, hoy en día aún quedan bastantes retos para poder aplicar este 
conocimiento al ámbito clínico. Actualmente han surgido iniciativas con el fin de 
desarrollar nuevas herramientas y metodologías que permitan la integración de 
información para implementar la medicina de personalizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
 
OBJETIVOS 
 
● Realizar una revisión exhaustiva de publicaciones científicas recientes, 
relacionadas con la biomedicina. 
● Recopilar algunos de los hallazgos más significativos, relacionados con la 
secuenciación, en las diversas ramas de la medicina de precisión. 
● Analizar cómo han contribuido las tecnologías de secuenciación masiva al 
desarrollo de la medicina de precisión. 
● Comprender mejor cuál es el panorama actual de la medicina precisión, a 
nivel mundial y en México. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
1. Secuenciación de alto rendimiento y medicina personalizada 
La mayoría de los conceptos centrales de la biología que se aceptan en la 
actualidad, fueron definidos a partir de la caracterización de las moléculas de ácido 
desoxirribonucleico (DNA por sus siglas en inglés deoxyribonucleic acid) y ácido 
ribonucleico (RNA por sus siglas en inglés ribonucleic acid) (Sanchez-Flores and 
Abreu-Goodger 2014). Entre estos destacan la función del DNA en la heredabilidad, 
así como su participación en el código genético, y el Dogma Central de la Biología 
molecular, donde la transcripción, la traducción, y la regulación de las mismas, 
hubieran resultado imposibles de definir sin una previa caracterización de la 
estructura química de los ácidos nucleicos que componen el código genético 
(Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). 
Con la caracterización de la estructura tridimensional del DNA, es decir, la doble 
hélice, el siguiente paso limitante para la investigación biológica, sería poder 
descifrar el código genético, es decir “leer” o secuenciar el DNA (Sanchez-Flores 
and Abreu-Goodger 2014; Heather and Chain 2016). El orden de ácidos nucleicos 
en las cadenas de polinucleótidos determina la información hereditaria y las 
propiedades bioquímicas que serán transmitidas a la progenie en toda forma de vida 
(Heather and Chain 2016). Es por ello, que la determinación de este orden o 
secuencia es fundamental para la investigación biológica. 
Gracias a la llegada de nuevas tecnologías de secuenciación del DNA, se ha 
observado un crecimiento exponencial en los datos genómicos y transcriptómicos en 
décadas recientes (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). A pesar de que 
diversos factores también han contribuido al crecimiento exponencial de estos datos 
bioinformáticos, gran parte del avance se debe a las tecnologías de secuenciación 
de alto rendimiento (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). Tomando como 
referencia el método de Sanger, éstastecnologías reducen drásticamente los costos 
de secuenciación, y al mismo tiempo, muestran un gran aumento en el rendimiento 
(Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). Si se considera el método de Sanger 
como el primer método estandarizado de secuenciación, podría decirse que las 
tecnologías posteriores son de segunda y tercer generación, respectivamente 
(Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). 
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La disminución en los costos de secuenciación, así como la mayor accesibilidad de 
estas tecnologías han permitido a universidades a instituciones desarrollar un 
amplio catálogo de aplicaciones para la secuenciación de alto rendimiento (Reuter 
et al. 2015). Una de las aplicaciones más interesantes de estas nuevas tecnologías 
está en el campo de la medicina personalizada o medicina de precisión, la cual se 
basa en el panorama genético de los pacientes para evaluar y monitorizar su estado 
de salud, así como los posibles riesgos médicos, que el mismo paciente puede 
presentar (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). Para ello se requiere 
interpretar la información genómica y transcriptómica de cada paciente, en conjunto 
con los estudios clínicos e historia médica del paciente. Sin embargo, la integración 
de la información médica, así como la información de ciencias ómicas, no es una 
tarea sencilla, y requiere de la interpretación de expertos en ambas áreas para la 
integración de un diagnóstico útil (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). 
El término “medicina de precisión” fue utilizado por primera vez en una publicación 
del US National Research Council donde se buscaba inspirar una nueva taxonomía 
para la clasificación de enfermedades a través de redes de conocimiento (Ashley 
2016). Los autores de esta publicación sugieren el uso de este término, en vez del 
término más comúnmente usado, “medicina personalizada” ya que las terapias rara 
vez son desarrolladas para un individuo en particular, sino que se dirigen a un 
subgrupos de pacientes, en este caso, el subgrupo comparte ciertas características 
genómicas en común (Ashley 2016). 
La secuenciación del genoma humano llevó a una gran cantidad de avances 
potenciales para la medicina clínica (Ashley 2016). El comprender las bases 
genéticas de ciertas enfermedades naturalmente puede llevar a terapias mejor 
dirigidas (Ashley 2016). Es por ello que gracias a la disminución de costos y mayor 
accesibilidad de tecnologías de secuenciación de nueva generación se han 
descubierto nuevos genes causales, así como reportes de decisiones en la 
mediación, dirigidas con base en las características genómicas de un paciente 
(Ashley 2016). 
Debido a la complejidad del genoma humano, la secuenciación con el método 
tradicional de Sanger, no resultaba una alternativa viable para la investigación 
biomédica, principalmente por los elevados costos y el rendimiento relativamente 
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bajo que representaba este procedimiento. Esto dio lugar a diferentes iniciativas por 
parte de Instituciones y Universidades a nivel mundial para disminuir de manera 
drástica los costos de secuenciación, así como mejorar los rendimientos. Por 
ejemplo, el Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano (NGHRI por sus 
siglas en inglés National Human Genome Research Institute) invirtió 70 millones de 
dólares para reducir el costo de secuenciación del genoma humano a 1000 dólares, 
en tan sólo 10 años (Reuter et al. 2015). Gracias a esto surgieron diversas 
tecnologías de secuenciación innovadoras, dando lugar a las plataformas de 
secuenciación de segunda generación, las cuales tiene como principal característica 
que reducen el costo de secuenciación por base, requieren cantidades 
relativamente bajas de material genético y dan mayores rendimientos con respecto 
al método de Sanger (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). La mejora 
continua en las tecnologías, dio origen posteriormente a nuevas plataformas de 
secuenciación, las cuales ya no requerían del paso de amplificación del material 
genético, y además, la secuenciación en estos equipos puede monitorizarse en 
tiempo real (Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 2014). Por ello, estas últimas 
plataformas se denominan tecnologías de tercera generación (Sanchez-Flores and 
Abreu-Goodger 2014). A pesar de las ventajas que ofrecen los equipos de segunda 
generación, estos presentan ciertas limitaciones, por ejemplo longitudes de lectura 
cortas, problemas en el ensamblado de genomas y dificultades para la 
determinación de regiones genómicas complejas, detección de isoformas de genes 
y detección de la metilación (Rhoads and Au 2015). Algunos de estas limitaciones 
pueden superarse gracias a ciertos equipos de tercera generación (Rhoads and Au 
2015). 
1.1 Antecedentes 
Los ácidos nucleicos fueron descubiertos por primera vez en 1869 por Friedrich 
Miescher, quien los denominó como “nucleína”, no obstante, se desconocía su 
función en la herencia, y más aún, sus funciones bioquímicas (Sanchez-Flores and 
Abreu-Goodger 2014). Para 1953, fue elucidada por primera vez la estructura 
tridimensional del DNA, por Watson y Crick, con base en los datos cristalográficos 
obtenidos por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins(Sanchez-Flores and Abreu-
Goodger 2014; Heather and Chain 2016). Sin embargo, no se sabía como “leer” o 
interpretar esta información genética. No fue sino hasta 1965 cuando Robert Holley 
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y sus colegas obtuvieron la primer secuencia de una molécula completa de alanina 
de RNA de transferencia (tRNA) de Saccharomyces cerevisiae. Al mismo tiempo, 
Fred Sanger y colaboradores desarrollaron una técnica, basada en la detección de 
fragmentos parcialmente digeridos y marcados radiactivamente, después de un 
fraccionamiento bidimensional (Heather and Chain 2016).Posteriormente, Ray Wu y 
Dale Kaiser utilizaron el fago λ y la ADN polimerasa para llenar los extremos 
cohesivos usando nucleótidos radioactivos, proporcionando cada nucleótido, uno a 
la vez y midiendo su incorporación para deducir su secuencia (Heather and Chain 
2016). Esta técnica permitió inferir el orden de los nucleótidos en cualquier sitio del 
genoma de los bacteriófagos (Heather and Chain 2016). 
El siguiente paso crítico sería el reemplazo del fraccionamiento bidimensional por 
una separación sencilla, en función de la longitud de los polinucleótidos a través de 
geles de poliacrilamida. Esta técnica recibió el nombre de “plus y minus”. El 
procedimiento consistía en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar a partir de un 
iniciador, incorporando nucleótidos radiomarcados, antes de realizar dos reacciones 
seguidas de polimerización, la reacción “plus” en la cual solo un tipo de nucleótido 
estaba presente, así todas las extensiones serían terminadas con esa base, y 
posteriormente la reacción “minus” en la cual se usaban los otros tres nucleótidos, 
produciendo todas las secuencias antes de la posición del nucleótido faltante. Los 
productos obtenidos, se corren en un gel de poliacrilamida, y comparando entre los 
ocho carriles, es posible inferir la secuencia más probable. (Heather and Chain 
2016). 
A pesar de que estos métodos constituyeron un gran avance en la tecnología de 
secuenciación, el mayor progreso que cambiaría para siempre la forma de 
secuenciar el ADN sería con la técnica de Sanger, desarrollada en 1977 (Heather 
and Chain 2016). Esta técnica emplea análogos químicos de los 
desoxirribonucleótidos (dNTPs) los cuales son monómeros de las hebras de ADN. 
Los didesoxirribonucleótidos (ddNTPs) carecen del grupo hidroxilo en el carbono 3´ 
el cual se requiere para las extensiones de las cadenas de ADN durante la 
polimerización, y por lo tanto no se pueden enlazar con el fosfato en el carbono 5´ 
del siguiente dNTP. Al mezclar ddNTPs marcados radioactivamente, a una fracción 
de la concentración de dNTPs, en una reacción de extensión de ADN, las hebras de 
ADN se extenderán tan largo como sea posible, hasta la incorporación de un 
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ddNTP, en un sitio aleatorio. De esta manera se detendrá la síntesis debido a que 
no hay un hidroxilo libre en 3´ para incorporar el siguiente nucleótido. Realizando 
una corrida de cuatro reacciones en paralelo conteniendo cada una, un ddNTP 
específico, y posteriormente corriendo los resultados en un gel de poliacrilamida de 
cuatro carriles, es posible determinar la secuencia de nucleótidos del molde original, 
usando autorradiografía para observar las bandas en el gel, las cuales varían en 
función de la longitud del fragmento (Heather and Chain 2016). 
Se realizaron una serie de mejoras a la técnica de secuenciación de Sanger, 
principalmente se reemplazó el marcado radiactivo con fósforo o tritio, por la 
detección fluorimétrica de bases, así como la mejora en la detección utilizando 
electroforesis capilar (Heather and Chain 2016). Ambas mejoras contribuyeron al 
desarrollo de máquinas de secuenciación de ADN cada vez más automatizadas. 
Las máquinas de secuenciación de primera generación producían lecturas 
ligeramente menores a una kilobase (kb), por lo que, para analizar fragmentos de 
mayor tamaño, los investigadores usaron técnicas como la secuenciación en 
“shotgun” donde los fragmentos de ADN se rompen en segmentos de menor 
tamaño, los cuales son clonados por separado, y ensamblados en una secuencia 
larga y continua in silico, utilizando algoritmos informáticos (Heather and Chain 
2016). El desarrollo de técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR 
por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) y tecnologías recombinantes 
de DNA permitieron generar altas concentraciones de fragmentos de ADN, 
requeridas para secuenciar (Heather and Chain 2016). 
Al mismo tiempo que se dio el desarrollo de métodos para secuenciar a gran escala, 
usando la técnica de Sanger, surgió una técnica luminiscente que abrió paso a la 
siguiente generación de secuenciadores de ADN. (Heather and Chain 2016). 
Consistía en un proceso de dos reacciones consecutivas, en el cual se empleó ATP 
sulfurilasa para convertir el pirofosfato en ATP, mismo que es usado como sustrato 
por la luciferasa, produciendo luz, proporcional a la cantidad inicial de pirofosfato. 
Este principio se usa para inferir el orden de nucleótidos midiendo la producción de 
pirofosfato conforme cada nucleótido es lavado a través del sistema, a lo largo del 
molde de ADN fijado a una fase sólida (Heather and Chain 2016). Este método 
recibió el nombre de pirosecuenciación, y al igual que el método de Sanger, requiere 
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la acción directa de la DNA polimerasa, sin embargo presenta ciertas ventajas, 
como el uso de nucleótidos naturales, además puede ser observada en tiempo real. 
1.2. Secuenciadores comerciales 
La primera máquina de secuenciación de alto rendimiento que se comercializó 
ampliamente fue la máquina original 454, llamada GS 20, que posteriormente se 
convirtió en la 454 GS FLX, la cual utilizaba la técnica de pirosecuenciación y 
ofrecía un gran número de lecturas, así como datos de mejor calidad (Heather and 
Chain 2016). El desarrollo posterior de las tecnologías de secuenciación se dio de 
manera continua, sin embargo debido al fundamento de su técnica se clasificaron 
como tecnologías de primera, segunda y tercera generación. Puede decirse que 
todas las tecnologías de secuenciación que no requieran la amplificación de ADN, 
son consideradas de tercera generación, ya que todas las tecnologías previas a 
estas, si lo requieren (Heather and Chain 2016). A continuación se describen 
algunas plataformas de secuenciación comerciales de mayor relevancia. 
1.2.1 Illumina 
Solexa liberó su equipo Genome analyzer II en 2006, que posteriormente sería 
adquirida por Illumina (Heather and Chain 2016). El proceso de secuenciación en la 
plataforma Illumina/Solexa involucra la amplificación clonal de fragmentos de ADN 
ligados a un adaptador en la superficie de una placa de vidrio. La lectura de las 
bases se realiza mediante terminación cíclica reversible, en la cual se secuencia la 
hebra molde, nucleótido por nucleótido (Reuter et al. 2015). Esto se realiza a través 
de rondas progresivas de incorporación a la base, lavado, obtención de imagen y 
escisión. Para llevar a cabo esta estrategia, se emplean 3´-O-azidometil-dNTPs 
marcados fluorescentemente para pausar la reacción de polimerización. De este 
modo, es posible remover las bases no incorporadas y obtener a su vez, la imagen 
fluorescente del nucleótido incorporado (Reuter et al. 2015). Para obtener la imagen, 
el equipo realiza un escaneo a la celda de flujo, mediante una cámara de dispositivo 
de carga acoplada (Reuter et al. 2015). Una vez obtenida la imagen, la mitad 
fluorescente y el bloque 3´ se remueven, dejando libre el 3´OH, y así el proceso se 
repitehasta obtener la secuencia completa (Reuter et al. 2015). En la Figura 1 se 
detalla el fundamento químico de esta plataforma, mientras que la Figura 2 
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muestran los equipos HiSeq 2000 ® y Miseq ® de la compañía Illumina, los cuales 
funcionan gracias a este principio. 
 
Figura 1. Fundamento químico de la terminación cíclica reversible 
 
 
Terminación reversible con cuatro colores en el método de Ilumina. Los moldes de ADN se amplifican clonalmente en la 
superficie de vidrio de la celda de flujo. La secuenciación se logra mediante rondas sucesivas de incorporación de base, 
lavado y obtención de la imagen. Tras la obtención de la imagen, se realiza una escisión del nucleótido marcado y se regenera 
el 3´OH para el siguiente ciclo. El análisis posterior de la imagen de cuatro colores permite determinar la secuencia de 
nucleótidos. Adaptada de (Reuter et al. 2015). 
 
Figura 2. Equipos HiSeq 2000 y MiSeq 
 
Equipos de secuenciación de terminación reversible. A)HiSeq 2000, al igual que las plataformas de Illumina, este equipo, se 
recomienda su uso para la secuenciación de exomas y análisis de transcriptoma completo. B)MiSeq, a pesar de que funciona 
bajo el mismo principio que otros equipos de la plataforma Illumina, se recomienda su uso para la secuenciación de genomas 
pequeños(virus, bacterias), gracias a sus cortos tiempos de corrida, y largas longitudes de lectura 
(https://www.eurofinsgenomics.co.in/en/next-generation-sequencing/rna-seq/small-rna-seq.aspx). 
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1.2.2 Life Technologies 
La mayoría de los equipos de secuenciación utilizaban la fluorescencia o 
luminiscencia como método de detección para las bases nitrogenadas. Sin 
embargo, para el año 2010 Life Technologies comercializó el equipo Ion Torrent en 
2010. Esta fue la primera plataforma de secuenciación que dejó de emplear 
fluorescencia o luminiscencia. De manera análoga a 454, las poblaciones clonales 
de fragmentos de ADN (producidas por PCR en emulsión) son soportadas en perlas, 
y lavadas en placas de pozos, seguidas por la adhesión de cada nucleótido 
sucesivamente, sin embargo, la incorporación de cada nucleótido no se sigue por la 
liberación de pirofosfato, sino por cambios en el pH, producidos por la liberación de 
protones (H+) durante la polimerización (Heather and Chain 2016). Esta detección 
es posible gracias al uso de la tecnología de semiconductor complementario metal-
óxido, usado en la manufactura de chips de microprocesadores (Heather and Chain 
2016). 
1.2.3 Helicos Biosciences 
La primera tecnología de secuenciación de una sola molécula, fue comercializado 
por Helicos BioSciences (Heather and Chain 2016). En este equipo los moldes 
están ligados a una superficie plana, y los dNTPs terminadores fluorescentes 
adecuados son lavados, uno por uno conforme se incorporan las bases, y al mismo 
tiempo se obtiene la imagen, antes de la escisión e incorporación de la siguiente 
base (Heather and Chain 2016). A pesar de ser relativamente lenta y cara, esta 
tecnología fue la primera que permitió secuenciar sin la necesidad de usar ADN 
amplificado, por lo que también eliminó todos los sesgos y errores asociados a este 
proceso (Heather and Chain 2016). 
1.2.4 Pacific Biosciences 
Por otra parte, la tecnología de secuenciación de tercera generación probablemente 
más empleada, es la plataforma de secuenciación una sola molécula en tiempo real 
(SMRT por sus siglas en inglés Single Molecule Real Time), desarrollada por Pacific 
Biosciences (Heather and Chain 2016). En la secuenciación SMRT, la preparación 
del molde involucra el ligamiento de adaptadores de hebra sencilla en forma de 
horquilla a las moléculas de cDNA o ADN digerido, generando un molde tapado 
(Reuter et al. 2015). Se utiliza una polimerasa que desplaza la hebra de ADN, por lo 
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que la molécula original puede ser secuenciada múltiples veces, mejorando así la 
exactitud (Reuter et al. 2015). 
En este sistema, la amplificación clonal ya no es requerida, por lo que se puede 
secuenciar directamente del DNA nativo o parcialmente modificado (Rhoads and Au 
2015). La síntesis del DNA ocurre en arreglos de nanoestructuras llamadas guías de 
onda de modo cero o ZMW (por sus siglas en inglés zero-mode waveguides), en las 
cuales una sola polimerasa se encuentra inmovilizada en el fondo de la cámara 
(Rhoads and Au 2015). La cámara cuenta con un orificio tan pequeño como la 
longitud de onda de la luz que lo atraviesa, lo que provoca un decaimiento 
exponencial, iluminando exclusivamente el fondo del pozo. Esto permite la 
visualización de una sola molécula fluorófora, cercana al fondo del ZMW, debido a la 
zona de excitación del láser. La simple deposición de cada base, debida a la 
polimerización del DNA coloca a los nucleótidos marcados fluorescentemente en la 
región iluminada, por lo que se puede seguir en tiempo real la incorporación de cada 
base, y elucidar así la secuencia de nucleótidos de la muestra de interés. En la 
Figura 3 se presenta un esquema del funcionamiento químico de esta plataforma, 
mientras que la Figura 4 muestra una fotografía del equipo PacBio RS II, el cual 
funciona con este principio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 3. Fundamento químico de la secuenciación SMRT 
 En esta plataforma una sola DNA polimerasa se encuentra fija en el fondo del ZMW. Versiones marcadas en el fosfato de 
cada uno de los cuatro dNTPs son incorporados a la reacción de polimerización a partir del DNA molde. La incorporación de 
las bases aumenta el tiempo de residencia del nucleótido en el ZMW, resultando en una señal fluorescente detectable que es 
capturada en video. Adaptada de (Reuter et al. 2015). 
Figura 4. Equipo PacBio RS II 
 
Este equipo utiliza la plataforma de Pacific Biosciences SMRT. No se requiere amplificar previamente el ADN a secuenciar, por 
lo que se considera un equipo de tercera generación. Una de sus ventajas es su gran longitud de lectura, la cual va de 10 a 60 
kpb (https://www.genomescan.nl/pacbio-rs-ii-ultra-long-read-sequencing/). 
1.2.5 Oxford Nanopore Technologies 
Posiblemente, la tecnología de secuenciación de tercera generación más novedosa 
sea la plataforma de secuenciación por nanoporos. El uso potencial de los 
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https://www.genomescan.nl/pacbio-rs-ii-ultra-long-read-sequencing/17 
 
nanoporos para la secuenciación fue descubierto incluso antes que muchas 
tecnologías de segunda generación (Heather and Chain 2016). En eso entonces, los 
investigadores demostraron que el DNA o RNA de una sola hebra que atravesaba 
una bicapa lipídica a través de un canal iónico de α-hemolisina, mediante 
electroforesis, generaba cambios en el flujo iónico, disminuyendo la corriente, por un 
intervalo de tiempo proporcional a la longitud de la cadena del ácido nucleico, por lo 
que se propuso el uso potencial de este principio para la secuenciación. La primera 
compañía que ofreció secuenciadores por nanoporo fue Oxford Nanopore 
Technologies, a través de las plataformas GridION y MinION (Heather and Chain 
2016). A pesar de los perfiles de baja calidad observados actualmente, permite 
lecturas muy largas, sin necesidad de amplificar, produciendo datos de secuencias 
mucho más rápidos y baratos que cualquier otra tecnología anterior. Los 
secuenciadores de nanoporos han revolucionado no solo la cantidad de datos de 
secuenciación que se producen, sino también cuándo y dónde se obtienen esos 
datos y por quien se obtienen los mismos. 
La secuenciación por nanoporos se basa en la transición de ADN o nucleótidos 
individuales a través de un canal pequeño (Reuter et al. 2015). La tecnología de 
nanoporos de Oxford, utiliza celdas de flujo de secuenciación, las cuales 
comprenden cientos de micropozos individuales, cada uno conteniendo una bicapa 
sintética perforada por nanoporos biológicos (Reuter et al. 2015). La secuenciación 
se consigue midiendo cambios característicos en la intensidad de corriente que son 
inducidos conforme las bases atraviesan el poro gracias a una proteína motriz 
molecular. 
El primer adaptador se une con la enzima motriz adecuada, así como a un 
adaptador molecular, mientras que el segundo adaptador es un oligonucleótido en 
horquilla que a su vez es unido a una segunda proteína motriz llamada HP (Figura 
5). En la Figura 6, se muestra una imagen del equipo MinION, el cual está diseñado 
para realizar ensayos de secuenciación masiva fuera del laboratorio, gracias a su 
tamaño pequeño. 
 
 
 
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Figura 5. Fundamento químico de la secuenciación por nanoporos 
 
En el sistema de nanoporos de Oxford, los moldes de DNA se encuentran ligados a dos adaptadores, el primer adaptador se 
encuentra unido a la enzima motriz (color ámbar), al igual que a una correa molecular (color amarillo), el segundo adaptador 
está ligado a un oligo en forma de horquilla que está ligado a su vez a la proteína motriz HP (color azul). Una vez que los 
nucleótidos atraviesan el poro se produce un cambio en la intensidad de corriente característico de cada base, lo que permite 
discriminar entre ellas. Gracias al diseño de la biblioteca, se pueden secuenciar ambas hebras de DNA a partir de una sola 
molécula. Adaptada de (Reuter et al. 2015). 
 
Figura 6. Equipo MinION 
 
Este dispositivo es fácilmente transportable debido a su diminuto tamaño, por lo que permite secuenciar fuera del laboratorio. 
Utiliza la plataforma de Oxford Nanopore, de manera que puede realizar análisis en tiempo real y es adaptable para 
secuenciar directamente DNA o RNA. Tomada de (https://nanoporetech.com/products/minion ). 
 
Cada una de las plataformas de secuenciación de nueva generación opera con un 
principio químico diferente. En la Tabla 1 se realiza una comparación de algunas de 
las plataformas más utilizadas actualmente, considerando la longitud de lectura, el 
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rendimiento y el tiempo de corrida. Es importarte considerar las características de 
cada equipo, ya que éstas pueden aportar distintos tipos de sesgo o errores 
relativos, dependiendo del tipo de experimento que se desee realizar. 
Equipo Longitud de 
lectura(pb) 
Rendimiento 
(Gb) 
Tiempo por 
corrida(horas
) 
Referencias 
HiSeq 2500 
(High-output) 
250 600 264 (Sanchez-Flores and Abreu-
Goodger 2014; Rhoads and 
Au 2015) 
HiSeq 2500 
(Rapid-run) 
500 90 40 (Sanchez-Flores and Abreu-
Goodger 2014; Rhoads and 
Au 2015) 
Oxford 
Nanopore 
MinION 
2000-5000 >0.0009 18-50 (Reuter et al. 2015; Rhoads 
and Au 2015) 
Ion Torrent- 
Ion proton 
200 10 2-8 (Reuter et al. 2015) 
PacBio RS II 1000-15000 1 0.5-4 (Rhoads and Au 2015; Reuter 
et al. 2015) 
Tabla 1. Cuadro comparativo las principales tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, utilizadas a la fecha. Se 
incluyen longitudes de lectura y rendimiento (Reuter et al. 2015; Rhoads and Au 2015; Sanchez-Flores and Abreu-Goodger 
2014). 
 
1.3. Aplicaciones de la tecnología de secuenciación 
Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento han permitido mejorar nuestra 
comprensión de las diversas moléculas que permiten la preservación y transmisión 
de la información. La secuenciación de genomas y exomas ha mejorado nuestro 
entendimiento de la genética en las enfermedades humanas, principalmente en los 
desórdenes monogénicos y multifactoriales como el cáncer (Reuter et al. 2015). Por 
otra parte, la secuenciación del RNA ha permitido identificar sistemáticamente los 
diferentes tipos de RNA tales como los RNA no codificantes largos (lncRNA), RNA 
pequeños nucleolares (snoRNA) y micro RNA (miRNA)), así como caracterizar su 
estructura, las interacciones RNA-proteína y su localización genómica (Reuter et al. 
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2015). El mapeo genómico de elementos regulatorios del DNA en alta resolución ha 
permitido comparar la información regulatoria entre muchos genomas individuales o 
un solo genoma entre diferentes tipos celulares o tipos de tejido (Reuter et al. 2015). 
Finalmente la metagenómica ha permitido obtener un catálogo extenso de muestras 
de diferentes hábitats, proporcionando información sobre la diversidad microbiana 
en una gran variedad de ecosistemas (Reuter et al. 2015). En las siguientes 
secciones se hará una revisión de las diferentes aportaciones a cada uno de los 
campos antes mencionados. 
2. Secuenciación de genoma y variación 
La secuencia de DNA a lo largo de los cromosomas cambia constantemente, y 
gracias a este proceso, el ser humano ha logrado evolucionar y adaptarse (Zarrei et 
al. 2015). La variación genética ha sido un tema de interés, pues desde tiempo atrás 
se sabe que la variación puede ocurrir en un amplio rango de tamaño, que va desde 
fragmentos del genoma citogeneticamente reconocibles, hasta variantes de un sólo 
nucleótido (Zarrei et al. 2015). Además, el significado de las variantes también 
sigue un gradiente, que va las variantes directamente involucradas con un desorden 
patogénico hasta las variantes benignas (Richards et al. 2015). La secuenciación del 
genoma humano, despertó el interés por la búsqueda de variantes genéticas en 
enfermedades humanas. Con la mejora continuaen las tecnologías de 
secuenciación, fue posible volver a secuenciar diversos genomas y exomas 
humanos, y de este modo, comparar las nuevas secuencias con el genoma de 
referencia, lo cual permitió identificar las variantes entre genomas muestra y el 
genoma de referencia (Reuter et al. 2015). Los individuos típicamente poseen de 
3.5-4 millones de variantes de un sólo nucleótido, y cientos de miles inserciones y 
deleciones cortas, relativas al genoma de referencia (Reuter et al. 2015). 
Actualmente, la secuenciación de alto rendimiento ha sido aplicada a miles de 
genomas y decenas de miles de exomas, resultando en enormes hallazgos en la 
diversidad y enfermedades humanas (Reuter et al. 2015). 
Una mutación, se define como un cambio permanente en la secuencia de 
nucleótidos, mientras que un polimorfismo se define como una variante genética 
presente en más del 1% de una determinada población (Richards et al. 2015). Sin 
embargo ambos términos a menudo pueden llevar a confusiones, debido a 
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suposiciones incorrectas de los efectos benignos y patogénicos, respectivamente 
(Richards et al. 2015). El término “polimorfismo” es confuso ya que en algunas 
disciplinas se refiere a una variación en la secuencia que no causa enfermedad, 
mientras que en otras disciplinas se refiere a una variante presenten en el 1% o 
más de la población (den Dunnen et al. 2016). El término “mutación” también resulta 
ambiguo, ya que se usa tanto para hacer referencia a un simple cambio en la 
secuencia, como para un cambio causante de enfermedad (den Dunnen et al. 
2016). Por ello, se recomienda el reemplazo de ambos términos por “variante” con 
las siguientes modificaciones: a)patogénica, b)probablemente patogénica, c) de 
significado incierto, d) probablemente benigna y e) benigna (Richards et al. 2015). A 
pesar de que estas modificaciones pueden no englobar todos los fenotipos 
humanos, comprenden un sistema de clasificación de cinco niveles relevante para 
los desórdenes Mendelianos (Richards et al. 2015). 
Para mejorar la claridad, así como facilitar los análisis computacionales y la 
descripción de variantes secuenciales, los cinco tipos de variantes básicos han sido 
definidos más estrictamente (den Dunnen et al. 2016). Además, las descripciones se 
han priorizado de tal manera que, cuando una variación puede entrar en más de una 
clase de descripciones, se le asigna únicamente la descripción de mayor prioridad 
(den Dunnen et al. 2016). Por ejemplo, si una variante puede considerarse como 
una inserción y una duplicación al mismo tiempo, se dice que esta es una 
duplicación, ya que esta descripción tiene mayor prioridad. El orden de prioridad 
para las descripciones es el siguiente ; 1) deleción, 2) inversión, 3) duplicación, 4) 
conversión e 5) inserción (den Dunnen et al. 2016). Las definiciones de cada 
categoría se presentan en la tabla 2. 
 
Tipo de variante Definición 
Sustitución (>) Cambio donde un nucleótido es reemplazado por otro. 
Deleción (del) Cambio donde uno o más nucleótidos no están presentes (borrados). 
Inversión (inv) Cambio donde más de un nucleótido reemplaza la secuencia original y es 
el complemento inverso de la misma (ejemplo CTCGA por TCGAG) 
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Duplicación (dup) Cambio donde una copia de uno o más nucleótidos es insertada 
directamente en la posición 3´ de la secuencia original. 
Inserción (ins) Cambio donde uno o más nucleótidos son insertados en la secuencia y la 
inserción no es una copia de se la secuencia inmediata en 5´. 
Conversión (cons) Tipo específico de deleción donde un rango de nucleótidos que reemplaza 
la secuencia original es una copia de otra secuencia presente en otra 
región del genoma. 
Deleción-Inserción 
(delins/indel) 
Cambio donde uno o más nucleótidos son reemplazados por uno o más 
nucleótidos, el cual no es una sustitución, inversión o conversión. 
Tabla 2. Definiciones de los tipos básicos de variaciones genómicas. Para una definición más completa debe entenderse 
“Cambio” como “ Cambio en una secuencia específica comparada con la secuencia de referencia”. Adaptada de (den Dunnen 
et al. 2016). 
Las variaciones genéticas se dividen en dos principales categorías, las variaciones 
de un sólo nucleótido ( SNV por sus siglas en inglés single nucleotide variation) y las 
variaciones estructurales (SV por sus siglas en inglés structural variation) (Liu et al. 
2015). Inicialmente, las SV se definieron como alteraciones genómicas que 
involucran segmentos mayores a 1kb, pero posteriormente se amplió la definición 
para incluir a toda alteración en la secuencia del DNA diferente de las SNV (Liu et 
al. 2015). 
Las SNV son el tipo de variación genética más común en seres humanos, se estima 
que estos se presentan cada 290 pb en el genoma humano (Kosaloglu et al. 2016). 
Evidencia reciente relaciona a las SNV con un amplio rango de enfermedades en 
humanos tales como el cáncer o desórdenes autoinmunes, además se piensa que 
éstos pueden ser activados (Kosaloglu et al. 2016). La regulación transcripcional de 
una proteína, así como su estructura y función pueden verse afectados por la 
sustitución de una sola base, una inserción o deleción (Kosaloglu et al. 2016). Hasta 
la fecha se conocen dos tipos principales de SNV las SNV sinónimas (sSNV) y las 
SNV no sinónimas (nsSNV) (Kosaloglu et al. 2016). Las nsSNV tienen mayor 
probabilidad de afectar la función de una proteína (Kosaloglu et al. 2016). 
Las SV son un tipo importante de variación genética que incluyen inserciones, 
deleciones, duplicaciones, inversiones y rearreglos estructurales a gran escala (Lu 
et al. 2016). Las SV son más difíciles de detectar y de caracterizar que las SNV 
(Rhoads and Au 2015). Entre las SV mejor estudiadas se pueden mencionar las 
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variaciones en el número de copia (CNV por sus siglas en inglés copy number 
variant), las inversiones neutrales en el número de copia, la inserción de elementos 
móviles (MEI por sus siglas en inglés mobile-element insertion), deleciones y 
translocaciones , así como la combinación de estos eventos (Rhoads and Au 2015). 
Gracias a los adelantos en las tecnologías de secuenciación de nueva generación 
se han desarrollado varios métodos de análisis para detectar SV (Lu et al. 2016). 
Mientras que las sustituciones e inserciones y deleciones cortas pueden detectarse 
de manera relativamente sencilla por alineamiento de las lecturas, la identificación 
de SV de mayor tamaño se dificulta al emplear plataformas de lecturas de secuencia 
cortas (Lu et al. 2016). Para resolver estas dificultades, a menudo se requiere el uso 
de evidencias indirectas tales como la perturbación en el mapeo de la lectura, la 
cobertura de mapeo y los puntos de quiebre en el mapeo (Lu et al. 2016). La 
caracterización de las Sv es crucial para el estudio de muchas enfermedades, 
incluyendo el cáncer (Rhoads and Au 2015). Cerca del 13% del genoma humano 
está sujeto a SV, las cuales representan la mayoría de las variantes de bases 
(Rhoads and Au 2015). 
2.1 Variación genómica y cáncer 
Los tumores generalmente emergen a partir de células normales cuando se 
acumulan en estas mutaciones específicas adquiridas en su genoma (Sudmant et 
al. 2015). Estas variantes somáticas pueden dividirse en dos categorías principales, 
SNV y SV (Sudmant et al. 2015). 
El uso de las tecnologías de secuenciación de nueva generación se ha vuelto una 
poderosa herramienta para caracterizar los panoramas genotípicos de las variantes 
somáticas y dianas terapéuticas en varios tipos de cáncer (Kohmoto et al. 2017). 
El cáncer gástrico (CG) ha sido una de las principales causas de mortalidad a nivel 
mundial, con un aumento en la incidencia en Asia, principalmente en Japón 
(Kohmoto et al. 2017). 
Las variaciones en cáncer humano, incluyendo CG, se clasifican en seis categorías 
principales de sustituciones de bases, la cuales son: C>A, C>G, C>T, T>A, T>C y 
T>G (Kohmoto et al. 2017). C>T es la sustitución predominantemente reportada en 
CG, principalmente en los trinucleótidos NpCpGp o TpCpN (Kohmoto et al. 2017). 
La causa del incremento en C>T, se considera que puede estar relacionada a la 
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edad, debido a la alta tasa de desaminación espontánea de 5-metilcitosina 
(NpCpGp) o a la sobreactivación de la familia APOBEC de desaminansas de 
citidina (Kohmoto et al. 2017). 
Otro tipo de cáncer que también ha sido estudiado desde el punto de vista de 
llamado de variantes es el cáncer colorrectal (CCR). En un estudio realizado por 
Betge et. al. (2015) se evaluó la estabilidad de la secuenciación por amplicones de 
muestras embebidas en parafina fijadas en formalina (FFPE por sus siglas en inglés 
formalin-fixed paraffin-embebed) y muestras congeladas de CCR con metástasis al 
hígado, utilizando tres diferentes herramientas de procesamiento de datos para el 
análisis bioinformático (Betge et al. 2015). La secuenciación dirigida permite 
alcanzar una mayor profundidad de lectura (>1000 lecturas) lo cual facilita la 
detección de variantes de baja frecuencia en muestras heterogéneas de tumores 
(Betge et al. 2015). Sin embargo, este enfoque presenta ciertas dificultades en la 
práctica clínica, ya que frecuentemente se prefiere utilizar muestras FFPE, pues 
estas pueden almacenarse con mayor facilidad que las muestras congeladas de 
tumor. No obstante, las muestras FFPE almacenadas por largos periodos de tiempo 
pueden llevar a alteraciones en el DNA, debidas a la formación de enlaces 
covalentes del DNA, RNA y proteínas con puentes metileno, así como desaminación 
y reacciones oxidativas, las cuales fragmentan el DNA y dan lugar a fuentes de error 
en los datos de secuenciación (Betge et al. 2015). 
Las variaciones más frecuentes se encontraron en los genes TP53 (10), APC (7), 
PIK3CA (3) y KRAS (2) (Betge et al. 2015). Se observó una alta concordancia entre 
las mutaciones reportadas en muestras FFPE y las muestras de tumores 
congelados (Betge et al. 2015). Sin embargo, se observaron diferencias 
significativas entre los resultados de distintas herramientas bioinformáticas para 
llamado de variante, las cuales no estaban relacionadas a la calidad del DNA (Betge 
et al. 2015). Es por ello que se reitera la necesidad de fuentes de información para 
llamado de variante, lo cual permitiría la traducción de ésta información al ámbito 
clínico (Betge et al. 2015). Betge et. al. (2015) concluyeron que la secuenciación de 
amplicones potencialmente es un enfoque viable para detectar mutaciones 
predictivas o pronósticas en el genoma de CCR debido al grado de concordancia 
entre ambas muestras, sin embargo sugieren optimizar los algoritmos 
bioinformáticos para llamado de variante. 
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A pesar de que las nuevas tecnologías de secuenciación y el desarrollo de 
algoritmos computacionales han mejorado la precisión en el llamado de variantes 
somáticas, aún es un proceso difícil, debido a factores tales como los alelos de baja 
frecuencia, poca pureza en las muestras, heterogeneidad clonal, cobertura de 
secuencia inadecuada, errores de secuenciación y ambigüedades en el mapeo de 
lecturas cortas (Kohmoto et al. 2017). 
El cáncer de mama (CM) es una enfermedad, cuya etiología se ve influenciada por 
factores ambientales, hormonales y genéticos. La investigación genómica se ha 
concentrado principalmente en familias con antecedentes de CM, con alto riesgo de 
presentar alteraciones en los genes BRCA1 y BRCA2, los cuáles están asociados 
con el riesgo más alto de presentar la enfermedad, a lo largo de toda la vida (De 
Summa et al. 2017). Sin embargo, en la mayoría de las familias con múltiples 
pacientes de CM, no se observan mutaciones en estos genes (De Summa et al. 
2017). Estas observaciones han llevado a suponer que la susceptibilidad de CM es 
altamente poligénica, por lo que ésta se ve afectada por un gran número de loci, 
cada uno de los cuales podría tener una pequeña contribución en el riesgo de CM 
(De Summa et al. 2017). 
El descubrimientode nuevos genes de susceptibilidad para CM es crítico para 
mejorar la evaluación del riesgo de contraer la enfermedad y a su vez, proporcionar 
un vistazo hacia los mecanismos etiopatogénicos, así como el desarrollo de terapias 
más efectivas (Chandler et al. 2016). 
A la fecha las variantes de riesgo para CM han sido obtenidas a resolución de una 
sola base, y se asume que pequeñas inserciones o deleciones que truncan las 
proteínas pueden estar generando pérdidas de función (Chandler et al. 2016). 
Gracias a los estudios de asociación de genoma completo (GWAS por sus siglas en 
inglés genome-wide association studies), más de 100 variantes comunes, 
principalmente SNV, se han reportado asociadas con incrementos menores en el 
riesgo de CM (Li et al. 2018). Uno de los principales objetivos de los investigadores 
ha sido identificar las variantes causales como primer paso para comprender cómo 
es que estas variantes aumentan el riesgo de CM (Li et al. 2018). La mayoría de las 
SNV reportadas no son codificantes, y se sugiere que algunos de ellos se 
encuentran en regiones regulatorias, y alteran la expresión de genes tales como 
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CCND1, o afectan la regulación post-transcripcional, al alterar el splicing, como es el 
caso de TERT (Li et al. 2018). Sin embargo, para la mayoría de los loci de riesgo 
que han sido reportados en CM, el mecanismo de incremento en el riesgo no ha 
sido del todo explicado, aunque se espera que, para muchas de estas SNV, el 
mecanismo sea a través de la modificación de la regulación o expresión del gen 
diana en la vecindad de la SNV (Li et al. 2018). 
En un estudio realizado por Li et. al. (2018), se investigaron los cambios en el nivel 
de riesgo de CM, debidos a variantes codificantes de algunos genes (Li et al. 2018). 
Los investigadores plantearon , que si los cambios sutiles en la expresión llegaban a 
conferir baja susceptibilidad de CM, las variantes codificantes en algunos genes 
podrían conferir niveles de riesgo mucho más altos (Li et al. 2018). Para ello, se 
secuenciaron todos los exones y uniones exón-intrón de 56 genes que contienen 
SNV de riesgo para CM en casos índices de 1043 familias con CM familiar, las 
cuales resultaron negativas para las pruebas de mutaciones patogénicas en los 
genes BRCA1 y BRCA2 (Li et al. 2018). 
De acuerdo con sus resultados, la mayoría de las SNV de baja penetrancia de CM, 
se localizan en regiones genómicas no codificantes, y a pesar de que se han 
planteado diversas hipótesis, los mecanismos biológicos mediante los cuales estas 
SNV contribuyen al riesgo de CM no se han elucidado por completo (Li et al. 2018). 
A la fecha se ha demostrado que al menos algunos de ellos alteran regiones 
activadoras o promotoras, o afectar el splicing de RNA (Li et al. 2018). Partiendo de 
este supuesto, estos autores propusieron que si las alteraciones sutiles en la 
expresión de genes resultan en pequeños incrementos al riesgo de CM, entonces 
las alteraciones en variantes codificantes podrían tener efectos de mayor 
importancia en la función de los genes, dando lugar a niveles de riesgo mayores (Li 
et al. 2018) . Los genes con la mayor contribución a las variantes de pérdida de 
función incluyeron TET2, NRIP1, RAD51B y SNX32 , mientras que ZNF283 y 
CASP8 contribuyeron ampliamente a las variantes sin sentido (Li et al. 2018). 
En el caso de las variantes de pérdida de función, el gen TET2 tuvo una fuerte 
contribución (Li et al. 2018). TET2 ha sido reportado como un gen con influencia a 
nivel genómico en la expresión de genes al alterar la metilación del DNA, mientras 
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que su desregulación ha sido asociada con una metilación de DNA aberrante, y se 
ha involucrado en el desarrollo de leucemia mieloide aguda (Li et al. 2018). 
De acuerdo con los datos de estos investigadores, las variantes raras de pérdida de 
función, así como las variantes sin sentido están asociadas con SNV de baja 
penetrancia que podría contribuir a un riesgo adicional en CM, sin embargo, es muy 
poco probable que estas sean los principales contribuyentes a la heredabilidad de 
CM (Li et al. 2018). 
3. Metagenómica 
El desarrollo reciente de las tecnologías de nueva generación, así como la 
expansión en paralelo de poderosos programas bioinformáticos han hecho posible 
el análisis genómico de más de 1000 organismos procariontes, 100 eucariontes y 
más de 1200 genomas humanos completos (Belizário and Napolitano 2015). La 
metagenómica es un enfoque biotecnológico encargado del estudio de las 
secuencias genómicas de microorganismos directamente de su hábitat natural o 
nicho biológico (Belizário and Napolitano 2015). Esto permite el análisis simultáneo 
de la diversidad microbiana, conectando todas las funciones específicas de la 
microbiota en distintos ambientes tales como el suelo, el mar y el mismo cuerpo 
humano (Belizário and Napolitano 2015). 
En 2008, los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos (NIH por sus 
siglas en inglés National Institute of Health) lanzaron una iniciativa para identificar y 
caracterizar los microorganismos asociados a los humanos en condiciones de salud 
y enfermedad, que se llamó proyecto del microbioma humano. Este proyecto tenía 
como objetivos el desarrollo de un conjunto de genomas de referencia y la 
caracterización preliminar de el microbioma humano, el efecto de la dieta en el 
microbioma, la elucidación de la relación entre enfermedades y el el cambio en la 
composición del microbioma humano, así como su posible uso como biomarcador. 
También buscaba favorecer el desarrollo de nuevas técnicas de aislamiento y cultivo 
de microorganismos así como el desarrollo de herramientas computacionales para 
el análisis bioinformático de los datos obtenidos 
(http://commonfund.nih.gov/hmp/initiatives#resources). 
 
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3.1 Secuenciación del microbioma 
El microbioma comprende todo el material genético de una comunidad microbiana 
en un nicho específico (microbiota). El microbioma puede subdividirse para su 
estudio en bacterioma, viroma y microbioma eucariótico o eucarioma. 
La diversidad microbianapuede determinarse mediante dos enfoques diferentes: la 
secuenciación de amplicones o bien, la metagenómica “Shotgun”. En el primer 
enfoque, se amplifican regiones específicas de DNA de las comunidades utilizando 
como objetivo cebadores taxonómicamente informativos tales como el gen de rRNA 
16S para procariontes y espaciadores intergénicos transcritos (ITS por sus siglas en 
inglés Intergenic Transcribe Spacers) y el gen para la subunidad larga ribosomal 
(LSU por sus siglas en inglés Large ribosomal SubUnit) en el caso de los 
eucariontes. En el segundo enfoque, la metagenómica “Shotgun”, se reconstruyen 
fragmentos largos e incluso genomas completos de organismos en una comunidad, 
sin aislamiento previo, permitiendo así, la caracterización de una gran cantidad de 
secuencias codificantes y no codificantes que pueden ser usadas como marcadores 
filogenéticos (Escobar-Zepeda et al. 2015). 
Figura 7. Análisis por Amplicones y metagenómica Shotgun 
 
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Principales enfoques de la metagenómica. El primero de ellos se basa en el perfil del gen rRNA 16S, es cual es 
un marcador genético altamente conservado. El segundo enfoque es la metagenómica “Shotgun” en el cual 
mediante el uso de cóntigos, se secuencia todo el material genético presente en la muestra, y a partir de este 
enfoque derivan tres enfoques más que son la metagenómica(DNA), metatranscriptómica (RNA) y viromica 
(partículas virales). Adaptada de (Bikel et al. 2015). 
 
3.1.1 Análisis del perfil del gen rRNA 16S 
El análisis de secuenciación de amplicones o “metaprofiling” consiste en el estudio 
de todos los miembros de una comunidad microbiana basado en un solo gen o 
marcador para propósitos taxonómicos y filogenéticos. Para el estudio de bacterias 
y arqueas se utiliza el gen de la subunidad ribosomal pequeña 16S mientras que 
para los eucariontes se utiliza el 18S. Los fragmentos amplificados del gen o 
amplicones en procariontes corresponden a regiones cortas hipervariables 
seleccionadas, que van por rangos de V1 a V9 como se muestra en la Figura 8 
(Bikel et al. 2015), mientras que para eucariontes se amplifican los ITS y LSU 
(Escobar-Zepeda et al. 2015).Tanto las regiones ITS como LSU, ofrecen buenas 
alternativas para clasificar organismos eucariontes a nivel de especie ya que 
ofrecen alta precisión (Escobar-Zepeda et al. 2015). Las regiones ITS son 
marcadores moleculares que contienen regiones no codificantes que se caracterizan 
por una alta tasa de sustitución de nucleótidos y han demostrado ser útiles para 
elucidar relaciones filogenéticas a nivel de género y especie (Sevİndİk et al. 2016). 
LSU por otro lado, es considerado un buen marcador filogenético, ya que 
proporciona muy buena resolución en Metazoa (Kumar et al. 2014). 
La secuenciación por amplicones ha sido una de las técnicas más empleadas ya 
que permite realizar clasificaciones filogenéticas y taxonómicas a partir de muestras 
grandes y complejas, además de que puede realizarse con casi todas las 
plataformas de secuenciación que existen actualmente (Escobar-Zepeda et al. 
2015). Además, la secuenciación por amplicones es la opción más económica tanto 
en la preparación de bibliotecas, como en la misma secuenciación, principalmente 
en plataformas como Ion Torrent o Illumina (Escobar-Zepeda et al. 2015). 
Sin embargo, las ventajas de la secuenciación por amplicones se ven contrastadas 
por los sesgos generados usando un solo marcador filogenético, como es el caso 
del gen ribosomal 16S, o una región variable del mismo. Una de las limitaciones de 
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esta estrategia es la baja resolución a nivel de especies, un rango en el número de 
copias de genes de varias especies, la transferencia horizontal de los genes rRNA 
16S y el hecho de que menos del 0.1% del genoma total son genes ribosomales, lo 
cual dificulta la amplificación de este marcador genómico de muy baja abundancia 
pre en la muestra (Escobar-Zepeda et al. 2015). Otra limitación de este enfoque es 
que se limita a identificar especies de bacterias conocidas, por lo tanto no puede 
encontrar especies nuevas o que no han sido descritas previamente (Kim et al. 
2015). La Figura 8 muestra una representación gráfica de éste enfoque. 
 
Figura 8. Análisis del gen 16S rRNA 
 En el perfil del gen rRNA 16S, se suelen utilizar las regiones hipervariables V, las cuales pueden variar de 
acuerdo con el grupo de bacterias que se desea clasificar, ya que algunas regiones son más útiles que otras 
como marcadores genéticos para cierto tipo de bacterias. Adaptada de (Bikel et al. 2015). 
 
3.1.2 Metagenómica “Shotgun” 
La secuenciación metagenómica permite determinar el potencial funcional 
codificado en el microbioma. Esta característica ha permitido el descubrimiento de 
nuevas funciones enzimáticas, microorganismos y genes que pueden ser utilizados 
en diferentes campos como la biorremediación, la comprensión de la interacción 
patógeno-hospedero y para nuevas estrategias terapéuticas en enfermedades del 
humano (Bikel et al. 2015). A este tipo de enfoque metagenómico se le conoce 
como metagenómica “Shotgun” ya que las secuencias totales de material genético 
se fragmentan en secuencias de menor tamaño, obteniendo todo el ADN presente 
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en un determinado nicho biológico. Teóricamente, este enfoque permite obtener una 
representación de todos los genomas en la muestra (Escobar-Zepeda et al. 2015). 
Esto permite escoger entre un amplio margen de marcadores filogenéticos además 
de los marcadores ribosomales para realizar una anotación taxonómica. 
De manera general, un protocolo experimental de metagenómica comprende varios 
pasos que pueden dividirse en tres etapas: a) La extracción de DNA de la muestra, 
el fraccionamiento y generación de bibliotecas, b) el proceso de secuenciación y 
generación de los archivos de secuencias y c) el análisis bioinformático que incluye 
el ensamblado, la asignación taxonómicas, el cálculo de abundancia de las 
secuencias, el cálculo de la diversidad microbiana y la caracterización de las 
funciones metabólicas. 
Este enfoque tiene la ventaja de que permite realizar una caracterización más 
profunda de la comunidad en estudio. Sin embargo este enfoque aún presenta 
limitaciones tanto metodológicas como técnicas, ya que no se ha podido eliminar 
por completo el DNA del hospedero en la muestra, en el caso de microbioma 
humano. O bien la falta del desarrollo de mejores herramientas para el ensamble de 
organismos desconocidos. 
3.2 Microbioma humano 
A la fecha se ha caracterizado la microbiota de las diferentes partes del cuerpo 
humano tales como el tracto gastrointestinal, piel, cavidad oral y vagina, 
principalmente (Figura 9). 
El tracto gastrointestinal humano involucra una comunidad microbiana 
extremadamente dinámica y compleja, la cual incluye virus, bacterias, arqueas y 
eucariontes (Bikel et al. 2015). Sin embargo, la mayoría de los microorganismos