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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA BIODEGRADABILIDAD E INDUCCIÓN A LA BIODEGRADABILIDAD DE DETERGENTES LÍQUIDOS T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA PRESENTA Evangelina Polaco Mendoza MÉXICO, D.F. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Profesor: Víctor Manuel Ugalde Saldivar VOCAL: Profesor: Ruth Edith Martin Fuentes SECRETARIO: Profesor: Víctor Manuel Luna Pabello 1er. SUPLENTE: Profesor: Beatriz Ruiz Villafan 2° SUPLENTE: Profesor: Minerva Carrasco Fuentes SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Laboratorio de Microbiología Experimental, del Departamento de Biología de la Facultad de Química, de la Universidad Nacional Autónoma de México. ASESOR DEL TEMA: DR. VÍCTOR MANUEL LUNA PABELLO. SUPERVISOR TÉCNICO: M. EN C. LUCIANO HERNÁNDEZ GÓMEZ. SUSTENTANTE: EVANGELINA POLACO MENDOZA Agradecimientos Al Dr. Víctor Manuel Luna Pabello, por su paciencia, por darme una gran oportunidad al aceptarme bajo su tutela y permitirme alcanzar esta meta. Se agradece el apoyo económico otorgado a través del Proyecto: DGAPA/PAPIME EN213104 y PAIP 2005 (VMLP) 6190-14. A mis padres y a mi hermana, por su cariño y su paciencia. A mis amigos a quienes conocí, conviví, crecí, soñé y aprendí de ellos a lo largo de mi estancia en la Facultad de Química. INIDICE 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................................. 10 2. MARCO DE REFERENCIA .................................................................................................................................. 12 2.1. MECANISMO DE DETERGENCIA .............................................................................................................................. 12 2.2. AGENTES TENSOACTIVOS ..................................................................................................................................... 13 2.2.1. Tipos de tensoactivos ............................................................................................................... 14 2.2.1.1. Tensoactivos iónicos catiónicos ........................................................................................... 14 2.2.1.2. Tensoactivos iónicos aniónicos ............................................................................................ 15 2.2.1.3. Tensoactivos iónicos anfotéricos.......................................................................................... 16 2.2.1.4. Tensoactivos no iónicos ........................................................................................................ 16 2.3. DETERGENTES LÍQUIDOS ..................................................................................................................................... 18 2.4. PROBLEMÁTICA DE LOS DETERGENTES LÍQUIDOS ................................................................................................... 18 2.5. SOLUCIONES AL PROBLEMA DE DETERGENTES ....................................................................................................... 25 2.6. BIODEGRADABILIDAD ............................................................................................................................................ 27 2.6.1. PRUEBAS DE EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD ........................................................................................ 27 2.6.1.1. Biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO ................................................ 27 2.6.1.2. Prueba estándar internacional de biodegradabilidad aerobia rápida (OECD 301-A, 1997).29 2.10. INDUCCIÓN A LA BIODEGRADABILIDAD ................................................................................................................. 30 2.11. TOXICIDAD ........................................................................................................................................................ 30 3. OBJETIVOS Y ESTRATEGIA DE TRABAJO ...................................................................................................... 32 3.1. OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................................. 32 3.2. OBJETIVOS PARTICULARES .................................................................................................................................. 32 3.3. HIPÓTESIS ........................................................................................................................................................... 32 3.4. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................................................... 33 3.5. ESTRATEGIA GENERAL DE TRABAJO ...................................................................................................................... 34 3.6. ALCANCES ........................................................................................................................................................... 35 3.7. MATERIALES Y EQUIPOS ....................................................................................................................................... 36 4. PRIMERA ETAPA EXPERIMENTAL BIODEGRADABILIDAD DEL DETERGENTE .......................................... 39 4.1. PRIMERA EVALUACIÓN DE BIODEGRADABILIDAD Y SELECCIÓN DE UN DETERGENTE LÍQUIDO ...................................... 39 4.2. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPALES TENSOACTIVOS ................................................................. 46 4.3. PRUEBA INTERNACIONAL BIODEGRADABILIDAD AEROBIA RÁPIDA. ............................................................................ 50 4.4. PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA. .......................................................................................................................... 55 CONCLUSIONES PRIMERA ETAPA EXPERIMENTAL .......................................................................................................... 58 5. SEGUNDA ETAPA EXPERIMENTAL, INDUCCIÓN A LA BIODEGRADABILIDAD. .......................................... 60 5.1. ENSAYO INÓCULO ACLIMATADO ............................................................................................................................ 60 5.2. EVALUACIÓN DE LA BIODEGRADABILIDAD DE ACUERDO A LA RELACIÓN DBO5/DQO USANDO EL INÓCULO ACLIMATADO. .................................................................................................................................................................................. 63 5.3. PRUEBAS DE TOXICIDAD AGUDA. ........................................................................................................................... 65 5.4. IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE LAS CEPAS ACLIMATADAS AL DETERGENTE. ....................................................... 66 5.5. CONCLUSIONES PARCIALES................................................................................................................................. 69 6. CONCLUSIONES FINALES ................................................................................................................................ 70 7. BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................................... 71 ANEXOS .................................................................................................................................................................. 74 INDICE DE TABLAS Tabla 1. Relación de técnicas para la ejecución de las pruebas experimentales. ................................................. 36 Tabla 2. Resultados de la prueba DQO para los cinco detergentes líquidos. ......................................................... 40 Tabla 3. Resultados de la prueba de DBO5 para los cinco detergentes líquidos. ................................................. 41 Tabla 4. Resultados de la relación DBO5/DQO. ..................................................................................................... 42 Tabla 5. Porcentaje biodegradable y composición de 5 detergentes líquidos. ...................................................... 43 Tabla 6. Determinación pruebas analíticas detergente D5. .................................................................................... 47 Tabla 7. Biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5/DQO, para la mezclas de tensoactivos. ................... 50 Tabla 8. Contenido de cada matraz para la prueba internacional biodegradabilidad aerobia rápida. ................. 52 Tabla 9. Porcentajes de remoción. .......................................................................................................................... 54 Tabla 10. Resultados de DQO para evaluación de la biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5/DQO. ... 63 Tabla 11. Resultados de DBO5 con inóculo aclimatado. ....................................................................................... 64 Tabla 12. Evaluación de biodegradabilidad de acuerdo a relación DBO5/DQO del inoculo aclimatado. ............... 64 Tabla 13. Elongación de radículas e hipocotilos del inóculo aclimatado al D5. ...................................................... 65 Tabla 14. Pruebas bioquímicas para identificación de cepas del inoculo aclimatado. ............................................ 67 INDICE DE FIGURAS Figura 1. Tensoactivo aniónico .............................................................................................................. 15 Figura 2. Estructura de alquildimetilbetaína ........................................................................................... 16 Figura 3. Estructura de laurato de sorbitán ........................................................................................... 17 Figura 4. Estrategia de trabajo, primera y segunda etapa de trabajo. ................................................... 34 Figura 5. Espectro electrónico en disolución de nonilfenol en la región del ultravioleta. ...................... 48 Figura 6. Espectro electrónico en la región del infrarrojo de los cristales blancos. ............................... 49 Figura 7. Espectro electrónico en la región del infrarrojo de los cristales amarillos. ............................. 49 Figura 8. Imagen de matraces para prueba internacional biodegradabilidad aerobia rápida. ............... 51 Figura 9. Prueba internacional de biodegradabilidad aerobia rápida el detergente. ............................. 53 Figura 10. Porcentaje de remoción de la prueba internacional de biodegradabilidad aerobia rápida. .. 54 Figura 11. Imagen del esquema de la plántula Lactuca sativa al finalizar la prueba. ............................ 55 Figura 12. Imagen comparativa, a) blanco, b) D5 al 100 %. ............................................................... 56 Figura 13. Efecto del D5 en el crecimiento de radículas de semillas de lechuga. ................................ 56 Figura 14. Efecto del D5 en el crecimiento del hipocotilo de semillas de lechuga. ................................ 57 Figura 15. Ensayo de inoculo aclimatado, para el detergente D5. ........................................................ 61 Figura 16. Ensayo de inóculo aclimatado por 56 días, para el detergente D5. ...................................... 62 Figura 17. Imagen de bacterias gram negativas pertenecientes al inóculo aclimatado. ........................ 66 ABREVIATURAS ABS Alquilbencesulfonato APHA American Public Health Association (siglas en ingles) AOS α-olefinsulfonato ASTM American Section of the International Association for Testing Materials (siglas en ingles) CNA Comisión Nacional del Agua D5 Detergente líquido para cocina denominado 5 DBO5 Demanda Bioquímica de Oxígeno prueba que se realiza en 5 días DNasa Agar desoxirribonucleasa DQO Demanda Química de Oxígeno g Gramo IR Infrarrojo KIA Medio Kingler Iron Agar LAS Lauril alquilsulfonato mg Miligramo (1 gramo/1,000) mL Mililitro (1 litro/1,000) MIO Medio Motilidad, Indol-Ornitina mm Milímetro (1 metro/1,000) NOM Norma Oficial Mexicana NMX Norma Mexicana OD Oxígeno Disuelto (concentración) OECD Organization Economic Co-operation and Development (siglas en ingles) O/F Medio oxidativo/fermentativo pH pH= -log[H+] PTAR Planta de Tratamiento de Aguas Residuales SEMARNAT Secretaría del Medio Ambiente y Recursos Naturales SIM Agar Sulfuro-Indol-Motilidad SAAM Substancias activas al azul de metileno VP-RM Medio Voges Proskauer-Rojo de metilo UV Ultravioleta RESUMEN El uso indiscriminado de los detergentes líquidos se ha convertido en un grave problema ambiental, la mayoría de los detergentes líquidos fabricados en México no cuentan con información en sus etiquetas sobre si el producto es biodegradable. El objetivo del presente trabajo fue evaluar los componentes que hacen a un detergente líquido fabricado en México dañino para el ambiente y determinar la manera por la que se puede reducir el daño. Se presentan en este trabajo dos etapas experimentales, en la primera etapa, se evaluó la biodegradabilidad aerobia en base a la relación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno realizada en 5 días (DBO5) entre la Demanda Química de Oxígeno (DQO), es decir, DBO5/DQO de 5 detergentes líquidos fabricados en México denominados D1, D2, D3, D4 y D5 por razones de confidencialidad. Se seleccionó uno de ellos de acuerdo con tres criterios: mayor consumo comercial, menor biodegradabilidad y reproducibilidad de resultado. El detergente líquido seleccionado fue el D5, ya que es de un alto uso comercial, su biodegradabilidad es del 10 % y se pueden reproducir los resultados, además que contiene en su formulación tensoactivos iónicos y no iónicos, esto de acuerdo las etiquetas que informa el fabricante. Este detergente D5, fue procesado para aislar e identificar al tensoactivo no iónico (nonilfenol) y el tensoactivo aniónico alquilbencensulfonato (ABS). Para aislar cada tensoactivo se utilizaron métodos como APHA, 5540 B separación de surfactantes y para su identificación se utilizó espectroscopia electrónica en el intervalo del ultravioleta y en el intervalo del infrarrojo, llegando a la conclusión que los tensoactivos no se aislaron completamente sino que predominan en una mezcla. Se evaluó su biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO de cada mezcla de tensoactivos, obteniéndose un porcentaje del 12 % para nonilfenol en mezcla y del 10 % para ABS en mezcla. Se llevó acabo la prueba de biodegradabilidad aerobia rápida (OECD 301-A, 1997), tanto para el detergente D5, como al nonilfenol y al ABS, confirmándose que no son biodegradables,ya que la OECD establece 70 % de remoción DQO antes de 28 días y los compuestos evaluados solo alcanzaron el 32 %, 28 % y 49 %, respectivamente. Se realizó la prueba de toxicidad aguda de acuerdo al método 208 (OECD, 1993) con semillas de lechuga (Lactuca sativa), donde observamos que a la concentración comercial de uso del D5 recomendada por el fabricante, resulta letal para las plantas vasculares como la lechuga, donde inhibe completamente la germinación de las semillas. En la segunda etapa experimental se llevo a cabo la inducción a la biodegradabilidad del detergente líquido D5, por medio de un inóculo aclimatado adaptado a un mL de detergente D5. El inóculo se aclimató en un periodo de 14 días. Al inóculo aclimatado se le agregó la misma concentración de detergente que en la primera parte experimental para evaluar su biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5/DQO donde su biodegradabilidad aumento de 10 % a 45 %. Se realizó la prueba de toxicidad aguda de acuerdo al método 208 (OECD, 1993) con semillas de lechuga (Lactuca sativa), para el inóculo aclimatado con D5, donde aún se observa un retraso en la germinación de las semillas, es decir, tiene un efecto subletal considerándose tóxico para las plantas vasculares después de ser inducido a la biodegradabilidad. Del inóculo aclimatado se identificaron tres tipos de bacterias, Pantotea agglomerans, Klebsiella ozaenae y Acinetobacter calcoaceticus iwoffi. En conclusión el detergente líquido D5 no es biodegradable y resulta tóxico para plantas vasculares, esto se debe a los tensoactivos iónicos y no iónicos que conforman al D5. Se puede inducir a su biodegradabilidad en un 35 % mediante el ensayo inóculo aclimatado pero aún así no alcanza las estándares internacionales para considerarlo biodegradable. 10 1. INTRODUCCIÓN Los detergentes en su forma comercial, líquida o sólida son de gran ayuda en las labores de limpieza doméstica e industrial. Cada vez se tienen nuevos y especializados productos para cada tipo de suciedad, lo que constituye un grave problema ambiental, ya que su uso es indiscriminado, se descargan en alcantarillas presentando alta carga en aguas residuales, contaminan suelos y cuerpos acuáticos superficiales y mantos freáticos. Los sistemas de tratamiento convencional de aguas residuales únicamente logran un bajo porcentaje de eliminación de detergentes (Altmajer, 2004). Los detergentes líquidos enfocados al uso doméstico están formulados con disolventes miscibles en agua como el etilenglicol, así como tensoactivos iónicos y no iónicos. Este tipo de detergentes son fáciles de usar, teniendo buenos resultados en la limpieza, por esta razón, en los últimos 40 años ha aumentado su importancia en el mercado. (Fernández, 2004). En países como Alemania, desde 1962, se prohibió el uso de tensoactivos que no contaran con un 80 % de biodegradabilidad. Lo anterior obligó a que la industria de los detergentes en ese país cambiara rápidamente a la fabricación de detergentes biodegradables, sin que ello implicara detrimento en el efecto limpiador ni un aumento en los precios, para ello fue necesario que se regularan el uso de los tensoactivos y se cambiara la formulación química, de tal forma que resultaran más vulnerables a la acción bacteriana que habita naturalmente en el medio ambiente (Martínez, 2002). En la Unión Europea de acuerdo con el parlamento europeo número 907/2006 donde se garantiza la protección del medio ambiente y de la salud humana al establecer normas sobre la biodegradabilidad de los detergentes, compuestos tensoactivos de cadenas ramificadas, son remplazados por compuestos de cadenas lineales, ya que alcanzan la biodegradabilidad al 80 %. 11 En general, en algunos países de América como Estados Unidos, Canadá y Brasil, se encuentran regulados los detergentes de uso domestico y se exige al fabricante que sus productos sean biodegradables, la normatividad de estos países esta basada en el parlamento europeo no. 907/2006. En los demás países que conforman América, no existen normas obligatorias para el control de compuestos tensoactivos que conforman la base de un detergente. Así mismo, los tensoactivos están constituidos por compuestos derivados de fenoles, los cuales son ingredientes con características tóxicas (Gordon, 1997). Actualmente, la normatividad existente en México sobre aguas residuales como la NOM-001-SEMARNAT-1996, que establece los límites máximos permisibles de contaminantes en las descargas de aguas residuales en aguas y bienes nacionales. Esta NOM solo menciona que la concentración de los detergentes debe ser reducida antes de ser descargados en cuerpos acuáticos y terrestres receptores. Para verificar la calidad de los detergentes en México, son analizados de acuerdo a la NOM-002- SCFI-1993 «Productos pre envasados. Contenido neto. Tolerancia y métodos de verificación» y la NOM-050-SCFI-1994 «Información comercial. Disposiciones generales para productos», las pruebas aplicadas son: contenido neto, eficiencia de lavado, veracidad del etiquetado, blancura, conservación de la tela y rendimiento, es decir, solo es información para el consumidor, dentro de esta información falta mencionar si el detergente es biodegradable y tóxico. En términos generales, la Sociedad Mexicana de Normalización y Certificación (NORMEX, S. C.), dentro de su catálogo de Normas NMX vigentes, cuenta con una sección sobre 42 Normas Mexicanas de productos higiénicos hospitalarios, institucionales e industriales, donde marca los porcentajes y concentraciones límite para la elaboración de detergentes de acuerdo al uso, así como, el porcentaje de biodegradabilidad que debe cumplir cada producto. 12 2. MARCO DE REFERENCIA El tema de los detergentes es muy amplio, pueden clasificarse de acuerdo con su uso, su estado físico o a su composición química. La mayoría de los detergentes funcionan bajo el mismo principio, eliminar la suciedad disolviéndola en el agua de lavado y modificar las manchas. Existen principalmente detergentes en polvo (sólidos) y líquidos, la diferencia entre ellos, está en su formulación química. Al enfocarnos en el uso doméstico de los detergentes, es decir, para lavar ropa, trastes de cocina, pisos, baños y grasa de estufas, podemos encontrar diferencias en la formulación al comparar detergentes en polvo y líquidos (León, 2008). De acuerdo con la Procuraduría Federal del Consumidor (PROFECO), la diferencia entre detergentes en polvo y líquidos es la siguiente: En polvo: pueden contener en general agentes tensoactivos, blanqueadores, enzimas, abrillantadores, zeolitas y compuestos fosfatados. Líquidos: contienen en general agentes tensoactivos (en mayor concentración que los polvos) y humectantes, siendo menos agresivos a la piel de los consumidores. El marco de referencia de este trabajo, está enfocado a detergentes líquidos de uso doméstico en general. 2.1. Mecanismo de detergencia Todos los tensoactivos en general tienen una estructura molecular que consiste en una larga cadena no polar, es decir, una cadena de hidrocarburos que es soluble en aceite pero insoluble en agua, esta es la parte hidrofóbica. La molécula de agua es muy polar y forma enlaces por puentes de hidrógeno. Cuando se disuelve una sal en agua algunos de los puentes de hidrógeno se rompen porque los iones se interponen entre las moléculas de agua. Por otra parte, las moléculas de agua al ser muy polares se comportan como pequeños imanes que se aglomeran alrededor del ión en forma de capas de solvatación que constituyen las interacciones ión-dipolo. 13 Si en el equilibrio la energía que se gana por la solvatación supera la pérdida por la separación de las moléculas de sólido y la ruptura de los enlaces por puentes dehidrógeno en el agua, entonces la sustancia se disolverá, si no es así, será insoluble. Así pues, si la cadena de hidrocarburo de la sal de un ácido graso es corta, como en el acetato de sodio, sólo se romperán unos cuantos enlaces por puentes de hidrógeno y el compuesto será totalmente soluble. Si la cadena es muy larga, como en el melisato de sodio (C29H59COO -Na+), entonces se necesitarán romper muchos enlaces por puentes de hidrógeno y el compuesto será insoluble o parcialmente insoluble. (Harold, 1999) Sin embargo, los iones tensoactivos pueden permanecer en disolución sin tener que romper muchos enlaces de hidrógeno. Los grupos hidrofílicos se encuentran en el agua y están debidamente solvatados, mientras que los hidrofóbicos están ordenados perfectamente lado a lado en la superficie y casi no perturban los enlaces por puentes de hidrógeno. Esto, energéticamente es mucho más favorable que una distribución uniforme de iones en el agua, entonces los iones tensoactivos al alinearse en la superficie superan las fuerzas intermoleculares de la tensión superficial disminuyéndola y a la vez formando espuma y burbujas. (Altmajer, 2004) 2.2. Agentes tensoactivos Los agentes tensoactivos o también conocidos como agentes surfactantes, son compuestos químicos que al disolverse en agua o en otro disolvente, se orientan a la interfase entre el líquido y una fase sólida, líquida o gaseosa, modificando las propiedades de la interfase. Las modificaciones pueden estar acompañadas por formación de espumas, emulsiones, suspensiones, dispersiones y aerosoles. 14 Los tensoactivos se clasifican químicamente de acuerdo con sus grupos hidrofílicos como aniónicos, catiónicos, no iónicos o anfotéricos. Cuando los tensoactivos se utilizan en agentes de limpieza, normalmente se mezclan con diversos aditivos para mejorar su función y tales formulaciones se conocen como detergentes (León, 2008). 2.2.1. Tipos de tensoactivos La clasificación se fundamenta en el poder de disociación del tensoactivo en presencia de un electrolito y de sus propiedades fisicoquímicas, pueden ser: iónicos o no-iónicos; y dentro de los iónicos según la carga que posea serán: catiónicos, aniónicos y anfóteros (Cantarero, 2010). 2.2.1.1. Tensoactivos iónicos catiónicos El término "catiónico" se refiere a los compuestos que contienen una cadena de 8 a 25 átomos de carbono, derivada de un ácido graso y un nitrógeno cargado positivamente, el anión suele ser un Cl- ,Br-, OH- , SO4 =. En el catión, el radical (R), representa la cadena larga (grupos alquílicos o arílicos); los otros radicales pueden estar reemplazados por átomos de hidrógeno u otros radicales alquílicos, como ejemplos: cloruro de alquildimetilbencilamonio y cloruro de cetiltrietilamonio. Los tensoactivos catiónicos son de poca utilidad en los detergentes líquidos de uso doméstico porque la mayoría de las superficies tienen una carga negativa y los cationes se absorben sobre ellas en lugar de solubilizar la suciedad adherida. Sin embargo, las aminas y los compuestos cuaternarios inhiben el crecimiento de organismos unicelulares como las bacterias y las algas. Otra función de estos tensoactivos es el suavizado de textiles (Altmajer, 2004). 15 2.2.1.2. Tensoactivos iónicos aniónicos Son espumantes, emulsionantes, se pueden usar como aditivos, sobre todo en formulaciones que no contienen fosfatos. Los agentes tensoactivos aniónicos, están caracterizados por moléculas de cationes orgánicos e inorgánicos (Na+, K+, Ca++, Ba++, Mg++, NH4 + y una parte hidrofílica que contiene los grupos aniónicos (-COO- , -SO4 -, -PO4 =, entre otros) unido a la fracción orgánica. En la figura 1 podemos observar un ejemplo de tensoactivo aniónico del tipo sulfonato (Cantarero, 2010) Figura 1. Tensoactivo aniónico Además de los productos anteriores, podemos citar otros compuestos en general del tipo aniónico: Tipo sulfonato –SO3 - ejemplos: alquilbencensulfonato de sodio (ABS), lauril sulfonato de sodio (LAS) y α-olefinsulfonato de sodio (AOS). Substancias adecuadas para las formulaciones líquidas. Tipo sulfato -O–SO4 = ejemplos: alquilsulfato de sodio, alquiletersulfato de sodio, monoglicéridosulfato de sodio y nonilfeniletersulfato de sodio. Dan una alta formación de espuma. Tipo fosfato -O-PO4 = ejemplos: alquilfosfato de sodio, ácido oleileterfosfórico y alquileterfosfato de sodio. Tipo sulfoacetato ejemplo: laurilsulfoacetato de sodio CH3-CH2-CH2-O-COO- CH2-SO3 -Na+. Constituyente principal de muchos cosméticos. Tipo derivados de aminoácidos ejemplo: n-laurilsarcocinato de sodio y alquilamidopolipeptidato de sodio. 16 Los tensoactivos aniónicos, son substancias activas al azul de metileno (SAAM) y de acuerdo con la NMX-AA-039-SCFI-2001. Análisis de agua.- determinación de substancias activas al azul de metileno (SAAM) en aguas naturales, potables, residuales y residuales tratadas, este método pude emplearse para estudios de monitoreo de biodegradabilidad, pero no puede diferenciar entre tipos de tensoactivos, ya que solo detecta tensoactivos aniónicos. 2.2.1.3. Tensoactivos iónicos anfotéricos. Los tensoactivos anfotéricos son un grupo de productos especializados que tiene tanto una carga positiva como una negativa en la molécula. Como contiene ambas cargas, pueden comportarse como catiónicos o aniónicos, dependiendo del pH de la disolución en la que se utilicen. Las estructuras moleculares típicas son las betaínas, como la que se muestra en la figura 2 la alquildimetilbetaína, este tipo de moléculas son catiónicas en disolución ácida y aniónicas en disolución básica, otro ejemplo son los aminoácidos (León, 2008). Figura 2. Estructura de alquildimetilbetaína 2.2.1.4. Tensoactivos no iónicos Durante los últimos 30 años, los tensoactivos no iónicos han alcanzado cada día mayor importancia, hasta representar hoy más del 25 % de la producción total. Estos tensoactivos no producen iones en disolución acuosa y por este hecho son compatibles con cualquier otro tipo de tensoactivos. Por otra parte, son menos sensibles a los electrolitos, especialmente a los cationes divalentes y pueden por lo tanto ser utilizados en concentraciones altas de salinidad. 17 Los tensoactivos no iónicos son buenos detergentes, humectantes y emulsionantes. Algunos poseen excelentes propiedades espumantes. Otros presentan un bajo nivel de toxicidad y se utilizan en la fabricación de fármacos, detergentes de uso doméstico, cosméticos y alimentos. Existen numerosos tipos de tensoactivos no iónicos, sin embargo el mercado lo dominan los productos etoxilados, aquellos donde el grupo hidrofílico es una cadena poli-óxido de etileno fijada por la función hidroxilo o amina. Un ejemplo es el laurato de sorbitán mostrado en la figura 3 (Altmajer, 2004). Figura 3. Estructura de laurato de sorbitán Como ejemplo de ellos pueden ser: Alcoholes grasos polioxietilenados: alcohol laúricoetoxilado, alcohol oleílico. Alquilfenolpolioxietilenados: nonilfenoletoxilado. Ácidos grasos polioxietilenados: ácido oléico etoxilado. Derivados de óxidos de etileno y propileno: alcohol graso etoxilado. Amidas de ácidos grasos polioxietilenados: laurildietanolamida polioxietilenada. Aminas grasas polioxietilenadas: laurilamina polioxietilenada. Esteres de ácidos grasos: monoestearato de etilenglicol. Alcanolamidas: lauril monoetanolamida. Derivados de azúcar: monolaurato de sacarosa. Esteres de ácidos grasos derivados del sorbitol: laurato de sorbitán. 18 2.3. Detergentes líquidos Comúnmente de los tensoactivos aniónicos y no iónicos se utilizan en las formulaciones de detergentes líquidos, sobre todo para el uso doméstico, ya que son más fáciles de manejar y diluir. Este tipo dedetergentes carecen de compuestos fosfatados, pero contienen sulfatos que pertenecen a los tensoactivos aniónicos. Utilizan aditivos solubilizantes como etanol, glicoles y éteres de glicol, estos aditivos funcionan como disolvente-detergente y se utiliza para superficies duras, por ejemplo, ventanas, estufas, pisos, entre otros (Martínez, 2002). 2.4. Problemática de los detergentes líquidos Las actuales formulaciones de productos de limpieza líquidas, están constituidas por una mezcla de uno o varios tensoactivos pertenecientes a dos grupos, aniónicos y no iónicos, lo que suele proporcionar un efecto sinérgico, aumentando su poder detergente. Los detergentes líquidos, contienen entre un 5 – 20 % de peso de tensoactivos (tanto aniónicos y no iónicos). De esta manera, una concentración de detergente doméstico de 5 g/L, originará un agua de lavado con aproximadamente 1 gramo de tensoactivo por cada litro, es decir, un 0.1 % en peso. (Cantarero, 2010). En México, existen 28 millones de viviendas (INEGI, 2010), supongamos que cada vivienda usa un detergente líquido y de acuerdo al párrafo anterior, el agua de lavado lleva 1 gramo de tensoactivos por cada litro, si suponemos que cada vivienda genera un litro de agua de lavado al día proveniente solo del uso de un detergente líquido, tendremos al día 28 millones de gramos, es decir, 28 toneladas de tensoactivos al día en aguas de lavado en México, al año la acumulación de tensoactivos será de 10 mil toneladas al año, las cuales, si no se les da un tratamiento adecuado, se incorporarán a lagos, ríos, mares y mantos freáticos. 19 Recordemos que un contaminante es una sustancia presente en una concentración mayor a la natural como resultado de la actividad humana, que tiene un efecto perjudicial neto en el medio ambiente (Manahan, 2007). Al no tratar las aguas de lavado que contienen detergentes líquidos, puede tener impactos ambientales como: Los tensoactivos aniónicos, tienden a precipitar, en presencia de aguas con alto contenido en sales (aguas duras), dando lugar a grandes acumulaciones de sales. Al acumularse grandes cantidades de tensoactivos presentan efectos tóxicos, en los microorganismos del agua y suelo, ya que estos microorganismos no pueden degradarlos a moléculas mas simples. Puede cambiar drásticamente el pH de las aguas que los contienen afectando a microorganismos, plantas, animales del agua y del suelo. Los cambios en el pH del suelo ejercen una influencia directa sobre las plantas y sobre el ambiente del suelo, al crear cambios notables en la disponibilidad de nutrientes. La presencia de tensoactivos en aguas residuales que llegan a ríos, lagos y mares, disminuyen el oxígeno disuelto (OD) en el agua que las contiene, ya que para oxidar a los compuestos los microorganismos utilizan oxígeno disponible y al no ser suficiente, provocan que animales como peces y microorganismos naturales de las aguas, no puedan sobrevivir. El uso de tensoactivos no iónicos como el nonilfenol etoxilado y el octilfenol etoxilado, en su proceso de biodegradación producen metabolitos como el nonilfenol y octilfenol que aunque no son formadores de espumas, poseen mayor toxicidad que los compuestos originales. (Cantarero, 2010). 20 México tiene una serie de normas emitidas por la Sociedad Mexicana de Normalización y Certificación (NORMEX, S. C.), dentro de su catálogo de normas NMX vigentes, cuenta con una sección sobre 42 normas mexicanas de productos higiénicos para uso hospitalario, institucional e industrial. Es la única normatividad en México donde se exige a los fabricantes que sus productos sean biodegradables. Los productos domésticos no son mencionados en estas normas. Las normas son las siguientes: NMX-K-620-NORMEX-2008.Productos de aseo.-Desinfectante y blanqueador líquido concentrado, formulado con hipoclorito de sodio a una concentración de 6,0 % de cloro activo -Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-621-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Blanqueador líquido concentrado, formulado con hipoclorito de sodio a una concentración de 13 % de cloro activo.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-622-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Limpiador desinfectante para utensilios de cocina y comedor, a base de yodo.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-623-NORMEX-2008 Productos de aseo.- Limpiador líquido desengrasante y desinfectante para utilizarse en ambulancias.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-624-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Neutralizador líquido de cloro para ropa hospitalaria-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-625-NORMEX-2010. Productos de aseo.- prelavador líquido para lavado de ropa hospitalaria e industrial-Especificaciones y Métodos de prueba. 21 NMX-K-626-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Detergente en polvo, de uso industrial, institucional y hospitalario. Especificaciones y métodos de prueba. NMX-K-627-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Sellador y cera para pisos de madera, linoleum, loseta de vinilo, granito y terrazo, para ser tratado con máquina pulidora.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-628-NORMEX-2008. Productos higiénicos.-Detergente y desinfectante líquido, para aseo y desinfección de quirófano y áreas blancas, a base de derivados fenólicos .-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-629-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Cera para pisos de madera, linoleum, loseta de vinilo, granito y terrazo, para ser tratado con máquina pulidora de alta velocidad.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-630-NORMEX-2010. Productos de aseo.-Restaurador líquido para limpiar, reparar y restaurar el brillo para pisos suaves y duros.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-631-NORMEX-2008. Productos higiénicos.- Líquido desinfectante para manos y piel que no requiere enjuague, para ser utilizado en áreas blancas y/o aisladas.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-632-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Jabón líquido neutro para limpieza de pisos, paredes y vidrios.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-633-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Jabón líquido para lavado de manos, para uso industrial, institucional y hospitalario.-Especificaciones y Métodos de prueba 22 NMX-K-634-NORMEX-2008. Productos higiénicos.-Jabón líquido desinfectante para lavado pre y post quirúrgico de manos y piel, a base de triclosán y PCMX.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-635-NORMEX-2008. Productos higiénicos.- Detergente y desinfectante líquido para aseo y desinfección de quirófano y áreas blancas, a base de sales cuaternarias de amonio.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-636-NORMEX-2008. Productos higiénicos.-Detergente y desinfectante en polvo, para limpieza y desinfección de quirófano y áreas blancas, a base de cloro orgánico.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-637-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Pre-lavador en polvo, removedor de sangre, aceite y grasas para ropa hospitalaria.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-638-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Detergente, desinfectante y desodorante líquido para limpieza de baños y su mobiliario a base de cloruro de benzalconio.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-639-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Desinfectante líquido de vegetales frescos, a base de yodo.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-640-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Limpiador desinfectante y desodorante quita sarro concentrado para sanitarios y materiales vítreos.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-641-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Líquido removedor de ceras y selladores en pisos.-Especificaciones y Métodos de prueba. 23 NMX-K-642-NORMEX-2008.Productos de aseo.-Pasta semisólida para limpiar, pulir y abrillantar metales.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-643-NORMEX-2010. Productos de aseo.- Blanqueador concentrado en polvo, para blanquear y desinfectar la ropa hospitalaria.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-644-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Limpiador en polvo con cloro, para limpieza por frote de utensilios de cocina y comedor, para uso industrial institucional y hospitalario.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-645-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Líquido desinfectante, desodorante ambiental con aroma, para desinfección de pisos, superficies, mobiliario y baños, a base de derivados fenólicos.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-646-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Limpiador líquido desengrasante para disolver y remover manchas de grasa y aceite en paredes, pisos duros y mobiliario en general.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-647-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Líquido para el tratamiento de trapeadores.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-648-NORMEX-2009. Productos de aseo.-Pasta para pulir y abrillantar pisos duros.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-649-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Detergente en polvo para el lavado de ropa de uso industrial, institucional y hospitalaria.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-650-NORMEX-2008. Productos de aseo.- Detergente en polvo para el lavado y limpieza de loza en máquinas automáticas.- Especificaciones y Métodos de prueba. 24 NMX-K-651-NORMEX-2010. Productos de aseo.- Detergente líquido para el lavado de ropa hospitalaria e Industrial.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-652-NORMEX-2008. Productos higiénicos.- Jabón líquido desinfectante para lavado pre y post quirúrgico de manos y piel, a base de yodo.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-653-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Neutralizador en polvo para el lavado de ropa hospitalaria.-Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-654-NORMEX-2008. Productos de aseo.-Aditivo de enjuague y secado de loza para máquinas automáticas.- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-655-NORMEX-2004. Productos de aseo –Accesorios de higienización y limpieza.-Trapeadores rectangulares y sus repuestos. –Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-656-NORMEX-2004. Productos de aseo –Accesorios de higienización y limpieza.-Mechudos con sujetador y sus repuestos. – Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-657-NORMEX-2004. Productos de aseo –Accesorios de higienización y limpieza. Fibras –Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-658-NORMEX-2004. Productos de aseo –Accesorios de higienización y limpieza. Discos abrasivos –Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-659-NORMEX-2004. Productos Higiénicos –Vasos cónicos de papel – Especificaciones y Métodos de prueba. 25 NMX-K-660-NORMEX-2005. Antiséptico y Germicida, Yodo Polivinilpirrolidona (Yodo povidona), Espuma y Solución- Especificaciones y Métodos de prueba. NMX-K-662-NORMEX-2008. Productos de aseo – Neutralizante líquido de alcalinidad para ropa hospitalaria –Especificaciones y Métodos de prueba. 2.5. Soluciones al problema de detergentes Ante la problemática de los compuestos que conforman un detergente, comenzaron a aparecer legislaciones que limitaban el uso de estos compuestos. La primera regulación se promulgó en Alemania en 1961, donde se exigía a los fabricantes de tensoactivos que cumplieran con el 80 % de biodegradabilidad. Así, hasta el 2004 se promulgaron gran cantidad de normas algunas como: La Directiva 86/94/CEE las legislaciones de los estados miembros en materia de detergentes. La Directiva 82/242/CEE, las legislaciones de los estados miembros relativas a los métodos de control de la biodegradabilidad de los tensoactivos no iónicos. Todas estas normas fueron recabadas en un solo texto en el reglamento (CE) no. 648/2004, actualmente vigente. Donde, se enlistan algunas substancias, de las cuales su porciento en peso no debe pasar del 0.2 % en las formulaciones de detergentes domésticos. Las substancias son las siguientes: Fosfatos y fosfonatos. Todos los tipos de tensoactivos. Blaqueadores oxígenados y clorados. EDTA y sus sales. Ácido nitrilotriacético (NTA). Fenoles y fenoles Halogenados. Paradiclorobenceno. 26 Hidrocarburos arómaticos, alifáticos y halogenados. Jabón Zeolitas. Policarboxilatos. Una propuesta no legislada es el uso de tensoactivos de origen natural, en el sentido estricto de la palabra, se refieren a aquellos que provienen de fuentes naturales animales o vegetales que siguiendo un proceso de extracción y purificación son obtenidos sin sufrir modificaciones químicas que alteren estructural y biológicamente su condición natural. El término incluye también aquellos que han sido obtenidos por vía de síntesis orgánica que utilizan en su preparación materias primas de origen natural (León, 2008) Las materias primas de origen natural, utilizadas en la síntesis de tensoactivos naturales comprenden: 1. ·Carbohidratos: Monosacáridos: D-glucosa, D-galactosa, D-fructuosa. Disacáridos: lactosa y sacarosa. Polisacáridos derivados del almidón. 2. Péptidos y polipéptidos: arginina, triptofano, ácido glutámico, lisina e hidrolizados proteicos. 3. Aceites y grasas triglicéridas que por procesos de hidrólisis rindan alcoholes y ácido grasos como aceite de soya, coco, entre otros. 4. Colesterol y sus derivados. El uso de las materias primas de origen natural en las formulaciones químicas de los detergentes mejora considerablemente la biodegradabilidad de los mismos, reduciendo el impacto ambiental (León, 2008). 27 2.6. Biodegradabilidad El proceso de biodegradación es un factor clave para la reducción a largo plazo de contaminantes orgánicos generados en los procesos industriales y desechados al medio ambiente en las aguas residuales. En la actualidad la eliminación de muchos de estos contaminantes presentes en la naturaleza es realizada con metodologías de tipo biológico, en las que se emplea una gran variedad de microorganismos capaces de degradar compuestos orgánicos. Éstos cuentan con una diversidad de enzimas cuya síntesis, le confieren la capacidad de degradar moléculas orgánicas recalcitrantes; permitiendo de esta manera, que las poblaciones logren adaptarse y sobrevivir bajo esa presión selectiva, que ejerce la persistencia y la acción antimicrobiana de algunos contaminantes, lo que dificulta la sobrevivencia de la mayoría de los microorganismos autóctonos de la zona afectada. Por tanto, sólo sobrevivirán aquellos microorganismos capaces de tolerar la existencia de ciertas substancias y/o que puedan aprovechar directa o indirectamente, estos compuestos como sustratos para la generación de biomasa microbiana o la obtención de energía. (Luna, 2011). 2.6.1. Pruebas de evaluación de la biodegradabilidad Existen varias pruebas para evaluar la biodegradabilidad, las que se usarán en este trabajo son dos, las cuales se describen a continuación. 2.6.1.1. Biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO Esta evaluación de la biodegradabilidad se basa en determinar la Demanda Bioquímica de Oxígeno prueba que se realiza en 5 días (DBO5) y la Demanda Química de Oxígeno (DQO). Al obtener el cociente resultante de la división DBO5/DQO, proporciona información sobre la biodegradabilidad de los compuestos a evaluar. 28 El cociente tiene un parámetro del 0 al 1. Los resultados cercanos a la unidad, indicarán biodegradabilidad, valores menores a 0.5 no son considerados biodegradables. A continuación se describe cada prueba:Determinación de la Demanda Bioquímica de Oxígeno prueba que se realiza en 5 días (DBO5): es una prueba en la que se establecen los requerimientos relativos de oxígeno disuelto (OD) en aguas contaminadas como son aguas residuales domésticas e industriales, aguas superficiales y efluentes provenientes de plantas de tratamiento de aguas. El OD es la cantidad de oxígeno que está disuelto en el agua y que es esencial para los ríos y lagos saludables. El nivel de oxígeno disuelto puede ser un indicador de contaminación de agua, debido a que generalmente, un nivel alto indica un agua de mayor calidad, mientras que si los niveles de OD son demasiado bajos algunos peces y otros organismos no pueden sobrevivir en ella. (Luna, 2011). El método se basa en medir el oxígeno disuelto requerido para que los microorganismos inoculados degraden el material orgánico e inorgánico de una muestra, incubado a 28 grados Celsius, en ausencia de luz durante 5 días en una botella Winkler, de acuerdo con el American Public Health (APHA) (1998). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater. Anexo I. Demanda Química de Oxígeno (DQO): es un parámetro que mide la cantidad de materia que hay en una muestra líquida susceptible de ser oxidada por métodos químicos. La DQO también es la cantidad de oxígeno necesario para oxidar la materia orgánica expresada en mg O2/L presente en un agua residual, por lo que, es una medida representativa de la contaminación orgánica de un efluente. Éste es un parámetro que se puede controlar dentro de las distintas normas de vertidos y que da una idea muy real del grado de contaminación. (Luna, 2011). 29 Existen distintas formas de determinar la DQO, para este trabajo utilizaremos el método colorimétrico de reflujo cerrado (APHA, 5220 D). La materia orgánica es oxidada por el ión dicromato (Cr2O7 2-), el cromo cambia del estado hexavalente (VI) al estado trivalente (III). Ambas especies del cromo tienen coloración y absorben en la región visible del espectro de 600 nm a 420 nm. Sin embargo, la presencia de substancias inorgánicas susceptibles a ser oxidadas como los sulfuros, sulfitos, yoduros, entre otros, puede causar interferencias en el método. Anexo II. 2.6.1.2. Prueba estándar internacional de biodegradabilidad aerobia rápida (OECD 301-A, 1997). Esta prueba se aplica en substancias no volátiles, que tiene una solubilidad mínima en agua de 100 mg/L. Esta prueba se basa en la determinación de Demanda Química de Oxígeno (DQO) a una concentración conocida (entre 10 y 40 mg DQO/L) de la sustancia de prueba, que es la única fuente de carbono para el inóculo, manteniéndose en un medio mineral, con aireación constante, en oscuridad y a una temperatura de 22 ± 2 °C. El curso de la biodegradabilidad es monitoreado por la determinación de la concentración de la DQO durante un periodo de 28 días. El porcentaje de biodegradación es calculado a partir de la cantidad de DQO removida. De acuerdo a la prueba, para que una sustancia se considere de fácil biodegradabilidad debe alcanzar el 70 % de DQO removida. Un inóculo, es una preparación de microorganismos a concentración conocida, que se transfiere a un cultivo o a un medio mineral. El inóculo puede obtenerse de una gran variedad de fuentes, para esta prueba de biodegradabilidad se recomiendan las siguientes fuentes: lodos activados, efluentes de aguas residuales, aguas superficiales, suelo o una mezcla de estos. 30 La fuente de inóculo común para esta prueba, es el lodo activado. Los lodos activados se utilizan como tratamiento biológico en una planta de tratamiento aerobio (PTAR), los lodos actúan como medio de cultivo donde crecen microorganismos, bajo controles de aireación, estos microorganismos tiene la habilidad de oxidar materia orgánica, por eso se les da el nombre de activados (Martínez, 2002). 2.10. Inducción a la Biodegradabilidad La baja o nula biodegradabilidad de un compuesto o mezcla de compuestos presentes en aguas residuales puede deberse a diversos factores tales como: la toxicidad de algunos compuestos, la ausencia de microorganismos capaces de degradar compuestos tóxicos, entre otros. Sin embargo, existe la posibilidad de inducir de manera natural la degradación de un compuesto a través de la modificación de: 1) las condiciones abióticas y 2) las condiciones bióticas, ya sea por medio de la mutación de cultivos microbianos o por la inducción con un inóculo microbiano capaz de degradar algunos de estos compuestos. Para este último caso, se emplea una disolución o suspensión de la sustancia de prueba, en un medio mineral, la cual es inoculada e incubada bajo condiciones aerobias en la oscuridad o luz difusa. Posteriormente, se incrementa de manera progresiva la concentración de la sustancia de interés, de tal manera que sólo queden microorganismos capaces de tolerar y degradar dicho compuesto. (Luna, 2011). 2.11. Toxicidad Un compuesto tóxico puede entrar al cuerpo principalmente por vía inhalada, digestiva o dérmica. La sustancia química puede causar daños en el sitio de contacto o ser absorbida, transportada y distribuida por la sangre hasta alcanzar diversos órganos. El tipo y la intensidad de sus efectos nocivos dependerán de su concentración en estos órganos de su forma química, física y del tiempo de permanencia. (Ayala, 2011). 31 El bioensayo de toxicidad con semillas de lechuga (Lactuca sativa L) es una prueba estática de toxicidad aguda (120 h de exposición), en la que se pueden evaluar los efectos fitotóxicos de compuestos puros o mezclas complejas a diferentes diluciones en el proceso de germinación de las semillas y el desarrollo de plántulas durante los primeros días de crecimiento. Determinando la inhibición en la germinación y la inhibición en la elongación de la radícula y del hipocótilo que son indicadores para determinar la capacidad de establecimiento y desarrollo de la planta. (Luna, 2011). La toxicidad aguda es, por lo general, más fácil de identificar y la evidencia científica obtenida de los estudios a corto plazo es más confiable, siendo así la base de la regulación y el manejo de los compuestos químicos, principalmente para casos de exposición ocupacional. (Ayala, 2011). 32 3. OBJETIVOS Y ESTRATEGIA DE TRABAJO 3.1. Objetivo General Evaluar los componentes que hacen a un detergente líquido fabricado en México dañino para el ambiente y determinar la manera por la que se puede reducir el daño. 3.2. Objetivos Particulares a) Evaluar la biodegradabilidad aerobia de 5 detergentes fabricados en México mediante la relación DBO5/DQO. b) Seleccionar un detergente con el fin de aislar a partir de este, sus principales tensoactivos. c) Efectuar pruebas estándar internacionales de biodegradabilidad aerobia rápida (OECD 301-A, 1997), tanto al detergente en su conjunto, como a los principales componentes. d) Inducir a la biodegradabilidad del detergente, mediante un inoculo aclimatado. e) Conocer el grado de toxicidad aguda del detergente seleccionado en cada etapa. f) Aislar bacterias provenientes de lodos activados, las cuales son reconocidas por su crecimiento en aguas residuales 3.3. Hipótesis El uso de productos como un detergente líquido ajenas en un entorno biológico puede resultar dañino, si se emplean en cantidades considerables. Es posible detectar a las substancias presentes en los detergentes líquidos por medio de métodos químicos y determinar la biodegradabilidad, así como el daño en el desarrollo de modelos vegetales. 33 3.4. Justificación En México no existe normatividad que regule las formulaciones de detergentes para que sean productos biodegradables. En el reglamento europeo (CE) No. 648/2004,que está actualmente en vigor, se enlistan una serie de substancias de las cuales su porcentaje en peso dentro de la formulación del detergente no debe pasar del 0.2, esto para productos destinados a la venta en público. Los consumidores de detergentes líquidos no están conscientes del daño que estos productos causan al ambiente al ser utilizados por millones de personas diariamente. En las tiendas de autoservicio en México, se puede encontrar gran variedad de detergentes líquidos, pero solo los fabricados en Canadá mencionan en su etiqueta, que son biodegradables en un 70 % en 28 días, como lo marca el reglamento europeo (CE) No. 648/2004. En este sentido, el presente trabajo pretende determinar el daño que causa al ambiente un detergente líquido fabricado en México, evaluando su biodegradabilidad mediante pruebas estándar internacionales y su toxicidad aguda. Para después evaluar si es o no posible aumentar su biodegradabilidad mediante la adición de un inóculo aclimatado a la presencia del detergente líquido y con ello reducir el efecto dañino del compuesto en estudio. 34 3.5. Estrategia general de trabajo PRIMERA ETAPA EXPERIMENTAL SEGUNDA ETAPA EXPERIMENTAL Figura 4. Estrategia de trabajo, primera y segunda etapa de trabajo. 5 detergentes líquidos de uso común en la Ciudad de México Evaluación de la biodegradabilidad aerobia DBO5/ DQO Análisis y selección de un detergente Caracterización e identificación de los tensoactivos Evaluación de biodegradabilidad aerobia DBO5/ DQO Prueba de biodegradabilidad aerobia rápida OECD-301 A Prueba de toxicidad aguda método 208 OECD Detergente líquido, ensayo de inóculo aclimatado Identificación y aislamiento de microorganismos aclimatados Inducción a la biodegradabilidad por medio del inóculo aclimatado Evaluación de la biodegradabilidad aerobia DBO5/ DQO Prueba de toxicidad aguda método 208 OECD 35 3.6. Alcances Primera etapa experimental Evaluación de la biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO (APHA, 1998), de cinco detergentes líquidos comerciales fabricados en México. Selección de un detergente líquido de los cinco evaluados, de acuerdo a tres criterios, mayor consumo comercial, menor biodegradabilidad y reproducibilidad de resultados. Caracterización e identificación de los tensoactivos principales del detergente seleccionado. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO (APHA, 1998) de los tensoactivos identificados y caracterizados del detergente seleccionado. Análisis de la prueba estándar internacional de biodegradabilidad aerobia rápida (OECD 301-A, 1997), al detergente seleccionado y a sus tensoactivos caracterizados. Evaluación de la toxicidad aguda del detergente seleccionado con semillas de lechuga (Lactuca sativa), según el método 208 (OECD, 1993). 36 Segunda etapa experimental Obtención del ensayo de inóculo aclimatado al detergente líquido seleccionado. Inducción a la biodegradabilidad utilizando inóculo aclimatado al detergente líquido. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia mediante la relación DBO5/DQO del detergente seleccionado inducido a la biodegradabilidad. Evaluación de la toxicidad aguda del detergente seleccionado e inducido con semillas de lechuga (Lactuca sativa) método 208 (OECD, 1993). Identificación y aislamiento de las cepas aclimatadas al detergente seleccionado. 3.7. Parámetros y equipos Los parámetros empleados son los correspondientes a las técnicas citadas en la tabla 1, los métodos se pueden consultar en la parte anexos. Tabla 1. Relación de técnicas para la ejecución de las pruebas experimentales. Parámetro Técnica Referencia Demanda Bioquímica de oxígeno (DBO5) Método de botella Winkler con duración de 5 días. APHA (1998) Demanda Química de Oxígeno (DQO) Método colorimétrico de reflujo cerrado APHA (1998) pH Método electroquímico APHA (1998) Biodegradabilidad aerobia rápida Prueba de disminución de DQO OECD 301-A Oxígeno disuelto (OD) Método de electrodo de membrana APHA (1998) y manual del equipo. Determinación de Sulfatos en agua Método Turbidimetrico ASTM D 516-90 Determinación de Fenoles Método Volumétrico Anexo I Evaluación de la toxicidad Método 208 OECD (1993) Aislamiento y caracterización de cepas Pruebas bioquímicas Farmer (1999) 37 Cinco Detergentes líquidos fabricados en la Ciudad de México, se ha ocultado la marca del fabricante como sus nombres comerciales por cuestiones de confidencialidad. Por tanto se nombraran de la siguiente manera: D1- Detergente con aceite de pino de uso general en superficies. D2- Detergente con aroma a chicle para la limpieza de pisos. D3- Detergente lavanda de uso general en superficies. D4- Detergente con aromatizante ambiental concentrado para superficies. D5- Detergente desengrasante de uso general para la cocina. Medios de cultivo selectivos para identificación de la actividad metabólica Agar de Hierro Kliger (KIA). Citrato de Simmon´s Medio agar-sulfuro-indol-motilidad (SIM) Medio motolidad-indol-ornitina (MIO). Caldo de Urea Agar de fenilalanina de aminasa Medio Oxidativo/Fermentativo (O/F) más 1 % de glucosa. Agar Desoxirribonucleasa (DNasa). Medio Voges Proskauer (VP). Medio rojo de metilo (RM). 38 Equipo Medidor de oxígeno disuelto marca Corning con membrana para O2 Potenciómetro marca Oakton, con electrodo de vidrio marca Orión Bomba compresora de aire con flujo de 2,500 cm3 de aire/minuto. Horno modelo Robertshaw de Controls Company Mufla modelo F-A1525M, marca Thermolyne Corporation Incubadora modelo 774, marca J. M. Ortiz Incubadora con agitación modelo G24, marca New Brunswick Scientific Edison A.J.USA. 39 4. PRIMERA ETAPA EXPERIMENTAL BIODEGRADABILIDAD DEL DETERGENTE 4.1. Primera evaluación de biodegradabilidad y selección de un detergente líquido En esta primera etapa se evaluó la biodegradabilidad de cinco detergentes líquidos comerciales de un mismo fabricante en México, por cuestiones de confidencialidad, omitiremos los nombres y marcas comerciales, nombrándolos de la siguiente manera: D1- Detergente con aceite de pino de uso general en superficies. D2- Detergente con aroma a chicle para la limpieza de baños. D3- Detergente lavanda de uso general en superficies. D4- Detergente con aromatizante ambiental concentrado para superficies. D5- Detergente desengrasante de uso general para la cocina. Para evaluar la biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5/DQO en los 5 detergentes líquidos antes mencionados, realizamos las pruebas correspondientes para obtener el resultado del cociente de la relación DBO5/DQO, si el resultado es cercano a la unidad se considera biodegradable. La determinación de las pruebas de Demanda Bioquímica de Oxígeno en 5 días (DBO5) y la prueba de Demanda Química de Oxígeno (DQO), se realizaron de acuerdo a lo indicado en los métodos estándar americanos (APHA, 1998). La primera prueba que se realizó para los 5 detergentes líquidos fue la determinación de DQO. La determinación de DQO, constituye una prueba en la cual la muestra se encuentra sometida a condiciones fuertemente oxidantes por el ión dicromato (Cr2O7 2-), en esta prueba se determina el contenido de materia orgánica e inorgánica químicamente oxidable expresada en mg O2/L. Esta prueba tiene una limitante para las concentraciones de las muestras, las substancias de prueba deben tener una concentraciónde materia químicamente oxidable de 100 a 900 mg O2/L de DQO. 40 Los 5 detergentes líquidos en su presentación comercial, están por encima de las concentraciones marcadas por la prueba, por esa razón, se busco la dilución adecuada (anexo I). La dilución adecuada fue al 1 % para cada uno de los detergentes. Se trabajó cada muestra por triplicado y se repitió la prueba 2 veces. Los resultados de DQO obtenidos, se presentan en la tabla 2. Tabla 2. Resultados de la prueba DQO para los cinco detergentes líquidos. D1 Materia oxidable (mg O2/L) D2 Materia oxidable (mg O2/L) D3 Materia oxidable (mg O2/L) D4 Materia oxidable (mg O2/L) D5 Materia oxidable (mg O2/L) 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 27 328 27 666 14 168 12 194 28 374 28 991 23 742 21 904 14 159 10 176 28 879 28 258 11 741 11 318 26 061 27 254 21 238 19 180 13 659 10 579 28 833 28 165 11 995 13 849 28 588 26 770 21 884 21 017 10 365 13 041 x=28 188 x=12 544 x=27 673 x=21 494 x=11 996 De acuerdo con los valores promedio por cada detergente, se aprecia que el detergente con menor cantidad de materia oxidable es el D5 y el de mayor corresponde al D1. Esta prueba solo cuantifica la cantidad de materia oxidable que posee un compuesto, debemos tener en cuenta que no toda esta materia oxidable es biodegradable. Para evaluar la biodegradabilidad de los detergentes líquidos de acuerdo a la relación DBO5/DQO, realizamos la prueba DBO5 con el detergente al 1 % igual que en la DQO. La prueba de DBO5 consiste en determinar el oxígeno disuelto (OD) requerido para que los microorganismos inoculados degraden el material orgánico e inorgánico de una muestra, incubado a 28 grados Celsius, en ausencia de luz durante 5 días. La DBO5 se expresa en mg O2/ L. La metodología y los cálculos de esta prueba se encuentran en el anexo II. 41 La concentración de DBO5 (mg O2/ L) indica la cantidad oxígeno están ocupando los microorganismos para degradar a los detergentes líquidos. En la tabla 3, se muestran los resultados promedio que se obtuvieron al realizar por triplicado la prueba de DBO5. Tabla 3. Resultados de la prueba de DBO5 para los cinco detergentes líquidos. Tipo de muestra DBO5 mg O2/L D1 8 174 D2 627 D3 5 257 D4 1 504 D5 1 199 En el caso del D1 su concentración es la más alta, los microorganismos inoculados utilizan más oxigeno para degradarlo, como el D2, el cual presenta una baja concentración de DBO5, los microorganismo ocupan menos oxígeno para degradarlo, puede suceder que los microorganismos solo pudieron consumir una cantidad de oxígeno, ya que el compuesto es tóxico y resulta letal para los microorganismos o que los microorganismos consumieron por completo la materia orgánica disponible. Una vez obtenidos los resultados de las pruebas DQO y DBO5, se valoró la biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5 /DQO. Para que una muestra sea considerada biodegradable, las concentraciones de DQO y DBO5 deben ser iguales o cercanas a la unidad. En la tabla 4, se observan los resultados de la relación DBO5/DQO. 42 Tabla 4. Resultados de la relación DBO5/DQO. Tipo de detergente DBO5 mg O2/L DQO mg O2/L DBO5/DQO Biodegradable Uso D1 8 174 28 188 0.29 No ++ D2 627 12 544 0.05 No + D3 5 257 27 673 0.19 No +++ D4 1 504 21 494 0.07 No ++ D5 1 199 11 996 0.10 No +++ Consumo doméstico: + Poco; ++ Moderado; +++ Alto Como se observa, el cociente de la relación DBO5/DQO para los 5 detergentes es menor a 0.3, es decir, el cociente de la relación no es cercano a la unidad, considerándose no biodegradable para los 5 detergentes líquidos. A pesar de que el D1 tiene las concentraciones más altas de DBO5 y DQO comparado con los demás detergentes (tabla 4), su relación DBO5/DQO es la más grande, es decir, es el que contiene más materia oxidable (DQO) y de acuerdo a la DBO5 es el detergente líquido que mas oxígeno consumen los microorganismos para su degradación, por esa razón su biodegradabilidad es la más alta de los 5 detergentes. El D2 de acuerdo a las pruebas realizadas, presenta una DBO5 de baja concentración y su DQO también es una de las más bajas, su biodegradabilidad es de 0.05, tiene poca materia oxidable susceptible a la biodegradabilidad y esta materia oxidable resulta letal para los microorganismos, por eso su bajo consumo de oxígeno y su baja biodegradabilidad. Igualmente para los detergentes líquidos D3, D4 y D5, no son considerados biodegradables ya que contienen materia oxidable que los microorganismos no pueden degradar. 43 Como se observa en la tabla 4 el consumo doméstico determinado por las ventas que reporta el fabricante, el D3 y el D5, son los detergentes líquidos de mayor consumo. En la tabla 5 se presenta la composición de cada detergente líquido, de acuerdo a los datos proporcionados por el fabricante en la etiqueta de cada producto (la etiqueta no muestra datos de concentraciones, ni porcentajes de los compuestos), se presenta también el porcentaje de biodegradabilidad de los detergentes líquidos de acuerdo a la relación DBO5/DQO. Tabla 5. Porcentaje biodegradable y composición de 5 detergentes líquidos. Detergente líquido Composición de acuerdo a la etiqueta Porcentaje de biodegradabilidad (DBO5/DQO) D1 Isopropanol, ácido oleico, ácido etilendiaminotetraacecético (EDTA), aceite esencial de pino, hidróxido de sodio. 29 D2 Cloruro de bencil amonio, ácido clorhídrico, aceite esencial de chicle. 5 D3 Isopropanol, ácido oleico, ácido etilendiaminotetraacecético (EDTA), aceite esencial de lavanda, hidróxido de sodio. 19 D4 Nonilfenol, etilenglicol, isopropanol, hidróxido de sodio 7 D5 Nonilfenol, aceite esencial, etilenglicol, isopropanol, alquilbencensulfonato de sodio 10 A continuación se definirá el uso en general de cada componente químico acuerdo con la Guía de productos químicos, enciclopedia de salud y seguridad en el trabajo 2009. 44 Para los detergentes D1 y D3, ambos enfocados superficies como pisos, su composición solo difiere en el tipo de aceite esencial (pino o lavanda). Isopropanol como antiséptico. Ácido oleico se utiliza como agente de solubilidad o emulsionante. EDTA actúa como agente quelante ayuda a unir a los radicales libres y las impurezas, permitiendo que los principales ingredientes de los detergentes trabajen con eficacia. Hidróxido de sodio se utiliza como regulador del pH. Cuando se mezcla con el ácido oleico, es útil para remover grasas como las que se generan en la cocina. Los aceites esenciales se utilizan para dar olor y color a los detergentes. Estos dos detergentes D1 y D3, tiene el más alto porcentaje de biodegradabilidad de acuerdo a la tabla 5, no contienen tensoactivos en su formulación. El EDTA es considerado un producto toxico, por esa razón son productos que dañan al ambiente. El detergente líquido denominado D2 con aroma a chicle para la limpieza de baños, sus componentes actúan de la siguiente manera: Cloruro de bencilamonio, se usa como desinfectante. Ácido clorhídrico, actúa como blanqueador de superficies y desinfectante. Aceite esencial de chicle para darle olor y color. De acuerdo a la tabla 5, este detergente líquido es el menos biodegradable de los 5 y se debe a que su formulación está enfocada a eliminar microorganismos, por esa razón su concentración de DBO5 es menor comparado con los demás detergentes y su biodegradabilidad es del 5 %, también es el que menos se vende. 45 La composición del D4-Detergente con aromatizante ambiental concentrado para superficies: Nonilfenol, tensoactivo no iónico, que se usa por su acción de limpieza. Etilenglicol, actúa como solvente. Isopropanol, se usa como antiséptico, es decir, es una sustancia que evita el crecimiento de microorganismos. Hidróxido de sodio, se utiliza como regulador del pH. La presencia del tensoactivo no iónico, nonilfenol, el cual es un compuesto considerado altamente tóxico y se ve reflejado en su biodegradabilidad del 7 %. El detergente líquido D5 que es un desengrasante de uso general para la cocina, tiene la siguiente composición: Nonilfenol, tensoactivo no iónico, que se usa por su acción de limpieza Alquilbencensulfonato de sodio, tensoactivo aniónico, forma espumas y es un emulsificante. Etilenglicol, actúa como solvente. Isopropanol, se usa como antiséptico, es decir, es una sustancia que evita el crecimiento de microorganismos. Esencial general, para darle coloración y olor. Este es el único detergente líquido de los 5, que en su formulación contiene tensoactivos aniónicos y no iónicos. El D5, presenta la concentración más baja de DQO, es el que menos cantidad de materia oxidable presenta y su DBO5 también es de las más bajas por eso su biodegradabilidad es del 10 %, y es uno de los más vendidos. 46 Con los resultados obtenidos, seleccionamos un detergente líquido de los cinco, bajo los siguientes criterios: 1. Alto consumo en el mercado. 2. Porcentaje de biodegradable bajo. 3. Fácil reproducibilidad de las pruebas. De acuerdo con el primer criterio los detergentes de alto consumo son: D3- Detergente lavanda de uso general en superficies. D5- Detergente desengrasante de uso general para la cocina. Basándonos en el siguiente criterio, el D3 presenta 19 % de biodegradabilidad y el D5 presenta un 10 % de biodegradabilidad (de acuerdo con la relación DBO5/DQO), por tanto, elegimos el D5. Las pruebas fueron realizadas por triplicado para todos los detergentes, así que el D5 cumple con el último criterio. 4.2. Aislamiento y caracterización de los principales tensoactivos Una vez seleccionado al detergente D5, se realizaron pruebas analíticas cuantitativas, para obtener información indirecta sobre las concentraciones de los tensoactivos que conforman al D5, ya que en su etiqueta se proporciona esta información. Se realizó la determinación de sulfatos por turbidimetría en agua (ASTM D 516-90), la determinación de fenoles método volumétrico (Anexo III y IV) y la determinación del pH. 47 Tabla 5. Determinación pruebas analíticas detergente D5. Parámetros D5 pH (unidades) 7.5 Fenoles ( mg/L) 160 Sulfatos (mg/L) 102 Los valores obtenidos (tabla 6), nos aproximan a las cantidades de tensoactivos presentes. Se observa que existe una concentración por debajo del 0.2 % de tensoactivos inferior a la que marca el reglamento (CE) no. 648/2004, ya que al obtener el porcentaje en peso en un litro de D5 tanto para los fenoles y sulfatos resulta de 0.0026 %. El siguiente paso fue aislar y caracterizar los tensoactivos presentes en el D5, para evaluar su biodegradabilidad por separado y en conjunto. Para la separación de los tensoactivos (nonilfenol y alquilbencensulfonato) se siguieron varios métodos, de acuerdo a la composición del D5 (tabla 5), cada método se trabajo por triplicado, como se explica a continuación. Un volumen de 2 L del detergente líquido D5 se colocó en el horno (el volumen de la muestra se dividió en 5 partes), primero a 85 °C, por 20 minutos, con la finalidad de que el isopropanol (punto de ebullición 82 °C), se volatilizara, después se aumento la temperatura a 200°C, por 10 minutos, para volatilizar al etilenglicol (punto de ebullición 198 °C). Al sacar la muestra del horno, quedo una parte sólida que peso 15 g. El sólido resultante se disolvió en un litro de agua destilada y se dejo en refrigeración. (Martínez, 2002). La disolución anterior se trato de acuerdo a lo descrito en la bibliografía APHA, 5540 B Separación de surfactantes (Anexo V). El proceso de separación de los tensoactivos se logra por el borboteo de una corriente de nitrógeno a través de una línea de vacío con cloruro de sodio, carbonato anhídrido de sodio y del disolvente acetato de etilo donde quedan los tensoactivos de la muestra. 48 Se aisló la parte que contenía el acetato de etilo. Se evaporó el acetato de etilo y al sólido resultante se le realizó un análisis cualitativo por espectroscopia electrónica en ultravioleta a diferentes longitudes de onda, se utilizó una celda de cuarzo de 1 cm y como disolvente se utilizo etanol. En la figura 5 se muestra los resultados de la espectroscopia electrónica en la región del ultravioleta para una disolución de nonilfenol resultante del proceso de aislamiento de tensoactivos. Se observa la diferencia entre el nonilfenol puro y la disolución del nonilfenol, la cual es una mezcla con otras substancias. Figura 5. Espectro electrónico en disolución de nonilfenol en la región del ultravioleta. Posteriormente la disolución de mezclas se indujo a la cristalización, donde se obtuvieron dos diferentes tipos de cristales, los más abundantes de color blanco y los otros cristales amarillos. A ambos cristales se les realizó una espectroscopia electrónica en la región del infrarrojo(figuras 6 y 7). 49 Figura 6. Espectro electrónico en la región del infrarrojo de los cristales blancos. Figura 7. Espectro electrónico en la región del infrarrojo de los cristales amarillos. 50 Las figuras 6 y 7 muestran que los cristales blancos son una mezcla de nonilfenol con otro compuesto y los amarillos son el compuesto alquilbencensulfonato (ABS) junto con otro compuesto. Por tanto no aislamos completamente ambos tensoactivos, pero podemos decir que en los cristales blancos predomina el nonilfenol, se obtuvo un peso 0.05 g por cada litro de D5 y en los cristales amarillos predomina el ABS, se obtuvo un peso de 0.03 g por cada litro de D5. A la mezcla de los tensoactivos principales se les efectuaron las pruebas por separado de DQO y DBO5, con la finalidad de ver cual es su contribución a la baja biodegradabilidad del detergente D5. Los resultados se muestran en la tabla 7. Tabla 6. Biodegradabilidad de acuerdo a la relación DBO5/DQO, para la mezclas de tensoactivos. Tensoactivo DQO mgO2/L DBO5 mgO2/L DBO5/DQO Biodegradabilidad Porciento Biodegradable (%) Nonilfenol mezcla 845 101 0.12 No 12 ABS mezcla 503 50 0.01 No 10 El nonilfenol y el ABS se encuentran mezclados entre ellos o con alguna otra substancia en común, como se muestra en las figuras 6 y 7, por esa razón la biodegradabilidad es parecida. 4.3. Prueba internacional biodegradabilidad aerobia rápida. La prueba denominada biodegradabilidad aerobia rápida, la cual tiene un tiempo de ejecución de 28 días (OECD 301-A, 1997), se considera que el o los compuestos evaluados son fácilmente biodegradables, cuando se degradan al 70 % en 28 días de incubación a 28± 2ºC, por tanto la biodegradabilidad no depende sólo de la estructura molecular del compuesto, sino también de los microorganismos disponibles. La degradación es seguida por la determinación de la prueba DQO, las sustancias de prueba deben iniciar a una concentración de 40 mg O2/L de DQO. El grado de biodegradación es calculado de acuerdo a la concentración removida de DQO a partir de la concentración inicial. 51 De acuerdo al procedimiento de la prueba el cual se describe a detalle en el anexo VI, se prepara medio mineral para que los microorganismos pertenecientes al inóculo tengan las condiciones adecuadas para degradar las substancias de prueba. El inóculo proviene de una muestra fresca de lodos activados del tanque de aireación de la planta de tratamiento de Ciudad
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