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Aprendiendo Biologia

20/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES INDUCIDOS POR CURCUMINA
EN LA LÍNEA CELULAR A172 DE GLIOBLASTOMA HUMANO

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS

PRESENTA:
M. EN C. GARRIDO ARMAS MÓNIKA BERENICE

TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. FRANCISCO JESÚS ARENAS HUERTERO
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM.
COMITÉ TUTOR: DRA. MARCELA LIZANO SOBERÓN
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS, UNAM.
DRA. MARÍA DEL CARMEN MALDONADO BERNAL
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM.

CD.MX., FEBRERO, 2019.

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL

CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES INDUCIDOS POR CURCUMINA
EN LA LÍNEA CELULAR A172 DE GLIOBLASTOMA HUMANO

TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS

PRESENTA:
M. EN C. GARRIDO ARMAS MÓNIKA BERENICE

MÉXICO, CD.MX., FEBRERO, 2019.

UN M~
POSG DOg
COORDINACiÓN
OFICIO CPCB/050/2019
Asunto : Oficio de Jurado para Examen de Grado.
M. en C. Ivonne Ramírez Wence
Directora General de Administración Escolar, UNAM
Presente
Me permito informar a usted que el Subcomité de Biolog ia Experimental y Biomedicina del Posgrado
en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinaria del dia 01 de octubre de 20 18, aprobó el siguiente
jurado para la presentación del examen para obtener el grado de DOCTORA EN CIENCIAS de la
alumna GARRIDO ARMAS MÓNIKA BERENICE con número de cuenta 509021184, con la tesis
titulada " CAMBIOS MORFOLÓGICOS Y MOLECULARES INDUCIDOS POR CURCUMINA EN LA
LíNEA CELULAR A172 DE GLlOBLASTOMA HUMANO" , realizada bajo la dirección del DR.
FRANCISCO JESÚS ARENAS HUERTERO:
Presidente:
Vocal:
Secretario:
Suplente:
Suplente:
DR. JUAN MIRANDA RíOS
ORA. LEDA CAROLI NA TORRES MALDONADO
ORA. MARíA DEL CARMEN MALDONADO BERNAL
ORA. MAYRA FU RLAN MAGARIL
ORA. MARCELA LlZANO SOBERÓN
Sin otro particu lar, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
" POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU"
Cd. Universitaria, Cd. Mx., a 11 de enero de 2019
------._-~
DR. ADOLFO GERARDO AVARRO SIGÜENZA
COORDINADOR O L PROGRAMA
COOROINACION
Unidad de Posgrado · Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio O, ler. Piso, Circuito de Posgrados Cd. Universitaria
Delegación Coyoacán c.P. 04510 Cd. Mx. Tel. 5623 7002 http://pcbiol.posgrado.unam.mx
AGRADECIMIENTOS

Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de
México UNAM, por su formación académica.

La alumna recibió apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
CONACyT, con número de becario 225321

Al Tutor principal de éste proyecto, Dr. Francisco Jesús Arenas Huertero y a los
miembros del Comité Tutor Dra. Marcela Lizano Soberón y Dra. María del Carmen
Maldonado Bernal.

AGRADECIMIENTOS PERSONALES
En primer lugar al Dr. Francisco Jesús Arenas Huertero, por ser mi tutor y
permitirme ser parte de su grupo de trabajo, por toda la paciencia, por otorgarme
todos los votos de confianza y por su enseñanza profesional y personal.
A la dirección de Investigación del Hospital Infantil de México, Federico Gómez
(número de proyecto HIM-2015-026).
Al Dr. Abrahan Hernández Hernández, por llegar en el momento indicado, por sus
sabios consejos para la realización de este trabajo, su apoyo, su amistad y por su
calidad humana.

A la Dra. Marcela Lizano Soberón y a la Dra. María del Carmen Maldonado por ser
parte de mi comité Tutor, por su apoyo incondicional, su amabilidad, consejos y
sus atenciones.
Al Dr. Juan Carlos Corona, por su colaboración en la realización de la microscopía
confocal, compartir sus conocimientos y por su interés.
A la Dra. Leda Torres, por colaborar en el análisis de los arreglos de baja
densidad, por mejorar la escritura de la tesis, por sus consejos y apoyo.
A la Dra. Vilma Maldonado Lagunes, por ayudarme a realizar el análisis de
resultados en el programa IPA, orientación y su disposición siempre.
A la Dra. Mayra Furlan Margaril, por las observaciones y mejora en la escritura de
la tesis y sus atenciones.
A la Dra. María Luisa Escobar, por su colaboración en los experimentos de
microscopía de transmisión y su gentileza.
Al Biólogo Francisco Ordoñez Romero, por su asesoría en la realización de los
Western Blot en el laboratorio, su apoyo y consejos.
A la M. en C. Zelmy Castro Gálvez, por su apoyo incondicional, asesoría en el
análisis de resultados y por sus consejos acertados.
A la Química Marina Ramírez, por su amistad, orientación en el uso de equipo y
material de laboratorio.
A la MVZ. Rocío Chávez Trejo, por su cortesía y asesorarme durante todos los
trámites del doctorado, además escucharme en cada momento de frustración.
A la Dra. Sandra Orozco Suárez, por prestarme equipo de su laboratorio,
brindarme material, adoptarme como casi su alumna y permitirme usar su
laboratorio.
A la Dra. María del Pilar Eguía Aguilar, por la asesoría en diferentes técnicas del
laboratorio, regalarme reactivos y por todo el apoyo otorgado durante todo este
tiempo.
DEDICATORIA

Con todo mi corazón …

A mi amada María Julia Armas Morales, por toda una vida de amor incondicional,
gracias por cada sonrisa y abrazo diario, por darme tu calor, por ser una mujer
ejemplar y por ser la mejor madre del mundo.

Ésta tesis está dedicada especialmente a Martha Libia Martínez Robles, por ser de
mis mejores amigas en vida y un gran ángel protector, por enseñarme lo que es
luchar y no flaquear en los momentos complicados.

A mis abuelitos, que siempre están presentes en cada cosa que hago, por darme
valores, sabiduría, consejos, vivencias, amor, sobre todo luz y alegría en cada día
de sus vidas.

A Alfonso Armas Morales y Fernando Armas Morales, por ser mis padres,
consentirme y amarme en todo momento.

A mi tercera madre Gloria Armas Morales, por siempre confiar en mí, apoyarme y
protegerme incondicionalmente. A Hugo Montealegre M. por su cariño y apoyo.

A Cynthia Armas Gassós y Fernando Armas Gassós, por siempre cuidarme, por
enseñarme tantas cosas de la vida, lo más importante, vivir como verdaderos
hermanos. A Andy y Memo, que son mis hermanos pequeños.

A toda mi bella familia, mis primos, tíos, sobrinos, imposible mencionar a cada uno
por que por fortuna es una familia grande y sobre todo, amorosa conmigo.

A Vinnitsa Buzoianu Anguiano, por siempreestar a mi lado, apoyarme en
momentos complejos, por alentarme a seguir y por ser el equipo perfecto.

A Alaide García Sinecio, por tantos años de amistad y crecimiento, por décadas de
hermandad a pesar de todo y que pese a las circunstancias siempre seguiremos
juntas.

A Zelmy Castro Gálvez, por su apoyo día con día, por hacerme reír diario y
compartir muchos momentos locura, escucharme cada momento de frustración y
mostrarme que en todo momento se puede encontrar una verdadera amistad.

A Marina Ramírez, Carmen Retana, Jorge García, Aranxa, Cecilia Cabrera,
Miguel, Berenice, Carlos, Leticia, Alfredo amigos y colegas del Laboratorio en
Investigación en Patología Experimental del Hospital Infantil de México, Federico
Gómez.

A mi tribu especial, Moni Hernández Estrada, Alejandro García Muñoz, Hugo
Sánchez, Hegel Hernández, por su hermosa amistad y su energía tan especial.

A mis amigos de mi “segundo laboratorio”, Katia, Stephanie, Rodrigo, Lalo, Jared,
Mayra y Josué, gracias por todos los bellos momentos.

A Mónica González Lázaro, por su apoyo en todos estos años de estudio,
consejos y compartir sus conocimientos sin interés alguno.

Gracias, por formar parte de mi vida.
Gracias, por enseñarme tanto.
Gracias, por ser y estar.

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS
LISTA DE CUADROS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMEN . . . . . . . . . . 1
ABSTRACT . . . . . . . . . . 2
INTRODUCCIÓN
Cáncer, concepto general . . . . . . . . 3
Cáncer de cerebro, glioblastoma . . . . . . . 4
Tratamiento médico de glioblastoma . . . . . . 5
Tratamiento alterno contra el cáncer: Productos naturales . . . 6
Curcumina . . . . . . . . . . 7
ANTECEDENTES
Actividad antineoplásica de la curcumina . . . . . 11
La curcumina provoca muerte celular en células tumorales . . . 13
a) Apoptosis . . . . . . . . . 13
b) Catástrofe mitótica . . . . . . . . 14
c) Necrosis . . . . . . . . . 15
d) Autofagia . . . . . . . . . 16
e) Metuosis . . . . . . . . . 16
f) Paraptosis . . . . . . . . . 17
Estrés de retículo endoplásmico y muerte celular . . . . 19
El estrés del retículo endoplásmico y la respuesta UPR pueden ayudar al
tratamiento contra el cáncer . . . . . . . 24
El estrés del retículo endoplásmico modifica la expresión de reguladores
transcripcionales como los miRNA . . . . . . 25
Los miRNA como reguladores de los procesos biológicos . . . 28
JUSTIFICACIÓN . . . . . . . . . 30
HIPÓTESIS . . . . . . . . . . 30

OBJETIVOS . . . . . . . . . . 31
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL . . . . . . . 32
METODOLOGÍA . . . . . . . . . 33
RESULTADOS . . . . . . . . . 42
DISCUSIÓN . . . . . . . . . . 59
CONCLUSIONES . . . . . . . . . 68
PERSPECTIVAS . . . . . . . . . 69
LITERATURA CITADA . . . . . . . . 70
APÉNDICE (ARTÍCULO REQUISITO) . . . . . . 82

LISTA DE FIGURAS Y CUADROS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química de la curcumina.
Figura 2. Funciones potenciales anti-cáncer de la curcumina
Figura 3. Principales tipos de muerte celular que provoca la curcumina.
Figura 4. Vías de señalización de UPR.
Figura 5. Biogénesis de los miRNA.
Figura 6. Esquema general de trabajo.
Figura 7. Viabilidad celular y determinación de CI50 de las células expuestas a
curcumina.
Figura 8. Cambios morfológicos inducidos por la curcumina.
Figura 9. Cambios ultraestructurales inducidos por la curcumina.
Figura 10. Inhibidores de paraptosis.
Figura 11. Medición de masa mitocondrial, potencial de membrana (m) de
mitocondria y RE.
Figura 12. Niveles de expresión de genes relacionados con ERE y expresión de la
proteína BIP.
Figura 13. Análisis de calidad del RNA que se usó en las placas de baja densidad
para la evaluación de la expresión miRNA.
Figura 14. miRNA regulados diferencialmente después de la exposición a
curcumina.
Figura 15. Identificación de vías moleculares reguladas por los miRNA alterados
en respuesta a la curcumina en las células A172.
LISTA DE CUADROS.
Cuadro 1. Clasificación de los astrocitomas.
Cuadro 2. Secuencia de oligonucleótidos usados en la RT-qPCR.
Cuadro 3. Mezcla de reacción para placas de baja densidad.
Cuadro 4. Mezcla de reacción para la PCR para placas de baja densidad.
Cuadro 5. Mezcla de reacción para la preparación de geles de acrilamida para el
análisis de expresión de diferentes proteínas

ABREVIATURAS
AKT: Serina-treonina proteina cinasa (Serine-threonine protein kinase).
ATF4: Factor 4 activante de la transcripción (Activating Trascription Factor 4).
ATF6: Factor 6 activante de la transcripción (Activating Transcription Factor
6).
BIP: Proteína de unión a inmunoglobulina (Binding immunoglobulin protein).
BCL2: Linfoma de células B (B-Cell lymphoma 2).
CaCl2: Cloruro de calcio.
CHOP: Factor de transcripción homólogo a C/EBP (CAAT/enhancer binding
Protein).
CHX: Cicloheximida.
CI50: Concentración inhibitoria 50.
DNA: Ácido desoxirribonucleico.
DMEM: Medio eagle modificado de Dulbecco (Dulbecco´s Modified Eagle´s
Medium).
ERE: Estrés de retículo endoplásmico.
GAPDH: Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Glyceraldehyde-3 phosphate
dehydrogenase).
GB: Glioblastoma
IRE1: Proteína-1 que requiere inositol (Inositol requiring protein-1).
IPA: Ingenuity Pathway Analysis.
JNK: Cinasa N-Terminal de c-Jun (c-Jun NH2-terminal kinase).
KCl: Cloruro de potasio.
KH2PO4: Fosfato monobásico de potasio.
MET: Microscopía electrónica de transmisión.
MEK: Proteína cinasa activada por mitógenos (Mitogen-Activated Protein Kinase).
MgSO4: Sulfato de magnesio.
hsa-miRNA: microRNA de Homo sapiens.
Min: minutos.
MTT: 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol.

nm: nanómetros.
NaCl2: Cloruro de Sodio.
OsO4: Tetraóxido de Osmio.
PBS: Solución amortiguadora de fosfato (Phosphate Buffer Solution).
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polimerase Chain Reaction).
PERK: Proteína cinasa del retículo endoplásmico (Protein kinase-like
Endoplasmic Reticulum Kinase).
PSA: Persulfato de amonio.
PVDF: Polyvinylidene difluoride.
RE: Retículo endoplásmico.
RIN: RNA integrity number.
RNA: Ácido ribonucleico.
RNAm: RNA mensajero.
ROS: Especies reactivas del oxígeno (Reactive Oxigen Species).
RT-qPCR: Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa
revesa (Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction).
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis.
Seg: segundos.
SFB: Suero fetal bovino.
TMRM: Tetramethylrhodamine, methyl ester.
TLDA: Arreglo de Baja Densidad TaqMan (TaqMan Low Density Array).
UPR: Respuesta a proteínas mal plegadas (Unfolded Protein Response).
XBP1: Proteína 1 de unión a la caja X (X-box Binding Protein 1).
V: Voltios.

RESUMEN
La curcumina es un polifenol extraído de la planta Curcuma longa, molécula con
efectos pleiotrópicos que suprime la transformación, proliferación y metástasis de
tumores malignos. La curcumina puede causar diferentes tipos de muerte celular,
dependiendo de su concentración y el tipo celular que se expone. Sin embargo, se
desconoce el efecto molecular y celular que induce la curcumina en la línea celular
de glioblastoma humano A172. En este trabajo se demostró que la exposición de
la línea celular A172 de glioblastoma a 50 M de curcumina concentración
Inhibitoria 50 (CI50), durante 24 h provoca cambios morfológicos característicos a
la muerte celular llamada paraptosis. Las células presentaron vacuolas derivadas
del retículo endoplásmico (RE) verificadas por microscopía electrónica de
transmisión y un trazador fluorescente del mismo RE. La curcumina baja el
potencial de membrana tanto del RE (30% aproximadamente, p<0.01) como de la
mitocondria (60% aproximadamente, p<0.05). Estos cambios fueron inhibidos con
cicloheximida (CHX) (40 M, dos horas antes de la exposición a curcumina)por lo
que depende de la síntesis de proteínas. Se encontraron cambios en la regulación
de genes que responden al estrés del RE (ERE), como son IRE1 y ATF6, los que
mostraron incremento de más de 2 veces con respecto a células crecidas sólo en
medio (p<0.01). También se observó cambio en la expresión de los miRNA como
hsa-miR-133a, hsa-miR-181a y hsa-miR-449 en las células expuestas a
curcumina, que incrementaron 5, 6 y 7 veces respectivamente. Se realizó un
análisis bioinformático mediante el programa Ingenuity pathway analysis (IPA) de
los miRNA alterados en las células expuestas y se encontró que esta modificación
de los miRNA se relaciona con dos vías principales, una de ellas es regulada por
AKT-Insulina y la segunda por p53-BCL2: vías descritas en la muerte celular de
paraptosis. Se evalúo la expresión proteica de AKT, observándose que la
curcumina disminuyó aproximadamente un 50% de la proteína con respecto a la
contenida en células crecidas en vehículo (p<0.01). Los datos sugieren
fuertemente que la curcumina puede estresar al RE, dando lugar a la paraptosis
modificando morfológicamente y molecularmente a las células de glioblastoma.
2

ABSTRACT

Curcumin is a polyphenol extracted from the Curcuma longa plant, molecule with
pleiotropic effects that abrogates transformation, proliferation and metastasis of
malignant tumors. Curcumin can cause different types of cell death, depending on
its concentration and the cell type that is exposed. However, the molecular and
cellular effect that curcumin induces in the human glioblastoma cell line A172 is
unknown. In this work, we show the effect in the cellular line A172 of glioblastoma
of the treatment with 50 μM curcumin at 50 inhibitory concentration, for 24 h. This
treatment caused morphological changes characteristic to a cell death process,
called paraptosis. The cells presented vacuoles derived from the endoplasmic
reticulum (ER) verified by transmission electron microscopy and a fluorescent
tracker of the same ER. Curcumin lowers the membrane potential of both the ER
(approximately 30%, p <0.01) and the mitochondria (approximately 60%, p <0.05).
These changes were inhibited with cycloheximide (40 μM, two hours before
exposure to curcumin) so it depends on protein synthesis. Changes were found in
the regulation of genes that respond to ER stress, such as IRE1 and ATF6, with a
2-fold increase compared to cells grown only in medium (p <0.01). The expression
of miRNAs such as hsa-miR-133a, hsa-miR-181a and hsa-miR-449 in cells
exposed to curcumin, also increased in 5, 6 and 7 times, respectively. A
bioinformatic analysis was carried out using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
software of the altered miRNAs in the exposed cells and it was found that this
modification of the miRNAs is related to the main pathways; one of them is
regulated by AKT-Insulin and the second by p53-BCL2: pathways described in the
cell death paraptosis pathway. Moreover, curcumin decreased approximately 50%
of AKT protein levels with respect to that contained in cells grown in vehicle (p
<0.01). Our results demonstrate an effect of curcumin on ER, giving rise to
paraptosis, which modifies morphological and molecular responses in glioblastoma
cells.

INTRODUCCIÓN
Cáncer, concepto general
La tumorigénesis es un proceso de varios pasos que convierte las células
normales en tumores malignos. Hannahan y Weinberg proponen características
importantes que las células adquieren durante el desarrollo de varios tumores
entre ellas: mantener la señalización proliferativa, evadir los supresores de
crecimiento, activación de invasión y metástasis, permitiendo la replicación e
inmortalidad, inducción de angiogénesis, la resistencia a la muerte celular
(Hanahan, D. y Weinberg, R., 2000), desregulación de la energía celular (o
reprogramación del metabolismo energético), son capaces de evadir la
destrucción inmune, la inestabilidad y mutación del genoma y la inflamación que
promueve el tumor (Hanahan, D. y Weinberg, R., 2011). Gracias a éstas
características las células de cáncer acumulan mutaciones genómicas, que dan
ventaja de crecimiento a las mismas por lo que proliferan incontrolablemente y
pueden invadir y crecer en otras partes del cuerpo (Lin, S. y cols., 2017).
El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial, ocupando la
segunda causa, seguida de infartos al miocardio. El número de casos de cáncer
se incrementa considerablemente tanto en países desarrollados como en países
en vías de desarrollo (Pratheeshkumar, P., y cols., 2012).
Tan sólo en el año 2015, cerca de 90.5 millones de personas fueron
diagnosticados con esta enfermedad. Cerca de 14.1 millones de nuevos casos
ocurren cada año (sin incluir el cáncer de piel o melanoma) (Lin, S. y cols., 2017).
La incidencia de enfermedades oncológicas se ha incrementado
considerablemente en todo el mundo y el cáncer del sistema nervioso central
(SNC), en especialmente el glioblastoma multiforme (GBM), no es la excepción.
(Staller, A., 2016).

Cáncer de cerebro, Glioblastoma
El GB es un grave problema de salud pública debido a que es el tumor cerebral
primario más frecuente, letal, agresivo y difícil de tratar en adultos (Staller, A.,
2016).
La mayor parte de los tumores del SNC derivan de los astrocitos, mientras que los
oligodendrogliomas, que derivan de los oligodendrocitos, y los ependimomas, que
se producen a partir de las células ependimarias, aparecen en raras ocasiones.
Los astrocitomas se clasifican tanto por su grado como por su tipo, establecido por
la OMS. Los pertenecientes a los grados I y II (grado bajo) son de crecimiento
lento y presentan una probabilidad muy elevada de tratamiento, por el contrario,
los de grados III y IV (grado alto) son altamente malignos, tienen mal pronóstico y
son letales y los pacientes tienen un sobrevida aproximada de 1 año de vida
(Cuadro 1) (Sofroniew, M. y Vinters, H. 2010).

Cuadro 1. Clasificación histopatológica de los astrocitomas. Los tumores se
clasifican tanto por su grado, según los criterios histológicos establecidos por la
OMS (Sofroniew, M. Vinters, H. 2010).
En México, el cáncer de encéfalo y de SNC ocupa el segundo lugar de mortalidad
por neoplasias malignas, seguido por leucemias, en población de entre 0 y 17
años de edad. En la infancia son más comunes los tumores cerebrales que no se
extienden fuera del cerebro, ni medula espinal y que se generan principalmente de
astrocitos; en los adolescentes junto con los tumores cerebrales se observan más
casos de ependimomas, que son tumores malignos que se desarrollan en las
membranas que recubren los ventrículos cerebrales. La incidencia de los gliomas
en adultos es de 14.07 por 100,000 personas al año a 0.18 casos por cada
5

100,000 personas en los niños (Alegría-Loyola MA, Galnares-Olalde A, y Mercado
M., 2017).

Tratamiento médico de Glioblastoma
El tratamiento contra GB es muy agresivo ya que consiste en una resección
quirúrgica máxima, en la que en la mayor parte de los casos, el tumor se
encuentra en áreas funcionales e imposibilita hacer una resección con márgenes
seguros, además de que corren riesgo de deterioro neurológico, por lo que tiene
un efecto importante en la supervivencia libre de progresión y la calidad de vida
del paciente. También los tratan con radioterapia-quimioterapia concurrente y
quimioterapia adyuvante (Lemée J., y cols., 2015). La radioterapia es importante
en la terapia postquirúrgica con un beneficio adicional modesto por la
administración concurrente de un metilador oral, la temozolamida, como
quimioterapéutico. Sin embargo, la radioresistencia y la recurrencia tumoral son
universales en glioblastoma. La radiación también daña el tejido cerebral no
neoplásico, lo que resulta en deterioro cognitivoy disminución de la calidad de
vida. La radiación focal de alta dosis reduce la toxicidad del tejido no neoplásico,
pero la invasión tumoral a las regiones normales del cerebro limita el beneficio de
supervivencia de las técnicas de radioterapia altamente enfocadas (como el
cuchillo gamma y el haz de protones) (Rivera M. y cols. 2015).
El tiempo medio de supervivencia después de la cirugía, radioterapia y
quimioterapia, es de aproximadamente de 9 a 14 meses, con tasa de
supervivencia a 5 años de menos del 10% de los pacientes tratados y con efectos
secundarios significativos y eficacia limitada, por lo que, se necesita encontrar
agentes terapéuticos más efectivos (Desai V., y Bhushan A., 2017).
Un tratamiento anticarcinógeno propuesto es el uso de productos naturales,
siendo un área de investigación importante para el descubrimiento de nuevos
medicamentos. Ya que se ha demostrado en experimentos tanto in vivo como in
vitro que son capaces de interferir en el inicio, desarrollo y progresión del cáncer,
6

modulando varios mecanismos, como la proliferación diferenciación, angiogénesis,
metástasis y algo muy importante, provocar muerte celular (Chen, D., y Dou, Q.,
2008; Pratheeshkumar, P., y cols., 2012).

Tratamiento alterno contra el cáncer: Productos naturales.
Los productos naturales son metabolitos secundarios producidos por las plantas
como respuesta específica a su entorno y contribuye a su crecimiento, son
sintetizados para protegerse contra agentes bióticos y/o abióticos (Saewan N., y
Jimtaisong A., 2015).
Varios compuestos derivados de plantas son importantes para el tratamiento de
cáncer, algunos ya son medicamentos usados contra diferentes tipos de cáncer
como son; el taxol, camptotecina, combrestatina, alcaloides, entre otros. Pero
mucho de ellos tienen efectos secundarios y son tóxicos a las células sanas, por lo
que hay que seguir explorando otros productos naturales (Saewan, N., y
Jimtaisong, A., 2015).
Se han identificado productos dietéticos con efectos anticarcinogenos, uno de
esos metabolitos, son los polifenoles, principalmente la curcumina
(Pratheeshkumar, P. y cols., 2012).
Muchas evidencias señalan que la curcumina, puede representar una estrategia
novedosa para tratar a los pacientes de cáncer en combinación con regímenes
terapéuticos ya existentes (Hackler L y cols. 2016). Además, se ha demostrado
que la curcumina provoca efectos tóxicos únicamente a las células tumorales,
mientras que las células normales no son afectadas (Syng-Ai y cols. 2004;
Kakarala y cols. 2010; Colacino JA y cols, 2016).

Curcumina
La Curcumina es un polifenol que se encuentra en el rizoma de la planta Curcuma
longa, según el Sistema de clasificación APG III (Grupo para la filogenia de las
angiospermas-Angiosperm Phylogeny Group) del año 2009, es una planta
monocotiledónea del Orden Zingiberales de la familia Zingiberaceae. Se incluye
dentro del grupo de las Comelínidas, caracterizado por paredes celulares
fluoscentes bajo luz ultravioleta por la presencia de ácido ferúlico, cumárico y
salícico en las hojas (Saiz De Cos, P. y Pérez-Urria, C., 2014).
La Curcuma longa se cultiva ampliamente en diferentes partes de la India, en el
sureste de Asia y en zonas tropicales. La curcumina (diferuloilmetano) es de color
amarillo y se usa como colorante de quesos, mostaza y arroz. Es un condimento
con muchos beneficios a la salud, que se ha utilizado por siglos en la India y China
para tratamientos médicos de enfermedades dermatológicas, infecciones, estrés y
depresión (Kocaadam B. y Sanlier N., 2015).
Estructuralmente, la curcumina es un compuesto fenólico, existente al menos en
dos formas de cúrcuma, ceto y enol (Figura 1). La forma enol es químicamente
más estable, posee componentes hidrofóbicos que son extensamente encontrados
en el rizoma de la cúrcuma, se disuelven en dimetilsulfóxido, solventes orgánicos y
en aceites. Estudios en farmacocinética muestran que después del consumo oral,
la curcumina es metabolizada para dar sulfatos y derivados de glucurónidos. Sin
embargo, hexahidrocurcuminol, hexahidrocurcumina y tetrahidrocurcumina, son
los principales metabolitos de la curcumina, seguidos a una administración
intraperitoneal. Hasta ahora, hay pocos reportes científicos que revelen los efectos
adversos ante el consumo de la curcumina, como efectos teratogénicos, toxicidad
reproductiva y embriotoxicidad en altas dosis. La FAO (Food an Agriculture
Organization, Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentación) y la WHO (Organización Mundial de la Salud: World Health
Organization) muestran que un consumo de curcumina diario aceptable es de 0.1-
3 mg/kg de peso. La curcumina se reduce a dihidrocurcumina y
tetrahidrocurcumina por una enzima dependiente de NADPH
dihidrocurcuminreductasa (de Oliveira, M. y cols., 2016).
8

Figura 1. Estructura química de la curcumina. Posee dos residuos de ácido
ferúlico, unidos entre sí por un puente metilélico (por ello, algunos autores la
nombran diferuloilmetano) (Elguero, J., 2015).

Ensayos clínicos en humanos revelan que la curcumina al ser ingerida, tiene una
alta seguridad, tolerabilidad y ausencia de toxicidad administrada en dosis
elevadas. Por ejemplo, un ensayo en fase I de pacientes con cáncer de vejiga,
cervico-uterino, intestinal entre otras, se administraron 8 gramos diarios durante 3
meses y fue bien tolerada, no hubo toxicidad relacionada con el tratamiento. Sin
embargo, la administración y la biodisponibilidad de la curcumina oral son bajos,
debido a que existe una mala absorción intestinal, se elimina rápidamente y posee
baja solubilidad acuosa. La eliminación es principalmente a través del hígado por
glucuronidación y sulfatación y se excreta a través de las heces. Tras la
administración oral de la curcumina, las concentraciones séricas máximas (1% del
consumo) se alcanzan entre 1-2 horas después de consumirla (Epstein, J. y cols.,
2010).
La curcumina tiene muchos blancos moleculares, por lo cual afecta numerosas
cascadas bioquímicas y moleculares. Se une físicamente a más de 33 proteínas,
incluyendo tioredoxina reductasa, ciclooxigenasa-2 (COX2), proteínas cinasa C,
lipooxigenesa 5 y tubulina. Modula factores de transcripción, factores de
crecimiento, receptores, citosinas, enzimas y genes que regulan la proliferación,
por lo que la curcumina ha sido blanco de investigaciones en modelos animales,
9

en estudios con humanos y en estudios in vitro (Saiz De Cos, P. y Pérez-Urria, C.,
2014).
La curcumina posee numerosas propiedades biológicas y farmacológicas, como:
Antioxidante y antiinflamatorio, ya que reduce el estrés oxidativo al eliminar los
radicales libres y previene la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS).
Por ejemplo, en células de hepatocitos humano L02 que fueron pre-tratadas con
curcumina se inhibe la generación de ROS y de superóxido dismutasa ante un
genotóxico como la quinocetona. En ratones diabéticos, el tratamiento con
curcumina inhibe la producción de ROS y de estrés oxidativo inducido por la
hiperglucemia mediante la restauración de la función de la DNA-metiltransferasa
(Dai CS y cols, 2015; Maugeri A., 2018)
La curcumina se une directamente a moléculas inflamatorias, como al factor de
necrosis tumoral (TNF-) y ciclooxigenasas COX-1 y 2. En el caso del TNF- que
está involucrado en enfermedades autoinmunes, la curcumina interacciona en los
sitios de unión del receptor por acoplamiento molecular por interacciones no
covalentes y puede interrumpir la señal de transducción entre TNF y su receptor
por unión directa, por lo tanto suprimir la inflamación inducida (Aggarwal B., Gupta
S., y Sung B., 2013).
Es un antiparasitario, inhibe la proliferación y adhesión de la Giardia, disrumpiendo
las estructuras del citoesqueletode los trofozoitos, dañando el flagelo y la región
caudal del parasito, al igual que su membrana. Reduciendo significativamente el
número de infección intestinal del protozoario (Gutierrez-Gutierrez F., y cols.,
2017).
La curcumina también es anti-viral ya que bloque la replicación viral a través de la
inhibición de la integrasa en el VIH (Prasad S. y Tyagi A., 2015).
La curcumina posee la capacidad de interactuar con muchos blancos moleculares
y la característica más importante para el presente trabajo, es que tiene potente
actividad antineoplásica in vivo e in vitro, a través de la supresión de la
transformación celular, la inhibición del crecimiento tumoral y en evitar la iniciación
del cáncer. Por ejemplo, Estudios in vivo en ratones con adenocarcinoma gástrico
10

con tratamiento con curcumina, a los cuales se les midió y pesó el tumor
generado, comparado con los tumores gástricos sin tratamiento, fueron más
pequeños y con presencia de apoptosis, además expresaron a la baja genes como
VEGF y STAT3, por lo que el tratamiento con curcumina induce muerte celular en
el tumor e inhibe la proliferación de cáncer gástrico (Wang XP, y cols., 2017).
También participan en la supresión de la angiogénesis, efecto anti-invasivo, así
como en el bloqueo de la metástasis. Se ha analizado la supresión de
carcinogénesis en diferentes tipos de cáncer; como el de mama, pulmón, piel y
colon (Zhi-Dong LV., y cols., 2014; Liu L., y cols., 2013; Fadus, MC. y cols., 2016).
Una amplia investigación realizada en las dos últimas décadas ha puesto en
manifiesto que el cáncer es un resultado de la desregulación de la señalización
celular de múltiples vías y la curcumina, por su característica de interactuar con
diversos blancos, puede afectar numerosas cascadas bioquímicas y moleculares,
lo que puede ser clave en su potencial terapéutico (Anand, P. y cols., 2008).

ANTECEDENTES
Actividad antineoplásica de la curcumina
Existen diversos reportes en los cuales se abordan las propiedades
antineoplásicas de la curcumina que muestran que modula múltiples vías de
señalización celular que incluyen moléculas que controlan la proliferación celular
como NF-kB (Nuclear factor kB), Ciclina D1, c-MYC; la supervivencia celular, como
BCL-2 (B-cell lymphoma 2), BCL-XL (B-cell lymphoma-extra large), FLIP (FLICE-
like inhibitory protein), XIAP (X-Linked inhibitor of apoptosis), C-IAP1; la apoptosis
o muerte celular, como Caspasa-8, 3, 9. También controla supresores de tumor
como p53, p21; receptores de vías de muerte como DR4, DR5, de vías
mitocondriales y vías de cinasas, MAPK (Mitogen-activated protein kinases), JNK
(c-Jun N-terminal kinase), AKT (Serine-threonine protein kinase) y AMPK (AMP-
activated protein kinase), las cuales pueden afectar el crecimiento tumoral (Lee D.
y cols., 2016).

Hanahan y Weinberg, propusieron que las células cancerosas de cualquier tipo de
tumor poseen ciertas características comunes que llevan al desarrollo del cáncer
(Hanahan, D. y Weinberg R., 2000; Hanahan D. y Weinberg R., 2011), en las
cuales la curcumina puede interferir en algunos procesos del desarrollo del cáncer.
Basado en sus propiedades químicas, la curcumina interactúa con numerosas
moléculas extracelulares e intracelulares, que están involucradas en la iniciación y
progresión del cáncer (Figura 2) (Shanmugam, M. y cols., 2015).

Figura 2. Funciones potenciales anti-cáncer de la curcumina. La curcumina
actúa en diferentes procesos de la transformación de una célula normal, cuando
existe el crecimiento tumoral y la metástasis (modificado de Shanmugam, M. y
cols., 2015).

En el caso de las vías de señalización relacionadas con la proliferación, por
ejemplo, la curcumina interfiere directamente inhibiendo la expresión del factor
nuclear NF-kB que la regula, con la metástasis, la angiogénesis, la apoptosis y la
resistencia a quimioterapia. También suprime cascadas de señalización como
PI3K, AKT, mTOR, AP1 (JUN y FOS), JNK, JAK-STAT, PKC, CMYC, MAPK, ELK,
CDKs, iNOS, Wnt/-Catenina, las cuales regulan la progresión del cáncer. La
curcumina también baja la expresión de ciclinas D1 y proto-oncogenes, que están
principalmente expresados en la mayoría de los tipos de cáncer (Vallianou, N. y
cols., 2015).

La curcumina provoca muerte celular en células tumorales
La eliminación de las células tumorales por fármacos antineoplásicos de uso
común, está mediada por el desencadenamiento de la muerte celular por
apoptosis, pero las células tumorales a menudo evitan la muerte celular y pueden
resistir y sobrevivir, por lo que es necesario buscar y encontrar compuestos que
permitan la eliminación de las células resistentes (Lee D. y cols., 2016).
Como se mencionó anteriormente, la curcumina es capaz de modular múltiples
blancos en las células neoplásicas, provocando así, varios tipos de muerte celular,
(Lee D. y cols., 2016). Las respuestas de las células tumorales ante la exposición
de la curcumina no es homogénea, ésta depende de la concentración de
exposición, el tipo celular y el tiempo que se exponga la célula.
La curcumina puede provocar diferentes tipos de muerte celular (Figura 3) entre
ellos: apoptosis, catástrofe mitótica, necrosis, autofagia y paraptosis (Hassan, M. y
cols., 2014; Elmore S., 2007; Imreh G., y cols., 2017; O´Sullivan-C G y cols., 2009;
Kang D, y cols., 2013; Aoki, H., y cols., 2007; Romero-Hernandez M., y cols.
2013). .
a) Apoptosis
La apoptosis es un proceso fisiológico normal que es requerido para el
mantenimiento de la homeostasis celular, cumpliendo un papel muy importante
para el desarrollo normal de los organismos. Contribuye a la eliminación de
células no necesarias y no requeridas, para mantener un balance entre células
vivas y muertas en organismos multicelulares, entre ellos el ser humano (Hassan,
M. y cols., 2014).
En la apoptosis, las células reducen su tamaño (aproximadamente 30%). Esto es
provocado por el movimiento de fluidos fuera de la célula, debido a la inhibición del
transporte de Na+- K+, Cl-. La fosfatidilserina presente en el lado interno de la
membrana plasmática, pasa al exterior de la membrana plasmática. El núcleo
sufre cambios notorios, la cromatina se condensa y se acumula en la periferia. El
nucléolo se desorganiza. La cromatina se fragmenta por endonucleasas en
fragmentos de 180-200 pb (cortes nucleosomales) y esto genera el patrón de
escalera del DNA en electroforesis, aunque no todas las células la presentan ya
14

que depende del grado de fragmentación. La membrana plasmática aparece con
grandes invaginaciones, que son los cuerpos apoptóticos (Elmore, S., 2007).
Hay dos vías de activación de la apoptosis, la vía extrínseca, en la cual participan
receptores de muerte y mediante transducción de señales llevan la activación de
caspasas, especialmente la 8 y la 3. Y la vía intrínseca, donde participa la
mitocondria y se producen los factores proapoptóticas como los de la familia
BCL2, entre otros (Hassan M. y cols., 2014).
La curcumina provoca la activación de caspasas y receptores de muerte, afecta
las funciones de la mitocondria, de las proteínas cinasas y de las vías supresoras
de tumores. Mediante estas interacciones, la curcumina actúa como un supresor
de tumor, durante el proceso de iniciación, progresión y metástasis, favorece
principalmente la activación de la vía intrínseca de señalización que provocan la
apoptosis, ya que es capaz de inhibir BCL2 y XIAP, que permiten el aumento de
expresión de BAX y BAK. También incrementa la inestabilidad y con ello la
modificación de la permeabilidad mitocondrial, incrementando la liberación de
citocromo C que causa la activación de caspasas, finalizando así, en una
respuesta apoptótica (Kim SH, y cols.,2014).
b) Catástrofe mitótica
Existendiferentes mecanismos por los cuales se eliminan las células
genéticamente inestables y defectuosas en un tejido. La catástrofe mitótica es un
mecanismo antiproliferativo regulado, que se produce cuando la mitosis no es
adecuada o su procesamiento es inadecuado (Imreh, G. y cols., 2017).
Las células que presentan este tipo de respuesta poseen alteraciones nucleares
únicas que conducen a la multinucleación y/o micronucleación, éstas
características son utilizadas como marcadores morfológicos para esta respuesta
celular. Estas células multinucleadas surgen de cromosomas no condensados o
de sus fragmentos durante la anafase y que quedan fuera de los núcleos de las
células hijas formados durante la telofase, lo que da lugar a encontrar tanto a los
núcleos principales más los micronúcleos. En la catástrofe mitótica también existe
15

desorganización del huso mitótico, por ello no hay segregación cromosómica
adecuada (Imreh, G. y cols., 2017).
Varios estudios han encontrado que el tratamiento con la curcumina en las células
tumorales, desencadena también catástrofe mitótica en la que los puntos de
control de la célula son defectuosos (en particular, los puntos de control de la
estructura del DNA); también induce diversas alteraciones en la mitosis, lo que
provoca falla mitótica y detención en las fases G2/M del ciclo celular, junto con la
disrupción del uso mitótico y defectos en la citocinesis(Wolanin, K. y cols., 2006).
La curcumina provoca catástrofe mitótica en células esofágicas de cáncer (OE19,
OE21 y OE33), las células sensibles a la curcumina acumulan proteínas poli-
ubiquitidadas y ciclina B, lo que tiene relación con el sistema ubiquitina-
proteasoma. Esto es clave para el punto de control del ciclo celular y puede ser la
causa de las alteraciones mitóticas, provocando una citoxicidad en las células. La
catástrofe mitótica, se puede acompañar por la apoptosis o la autofagia y esto
probablemente depende de la vía de señalización de muerte activa en una línea
celular determinada (O’Sullivan-C, G. y cols., 2009).
c) Necrosis
Las células que presentan muerte celular por necrosis tienen la característica de
perder el potencial de membrana mitocondrial y se provoca por la inducción de las
especies reactivas de oxígeno, lo que resulta una muerte independiente de
caspasas (Kang, D. y cols., 2013).
En la necrosis la degeneración celular es pasiva, sin un requerimiento de energía
en forma de ATP. Morfológicamente hay un “abultamiento” de los organelos y la
ruptura de la membrana celular, que conduce a la pérdida de osmoregulación y la
lisis de la célula. Es un proceso en el cual se libera el contenido intracelular y
puede activar una respuesta inmunitaria fuerte, en el cual se afectan las células
vecinas. En los primeros cambios morfológicos, se ve aumento en el volumen
celular, se rompe la membrana plasmática y se libera el contenido celular al
microambiente. Y en una respuesta tardía se liberan hidrolasas ácidas de los
lisosomas, las cuales aceleran la desintegración celular. La cromatina se
condensa de manera irregular en el núcleo y se degrada en sitios al azar. Este es
16

el tipo de muerte celular que causa la curcumina en células de cáncer de próstata
(Kang, D.y cols., 2013).

d) Autofagia
Autofagia, es la muerte celular programada tipo II. Esta muerte se caracteriza por
que las células presentan múltiples vacuolas de doble membrana en el citoplasma,
y el núcleo permanece intacto. La autofagia es básicamente un sistema de
degradación de proteínas por los lisosomas de la propia célula. Es un proceso en
el cual, se mantienen los niveles de ATP y típicamente es activado en privación de
aminoácidos (Levy JM, y cols., 2017).
Aoki y colaboradores (2007), encontraron que las líneas celulares U87-MG y
U373-MG de glioblastoma expuestas a 40 M de curcumina durante 48 h induce
autofagia, la cual está regulada por la inhibición de Akt/mTOR/p70S6K y por la
estimulación de la vía ERK1/2 (Aoki, H., y cols., 2007).

e) Metuosis
Esta muerte celular es distinta de otras muertes no apoptóticas, ya que involucra
la macropinocitosis, combinada con defectos en el tráfico de vesículas endociticas
independientes de clatrinas, lo que da como resultado, la presencia de vacuolas
grandes que alteran la integridad de la membrana celular, este tipo de muerte es
llamada metuosis del griego "methuo", que significa “beber hasta la intoxicación” y
se caracteriza por la acumulación de vacuolas grandes llenas de fluido extracelular
originados de macropinosomas. Los efectos de la alta expresión de Ras están
relacionados con la activación de Rac1 y la inactivación de Arf6, dos GTPasas
implicadas en macropinocitosis y en el reciclaje del endosoma, respectivamente
(Chi, S. y cols., 1999). Romero-Hernández y colaboradores (2013) en el
Laboratorio de Investigación en Patología Experimental del Hospital Infantil de
México, Federico Gómez, evaluaron el efecto tóxico de la curcumina en cuatro
líneas celulares de astrocitoma humano, y demostraron que induce una muerte
celular de tipo metuosis. En éste trabajo, no existió evidencia de fragmentación
17

nuclear, ni autofagia en líneas de astrocitoma D54-MG, U373-MG, T98G, y A172
tratadas con curcumina. Se realizó un análisis ultraestructural por microscopía
electrónica de transmisión en todas las células (astrocitos normales y de
astrocitoma) y se demostró la presencia de vacuolas grandes "vacías" o al menos
sin la presencia de organelos celulares como mitocondrias y RE. La evidencia que
se tiene es que la vía H-Ras, no parece participar en la inducción de metuosis en
las líneas tumorales, ya que los experimentos de exposición a la curcumina y en
presencia de varios inhibidores, entre ellos para Rac1, no detienen la inducción de
metuosis (Romero-Hernandez, M. y cols., 2013). La descripción y comprensión de
esta respuesta en las líneas de astrocitoma por efecto de la curcumina aún no es
clara, por lo que es importante continuar con su estudio.

f) Paraptosis
La paraptosis, es una muerte celular programada no apoptótica que se deriva del
griego para= “cerca de” o “relacionada a” y apoptosis, que se acompaña de la
dilatación de la mitocondria y del RE, sin las características apoptóticas de
picnosis (condensación del material genético) en algunos casos, fragmentación del
DNA, o bien, activación de las caspasas. La paraptosis requiere de síntesis de
proteínas y reportes recientes muestran que es inhibida por la expresión de AIP-
1/Alix. Sin embargo, falta por describir mejor los mecanismos asociados a la
paraptosis como las señales responsables de desencadenar la dilatación del RE y
aumentar el volumen de la mitocondria (Mi Jin, Y. y cols., 2012).
Es mediada por la proteína cinasa activada por mitogenos (MAKP) y que puede
ser activada por miembros de la familia TNF como TAJ/TROY y por el receptor del
factor de crecimiento tipo insulina. Es posible inhibir la paraptosis por medio de la
proteína AIP1/Alix, que interactúa con otra relacionada a muerte, ligando de calcio
ALG-2, sugiriendo que este tipo de muerte es totalmente distinta de la apoptosis.
Hasta el momento, existen pocos reportes que describan en más detalle los
mecanismos asociados, en comparación con los otros tipos de muerte celular
programada (Sperandio, S. y cols., 2004; Dai, R. y cols., 2010b; Sperandio, S., de
Belle, I. y Bredesen, D., 2000).
18

La paraptosis se produce durante el desarrollo y la neurodegeneración de
células, se observa en células que son tratadas con agentes anticancerígenos
naturales y sintéticos (Lee, D. y cols., 2016). Se ha informado que el inhibidor de la
síntesis de proteínas cicloheximida (CHX) bloquea la formación de vacuolas
citoplásmicas en la paraptosis y que el RE participa es ésta formación (Wang WG,
2012).

En resumen, eltipo de muerte celular depende de la concentración a la cual se
usa la curcumina y el tipo de célula a la cual se expone. En la Figura 3, se
muestran algunas características generales de los diferentes tipos de muerte
celular, características bioquímicas, morfológicas y un ejemplo de como se
observa una célula ultraestructuralmente con el tipo de muerte específica.

Figura 3. Principales tipos de muerte celular que provoca la curcumina. Se
describen algunas características bioquímicas, morfológicas y ultraestructurales de
los tipos de muerte en diferentes tipos de células. (modificado de Aoki, H. y cols.,
2007; Elmore, S., 2007; Hassan, M. y cols., 2014; Imreh, G. y cols., 2017; Kang,
D. y cols., 2013; Lee, W. y cols., 2015; O’Sullivan-Coyne, G. y cols., 2009).

Estrés de retículo endoplásmico y muerte celular
Algunos tipos de muerte celular que provoca la presencia de la curcumina en las
células neoplásicas, se debe a que afecta la homeostasis de organelos como el
retículo endoplásmico (RE). Por ejemplo, en la paraptosis (muerte celular no
apoptótica) se encuentran vacuolas en el citoplasma de la célula derivadas del
estrés de éste organelo (Wang, WB., y cols.,2012).
El RE se encarga en las células del procesamiento, plegamiento y exportación de
proteínas recién sintetizadas a la vía secretora; también tiene un papel central en
la biosíntesis de lípidos. Además, actúa como un reservorio de calcio intracelular,
20

necesario para varios eventos de señalización. El RE está formado por túbulos
membranosos que continúan la membrana nuclear externa y que se extienden
formando una red a través de todo el citosol. La membrana del RE es el lugar
donde se producen todas las proteínas de transmembrana y la mayoría de los
lípidos de los organelos subcelulares. Casi todas las proteínas secretadas,
además de las destinadas al lumen del Aparato de Golgi o lisosoma, tienen como
primer destino el lumen del RE (Ron, D., 2001).

Las proteínas que residen en el RE tienen una señal de retención, el péptido
señal, compuesta por cuatro aminoácidos en su extremo C-terminal. Muchas de
estas proteínas funcionan como catalizadores, ayudando en el transporte co-
traduccional hacia el RE, o bien en las modificaciones y plegamiento post-
traduccional. En el lumen del RE, las proteínas se ensamblan y oligomerizan, se
forman enlaces bisulfuro y se agregan N-glicosilaciones. Además se produce el
corte del péptido señal y la isomerización de aminoácidos (Ron, D., 2001).
En las células en condiciones de estrés intenso o persistente, el RE puede inducir
apoptosis o diversas formas de muerte celular. Estudios recientes han indicado
que el estrés del RE (ERE) también puede contribuir a la muerte celular
independiente de las caspasas, que se caracteriza por una vacuolación
citoplásmica extensa en las células cancerosas sin la participación de apoptosis o
autofagia. Además, el ERE puede ser desencadenado por diversos estímulos,
como el estrés oxidativo y la alteración de la homeostasis de Ca2+ (Ron, D., 2001).
La producción excesiva de ROS puede interferir con la función RE, causando la
acumulación de grandes cantidades de proteínas mal plegadas y conduciendo a la
respuesta celular del ERE (Ron, D., 2001).

Cuando la capacidad de plegamiento de proteínas del ER se ve alterada o
comprometida, las células sufren una condición llamada ERE y se caracteriza por
proteínas mal plegadas acumuladas en la luz del RE. Se puede afectar la
homeostasis de este organelo al presentar diferentes condiciones, como por
21

ejemplo, carencia de nutrientes, hipoxia, la falta de calcio, la exposición a algunos
compuestos, como la curcumina (Ron, D., 2001; Zheng, M. y cols.,2013).
Para recuperar la capacidad de plegamiento de proteínas el RE de las células
poseen señales altamente conservadas llamadas UPR (Unfolded Protein
Response) cuya función principal es restablecer la homeostasis del RE (Malhi H. y
Kaufman, RJ., 2011).

La respuesta UPR está principalmente controlada por tres sensores
transmembranales del RE; IRE1, PERK y ATF6. En condiciones fisiológicas, la
activación de estos sensores se ve inhibida por la unión en sus dominios luminales
con la chaperona del RE que es BIP/GRP78 (proteína regulada por glucosa 78
kDa). De hecho, BIP establece un equilibrio dinámico entre las proteínas mal
plegadas y que se van a plegar, y los dominios intra-luminales de los tres sensores
de ERE (Figura 4) para estimular la capacidad del RE para controlar las proteínas
mal plegadas. Esta es una adaptación a largo plazo que implica la activación
transcripcional de los genes blanco UPR, incluidos los que funcionan como parte
de la maquinaria de plegado de proteínas del RE (Corazzari, M. y cols., 2017).
Si no se puede restablecer la homeostasis generada en el RE por las proteínas
mal plegadas, se activan genes que provocan la muerte celular, con la finalidad de
proteger al organismo de las fallas en la maquinaria de síntesis de proteínas.

Figura 4. Vías de señalización de UPR. Hay tres sensores de RE que se activan
para detectar proteínas mal plegadas, que se encuentran en la membrana del RE:
ATF6, IRE1 y PERK, que regulan las señales en el RE tras la activación de UPR.
La acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE, secuestran a la
chaperona BIP lejos del dominio luminal de los tres sensores del RE que
conducen a su activación. ATF6 es regulado por proteólisis intramembrana en el
aparato de Golgi para liberar el dominio N-terminal citosólico de 50 kDa
transcripcionalmente activo. El ATF6 cortado se heterodimeriza con el splicing de
XBP1 (sXBP1) para inducir transcripcionalmente varios genes que codifican
chaperonas y proteínas de degradación asociadas a RE (ERAD). IRE1 se
somete a la dimerización, se autofosforila y se activa, posee características de
endoribonucleasa (RNAsa). Escinde el RNAm de la proteína de unión X-box
(XBP1), que luego se une por una ligasa para formar Sxbp1 que codifica un
factor de transcripción que también induce la expresión de proteínas ERAD y
chaperonas. La dimerización y transautofosforilación de PERK prende la actividad
de cinasa, lo que lleva a la fosforilación de la subunidad alfa del factor de iniciación
eucariótico 2 (eIF2) esto lleva a una atenuación de la traducción. La traducción
selectiva de activar (ATF4) se produce después de la fosforilación de eIF2. ATF4
induce la expresión de varios genes que incluyen transportadores de aminoácidos,
chaperonas y CHOP. CHOP también induce la expresión de GADD34, la cual se
asocia con la proteína PP1 para desfosforilar eIF2 en un ciclo de
23

retroalimentación negativa reanudando la traducción. En caso contrario, si la
célula no puede reparar el daño, se activan señales de muerte (modificado de
Malhi, H. y Kaufman, R., 2011).

Los tres sensores de la ERE realizan las siguientes funciones:
IRE1
Es una proteína transmembranal tipo I, que es conservada evolutivamente y está
presente en levaduras y mamíferos. Tiene dos homólogos en mamíferos: uno es
IRE1 expresado de forma ubicua y la otra es IRE1, específico de epitelio
intestinal. Posterior a la ERE, IRE1 tiene la actividad cinasa y endorribonucleasa,
mientras que el papel de IRE1 aún no es claro. Las proteínas mal plegadas en el
RE dificultan la interacción GRP78 e IRE1 que a su vez dimeriza y autofosforila a
IRE1, seguido de la actividad tanto de cinasa como de endorribonucleasa de
IRE1. El dominio de cinasa citosólica de IRE1 recluta a TRAF2 y ASK1, seguido
de la fosforilación de JNK y la posterior activación de reguladores debajo de la vía.
La actividad endoribonucleasa de IRE1 regula el corte y el empalme de la
proteína XBP1 eliminando un intrón de 26 pares de bases y produciendo un factor
de transcripción, s-XBP1, seguido dela activación transcripcional de varios genes
implicados en el plegamiento de proteínas y asociados a degradación. Además
IRE1 activado degrada los RNAm asociados al RE que codifican proteínas
secretadas y de membrana, por medio de un proceso llamado decaimiento
dependiente regulado por IRE1 (Rashid, H. y cols., 2017).

ATF6
Se activa ante el estrés del RE. Es una proteína transmembranal del RE que se
activa posterior a su traslocación del RE al Golgi y la proteólisis por S1P (proteasa
del sitio 1) y luego S2P (proteasa del sitio 2). Después de la escisión, se libera
ATF6-p50 (un fragmento de unión al DNA citosólico) y se transloca al núcleo
donde se une a los elementos de ERE, para amplificar la transcripción de los
genes UPR. Además de su papel como factor de transcripción, ATF6 tiene como
blanco para aumentar la unión de XBP-1 a los elementos de ERE y mejorar la
24

transcripción de los genes necesarios para la respuesta UPR. Por lo tanto, la
función de ATF6 se ha visto relacionado con la supervivencia y muerte celular
(Sanderson, T., Gallaway, M. y Kumar, R., 2015).

PERK
Esta proteína sensor del RE, es la responsable de atenuar la traducción de
proteínas. Posterior al estrés, los monómeros de PERK se homoligomerizan y
trans-autofosforilan para convertirse en un eIF2 cinasa activa. La fosforilación de
la subunidad a del eIF2 impide la tasa de síntesis de proteínas. Además de que
PERK fosforila a eIF2 y disminuye la traducción proteica. La activación de PERK
tiene efectos posteriores. Los RNAm incluido ATF4, se sintetizan debido al
aumento de eIF2(p) mediado de PERK. ATF4 aumenta la transcripción del factor
de muerte CHOP (Sanderson, T., Gallaway, M. y Kumar, R., 2015).

En términos generales, la función principal de la activación de la UPR inducida por
estrés del RE es promover la supervivencia celular y recuperar la homeostasis. Si
el estrés es intenso y persistente hay una alta probabilidad de inducir muerte
celular.

El estrés del retículo endoplásmico y la respuesta UPR pueden ayudar al
tratamiento contra el cáncer
En el caso de tratamientos contra el cáncer, muchos agentes terapéuticos como el
uso de la bleomicina y antraciclinas, toman ventaja de esa respuesta celular para
actuar, pero mucho de ese ERE que provocan, es solamente transitorio.
Por otro lado, se ha encontrado que la curcumina induce la señalización de las
UPR. Por ejemplo, el tratamiento de las células Jurkat (de leucemia linfoide aguda)
con curcumina indujo una respuesta UPR, iniciada por la fosforilación de PERK e
IRE1. Aumentó la expresión de los factores de transcripción asociados al ERE
como XBP-1, y CHOP. Las células presentaron muerte celular por apoptosis,
provocada por una respuesta de ERE excesiva. Por lo tanto, la curcumina puede
25

impactar tanto en el ERE, como en la disfunción de la mitocondria, ya que baja la
expresión de BCL2 (molécula anti-apoptótica) y activa la expresión de pro caspasa
3 (Zheng, M. y cols., 2013).
En células de cáncer cervicouterino expuestas a curcumina, se encontró que hay
un aumento en los sensores de UPR y sus proteínas debajo de la vía, pero esta
respuesta no se encuentra en células de epitelio normal. Se reportó que la
curcumina eleva los niveles de ROS intracelular únicamente en las células de
cáncer cervicouterino y así promueven la apoptosis mediada por ERE (Kim, B. y
cols., 2016).
El estrés del RE es asociado con el alargamiento en el tamaño del RE, que ha
sido interpretado como un mecanismo de adaptación para aumentar la capacidad
de plegamiento de proteínas, pero si éste no se adapta, genera señales de
muerte.
Además de degradar el RNAm, está demostrado que junto con ese cambio en la
morfología del RE, por el ERE, IRE1 también tiene capacidad de degradar la
expresión de los miRNA (Heindryckx F. y cols., 2016).

El estrés del retículo endoplásmico modifica la expresión de reguladores
transcripcionales como los miRNA

En todas las células eucariotas, las condiciones de estrés conducen a un ajuste en
la maquinaria de expresión génica, la cual incluye la disminución en la
transcripción, la inhibición del splicing, la exportación del RNAm al citoplasma y la
atenuación de la traducción dependiente de Cap. Los procesos celulares inducidos
por estrés ponen en duda los mecanismos postranscripcionales de la regulación
de la expresión génica (Friedman RC. y cols., 2009).
Los miRNA son reguladores postranscripcionales implicados en la remodelación
del transcriptoma y tienen impacto en muchos procesos biológicos, comprenden
aproximadamente 1-2% de los genes en gusanos, moscas y mamíferos y por cada
26

miRNA está previsto que puede regular cientos de moléculas blanco, en su
mayoría genes codificadores de proteínas (Friedman, R.C. et al., 2009).
El estrés del RE es de particular interés sobre todo porque los miRNA también
participan en regular esta respuesta. Se ha demostrado que algunos miRNA
regulan directamente los componentes principales de la señalización de UPR. Por
ejemplo, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-199a y miembros de la familia de hsa-miR-30,
suprimen la expresión de la chaperona BIP, uno de los reguladores principales de
la UPR. La endoribonucleasa IRE1 degrada los precursores anti-apoptóticos hsa-
miR-17-5p, hsa-miR34a-5p, hsa-miR-96-5p y hsa-miR-125b-5p, que regulan
negativamente la expresión de caspasa 2. La activación de la cinasa PERK induce
la expresión de hsa-miR-30c-2-3p, que regula negativamente el factor clave de
transcripción XBP1, formando una relación negativa entre las vías PERK e IRE1
de la UPR (Mesitov, M. y cols., 2017).
Por lo tanto se confirma el papel crítico que poseen los RNA no codificantes, como
los miRNA en respuesta al estrés reticular.

Los miRNA, son un grupo de pequeños RNA no codificantes endógenos
conservados de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud, que controlan la
expresión de más de la mitad de los genes codificantes de proteínas responsables
de procesos celulares, como la proliferación y la progresión del ciclo celular,
diferenciación, la respuesta inmune y la muerte celular (Olejniczak M., y cols.,
2018).
La vía canónica de biosíntesis de los miRNA incluye varias etapas. Los miRNA
son transcritos por la RNA polimerasa II para generar moléculas precursoras o pri-
miRNA con un casquete (7-metil-guanosina) en el extremo 5´ y una cola de poli
(A) en el extremo 3´. Estos transcritos primarios se autocomplementan formando
estructuras tallo-asa de aproximadamente 80 nucleótidos de longitud.
Posteriormente, son procesados en el núcleo por un microprocesador que genera
un precursor (pre-miRNA), de aproximadamente 65 nucleótidos, compuesto por la

enzima RNasa III Drosha y DGCR8 (reconoce sitios de corte de Drosha en el tallo
de pri-miRNA) dando origen al pre-miRNA. Después del procesamiento en el
núcleo, los pre-miRNA son reconocidos por un factor nuclear de exportación
(Exportina-5) que junto con la proteína GTP forman un complejo de transporte
nuclear que lleva a los pre-miRNA al citoplasma a través de los poros nucleares.
En el citoplasma son reconocidos y procesados por la enzima RNasa III Dicer, la
cual corta el tallo y el asa del pre-miRNA para generar un RNA dúplex formado por
una cadena de miRNA maduro y una cadena de miRNA complementaria de
aproximadamente 22 nucleótidos (Ma, C. y Liu, Y., 2013).
Después de la incorporación en un complejo silenciador, que contiene un
componente catalítico en su núcleo una proteína Argonauta (AGO), un miRNA
reconoce las secuencias complementarias y puede emparejarse de manera
imperfecta a su objetivo, localizado principalmente en 3´UTR, lo que lleva a la
represión de la traducción y/o degradación de la transcripción por quitarle el
casquete o deadenilación. Los miRNA reconocen sus objetivos principalmente por
su secuencia semilla: en losnucleótidos 2-8 del extremo 5´del miRNA. (Ma, C. y
Liu, Y., 2013; Olejniczak M. y cols., 2018) (Figura 5). También se ha reportado que
regulan por la unión a la zona 5´UTR o en la región codificante de un RNAm.
Además, los miRNA podrían cambiar de supresión a la activación de la traducción
de la molécula blanco. Se ha demostrado que el núcleo está enriquecido de
miRNA y se sugiere que pueden modular la expresión génica a nivel
transcripcional. Esto revela que el mecanismo en que los miRNA regulan la
expresión de genes es complicado en metazoarios (Zhang Y. y cols., 2014)
La vía no canónica en la que funcionan los miRNA, puede ser que alguno de ellos
se agrupen transcriben/procesan juntos; los pri-miRNA intrónicos (mirtrons) son
independientes de Drosha y son liberados por el spliceosoma; algunos miRNA
pueden ser procesados independientemente de Dicer con el uso de Ago2 que
puede romper precursores de miRNA y producir miRNA maduros; los agotrons
escapan por completo de la ruta de la biogénesis convencional y se asocian con
proteínas Ago (Hansen T. y cols., 2016).

Figura 5. Biogénesis de los miRNA. Los miRNA se generan a partir de un pre-
miRNA, que a su vez se genera a partir de un transcrito primario (pri-miRNA). Los
miRNA pueden llevar a cabo por ejemplo, el silenciamiento de la expresión génica
y se puede dar de tres formas diferentes: 1. inhibición al inicio de la traducción; 2.
represión traduccional pos-inicio, y 3.desestabilización del RNAm blanco a través
de un proceso de desadenilación.

Los miRNA como reguladores de los procesos biológicos.
Los genes de los miRNA están generalmente en regiones intergénicas, pero
también pueden estar presentes en regiones exónicas e intrónicas, en todos los
cromosomas humanos (Phuah, N. y Nagoor, N., 2014). Los miRNA, constituyen
aproximadamente un 1% de los genes en los organismos, como nemátodos,
moscas, mamíferos, plantas, hongos y virus (Zhang, J. y cols., 2014).
Se han identificado las funciones de regulación de los miRNA y se ha visto que no
solo participan en el desarrollo embrionario, la diferenciación celular, proliferación
y apoptosis, sino también en la tumorigénesis y las interacciones hospedero-
patógeno (Zhang, J. y cols., 2014).
Aunque una gran cantidad de genes de miRNA están distribuidos en el genoma,
hay algunos agrupados que se coexpresan como unidades policistrónicas que
pueden tener relaciones funcionales. Además, más de la mitad de los miRNA
29

residen en intrones de genes del hospedero y coexpresan con sus secuencias
codificadoras de proteínas vecinas, y algunos pueden derivar de las
transcripciones primarias comunes e incluso compartir los mismos promotores.
Sin embargo, un número importante de genes de los miRNA vienen de las
regiones que son distales de secuencias codificadoras de proteínas y
probablemente se derivan de unidades de transcripción independiente con sus
propios promotores (Cai, Y. y cols., 2009).
Existe una relación funcional entre la señalización de UPR-ERE y la expresión de
los miRNA que ha revelado lo complejo que es la regulación de la homeostasis de
proteínas y no solo tiene relación con la biogénesis de los miRNA, se ha
encontrado que la maquinaria se localiza en la proximidad del RE, también se
demostró que la expresión de los miRNA regula y se regula mediante la
señalización de UPR del RE (Maurel, M. y Chevet, E., 2013).
La relocalización de la proteína argonauta (AGO) en gránulos de estrés sobre el
RE estresado y la alteración del patrón de expresión de miRNA cuando las células
están bajo estrés el RE no es normal. La mayoría de las proteínas AGO se
distribuyen difusamente en el citoplasma bajo condiciones basales, mientras que,
después del estrés de RE, AGO se acumula de manera puntuada dentro de
estructuras conocidas como gránulos de estrés. Estos gránulos son
macroestructuras citoplásmicas dinámicas que agregan complejos de
RNAm/Proteína detenidos por la traducción y específicamente formados en
respuesta a las condiciones de estrés. La composición de estos gránulos no está
bien conocida. Sin embargo, poseen complejos de pre-iniciación detenidos,
subunidades ribosómicas, diversos inhibidores de estabilidad/traducción de
RNAm, miRNA y proteínas AGO (Maurel, M. y Chevet, E., 2013).

JUSTIFICACIÓN
El glioblastoma, es el tumor primario más frecuente en adultos y representa un
grupo altamente heterogéneo de neoplasias que se encuentra entre las más
agresivas y difíciles de tratar.
Uno de los mejores modelos experimentales para estudiar a los glioblastomas, es
el uso de modelos in vitro, en los que se pueden usar líneas celulares derivadas
de los tumores y en los cuales se pueden encontrar respuestas que nos permitan
determinar los efectos y analizar el comportamiento de las células neoplásicas
ante la presencia de algunos compuestos.
En ese sentido, se ha evaluado el efecto que producen los productos naturales,
como la curcumina, en diferentes tipos de células de cáncer, incluyendo el
glioblastoma y se ha encontrado que ejerce efectos antineoplásicos importantes.
Cabe señalar, que la respuesta celular in vitro a la curcumina no es homogénea
ya que depende de la concentración que se use y del tipo celular a la cuál esté
expuesta.
Por lo anterior, es importante detallar el tipo de efecto y muerte de la línea celular
de glioblastoma humano A172, mediante dosis controlada de curcumina para
entender el mecanismo de acción, lo cual puedes ser útil a largo plazo para
controlar la progresión y crecimiento del glioblastoma.

HIPÓTESIS
La administración de curcumina a la concentración inhibitoria 50 (CI50) establecida,
provocara muerte celular de la línea celular de gliolastoma A172. Por lo que, los
daños morfológicos, fisiológicos, así como la expresión diferencial de genes y de
miRNA nos permitirán identificar el tipo de muerte que provoca.

OBJETIVO GENERAL
Evaluar a nivel morfológico y molecular la muerte celular inducida por la curcumina
en la línea celular A172 de glioblastoma humano.

OBJETIVOS PARTICULARES
1. Establecer la CI50 de curcumina en células A172 de glioblastoma.
2. Evaluar el efecto morfológico y el tipo de muerte celular que provoca la
exposición a la curcumina en las células A172.
3. Evaluar la respuesta molecular de la ERE por efecto de la curcumina en las
células A172.
4. Determinar el patrón de expresión de los miRNA en las células A172 en
respuesta a la exposición a la curcumina.
5. Analizar las vías que se modifican por efecto de la expresión diferencial de
los miRNA después de la exposición a curcumina.

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL.

Figura 6. Esquema general de trabajo.

Análisis morfológico
(Gíemsa-MET)
Línea celular A 172 de
glioblastoma humano
OH (Vehículo) Curcumina
CI50 (MTT-azúl trípano)
Extracción RNA
(Trízol-RIN)
Arreglos de Baja
Densidad miRNAs
miRNAs modificados
Análisis de muerte
celular
(RT-qPCR,Colorantes
fluorescentes)
Extracción proteína
(M-PER)
WB
Selección In silico vías de señalización de interacción IPA
33

METODOLOGÍA
MATERIAL BIOLÓGICO
La línea celular de glioblastoma humano A172 se obtuvo de la colección del ATCC
(American Type Culture Collection, EUA). El crecimiento de las células se realizó
en medio Eagle modificado Dulbecco-F12 1:1 (DMEM:F12) (In vitro S.A., México),
suplementado con aminoácidos no esenciales al 1% (In vitro S.A., México),
penicilina/estreptomicina al 1% (In vitro S.A., México) y 10% de suero fetal bovino
(Biowest, México) . Los cultivos celulares se incubaron a 37ºC en una atmósfera
húmeda y con 5% de CO2.

EXPOSICIÓN A CURCUMINA Y ENSAYO DE VIABILIDAD CELULAR.
Las células se expusieron a cuatro concentraciones diferentes de curcumina
(Sigma-Aldrich):20, 50, 70 y 100 μM, disueltas en etanol al 0.5%. Las células
control se expusieron a etanol al 0.5% (vehículo).
La Concentración Inhibitoria 50 (CI50) de la curcumina sobre las células se
determinó a continuación mediante el ensayo de viabilidad de bromuro de Tiazolil
Blue Tetrazolium (MTT) (Sigma, EUA). Se incubaron placas de 96 pozos con
10,000 células durante 21 h a 37 ° C bajo humedad y 5% de CO2. Después, se
añadieron 20 μl de MTT a una concentración de 5 mg/ml en PBS a los cultivos,
que se incubaron durante 3 h bajo oscuridad a 37ºC y CO2 al 5%. A continuación,
se eliminó el medio y se añadieron 100 μl de isopropanol ácido para disolver las
sales de formazán resultantes. Después de 5 min, la concentración del producto
se cuantificó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm restando
el valor medido a 650 nm. Se realizaron un total de 3 ensayos biológicos
independientes, utilizando las mismas condiciones experimentales.

Para verificar la permeabilidad de la membrana de las células expuestas a 50 μM
de curcumina (CI50 en el ensayo de MTT), se realizó la prueba de exclusión de
azul de tripano (Bio Whittaker Reagents, EUA). Las células se separaron con
tripsina-verseno (In vitro, S.A., México), se centrifugaron y se resuspendieron en
34

50 μl de medio con 50 μl de colorante de azul de tripano. Posteriormente, se
cuantificaron las células con daño a la membrana (células que permiten el paso
del colorante) y las que no, en una cámara de Neubauer.
Para determinar el porcentaje de células dañadas, se utilizó la siguiente formula:
(Número de células vivas (blancas) totales) ÷ (Número de células Totales
[blancas+azules]) × 100.

TINCIÓN CON GIEMSA, EVALUACIÓN DE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS
INDUCIDOS POR CURCUMINA.
Una vez que se obtuvo la CI50, se sembraron 60,000 células en cajas de cultivo de
35 mm con cubreobjetos estériles y se expusieron a 50 μM de curcumina, las
células de control se expusieron a una solución de etanol al 0.5% y medio de
cultivo solo. Las placas se incubaron durante 24 h a 37ºC en las mismas
condiciones descritas anteriormente. Después de 24 h de incubación con los
diferentes tratamientos, se retiró el medio de cultivo, se lavaron las células con
una solución salina al 0.9% y después se fijaron con metanol absoluto frío durante
5 min. El metanol se retiró y las muestras se dejaron secar antes de la tinción con
una solución de colorante de tinción Giemsa al 0.4% (Sigma diagnostic, EUA)
durante 20 min a temperatura ambiente. Se eliminó el colorante, los cubreobjetos
se lavaron con agua corriente y se montaron con resina. Las imágenes fueron
obtenidas en un microscopio NIKON E-600.

EXPOSICIÓN DE LAS CÉLULAS A INHIBIDORES DE LA PARAPTOSIS.
Las células crecidas en el cubreobjetos se expusieron al inhibidor de la síntesis de
proteínas cicloheximida CHX (Sigma, EUA) (Bury, M., y cols., et al. 2013; Kim, S. y
cols., 2014) a una concentración de 40 μm durante 2 h antes de la exposición a 50
μM de curcumina durante 24 h. Por otro lado, las células en el cubreobjetos se
expusieron al inhibidor de MEK PD98059 (Sigma Chemical, EUA) (Sperandio, S. y
cols., 2004) 1 h antes de la exposición a 50 μM de curcumina durante 24 h.
Posteriormente, las células fueron teñidas con Giemsa como se describió en la
sección anterior.
35

ANÁLISIS ULTRAESTRUCTURAL DE LAS CÉLULAS TRATADAS CON
CURCUMINA.
El análisis ultraestructural se realizó mediante microscopía electrónica de
transmisión (MET). Las células expuestas a 50 μm de curcumina durante 24 h y al
vehículo, se despegaron con tripsina-verseno, se centrifugaron, y las células
fueron fijadas en glutaraldehído al 2.5% (Electron Microscopy Science, EMS, EUA)
durante 90 min, se lavaron con regulador de cacodilatos y se fijaron con tetraóxido
de Osmio (OsO4) al 1% (Polysciences, EUA) durante 1 h. A continuación se
lavaron con regulador de cacodilato y se deshidrataron mediante cambios
graduales de etanol. Después de la deshidratación, las células se incluyeron en
resina Epon (Embed-812, EMS, EUA) y se polimerizó a 60ºC durante 48 h. Se
obtuvieron secciones ultrafinas de 60 nm en rejillas de cobre. Las rejillas se tiñeron
con acetato de uranilo al 4% y citrato de plomo al 0.35% y se examinaron con un
microscopio electrónico de transmisión JEOL 1010. Se tomaron imágenes digitales
con una cámara de Hamamatsu para el análisis ultraestructural de los cambios
morfológicos observados.

MEDICIONES DEL POTENCIAL DE MEMBRANA (m) DE LAS
MITOCONDRIAS Y DEL RETÍCULO ENDOPLÁSMICO.
Las células se cultivaron sobre cubreobjetos circulares de 22 mm durante 24 h y
posteriormente, se expusieron a la curcumina y luego se cargaron con un medio
de tinción compuesto de; NaCl 156 mM; KCl 3 mM; Mg2SO4 2 mM; KH2PO4 1.25
mM; 10 mM de D-Glucosa; CaCl2 2 mM; Hepes 10 mM; con pH 7.3 a 7.4 que
contiene 25 nM tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM: Invitrogen,
EUA) para m y 1 M de ER-Tracker Green (Invitrogen, EUA) durante 30 min a
temperatura ambiente. Después de 30 min, las células se lavaron con la misma
solución salina que contenía TMRM 25 nM. Las imágenes se registraron utilizando
un microscopio confocal Zeiss Axiovert 100M con una lente objetivo de inmersión
de aceite Plan-Neofluar × 63/1.25 a TA. La fluorescencia de TMRM se excitó a
543 nm y del ER-Tracker Green a 488 nm de longitud de onda láser. Las
36

imágenes se analizaron usando el programa de Image J. El porcentaje de la
proporción del citoplasma (teñidas con ER-Tracker verde) y el ocupado por la red
mitocondrial (teñido con TMRM) se calcula a partir de la medición de zona de
ambas imágenes, calculando el área que ocupan en el citosol.
A partir de estos ensayos se usó en exposiciones independientes a la curcumina,
un estresor positivo de RE, llamado tunicamicina. Las células A172 fueron
expuestas a éste compuesto a una concentración final de 2 M durante 24 h.

EXTRACCIÓN DE RNA TOTAL DE LAS CÉLULAS EXPUESTAS A
CURCUMINA
Se sembraron 60,000 células por tratamiento y se despegaron con
tripsina:verseno al 1% en solución salina y se centrifugaron a 1,200 rpm durante 5
min. El "botón" celular obtenido se lavó con solución salina. Las células fueron
homogenizadas en Trizol (Gibco BRL, EUA) y se centrifugaron a 12,000 rpm
durante 10 min a 4˚C, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio, se incubó por
5 min a temperatura ambiente, posteriormente se agregaron 40 l de cloroformo y
se mezcló. Se centrifugaron a 12,000 rpm, durante 15 min a 4˚C y la fase acuosa
se transfirió a un tubo nuevo. Posteriormente, el RNA se precipitó con 100 l de
isopropanol frío y se incubó a -20˚C toda la noche. Finalmente, se centrifugaron a
12,000 rpm durante 10 min a 4˚C, el RNA se lavó con etanol al 70% en H2O-DEPC
y se resuspendió en 12 l de H2O-DEPC. Las muestras fueron tratadas con
DNAsa (Thermo, Scientific, EUA). Las muestras fueron cuantificadas y se analizó
el grado de pureza en un espectrofotómetro (NanoDrop).
Se realizó la síntesis de cDNA con una enzima transcriptasa reversa M-MuLV (20
U/l) usando 200 ng de RNA total (Thermo Scientific, EUA). Las reacciones
fueron incubadas por 60 min a 37 °C y por 5 min a 70°C.
Se realizó la RT-qPCR con Maxima SYBR Green qPCR Master mix (Thermo
Scientific, EUA), en un termociclador (Agilent Technologies, Stratagene Mx3005P,
EUA), con SYBR Green como colorante de amplificador y ROS como colorante
pasivo. Se usó el algoritmo 2-Ct para cuantificar la expresión relativa de los
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genes. Los oligos de genes sensores de estrés de RE que se usaron y las
secuencias fueron las siguientes:

OLIGONUCLEÓTIDO FORWARD 5´-3´ REVERSE 5´-3´
CHOP CCTATGTTTCACCTCCTGGA CAGCCAAGCCAGAGAAGCA
IRE1 GCAGGTCCCAACACATGTG TCTTGCTTCCAAGCGTATACA
PERK TACATATGGACTCAGTGCATAT CGTCACTATCCCATTGGCG
ATF6 CAGACATTTGGGACATCAAC TGACCGAGGAGACGAGACT