Caracterizacion-cinetica-y-estructural-de-la-nitrilasa-de-rhodococcus-pyridinovorans

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
Caracterización cinética y estructural de la nitrilasa 
de Rhodococcus pyridinovorans 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGO 
 P R E S E N T A : 
 
ALEJANDRO EVARISTO CÁLIZ RODRÍGUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: 
 
DRA. GEORGINA GARZA RAMOS MARTÍNEZ 
 
2015 
 
 
 
Lourdes
Texto escrito a máquina
Ciudad Universitaria, D. F.
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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I 
 
Hoja de datos del jurado 
1.Datos del alumno 
Cáliz 
Rodríguez 
Alejandro Evaristo 
36828463 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
305287348 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Georgina Regina 
Garza Ramos 
Martínez 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Claudia Andrea 
Segal 
Kischinevzky 
 
4. Datos del sinodal 2 
M. en C. 
Suri Karina 
Martínez 
Yee 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dra. 
Tatiana 
Fiordelisio 
Coll 
 
6. Datos del sinodal 4 
Dr. 
Ismael 
Bustos 
Jaimes 
 
7.Datos del trabajo escrito. 
Caracterización cinética y estructural de la nitrilasa de Rhodococcus pyridinovorans 
68p 
2015 
 
II 
 
TABLA DE CONTENIDO 
Agradecimientos ..................................................................................................................... V 
Abreviaturas ........................................................................................................................... VII 
Resumen ............................................................................................................................... VIII 
1 Introducción ...................................................................................................................... 1 
1.1 Enzimas y biocatálisis .................................................................................................................................1 
1.2 Los nitrilos y las nitrilasas en la naturaleza ................................................................................................2 
1.3 Plegamiento y sitio catalítico de la superfamilia de las nitrilasas ..............................................................5 
1.4 Nitrilasas (E.C.3.5.5.1).................................................................................................................................6 
1.5 Mecanismo catalítico ..................................................................................................................................7 
1.6 El papel biológico de las nitrilasas ..............................................................................................................8 
2 Antecedentes .................................................................................................................... 9 
3 Justificación .................................................................................................................... 11 
4 Objetivos .......................................................................................................................... 11 
4.1 General .................................................................................................................................................... 11 
4.2 Particulares .............................................................................................................................................. 11 
5 Metodología ..................................................................................................................... 12 
5.1 Transformación de células competentes ................................................................................................ 12 
5.2 Purificación de plásmidos de DNA ........................................................................................................... 12 
5.3 Diseño de mutantes................................................................................................................................. 12 
5.3.1 Extracción y purificación del gen nitA ............................................................................................. 13 
5.3.2 Amplificación del gen nitA incorporando los sitios de restricción .................................................. 13 
5.3.3 Subclonación.................................................................................................................................... 16 
5.4 Crecimiento de las células y sobreexpresión de las proteínas ................................................................ 16 
5.4.1 Cultivo en medio sólido. .................................................................................................................. 16 
5.4.2 Precultivo. ........................................................................................................................................ 17 
5.4.3 Cultivo. ............................................................................................................................................. 17 
5.4.4 Sobreexpresión. ............................................................................................................................... 17 
5.4.5 Cosecha de células. .......................................................................................................................... 17 
5.4.6 Fragmentación celular. .................................................................................................................... 17 
5.4.7 Centrifugación. ................................................................................................................................ 17 
III 
 
5.5 Purificación de las proteínas recombinantes .......................................................................................... 18 
5.5.1 Purificación de la nitrilasa silvestre ................................................................................................. 18 
5.5.1.1 Precipitación con sulfato de amonio ........................................................................................... 18 
5.5.1.2 Cromatografía de exclusión molecular ........................................................................................ 18 
5.5.1.3 Cromatografía de intercambio aniónico ..................................................................................... 18 
5.5.2 Purificación de las nitrilasas con etiquetas de histidina. .................................................................19 
5.5.2.1 Nitrilasa Nit-CHis .......................................................................................................................... 19 
5.5.2.2 Nitrilasa Nit-NHis ......................................................................................................................... 19 
5.5.2.2.1 Lavado de cuerpos de inclusión ............................................................................................ 20 
5.5.2.2.2 Ensayos de renaturalización .................................................................................................. 20 
5.5.2.2.3 Renaturalización en presencia de arginina ........................................................................... 20 
5.5.2.2.4 Corte de la etiqueta de histidinas ......................................................................................... 21 
5.6 Determinación del estado oligomérico ................................................................................................... 21 
5.6.1 Cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) .............................................................................. 21 
5.6.2 Dispersión dinámica de luz (DLS) ..................................................................................................... 22 
5.7 Medición de actividad ............................................................................................................................. 22 
6 Resultados ....................................................................................................................... 24 
6.1 Construcción de las variantes de la nitrilasa de R. pyridinovorans ......................................................... 24 
6.2 Purificación de la nitrilasa Nit-NHis ......................................................................................................... 26 
6.3 Purificación de la nitrilasa Nit-NHis a través de una columna de afinidad de níquel ............................. 28 
6.4 Ensayos de renaturalización .................................................................................................................... 30 
6.5 Corte de la etiqueta de histidinas ............................................................................................................ 30 
6.6 Purificación de la nitrilasa Nit-CHis ......................................................................................................... 32 
6.7 Purificación de la Nit-CHis por una columna de afinidad a níquel .......................................................... 32 
6.8 Actividad de las mutantes con BZCN ....................................................................................................... 34 
6.9 Caracterización cinética de la nitrilasa de R. pyridinovorans .................................................................. 35 
6.9.1 Actividad dependiente de la concentración de enzima .................................................................. 35 
6.9.2 Actividad de la nitrilasa con diferentes sustratos. .......................................................................... 37 
6.9.3 Ensayo de termoactividad de la nitrilasa de R. pyridinovorans ....................................................... 38 
6.10 Estado oligomérico .................................................................................................................................. 38 
7 Discusión ......................................................................................................................... 42 
IV 
 
8 Conclusiones .................................................................................................................. 52 
9 Perspectivas .................................................................................................................... 53 
10 Bibliografía ................................................................................................................... 54 
11 Anexo ............................................................................................................................ 59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
V 
 
Agradecimientos 
 Personales 
Quiero comenzar estas líneas agradeciendo a quienes han sido la principal motivación y 
motor en mi vida, mi familia. En particular a mis padres, quienes son la piedra fundamental 
para ser quien soy, por lo que les doy las gracias por todos los momentos que he pasado a su 
lado, tantos buenos como malos, por su amor, cariño, comprensión, consejos, así como sus 
regaños, además por las incalculables horas de esfuerzo y desvelo, para llevar el sustento a 
casa, no saben cuan orgulloso me siento de ser su hijo y les he de confesar que me faltará 
vida para agradecerles y retribuirles por todo lo que me han dado. A mis hermanas, una quien 
fue mi compañera de juegos e infancia, gracias por hacerme creer en mí mismo, y a mi 
hermanita por darme esa ese impulso extra para superarme cada día y poder ser ejemplo 
para ti en esta vida. A mis tías, tíos, primos y primas que son una parte esencial de mi 
persona, ¡gracias! por las palabras de aliento y soporte, así como por estar cuando más los he 
necesitado. 
Y dado que no quiero excluir a nadie, de manera general me dirijo a mis amigas y amigos, los 
cuales han sido la familia que elegí, con quienes he pasado momentos de grandes alegrías, 
invaluables experiencias de vida y temerarias aventuras, además de que me han apoyado con 
sus palabras y acciones en los pasajes más tristes de quien les escribe, no saben cuánto les 
agradezco por honrarme con su compañía y amistad, créanme cuando les digo que de cada 
uno de ustedes he aprendido mucho, y que estén donde estén siempre tendrán mi amor 
fraternal. 
A todos los maestros y profesores que he conocido a lo largo de toda mi formación 
académica, que me mostraron que la búsqueda de una sólida preparación, un buen juicio y 
criterio, guiados por la curiosidad y el hambre de aprendizaje, son algo que jamás debo 
olvidar. Y que como ellos, la transmisión y generación de conocimiento, así como motivar el 
interés en quien nos escucha, es algo que debe ser una constante en nuestra vida. Y aunque 
solo es la punta del iceberg, quiero darle las gracias especialmente a la Dra. Georgina Garza, 
por haberme abierto las puertas del Laboratorio de Fisicoquímica e Ingeniería de Proteínas, 
donde en estos años he aprendido mucho de usted, tanto en el ámbito académico como 
VI 
 
personal, gracias por haber forjado las bases para poder ser un científico del cual usted pueda 
sentirse orgulloso. 
En memoria a esos seres queridos que por giros de la vida ya no están con nosotros 
físicamente, pero en cada pensamiento, obra y acción se hacen presente con sus enseñanzas 
y consejos, por lo que su esencia y recuerdo siempre estarán a mi lado. Amigo Aldo siempre 
serás el colibrí de plumas de mil colores; abuela… mí querida “abuelita” gracias por darme tu 
cariño, amor y comprensión, pero sobre todo por alentárteme a ser mejor persona cada día. 
 Institucionales 
Esta tesis se realizó bajo el apoyo en becas para el alumno Alejandro Evaristo Cáliz 
Rodríguez de los siguientes programas institucionales: 
a) Programa Nacional de Becas para la Educación Superior (PRONABES). 
b) Apoyo por parte del CONACyT, de marzo del 2011 a febrero del 2012, con número de 
referencia del proyecto: CB-2008/99857. 
c) Al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica 
(PAPIIT), con número de proyecto: I-N216413-2 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VII 
 
Abreviaturas 
BCA: ácido bicinconínico 
BZCN: benzonitrilo 
CDH: cianuro dihidratasas 
CH: cianuro hidratasas 
DLS: dispersión dinámica de luz 
DMSO: dimetilsulfóxido 
DO: densidad óptica 
DTT: dithiotheitol 
EDTA: ácido etildiaminotetraacético 
EtBr: bromuro de etidio 
GndHCl: cloruro de guanidinio 
HCN: ciaunuro 
His-tag: etiqueta de histidinas 
HPLC:cromatografía liquida de alta eficiencia 
IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido 
Met: metionina 
MWCO: Peso molecular de corte 
Nit-NHis: nitrilasa con la etiqueta de histidinas en el amino-terminal 
Nit-CHis: nitrilasa con la etiqueta de histidinas en el carboxilo-terminal 
NH4+: ión amonio 
PCR: reacción en cadena de la polimerasa 
PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo 
rpm: revoluciones por minuto 
SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato 
STOP: codón de término o de paro 
TRIS HCl: tris (hidroximetil) aminometano clorhídrico 
VIII 
 
 
Resumen 
Las nitrilasas catalizan la hidrólisis directa de nitrilos orgánicos a sus correspondientes ácidos 
carboxílicos y la liberación de amonio. Las nitrilasas junto con las cianuro dihidratasas se agrupan en 
una sola familia conocida como Nitrilasa/Cianuro Hidratasa, la cual pertenece a su vez a la 
superfamilia Nitrilasa que agrupa en trece ramas distintas a las hidrolasas carbono-nitrógeno, cuyos 
miembros catalizan reacciones hidrolíticas de enlaces carbono-nitrógeno no peptídicos. Las distintas 
enzimas comparten significativa homología estructural, a pesar de las grandes variaciones en sus 
secuencias. Las estructuras cristalográficas de once homólogos distantes de las nitrilasas, 20 % de 
homología, sugieren que este grupo de enzimas poseen una triada catalítica Glu-Lys-Cys, y una 
conformación multimérica que presenta en su plegamiento un motivo estructural único formado por 
cuatro capas alfa-beta-beta-alfa (αββα sándwich). 
El objetivo del presente trabajo fue implementar un sistema de purificación que permitiera obtener a la 
nitrilasa de Rhodococcus pyridinovorans cepa V51B en cantidades óptimas y con alta pureza. Se 
empleó un sistema de purificación basado en la adición de residuos de histidinas (“His-tagging”), ya 
fuera integrándolos en el extremo amino o en el carboxilo terminal, en las variantes Nit-NHis y Nit-
CHis, respectivamente. Dado que hasta el momento no se cuenta con la estructura cristalográfica de la 
proteína, la localización de los extremos dentro del monómero y del oligómero funcional, así como, los 
efectos de la integración de las etiquetas de histidinas eran desconocidos. 
A pesar de que para ambas variantes, Nit-NHis y Nit-CHis, se obtuvo una buena expresión, no fue 
posible purificarlas por columnas de afinidad por níquel. En el caso de NitHis-N encontramos que la 
proteína forma cuerpos de inclusión y no se repliega después de extraerla desnaturalizada de la 
fracción insoluble. Mientras que, NitHis-C aun cuando se obtiene de forma soluble no se pega a la 
columna de afinidad por níquel, ya que la etiqueta de histidinas se encuentra al parecer oculta. La 
actividad no se modificó por la presencia de los residuos de histidina en el C-terminal. 
La nitrilasa silvestre se purificó por métodos convencionales: filtración molecular e intercambio iónico. 
A partir de la enzima pura se realizaron estudios hidrodinámicos para determinar su estado 
oligomérico. Se encontró que la nitrilasa de R. pyridinovorans, es un dodecámero de 480 KDa, con un 
tamaño de partícula de 15-17 nm de diámetro. Se observó que a bajas concentraciones de proteína 
hay una inactivación o disociación del oligómero funcional. La enzima es activa en un rango amplio de 
temperatura, 45 a 65°C, así como para diferentes nitrilos, tanto alifáticos como aromáticos. 
1 
 
1 Introducción 
1.1 Enzimas y biocatálisis 
Las enzimas son proteínas que catalizan miles de reacciones bioquímicas en procesos como 
la digestión, la captura de energía y la biosíntesis. Estas moléculas tienen propiedades 
notables. Por ejemplo, pueden aumentar la velocidad de reacción por factores comprendidos 
entre 106 y 1012 [1]. Pueden catalizar a su sustrato en condiciones de reacción suaves, es decir 
a temperaturas menores de 100°C, a una atmosfera de presión y a pH cercano a la 
neutralidad, dado que disminuyen la energía de activación necesaria para que se lleve a cabo 
una reacción en determinada dirección al estabilizar intermediarios de reacción [2]. 
 
Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan, las cuales pueden ser 
oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Esto es la base de la 
clasificación enzimática internacional, la cual asigna nombres y números de clasificación. En 
ocasiones la actividad de la enzima puede estar sujeta a la presencia de cofactores o 
coenzimas, los que sí se encuentran unidos covalentemente a la enzima se les da el nombre 
de grupos prostéticos. Cuando la enzima está en presencia de su cofactor o coenzima se le 
da el nombre de holoenzima, o de lo contrario es denominada apoenzima o apoproteína [3]. 
 
Hay que decir que las enzimas exhiben un grado de especificidad muy grande, tanto respecto 
a las identidades de sus sustratos como de sus productos, mayor que los catalizadores 
químicos; es decir raramente las reacciones enzimáticas generan productos colaterales [2]. 
Esta especificidad en los productos generados así como el control que se puede tener de la 
catálisis enzimática durante la reacción, ajustando parámetros tales como la concentración de 
enzima, la temperatura, el tipo de sustrato, etc., hacen que las enzimas constituyan un grupo 
particularmente importante de proteínas de interés biotecnológico, en particular por su amplio 
potencial de aplicaciones para la industria química, alimenticia y farmacéutica, que en 
conjunto es conocida como el área de la biocatálisis, la cual es más amigable con el medio 
ambiente, ya que generan desechos poco o nada tóxicos. 
 
2 
 
1.2 Los nitrilos y las nitrilasas en la naturaleza 
Los nitrilos son compuestos orgánicos que poseen un triple enlace carbono-nitrógeno. Están 
representados en la naturaleza por: cianoglucósidos y cianolípidos en las plantas, los 
aminonitrilos y las cianhidrinas en los hongos y mandelonitrilos en los artrópodos, así como 
por una variedad de nitrilos que se encuentran en microorganismos [4]. Por otro lado, la 
industria química hace uso amplio de varios nitrilos para fabricar una gran variedad de 
polímeros y otros productos químicos; por ejemplo, precursores requeridos para la producción 
de poliacrilonitrilo y polímeros derivados del nylon. Los nitrilos son importantes intermediarios 
en la síntesis orgánica de aminas, amidas, ácidos carboxílicos, ésteres, aldehídos, cetonas y 
compuestos heterocíclicos. Algunos de estos productos se usan como disolventes, 
conservadores e intermediarios en la síntesis de fármacos. 
 
La mayoría de los nitrilos son compuestos altamente tóxicos y suelen no ser biodegradables. 
Debido a que algunos microorganismos pueden utilizar nitrilos como fuentes de carbono y/o 
nitrógeno, la degradación bacteriana ha sido considerada como una eficiente forma de 
eliminar nitrilos contaminantes del ambiente. En estos microorganismos, diferentes enzimas 
participan en el metabolismo de los nitrilos, que involucra su oxidación, reducción y/o 
hidrólisis. 
 
Por otro lado, la hidrólisis química de los nitrilos requiere de condiciones drásticas de 
reacción, por ejemplo, ácido sulfúrico 4 a 6 M a reflujo por varias horas, lo que lleva a la 
formación de productos no deseados y a la generación de grandes cantidades de residuos y 
productos colaterales[5]. Por lo que la quimio-selectividad de la hidrólisis enzimática de nitrilos 
representa una alternativa biocatalítica valiosa ya que se produce a temperatura ambiente y 
pH fisiológico. Diversas reacciones catalizadas por enzimas que metabolizan nitrilos, tienen en 
la práctica rendimientos importantes a gran escala o el potencial para alcanzar un buen 
rendimiento a nivel industrial. El éxito de organismos convertidores de nitrilos, tales como 
Rhodococcus sp. N-774, Pseudomonas chlororaphis B23 y R. rhodochous J1, en la 
producción industrial de acrilamida y las síntesis de nicotinamida y ácido nicotínico,respectivamente, han demostrado la viabilidad comercial de estas enzimas. Esto ha llevado 
3 
 
en los últimos años, a la búsqueda de nitrilasas bacterianas con propiedades que puedan 
servir como sistemas biocatalizadores de la hidrólisis de nitrilos[6]. 
 
La degradación microbiológica de los nitrilos procede a través de dos rutas enzimáticas, 
evolutivamente distintas: el de la nitrilasa y el de la nitrilo hidratasa-amidasa. Las nitrilasas 
(EC 3.5.5.1) catalizan la transformación directa de nitrilos orgánicos a sus correspondientes 
ácidos carboxílicos y la liberación de amonio. La hidrólisis del nitrilo es catalizada también por 
la acción concertada de una nitrilo hidratasa (EC 4.2.1.84), que produce un intermediario 
amida y de una amidasa (EC 3.5.1.4), la cual completa la transformación al ácido carboxílico 
correspondiente (ver fig. 1) [7]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La hidrólisis del cianuro (HCN), el nitrilo más sencillo, es catalizada por otro grupo de enzimas 
específicas, las cianuro dihidratasas, que hidrolizan directamente el cianuro a ácido fórmico y 
amonio y las cianuro hidratasas, que lo convierten a formamida. Estas enzimas están 
cercanamente relacionadas a la nitrilasa, ya que presentan similitudes significativas a nivel de 
secuencia de aminoácidos y de estructura. 
 
Las nitrilasas pertenecen a la superfamilia nitrilasa, denominada también hidrolasa carbono-
nitrógeno, con trece ramas distintas de enzimas que catalizan una serie de reacciones 
hidrolíticas de enlaces carbono-nitrógeno no peptídicos. Dentro de estas trece clases de 
enzimas se encuentran a las ya mencionadas nitrilasas, pero en otras ramas destacan las 
Figura 1.- Vías de hidrólisis enzimática de nitrilos [7]. 
Nitrilo hidratasa Amidasa 
Nitrilasa 
4 
 
amidasas, carbamilasas y N-aciltransferasas[8]. En la superfamilia de las nitrilasas se llevan a 
cabo cuatro tipos de reacciones generales y todas estas reacciones proceden a través de un 
intermediario acil-enzima (ver tabla 1). 
 
 
Miembros de la superfamilia nitrilasa parecen encontrarse en todas las plantas, animales y 
hongos y muchos de estos organismos tiene múltiples proteínas de más de una rama de la 
superfamilia. Las secuencias de nitrilasas-relacionadas, también se encuentran en 
procariontes filogenéticamente agrupados que parecen tener una relación ecológica con 
plantas y animales. 
 
La superfamilia de la nitrilasa probablemente surgió antes de que ocurriera la separación de 
plantas, animales y hongos. Posteriormente, divergió en familias y luego se dispersó de 
manera horizontal a arqueas y bacterias. La mayoría de las ramas contienen miembros que 
son amidasas con distintas afinidades o enzimas que condensan cadenas acilo a grupos 
amino y solamente los miembros de la rama 1 de la superfamilia presentan la actividad de 
nitrilasa. 
Rama de la nitrilasa Nitrilasa 
 
 
Amidasa Amidasa reversa Carbamilasa 
 
Sustrato proteínico 
 
 
 
1 - Nitrilasa Si 
2 - Amidasa alifática Si 
3 - Amidasa amino-terminal Si Si 
4 - Biotinidasa Si Si A veces 
5 - β-Ureidopropionasa Si Si 
6 - Carbamilasa Si Si 
7 - NAD sintasa procarionte Predicha 
8 - NAD sintasa eucarionte Predicha 
9 - Apolipoproteína N-aciltransferasa Si Si Si 
10 - Nit y Nitfhit 
11 - NB11 
12 - NB12 Predicha 
13 - No fusionados atípicos 
Tabla 1.- Las trece ramas correspondientes a la superfamilia de las nitrilasas, así como los cuatro tipos de 
reacciones generales que catalizan según el caso particular de cada rama [8]. 
Resumen de las actividades enzimáticas de la superfamilia de las nitrilasas 
5 
 
En base a un análisis de secuencia y de especificidad de la reacción, se agrupó a las 
nitrilasas, cianuro dihidratasas (CDH) y cianuro hidratasas (CH) dentro de la misma 
subfamilia. Su distribución es amplia, se encuentran en plantas, animales (C. elegans), 
hongos, y varios tipos de bacterias. La mejor evidencia de la función de las nitrilasas in vivo, la 
conversión del indol-3-acetonitrilo a un factor de crecimiento en plantas, el ácido indol-3-
acético (auxina), viene de experimentos en Arabidopsis. Mutaciones recesivas del gen de la 
nitrilasa reducen los efectos tipo auxina del indol-3-acetonitrilo, mientras que su 
sobreexpresión los aumentan. Las nitrilasas bacterianas se utilizan frecuentemente para 
síntesis bioquímicas y de biorremediación ambiental. En la mayoría de los microorganismos 
las nitrilasas no se expresan constitutivamente. Se ha reportado que la nitrilasa en Nocardia 
sp se induce por benzonitrilo [9]. El acetonitrilo se ha usado para inducir la expresión de 
nitrilasa en Fusarium oxysporum [10]. En Rhodococcus rhodochous J1, la nitrilasa se induce 
fuertemente por el isovaleronitrilo [11] y la caprolactama[12]. Por lo que aún no está claro si las 
nitrilasas bacterianas juegan un papel importante en las relaciones ecológicas con las plantas 
o si sólo benefician a las bacterias de manera aislada [8]. 
 
1.3 Plegamiento y sitio catalítico de la superfamilia de las nitrilasas 
La comprensión de la estructura y propiedades catalíticas de la nitrilasa son el principal 
obstáculo para la manipulación molecular, así como el diseño racional de este tipo de 
enzimas. Por lo tanto, la determinación exacta de la estructura y el mecanismo catalítico de la 
nitrilasa son indispensables. La primera proteína cristalizada de la superfamilia de las 
nitrilasas que sirvió como estructura putativa, fue el dominio homólogo Nit, de la proteína 
NitFhit de C. elegans (PDB: 1EMS) [13]. Según Brenner y colaboradores, los miembros de esta 
superfamilia comparten una estructura característica formada por cuatro capas αββα 
arregladas en un plegamiento tipo sándwich[8]. Hasta ahora se cuenta con las estructuras 
cristalográficas de algunos miembros de la superfamilia, como la N-carbamil-D-aminoácido 
amidohidrolasa de Agrobacterium (PDB: 1ERZ [14]) la proteína Ni3 de Saccharomyces 
cerevisiae que es una CN-hidrolasa putativa (PDB: 1F89 [15]), una amidasa de Geobacillus 
pallidus RAPc8 (PDB: 2PLQ [16]) y de Pseudomanas aeruginosa (PDB 2UXY [17]) y la proteína 
hipotética PH0642 de Pyrococcus horikoshii (PDB: 1J31[18]). Recientemente fue liberada la 
primera estructura cristalográfica de una nitrilasa hipertermófila de Pyrococcus abyssi (PDB: 
6 
 
3IVZ [19]), la cual es activa para dinitrilos alifáticos pequeños y posee el mismo tipo de 
plegamiento presente en toda la superfamilia (ver figura 2) [19]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Complementaria a la estructura se ubica en la secuencia de aminoácidos una tríada catalítica 
Glu-Lys-Cys, que se mantiene conservada a lo largo de toda la superfamilia (ver figura 3) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.4 Nitrilasas (E.C.3.5.5.1) 
La nitrilasa fue la primera enzima descrita, con la capacidad de metabolizar compuestos de 
tipo nitrilo. La enzima, obtenida inicialmente de hojas de cebada, cataliza la conversión del 3-
indol acetonitrilo a ácido 3-indolacético. Esta reacción se observó en extractos enzimáticos 
Figura 2.- Estructura de la proteína NitFhit de C. elegans. A) Dímero de la proteína NitFhit (uno de los monómeros en rojo y 
otro en color azul). B) Monómero de la proteína NitFhit, donde se resalta su plegamiento tipo α-β-β-α o también llamado 
tipo sándwich. 
A 
B 
Figura 3.- A) Fragmento del alineamiento de secuencias de aminoácidos de miembros de las 13 ramas de la superfamilia 
de las nitrilasas, se resalta en amarillo los aminoácidos que componen la tríada catalíca, la cual se conserva en todos sus 
miembros, consistente de un glutamato, una lisina y una cisteína. B) Sitio activo putativo de la superfamilia de las 
nitrilasas [8] 
B 
7 
 
obtenidos de diferentes plantas. Posteriormente se observó actividad de nitrilasa en extractos 
enzimáticos obtenidos de bacterias del suelo (Pseudomonas) seleccionadas para crecer en un 
medio que contieneel nitrilo natural, ricina (N-metil-3-ciano-4-metoxi-2-piridona), como única 
fuente de carbono [20]. A la fecha más de 20 nitrilasas han sido purificadas y caracterizadas y 
varias de ellas se han expresado en hospederos heterólogos[21]; los datos reportados indican 
que las propiedades bioquímicas varían dependiendo de la especie. Las diferencias más 
significativas son la especificidad por sus sustratos, su estructura nativa y propiedades de 
agregación y pH óptimos [20]. Basados en la especificidad por el sustrato, las nitrilasas se 
clasifican en tres categorías: aquellas que hidrolizan nitrilos aromáticos o heterocíclicos, las 
que degradan preferentemente nitrilos alifáticos o arilacetonitrilos y por último las que tiene 
capacidad de hidrolizar tanto nitrilos aromáticos como alifáticos [21]. 
 
Las nitrilasas son enzimas formadas por subunidades de aproximadamente 40 kDa (32-47 
kDa) que se asocian en homo-oligómeros de diferentes tamaños, entre 6-26 subunidades. 
Estos agregados y homo-oligómeros son la forma activa de la enzima[20]. Se ha reportado que 
la nitrilasa de R. rhodochous se transforma en su forma activa por asociación de subunidades 
cuando se incuba en presencia del sustrato [22], sales o disolventes orgánicos y altas 
concentraciones de proteína[23]. La actividad de las nitrilasas, a diferencia de las nitrilo-
hidratasas, no requiere de cofactores metálicos o grupos prostéticos. Se ha reportado la 
presencia de residuos esenciales de cisteína en o cerca del sitio activo[24 y 25]. 
 
1.5 Mecanismo catalítico 
 
Las propiedades catalíticas de la reacción llevada a cabo por la nitrilasa han sido estudiadas 
por varios grupos. En los inicios de los años 1960 cuando se encontró la primera nitrilasa en 
hojas de cebada, por Mahadevan y colaboradores [26], se postuló que el carbono del grupo 
ciano que lleva una carga positiva parcial, está sujeto a un ataque nucleofílico probablemente 
por uno de dos tioles (-SH) de la nitrilasa. La adición de una molécula de agua es 
acompañada por la liberación de amonio y la transformación del tioimidato a una tiol 
acilenzima a través de un intermediario tetraédrico. Enseguida entra una segunda molécula 
8 
 
de agua que permite la liberación del producto (ácido carboxílico) y la regeneración de la 
enzima [27] (ver figura 4). 
 
 
 
 
 
 
 
1.6 El papel biológico de las nitrilasas 
El rol que desempeñan las nitrilasas en la naturaleza ha sido abordado escasamente en la 
literatura, ya que se le ha asignado la función de una enzima que interviene en el 
aprovechamiento de nitrilos como fuente de carbono, así como de protección al organismo 
contra compuestos tóxicos (como son los nitrilos) que son degradados a compuestos menos 
perjudiciales. En este último caso se tiene un organismo genéticamente modificado que saca 
provecho de esta función, ya que a partir de la nitrilasa Klebsiella pneumoniae subsp. 
ozaenae, que es altamente específica para el herbicida “bromoxynil” (3,5 dibromo-4-
hidroxibenzonitrilo), donde se integra el gen bacteriano a la planta de algodón, haciéndola 
resistente al herbicida y liberando amonio como fuente de nitrógeno al suelo[28]. 
 
Realmente son pocos los ejemplos de nitrilasas que se conozca aunque sea brevemente su 
función para el organismo que las produce. La mejor evidencia de la función in vivo de estas 
enzimas, es la nitrilasa de Arabidopsis thaliana que lleva a cabo la formación del ácido 3-
indolacético que es una auxina (una hormona necesaria para el adecuado desarrollo de la 
planta) a partir del indolacetonitrilo[8]. Por otro lado igual en A. thaliana, se tiene el caso de la 
nitrilasa 1 de la cual intrínsecamente tiende a la formación de filamentos, los cuales tienden a 
acumularse en áreas de la célula como efecto de un estímulo, sirviendo como plataformas de 
interacción para otras proteínas que junto con ella regulan la de manera directa la división y 
diferenciación celular en balance con la apoptosis [29]. 
Fig.4.- Mecanismo propuesto para la biocatálisis de nitrilos [8]. 
tiomidato acilenzima 
B) 
9 
 
2 Antecedentes 
El presente trabajo se enfocó en el estudio de una nitrilasa obtenida de manera recombinante 
a partir de una bacteria del género Rhodococcus. Históricamente este género fue establecido 
en base en un estudio de taxonomía numérica teniendo como especie tipo a Rhodococcus 
rhodochous [30]. 
Sistemáticamente los miembros del género Rhodococcus están colocados en el sub-orden 
Corynebacterineae en la familia Nocardiaceae en el phylum (o filo) Actinobacteria. A grandes 
rasgos este género posee las siguientes características: sus miembros van de Gram positivos 
a Gram variables, no móviles, aeróbicos, quimiorganótrofos con un metabolismo oxidativo y 
son capaces de emplear un amplio rango de compuestos orgánicos como única fuente de 
carbono y energía. Dependiendo de la cepa pueden estar sujetos a cambio morfológicos 
drásticos convirtiéndose de cocos a bastoncillos y filamentos, llegando a desarrollar extensas 
ramificaciones o hifas[31]. Están presentes comúnmente en nichos ambientales que van desde 
el suelo a plantas acuáticas, además de que comparten, junto con algunas especies de 
Pseudomonas, la capacidad de degradar a una gran variedad de compuestos orgánicos. Esto 
hace a los miembros del género Rhodococcus candidatos ideales para la biorremediación de 
sitios contaminados y han demostrado ser de gran utilidad para una amplia gama de bio-
transformaciones, tales como modificaciones de esteroides, la síntesis enantioselectiva y la 
producción de amidas a partir de nitrilos[32]. 
Dentro del género Rhodococcus encontramos a Rhodococcus pyridinovorans, que fue 
originalmente aislado de aguas residuales industriales en Corea, como una bacteria 
corineforme extremadamente eficiente para degradar piridina [33]. Las especies de R. 
pyridinovorans abarcan cepas que son metabólicamente versátiles y son capaces de 
biodegradar un amplio número de compuestos aromáticos tales como piridina, bifenilo y 
estireno, así como químicos BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno) [34]. 
A partir de muestras de suelo tomadas en Jiutepec, Morelos como parte de un tamizado de 
muestras ambientales de diferentes regiones del centro de la República Mexicana por el Dr. 
Ignacio Regla (FES-Zaragoza UNAM), se identificó a la especie Rhodococcus pyridinovorans 
cepa V51B, la cual poseía una enzima con una actividad catalítica de nitrilasa[35]. Se probaron 
10 
 
varias condiciones para optimizar el crecimiento del organismo así como la inducción de la 
proteína. Se desarrolló un método reproducible de purificación parcial de la enzima, partiendo 
de cultivos de la cepa silvestre inducidos por valeronitrilo y caprolactama. A partir de estos 
extractos, parcialmente puros, se identificó una banda de inducción de 38 KDa 
correspondiente al monómero de la nitrilasa [36]. La banda se purificó para ser analizada por 
espectroscopía de masas (LS-MS/MS) y se determinó la secuencia de aminoácidos de los 
fragmentos obtenidos por digestión proteolítica. A partir de estas secuencias se diseñaron y 
sintetizaron los oligonucleótidos específicos para clonar el gen nitA de R. pyridinivorans. 
Se obtuvo a la nitrilasa recombinante de R. pyridinivorans a partir de la clonación del gen nitA 
en un vector de expresión pET 24 a(+). Se desarrolló un método de purificación basado en 
precipitaciones diferenciales con sulfato de amonio y cromatografías de filtración molecular e 
intercambio iónico [37]. 
Se estandarizaron los métodos para el ensayo de la actividad por análisis cromatográficos de 
las mezclas de reacción por HPLC de fase inversa para nitrilos aromáticos y por medición del 
amonio producido en la reacción con un método colorimétrico comercial, Spectroquant® NH4+. 
La enzima silvestre hidroliza benzonitrilo y valeronitrilo, un sustrato aromático y uno alifático, 
con la misma eficiencia.Se obtuvieron las constantes cinéticas para ambos sustratos. La Vmax 
es de 830 y 92.2 µmol/min/mg y la Km de 0.33 y 0.05 mM, con benzonitrilo y valeronitrilo, 
respectivamente. La nitrilasa de R. pyridinovorans tiene una actividad y afinidad, 10 y 3.5 
veces mayores respecto a otras nitrilasas específicas para nitrilos aromáticos. La 
característica más importante de esta nitrilasa, es que presenta también alta especificidad por 
el valeronitrilo, que es un nitrilo alifático; esta propiedad la hace una enzima con gran 
potencial biocatalítico, solo reportada anteriormente para la nitrilasa de R. rhodochous 
ATCC33278, con quien guarda una identidad del 97%. 
 
 
 
 
11 
 
3 Justificación 
 
La nitrilasa de Rhodococcus pyridinovorans es un modelo de estudio atractivo dadas sus 
propiedades catalíticas. Pese a obtener condiciones favorables para la inducción y 
sobreexpresión de la enzima, el rendimiento en la purificación es bajo, 3 mg de proteína total 
al 80-85 % de pureza como máximo. Se ha reportado el caso exitoso de purificaciones 
mediante el empleo de la adición de etiquetas de histidinas ya sea en el extremo N-terminal o 
C-terminal, sin efecto sobre la actividad y estructura de las enzimas, por lo que hace de esta 
técnica una opción viable para mejorar el rendimiento y acelerar el proceso de purificación. La 
falta de datos estructurales de las nitrilasas nos lleva a generar formas de la enzima silvestre 
con etiquetas de histidina en ambos extremos, con lo que además obtendremos información 
sobre el papel que desempeñan los grupos amino y carboxilo terminal en la estructura 
oligomérica de la nitrilasa de R. pyridinovorans. 
 
4 Objetivos 
 
4.1 General: 
Implementar un sistema de expresión y purificación de alto rendimiento y elevada pureza para 
la nitrilasa de R. pyridinovorans, con el fin de llevar a cabo un estudio completo de sus 
propiedades cinéticas y estructurales. 
 
4.2 Particulares: 
I. Clonar y sobreexpresar la nitrilasa silvestre con etiquetas de histidinas en los extremos 
amino y carboxilo respectivamente. 
II. Purificar a la nitrilasa mediante cromatografía de afinidad en columna de níquel. 
III. Determinar el estado oligomérico de la nitrilasa de Rhodococcus pyridinovorans. 
IV. Evaluar el papel que desempeña el amino y el carboxilo terminal en la formación del 
oligómero. 
V. Estudiar la actividad de la enzima mediante pruebas de actividad hacia diferentes 
sustratos, así como en diferentes rangos de temperatura. 
 
 
12 
 
5 Metodología 
 
5.1 Transformación de células competentes 
Las células de E. coli electrocompetentes se prepararon a partir de cultivos de las cepas 
DH5α y BL21(DE3) pLys en 500 mL de medio LB, crecidos hasta la fase exponencial (DO600nm 
=0.5) con agitación continua a 37 °C. Tras enfriar el cultivo en hielo, se centrifugó a baja 
velocidad (5,000 rpm) a 4 ºC, se desechó el sobrenadante y se lavó la pastilla resultante tres 
veces con 200 mL de agua desionizada y estéril. Finalmente, las células se resuspendieron en 
glicerol al 10% y se congelaron en alícuotas de 50 µL a -80 ºC. Las células competentes de E. 
coli se transformaron por electroporación y en todos los casos el DNA que se utilizó estaba 
disuelto en agua desionizada estéril. El DNA se mezcló con 50 µL de células competentes. La 
mezcla se transfirió a una celda de electroporación, con un ancho de ranura de 2 mm, 
previamente enfriada a 4 ºC. Para aplicar el pulso eléctrico se utilizó un electroporador Micro 
Pulser (BioRad), con las siguientes condiciones: 25 µF, 2.5 kV/cm y 200 Ω. Las mezclas de 
transformación se diluyeron en 1.0 mL de medio SOC y se incubaron a 37ºC en agitación (150 
rpm) durante 1 hora. La selección de transformantes se realizó mediante siembra en placas 
con medio LB que contenían kanamicina para la selección (a una concentración de 30 µg/mL). 
 
5.2 Purificación de plásmidos de DNA 
Para la obtención de plásmidos derivados de pET: 24-a+, 28-a+ y 22-b+ de las cepas 
recombinantes, se utilizó el método de lisis alcalina y extracción por fenol-cloroformo, el cual 
permite obtener una concentración apropiada del vector correspondiente. Para las pruebas de 
secuenciación los plásmidos recombinantes se purificaron por lisis alcalina y columnas con 
membrana de silicatos con el QIAprep Miniprep kit (QIAgen). 
 
5.3 Diseño de mutantes 
Se diseñaron dos variantes de la nitrilasa con etiqueta de histidinas, una de ellas ubicada en 
el carboxilo y la otra en el amino terminal, para su obtención se realizó lo siguiente: 
 
 
13 
 
5.3.1 Extracción y purificación del gen nitA 
Se extrajo plásmido pET24a+ que contiene al gen nitA (el cual ya está integrado de manera 
recombinante en un sistema pET, para su expresión en E. coli) mediante el método de lisis 
alcalina y extracción por fenol cloroformo. El gen nitA está flanqueado por los sitios de corte 
correspondientes a las enzimas de restricción NdeI y HindIII, por lo que se realizó un ensayo 
de doble de restricción enzimática del plásmido, empleando el protocolo de la tabla 2 para 
llevar a cabo la liberación del gen. Posteriormente se realizó una purificación del gen nitA 
mediante extracción de gel de agarosa al 1%, teñido con bromuro de etidio al 1% empleando 
un kit de QIAGEN (QIAquick Gel Extraction Kit). 
 
 
 
 
 
 
 
Se cuantificó la cantidad de gen nitA obtenido mediante espectroscopía de UV a 280 y 260 nm 
así como se observó en gel de agarosa. 
 
5.3.2 Amplificación del gen nitA incorporando los sitios de restricción 
 
El gen nitA para la variante Nit-NHis que posee la etiqueta de histidinas en el amino-terminal 
no sufrirá cambios en su secuencia. El gen nitA cuenta con los sitios de corte de NdeI y HindIII 
por lo que al amplificarlo y después digerirlo con las enzimas de restricción ya citadas, se 
subclonó en el vector pET28a(+), el cual fue previamente digerido con las enzimas NdeI y 
HindIII. La ligación del gen nitA en el vector pET28a(+) generó la inserción de la secuencia 
correspondiente a la etiqueta de histidinas en la región del amino terminal del gen, la cual 
adicionalmente tiene un sitio de corte con trombina (ver figura 5). Las secuencias de corte de 
las enzimas de restricción NdeI y HindIII se resaltan en los oligos 1 y 2 respectivamente (ver 
tabla 3). 
 
Reactivo Volumen 
Agua 20µL 
Amortiguador N°2 2µL 
pET24a + gen nitA (150 ng / μL), 20µL 
Enzima de restricción : NdeI (20,000 U / mL) 2µL 
Enzima de restricción : HindIII (20,000 U / mL) 2µL 
Tabla 2.- Cantidades empleadas para la doble digestión que liberá al gen nitA del plásmido pET24 . Se emplearon las enzimas de restricción de la 
empresa New England BioLabs®Inc., así como el amortiguador recomendado para el funcionamiento de las enzimas. 
 
14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para el caso de la variante con la etiqueta de histidinas en el carboxilo terminal Nit-CHis, el 
gen nitA se modificó. Para amplificar esta variante del gen nitA se empleó el oligo 1 que no 
realiza modificaciones para la zona amino terminal, mientras que para la zona carboxilo 
terminal se usará el oligo 3 (ver tabla 3), que fue diseñado para agregar el sitio de restricción 
de la enzima HindIII y adicionalmente generar la deleción del codón de paro en la secuencia 
de la enzima, para que cuando el gen se ligue al pET22b (linearizado con las mismas enzimas 
de restricción, ver figura 6), se pueda integrar al gen la secuencia correspondiente a la 
etiqueta de histidinas. 
 
 
 
 
 
 
Oligo Nombre Secuencia TM Longitud 
1 NdeI (Forward) 5´-CA▼T ATG GTC GAA TAC ACA AAC ACA TTC-3´ 55.2 °C 27 
2 HindIII2 (Reverse) 5´-A▼AG CTT TCA GAG GGT GGC TGT-3´ 54.4 °C 21 
3 HindIII3 (Reverse) 5’-A▼AG CTT GAG GGT GGC TGT-3’ 50.3 °C 18 
Tabla 3.- Nombres y secuencias de los oligos usados durante la PCR, para la amplificación del gen nitA, los cuales para cada caso permitieron 
insertar los cambios necesarios. Sitio de cortede la enzima de restricción (▼), en gris se resalta la secuencia de corte de la enzima de 
restricción, en amarillo se ubica el codón de paro en la secuencia. 
Figura 5.- Mapa del pET-28a(+), hay que destacar la ubicación de los sitios de restricción HindIII (173) y NdeI (238). En la parte derecha se muestra la 
secuencia de algunos de los sitios de corte, en este caso se hace hincapié en observar el sitio correspondiente a NdeI, ya que el corte se realizó entre 
los codones correspondientes a una histidina y una metionina, su posterior ligación al gen nitA no modificó el marco de lectura y agregó a la 
secuencia del gen la correspondiente secuencia de la etiqueta de histidinas y del corte de trombina en la región del amino terminal (mapa del vector 
comercial y de la secuencia, NOVAGEN). 
15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
En la tabla 4 se señalan las cantidades empleadas para la amplificación del gen nitA mediante 
PCR: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4.- Componentes de la mezcla de reacción para la PCR, donde se amplificó el gen nitA. Se usó una DNA polimerasa de Pyrococcus furiosus de la 
marca Thermo SCIENTIFIC, y se empleó el amortiguador de magnesio 10X, que se proporciona para el adecuado desempeño de la enzima 
 
El gen nitA purificado se amplificó por PCR siguiendo estas condiciones de termociclado: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Reactivo Volumen 
Amortiguador de Mg2+ 10X [20 mM] 5 µL 
dNTP’s [2.5 mM] 2 µL 
gen nitA (60 ng / μL) 2 µL 
DNA polimerasa Pfu (2.5 U / µL) 1 µL 
Oligo 1 [125 ng] final 1 µL 
Oligo 2 o 3 [125 ng] final 1 µL 
Agua 38 µL 
Temperatura Tiempo N° de ciclos 
94 °C 1 min 
3 ciclos 50 °C 1min 
68 °C 14 min 
94 °C 1 min 
30 ciclos 60 °C 1min 
68 °C 14 min 
Figura 6.- Mapa del pET-22b(+), hay que destacar la ubicación de los sitios de restricción HindIII (173) y NdeI (288). En la parte derecha se encuentran 
las secuencias de algunos de los sitios de corte presentes en el plásmido, en este caso hay que resaltar la zona correspondiente al sitio de corte de 
HindIII, donde al ligar de manera directa al gen nitA en este sitio, sin antes modificar el codón de paro llevaría a la no integración de la etiqueta de 
histidinas, es por ello que se modifica el marco de lectura a partir del codón de paro del gen nitA lo que agregará a la secuencia la etiqueta de 
histidinas en la región carboxilo terminal (mapa del vector comercial y de la secuencia, NOVAGEN). 
 
 Tabla 5.- Tiempos para los ciclos de la PCR, donde se amplifica el gen nit A para insertar la etiqueta de histidinas. 
 
16 
 
5.3.3 Subclonación 
Para llevar a cabo la subclonación en los vectores pET28a y pET22b respectivamente, el 
producto de PCR obtenido para cada una de las variantes se ligó al vector correspondiente, el 
cual previamente se encontraba linearizado, empleando las enzimas de restricción NdeI y 
HindIII, para la ligación se empleó el siguiente protocolo: 
 
 
 
 
 
Tabla 6.- Componentes de la mezcla para la ligación del pET28 con el gen nitA. Se empleó la ligasa de la empresa New England BioLabs®Inc., así como el 
amortiguador recomendado para el funcionamiento de las enzima. 
 
Mediante un gel de agarosa al 1% se analizó que las ligaciones se hubieran llevado a cabo 
con éxito. Se transformaron células electrocompetentes DH5α con cada una de las muestras. 
Se realizó una nueva purificación de plásmido empleando columnas de silicatos. Las muestras 
de plásmidos con el inserto para las variantes Nit-NHis y Nit-CHis fueron sometidas a 
digestiones con las enzimas de restricción NdeI y HindIII, para ver la adecuada presencia del 
gen nitA, así como un control del pET28a con la enzima NcoI y BamHI. Finalmente ambas 
muestras fueron secuenciadas para comprobar la adecuada subclonación. 
 
5.4 Crecimiento de las células y sobreexpresión de las proteínas 
 
5.4.1 Cultivo en medio sólido. 
Células de E. coli de la cepa BL21 (DE3) pLysS, fueron transformadas con el vector de 
expresión pET28a, pET22b o pET24a (pET System, Novagen), el cual tenía integrado a su 
secuencia el gen Nit-NHis, Nit-CHis o nitA respectivamente; se crecieron en placas de medio 
LB-agar-kanamicina, a 37°C. 
 
Reactivo Volumen 
Amortiguador para T4 DNA ligasa 2µL 
Gen nitA producto de PCR 11µL 
pET28a o pET22b 5µL 
T4 DNA ligasa (400,000 U / mL) 2µL 
17 
 
5.4.2 Precultivo. 
50 mL de medio líquido LB complementado con 50 g mL-1 de kanamicina se inocularon con 
una colonia fresca del cultivo en medio sólido. Se mantuvo durante toda la noche a 37 C con 
agitación constante (250 rpm). 
 
5.4.3 Cultivo. 
Los 50 mL del precultivo, se centrifugaron durante 10 min a 5,000 rpm. El botón que se obtuvo 
de la centrifugación se resuspendió en 1 mL de medio LB con 100 µg mL-1 de kanamicina, con 
éste se inoculó un litro del mismo medio, agregando poco a poco hasta que la DO600nm fue de 
0.1. Se dejó crecer a 37 C con agitación constante hasta que se alcanzó la fase de 
crecimiento exponencial del cultivo, DO600nm  0.7. 
 
5.4.4 Sobreexpresión. 
La sobreproducción de la proteína se promovió con la adición del inductor IPTG a una 
concentración final de 0.4 mM. El cultivo se mantuvo por 4 h a 37 C con agitación constante. 
 
5.4.5 Cosecha de células. 
Las células del cultivo se centrifugaron a 5,000 rpm durante 10 min a 4 C. El botón se 
resuspendió en 40 mL de amortiguador de lisis. 
 
5.4.6 Fragmentación celular. 
Las células resuspendidas en 40 mL de amortiguador de lisis, se lisaron por el método de 
sonicación (la muestra fue sonicada en frio, empleando un pulso de 35% de amplitud y una 
duración de 60 segundos, esto se repitió 7 veces dejando 2 minutos de tiempo entre pulso y 
pulso). También se pueden lisar las células empleando una prensa de French (pasar 3 veces 
la muestra por el cilindro a 40 kpsi), la cual ofrece rendimientos similares al método de ruptura 
por sonicación. 
 
5.4.7 Centrifugación. 
Las células fragmentadas (extracto total) se centrifugan a 15,000 rpm durante 20 minutos a 
4º C. 
18 
 
 
5.5 Purificación de las proteínas recombinantes 
Para cada paso, el grado de pureza de la proteína se determinó por técnicas de electroforesis, 
en geles de poliacrilamida al 12.5% en condiciones desnaturalizantes, empleando el método 
de Laemmli (SDS-PAGE) y teñidos con azul de Coomassie. Además se determinó la 
concentración de proteína en cada paso mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) 
para valorar el rendimiento de la purificación. 
 
5.5.1 Purificación de la nitrilasa silvestre 
 
5.5.1.1 Precipitación con sulfato de amonio 
El volumen de sobrenadante obtenido se midió y se fraccionó adicionando sulfato de amonio 
al 20% de saturación. La muestra se dejó precipitar por 12 h a 4 ºC y se centrifugó a 15,000 
rpm durante 15 min a 4 ºC. El sobrenadante se llevó a 45% de saturación con sulfato de 
amonio, se mantuvo así por 12 h a 4 ºC y se centrifugó. El precipitado se resuspendió en 5 mL 
de amortiguador de corrida (fosfatos 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM y β-mercaptoetanol 
14.25 mM a pH 7,) y se dializó en 500 mL del mismo amortiguador. 
 
5.5.1.2 Cromatografía de exclusión molecular 
Empleando un equipo de HPLC (Waters), el solubilizado resultante de la precipitación de 
sulfato de amonio al 45% previamente dializado se inyectó a una columna Sephacryl S-300 
equilibrada con el amortiguador de corrida a un flujo de 0.5 mL / min. Las fracciones se 
analizaron mediante SDS-PAGE y las de mayor pureza se juntaron y concentraron 
en cartuchos de filtración Amicon® Ultra (Millipore), con 10 KDa de peso molecular de corte 
(MWCO). 
 
5.5.1.3 Cromatografía de intercambio aniónico 
Las fracciones recolectadas con nitrilasa silvestre se pasaron a través de una columna Source 
Q, la cual previamente fue equilibrada con el amortiguador de corrida (pH 7.0), a un flujo de 
0.5 mL/min. Se eluyó a la proteína con un gradiente lineal de NaCl de 0.2 a 1 mM, dondela 
fracción activa de la enzima eluyó en un rango aproximado de 0.325 mM de NaCl. Las 
19 
 
fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las de mayor pureza se juntaron y concentraron. La 
muestra se pasó una vez más en la columna ahora en un pH de 8.0. Las fracciones 
recolectadas con la nitrilasa pura se juntaron y concentraron para su posterior caracterización. 
 
5.5.2 Purificación de las nitrilasas con etiquetas de histidina. 
 
5.5.2.1 Nitrilasa Nit-CHis 
El sobrenadante resultante de esta variante es pasado por la columna de afinidad de níquel 
que tiene una resina Protino® Ni-TED, la cual fue inicialmente regenerada y lavada 
empleando agua desionizada y sulfato de níquel. Antes del paso de la muestra, la columna 
fue previamente equilibrada con 40 mL del amortiguador de lavado (KH2PO4 50 mM, NaCl 300 
mM, pH 7.5) para después hacer pasar la totalidad de la muestra y finalmente adicionar ≈20 
mL del amortiguador de elución (KH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7.5). Se 
evaluó la pureza de las fracciones mediante SDS-PAGE, para juntar las fracciones de la 
enzima con la pureza deseada. 
 
Posteriormente se concentró la totalidad de la muestra usando cartuchos de filtración 
(Amicon® Ultra de 15 mL, con 10 KDa de MWCO) obteniendo finalmente un volumen 
aproximado de 10 mL de muestra. Esta muestra es dializada en un amortiguador con KH2PO4 
35 mM, NaCl 300 mM a pH 7.5. Al finalizar la diálisis, la muestra es centrifugada a 14,000 
rpm, por 10 min a 10 °C, el sobrenadante resultante fue la muestra final. 
 
5.5.2.2 Nitrilasa Nit-NHis 
En este caso se conservó el botón o precipitado resultante de la centrifugación (ya que la 
enzima se ha ido a cuerpos de inclusión). El precipitado se resuspendió en 20 mL del 
amortiguador de lisis (KH2PO4 35 mM, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, PMSF+ DMSO, pH 7.5). 
La muestra es sonicada una sola vez en frio empleando un pulso de 35% de amplitud y una 
duración de 30 segundos. Se centrifuga la muestra a 10,000 rpm durante 10 min a 4 °C; se 
desecha el sobrenadante y se conserva el precipitado 
 
20 
 
5.5.2.2.1 Lavado de cuerpos de inclusión 
 
El precipitado fue resuspendido en 20 mL del amortiguador de lisis+ Tritón X-100 al 2% + urea 
3 M, se sónica la muestra una vez más empleando un pulso de una amplitud de 35% durante 
30 s, para después ser centrifugada a 10,000 rpm, este paso se repite una vez. Después el 
botón es resuspendido en 20 mL del amortiguador de lisis + 1 mM de DTT, e igualmente es 
sonicado y centrifugado. 
 
El precipitado resultante se dividió en 2 partes equitativas; una de ellas se resuspendió en 20 
mL del amortiguador con 6 M de GndHCl; y la otra en 20 mL del amortiguador con 8 M de 
urea. Ambas muestras se sonicaron una vez más durante 30 s, enseguida se incubaron en 
agitación a 37 °C durante un lapso de 12-16 h. 
 
Empleando una ultracentrífuga ambas muestras se centrifugan a 30,000 rpm por 45 min, se 
conservan los sobrenadantes y se desechan los precipitados quedando las muestras listas 
para ser pasadas por la columna de afinidad. Se siguió el mismo protocolo empleado en la 
nitrilasa Nit-CHis, para el paso por la columna, solo que los amortiguadores de lavado y 
elución tienen de manera adicional un contenido de 6 M de urea o GndHCl respectivamente. 
Se juntaron las fracciones deseadas y se concentran empleando un cartucho de filtración 
(Amicon® Ultra de 15 mL). 
 
5.5.2.2.2 Ensayos de renaturalización 
Se toman 200 µL de la nitrilasa Nit-NHis que esta disuelta ya sea en urea o GndHCl y se 
procedió a dializarlas en un amortiguador que no contiene al agente desnaturalizante 
respectivo (KH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, DTT 1 mM a pH 7.5), haciendo tres cambios del 
amortiguador en lapsos de una hora (200 mL del amortiguador por cambio). 
 
5.5.2.2.3 Renaturalización en presencia de arginina 
Se realizó un ensayo de replegamiento empleando un amortiguador que contenía 300 mM de 
arginina, la cual mejora los resultados de la renaturalización de la proteína [38]. Para ello se 
concentra la muestra de la nitrilasa Nit-NHis que se encuentra en el amortiguador de fosfatos 
con 6 M de GndHCl y con ayuda de un cartucho de filtración (Amicon® Ultra 15 mL, con 10 
21 
 
KDa de MWCO) es llevada a un volumen de entre 6-8 mL, para dializarla ahora en un 
amortiguador de fosfatos pH 7.5 (KH2PO4 50 mM , NaCl 300 mM, L-Arginina 300 mM). Se 
realizan tres cambios de amortiguador cada hora (1 L de amortiguador por cambio). Al 
terminar la diálisis se centrifuga la muestra a 14,000 rpm durante 20 min a 4 °C. Se conserva 
el sobrenadante, al cual se le determina concentración de proteína así como actividad. 
 
5.5.2.2.4 Corte de la etiqueta de histidinas 
Se usó el “Thombin Clean TM Kit”, de Sigma-Aldrich. Se tomó 1 mL de la muestra de la 
nitrilasa Nit-NHis renaturalizada con arginina, a la cual se le agregó 1.2 mg de CaCl2 (cloruro 
calcio 10 mM final) para dializarla contra un amortiguador de TRIS HCl 50 mM a pH 8. 
 
Adicionalmente se hicieron ensayos llevando a la muestra a 1 M de GndHCl. Al terminar la 
diálisis la muestra se deja incubando a temperatura ambiente, bajo agitación durante 24 h. Se 
toma una muestra de 100 µL a diversos tiempos 1, 2, 4, 6 y 24 h. Cada muestra tomada fue 
centrifugada a 2,000 rpm durante 5 min para poder separar la muestra de la resina. Se 
elaboró un SDS-PAGE para analizar la efectividad del corte. 
 
5.6 Determinación del estado oligomérico 
 
5.6.1 Cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) 
Se empleó una columna Superdex 200 10/300 GL, la cual fue equilibrada con un amortiguador 
de fosfatos (KH2PO4 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM, β-mercaptoetanol 14.25 mM, pH 7.0) 
a un flujo de 0.5 mL/min por 60 min. Se construyó una curva patrón inyectando un estándar de 
pesos moleculares que contenía tiroglobulina, γ-globulina, albúmina de suero bovino (BSA), 
ovoalbúmina, mioglobina y vitamina B12. Adicionalmente se hicieron inyecciones con 
muestras de β-amilasa y anhidrasa carbónica. Todas estas proteínas de referencia estaban a 
una concentración de 1 mg/mL, inyectándose un volumen de 100 µL a un flujo de 0.5 mL/min 
por corrida. Finalmente se procedió a la inyección de una muestra de la nitrilasa silvestre a un 
flujo y volumen idéntico a los estándares de peso molecular. 
 
22 
 
5.6.2 Dispersión dinámica de luz (DLS) 
Se utilizó un equipo Zetasizer μV Malvern. La enzima silvestre es previamente dializada en 
amortiguador de fosfatos, se lleva a una concentración cercana a 1 mg/mL, para después 
filtrarse con ayuda de un filtro Millipore™ Millex-GV de 0.22 μm. Se realizaron 5 mediciones 
con 10 repeticiones cada una. Finalmente a la muestra leída en el dispersor se le mide la 
concentración de proteína por el método de BCA, para determinar si hubo pérdidas en el 
proceso de filtración. 
 
5.7 Medición de actividad 
 
El estudio de los diversos efectos de la concentración de enzima, la temperatura y la clase de 
sustratos probados, sobre la actividad de la nitrilasa silvestre de R. pyridinovorans fueron 
evaluados mediante la cuantificación de amonio (NH4+) por medio del kit Spectroquant® de 
Merck. Se puede relacionar que la conversión de una molécula de sustrato al ácido carboxílico 
correspondiente libera una molécula de amonio teniendo una proporción estequiométrica de 
1:1, por lo que se puede seguir indirectamente la conversión de cualquier nitrilo al ácido 
carboxílico correspondiente, cuantificando la cantidad de amonio presente en la reacción. 
Para ello se prepara una mezcla de reacción de 1 mL que consiste en los microgramos de 
enzima correspondientes según el tipo de ensayo, el amortiguador de fosfatos para actividad 
(KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7.8) y la cantidad de sustrato correspondiente. Se deja incubar 
la reacción a la temperatura y tiempos indicados. Cumplido ese tiempo se cuantifica el amonio 
presente en la mezcla de reacción a 690nm (se usó un espectrofotómetroDU 7500, 
Beckman). Las cantidades de enzima y sustrato, así como los tiempos y temperaturas en los 
que se llevó a cabo la reacción, se detallan a continuación, ya que dependen de cada uno de 
los ensayos diseñados: 
 
Para la comparación entre la enzima silvestre y la mutante Nit-CHis, se emplearon 10 µg/mL 
de cada enzima, 1 mM final de BZCN y se incubaron a 30 °C por 30 minutos evaluando la 
actividad relativa, tomando como 100% la actividad total de la enzima silvestre. 
 
 
23 
 
En el caso del análisis de la dependencia de la concentración de la enzima silvestre, se 
evaluó la actividad específica resultante de 5 µg de enzima, la cual fue incubada previamente 
a diferentes concentraciones de proteína (5 - 100 µg / mL). Como sustrato se utilizó el BZCN a 
una concentración final de 1 mM, incubando la mezcla de reacción a 30 °C durante 30 min. 
 
Para las curvas de progreso que evaluaron las diferencias en la actividad de la enzima a dos 
diferentes concentraciones de proteína, se emplearon 60 µg / mL con 1 mM de BZCN final 
incubando en tiempos que fueron de 0.5 - 20 min. Mientras que en el otro caso se usó una 
concentración de enzima de 5 µg/mL a una misma concentración de 1 mM de BZCN 
evaluando tiempos de 1 min a 4 h. 
La especificidad de sustrato de la nitrilasa de R. pyridinovorans fue evaluada empleando 
diferentes sustratos a una concentración final de 10 mM, se usaron 50 μg/mL de la enzima y 
se incubó la reacción a 30 °C por 5 min. Hay que añadir que la mezcla contiene 10% de 
metanol para mantener solubles los nitrilos. 
En el caso de la temperatura óptima de reacción, fue determinada en un rango de 20 a 70°C, 
donde la mezcla de reacción de 1 mL consistió de 50 µg / mL de la enzima con 1 mM de 
BZCN, la reacción que fue incubada durante 10 min a cada una de las temperaturas 
analizadas, evaluando las diferencias de la actividad específica obtenida para cada 
temperatura. 
 
 
 
 
 
 
 
24 
 
 
6 Resultados 
 
6.1 Construcción de las variantes de la nitrilasa de R. pyridinovorans 
Para el caso de la variante Nit-NHis pudo optarse por no amplificar el gen vía PCR y 
simplemente ligarlo directamente al vector pET28a+, se decidió no hacerlo ya que existe una 
pérdida considerable del gen al extraerlo de agarosa, por lo que al amplificarlo vía PCR, se 
incrementa la cantidad y concentración del gen nitA para la ligación. En el caso de la variante 
de la nitrilasa con la etiqueta de histidinas en el carboxilo, se diseñó de manera inicial una 
mutación puntual en la secuencia del vector pET24a+ que mediante la inserción de una base 
permitiera cambiar el marco de lectura y obtener la secuencia opcional para la etiqueta de 
histidinas, la cual está dentro del mismo plásmido; esta estrategia no dio resultados, dadas las 
altas temperaturas de fusión (TM por sus siglas en inglés, y que refleja la estabilidad del DNA 
de doble cadena) de los oligonucleótidos en esa zona, por lo que se decidió hacer la 
modificación de la enzima a partir del corte del gen nitA del plásmido para su posterior 
modificación vía PCR y su integración a un vector de clonación distinto, en este caso el 
pET22b. 
 
Los genes Nit-NHis y Nit-CHis obtenidos por PCR y que luego fueron ligados a los vectores 
correspondientes, y con ellos se transformaron células DH5-α para obtener los plásmidos con 
los genes y secuenciarlos. En el caso de ambas variantes se comprobó de manera previa a la 
secuenciación, que inserción de la variación en los plásmidos con los genes nitA modificados 
se hubiera llevado a cabo de manera exitosa. Mediante una serie de digestiones sencillas y 
dobles de DNA con enzimas de restricción se corroboró la presencia de los genes nitA 
modificados en sus correspondientes vectores de expresión. 
 
Para el plásmido pET28a con el gen Nit-NHis, se realizó una serie de digestiones sencillas y 
dobles que se describen a continuación y que se observan en el gel de agarosa de la figura 7: 
en el carril 1 se encuentra el marcador de peso molecular; en el carril 2 al plásmido pET28a 
sin modificaciones, que fue linearizado empleando la enzima de restricción BamH1 (se usó 
esta endonucleasa de manera aleatoria, lo único que se buscaba era linearizar al plásmido), 
25 
 
mostrando un peso de 5.3 Kb; en el carril 3 está el plásmido pET28a con el gen modificado, 
se le sometió a una digestión doble con las enzimas HindIII y NcoI, ambos sitios flanquean al 
gen, hay que señalar que el sitio de restricción de NcoI se encuentra rio arriba del sitio NdeI y 
solo está presente en el vector pET28a, más no en el pET24a de donde se extrajo el gen nitA 
originalmente, por lo que al cortar con la enzima NcoI, se lleva a cabo un control para 
corroborar la no presencia del pET24a. Se puede apreciar el ligero aumento del peso en el 
gen nitA modificado debido al corte con NcoI, ya que le proporciona 60 pb extras a la longitud 
del gen, por último en el carril número 4 se llevó a cabo una doble digestión empleando las 
enzimas HindIII y NdeI, que son los sitios de corte que originalmente fueron diseñados para 
liberar el inserto. Hay que recordar que el peso del gen es de 1.1 Kb; como se puede notar 
todos los cortes se dieron de manera correcta. 
 
En el caso de la variante Nit-CHis, se llevó a cabo una digestión doble del plásmido pET22b 
que contiene el gen nitA modificado, empleando las enzimas de restricción NdeI y HindIII, y 
como se puede ver en el gel de agarosa de la figura 8, se observó la liberación de los 
fragmentos correspondientes al pET22b (5.5 Kb) y al gen nitA modificado (1.1 Kb). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8.- Gel de agarosa al 1%, 
teñido con EtBr al 1%, donde se 
muestra la digestión doble del 
plásmido pET22b con el gen nitA 
modificado 
Carril: 
A: Marcador de peso molecular. 
B: Liberación del gen nitA del 
plásmido pET22b, mediante una 
digestión doble con las enzimas 
NdeI y HindIII. 
A B 
Kilobases 
 
 
10.0 
8.0 
6.0 
5.0 
4.0 
 
3.0 
 
 
2.0 
 
1.5 
 
1.2 
 
1.0 
0.9 
0.8 
0.7 
0.6 
0.5 
 
0.4 
 
0.3 
 
0.2 
 
0.1 
 
 
Kilobases 
 
 
 
10.0 
8.0 
6.0 
5.0 
4.0 
 
3.0 
 
 
2.0 
 
 
1.5 
 
 
1.2 
 
1.0 
 
 
 
 
 
 
0.9 
 
0.8 
Figura 7.- Gel de agarosa al 1%, teñido EtBr 
al 1%, que muestra la digestión sencilla y 
doble del plásmido pET28a con y sin el gen 
nitA modificado. 
Carriles: 
1: Marcador de PM 
2: pET28Nit/ corte de restricción con Bam H1 
3: pET28Nit/ corte de restricción con HindIII 
+ NcoI 
4: pET28Nit/ corte de restricción con HindIII+ 
NdeI 
1 2 3 4 
26 
 
Las secuencias resultantes de los genes modificados fueron comparadas con el gen nitA 
silvestre mediante la traducción de las secuencia de nucleótidos a aminoácidos para verificar 
los cambios realizados. Como se ve en el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la 
figura 9, las variantes Nit-NHis y Nit-CHis corresponden exactamente con la secuencia de la 
enzima silvestre, a excepción de los extremos amino y carboxilo terminal, en donde se agregó 
His-tag correspondiente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.2 Purificación de la nitrilasa Nit-NHis 
La expresión de la proteína recombinante se indujo tras la adición de IPTG por 4 h a 37 C. En 
la figura 10 se muestra el gel relativo a la inducción, en la que se observa un claro aumento en 
la producción de la enzima en el extracto total, obtenido después de romper las células por 
CLUSTAL 2.1 multiple sequence alignment 
 
 
NR.pyrNHis MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVEYTNTFKVAAVQAQPVWFDAAKTVDKTVSNIAEAARNG 60 
NR.pyrCHis --------------------MVEYTNTFKVAAVQAQPVWFDAAKTVDKTVSNIAEAARNG 40 
NR.pyr --------------------MVEYTNTFKVAAVQAQPVWFDAAKTVDKTVSNIAEAARNG 40 
 **************************************** 
 
NR.pyrNHis CELVAFPEVFIPGYPYHIWVDSPLAGMAKFAVRYHENSLTMDSPHVQRLLDAARDHNIAV 120 
NR.pyrCHis CELVAFPEVFIPGYPYHIWVDSPLAGMAKFAVRYHENSLTMDSPHVQRLLDAARDHNIAV100 
NR.pyr CELVAFPEVFIPGYPYHIWVDSPLAGMAKFAVRYHENSLTMDSPHVQRLLDAARDHNIAV 100 
 ************************************************************ 
 
NR.pyrNHis VVGISERDGGSLYMTQLIIDADGQLVARRRKLKPTHVERSVYGEGNGSDISVYDMPFARL 180 
NR.pyrCHis VVGISERDGGSLYMTQLIIDADGQLVARRRKLKPTHVERSVYGEGNGSDISVYDMPFARL 160 
NR.pyr VVGISERDGGSLYMTQLIIDADGQLVARRRKLKPTHVERSVYGEGNGSDISVYDMPFARL 160 
 ************************************************************ 
 
NR.pyrNHis GALNCWEHFQTLTKYAMYSMHEQVHVASWPGMSLYQPEVPAFGVDAQLTATRMYALEGQT 240 
NR.pyrCHis GALNCWEHFQTLTKYAMYSMHEQVHVASWPGMSLYQPEVPAFGVDAQLTATRMYALEGQT 220 
NR.pyr GALNCWEHFQTLTKYAMYSMHEQVHVASWPGMSLYQPEVPAFGVDAQLTATRMYALEGQT 220 
 ************************************************************ 
 
NR.pyrNHis FVVCTTQVVTPEAHEFFCENEEQRKLIGRGGGFARIIGPDGRDLATPLAEDEEGILYADI 300 
NR.pyrCHis FVVCTTQVVTPEAHEFFCENEEQRKLIGRGGGFARIIGPDGRDLATPLAEDEEGILYADI 280 
NR.pyr FVVCTTQVVTPEAHEFFCENEEQRKLIGRGGGFARIIGPDGRDLATPLAEDEEGILYADI 280 
 ************************************************************ 
 
NR.pyrNHis DLSAITLAKQAADPVGHYSRPDVLSLNFNQRRTTPVNTPLSTIHATHTFVPQFGALDGVR 360 
NR.pyrCHis DLSAITLAKQAADPVGHYSRPDVLSLNFNQRRTTPVNTPLSTIHATHTFVPQFGALDGVR 340 
NR.pyr DLSAITLAKQAADPVGHYSRPDVLSLNFNQRRTTPVNTPLSTIHATHTFVPQFGALDGVR 340 
 ************************************************************ 
 
NR.pyrNHis ELNGADEQRALPSTHSDETDRATATL------------- 386 
NR.pyrCHis ELNGADEQRALPSTHSDETDRATATLKLAAALEHHHHHH 379 
NR.pyr ELNGADEQRALPSTHSDETDRATATL------------- 366 
 ************************** 
 
Figura 9.-Alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la nitrilasa de R. pyridinovorans contra las secuencias de las 
variantes obtenidas con etiqueta de histidinas en el amino y carboxilo terminal respectivamente. 
 
27 
 
sonicación. Sin embargo, después de centrifugar, no se encontró proteína en la fracción 
soluble del sobrenadante, observando que la Nit-NHis se agrega en el precipitado, formando 
cuerpos de inclusión. A pesar de varios intentos cambiando la temperatura y el tiempo de 
inducción, esta tendencia a la agregación se mantuvo, por lo que generamos un protocolo 
mediante el uso de agentes desnaturalizantes para extraer la proteína de los cuerpos de 
inclusión presentes en el precipitado después de lisar y centrifugar las células. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
En la recuperación de las proteínas insolubles se utilizan amortiguadores con detergentes 
como SDS o Tritón X-100, agentes caotrópicos como la urea y el cloruro de guanidinio y 
agentes reductores como DTT y -mercaptoetanol. Mediante lavados sucesivos en presencia 
de tritón al 2% y urea 3 M se pudo incrementar la pureza de la proteína en los cuerpos de 
inclusión. La solubilización y desnaturalización de los cuerpos de inclusión se probaron dos 
condiciones del amortiguador de solubilización en presencia de 8 M de urea o 6 M de GndHCl 
(ver figura 11). 
 
 
 
 
Figura 10.- Análisis de proteína seguido por SDS-PAGE, 
donde se muestra la expresión e inducción de la mutante 
Nit-NHis, en células BL21 pLys. 
 
Carril: 
1) Muestra antes de inducir 
2) Muestra después de inducir con IPTG 
3) Extracto total 
4) Sobrenadante 
 
1 2 3 4 
 
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Durante las fases de prueba al solubilizar los cuerpos de inclusión, se buscó hacerlo con la 
menor cantidad de agente desnaturalizante. En el caso de la urea se debió subir la 
concentración molar de 6 a 8 M, ya que en la concentración más baja aún se presentaban 
agregados de proteína. En contraste el amortiguador que contenía GndHCl, ya que a una 
concentración de 6 M, se solubilizaba toda la muestra, por lo que se decidió emplear 
solamente GndHCl para la resuspensión de la muestra. 
 
6.3 Purificación de la nitrilasa Nit-NHis a través de una columna de afinidad de níquel 
 
Después de realizar los lavados de los cuerpos de inclusión, se recuperó una fraccion soluble 
de proteína en urea y en GndHCl. Las muestras fueron pasadas a tráves de una columna de 
afinidad por níquel. En la figura 12 A y B, se muestran una serie de geles SDS-PAGE 
referentes a las fracciones en urea y GndHCl obtenidas de la columna a partir de la adición 
del amortiguador de elución, se seleccionó al grupo de fracciones que contenían la muestra 
con las características de peso y pureza deseadas, las cuales fueron concentradas con ayuda 
de un cartucho de filtración (ver figura 13). 
4 3 2 1 
 
6 5 
Figura 11.- SDS-PAGE, que sigue el proceso de 
lavado de los cuerpos de inclusión de la nitrilasa 
Nit-NHis. 
 
Carriles: 
1) Sobrenadante del lavado con 
amortiguador de lisis. 
2) Sobrenadante del lavado 1 con el 
amortiguador de lisis + tritón al 2% y 
urea 3 M. 
3) Sobrenadante del lavado 2 con el 
amortiguador de lisis + tritón al 2% y 
urea 3 M. 
4) Sobrenadante del lavado con el 
amortiguador de lisis + DTT 1 mM. 
5) Pastilla al inicio de la serie de lavados. 
6) Pastilla resuspendida en 8 M de urea. 
7) Pastilla resuspendida en 6 M de GndHCl 
 
7 
29 
 
Como se puede notar en el gel SDS-PAGE de la figura 13, existe un mejor rendimiento en la 
purificación usando GndHCl como agente desnaturalizante, ya que se observa una mayor 
cantidad de la enzima presente en la muestra, aunque la pureza de ésta no es tan buena ya 
que están presentes varios contaminantes. Mientras en el caso de la solubilización de los 
cuerpos de inclusión empleando urea, se nota un aumento en la pureza aunque la 
concentración presente de proteína es mucho menor que en el caso de la muestra usando 
GndHCl. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12.- Análisis de fracciones de la nitrilasa Nit-NHis, obtenidas de la columna de afinidad después de agregar el amortiguador de elución 
(que contiene imidazol). A) Nitrilasa Nit-NHis solubilizada en urea. B) Nitrilasa Nit-NHis solubilizada en GndHCl. Para ambas muestras se 
señalan las fracciones seleccionadas para ser concentradas. 
 
Muestras seleccionadas 
Urea GndHCl 
 
Muestras seleccionadas 
 
A B 
Figura 13.- Comparativo entre los rendimientos de proteína obtenidos con los dos agentes 
desnaturalizantes (urea y GndHCl) .En el gel SDS-PAGE se indica la cantidad de proteína obtenida 
durante el proceso de concentración de la enzima. 
 
Urea 
(0.51mg/mL) 
GndHCl 
(2.5mg/mL) 
 
Concentrado Concentrado Sobrenadante Sobrenadante 
30 
 
Al analizar la fracción del sobrenadante resultante de la centrifugación de la muestra con 
GndHCl, se puede ver que existe una considerable cantidad de enzima, este efecto puede 
deberse a que la mayor concentración de proteína pudo superar los límites de retención del 
cartucho de filtración. En base a estos resultados, se decidió que para posteriores 
purificaciones sólo se resuspendería a la proteína en GndHCl después de la serie de lavados 
de los cuerpos de inclusión, ya que una menor cantidad de agente desnaturalizante en la 
muestra facilitaría su posterior eliminación en los protocolos de renaturalización de la enzima. 
 
6.4 Ensayos de renaturalización 
Dado que nos interesa conocer la actividad de la enzima Nit-NHis y esto no es posible debido 
a que se encuentra en un ambiente caotrópico, se procedió a la eliminación del agente 
desnaturalizante. Para ello se dializó a las muestras en un amortiguador con las mismas 
características, excepto que éste no contiene urea o GndHCl. Al finalizar los cambios de los 
amortiguadores respectivos, se procedió a evaluar el éxito del ensayo de renaturalización. De 
manera directa se apreció una alta cantidad de agregados a simple vista, tanto para la 
muestra que estaba en urea como la que contenía GndHCl. Al analizar un gel con el 
sobrenadante resultante de una centrifugación para eliminar los agregados, se pudo ver poca