Caracterizacion-de-una-expansina-de-pectobaterium-carotovorum-pcexl1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
Caracterización de una expansina de Pectobaterium 
carotovorum PcEXL1 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
 
PRESENTA: 
 
Q.B.P. MARIO ANTONIO MENDOZA NÚÑEZ 
 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
 
Dra. CLAUDIA MARTÍNEZ ANAYA-IBT, UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
 
Dr. ALFREDO MARTÍNEZ JIMÉNEZ-IBT, UNAM 
Dra. LILIANA PARDO LÓPEZ-IBT, UNAM 
 
 
 
CUERNAVACA MORELOS. OCTUBRE, 2014 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado bajo la 
dirección de la Dra. Claudia Martínez Anaya, en 
el departamento de Ingeniería Celular y 
Biocatálisis del Instituto de Biotecnología de la 
Universidad Nacional Autónoma de México. 
Durante los estudios de maestría se recibió una 
beca para estudios de posgrado otorgada por el 
CONACyT (No. 323158) 
La investigación fue realizada gracias al apoyo 
del donativo de Ciencia Básica SEP-CONACyT 
166050. 
DEDICATORIAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A la memoria de mi Madre por enseñarme a 
darle una buena cara a la vida. 
 
A mi Padre por ser un ejemplo de superación, 
trabajo y constancia. 
 
A mi Hermano por alegrarme la vida. 
 
A Citlali por estar siempre presente y 
apoyarme en los buenos y malos momentos. 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A la Dra. Claudia Martínez Anaya por brindarme la oportunidad de trabajar y 
aprender de ella, brindarme su confianza, apoyo, paciencia y tiempo desde el primer 
momento. 
 
Al Dr. Lorenzo Segovia por la oportunidad, por su buen humor y propiciar que en 
su laboratorio siempre hubiera un ambiente ameno. 
 
A la Dra. Marcela Ayala por su apoyo y conocimientos brindados. 
 
Al Dr. Alfredo Martínez y Dra. Liliana Pardo por su aportación al desarrollo de este 
proyecto. 
 
A los miembros de mi comité evaluador por su tiempo y aportaciones a este 
proyecto. 
 
A Adrián Duque, Anahí Tornes, Daniel Locia, Yazmín Godínez y Citlali Sollano por 
su amistad incondicional. 
 
A Banda, Dago, Fer, Gustavo, Iris, Kati, Miguel y Valerie por su amistad, apoyo y 
conocimientos brindados que aportaron a mi aprendizaje académico y personal. 
 
Al resto de integrantes del laboratorio que hicieron de este, un lugar agradable 
para trabajar y convivir. 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
I. RESUMEN..................................................................................................................................... 1 
II. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................... 2 
1.1 Pared celular vegetal. .......................................................................................... 3 
2.1.1 Generalidades de la pared celular. .................................................................................... 3 
2.1.2 Componentes estructurales de la pared celular vegetal primaria. .................................... 4 
Hemicelulosa. .............................................................................................................................. 4 
Pectina. ........................................................................................................................................ 5 
Celulosa. ...................................................................................................................................... 6 
2.1.3 Modificación de las paredes celulares vegetales. .................................................. 7 
2.2. Expansinas. ............................................................................................................. 8 
2.2.1 Clasificación de las expansinas. .......................................................................................... 8 
2.2.2 Estructura de las expansinas. .................................................................................... 10 
2.2.3 Funciones generales de las expansinas. ........................................................................... 12 
2.2.3 Papel fisiológico de las expansinas en plantas. ......................................................... 13 
2.2.5 Expansinas en otros organismos. ..................................................................................... 15 
III. ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 16 
IV. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 19 
V. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................................... 19 
VI. OBJETIVOS PARTICULARES ........................................................................................................ 19 
VII. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................................................... 20 
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................................ 26 
IX. CONCLUSIONES ......................................................................................................................... 43 
X. PERSPECTIVAS ........................................................................................................................... 45 
XI. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................ 46 
Anexo I. Presentación en congresos. ................................................................................................ 51 
Anexo II. Articulo .............................................................................................................................. 52 
 
TABLA DE FIGURAS 
 
Figura 1. Estructura y composición de la pared celular. ..................................................................................... 4 
Figura 2. Unidades estructurales de las hemicelulosas. ..................................................................................... 5 
Figura 3. Estructuras representativas de pectinas de la pared celular.. ............................................................. 6 
Figura 4. Representación esquemática de la cadena de celulosa. ..................................................................... 7 
Figura 5. Análisis filogenético de la superfamilia de las expansinas. ................................................................. 9 
Figura 6. Esquema de la estructura de las expansinas.. ................................................................................... 10 
Figura 7. Superposición del sitio catalítico de las GH45 (azul) y los residuos correspondientes en D1 de las 
expansinas (rojo). ............................................................................................................................................. 11 
Figura 8. Vista superior de la superficie conservada de EXPB1 de Zea mays. .................................................. 11 
Figura 9. Superposición de EXLX1 y EXPB1. ......................................................................................................12 
Figura 10. Superposición de BsEXLX1 y PcEXL1. ............................................................................................... 16 
Figura 11. Efecto del pH en la carga neta teórica de BsEXLX y PcEXL1 a diferente pH. .................................... 17 
Figura 12. Representación de las cargas electrostáticas en la superficie de PcEXL1 y BsEXLX1. ...................... 17 
Figura 13. Esquema representativo del plasmido pET22b................................................................................ 21 
Figura 14. Hipocotilo y coleóptilo de dicotiledóneas o monocotiledóneas.. ..................................................... 24 
Figura 15. Debilitamiento de papel filtro por PcEXL1.. ..................................................................................... 27 
Figura 16. Termograma de PcEXL1. .................................................................................................................. 28 
Figura 17. Efecto del pH en la unión de diferentes proteínas a pared celular de coleóptilos de trigo.. ............ 29 
Figura 18. Efecto del pH en la unión de PcEXL1 a papel filtro. ......................................................................... 31 
Figura 19. Unión a paredes celulares fraccionadas.. ........................................................................................ 33 
Figura 20. Unión a paredes celulares de diferentes plantas. ............................................................................ 34 
Figura 21. Efecto de la concentración de NaCl en la unión a Avicel. ................................................................ 36 
Figura 22. Efecto de PcEXL1 en la hidrólisis enzimática de bagazo de maíz. ................................................... 38 
Figura 23. Efecto de PcEXL1 en la hidrólisis enzimática de papel filtro. ........................................................... 38 
Figura 24. Expansinas purificadas. ................................................................................................................... 40 
Figura 25. Debilitamiento de papel filtro por variantes de PcEXL1. ................................................................. 40 
Figura 26. Unión relativa de variantes de PcEXL1 a paredes celulares de trigo y papel filtro. ......................... 41 
 
 
 
 
 
~ 1 ~ 
 
I. RESUMEN 
Las expansinas de plantas son proteínas involucradas en el crecimiento celular 
vegetal (McQueen-Mason, Durachko y Cosgrove, 1992). También se han identificado 
proteínas homólogas en bacterias, hongos, eucariotes unicelulares y animales, muchos 
de los cuales son patógenos o simbiontes de las plantas. Se especula que estás 
expansinas pudieran ser parte de la maquinaria celulolítica de estos microorganismos 
para acceder a los tejidos vegetales (Nikolaidis, Doran y Cosgrove, 2014). 
En este trabajo tomamos como modelo de estudio la expansina PcEXL1, 
proveniente de Pectobacterium carotovorum –fitopatógeno de alta importancia 
económica– debido eficiente expresión heteróloga en E. coli y su fácil purificación. 
Nosotros demostramos que PcEXL1 provoca debilitamiento del papel filtro, 
presenta unión a paredes celulares de diferentes plantas y a celulosa pura (papel filtro y 
Avicel), que son características clásicas de las expansinas. Además determinamos la 
unión de PcEXL1 a paredes celulares fraccionadas, lo que permitió establecer que el sitio 
blanco de PcEXL1 son las cadenas de celulosa. Además al generar variantes de PcEXL1 
con mutaciones en aminoácidos altamente conservados y localizados en el surco de 
unión a polisacáridos (PBS), determinamos que el residuo D82 participa en la actividad de 
debilitamiento sobre papel filtro, mientras que los residuos aromáticos Y126, W127 y Y158 
en su conjunto, están involucrados en la unión a la pared celular vegetal y al papel filtro. 
A pesar de que algunas expansinas han mostrado sinergismo con 
glicosilhidrolasas para la liberación de azúcares reductores a partir de la biomasa 
lignocelulósica (Bunterngsook et al., 2014); PcEXL1 no presenta sinergismo con celulasas 
o xilanasas bajo las condiciones de reacción utilizadas en este trabajo. 
Se ha observado que las expansinas pueden clasificarse según su naturaleza 
electrostática, como ácidas (pI <5) o básicas (pI >9) y se piensa que estás diferencias en 
carga eléctrica están involucradas en su localización en sitios específicos de la pared 
celular vegetal. Nosotros comparamos la unión de PcEXL1 que es una expansina ácida a 
pH 7.5, con BsEXLX1 que es una expansina básica, a paredes celulares de diferente 
origen, y por lo tanto de diferente composición, observando que la naturaleza 
electrostática de las expansinas juega un papel importante en la unión productiva a las 
paredes celulares vegetales. 
~ 2 ~ 
 
II. INTRODUCCIÓN 
 
Durante el crecimiento celular vegetal, y durante la interacción entre patógenos ó 
simbiontes y plantas, se encuentra involucrada la actividad de diferentes expansinas, ya 
sea de las provenientes de las plantas o las secretadas por el microorganismo. Las 
expansinas provocan el debilitamiento de la pared celular vegetal sin provocar hidrólisis, 
lo que permite el crecimiento celular y además parece facilitar la acción de 
glicosilhidrolosas sobre la pared celular (McQueen-Mason, Durachko, y Cosgrove, 1992; 
Lee et al., 2010; Kerff et al., 2008). 
El estudio de las expansinas es importante debido a su potencial aplicación en el 
área agrícola, como blanco para la prevención de infecciones vegetales por patógenos 
como Pectobacterium carotovorum o para favorecer la colonización por organismos 
benéficos como Bacillus subtilis. Por otra parte, debido a que la acción de las expansinas 
bajo ciertas condiciones facilita la liberación de azúcares reductores por enzimas 
glicosilhidrolasas, ha despertado el interés de su aplicación en el área energética, como 
pretratamiento de la biomasa lignocelulósica para la producción de biocombustibles. (Lee 
et al., 2010; Bunterngsook et al., 2014; Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013; Olarte-
Lozano et al., 2014). 
Hasta el momento no se conoce el mecanismo de acción de las expansinas, 
aunque la evidencia apunta a que actúan mediante la disrupción de los enlaces no 
covalentes presentes entre los polisacáridos de la pared celular. Algunas de las limitantes 
para entender el mecanismo de acción de estas proteínas son: la complejidad estructural 
de la pared celular, la falta de productos liberados o modificados por la acción de las 
expansinas que puedan ser monitoreados de manera sencilla, y el desconocimiento del o 
los sitios blanco de su acción. 
 En este proyecto, se caracterizó una nueva expansina ácida proveniente de 
Pectobacterium carotovorum, a la que llamamos PcEXL1. Se establecieron las 
condiciones de purificación y de acción para PcEXL1, se determinó la importancia de 
aminoácidos altamente conservados, y además debido a que se cree que la naturaleza 
electrostática de las expansinas es importante para su actividad o localización dentro de 
la pared celular, en el presente trabajo se comparó el comportamiento en la unión a 
~ 3 ~ 
 
paredes celulares vegetales entre una expansina ácida (PcEXL1) y una expansina básica 
(BsEXLX1) proveniente de Bacillus subtilis. 
1.1 Pared celular vegetal. 
 
 Las células vegetales en crecimiento están rodeadas de una pared primaria rica 
en polisacáridos formando una matriz extracelular compleja que rodea y dicta la forma de 
cada célula, también controla la tasa y la dirección de crecimiento. Además, la pared 
celular contribuye en la especialización funcional de los diferentes tipos celulares, a la 
comunicación intracelular, al movimiento de agua y la defensa contra patógenos 
(Cosgrove, 2005). 
2.1.1 Generalidades de la pared celular. 
 
 En las células vegetales en crecimiento, la pared celular es típicamente una 
capa delgada y flexible (de 0.1-1 µm deespesor) altamente organizada. Ésta consiste 
principalmente de una mezcla compleja de polisacáridos, lignina y una pequeña cantidad 
de proteínas estructurales, que forman una fuerte red que da forma al protoplasto (figura 
1) (Cosgrove, 2005; Lee, 1997). Sin embargo, no todas las funciones de la pared celular 
son estructurales; también contiene moléculas que afectan los patrones de desarrollo y 
marcan una posición de las células dentro de la planta o participan en la comunicación 
célula-célula y comunicación intracelular (Keegstra, 2010). Además, los fragmentos de 
polisacáridos que conforman la pared celular al ser liberados por enzimas específicas 
pueden inducir la secreción de moléculas de defensa contra organismos patógenos como 
hongos y bacterias (Caffall y Mohnen, 2009). 
 
~ 4 ~ 
 
 
Figura 1. Estructura y composición de la pared celular. Las microfibrillas de celulosa (color morado) son 
sintetizadas en la membrana celular, mientras que la hemicelulosa y la pectina son sintetizados en el aparato 
de Golgi y depositados en la pared a través de vesículas (Cosgrove, 2005). 
 
2.1.2 Componentes estructurales de la pared celular vegetal primaria. 
 
 La composición y arreglo molecular de los polímeros de la pared celular vegetal 
difieren entre especies, pero también entre tejidos de una misma especie, entre células 
individuales, y entre diferentes regiones de la pared celular. Aproximadamente el 90% de 
la pared celular vegetal primaria está formada por carbohidratos, mientras que el 10% 
restante son proteínas. Los principales carbohidratos que forman la pared celular vegetal 
son la hemicelulosa, la pectina y la celulosa (figura1) (Bacic, Harris, y Stone, 1988). 
 
Hemicelulosa. 
 La hemicelulosa es un grupo heterogéneo de polisacáridos que incluye 
xiloglucanos, xilanos, mananos y glucanomananos. Se caracteriza por presentar 
esqueletos de azúcares principalmente xilosa y arabinosa, con uniones β 1-4 en 
configuración ecuatorial (figura 2) (Chandrakant y Bisaria, 1998). La estructura de la 
hemicelulosa y su abundancia varía ampliamente entre diferentes especies y tipos 
celulares. Los xiloglucanos predominan en las paredes celulares primarias de 
dicotiledóneas y coníferas, mientras que los glucuronoarabinoxilanos son predominantes 
en monocotiledóneas. 
 El papel biológico más importante de la hemicelulosa es su contribución al 
fortalecimiento de la pared celular por interacción con las microfibrillas de celulosa 
(Ebringerová, Hromádková y Heinze, 2005). 
~ 5 ~ 
 
 
Figura 2. Unidades estructurales de las hemicelulosas. La hemicelulosa se caracteriza por presentar 
uniones β-(1→4) con una configuración ecuatorial entre el C1 y C4 (Scheller y Ulvskov, 2010). 
 
Pectina. 
 La pectina es una mezcla heterogénea de polisacáridos ramificados y altamente 
hidratados, ricos en ácido D-galacturónico. La pectina incluye diferentes clases 
estructurales de polisacáridos: homogalacturonano (HG), xilogalacturonano II (XGA), 
apiogalacturonano (AGA), rhamnogalacturonano I (RG-I), y rhamnogalacturonano II (RG-
II) (figura 3). 
 
 La pectina es abundante en la pared celular vegetal, llegando a ser hasta el 30% 
de la pared de dicotiledóneas y gimnospermas, y el 10% en monocotiledóneas gramíneas. 
Se ha sugerido que la pectina se encuentra unida a la hemicelulosa, a compuestos 
fenólicos y a proteínas, lo que añade una complejidad estructural y funcional a esta 
estructura (Caffall y Mohnen, 2009). 
 
 Se cree que la pectina realiza varias funciones como: determinar la porosidad de 
la pared celular regulando el acceso de las enzimas a sus sustratos; proveer superficies 
cargadas que modulan el pH y el balance de iones; regular la adhesión célula-célula; 
servir como moléculas de reconocimiento que alertan de la presencia de organismos 
simbiontes, patógenos e insectos; y finalmente servir como sitio de unión para enzimas 
particulares de la pared celular a través de interacciones electrostáticas, permitiendo 
localizarlas en regiones específicas de la pared celular (Caffall y Mohnen, 2009). 
~ 6 ~ 
 
 Adicionalmente la pectina es el principal blanco de ataque en la invasión por 
microorganismos, y sus productos de degradación funcionan como potentes inductores de 
la respuesta de defensa en las plantas (Cosgrove, 2005). 
 
 
Figura 3. Estructuras representativas de pectinas de la pared celular. Las estructuras representan 
fragmentos de moléculas más grandes. Excepto la de RGII, que es altamente conservada, se cree que las 
otras clases de moléculas presentan diversidad estructural sustancial dentro de la misma planta. Símbolos: a, 
acetato; A, L-arabinosa; C, L-acido acerico; D, ácido D-3-deoxy-D-lyxo-2-heptulopiranosilarico; F, L-fucosa; G, 
D-glucosa; K, ácido D-3-deoxy-D-manno-octulosónico; L, D-galactosa; m, metil; P, D-apiosa; R, L-rhamnosa; U, 
ácido D-galacturonico; V, ácido D-glucuronico; X, D-xylose. Abreviaciones: HG, Homogalacturonano; RGI, 
rhamnogalacturonano I; RGII, rhamnogalacturonano II (Vorwerk, Somerville, and Somerville, 2004). 
 
Celulosa. 
 La celulosa es el polisacárido más abundante en la pared celular vegetal (15-
30% del peso seco), es un homopolímero lineal de residuos de D-glucosa unidos por 
enlaces O-glicosídicos β 1-4 (figura 4). Este homopolímero está asociado con otras 
cadenas de celulosa mediante enlaces de hidrógeno y fuerzas de Van de Waals (Caffall y 
Mohnen, 2009). La estructura de la celulosa consiste de 30 moléculas lineales, de entre 
10,000 y 14,000 moléculas de glucosa, que forman una estructura conocida como 
protofibrilla, estas a su vez se asocian formando fibrillas de celulosas, que se ensamblan 
entre ellas para formar fibras de celulosa. Estas fibras de celulosa están unidas mediante 
interacciones no covalentes con la hemicelulosa, la pectina y la lignina (Gama, Teixeira et 
al., 1994; Galbe y Zacchi, 2007; Arantes y Saddler, 2010). 
 
~ 7 ~ 
 
 
Figura 4. Representación esquemática de la cadena de celulosa. Homopolímero de residuos D-Glucosa 
unidos por enlaces β 1-4 (Pérez y Mazeau, 2005). 
 
2.1.3 Modificación de las paredes celulares vegetales. 
 
 La pared celular vegetal de los tejidos en crecimiento es un compartimento 
dinámico que cambia a través de la vida de la célula y ejerce una profunda influencia en el 
desarrollo y la morfología de las plantas (Varner y Lin, 1989). Cada célula vegetal se 
diferencia en forma, tamaño y propiedades estructurales únicas, esta diferenciación 
requiere una importante remodelación de la pared celular, en la cual los componentes 
pueden ser modificados constantemente. 
 
 Durante el crecimiento celular y en otros procesos fisiológicos como el 
ablandamiento de frutos, abscisión de órganos, germinación de semillas, etc., se llevan a 
cabo modificaciones en la estructura de la pared celular. Aunque la fuerza mecánica para 
el movimiento de los polímeros proviene del estrés sobre la pared (mediante la fuerza de 
turgencia, que es muy grande en las células vegetales), el control del proceso reside en la 
relajación selectiva y en los cambios en las uniones entre las microfibrillas de celulosa 
(Cosgrove, 2005). Durante estos procesos fisiológicos, el debilitamiento (loosening) de la 
red estructural de la pared celular es una característica importante que involucra la acción 
concertada y sinérgica de un conjunto de enzimas, que provocan la restructuración de la 
pared celular (Rose y Bennett, 1999). 
 
Originalmente, a partir de paredes celulares de hipocotilos de pepino, se aislaron 
dos proteínas que promueven la extensibilidad de la pared celular sin provocar hidrólisis 
de los polisacáridos, posteriormente se identificaron otras proteínas similares en 
diferentes plantas, a estas proteínas debilitadoras de la pared celular se les llamó 
expansinas (McQueen-Mason, Durachko y Cosgrove, 1992). 
 
~ 8 ~ 
 
2.2. Expansinas. 
 
 Las primeras expansinas fueron identificadas porMcQueen y colaboradores en 
1992, como proteínas capaces de inducir una rápida extensión de paredes celulares de 
una manera dependiente del pH. Típicamente las expansinas de plantas son activas entre 
pH 4.5-6, que es el rango de pH fisiológico de las paredes celulares en crecimiento 
(McQueen et al, 1992). Por otra parte, se ha sugerido que la interacción inicial de algunos 
organismos patógenos de plantas con las paredes celulares vegetales requiere de 
proteínas homólogas a las expansinas, que son expresadas por los patógenos. 
 
 La degradación de la pared celular vegetal por ataque de patógenos, 
típicamente ocurre a través de la acción de un conjunto de enzimas secretadas por los 
microorganismos, tales como celulasas, pectinasas, xilanasas y proteasas. Además, 
existen evidencias que sugieren que las proteínas amorfogénicas (expansinas, 
swolleninas y looseninas) también están involucradas en este proceso, provocando la 
disrupción de las interacciones débiles entre los polímeros de las paredes celulares (Kerff 
et al., 2008; Brotman et al., 2008; Arantes y Saddler, 2010; Quiroz-Castaneda et al., 
2011). 
 
2.2.1 Clasificación de las expansinas. 
 
 Los análisis genómicos y filogenéticos muestran que las expansinas de plantas 
forman una superfamilia de proteínas, estas son divididas en cuatro familias distintas: 
EXPA, EXPB, EXLA, EXLB (Figura 5). Las expansinas de diferentes familias comparten 
un 20-40% de identidad. Se ha demostrado experimentalmente que dos de las cuatro 
familias de expansinas vegetales tienen miembros con habilidad de provocar extensión en 
paredes celulares (EXPA o α-expansinas, y EXPB o β-expansinas), mientras que la 
función de las otras dos familias relacionadas (EXLA y EXLB) aún no han sido 
establecidas. Un estudio de expresión de EXLA en arroz, sugieren que no están 
involucradas en el crecimiento, y su función podría ser diferente a la de las EXPA y EXPB 
(Lee y Kende, 2002). 
 
 Además de las cuatro familias de expansinas de plantas, existen otros dos 
clados más distantes, que incluyen proteínas tipo-expansina (por practicidad, en este 
~ 9 ~ 
 
trabajo se llamarán solamente expansinas), identificadas en organismos distintos a las 
plantas (bacterias, hongos, eucariotes unicelulares y animales). Estos organismos, 
generalmente tienen relación directa con las plantas, ya sea como patógenos, simbiontes 
o bien producen celulosa durante su ciclo de vida (Lee et al., 2010; Quiroz-Castañeda et 
al., 2011; Brotman et al., 2008; Nikolaidis, Doran, y Cosgrove, 2014). Se piensa que estas 
expansinas fueron adquiridas mediante transferencia horizontal a partir de las plantas 
(Nikolaidis, Doran y Cosgrove 2014). 
 
 Alineamientos entre expansinas de plantas y expansinas de bacterias muestran 
una baja identidad (~15%). Sin embargo, Kerff y colaboradores (2008), determinaron la 
estructura cristalográfica de la proteína BsEXLX1 codificada por el gen yoaJ de Bacillus 
subtilis, y encontraron que a pesar de la baja identidad en su secuencia primaria, 
BsEXLX1 presenta homología estructural con las β-expansinas de maíz (figura 6). Sin 
embargo, a pesar de esta similitud, la actividad de las expansinas bacterianas reportadas 
hasta ahora llega a ser hasta 100 veces menor a la observada en expansinas de plantas 
(Kerff et al., 2008). 
 
 
 
Figura 5. Análisis filogenético de la superfamilia de las expansinas. Las subfamilias conocidas son 
representadas como EXPA (α-expansinas), EXPB (β-expansinas), EXLA (tipo-expansinas A), EXLB (tipo-
expansinas B) y EXLX (tipo-expansinas grupo X) ( Lee et al. 2010). 
 
 
 
~ 10 ~ 
 
2.2.2 Estructura de las expansinas. 
 
 Las expansinas presentan en el extremo amino terminal un péptido señal de 
exportación extracelular de ~25 residuos de aminoácidos el cual se corta para formar una 
proteína madura de ~225 residuos y un peso de ~25 kDa (Figura 6) (Kerff et al., 2008). 
 
 Las expansinas están formadas por dos dominios estructurales. El dominio N-
terminal o D1 tiene un peso de ~15 kDa y adquiere un plegamiento de barril β de doble Ψ, 
formado por tres α hélices y seis hojas β. El D1 tiene un 20% de identidad al dominio 
catalítico de la familia 45 de las endoglucanasas (GH45). Adicionalmente a la 
conservación parcial del plegamiento de las GH45, el D1 conserva parte del sitio catalítico 
identificado en las GH45 (figura 7). Sin embargo el Asp que sirve como base catalítica en 
las hidrolasas no está presente en las expansinas y la ausencia de este Asp podría 
explicar la falta de actividad hidrolítica en las expansinas (Yennawar et al., 2006; Arantes 
y Saddler, 2010). 
 
 El dominio C-terminal o D2 tiene un peso de ~10 kDa y está organizado en dos 
hojas β de cuatro cadenas antiparalelas, formando un β-sandwich parecido a las 
inmunoglobulinas. El D2 adquiere un plegamiento común a los módulos de unión a 
carbohidratos (CBM), especialmente al CBM tipo A, algunos de los cuales son específicos 
para unión a celulosa cristalina o a quitina (molécula similar a la celulosa). Actualmente el 
D2 se considera como un CBM funcional y se clasifica en la familia 63 según la base de 
datos CAZY (http://www.cazy.org/CBM63.html). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
Figura 6. Esquema de la estructura de las expansinas. En color verde se muestra el D1 y en azul el D2 
A) BsEXLX1: expansina de Bacillus subtilis, B) EXPB1: expansina de Zea mays. 
 
~ 11 ~ 
 
 
 
Figura 7. Superposición del sitio catalítico de las GH45 (azul) y los residuos correspondientes en D1 de 
las expansinas (rojo). Las expansinas conservan parte del sitio catalítico de las GH45. Otros residuos 
conservados en las expansinas se muestras de morado. Se ha propuesto que la falta del Asp10 en las 
expansinas es la causa de la falta de la actividad hidrolítica (Yennawar et al., 2006). 
 
 Con el análisis de las estructuras cristalográficas y estudios de mutagénesis 
dirigida, se ha identificado una superficie de unión a polisacáridos (PBS: polysaccharide 
binding surface) que abarca ambos dominios estructurales. Es importante mencionar que 
los residuos que forman el PBS están conservados tanto en expansinas de plantas como 
en expansinas de otros organismos (figura 8) (Yennawar et al., 2006). 
 
Figura 8. Vista superior de la superficie conservada de EXPB1 de Zea mays. A) Superficie conservada de 
EXPB1, el color indica el nivel de conservación (rojo: más conservada; azul: menos conservada; blanco: 
intermedio). B) Modelo de glucoronoarabinoxylano (amarillo y rojo) manualmente ajustado al PBS (rojo), D1 
(verde) y D2 (azul). C) vista lateral del modelo B, se observa una segunda superficie conservada (naranja) 
(Yennawar et al., 2006) 
 Debido a que las expansinas de plantas no habían podido ser expresadas 
heterólogamente, BsEXLX1 ha sido ampliamente analizada en trabajos de estructura-
C B A 
~ 12 ~ 
 
función. En BsEXLX1 se han identificado varios residuos que forman parte del PBS y que 
son importantes para la actividad: T-12, T-14, S-16, D-71, Y-73, E-75, D-82 en el D1 y K-
119, D-125, D-126, Y-157 en el D2. Destacando la importancia del D-82 en la actividad, y 
de los residuos aromáticos W-125, W-126, Y-157 en la unión a celulosa pura, y que 
resultan ampliamente conservados en todas las expansinas (figura 9). La mutación de 
estos residuos provoca la disminución o la pérdida de actividad, sin afectar de manera 
importante a la estructura de la proteína (Georgelis et al., 2011). 
 
Figura 9. Superposición de EXLX1 y EXPB1. Superposición de una expansina de planta y una proteína tipo-
expansina bacteriana, donde se remarcan algunos de los aminoácidos altamente conservados e importantes 
para la actividad o unión a sustrato (Kerff et al., 2008) . 
 
 Existen también expansinas que además de contener los dos dominios 
característicos, poseen otros dominios adicionales. Estos pueden ser módulos de unión a 
carbohidratos o celulasas (GH5) y pueden estarlocalizados en el extremo amino o en el 
carboxilo de las expansinas (Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013; Nikolaidis, Doran, y 
Cosgrove, 2014). 
2.2.3 Funciones generales de las expansinas. 
 
 Los principales métodos para medir la actividad in vitro de las expansinas se 
basan en su capacidad para romper los enlaces no covalentes, presentes entre los 
polisacáridos que conforman las paredes celulares o el papel filtro (celulosa pura). 
D1 D2 
~ 13 ~ 
 
El rompimiento de estos enlaces no covalentes permite el deslizamiento de los 
polisacáridos de un tejido vegetal (creep), y al aplicarle tensión, simulando la fuerza de 
turgencia que ocurre durante el crecimiento celular, y mediante un extensómetro se mide 
la elongación del tejido vegetal inducido por las expansinas. Por otra parte, este mismo 
mecanismo de acción, provoca debilitamiento del papel filtro, que está compuesto de 
celulosa pura, esto se traduce en una disminución de la fuerza tensil; es decir, la fuerza 
necesaria para romperlo disminuye, y ésta se puede medir mediante un tensómetro de la 
marca Instron (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; Kim et al., 2009; Georgelis et al., 
2011; Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013). 
Otra de las características observadas en las expansinas es su capacidad de 
unión a paredes celulares de plantas y a celulosa pura como Avicel, papel filtro y celulosa 
bacteriana microcristalina. Además, bajo ciertas condiciones de reacción, se ha 
observado un efecto sinérgico entre expansinas y glicosilhidrolasas, aumentando la 
liberación de azúcares reductores a partir de biomasa lignocelulósica o celulosa (Lee et 
al., 2010; Bunterngsook et al., 2014; Kim et al., 2009). 
2.2.3 Papel fisiológico de las expansinas en plantas. 
 
 La actividad bioquímica y fisiológica de las expansinas de plantas ha sido 
descrita ampliamente en la literatura. Cuatro líneas de evidencia soportan la idea de que 
las expansinas regulan la elongación de la pared celular: 1) Cuando el crecimiento ácido 
–el cual ocurre al acidificarse la pared celular por acción de bombas de protones 
inducidas por hormonas, lo que provoca debilitamiento de la pared celular y aumento de la 
presión interna de turgencia permitiendo el crecimiento celular– en paredes celulares 
aisladas es eliminado por calor o por tratamiento con proteasas, puede ser restituido 
completamente por la adición de expansinas purificadas. Esto indica que las expansinas 
provocan el reblandecimiento de la pared celular y que su acción es suficiente para 
restaurar la extensibilidad de las paredes celulares (McQueen, Durachko, y Cosgrove, 
1992). 2) La adición de expansina exógena estimula el crecimiento; demostrando que las 
expansinas endógenas son limitantes para el crecimiento celular (Link y Cosgrove, 1998; 
Fleming et al., 1997). 3) La expresión ectópica de expansinas estimula el crecimiento, 
mientras que la supresión por silenciamiento de genes provoca un crecimiento disminuido 
(Pien et al., 2001; Choi et al., 2003). 4) Los niveles de expresión de expansina endógena 
~ 14 ~ 
 
correlacionan positivamente con el aumento o negativamente con el cese del crecimiento 
celular (Cho y Kende, 1997). 
Estudios de expresión genética sugieren la implicación de las expansinas en varios 
procesos fisiológicos del desarrollo de las plantas durante los cuales ocurre 
ablandamiento de la pared celular vegetal, como el crecimiento, ablandamiento de frutos, 
formación de xilema, abscisión de órganos, germinación de semillas y penetración del 
tubo polínico (Cho y Cosgrove, 2000; Belfield, 2005; Brummell et al., 1999; Wu et al., 
2001). 
Además, mediante estudios de inmunolocalización y microscopia electrónica se ha 
observado que las expansinas se localizan exclusivamente en la pared celular, indicando 
que este es su sitio blanco. 
 No es claro como las expansinas catalizan el alargamiento de la pared celular. El 
mecanismo generalmente aceptado involucra, como ya se mencionó, la disrupción de los 
enlaces de hidrógeno entre las microfibrillas de celulosa y la red de xiloglucanos, lo que 
provoca el “creep” (extensión de la pared celular vegetal) (Jones et al., 2003). Esta 
hipótesis está basada en varias observaciones: 1) En paredes aisladas el “creep” inducido 
por las expansinas ocurre rápidamente, en contraste con la acción de las endoglucanasas 
de hongos, con las que se requiere de una digestión prolongada antes de que ocurra la 
inducción de “creep”. Esta diferencia sugiere que las expansinas no actúan mediante 
hidrolisis de enlaces covalentes (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995); 2) Se ha observado 
que sin provocar hidrolisis, las expansinas producen el debilitamiento de papel filtro, que 
es una red de fibras de celulosa unidas por enlaces de hidrógeno (Lee et al. 2010; 
Georgelis et al. 2011; Choi et al. 2003; Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013); 3) Las 
expansinas actúan sinérgicamente con las celulasas mejorando la hidrólisis de la celulosa 
cristalina (Kim et al., 2009; Wei et al., 2010), sin embargo no todos los reportes apoyan 
estas observaciones; 4) Estimulan la extensión de la pared celular y su subsecuente 
remoción restaura la pared a un estado inextensible, lo que indica que las expansinas no 
alteran mayormente la estructura de la pared ni degradan el entrecruzamiento de los 
polímeros (McQueen-Mason y Cosgrove, 1995). 
 
 
~ 15 ~ 
 
2.2.5 Expansinas en otros organismos. 
 
 Además de BsEXLX1 recientemente se han identificado y caracterizado otras 
expansinas en bacterias y hongos (HcEXLX2, Clavi-EXP, Xantho-EXP, Ralstonia-EXP, 
Asper-EXP, BpEX, CmEX, MaEX, PcEX, SaEX) provenientes de Hahella chejuensis, 
Clavibacter michiganensis, Xanthomonas campestris, Ralstonia solanacearum, Aspegillus 
niger, Bacillus pumilus, Pectobacterium carotovorum, Stigmatella aurantiaca, Clavibacter 
michiganensi y Micromonospora aurantiaca respectivamente. Estas expansinas provocan 
efectos de debilitamiento sobre papel filtro y/o “creep” sobre paredes celulares vegetales, 
características clásicas de las expansinas de plantas (Bunterngsook et al., 2014; 
Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013). 
En el 3% de los genomas bacterianos, el 5% de los genomas de hongos y en 
algunos eucariontes, a través de análisis filogenéticos se han identificado secuencias que 
codifican para proteínas homologas a BsEXLX1 (Nikolaidis, Doran y Cosgrove., 2014). 
 Se cree que las expansinas de organismos diferentes a las plantas, confieren una 
ventaja durante la interacción con estas. Está idea se basa en que estas proteínas están 
presentes en un reducido grupo de organismos que es filogenéticamente divergente, pero 
que tienen interacción directa con plantas, ya sea como patógenos, simbiontes o que 
producen celulosa durante alguna etapa de su ciclo de vida (Nikolaidis, Doran y Cosgrove, 
2014). Además, las cepas de Bacillus subitilis que no expresan BsEXLX1 tienen una 
menor capacidad para colonizar raíces de maíz que las cepas silvestres y cultivos de 
Tricoderma reesei en medios con celulosa o soforosa (un fuerte inductor de celulasas) 
como única fuente de carbono, sobreexpresan una proteína homologa a las expansinas, 
llamada swollenina (Saloheimo et al., 2002). 
 
 
 
 
~ 16 ~ 
 
III. ANTECEDENTES 
 
Pectobacterium carotovorum es una bacteria fitopatógena, responsable de la 
podredumbre blanda en distintas especies de plantas, afectando a un amplio rango de 
vegetales frescos, cultivos y plantas ornamentales. Su infectividad se debe a la 
producción de factores de virulencia regulados por los sistemas de quorum sensing (QS). 
P. carotovorum expresa una variedad de enzimas extracelulares que actúan sobre los 
tejidos vegetales, como pectinasas (pectato liasas, poli-galacturonasas y pectin metil-
esterasas), sideróforos, moléculas efectoras Tipo III, proteasas y celulasas (Lee et al., 
2013; Põllumaa, Alamäe, and Mäe, 2012; Davidsson et al., 2013)En nuestro laboratorio, se clonó en el vector pET22 una secuencia de 621 pb, que 
codifica para una probable expansina a la que llamamos PcEXL1, de aproximadamente 
23 kDa y con un 56.5% de identidad con BsEXLX1. La secuencia fue obtenida a partir de 
una cepa de P. carotovorum, aislada de un nopal en el estado de México, amablemente 
donada por el Dr. Oscar Mascorro del Departamento de Fitotecnia de la Universidad 
Autónoma de Chapingo (González-Rodríguez, Silva-Rojas, y Mascorro-Gallardo, 2005). 
 
 PcEXL1 tiene características semejantes a BsEXLX1: tamaño similar (203 vs 
208 aa); la presencia de una secuencia señal de exportación celular, lo cual que indica 
que tanto PcEXL1 como BsEXLX1 son proteínas de actividad extracelular; y además, el 
análisis de predicción de estructura en el servidor I-TASSER sugiere un plegamiento muy 
parecido entre ambas moléculas (figura 10), lo que en su conjunto sugiere que PcEXL1 es 
una expansina. 
 
Figura 10. Superposición de BsEXLX1 y PcEXL1. Se muestra la superposición de PcEXL1 en verde 
(modelo estructural I-TASSER) sobre BsEXLX1 (cristal) en azul. 
 
~ 17 ~ 
 
 Una característica distintiva entre BsEXLX1 y PcEXL1 es su punto isoeléctrico, 
de 9.02 y 4.86, respectivamente. Olarte-Lozano y colaboradores en 2014, calcularon los 
cambios en la carga global teórica de BsEXLX1 y PcEXL1 por efecto del pH, observando 
que BsEXLX1 mantiene carga positiva relativamente constante desde pH 4.5 a 9.5, 
mientras que PcEXL1 muestra carga negativa a pH mayor a 6 (figura 11). Los 
aminoácidos que provocan estas diferencias en el punto isoeléctrico están principalmente 
localizados en la superficie del lado posterior del PBS (figura 12) (Olarte-Lozano et al., 
2014). 
 
Figura 11. Efecto del pH en la carga neta teórica de BsEXLX y PcEXL1 a diferente pH. Se muestran los 
cambios en la carga neta de ambas proteínas, BsEXLX (círculos negros), PcEXL1 (cuadros blancos) (Olarte-
Lozano et al. 2014). 
 
Figura 12. Representación de las cargas electrostáticas en la superficie de PcEXL1 y BsEXLX1. A la 
izquierda se observa la cara posterior de PcEXL1 mientras que a la derecha la cara posterior al PBS de 
BsEXLX1, de color rojo se representan las cargas negativas y de azul las cargas positivas (Olarte-Lozano et 
al., 2014) 
~ 18 ~ 
 
 
 En nuestro grupo de trabajo, se ha observado que la gran mayoría de las 
expansinas bacterianas se pueden clasificar como proteínas ácidas (pI 4.5-5.96) o 
básicas (pI 8.2-9.8) y esta diferencia se debe principalmente a los aminoácidos de la cara 
posterior al PBS. Previamente Georgelis y colaboradores, (2011) observaron que algunos 
aminoácidos positivos localizados en esta cara posterior, están importantemente 
involucrados en la unión de BsEXLX1 a paredes celulares vegetales. Debido a las 
diferencias tan marcadas en los puntos isoeléctricos en las expansinas, en este trabajo se 
decidió caracterizar a la expansina ácida PcEXL1, proveniente de P. carotovorum, un 
fitopatógeno importante, y compararla con la expansina básica BsEXLX1 de B. subtilis, un 
simbionte de plantas. La diferencia electrostática entre ambas expansinas podría tener 
una implicación funcional importante, probablemente en la unión específica a sus 
sustratos (Pastor N et al., 2014). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
~ 19 ~ 
 
IV. HIPÓTESIS 
 
La proteína PcEXL1 presenta actividad de expansina, y su naturaleza ácida 
definirá su capacidad de unión a diferentes sustratos en comparación con una expansina 
básica. 
 
 
V. OBJETIVO GENERAL 
 
 Comprobar que la proteína PcEXL1 es una expansina funcional, y determinar si 
su naturaleza ácida determina su unión a sustratos, permitiendo establecer la relación 
estructura-función. 
. 
 
 
VI. OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Determinar la capacidad de PcEXL1 para inducir debilitamiento de papel filtro. 
 
 Caracterizar fisicoquímicamente a PcEXL1. 
 
 Evaluar la capacidad de unión de PcEXL1 (expansina ácida) a paredes celulares y 
celulosa pura y compararla con BsEXLX1 (una expansina básica). 
 
 Estudiar la importancia de los aminoácidos conservados D82, Y126, W127 y 
Y158A, en la actividad o unión de PcEXL1. 
 
 
 
~ 20 ~ 
 
VII. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Expresión de PcEXL1 y mutantes 
 La expresión de la proteína se realizó en células de Escherichia coli BL21 (DE3) 
transformadas con el plásmido pET22-PcEXL1 WT o sus variantes mutantes (figura 13), 
incubando en matraces de 500 ml conteniendo 50 ml de medio LB + ampicilina (200 µ/ml) 
a 37°C y 250 rpm, hasta alcanzar una OD600 de 0.9. La inducción se realizó con IPTG a 
una concentración final de 1.0 mM, y se continuó la incubación a 16°C durante 12 horas. 
El péptido señal nativo de PcEXL1 fue cambiado por el péptido señal pelB (de la proteína 
pectato liasa B de P. carotovorum) por lo que PcEXL1 fue exportada al espacio 
periplasmático de E. coli. 
 
Mutagénesis sitio dirigida para obtención de variantes de PcEXL1 
 Se utilizaron los oligonucleótidos enlistados en la tabla 2, para la construcción 
de las mutantes de PcEXL1 WT a partir de los plásmidos pET22-PcEXL1 previamente 
construidos en el laboratorio por la M. en C. Catalina Morales Herrera. 
 
Tabla 1. Oligonucleótidos usados para generar variantes de PcEXL1 
Variantes de PcEXL1 Oligonucleótido 
D83A 5’ GACTGTGCATTGGCTTTATCGTTTAACG 3’ 
Y126A W127A Y158A (Triple 
aromática) 
5’ GTTCAAACCCTGCGGCGGCTGCGGTGCAAT 3’ y 
5´ CAGAAAACCGATGCTAACCACTTTATT 3´ 
 
 La mutagénesis se realizó usando el kit QuikChange Lightning Multi Site-
Directed Mutagenesis, siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto obtenido se 
transformó en la cepa E. coli XL10 Gold quimio-competente. La correcta inserción de las 
mutaciones se confirmó mediante secuenciación en la unidad de Síntesis y Secuenciación 
de DNA del IBT, UNAM. 
 
 
 
~ 21 ~ 
 
Expresión de BsEXLX1-His 
 La expresión se realizó en células E. coli BL21 transformadas con el plásmido 
pET22-BsEXLX1-His en medio LB-ampicilina (200 µg/ml), incubando a 37 °C y 250 rpm, 
hasta una OD600 de 0.9. En este punto, la inducción de la expresión se realizó con IPTG a 
una concentración final de 1.0 mM y se continuó la incubación durante 12 horas. La 
proteína fue exportada al periplasma debido al péptido señal pelB. 
 
 
Figura 13. Esquema representativo del plasmido pET22b. El gen de PcEXL1 y BsEXLX están insertados 
entre los sitios Sfi1 y Not1, bajo la inducción del promotor T7. 
 
Extracción de proteínas periplásmicas. 
 Para la extracción de proteínas periplásmicas se obtuvo el paquete celular 
mediante centrifugación a 8200 x g durante 15 minutos, se resuspendió en 10% del 
volumen inicial con solución SET (20% sacarosa, 1 mM EDTA, 20 mM Tris HCl) y se 
incubó en hielo durante 15 minutos, se centrifugó a 8200 x g durante 15 minutos y se 
separó el sobrenadante (fracción 1). Se resuspendió el pellet nuevamente en 10% del 
volumen inicial con MgSO4 5 mM y se incubó en hielo durante 15 minutos, se centrifugó a 
8200 x g durante 15 minutos y se separó el sobrenadante (fracción 2). 
 
~ 22 ~ 
 
Purificación en columna de intercambio iónico 
Para el caso de las proteínas PcEXL1 y sus variantes mutadas, ambas fracciones 
(fracción 1 y fracción 2) obtenidas en el paso de extracción, se dializaron en membranas 
de nitrocelulosa de 10-12 kDa (Sigma-Aldrich) contra buffer de fosfatos 20 mM a pH 8.0, 
para eliminar la sacarosa, posteriormente se purificaron en columnas de intercambio 
iónico macro-prep DEAE support (Biorad) en una columna de (2.5 X 12 cm) que fue 
equilibraba con 60 ml de buffer fosfatos 20 mM a pH 8.0. La columna fue lavada con el 
mismo buffer y la elución se realizó con un gradiente lineal de NaCl (0-120 min en 1 hora) 
hasta una concentración de 0.5 M, el gradiente se realizó con una bomba peristáltica. Se 
colectaron fracciones de 2 ml, la elución de la proteína se siguió mediante reacción de 
Bradford, conel reactivo BioRad Protein Assay mezclando 20 µl de colorante con 40 µl de 
cada fracción. Las fracciones en donde eluyó la proteína fueron desaladas y concentradas 
por ultrafiltración Amicon (Healthcare) de 10 kDa de cut-off con buffer de fosfatos 20 mM 
pH 7.5. Tanto PcEXL1 WT y D82A eluyeron aproximadamente a 0.3 M de NaCl, mientras 
que la mutante PcEXL1 YWY eluyó a 0.1 M de NaCl. 
Purificación en columnas de afinidad anti-His 
La proteína BsEXLX1-6xHis se purificó mediante cromatografía de afinidad en una 
columna de NTA-níquel (HisTrap, GE Healthcare), previamente equilibrada con buffer 
fosfatos 20 mM a pH 7.5, 25 mM imidazol; posteriormente de lavó con 10 volúmenes de 
columna con buffer fosfatos 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 75 mM a pH 7.5, y se eluyó 
con buffer 20 mM fosfatos, 500 mM NaCl, 250 mM imidazol a pH 7.5. La proteína 
purificada se concentró y dializó con filtros Amicon (Healthcare) de 10 kDa de cut-off con 
un buffer de fosfatos 20 mM y pH 7.5. 
Se evaluó la pureza de todas las muestras mediante electroforesis en geles de 
acrilamida al 15% conteniendo 0.5% del reactivo fluorescente 2,2,2-tricloroetanol (Ladner 
et al., 2006). Los geles fueron visualizados en un aparato fotodocumentador Gel Doc EZ 
System (BioRad) con una pantalla para fluorescencia Stain Free Sample Tray (BioRad). 
 
Determinación de la resistencia al rompimiento 
El ensayo de resistencia al rompimiento de tiras de papel filtro (Whatman No.1 
Qualitative 0.5 X 3.8 cm) se llevó a cabo mediante la cuantificación de la fuerza tensil de 
~ 23 ~ 
 
las muestras incubadas en presencia de expansina, utilizando un tensómetro (Universal 
Testing Machine 5500 -UTM; Instron, USA) en el Instituto de Materiales, UNAM. Las tiras 
fueron incubadas en 3 ml de buffer 25 mM HEPES pH 7.5 con 120 µg/ml de proteína, con 
agitación suave durante 1 hora. Soluciones de albúmina de suero bovino (BSA), o buffer 
únicamente, fueron usados como control. La fuerza tensil (σmax) fue calculada con la 
ecuación σmax = Fmax A⁄ , donde A= área transversal y Fmax= carga máxima (kg). La 
velocidad de cruceta fue de 1 mm/min. 
Obtención de paredes celulares completas para ensayos de unión. 
Para los ensayos de unión se usaron paredes celulares de diferentes plantas tanto 
dicotiledóneas como monocotiledóneas. Para la extracción de paredes celulares se 
germinaron en la oscuridad semillas de trigo, pepino y frijol durante 4 a 5 días (hasta que 
alcanzaran aproximadamente 5 cm de largo) a 28 °C, todo esto en una charola con papel 
filtro para mantener la humedad constante. Los hipocotilos de frijol, pepino y los 
coleóptilos de trigo (figura 14) se cortaron y se almacenaron a -70°C durante 24 h, se 
eliminó la cutícula mediante fricción con tierra pomex que funciona como abrasivo, y se 
trituró el tejido con un mortero con hielo seco. También se obtuvieron paredes celulares 
de cebolla y tallo de apio que fueron comprados en el mercado local, y homogenizados en 
una licuadora con agua destilada. Los fragmentos de paredes fueron lavados 5 veces, con 
50 ml de NaCl 1 M en agitación constante a 4°C durante 2 horas por cada lavado, 
posteriormente se lavaron 5 veces con 50 ml de H2OMQ durante 5 min cada lavado, las 
paredes se secaron a temperatura ambiente. 
~ 24 ~ 
 
 
Figura 14. Hipocotilo y coleóptilo de dicotiledóneas o monocotiledóneas. Fotografías donde se muestra 
las partes de la planta correspodientes a los hipocotilos (izquierda) y coleóptilos (derecha). 
 
Ensayos de unión a diferentes sustratos 
Las reacciones de unión se llevaron a cabo mediante la incubación de 5 µg de 
proteína con 1 mg de sustrato insoluble en 50 µl de buffer, durante 1 hora a 25 °C y 1000 
rpm. Después de la incubación las muestras se centrifugaron en una microcentrifuga a 
13000 rpm durante 10 min, se tomaron 20 µl del sobrenadante y se mezclaron con 5 µl de 
buffer Laemmli 4X (8% SDS and 40% glicerol, 250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 0.02% azul de 
bromofenol, 10% β-mercaptoetanol) y se cargaron en geles de poliacrilamida al 15%, 
conteniendo 0.5% de 2,2,2-tricloroetanol. La cantidad de proteína unida fue determinada 
por diferencia de intensidad de las bandas con respecto a un control de carga mediante 
densitometría usando el software Image Lab 3.0 (Biorad). 
 
Sinergismo con xilanasa 
Se incubaron 2.5 mg de rastrojo de maíz pulverizado (tamaño de partícula < 1.19 
mm de diámetro) con 0.025 U de endo-1,4 xilanasa de Trichoderma longibrachiatum 
(Sigma-Aldrich) y 320 ó 640 µg de PcEXL1, 640 µg de BSA fueron usados como control. 
Las reacciones se realizaron en 500 µl de buffer HEPES 25 mM pH 7.5, a 30°C y 500 rpm 
en un incubador Termomixer (Eppendorf). Se tomaron alícuotas cada 12 h para estimar la 
~ 25 ~ 
 
cantidad de azúcares reductores liberados mediante el método de ácido dinitrosalicílico 
(DNS) usando D-xilosa para realizar una curva estándar. 
 
Sinergismo con celulasas 
Se incubaron 2.0 mg de papel filtro Whatman No.1 Qualitative con 0.25 U de 
celulasa de Trichoderma reesei ATCC 26921 (Sigma-Aldrich) y 80 ó 160 µg de PcEXL1, 
160 µg de BSA fueron usados como control. Las reacciones se realizaron en 500 µl de 
buffer de acetatos 25 mM pH 5.0, a 30°C y 500 rpm en un incubador Termomixer 
(Eppendorf). Se tomaron alícuotas cada 12 h para estimar la cantidad de azúcares 
reductores liberados mediante el método de ácido dinitrosalicílico (DNS) usando D-glucosa 
para realizar una curva estándar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
~ 26 ~ 
 
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
DEBILITAMIENTO DEL PAPEL FILTRO POR ACCIÓN DE PcEXL1. 
 
P. carotovorum es una bacteria fitopatógena que infecta una amplia variedad de 
plantas, muchas de ellas de importancia comercial. En su genoma se identificó una única 
secuencia que codifica para una proteína a la que se llamó PcEXL1, y mediante análisis 
de secuencias y predicción de estructura se determinó que presenta homología con las 
expansinas. Sin embargo, es necesario comprobar experimentalmente su actividad. Se 
sabe que las expansinas median la extensibilidad de la pared celular (“creep”) y el 
debilitamiento del papel filtro sin provocar hidrólisis de los polisacáridos. Esto es posible, 
por el rompimiento de los enlaces débiles entre los polisacáridos de la pared celular o del 
papel filtro (Cosgrove 1989; Kwon et al. 2008). Este proceso está bien documentado en la 
literatura y ejemplos de estas son: pollen β-expansin, Xantho-EXP, Clavi-EXP, Ralstonia-
EXP, Asper-EXP, BsEXLX y HcEXLX2 (Lee et al., 2010; Georgelis et al., 2011; Georgelis, 
Nikolaidis, y Cosgrove, 2013; Li et al., 2003). Con la finalidad de comprobar si PcEXL1 es 
una expansina, se determinó si es capaz de provocar el debilitamiento de papel filtro 
utilizando un tensómetro (Instron) para medir la resistencia al rompimiento después del 
tratamiento con PcEXL1 (figura 15). 
Las muestras tratadas con PcEXL1 –una expansina ácida– mostraron una 
reducción de la fuerza tensil de aproximadamente 20% en comparación con las muestras 
tratadas con buffer o con BSA. Se observó un debilitamiento similar en las muestras 
tratadas con la misma cantidad de la expansina BsEXLXHis –una expansina básica– que 
fue usada como referencia de una expansina funcional. Este debilitamiento del papel filtro 
comprueba PcEXL1 que es una expansina que mantiene la propiedad debilitamiento que 
es típica de estas proteínas. 
El nivel de debilitamiento del papel filtro observado con PcEXL1 en este trabajo es 
similar al reportado por Georgelis y colaboradores, quienes observaron una disminución 
del 20% de la fuerza tensil del papel filtro con la expansina básica BsEXLX1, y también a 
lo reportado por Lee y colaboradores, quienes observaron una disminución del 25% por 
acción de HcEXLX2 –otra expansina ácida– (Georgelis et al., 2011; Lee et al., 2010). Los 
niveles similares de actividad sobre papel filtro tanto en expansinas básicas o ácidas, 
~ 27 ~sugiere que la naturaleza electrostática de estas expansinas, no afecta de manera 
significativa la actividad sobre papel filtro o al menos las diferencias no son detectables 
por este método. 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE PcEXL1. 
Bajo las condiciones experimentales evaluadas (1 h de incubación/ buffer HEPES 
pH 7.5/ 120 µg/ml, en agitación constante), PcEXL1 muestra niveles de actividad similares 
a lo reportado para otras expansinas, sin embargo es necesario caracterizar las 
condiciones de temperatura y pH óptimos para esta expansina. 
 
Efecto de la temperatura sobre PcEXL1. 
Debido a la poca disponibilidad para el uso del tensómetro (Instron), no fue posible 
realizar ensayos de actividad sobre papel filtro a diferentes temperaturas por lo que no se 
determinó la temperatura óptima de actividad. Sin embargo, se determinó la estabilidad 
estructural de PcEXL1 al calor. Mediante Calorimetría diferencial de barrido (DSC) se 
cuantificó la capacidad calorífica de PcEXL1 a diferentes temperaturas. Los resultados 
obtenidos sugieren un rango de temperaturas en el cual la estructura de PcEXL1 es 
estable y probablemente tenga una mejor actividad (figura 16). 
* * 
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Buffer BSA BsEXLX1 PcEXLX WT
Fu
e
rz
a 
te
n
si
l (
M
P
a)
 
Figura 15. Debilitamiento de papel filtro por PcEXL1. Las muestras de papel filtro tratadas con expansinas 
muestran una menor fuerza tensil, que las no tratadas. La fuerza tensil en el punto de ruptura está expresada 
en Mpa (mega pascales). BSA y Buffer solo fueron usados como controles. Las barras indican el error 
estándar de al menos 4 experimentos independientes. * Denota p<0.05 (T3 de Dunnett). 
~ 28 ~ 
 
 
En el termograma se puede observar que PcEXL1 tiene una temperatura media 
(Tm) de 56.8°C (figura 16-A), es decir que a esta temperatura la mitad de las moléculas 
se encuentran desnaturalizadas. Además, se observan cambios estructurales a ~45°C, 
sugiriendo que PcEXL1 podría ser inestable a partir de esta temperatura, lo que afectaría 
su actividad. Estos resultados son similares a los reportados por Kim y colaboradores 
para BsEXLX1, la cual tiene una Tm de 55°C (Kim et al., 2013). 
Cuando se elevó la temperatura a 65°C, se observó una disminución en la 
capacidad calorífica de PcEXL1, lo que indica que a esta temperatura todas las moléculas 
están desnaturalizadas. Sin embargo, si en este punto se disminuye la temperatura, 
PcEXL1 vuelve a adquirir estructura, por lo que al elevar nuevamente la temperatura se 
observa una segunda curva de desnaturalización que se sobrepone a la primera, lo cual 
indica que la desnaturalización de PcEXL1 a 65°C es un proceso 100% reversible (figura 
16-A). Sin embargo, cuando la temperatura se elevó hasta 90°C la desnaturalización fue 
irreversible, por lo que ya no ocurre el replegamiento de PcEXL1 (figura 16-B). 
P. carotovorum crece bien a 30°C, lo que sugiere que puede ser una temperatura 
adecuada para la actividad de sus proteínas (Hsu y Camper, 1973; Kumar, Pakshirajan, y 
Dasu, 2009). Y debido a que entre 25-40°C no se observaron cambios estructurales 
importantes, se decidió llevar a cabo los experimentos a 30°C, que es la temperatura a la 
cual se observó estabilidad estructural de PcEXL1. 
 
 
A B 
15000 
 
 
 
10000 
 
 
 
 
5000 
 
 
 
0 
 
 
 
-5000 
 
 
 
-10000 
 
C
p
 (
k
ca
l/
m
o
l/
°C
) 
C
p
 (
k
ca
l/
m
o
l/
°C
) 
Temperatura (°C) Temperatura (°C) 
Figura 16. Termograma de PcEXL1. Se observa un aumento en la capacidad calorífica de la proteína 
conforme se eleva la temperatura lo cual indica cambios en la estructura. A) La línea negra indica el primer 
calentamiento, la línea roja indica el segundo calentamiento después de la renaturalización de la proteína. 
~ 29 ~ 
 
Efecto del pH en la unión a pared celular de trigo. 
La unión de las expansinas a paredes celulares de plantas es un parámetro 
importante de conocer. Se sabe que esta unión se lleva a cabo principalmente a través de 
interacciones iónicas entre la proteína y los polisacáridos de la pared celular vegetal 
(Georgelis et al., 2011), por lo que la modificación de la carga electrostática de la proteína 
por acción del pH, tendrá un importante efecto en la unión y por lo tanto en la actividad. 
Debido a que el perfil electrostático de PcEXL1, es diferente al de BsEXLX1 
(Olarte-Lozano, et al., 2014), se comparó el efecto del pH sobre la unión de ambas 
expansinas individualmente a paredes celulares de trigo (figura 17). 
 
Figura 17. Efecto del pH en la unión de diferentes proteínas a pared celular de coleóptilos de trigo. El 
nivel de unión de las expansinas hacia paredes celulares de trigo está influenciado por el pH. Observándose 
una mayor unión a pH ácidos. Buffer 25 mM de acetatos pH 3.5, citratos 5.0, HEPES 7.5 ó boratos pH 9.0 
fueron usados para mantener el pH de reacción. Se muestran la media y error estándar de 3 experimentos 
independientes. * Denota p<0.05 (T3 de Dunnett). 
 
El resultado de la figura 18 indica que a los diferentes pH´s evaluados la unión a 
paredes celulares de trigo es mayor para BsEXLX1 que PcEXL1. Esto puede explicarse 
debido a que la carga electrostática positiva de BsEXLX1 a un pH menor a 9.5 (figura 12) 
(Olarte-Lozano et al., 2014), le permite interaccionar con los polisacáridos ácidos de la 
pared celular. Mientras que PcEXL1, a pH entre 7.5 y 9.0 posee carga global negativa 
(figura 12), lo que repelería su interacción con los polisacáridos ácidos de la pared celular 
provocando niveles bajos de unión. Sin embargo, a pH ácido (menor a 5) la carga global 
* 
* 
* 
* 
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
3.5 5.0 7.5 9.0
pH de reacción 
BsEXLX1 His
PcEXL1 WT
~ 30 ~ 
 
de PcEXL1 es positiva (+5e, figura 12), lo que provoca una mejora significativa en la 
unión. 
BsEXLX1 tiene una carga electrostática estable (alrededor de +5e) en un amplio 
rango de pH (entre 5-10.5) lo cual corresponde con el pH de actividad de “creep” sobre 
paredes celulares, reportado por Georgelis y colaboradores (2011). Sin embargo, a pH 
menor a 4.5 la carga electrostática de BsEXLX1 cambia bruscamente a +10e (figura 12) lo 
que resulta en la perdida de la actividad sin afectar la unión a paredes celulares de 
plantas (figura 17). Esto sugiere que la unión a pH ácido no es indicativa de la actividad. 
Esta unión no productiva puede deberse a la protonización de la proteína por acción del 
pH, lo que favorece la interacción con las cargas negativas de la pared celular. 
El alto nivel de unión de PcEXL1 a pH<5 también podría ser inespecífico e 
improductivo, similarmente a lo que ocurre con BsEXLX1, especialmente debido a que la 
carga electrostática de PcEXL1 se mantiene relativamente estable (alrededor de -6e) 
entre pH 6.0 y 8.0, fuera de este rango la carga cambia abruptamente (figura 12). De 
acuerdo a estos resultados nosotros sugerimos que la unión observada a pH 7.5 podría 
ser más representativa de la actividad de PcEXL1 sobre paredes celulares. Esta hipótesis 
tiene apoyo si se toma en cuenta que las enzimas hidrolíticas de P. carotovorum son más 
activas alrededor de pH 8 (Marquez, et al., 2011). 
 
Efecto del pH en la unión a papel filtro. 
Además de la unión a paredes celulares, las expansinas también muestran unión a 
celulosa pura (por ejemplo Avicel o papel filtro). La unión a celulosa pura parece ser 
principalmente mediada por interacciones no polares entre los aminoácidos aromáticos 
del dominio 2 y los anillos de los azúcares del polisacárido. Sin embargo el pH del medio 
de reacción influye en la estructura de la proteína, por lo que se decidió evaluar el efecto 
del pH en la unión de PcEXL1 a papel filtro, compuesto de celulosa pura (figura 18). 
 
~ 31 ~ 
 
 
Figura 18. Efecto del pH en la unión de PcEXL1 a papel filtro. Los niveles de unión de las expansinas 
hacia papel filtro está influenciada por acción del pH, observándose una mayorunión a pH ácidos. Buffer 25 
mM de acetatos pH 3.5, citratos pH 5.0, HEPES pH 7.5 o Boratos pH 9.0 fueron usados para mantener el pH 
de la reacción. Se muestran la media y SD de 3 experimentos independientes. 
 
El comportamiento de unión de PcEXL1 al papel filtro fue similar al observado con 
paredes celulares: la unión aumentó a pH menor a 5, mientras que a pH 9.0 no se 
observó unión. Este resultado podría deberse a que a pH 9.0 se afecta de manera 
importante la estructura de la proteína, lo que provocaría la pérdida de la unión. Otra 
posibilidad es que además de las interacciones hidrofóbicas exista también un 
componente electrostático en la unión a celulosa pura, tal como ha sido sugerido por 
Georgelis y colaboradores (2011), y Kim y colaboradores (2013). 
A pH 7.5 los niveles de unión de PcEXL1 a la pared celular de trigo (figura 17) y al 
papel filtro (figura 18) son similares (0.9 µg/mg y 0.7 µg/mg respectivamente), sugiriendo 
que el blanco de unión de PcEXL1 en las paredes celulares son las cadenas de celulosa. 
Si el efecto de carga-función que se observa para BsEXLX1 aplica de la misma 
manera para PcEXL1, entonces esta última tendría un rango restringido de pH´s en el 
cual mantiene su carga electrostática relativamente estable (Figura 12); por esta razón se 
decidió trabajar a pH 7.5. Además, este es el pH al cual se observó actividad sobre papel 
filtro. 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
3.5 5.0 7.5 9.0
P
ro
te
in
a 
u
n
id
a 
(µ
g/
m
g)
 
pH de reacción 
~ 32 ~ 
 
A pesar de que los niveles de unión a paredes celulares entre PcEXL1 y BsEXLX1 
son diferentes, la unión a celulosa pura (Avicel) de ambas proteínas es similar: Bmax= 0.33 
µmol/g y Kd=2.97 µM para PcEXL1 (Olarte-Lozano et al., 2014), y Bmax= 0.34 µmol/g y 
Kd= 2.12 µM para BsEXLX1 (Georgelis et al., 2011). Indicando que pese a las diferencias 
en la carga neta de las dos proteínas su interacción con la celulosa ocurre de forma 
similar. Esto se debe a que la superficie proteica con la que se lleva a cabo la interacción 
con las cadena de celulosa (PBS) está formada por aminoácidos conservados en ambas 
proteínas, por lo que los perfiles electrostáticos en esa zona son similares (Olarte-Lozano 
et al., 2014). El hecho de que PcEXL1 y BsEXLX1 tengan niveles similares de unión y de 
actividad sobre celulosa pura (Avicel o papel filtro) tiene sentido si tal como se ha 
reportado recientemente, las fibras de celulosa son el blanco final de las expansinas 
(Georgelis, Yennawar, y Cosgrove, 2012; Wang et al., 2013). 
 
Unión a paredes celulares fraccionadas 
Con el objetivo de elucidar el sitio de unión de PcEXL1 en las paredes celulares, 
se evaluó su unión a fracciones de pared celular de trigo, a las que se les extrajeron 
secuencialmente diferentes polisacáridos. El primer tipo de polisacárido que se extrajo 
fueron las pectinas, que son componentes unidos por puentes de calcio y que son 
solubilizados con CDTA como compuesto quelante. A la fracción resultante le llamamos 
cw-p (cell wall sin pectina). Posteriormente, esta fracción se trató con álcali (NaOH) para 
solubilizar y extraer la hemicelulosa. A esta fracción resultante se le llamó cw-p-hc (cell 
wall sin pectina y sin hemicelulosa) (figura 19). 
~ 33 ~ 
 
 
Figura 19. Unión a paredes celulares fraccionadas. La unión de PcEXLX1 aumenta en fracciones de pared 
celular de trigo enriquecidas de celulosa. Buffer HEPES 25 mM pH 7.5 fue usado para mantener el pH de la 
reacción. Se muestran medias y SD de al menos 3 experimentos independientes. * Denota p<0.05, (Fisher’s 
LSD test). 
 
A diferencia de lo reportado para BsEXLX1, donde la unión va disminuyendo 
conforme se eliminan la pectina y la hemicelulosa (Georgelis et al., 2011), PcEXL1 mostró 
un aumento del 76% (0.8 µg/mg vs 1.4 µg/mg) en ausencia de pectina y del 137.5% (0.8 
µg/mg vs 1.9 µg/mg) cuando también se eliminó la hemicelulosa. Estos resultados 
confirman que la pectina y la hemicelulosa inhiben la unión de PcEXL1 a las paredes 
celulares, probablemente al bloquear el sitio blanco y/o por interferencia electrostática, por 
lo que al removerlos se exponen las fibras de celulosa que parecen ser el sitio blanco de 
PcEXL1. 
Durante el proceso natural de la infección de P. carotovorum se secreta un 
conjunto de enzimas degradadoras de la pared celular de las plantas (PCWDEs), que 
incluye pectinasas, celulasas, proteasas y xilanasas (Lee et al., 2013; Liu et al., 2008), y 
su actividad podría aumentar la disponibilidad de las fibras de celulosa para la actividad 
de PcEXL1. 
 
 
* 
* 
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
CW CW-P CW-P-HC
P
ro
te
in
a 
u
n
id
a 
(µ
g/
m
g)
 
~ 34 ~ 
 
Unión a diferentes paredes celulares vegetales. 
La composición de la pared celular parece ser un determinante importante que 
afecta la unión de las expansinas según su naturaleza ácido-básica, probablemente por 
interferencia electrostática o por bloqueo de sus sitios blanco. Para algunas expansinas 
se ha observado especificidad hacia paredes celulares de plantas monocotiledóneas o 
dicotiledóneas (Yennawar et al., 2006). Probablemente la baja unión de PcEXL1 a 
paredes celulares de trigo en comparación con BsEXLX1 podría deberse a esta 
especificidad hacia el sustrato. 
Para determinar si PcEXL1 presenta unión preferencial hacia paredes celulares de 
algún tipo de plantas, se determinó su unión hacia paredes celulares provenientes de 
diferentes especies vegetales, tanto dicotiledóneas: Apium greveolens (apio), Phaseolus 
vulgaris (frijol) y Cucumis sativus (pepino); como monocotiledóneas: Allium cepa (cebolla) 
y Triticum aestivum (trigo). Todas estas son especies susceptibles a infección por P. 
caratovorum según la literatura (Karasawa et al., 1990; Yishay et al., 2008; Nazerian et al., 
2011). 
 En la figura 20 se muestra el grado de unión de las expansinas BsEXLX1 y 
PcEXL1 a paredes celulares de diferentes especies de plantas. 
 
Figura 20. Unión a paredes celulares de diferentes plantas. La unión de ambas expansinas se ve 
influenciada por la composición de las paredes celulares vegetales. Buffer HEPES 25 mM pH 7.5 fue usado 
para mantener el pH de la reacción. Se muestran medias y SD de 3 experimentos independientes * Denota 
p<0.05, (Fisher’s LSD test). 
* * 
* 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Apio Cebolla Frijol Pepino Trigo
P
ro
te
ín
a 
u
n
id
a 
 (
µ
g/
m
g)
 
BsEXLXHis
PcEXL1
~ 35 ~ 
 
BsEXLX1 mostró unión significativamente mayor que PcEXL1 a tres de los cinco 
sustratos evaluados: 16 veces más en apio, 7.8 veces más en frijol, y 3.6 más veces en 
trigo. BsEXLX1 se unió a las paredes celulares de la siguiente manera: 
apio>trigo>cebolla>frijol=pepino, mientras que PcEXL1 se unió a frijol=pepino>trigo> 
cebolla=apio. 
En las paredes celulares de frijol y pepino se observaron los mayores niveles de 
unión de PcEXL1 (~1.2 µg/mg), y a la vez la menor unión de BsEXLX1 (~1.6 µg/mg), lo 
que representa niveles de unión similares entre ambas expansinas. Estos resultados 
sugieren que la celulosa es más accesible en estás dos paredes celulares que en el resto 
de las paredes celulares evaluadas. 
Nuestros datos indican que la naturaleza ácida o básica de las expansinas influye 
en su unión a las paredes celulares vegetales dependiendo del contenido de polisacáridos 
ácidos. La composición y proporción de los polisacáridos en la pared celular de las 
plantas es compleja y difícil de determinar, sin embargo el grado de unión de estas 
expasinas podría reflejar el contenido de polisacáridos ácidos y la disponibilidad de la 
celulosa en las diferentes especies vegetales. 
Por otro lado, no se observó preferencia de unión de las expansinas hacia algún 
tipo de planta (monocotiledónea o dicotiledónea). Es probable que la especificidad no se 
deba al tipo de planta, si no a la composición de la pared celular la cual cambia 
dependiendo de la especievegetal, sin embargo para corroborar esto, es necesario 
determinar la composición de cada una de las paredes celulares utilizadas. 
 
Efecto de la fuerza iónica en la unión. 
 
Los carbohidratos son moléculas anfipáticas capaces de formar enlaces de 
hidrógeno con los residuos polares de las proteínas a través de sus grupos hidroxilo. Se 
ha observado que para algunos módulos de unión a celulosa (CBMs) una mayor fuerza 
iónica aumenta su unión a polisacáridos, probablemente por la inducción de cambios 
conformacionales en la proteína que mejoran la interacción electrostática con su sustrato 
(Abou et al., 2000; Boraston et al., 2004). 
~ 36 ~ 
 
Para determinar el efecto de la fuerza iónica en la unión de PcEXL1 y BsEXLX1 a 
Avicel, se llevó a cabo un experimento de unión con concentraciones crecientes de NaCl 
(figura 21). 
 
 
 
Figura 21. Efecto de la concentración de NaCl en la unión a Avicel. La unión de PcEXL1 a Avicel en 
buffer HEPES 25 mM pH 7.5, es favorecida cuando se aumenta la concentración de NaCl, mientras que la 
unión de BsEXLX1 se ve afectada. Se muestran medias y SD de 3 mediciones. 
 
Los resultados obtenidos muestran que la fuerza iónica provocó un efecto inverso 
en la unión de ambas proteínas a Avicel. Conforme la fuerza iónica aumenta, la unión de 
BsEXLX1 disminuye mientras que la unión de PcEXL1 aumenta. Los resultados obtenidos 
para BsEXLX1 no concuerdan con lo reportado por Kim et al., quienes determinaron una 
mayor unión de BsEXLX1 al aumentar la fuerza iónica, sin embargo, ellos usaron 
concentraciones de NaCl desde 2.5 y hasta 10 veces mayor que la máxima concentración 
utilizada en este trabajo. Esta diferencia es importante, ya que las concentraciones de sal 
usadas por Kim representan un exceso si se piensa en las concentraciones fisiológicas de 
NaCl. 
Por otro lado, el hecho de que la fuerza iónica favorezca las interacciones entre 
PcEXL1 y Avicel es una evidencia más de la existencia de un componente iónico, además 
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0 10 25 50 75 100
P
ro
te
in
a 
u
n
id
a 
(µ
g/
m
g)
 
Concentración de NaCl (mM) 
PcEXL1
BsEXLX1
~ 37 ~ 
 
del hidrofóbico, en la unión de las expansinas a la celulosa, de manera similar a como 
ocurre con los CBMs (Abou et al., 2000). 
Ensayos de sinergismo con xilanasa y celulasa 
Las paredes celulares de plantas son altamente ricas en carbohidratos, lo que las 
hace una fuente renovable para la producción de energía y biocombustibles como el 
etanol. Sin embargo, la recalcitrancia de este sustrato hace difícil su utilización. Por lo que 
además de la importancia biológica, el debilitamiento de las paredes celulares por acción 
de las expansinas tiene también un gran interés biotecnológico. 
 Se piensa que la actividad de las expansinas puede facilitar la hidrólisis de los 
polisacáridos de la pared celular vegetal por parte de las enzimas hidrolíticas. Por lo que 
se ha analizado la liberación de carbohidratos simples por la acción concertada entre las 
expansinas y las PCWDEs (enzimas degradadoras de la pared celular de las plantas). Sin 
embargo los resultados sobre este posible sinergismo son contradictorios en la literatura 
(Lee et al., 2010; Bunterngsook et al., 2014; Georgelis, Nikolaidis, y Cosgrove, 2013; 
Olarte-Lozano et al., 2014). 
Para conocer si PcEXL1 presenta sinergismo con enzimas hidrolíticas se cuantificó 
la liberación de azúcares reductores a partir de dos sustratos diferentes: olote de maíz por 
acción de una xilanasa (hemicelulasa) proveniente de Trichoderma longibrachiatum, y a 
partir de papel filtro con una celulasa proveniente de Trichoderma ressei (figura 22 y 23 
respectivamente). En caso de existir sinergismo entre PcEXL1 y la xilanasa o la celulasa, 
la liberación de azúcares reductores debería ser mayor cuando los sustratos se incuban 
en presencia de ambas proteínas que cuando se incuban por separado. 
~ 38 ~ 
 
 
Figura 22. Efecto de PcEXL1 en la hidrólisis enzimática de bagazo de maíz. No se observa aumento en la 
producción de azucares reductores por acción sinérgica entre una xilanasa y PcEXL1. Se incubaron 2.5 mg de 
bagazo de maíz, 0.025 U de xilanasa de T. longibrachiatum y 320, 640 µg de PcEXL1 o BSA en buffer HEPES 
pH 7.5 a 30°C. 
 
 
 
Figura 23. Efecto de PcEXL1 en la hidrólisis enzimática de papel filtro. No se observa aumento en la 
producción de azucares reductores por acción sinérgica entre una celulasa y PcEXL1. Se incubaron 2.0 mg de 
papel filtro, 0.25 U de celulasa de T. ressei y 40, 80 µg de PcEXL1 o BSA por mg de sustrato en buffer citratos 
pH 5.0 a 30°C. 
 
En estos experimentos no se observaron diferencias significativas en los niveles 
de producción de azúcares reductores a partir de olote de maíz ni del papel filtro aún en 
las más altas concentraciones de expansinas, ni a un mayor tiempo de reacción. Esto 
indica que en las condiciones evaluadas, PcEXL1 no tiene un efecto sinérgico con la 
xilanasa ni la celulasa utilizada. Estos resultados concuerdan con los reportados por 
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 12 24 36 48
A
zu
ca
re
s 
re
d
u
ct
o
re
s 
(m
M
) 
Tiempo (Hrs) 
BSA
Buffer
Xilanasa
PcEXL1 640 µg/mg
Xilanasa+PcEXL1 320 µg/mg
Xilanasa+ PcEXL1 640 µg/mg
Xilanasa + BSA 640 µg/mg
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
12 24 36 48 72
A
zu
ca
re
s 
re
d
u
ct
o
re
s 
(m
M
) 
Tiempo (Hrs) 
Buffer
expansina
Celulasa
Celulasa +BSA 80 Ug/mg
Celulasa+ PcEXL1 40 Ug/mg
Celulasa + PcEXL1 80 Ug/mg
~ 39 ~ 
 
Georgelis, Nikolaidis y Cosgrove, (2013) quienes tampoco observaron sinergismo al 
incubar a las expansinas Xantho-EXP, Ralstonia-EXP, Asper-EXP con celulasas. Sin 
embargo, difieren de los resultados reportados por Bunterngsook y colaboradores (2014); 
estas diferencias pueden deberse a que las condiciones de reacción fueron diferentes 
(10,000 veces menos enzima, 50 mM de acetatos pH 5.0, 50°C). 
Existen diferentes posibilidades por las cuales no se observó un efecto sinérgico. 
Algunos reportes indican que el sinergismo solo se da a concentraciones muy bajas de 
PCWDE´s (Kim et al., 2013), nosotros utilizamos 10,000 veces más celulasa que la 
utilizada por Bunterngsook et al, quienes si observaron sinergismo. Otra diferencia es que 
los sustratos utilizados en este trabajo no fueron sometidos a un pretratamiento de NaOH 
10% (w/v), 80°C durante 90 min en autoclave, lo que probablemente facilite la actividad de 
las expansinas, tal como lo reportó por Bunterngsook y colaboradores, en 2014. 
Finalmente, también se podrían utilizar otro tipo glicosilhidrolasas tal como lo sugiere 
Georgelis, Nikolaidis y Cosgrove., (2013). 
 
Importancia de los residuos conservados D82, Y126, W127 y Y158 
A pesar de la baja identidad entre las expansinas de plantas y las expansinas 
bacterianas, existen aminoácidos altamente conservados localizados en el surco de unión 
a polisacáridos (PBS), lo cual sugiere que son importantes para la actividad, para la unión 
a los sustratos o para el mantenimiento de la estructura de las expansinas. Georgelis y 
colaboradores (2011), evaluaron la importancia de estos aminoácidos conservados, en la 
unión y actividad de BsEXLX1, entre los que destacan el residuo D82 que está 
involucrado en la actividad, y los residuos W126, W127 y Y157 (en su conjunto) que 
participan en la unión a celulosa. Se determinó que la pérdida de la unión a celulosa por 
carencia de esta triada aromática provoca la pérdida de la actividad. 
Con la finalidad de determinar la importancia de los aminoácidos conservados en 
el PBS de PcEXL1 se generaron las variantes PcEXL1 D82A y PcEXL1 
Y127A/W127A/Y158A (YWY) mediante mutagénesis sitio-dirigida. Ambas variantes fueron 
expresadas en E. coli BL21 (DE3) y purificadas (figura 24) para su posterior análisis. 
~ 40 ~ 
 
 
 
Para determinar la importancia de estos aminoácidos en la actividad y unión se 
evaluó la actividad de debilitamiento