Caracterizacion-de-vesculas-extracelulares-durante-la-infeccion-con-HAstV

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA 
INFECCIÓN CON HAstV 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
 
PRESENTA: 
CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
 
TUTOR PRINCIPAL 
 
DR. PAVEL IŠA 
Instituto de Biotecnología 
Universidad Nacional Autónoma de México 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
 
DRA. ROSARIO VERA ESTRELLA 
Instituto de Biotecnología 
Universidad Nacional Autónoma de México 
 
DRA. SOFÍA LIZETH ALCARAZ ESTRADA 
Centro Médico Nacional “20 de noviembre” 
Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado 
 
Cuernavaca, Morelos. junio, 2019 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Always remember: never accept the world as it appears to be. 
Dare to see it for what it could be” 
 
“Siempre recuerda: nunca des por sentado que el mundo es tal como lo ves. 
Atrévete a verlo como podría ser” 
 
Harold Winston 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
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AGRADECIMIENTOS 
Esta tesis se realizó en el laboratorio de Virología Molecular del Dr. Carlos Arias y 
la Dra. Susana López, del departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología 
Molecular del Instituto de Biotecnología de la UNAM, bajo la dirección del Dr. Pavel Iŝa 
y con fondos del CONACYT 254608. 
Durante el desarrollo experimental se contó con el apoyo del Dr. Iván Quevedo 
Partida de la Universidad Iberoamericana, a quien le agradezco su interés y colaboración 
en el proyecto al proporcionarnos acceso al equipo NanoSight NS300. 
Las imágenes de microscopía electrónica se realizaron con apoyo de la Dra. 
Guadalupe Zavala de la unidad de Microscopía Electrónica del Instituto de Biotecnología 
de la UNAM y la Dra. Bibiana Chávez Munguía del CINVESTAV. 
El desarrollo experimental del proyecto contó con la tutoría de la Dra. Rosario Vera 
Estrella del Instituto de Biotecnología de la UNAM y la Dra. Sofía Lizeth Alcaraz Estrada 
jefa del departamento de Medicina Genómica del Centro Médico Nacional “20 de 
noviembre” del ISSSTE, a quienes les agradezco profundamente su constante aporte de 
ideas y sugerencias en el cauce de la presente investigación, así como en mi formación 
como alumno de posgrado. 
Al Dr. Tomás López, cuya paciencia, dedicación y amplios conocimientos de 
Virología siempre fueron de utilidad en el trabajo de laboratorio. 
Al grupo Arias-López por su apoyo y compañerismo durante mi estancia en el 
Instituto de Biotecnología. 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
3 
DEDICATORIA 
En el caos de todo, hoy solo quiero dedicar este trabajo a mis padres Martha 
Lizmeth Baez Navarro y Pablo Alejandro Estrada Medina porque pese a la distancia, el 
cariño de la familia siempre es una fuente de motivación y coraje que no tiene fronteras. 
Por aguantar todos los corajes y frustraciones, siempre hombro a hombro con paciencia 
y amor. 
También, quiero dedicar este trabajo a la Dra. Sofía Lizeth Alcaraz Estrada, 
porque sin su apoyo y paciencia no habría podido llegar hasta el final, por toda su guía y 
consejos no solo académicos, sino de vida. Por nuevamente ser más que una 
investigadora, más que una científica, más que una asesora: ser una persona de calidad 
humana invaluable. 
A todas aquellas personas que han puesto su confianza en mí desde el inicio y 
que tras cada caída siempre tienden su mano para ayudarme a seguir adelante con más 
fuerza, aquellas personas que pese a los años siguen a mi lado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
4 
CONTENIDO 
AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... 2 
DEDICATORIA ................................................................................................................ 3 
CONTENIDO ................................................................................................................... 4 
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS ................................................................................... 6 
ABREVIATURAS ............................................................................................................. 8 
RESUMEN ...................................................................................................................... 9 
I. MARCO TEÓRICO ................................................................................................. 12 
1.1. Gastroenteritis .................................................................................................. 12 
1.2. Astrovirus ......................................................................................................... 14 
1.3. Vesículas extracelulares .................................................................................. 20 
1.4. Vesículas extracelulares y virus ....................................................................... 25 
1.5. Unidades Colectivas Infecciosas ...................................................................... 29 
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 31 
III. HIPÓTESIS ......................................................................................................... 32 
IV. OBJETIVOS ........................................................................................................ 33 
4.1. Objetivo general ............................................................................................... 33 
4.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 33 
V. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................... 34 
5.1. Cultivo celular ................................................................................................... 34 
5.2. Propagación de virus........................................................................................ 34 
5.3. Titulación de HAstV Yuc8 por focos infecciosos en placa ................................ 35 
5.4. Cinética de liberación y evaluación de virus resistente a tripsina ..................... 36 
5.5. Purificación de vesículas extracelulares por centrifugación diferencial ............ 38 
5.6. Western Blot SDS-PAGE ................................................................................. 40 
5.7. Procesamiento de proteínas virales ................................................................. 41 
5.8. Microscopía electrónica de transmisión (MET) ................................................ 41 
5.9. Infectividad asociada a vesículas extracelulares .............................................. 42 
5.10. Inmunofluorescencia ..................................................................................... 43 
5.11. Análisis de Trayectoria de Nanopartículas (NTA) ......................................... 44 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
5 
5.12. Presentación de datos y análisis estadístico .................................................45 
VI. RESULTADOS .................................................................................................... 46 
6.1. Cinética de liberación y evaluación de virus resistente a tripsina ..................... 46 
6.2. Liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) ................................................... 51 
6.3. HAstV Yuc8 en fracciones vesiculares por centrifugación diferencial .............. 52 
6.4. Western Blot SDS-PAGE de marcadores vesiculares ..................................... 59 
6.5. Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) ............................................... 62 
6.6. Inmunofluorescencia ........................................................................................ 67 
6.7. Análisis de Trayectoria de Nanopartículas (NTA) ............................................ 71 
6.8. Infectividad asociada a vesículas extracelulares .............................................. 77 
VII. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ......................................................................... 88 
VIII. CONCLUSIONES ................................................................................................ 99 
IX. PERSPECTIVAS ............................................................................................... 101 
X. REFERENCIAS .................................................................................................... 103 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
6 
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS 
Figura 1. Ilustración de virión maduro de astrovirus ...................................................... 14 
Figura 2. Genoma de astrovirus y sus productos proteicos .......................................... 15 
Figura 3. Ciclo replicativo de astrovirus ......................................................................... 18 
Tabla 1. Características Generales de Vesículas Extracelulares .................................. 21 
Figura 4. Similitud estructural entre la cápsides de astrovirus y hepatitis E .................. 27 
Figura 5. Pseudoenvoltura del virus de Hepatitis A ....................................................... 29 
Figura 6. Separación de componentes de un sobrenadante por centrifugación y 
microfiltración ................................................................................................................ 38 
Figura 7. Separación de componentes de un sobrenadante por centrifugación 
diferencial y precipitación .............................................................................................. 40 
Figura 8. HAstV Yuc8 resistente a la activación con tripsina aumenta con el tiempo ... 47 
Figura 9. HAstV Yuc8 se asocia a vesículas presentes en sobrenadantes ................... 49 
Figura 10. HAstV Yuc8 asociado a partículas vesiculares aumenta con el tiempo ....... 50 
Figura 11. La infección con HAstV Yuc8 no produce lisis celular .................................. 52 
Figura 12. Virus resistente a tripsina en diferentes fracciones purificadas de 
sobrenadante ................................................................................................................ 54 
Figura 13. Procesamiento proteolítico de proteínas virales asociadas a vesículas 
extracelulares ................................................................................................................ 58 
Figura 14. CD63 y Alix en fracciones purificadas de sobrenadantes ............................ 60 
Figura 15. Partículas virales asociadas a vesículas extracelulares grandes ................. 63 
Figura 16. Partículas virales asociadas a vesículas extracelulares pequeñas .............. 64 
Figura 17. Vesículas extracelulares purificadas de sobrenadantes de cultivos no 
infectados ...................................................................................................................... 65 
Figura 18. Inmunofluorescencia de proteína disulfuro isomerasa en células Caco-2 .... 68 
Figura 19. Inmunofluorescencia de CD63 en células Caco-2 no infectadas ................. 69 
Figura 20. Inmunofluorescencia de CD63 y Yuc8 en células Caco-2 infectadas .......... 70 
Figura 21. HAstV Yuc8 altera la producción de vesículas extracelulares ...................... 73 
Figura 22. El tratamiento con Tritón X-100 reduce la cantidad de partículas contadas 
por NanoSight ............................................................................................................... 74 
Figura 23. Concentración de partículas en fracciones vesiculares ................................ 76 
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CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
7 
Figura 24. Células Caco-2 infectadas por vesículas extracelulares purificadas de 
cultivos infectados con Yuc8 ......................................................................................... 78 
Figura 25. Células MA104 infectadas por vesículas extracelulares purificadas de 
cultivos infectados con Yuc8 ......................................................................................... 79 
Figura 26. Infectividad de las vesículas extracelulares producidas durante la infección 
con HAstV Yuc8 ............................................................................................................ 80 
Figura 27. Las vesículas extracelulares infectan mejor células Caco-2 comparadas con 
células MA104 ............................................................................................................... 81 
Figura 28. Células Caco-2expuestas a HAstV Yuc8 purificado .................................... 82 
Figura 29. Células Caco-2 infectadas por Yuc8 incubado con vesículas extracelulares 
Mock .............................................................................................................................. 83 
Figura 30. Células MA104 infectadas por Yuc8 incubado con vesículas extracelulares 
Mock .............................................................................................................................. 84 
Figura 31. HAstV Yuc8 incubado con vesículas de sobrenadantes Mock es más 
infeccioso que el virus sin activar .................................................................................. 86 
Figura 32. Porcentaje de células Caco-2 y MA104 infectadas por HAstV Yuc8 incubado 
con vesículas ................................................................................................................. 86 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
8 
ABREVIATURAS 
AFI Autofluorescence Imaging 
ARF ADP Ribosylation Factor (Factores de ribosilación de ADP) 
AV Apoptotic Vesicles (Vesículas Apoptóticas) 
DMEM 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (Medio Eagle Modificado de 
Dulbecco) 
ECV Extracellular Vesicles (Vesículas Extracelulares) 
ESCRT 
Endosomal Sorting Complexes Requiredfvor Transport (Complejos 
especiales requeridos para el transporte de endosomas) 
HAstV Human Astrovirus (Astrovirus Humano) 
HAV Hepatitis A Virus (Virus de Hepatitis A) 
HEV Hepatitis E Virus (Virus de Hepatitis E) 
HSP Heat Shock Proteins (Proteínas de Choque Térmico) 
HSV-I Herpes Simplex Virus Type I (Virus de Herpes Simple tipo I) 
LAMP1 
Lysosomal-associated Membrane Protein 1 (Proteína de Membrana 
Lisosomal Asociada) 
LDH Lactato Deshidrogenasa 
MEM Minimum Essential Medium (Medio Mínimo Esencial) 
MET Microscopía Electrónica de Transmisión 
MHC Major Histopatibility Complex (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) 
MV Microvesículas 
MVB Multi Vesicular Bodies (Cuerpos Multivesiculares) 
NTA 
Nanoparticle Tracking Analysis (Análisis de Trayectoria de 
Nanopartículas) 
PAGE 
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Electroforesis en Gel de 
Poliacrilamida) 
PBS Phosphate-buffered saline (Buffer Salino de Fosfatos) 
PDI Protein Disulfide-Isomerase (Proteina disulfuro isomerasa) 
PIGR 
Polymeric Immunoglobulin Receptor (Receptor Polimérico de 
Inmunoglobulinas) 
RdRP RNA-dependent RNA Polymerase (RNA polimerasa de RNA) 
SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sodio) 
SEM Standard Error of the Mean (Error Estándar de la Media) 
VEG Vesículas Extracelulares Grandes 
VEP Vesículas Extracelulares Pequeñas 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
9 
RESUMEN 
La gastroenteritis vírica es una enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal, 
causada principalmente por rotavirus, calicivirus, astrovirus o adenovirus. Esta patología 
constituye un riesgo elevado para la población mundial y principalmente para los 
menores de 5 años, debido a los síntomas como fiebre y evacuaciones líquidas 
constantes, que en sus casos más graves puede ocasionar deshidratación y 
desnutrición.1 
Los astrovirus humanos (HAstV) en particular, son virus de RNA de cadena 
sencilla y polaridad positiva (ssRNA+), cuyo ciclo replicativo aún tiene incógnitas, como 
su mecanismo de egreso celular. 2 Astrovirus representa la tercera causa más importante 
en gastroenteritis no bacteriana, principalmente en población pediátrica e 
inmunocomprometida.3 Incluso se ha identificado la presencia de HAstV en casos de 
encefalitis, meningitis e infección respiratoria aguda, aunque sin asociarse como agente 
causal.4 
Por otro lado, las vesículas extracelulares son un grupo de vesículas pequeñas 
(alrededor de 1000 nm de diámetro o menos) de carácter lipídico, secretadas por las 
células y estables en fluidos biológicos como sangre, orina o saliva. Su contenido 
(proteínas, DNA y diversos tipos de RNA), puede incluir moléculas o marcadores 
característicos del estado fisiológico de la célula que las originó.5 En presencia de 
procesos patológicos como cáncer o infecciones, las biomoléculas transportadas en 
estas vesículas pueden contribuir a propagar o detener el proceso, afectando de manera 
general el estado fisiológico de un individuo.6,7 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
10 
Existe evidencia de diversos virus de ssRNA+ que se asocian a vesículas 
extracelulares o bien, que emplean los mismos mecanismos de biogénesis y egreso que 
estas vesículas. Un ejemplo de estos virus es hepatitis E (HEV), en el que se ha 
observado que el virus ocupa la misma vía de egreso que los exosomas para su 
liberación de la célula.8 
 Análisis estructurales (alineación de secuencias) y de crio microscopía sugieren 
una relación a nivel de estructura y de secuencia de aminoácidos, entre la cápside de 
HEV y la de HAstV.9 Debido a la relevancia de las proteínas de cápside en la 
morfogénesis y egreso celular de un virus,10 la relación estructural entre las cápsides de 
ambos virus permite suponer que HEV y HAstV podrían emplear mecanismos similares 
de ensamblaje y salida,9 es decir, el mecanismo de egreso de HAstV también podría 
estar relacionado con la liberación de exosomas. 
Estudios anteriores han demostrado la asociación de astrovirus a partículas de 
carácter lipídico en sobrenadantes de células infectadas que bien podrían ser vesículas 
extracelulares.11 En este estudio se analizaron por microscopía electrónica de 
transmisión las vesículas extracelulares producidas por células Caco-2 infectadas con 
HAstV Yuc8, buscando demostrar una posible asociación entre partículas virales y 
vesículas. De la misma manera, se probó que las vesículas purificadas de cultivos 
infectados producían infección en células permisivas (Caco-2) y parcialmente permisivas 
(MA104).12,13 
Por medio de NanoSight se identificó que la infección con HAstV Yuc8 altera la 
cantidad de vesículas extracelulares producidas en células Caco-2, liberándose un 
mayor número de vesículas con un diámetro por encima de 150 nm en los casos de 
células infectadas. 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
11 
Si bien en este estudio no se indagó en las interacciones moleculares involucradas 
en la asociación virus-vesícula, los resultados obtenidos sugieren que las vesículas 
extracelulares podrían tener un papel en el ciclo replicativo y/o extracelular de HAstV 
Yuc8. Estos resultados representan el planteamientobase para futuros proyectos que 
permitan esclarecer el papel de las vesículas extracelulares en la infección no solo con 
HAstV Yuc8, sino con otros virus. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
12 
I. MARCO TEÓRICO 
1.1. Gastroenteritis 
La gastroenteritis es una enfermedad caracterizada por una inflamación del tracto 
gastrointestinal, diarrea frecuente y en algunos casos sangrado. Se puede clasificar 
como bacteriana y no bacteriana, según el agente patológico involucrado. Los principales 
agentes etiológicos de las gastroenteritis no bacterianas son virus, donde los de mayor 
relevancia clínica son: rotavirus, calicivirus (norovirus y sapovirus), astrovirus y 
adenovirus.1 La infección con cualquiera de estos patógenos puede cursar por una vía 
asintomática o bien presentarse un cuadro clínico severo o leve, dependiendo de 
diversos factores inherentes al paciente y su entorno.4 A continuación, se enlista la 
sintomatología general que se presenta en casos de gastroenteritis grave o leve.1,3 
Cuadro clínico severo: 
- Vómito frecuente e intenso 
- Diarrea de evacuaciones semilíquidas (más de 10 veces al día), sin sangre 
- Fiebre de más de 39°C 
- Dolor abdominal 
- Malestar general 
- Sintomatología gripal 
- Deshidratación y desnutrición 
 
Cuadro clínico leve: 
- Diarrea con menos de 10 evacuaciones al día, sin sangre 
- Malestar general 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
13 
- Sintomatología gripal 
- Deshidratación 
En la gastroenteritis causada por agentes virales, el sangrado es un signo poco 
frecuente. La deshidratación y desnutrición representan el mayor riesgo para la población 
menor de edad y en países en vías de desarrollo y poblaciones rurales, puede llevar a la 
muerte.1 
Cuando se presenta un caso de gastroenteritis, es importante diferenciar el agente 
causal para proporcionar un tratamiento adecuado. Hablando de gastroenteritis no 
bacterianas la terapia se limita, por lo general, a medicamentos que permitan restablecer 
el estado general de salud del individuo (rehidratación principalmente), y dejar que el 
sistema inmune combata la enfermedad.3 
Aunque por lo general los casos de gastroenteritis no bacteriana se resuelven en 
periodos menores a 5 días, los ensayos de diagnóstico son poco usados y por rutina 
cualquier gastroenteritis prolongada por periodos mayores y sin acompañamiento de otra 
sintomatología que sugiera enfermedades de mayor relevancia clínica, se tratan con 
antibióticos.1,4 
Los agentes causales de las gastroenteritis no bacterianas se transmiten por vía 
fecal-oral y tienen un periodo de incubación variable, pero no mayor a 5 días. Hasta la 
fecha, no se cuenta con un método eficaz para la profilaxis o tratamiento paliativo de esta 
enfermedad, solo existen vacunas para algunos de los virus causantes de gastroenteritis, 
como rotavirus (principal causa de gastroenteritis no bacteriana en menores de 5 años), 
por lo que la mejor manera de combatir las infecciones es la prevención, lavando bien 
los alimentos (principalmente las verduras), asegurándose de tener una buena higiene 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
14 
personal en todo momento, sobre todo al manipular alimentos y de preferencia evitar 
consumir alimentos crudos.1 
1.2. Astrovirus 
La familia Astroviridae, comprende a virus no envueltos, de cápside icosaédrica 
de tamaño aproximado de 28-30 nm (medidos por microscopía electrónica), con genoma 
viral de RNA de hebra sencilla con polaridad positiva (figura 1). Su genoma mide 
aproximadamente 6.8 Kb, incluye una cola de poli A en su extremo 3’ y está organizado 
en 3 marcos de lectura abiertos (ORF1a, ORF1b y ORF2). El ORF2 codifica para la 
proteína estructural (VP90), mientras los ORF1a y ORF1b codifican las proteínas no 
estructurales del virus como la proteasa viral y la RNA polimerasa dependiente de RNA 
(RdRP). También se ha encontrado un ORF putativo en la región del ORF2, aunque aún 
se desconoce la función concreta de su producto de traducción (figura 2).2,14 
La proteína estructural de la cápside VP90 es procesada por caspasas 
intracelulares para dar lugar a la proteína VP70. VP70 a su vez se procesa 
extracelularmente por proteasas como tripsina y origina a la VP34 (región central de la 
cápside) y las espículas VP25 y VP27 (figura 1).14 
 
 
 
 
Figura 1. Ilustración de virión maduro de astrovirus 
Estructura de astrovirus maduro, se muestra la organización del virus, con el genoma 
viral asociado a la región central de la cápside formada principalmente por VP34. Las 
espículas VP25 y VP27, fundamentales para la infectividad del virus. Todas las proteínas 
de la cápside viral (estructurales) son producto final del procesamiento proteolítico de la 
proteína VP90.15 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
15 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
De acuerdo con sus características genéticas y al tipo de hospedero al que son 
capaces de infectar, la familia Astroviridae se divide en dos géneros: Avastrovirus, que 
infectan aves, y Mamastrovirus, los cuales infectan mamíferos. Dentro del género 
Mamastrovirus se agrupan 8 serotipos de astrovirus humanos (HAstV1-8) conocidos 
como clásicos o canónicos, aislados por primera vez de heces provenientes de personas 
Figura 2. Genoma de astrovirus y sus productos proteicos 
A) El genoma de astrovirus posee tres marcos de lectura que codifican para productos 
funcionales bien definidos, (entre proteínas estructurales y no estructurales) y péptidos 
pequeños con función desconocida en su mayoría, resultantes del procesamiento de 
sus productos funcionales. Igualmente, se conoce la existencia de un marco putativo, 
denominado ORFX cuyos productos proteicos y funciones aún se desconocen. Para la 
traducción del ORF2, éste primero es replicado como RNA subgenómico. B) Posibles 
motivos de las proteínas estructurales y no estructurales de astrovius. El ORF1a, 
codifica para la proteasa viral (nsp1a); el ORF1b, codifica para la RdRP (nsp1b); el 
ORF2, codifica para la poliproteína estructural VP90, que consiste en regiones 
conservadas (P1 y cápside o “Shell”), una región variable comprende el dominio P2 
(espículas) y una región C que es procesada por caspasas celulares dando como 
producto el precursor VP70. Las partículas que contienen VP70 son procesadas 
posteriormente por tripsina, produciendo la nucleocápside (VP34) y las espículas 
(VP25 y VP27). HEL, dominio putativo de helicasa; VPg, región codificante para la 
proteína VPg; HVR, región hipervariable; NLS, señal de localización nuclear putativa; 
DD, dominio de muerte putativo. Modificado de Bosch A, et al, 2014. 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
16 
con gastroenteritis. En las últimas décadas, han emergido nuevas cepas de astrovirus 
en brotes epidémicos, conocidos como astrovirus no canónicos o nuevos, dentro de los 
que se encuentran HAstV-MLB y HAstV-VA.1, 14 
1.2.1. Ciclo de replicación 
El proceso infeccioso con HAstV comienza a nivel de tracto gastrointestinal, con 
la adhesión y entrada del virus en enterocitos, aunque hasta la fecha no se conocen las 
moléculas de la superficie celular involucradas en esto. Una vez adherido el virus a la 
membrana, este se internaliza por endocitosis mediada por clatrinas. Dentro de la célula, 
un descenso en el pH del endosoma permite el desnudamiento del virus, liberando su 
material genético al citoplasma para su traducción. 2,16 
Los ORF1a y ORF1ab se traducen simultáneamente, originando las proteínas no 
estructurales nsp1a y nsp1ab, que son procesadas hasta dar lugar a la proteasa viral, la 
RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRP) y otros péptidos cuya función aun no es 
conocida (figuras 2 y 3). El proceso de replicación viral ocurre en asociación con 
membranas intracelulares, en cuerpos similares avesículas.2,15 
La proteína estructural base del virus (VP90), se traduce del RNA subgenómico 
sintetizado del ORF2 del genoma viral. La interacción de unidades de VP90 da lugar a 
la cápside viral completa, donde se empaqueta el nuevo material genético replicado por 
la RdRP. La VP90 que constituye la cápside de los viriones ensamblados, se procesa 
intracelularmente por caspasas,17 mediante un corte proteolítico hacia el extremo 
carboxilo terminal, lo que origina que la unidad estructural de la cápside ahora se 
denomine VP70 (por la reducción de su peso molecular). 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
17 
La partícula viral con VP70 es capaz de ser liberada al medio extracelular,18 donde 
madura al ser procesada por otras enzimas, originando una organización en la cápside 
viral, donde la proteína VP34 es el componente central de la cápside y los polipéptidos 
VP25 y VP27 se asocian como espículas fundamentales en la infectividad del virus 
(figura 2).14 
El mecanismo de egreso celular de los astrovirus, no se conoce hasta el momento, 
aunque se ha comprobado que el virus requiere ser procesado por caspasas (partícula 
con proteína VP70), antes de ser liberado.17,18 Así mismo, se sabe que los HAstV no son 
virus líticos en fases tempranas de infección, es decir, su liberación no depende de la 
lisis celular. En la figura 3 se muestra un esquema general del ciclo de replicación viral 
de la familia Astroviridae.2,14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Ciclo replicativo de astrovirus 
El virus se adhiere a la membrana celular mediante receptores aún no caracterizados (A), 
es internalizado a la célula por endocitosis mediada por clatrinas (B) y su genoma se libera 
al citoplasma donde comienza a ser traducido y la replicación ocurre en agregados de 
proteínas y membranas, cuyo origen se desconoce (C). Las proteínas virales se traducen 
a partir del genoma viral ligado a VPg, que origina en primer lugar las proteínas no 
estructurales nsP1a, nsP1b y diversos péptidos de funcionalidad desconocida(D). 
Posteriormente se sintetiza el RNA subgenómico del que se traduce la proteína estructural 
VP90 para el empaquetamiento del genoma viral replicado y producción de los viriones 
VP90 (E). Los viriones con cápside VP90 son procesados por caspasas celulares para 
originar a los viriones inmaduros de cápside VP70, que son liberados de la célula por un 
mecanismo aún desconocido (F). En el espacio extracelular los viriones maduran por 
medio de procesamientos proteolíticos de la VP70 de la cápside, que da lugar a los 
viriones infectivos con nucleocápside VP34 y espículas VP25 y VP27 (G). Modificado de 
Bosch A, et al, 2014. 
A 
B 
C 
E 
F 
G 
D 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
19 
1.2.2. Patogenicidad 
Gran parte de los virus relacionados con gastroenteritis tienen su mayor efecto 
patogénico por lisis celular de los enterocitos y disrupción de la continuidad de la pared 
intestinal. Sin embargo, en el caso particular de los HAstV se ha comprobado que la lisis 
celular no es parte de su proceso infeccioso y por ende no se relaciona con su 
patogenicidad. Durante el proceso infeccioso con HAstV se ha observado una 
disminución de la absorción de iones y carbohidratos, lo que lleva a un desbalance 
electrolítico y osmótico responsable de la disminución en absorción de líquidos y 
deshidratación de los pacientes.4 
In vitro, se ha observado que péptidos residuales producidos durante el 
procesamiento de las proteínas de la cápside del virus, son capaces de alterar la 
permeabilidad de las células entéricas, lo que podría implicar in vivo, que se favorezca 
la pérdida de líquidos, llevando a un cuadro diarreico.19 
1.2.3. Epidemiología de astrovirus 
Los astrovirus humanos, son el tercer agente causal de gastroenteritis no 
bacteriana, de mayor importancia clínica. Tienen una incidencia de 8-10 % en menores 
de 5 años, como agentes etiológicos en casos graves de gastroenteritis; aunque se sabe 
que más del 80% de la población en el mundo posee anticuerpos contra estos virus.1,14 
Aunque los astrovirus humanos son de prevalencia global, se sabe que los países 
en vías de desarrollo tienen mayor incidencia por su falta de acceso a agua y alimentos 
salubres. Aunque en ciudades y localidades con alto nivel de industrialización, la elevada 
contaminación de aguas y ambientes, así como la falta de higiene, favorecen la 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
20 
diseminación del virus, el índice de mortalidad es menor por el acceso a tratamiento 
médico.1 
En los últimos años, se han reportado casos de astrovirus no canónicos 
identificados en biopsias de pacientes inmunocomprometidos fallecidos por encefalitis, 
meningitis e infección pulmonar aguda. Sin embargo, la relación de HAstV como agente 
causal de dichos casos no se pudo establecer de forma clara.20 
1.3. Vesículas extracelulares 
Las vesículas extracelulares son un grupo de cuerpos membranosos producidos 
por las células ya sea de mamíferos, proteobacterias, archaeas y plantas. Para su 
estudio, se han organizado en diferentes grupos como exosomas, microvesículas (MV) 
y vesículas apoptóticas (AV), según su biogénesis, tamaño, marcadores específicos, 
densidad, etc.6 
Aunque hay diversos métodos de purificación según el tipo de vesículas que se 
desea obtener, por lo general no se tiene la resolución suficiente para separar 
completamente los diferentes tipos de vesículas extracelulares en una muestra. Los 
aislados representan una mezcla de diversas vesículas solo diferenciadas por su tamaño 
o algunos marcadores. Existen métodos de afinidad que emplean anticuerpos para 
separar MV de exosomas, usando como blanco los marcadores comunes de exosomas 
acoplados a partículas magnéticas, en algunos casos viables para su uso en citómetros 
de flujo.21,22 En la tabla 1 se muestran algunos aspectos generales de vesículas 
extracelulares. 
En células eucariontes y en particular, organismos pluricelulares, se ha observado 
que la producción de vesículas extracelulares es una constante que se puede ver 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
21 
alterada en casos de enfermedad, originando cambios principalmente en su contenido, 
el cual puede incluir proteínas, mRNA y miRNA, entre otras biomoléculas.7,23 
Se ha considerado que una de las funciones de las diferentes vesículas 
extracelulares es la comunicación intercelular e inmunoregulación, aunque en algunos 
casos, patógenos como virus y parásitos intracelulares parecen influir en su contenido y 
aprovechar las vesículas extracelulares para transmitir factores de virulencia de una 
célula a otra favoreciendo su propagación.6,7 
 
Característica Exosomas MV AV 
Diámetro [nm] 50-150 100-1,000 >1,000 
Densidad en 
sacarosa [g/mL] 
1.13-1.2124 Variable 1.16-1.28 
Apariencia en 
MET 
Copa* 
Electrodensos con 
forma irregular 
Heterogéneos 
Sedimentación 
[xg] 
100,000 10,000 
1,200 
10,000 
100,000 
Composición 
lipídica 
Ricos en colesterol, 
esfingomielina y 
ceramidas; contienen 
balsas lipídicas y 
fosfatidilserina 
expuesta 
Fosfatidilserina 
expuesta 
Membranal, 
variable con 
fosfatidilserina 
expuesta 
Principales 
marcadores 
CD63, CD9, Alix y 
TSG101 
Integrinas, selectinas 
y CD40-L 
Histonas 
Origen 
intracelular 
Endosomas 
Membrana 
plasmática 
Membrana 
plasmática 
 
 
1.3.1. Función de las vesículas extracelulares 
En un principio, se creía que la única utilidad que podían tener las vesículas 
extracelulares era ser una herramienta de desecho de metabolitos celulares. Diversas 
observaciones del comportamiento celular ante la exposición a estas vesículas, y 
Tabla 1. Características Generales de Vesículas Extracelulares*Aislados por ultracentrifugación. 
Tabla modificada de Théry C, et al, 2009. 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
22 
estudios en modelos animales en casos de enfermedades como cáncer, entre otros, han 
llevado a proponer que las vesículas extracelulares participan en la comunicación celular 
y transferencia de proteínas biológicamente activas, lípidos y RNA (mRNA y miRNA 
principalmente), de una célula a otra. Estas biomoléculas contribuyen en procesos como 
la presentación antigénica y sensibilización local de células para la amplificación de la 
respuesta inmune; inducción de la expresión de proteínas mediante mRNA o 
transductores transportados en las vesículas, etc.26,27 
Por ejemplo, se ha encontrado que las células dendríticas liberan exosomas que 
contienen proteínas con función protectora ante el sistema del complemento en las 
células diana, y a su vez favorecen la presentación de antígenos o la estimulación de 
células T. Así mismo, se ha observado que, en casos de cáncer, los exosomas liberados 
por las células afectadas pueden contener biomoléculas que favorecen la aparición de 
eventos adversos en otras células. Estas biomoléculas se pueden emplear como 
marcadores específicos útiles en el diagnóstico y diferenciación de un cáncer respecto a 
otro o de otras patologías con sintomatología similar.26-28 
La interacción entre las células vecinas y las vesículas secretadas por otra puede 
desencadenar diversos eventos, como unión de ligandos solubles o adheridos en la 
membrana vesicular y que unen receptores celulares, estimulando cadenas de 
señalización, por ejemplo, en los casos de presentación antigénica. De la misma manera, 
las vesículas pueden liberar su contenido en el interior de una célula vecina, 
desencadenando diversos efectos y respuestas. La internalización puede ocurrir 
mediante diversos procesos como fusión de membranas, fagocitosis, macropinocitosis o 
endocitosis mediada por receptores.7,29 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
23 
La fusión de membranas puede darse por el propio carácter lipofílico de las 
vesículas y la presencia de lípidos fusogénicos (como fosfatidiletanolamina y 
fosfatidilcolina) en su membrana. Mecanismos como la endocitosis, fagocitosis y 
macropinocitosis, dependen de la unión específica de receptores celulares y ligandos 
presentes en la superficie de las vesículas, tales como reconocimiento de la fosfatilserina 
en las membranas vesiculares mediada por receptores celulares de tipo tirosina cinasa, 
opsonización mediada por anticuerpos y por unión a factores del sistema del 
complemento relacionada con receptores celulares específicos para inmunoglobulinas y 
factores del complento.23,29 
Esta diversidad de mecanismos de interacción de las vesículas extracelulares les 
confiere especificidad para interactuar con las células blanco, mediante receptores o 
moléculas que unen los ligandos adheridos a las vesículas. Las diferentes vías de 
internalización de las vesículas extracelulares también determinan una gran variedad de 
posibilidades para el destino de su contenido que puede ser reciclado, usado en la 
activación de vías de señalización y regulación de expresión genética, degradación, etc. 
El mecanismo de selección para la vía preferente de interacción entre una vesícula y una 
célula aún es una incógnita.29 
1.3.2. Composición y marcadores moleculares de vesículas extracelulares 
Los diversos tipos de vesículas extracelulares también tienen diferentes 
mecanismos de biogénesis. El mecanismo de biogénesis influye en el tamaño y 
contenido de las vesículas, así como los marcadores moleculares que presentan y que 
en muchos casos permiten diferenciar un tipo de vesícula de otra.23,25 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
24 
Los exosomas, por ejemplo, se originan a partir de invaginaciones producidas en 
endosomas maduros. En la formación y maduración de los denominados cuerpos 
multivesiculares al interior de la célula donde comienza la formación de exosomas, 
participa principalmente la maquinaria ESCRT. Este proceso los hace únicos en su 
composición proteica y lipídica, lo que ayuda a facilitar su distinción de otras vesículas 
extracelulares. Dentro del contenido común de un exosoma, se encuentran proteínas del 
citoesqueleto como actinas, cofilina 1, profilina 1, tubulina, etc.; proteínas 
transmembranales como PIGR (Receptor Polimérico de Inmunoglobulinas), LAMP1 
(Proteína de Membrana Asociada Lisosomal) y CD59 (Inhibidor membranal de lisis 
reactiva o Proteína Inhibidora de MAC); enzimas como acetil colinesterasa, enolasas, 
aldolasas, LDH (Lactato Deshidrogenasa), ciclofilina A, peroxirredoxinas, etc.; 
reguladores transcripcionales; tetraspaninas como CD9, CD63 y CD81; entre otras, 
dependiendo del origen celular de los exosomas y estado fisiológico de las mismas.27,30,31 
Pese a las diferencias que se presentan entre los exosomas provenientes de un 
tipo celular y otro o su estado fisiológico, se han identificado proteínas constitutivas que 
están presentes en la mayoría de los casos como aquellas relacionadas con su 
biogenésis, como Alix y TSG101, entre otras.30,32 
Las llamadas microvesículas de manera general, se originan de gemaciones 
producidas en la membrana celular, lo que le confiere a este tipo de vesículas un 
repertorio de marcadores similar al de la propia membrana celular que la originó, y 
marcadores comunes que incluyen bombas de sodio y potasio, bombas de calcio y una 
composición lipídica rica en fosfatidilserina.30 
Las microvesículas se forman por remodelación de la membrana plasmática; este 
proceso se dirige principalmente por cambios conformacionales en la actina y la miosina 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
25 
(constituyentes del citoesqueleto). Se ha observado que este evento es principalmente 
dirigido por proteínas de la familia ARF, como ARF1 y ARF6. Dentro de sus principales 
biomarcadores, se encuentran proteínas como RhoA, ARF1, ARF6, Rab22a, integrinas, 
selectinas, ligando de CD40, VCAMP3, entre otras.33,34 
Por su parte, las vesículas apoptóticas tienen un origen similar al de las MV, con 
la diferencia de que su formación ocurre junto con la separación de la membrana 
plasmática durante el proceso de muerte celular y la formación de los cuerpos 
apoptóticos. La gran diferencia que posee este tipo de vesículas extracelulares respecto 
a las otras es la presencia de marcadores como C3b, que ayudan a dirigir la fagocitosis 
de este tipo de vesículas. De la misma manera, en su repertorio de marcadores, pueden 
contar con histonas.34,35 
1.4. Vesículas extracelulares y virus 
En la actualidad se conocen diversas maneras en que los virus se relacionan 
directa o indirectamente con las vesículas extracelulares, usando la maquinaria de 
biogénesis de vesículas, el mecanismo de transporte de biomoléculas (material genético 
o proteico), inducción de síntesis de otras biomoléculas por la misma célula, 
componentes vesiculares, etc.6,25 
Por ejemplo, estudios recientes han demostrado que los exosomas liberados de 
células infectadas con virus de RNA, como HIV, HAV, HCV, HTLV y DEN, contienen y 
liberan diversos factores reguladores como vRNA, proteínas virales, y miRNAs tanto 
celulares como virales. En conjunto con otros elementos genéticos reguladores propios 
de la célula hospedera, estos componentes ayudan a establecer una infección productiva 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
26 
y modular la respuesta inmune; es decir, los exosomas pueden tanto diseminar como 
limitar una infección.26 
De manera similar, existe evidencia de múltiples virus de RNA de cadena sencilla 
y polaridad positiva que son capaces de asociarse a membranas intracelulares para 
organizar entornos óptimos de replicación. Estos virus poseen la habilidad de asociarse 
a otros cuerpos lipídicos durante su egreso celular o enel medio extracelular. Tal es el 
caso de virus como el de hepatitis E (HEV), que para su salida de la célula emplea la 
ruta de liberación de exosomas;8 hepatitis C (HCV), que se ha visto asociado a exosomas 
durante su egreso y cuya infección puede ser transmitida por esta vía.36,37 En general, 
los exosomas podrían estar relacionados con la internalización y liberación de virus como 
Hepatitis C y E, así mismo podrían influir en el mecanismo de egreso de virus como 
VIH.38 
Por otro lado, se ha observado que el virus de la hepatitis A, que es un virus de 
RNA, no envuelto, es liberado por mecanismos asociados a microvesículas y exosomas. 
El virus es empacado en vesículas y durante una parte de su ciclo extracelular le 
confieren características similares a las de un virus envuelto (figuras 4 y 5). Se cree que 
este mecanismo de pseudo envoltura podría ayudar al virus en la evasión de la respuesta 
inmune.39,40 
La importancia de las observaciones relacionadas con las MV, exosomas y los 
diferentes virus de hepatitis, para el presente trabajo, radica en las similitudes que se 
han observado entre HEV y HAstV, como características estructurales y de secuencia 
aminoácidos en las proteínas de cápside (figura 4); mismo tipo de material genético (RNA 
cadena sencilla polaridad positiva) y un ciclo de replicación parecido.9 Estos aspectos 
permiten pensar en la posibilidad de que estos virus compartan características en su 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
27 
mecanismo de salida, como el uso de exosomas, MV o la vía de biogénesis y egreso de 
estas vesículas extracelulares.41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Similitud estructural entre la cápsides de astrovirus y hepatitis E 
A) Reconstrucción de la cápside de astrovirus serotipo 8 inmaduro y HEV, por crio 
electro microscopía. Ambas cápsides comparadas presentan una estructura icosaédrica 
y morfología similar en la reconstrucción tridimensional con espículas (viriones de la 
parte superior) y sin espículas (viriones de la parte inferior). Los colores pareados que 
se indican en la cápside de astrovirus, representan el posible sitio de unión de las 
espículas con la nucleocápside. B) Si se compara la secuencia de aminoácidos de la 
proteína estructural de la cápside de astrovirus (VP70), con los diferentes dominios 
estructurales de la cápside de HEV, el alineamiento presenta una similitud del similitud 
del 21% en el dominio S y 13% en los dominios M y P de la proteína estructural de HEV. 
Las regiones de sombreado gris representan las regiones variables (no conservadas 
entre los diferentes astrovirus) de la VP70. Modificado de Dryden KA, et al, 2012. 
 
A 
B 
21% 13% 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
28 
En algunos estudios del laboratorio se ha observado que al utilizar un gradiente 
de densidad para purificar HAstV de sobrenadante de cultivos infectados, hay una 
fracción flotante (menos densa) de virus, que se asocia a cuerpos lipídicos aún no 
caracterizados. La presencia de estos cuerpos lipídicos reduce el efecto de la tripsina en 
la activación de los virus purificados. Al analizar las proteínas que se encuentran 
asociadas en estas fracciones menos densas, se ha observado la presencia de proteínas 
virales al tratarse con tripsina, muestran un procesamiento parcial, es decir, hay una 
parte de proteínas virales que no llegan a ser procesadas. Si las fracciones son tratadas 
con detergente y posteriormente con tripsina, ocurre un procesamiento total de las 
proteínas virales (VP90 procesada a VP70, que a su vez se procesa en VP25 y VP27 
completamente), lo que sugiere la protección o resistencia a la tripsina en el HAstV 
presente en estos cuerpos lipídicos.11 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
29 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1.5. Unidades Colectivas Infecciosas 
Otro de los procesos relacionados con las vesículas extracelulares en procesos 
infecciosos, es su capacidad de formar las denominadas unidades colectivas infecciosas 
(UCI). En general, las UCI se definen como organizaciones o estructuras que permiten 
Figura 5. Pseudoenvoltura del virus de Hepatitis A 
En la parte superior se muestra una microscopía electrónica de viriones de HAV 
envueltos en membranas de origen vesicular (eHAV), comparados con un virión 
desnudo del mismo virus (lado derecho).39 
En la parte inferior se muestran diferentes vías posibles de egreso de HAV en las 
que se propone el mecanismo mediante el cual el virus adquiere su pseudoenvoltura 
(asociación con vesículas extracelulares). a) cuerpos multivesiculares y exosomas, 
b) gemación de la membrana plasmática como microvesículas, c) asociación a 
autofagosomas (aunque este mecanismo no ha sido comprobado completamente), 
y d) desnudamiento en el espacio extraelular.40 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
30 
la transmisión de múltiples genomas virales a una misma célula blanco. La estructura de 
una UCI puede funcionar de diversas maneras: como la presencia de varios genomas 
del mismo virus en una sola cápside (viriones poliploides), formación de agregados de 
virus, viriones cristalizados en cuerpos de inclusión, virus agrupados en membranas o 
vesículas, transmisión de virus de una célula a otra a través uniones intersticiales, entre 
otros mecanismos.42 
Estas organizaciones brindan múltiples ventajas a los virus en su propagación, 
como la compensación de mutaciones entre diversos genomas, la compensación 
funcional de proteínas transportadas, resistencia física (tolerancia a condiciones 
ambientales), evasión de respuesta inmune (innata y adaptativa), entre otras.43 
Por definición, el transporte de múltiples genomas o partículas virales en estas 
estructuras permite aumentar la multiplicidad de infección (MOI), debido a que más de 
un genoma viral llega a una misma célula. Dadas las complementaciones posibles (de 
mutaciones y proteínas disfuncionales), es más probable producir una infección cuando 
más de un virus o un genoma llegan a una misma célula, que cuando se habla de 
partículas individuales donde las unidades defectivas (virus disfuncionales en algún 
sentido o con genomas dañados), llegan a una célula y pueden no causar infección 
productiva (sin posibilidad de producir viriones que infecten más células).43,44 
De esta forma se puede asumir que las UCI son más infectivas que unidades 
virales individuales (infectan con mayor eficiencia), pero pueden infectar un menor 
número de células en algunos casos, según las mutaciones y defectos en las unidades 
que las componen. De la misma manera, pueden presentarse casos en que favorezcan 
la propagación o conservación de unidades menos infectivas o con menor adaptación 
que otras.42-44 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
31 
II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
El ciclo replicativo de astrovirus es un proceso que hasta la fecha cuenta con 
diversas incógnitas. Por ejemplo, se ha observado que durante la replicación de HAstV, 
las partículas virales se asocian a estructuras membranosas en el interior de la célula 
cuya identidad no es clara. Así mismo, en el medio de crecimiento de células infectadas 
con HAstV una fracción del virus se asocia a estructuras de baja densidad 
(probablemente lípidos), y la activación de la infectividad por tratamiento del virus con 
tripsina, se ve disminuida en estas fracciones.11 
Actualmente, se conoce que virus con genoma de ssRNA+, emplean la 
maquinaria de biogénesis de exosomas para su egreso celular. Uno de estos virus que 
emplean la maquinaria de egreso de exosomas es el HEV. Adicionalmente, se ha 
observado que HEV tiene similitud con HAstV, en cuanto a estructura y de secuencia de 
aminoácidos en las proteínas de la cápside.9 Es importante mencionar que las proteínas 
estructurales en la cápside del virus son fundamentales en su mecanismode infección, 
ensamblaje y egreso celular.10 
Con estas bases se planteó el presente proyecto, cuya finalidad es caracterizar el 
comportamiento de las vesículas extracelulares producidas durante la infección con 
HAstV serotipo 8 (cepa Yuc8), y determinar si existe algún tipo de asociación de HAstV 
o componentes virales (viriones, material genético o proteínas), con capacidad 
infecciosa. 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
32 
III. HIPÓTESIS 
La infección con HAstV Yuc8 afecta la producción de vesículas extracelulares 
(exosomas y microvesículas) que pueden acarrear partículas virales capaces de producir 
infección en células permisivas y parcialmente permisivas al virus. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
33 
IV. OBJETIVOS 
4.1. Objetivo general 
Caracterizar la producción, asociación con componentes virales e infectividad de 
las vesículas extracelulares (exosomas y microvesículas) liberadas durante la infección 
con HAstV Yuc8. 
4.2. Objetivos específicos 
1. Implementar un método de purificación de vesículas extracelulares acorde al 
modelo biológico de trabajo. 
2. Determinar si HAstV Yuc8 se asocia a vesículas extracelulares producidas por 
células Caco-2 infectadas con el virus. 
3. Identificar si la infección con HAstV Yuc8 afecta la producción de vesículas 
extracelulares comparada con células no infectadas. 
4. Determinar si la asociación de HAstV Yuc8 con vesículas extracelulares es 
infectiva en células permisivas (Caco-2) y parcialmente permisivas (MA104) a la 
infección con el virus. 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
34 
V. MATERIALES Y MÉTODOS 
5.1. Cultivo celular 
Para este estudio se emplearon células Caco-2 y MA104. Las células Caco-2 
(aisladas de intestino grueso humano), se cultivaron a 37 °C en un ambiente con 10% 
de CO2 y empleando DMEM de alta glucosa (Sigma Aldrich, Cat. D7777-10X1L), 
adicionado con aminoácidos no esenciales y 15% de suero fetal bovino (Gibco, Cat. 
26140-079). Las células MA104 (aisladas de riñón de mono verde), se crecieron a 37 °C 
con un ambiente al 5% de CO2 y empleando DMEM advance (Gibco, Cat. 12491-015) 
con 5% de suero fetal bovino.46 
5.2. Propagación de virus 
Para la obtención del HAstV Yuc8 de trabajo se empleó lisado viral proveniente 
de dicha cepa aislada en el laboratorio y propagado en células Caco-2.46 El lisado viral 
se activa con 200 μg/mL de tripsina (Gibco, Cat. 27250-018), por una hora a 37 °C, 
posterior a lo cual la tripsina se inactiva con una cantidad equivalente de inhibidor de 
tripsina (Sigma Aldrich, Cat. T9003-250MG). Las células Caco-2 crecidas en un área de 
150 cm2, se lavan tres veces con MEM sin suero (SAFV, Cat. 56419C-10L). Se coloca 
suficiente lisado viral activado en las células para una MOI 3, dejando adsorber el virus 
por una hora a 37 °C. Finalmente, se retira el lisado viral y se lavan las células dos veces 
con MEM sin suero. Las células infectadas se incuban con 10 mL de MEM sin suero, por 
48 horas a 37 °C en un ambiente con 10% de CO2. Para la cosecha del nuevo lisado 
viral, se lisan los cultivos infectados por congelación-descongelación a -70 °C (tres 
veces). El lisado viral se alícuota y se titula por focos infecciosos en placa. 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
35 
5.3. Titulación de HAstV Yuc8 por focos infecciosos en placa 
Para conocer el título viral de una muestra con HAstV Yuc8 en unidades 
formadoras de foco por volumen de muestra (UFF/mL), se crecen células Caco-2 en 
placas de 96 pozos y se activa la muestra a titular en las condiciones mencionadas 
anteriormente (200 μg/mL de tripsina, una hora a 37 °C) y se inactiva la tripsina en la 
muestra con la cantidad equivalente de inhibidor de tripsina. 
Se preparan diluciones seriadas de la muestra activada, empleando MEM sin 
suero como vehículo. Las células Caco-2 crecidas en las placas de 96 pozos se lavan 3 
veces con MEM sin suero (100 μL por pozo) y posteriormente se transfieren las 
diluciones seriadas de la muestra con virus (50 μL por pozo). El virus se deja adsorber 
una hora a 37 °C, tras lo cual se retira el virus no adsorbido por las células y estas se 
lavan dos veces con MEM sin suero (100 μL por pozo), para finalmente incubarse con 
150 μL de MEM sin suero por 18 horas a 37 °C en un ambiente de CO2 al 10%.47 
Una vez transcurrida la infección de las células en las placas, se retira el medio 
de los pozos y se fijan las células con formaldehido (J. T. Baker, Cat. 2106-02) al 2% en 
PBS (100 μL por pozo), por 20 minutos a temperatura ambiente. Tras fijar las células, se 
lavan tres veces con PBS (100 μL por pozo) y se permeabilizan con Tritón X-100 (Sigma 
Aldrich, Cat. T8787) al 0.2% en PBS (100 μL por pozo), por 15 minutos a temperatura 
ambiente. Posteriormente las células se lavan tres veces con PBS (100 μL por pozo) y 
se incuban toda la noche a 4 °C con 50 μL de anti-Yuc848 en dilución 1:3,000 en PBS. 
Para marcar los focos infecciosos, se retira el anticuerpo de la placa, se lavan las 
células tres veces con PBS (100 μL por pozo) y posteriormente se colocan 50 μL de 
proteína A peroxidasa (GE Healthcare, Cat. NA9120) en dilución 1:2,500 como agente 
secundario. Se incuba la placa a 37 °C por 2 horas. 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
36 
Finalmente, tras la incubación con proteína A peroxidasa, se lavan las células tres 
veces con PBS (100 μL por pozo) y se revela la peroxidasa con una mezcla de buffer de 
acetatos, carbazol y peróxido de hidrógeno. 
Los focos infecciosos se observan al microscopio y se contabilizan para conocer 
el título viral de la muestra evaluada, considerando los factores de dilución, aumento 
(objetivo del microscopio) y focos contados. 
5.4. Cinética de liberación y evaluación de virus resistente a tripsina 
5.4.1. Virus en sobrenadante total 
Se activó lisado viral de HAstV Yuc8 con 200 μg/mL a 37°C por una hora, para 
infectar células Caco-2 a una MOI 5. La tripsina presente en el lisado se inactivó con una 
cantidad equivalente de inhibidor de tripsina. Las células Caco-2 cultivadas en placas de 
12 pozos se lavaron tres veces con 500 μL de MEM sin suero por pozo y el virus se dejó 
adsorber por una hora a 37°C. Pasado el tiempo de adsorción, las células se lavaron dos 
veces con MEM sin suero, para finalmente colocar 1 mL de MEM por pozo. Las células 
infectadas se incubaron a 37°C y se recolectaron sobrenadantes y lisados de celulares 
a las 12, 15, 18, 21 y 24 horas post infección.17,46 
Se dividió cada sobrenadante en dos alícuotas y se trató una alícuota con Tritón 
X-100 al 0.1% y otra con un volumen equivalente de MEM sin suero (condición control), 
incubándose por 30 minutos a 37°C. Posteriormente, se titularon todas las muestras 
(sobrenadantes y lisados) de acuerdo al procedimiento descrito en el apartado 5.3. 
Adicionalmente, se determinó el porcentaje de LDH presente en el medio y total 
en los cultivos infectados empleando el In vitro Toxicology Assay kit, Lactic 
Dehydrogenase based (Cat. TOX7-1KT), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
37 
Las muestras se analizaron por espectrofotometría en un equipo FLUOstar Omega de 
BMG Labtech, comparándose los resultados de los cultivos infectados con un control 
Mock incubado 24 horas a 37 °C. 
5.4.2. Virus en sobrenadante filtrado 
Se cultivaron células Caco-2 en áreas de 25 cm2 y se infectaron con HAstV Yuc8 
activado, a una MOI 5. Se incubaron las células infectadas a 37 °C y se recolectaron 
sobrenadantes a 12, 15 y 18 horas postinfección. Los sobrenadantes recolectados se 
centrifugaron a 500 xg por 5 minutos, descartando el precipitado, posteriormente se 
realizó una centrifugación a 2,000 xg por 30 minutos, en la que nuevamente se 
descartabael precipitado.49 
El sobrenadante recolectado tras la segunda centrifugación se pasó por 
microfiltros de 0.2 μm y el filtrado se incubó a 4°C toda la noche con polietilenglicol (PEG 
6000) al 8% y NaCl 0.5 M, para finalmente centrifugarse a 10,000 xg por una hora.49,50 
En la figura 6 se muestra un esquema ilustrativo del proceso de centrifugación y filtración 
de sobrenadantes, indicando el contenido teórico de cada fracción centrifugada.49,51 Este 
precipitado final se resuspendió en 50 μL de PBS estéril y se empleó para ensayos de 
microscopía electrónica y titulación por focos infecciosos en placa, tratado con y sin 
Tritón X-100 como se describió en el punto anterior. 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
38 
 
5.5. Purificación de vesículas extracelulares por centrifugación diferencial 
Para el trabajo con vesículas extracelulares se emplearon células Caco-2 crecidas 
en áreas de 150 cm2 e infectadas con HAstV Yuc8 a MOI 5, de acuerdo al procedimiento 
descrito en el apartado 5.2, considerando un tiempo de 18 horas para la incubación de 
la infección. En los casos de infección simulada (Mock), las células se sometieron a las 
mismas condiciones que las empleadas para infección, pero utilizando lisados celulares 
sin virus.46 
Figura 6. Separación de componentes de un sobrenadante por centrifugación 
y microfiltración 
El sobrenadante de cultivo celular se centrifugó primero a 500 xg por 5 minutos, 
después a 2,000 xg por 30 minutos. Los dos pellets obtenidos en estas 
centrifugaciones se descartaron. El sobrenadante remanente de se filtró con un 
microfiltro de 0.2 μm y se incubó toda la noche con un volumen equivalente de PEG 
al 16%, finalmente, la muestra con PEG se centrifugó a 10,000 xg por una hora. 
En los círculos se indica el contenido teórico separado con cada paso del 
procedimiento.49,51 EL contenido de virus se indica considerando la aplicación del 
procedimiento en un sobrenadante de células infectadas. En los sobrenadantes de 
células no infectadas (Mock) no hay virus en ninguna fracción. 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
39 
Se recolectaron sobrenadantes de células Caco-2 infectadas con HAstV Yuc8 a 
las 18 horas post infección (hpi). Se centrifugaron primero a 500 xg por 5 minutos, 
descartando el precipitado (precipitado 1), seguido de 2,000 xg por 30 minutos 
(precipitado 2). En este punto, se puede decir que el sobrenadante remanente se 
compone principalmente de microvesículas, exosomas, virus y sustancias solubles. Para 
poder separar las vesículas extracelulares por su tamaño y densidad, primero se 
centrifugó el sobrenadante remanente a 20,000 xg por 1 hora, es esta ocasión 
recuperando el precipitado para resuspenderlo en 50 μL de PBS estéril y se almacenó a 
4°C (precipitado 3).49 
El sobrenadante recolectado tras separar el precipitado 3 se incubó toda la noche 
a 4°C con polietilenglicol (PEG 6000) al 8% y NaCl 0.5 M, para finalmente centrifugarse 
a 10,000 xg por una hora. Se decantó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado 
(precipitado 4) en 50 μL de PBS estéril.50 En la figura 7 se muestra un esquema general 
del procedimiento de centrifugación diferencial y el contenido teórico de las fracciones 
separadas.49,51 
Se emplearon los marcadores Alix y CD63 para determinar por Western blot SDS-
PAGE la eficacia de la centrifugación diferencial realizada. Adicionalmente, se utilizaron 
muestras procesadas de la misma manera para análisis de título por focos infecciosos 
en placa, ensayos de resistencia a tripsina con y sin tritón (apartado 5.4), revelado por 
Western Blot (apartado 5.6), análisis de trayectorias de nanopartículas (apartado 5.11), 
entre otros. 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
40 
 
 
 
 
 
 
5.6. Western Blot SDS-PAGE 
Cada muestra por evaluar se trató con buffer de carga para electroforesis y se 
separaron a 130 mV en un gel de poliacrilamida al 10%. Se realizó electro transferencia 
a una membrana de nitrocelulosa en condiciones húmedas a 150 mA constantes por una 
hora. La membrana se bloqueó con leche descremada baja en grasa al 5% en PBS y se 
incubó con los anticuerpos primarios a probar. 
Figura 7. Separación de componentes de un sobrenadante por centrifugación 
diferencial y precipitación 
El sobrenadante de cultivo celular se centrifugó primero a 500 xg por 5 minutos, 
después a 2,000 xg por 30 minutos y posteriormente a 20,000 xg por una hora. El 
sobrenadante remanente se incubó toda la noche con un volumen equivalente de 
PEG al 16%, finalmente, la muestra con PEG se centrifugó a 10,000 xg por una hora. 
En los círculos se indica el contenido teórico separado con cada paso del 
procedimiento y la denominación general para ese pellet.49,51 EL contenido de virus 
se indica considerando la aplicación del procedimiento en un sobrenadante de 
células infectadas. En los sobrenadantes de células no infectadas (Mock) no hay 
virus en ninguna fracción. 
VEG, vesículas extracelulares grandes; VEP, vesículas extracelulares pequeñas. 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
41 
 Para exosomas se empleó CD63 (policlonal, Santa Cruz Biotechnology, Cat. sc-
15363) y Alix (policlonal, Aviva Systems Biology, Cat. OAAB15405) y virus (Anti-Yuc848) 
en diluciones 1:1,000 en PBS con 0.1% de leche. Cada muestra se reveló con su 
respectivo anticuerpo secundario anti-conejo asociado a peroxidasa (KPL, 04-15-06), en 
diluciones 1:2,500 en PBS con 0.1% de leche.6 
5.7. Procesamiento de proteínas virales 
Tras el procedimiento de centrifugación diferencial, la fracción VEG o precipitado 
3 proveniente de cultivos infectados se resuspendió en 50 μL de PBS. Se alicuotó la 
fracción resuspendida y se trató con Tritón X-100 al 0.1%, 0.2% y 0.5% (incubados 30 
minutos a 37°C) y posteriormente se adicionó tripsina (100 μg/mL, incubados 1 h a 37 
°C). La tripsina en cada alícuota se inactivo con cantidades equivalentes de inhibidor de 
tripsina. Las muestras se analizaron por Western-Blot SDS-PAGE, empleando un gel de 
poliacrilamida al 12.5% y de acuerdo a las condiciones descritas en el apartado 5.6. De 
la misma forma se analizó una alícuota sin tripsina ni Tritón X-100 como control negativo 
de los tratamientos evaluados.11 
5.8. Microscopía electrónica de transmisión (MET) 
Se cultivaron células Caco-2 en frascos T150 y se infectaron con HAstV Yuc8 o 
con Mock de la misma manera descrita para las pruebas anteriores. Los sobrenadantes 
se recolectaron a las 18 horas post infección y se procesaron como se indica en el 
procedimiento 5.5. Los precipitados VEG y VEP se resuspendieron individualmente en 
un volumen de 500 μL completado con TBS y se volvieron a purificar empleando el 
MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS (Cat. 293-77601), de acuerdo a las indicaciones 
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42 
del fabricante, para obtener fracciones vesiculares limpias de virus o proteínas 
coprecipitadas. 
Las muestras eluidas de VEG y VEP purificadas con el kit se fijaron en rejillas de 
cobre para microscopía electrónica y se tiñeron negativamente con acetato de uranilo.52 
Las muestras se observaron en un microscopio JEM-ARM200F a un aumento de 6,300X 
y 8,000X. 
5.9. Infectividad asociada a vesículas extracelulares 
5.9.1. Vesículas provenientes de células infectadas 
Se purificaron vesículas extracelulares provenientes de cultivos infectados, 
empleando centrifugación diferencial, en las condiciones descritas anteriormente. Las 
fracciones denominadas VEG y VEP, para los precipitados 3 y 4 respectivamente, se 
llevaron a un volumen de 500 μL de TBS y se trataron con perlas magnéticas afines a 
vesículas, empleando el MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS (Cat. 293-77601) de 
acuerdo a las instrucciones del fabricante. 
Cada fracción purificada se dividió en dos muestras y se trató una con Tritón X-
100 al 0.1% y otra con un volumen equivalente de MEMsin suero, incubándolas por 30 
minutos a 37°C. Posteriormente, el volumen de cada fracción con y sin Tritón X-100 se 
volvió a dividir en dos y se incubó una muestra con anticuerpo neutralizante anti-Yuc839 
en dilución 1:1,500 y otra con un volumen equivalente de MEM sin suero, se incubaron 
1 hora a 37°C.11 
Para determinar la infectividad de las vesículas purificadas, se emplearon células 
Caco-2 y MA104 (permisivas y parcialmente permisivas a la infección con HAstV Yuc8, 
respectivamente), crecidas a confluencia en placas de 96 pozos y cada muestra (4 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
43 
diferentes condiciones por cada fracción purificada) se diluyó a un volumen de 200 μL 
con MEM sin suero. Se lavaron las células dos veces con MEM sin suero colocó y se 
colocó 50 μL de muestra por pozo. Las muestras se dejaron adsorber por 2 horas a 
37°C53,54 y posteriormente se lavaron las células dos veces con MEM sin suero, para 
finalmente dejar incubar la infección por 18 horas a 37 °C.47 Se realizó un control de virus 
purificado HAstV Yuc8 con y sin activar, tratado en las mismas condiciones que las 
muestras. Cada placa se reveló de la misma forma descrita previamente para el ensayo 
de titulación por focos infecciosos en placa. 
5.9.2. Vesículas de cultivos no infectados 
Se recolectaron sobrenadantes de cultivos Mock de Caco-2 incubados 18 horas y 
se separaron vesículas extracelulares de la misma forma descrita anteriormente 
(centrifugación diferencial y el uso del MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS). Las 
vesículas obtenidas se incubaron con una cantidad conocida de virus purificado (y sin 
activar con tripsina), por una hora a 37 °C, posteriormente se tomaron alícuotas para 
realizar tratamiento con y sin Tritón X-100 al 0.1% y con y sin anticuerpo neutralizante, 
como se describió en el punto anterior. Cada muestra se empleó para infectar células 
Caco-2 y MA104 crecidas en una placa de 96 pozos, tomando nuevamente 2 horas a 
37°C como tiempo de adsorción53,54 y 18 horas de infección.47 Cada placa se reveló de 
la misma forma descrita previamente para el ensayo de titulación por focos infecciosos 
en placa. 
5.10. Inmunofluorescencia 
Células Caco-2 se sembraron en placas de 48 pozos, con cubreobjetos al fondo y 
se incubaron a 37 °C y 10% de CO2, hasta confluencia. Las células confluentes se 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
44 
infectaron con Yuc8 o trataron con Mock de acuerdo al protocolo descrito previamente 
para infección. Se incubaron por 18 h a 37 °C, tras lo que se fijaron las células con 
paraformaldehído al 2% en PBS, se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.2% en 
solución de bloqueo (albúmina bovina sérica al 0.1% en NH4Cl 50 mM en PBS). 
Las células fijadas y permeabilizadas se incubaron a 4 °C toda la noche, con anti-
CD63 monoclonal de ratón (Merck, Cat. CBL553), anti-Yuc-848 policlonal de conejo y anti-
PDI 1D3 monoclonal de ratón (Enzo Life Sciences, Inc., Cat. ADI-SPA-891-J). Los 
anticuerpos se emplearon diluidos 1:1,000 en solución de bloqueo. Para el marcaje 
fluorescente se lavaron las células y se incubaron 2 horas a temperatura ambiente con 
anti-conejo acoplado a ALEXA 488 (Invitrogen, Cat. A11034) y anti-ratón acomplado a 
ALEXA 568 (Invitrogen, Cat. A11031), diluidos 1:1,000 en solución de bloqueo. 
Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI y finalmente las muestras se fijaron en 
portaobjetos embebidos con AFI. Las muestras se observaron en un microscopio de 
epifluorescencia ZEISS AxiosKop 2 a un aumento de 100X. 
5.11. Análisis de Trayectoria de Nanopartículas (NTA) 
Se realizó un análisis de trayectoria de nanopartículas comparando las muestras 
purificadas (VEG y VEP) provenientes de sobrenadantes de células infectadas con 
HAstV Yuc8 a MOI 5 y en condiciones Mock.46 
El análisis se realizó en la Universidad Iberoamericana, campus Satélite, con 
apoyo del Dr. Iván Quevedo Partida, empleando un equipo NanoSight NS300. Se 
tomaron de 3-5 videos de 60’’ cada uno, midiendo un promedio de 20-40 partículas por 
marco. Las muestras se analizaron de forma estática (sin flujo) y diluidas 100-200 veces 
en PBS estéril y filtrado con poro de 0.2 μm. Adicionalmente se analizó un blanco de PBS 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
45 
estéril y filtrado para considerar las partículas propias de este medio de dilución que 
pudieran estar presentes formando ruido en las mediciones. 
5.12. Presentación de datos y análisis estadístico 
Para la presentación y análisis de datos de este trabajo, se empleó el software 
GraphPad Prism® 5. En las gráficas mostradas se representan promedios de los valores 
observados en 3 o más repeticiones experimentales (con sus respectivas replicas o 
duplicados), según se indique. Las barras de error en los gráficos representan el error 
estándar de la media (SEM) de los datos que se muestren. 
A menos que se indique lo contrario, para las pruebas estadísticas se realizó 
análisis de varianzas (ANOVA), con 0.05 de significancia (p). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QFB CARLOS ENRIQUE BAEZ NAVARRO 
 
46 
VI. RESULTADOS 
6.1. Cinética de liberación y evaluación de virus resistente a tripsina 
6.1.1. Virus en sobrenadante total 
Como se mencionó anteriormente, en trabajos anteriores se ha observado que 
una fracción del HAstV Yuc8 presente en sobrenadantes de células infectadas flota en 
gradientes de densidad y muestra resistencia al tratamiento con tripsina. Si se emplea 
detergente como el Tritón X-100, la sensibilidad a la activación con tripsina se recupera 
y en el gradiente de densidad, la fracción flotante del virus desaparece, por lo que se 
sugirió que el virus en sobrenadantes podría estar asociado a partículas de carácter 
lipídico, como membranas o vesículas.11 
Dado que ya se conoce la cinética de liberación para astrovirus que es activado 
con tripsina en sobrenadantes,17 se buscó determinar si la cantidad de virus asociado a 
partículas lipídicas (resistente a tripsina), en sobrenadantes de células infectadas 
cambiaba con el tiempo. Se infectaron células Caco-2 con HAstV Yuc8 a MOI 5, y los 
sobrenadantes totales se recolectaron a las 12, 15, 18, 21 y 24 horas postinfección. Cada 
muestra de sobrenadante se dividió en dos alícuotas, una alícuota se activó con tripsina 
y otra se trató con Tritón X-100 al 0.1% antes de ser activada con tripsina. La cantidad 
de virus en cada muestra se determino por ensayo de focos infecciosos en placa. 
 Se observó que el virus activado solo con tripsina no tiene un aumento 
significativo (aumento <106 UFF/mL), a partir de las 12 horas post infección (ANOVA, 
p>0.05). La cantidad de virus protegido, es decir, que requiere un tratamiento previo con 
Tritón X-100 para ser activado con tripsina, aumenta con el tiempo, sin diferencias 
significativas a partir de las 18 hpi (ANOVA, p>0.05). A partir de las 15 hpi el título de 
CARACTERIZACIÓN DE VESÍCULAS EXTRACELULARES DURANTE LA INFECCIÓN CON HAstV 
 
47 
este virus que requiere un tratamiento con Tritón X-100 antes de ser activado con 
tripsina, es aproximadamente 1.8 mayor que el título del virus activado solo con tripsina 
(Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
Estos coinciden con otros estudios donde se ha reportado que el título viral en 
sobrenadantes y células infectadas no tiende a cambiar en orden de magnitud después 
de las 12 horas de infección.17,18 Es decir, la mayoría del virus que liberan las células ya 
está presente en el sobrenadante a partir de las primeras 12 horas post infección. 
6.1.2. Virus en sobrenadante filtrado 
Tras analizar la cinética de virus resistente a tripsina presente en sobrenadantes 
de células infectadas, se buscó determinar si las partículas de carácter lipídico que 
impedían la activación de una parte del virus podían ser de carácter vesicular. En primera 
instancia se empleó un método de exclusión