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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS Biología Experimental CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE UNA MUTANTE CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENASA (Δmdh) DE Streptomyces coelicolor TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NELLY ARACELI ABURTO RODRÍGUEZ TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARIA ELENA DEL CARMEN FLORES CARRASCO Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. BERTHA MARÍA JOSEFINA GONZÁLEZ PREDAJO Instituto de Fisiología Celular, UNAM DR. LUIS SERVÍN GONZÁLEZ Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM MÉXICO, D.F. ABRIL 2015 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 3 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS Biología Experimental CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE UNA MUTANTE CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENASA (Δmdh) DE Streptomyces coelicolor TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NELLY ARACELI ABURTO RODRÍGUEZ TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARIA ELENA DEL CARMEN FLORES CARRASCO Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. BERTHA MARÍA JOSEFINA GONZÁLEZ PREDAJO Instituto de Fisiología Celular, UNAM DR. LUIS SERVÍN GONZÁLEZ Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM MÉXICO, D.F. ABRIL 2015 4 Dr. Isidro Ávila Martínez Director General de Administración Esco lar, UNAM. Pr esente COORDINACiÓN Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 19 de enero de) 2015, se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de MAESTRA EN CIENCIAS BIOLOGICAS de la alumna ABURTO RODRIGUEZ NELLY ARACELI con número de cuenta 30500035-8 con la tesis titulada " CARACTERIZACiÓN FISIOLOGiCA y BIOQuíMICA DE UNA MUTANTE CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENESA (Amdh) DE Streptomyces coelicofor', realizada bajo la dirección de la DRA. MARíA ELENA FLORES CARRASCO : Presidente: Voca l; Secretario: Suplente: Suplente: ORA. LUISA ALVARINA ALBA LOIS DRA. GLORIA DiAl RUIZ OR LUIS SERVIN GONZÁLEZ ORA. SILVIA GUZMÁN BELTRÁN ORA. RaMINA MARIA DE LA PAl RODRIGUEZ SANOJA Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. ATENTAMENTE " POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU" Cd. Universitaria, D.F., a 18 de marzo del 2015. DRA. MARiA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA COORDINADORA DEL PROGRAMA COORDINACiÓN Unidad de l'osgrado • Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológic.."ls Ed ifi cio S , 1 eL Pi:so. Circuito de Posgrados Cd. Universitaria Delegación Coyollcán C. P. 04510 México, D.F. TeL 5623 7002 http://pcbiol.posgrado.unam.mx 5 AGRADECIMIENTOS Al posgrado de Ciencias Biológicas, UNAM. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo económico brindado mediante la beca número 288715 para la realización de este trabajo. A la Dirección de Asuntos del Personal Académico por el apoyo financiero del proyecto PAPIIT IN206313 titulado “El ciclo de los ácidos tricarboxílicos en Streptomyces coelicolor”. A mi comité tutoral: Dra. María Elena Flores Carrasco. Dra. Bertha María Josefina González Pedrajo. Dr. Luis Servín González. Gracias por su apoyo, orientación y comentarios para mejorar este trabajo. 6 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Toshiko Takahashi Iñiguez por la asesoría técnica para la realización de este trabajo. A la M. en C. Gabriela González Cerón por la asesoría técnica para la realización de este trabajo. 7 AGRADECIMIENTOS A mis padres por estar siempre a mi lado para darme motivación y alegría para seguir adelante en los momentos difíciles. A mi hermano por todas las risas compartidas que en muchas ocasiones me ayudaron a olvidar los problemas. A mi tía Chole por todo su amor, su tiempo y su ternura. Siempre te extrañaré. Fuiste y serás mi ejemplo de valentía. A mis viejas amigas Sandra y Abigail por escucharme y entenderme siempre. A mi nueva amiga Tóshiko por su comprensión, atención y cariño. También por todas las emociones y charlas que compartimos, las cuales hicieron más agradable mi estancia en el laboratorio. 8 DEDICADA A: Mis padres, el amor y la confianza incondicionales Mi tía Chole, mi segunda madre Mi hermano, la chispa de diversión 9 CONTENIDO. RESUMEN................................................................................................................................................ 11 ABSTRACT. ............................................................................................................................................. 12 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................................................... 13 ANTECEDENTES. ................................................................................................................................. 15 1. EL GENERO Streptomyces. ........................................................................................................ 15 1.1. Ciclo de vida. .......................................................................................................... 16 2. METABOLISMO. ............................................................................................................................ 17 2.1. Consumo de nutrientes. ......................................................................................... 18 2.2. Respiración celular. ................................................................................................ 21 2.3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos....................................................................... 25 2.4. Rutas anapleróticas. ............................................................................................... 29 3. MALATO DESHIDROGENASA (MDH). ................................................................................... 31 3.1. Isoformas de MDH. ................................................................................................31 3.2. Malato:quinona oxidoreductasa (MQO). ................................................................ 32 3.3. Otras funciones de MDH. ....................................................................................... 33 3.4. Estructura de MDH. ................................................................................................ 34 3.5. Regulación de la actividad enzimática de MDH. ................................................... 36 3.6. Regulación de la expresión del gen mdh............................................................... 36 3.7. La MDH de Streptomyces coelicolor. .................................................................... 37 OBJETIVO GENERAL. ......................................................................................................................... 39 OBJETIVOS PARTICULARES. .......................................................................................................... 39 MATERIALES Y MÉTODOS. .............................................................................................................. 40 1. MICROORGANISMOS. ................................................................................................................ 40 2. MEDIOS DE CULTIVO. ................................................................................................................ 40 3. OBTENCIÓN DE LA CEPA MUTANTE NULA NO POLAR S. coelicolor Δmdh. ........... 42 3.1. Obtención del cósmido StD1-Δmdh. ...................................................................... 42 3.2. Transformación de la cepa E. coli BW25113/pIJ790 con el cósmido StD1- Δmdh..... .................................................................................................................. 42 3.3. Obtención del cassette aac(3)IV-OriT del plásmido pIJ784 para sustituir al gen bla. 42 3.4. Sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh por el cassette aac(3)IV-OriT. . 44 3.5. Conjugación de E. coli ET12567/pUZ8002/StD1-Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT y S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV-OriT. ................................................................................... 44 4. COMPROBACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LA CICATRIZ EN EL GENOMA DE LA MUTANTE NULA S. coelicolor mdh::aac(3)IV-OriT. .................................................................. 44 4.1. Purificación de ADN. .............................................................................................. 44 4.2. Amplificación de ADN por PCR. ............................................................................ 45 10 5. SUSPENSIÓN CONCENTRADA DE ESPORAS DE LAS CEPAS S. coelicolor M145 y Δmdh. ...................................................................................................................................................... 46 6. PRE-GERMINACIÓN DE ESPORAS. ...................................................................................... 46 7. CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO. ................................................................................................ 46 8. CUANTIFICACIÓN DE CRECIMIENTO. .................................................................................. 46 9. EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS. ........................................................................................... 46 10. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE MDH. ................................................................................... 47 11. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE IDH. ..................................................................................... 47 12. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE α-KGDH. ........................................................................... 47 13. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN EL EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS. .......... 48 14. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS. ...................................................................................... 48 RESULTADOS. ....................................................................................................................................... 49 1. OBTENCIÓN DE LA MUTANTE NULA NO POLAR Streptomyces coelicolor Δmdh. . 49 2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. ...................................................................................................................................................... 51 3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IDH Y α-KGDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. ................................................................................................................................... 53 4. CRECIMIENTO DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh EN DIFERENTES FUENTES DE CARBONO. .................................................................................................................................... 56 5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh.......... 58 DISCUSION. ............................................................................................................................................ 65 CONCLUSIONES. .................................................................................................................................. 69 BIBLIOGRAFIA. ...................................................................................................................................... 70 11 RESUMEN. La malato deshidrogenasa es una enzima que cataliza la interconversión entre malato y oxaloacetato, última reacción del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. En organismos aeróbicos este ciclo provee energía e intermediarios que sirven como precursores para la síntesis de compuestos a través de otras vías metabólicas. En Streptomyces coelicolor se ha estudiado que la falta de enzimas que llevan a cabo las reacciones iniciales de este ciclo afecta tanto su diferenciación como la producción de antibióticos. Con el fin de determinar el impacto de la carencia de una enzima clave en este ciclo, el objetivo de este trabajo fue caracterizar fisiológica y bioquímicamente a una mutante carente de malato deshidrogenasa de esta bacteria. Para lograr este objetivo, se obtuvo una mutante sin el gen que codifica para la malato deshidrogenasa de S. coelicolor. Posteriormente la mutante y la silvestre se crecieron en medio mínimo líquido con diferentes fuentes de carbono durante 72 h. Cada 24 h se tomaron muestras de los cultivos para medir el crecimiento y la actividad de malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa (IDH) y α- cetoglutarato deshidrogenasa (α-KGDH). Además ambas cepas se crecieron en medio mínimo sólido con diferentes fuentes de carbono durante 7 días y cada 24 h se observó la formación de esporas y la producción de antibióticos. En cuanto al crecimiento, los resultados obtenidos muestran que la mutante es capaz de crecer en todas las fuentes de carbono probadas. Sin embargo, cuando se empleó glucosa y casaminoácidos como fuente de carbono el crecimiento de la mutante disminuyó a la mitad de lo observado en la silvestre. Con respecto a la actividad de las enzimas, únicamente en casaminoácidos se observaron diferencias, siendo mayor la actividad de IDH y menor la de α-KGDH en la mutante. En relación a las características morfológicas, en presencia de casaminoácidos en el medio la mutante tuvo un retraso y una disminución en la producción de esporas y antibióticos. En conclusión, la enzima malato deshidrogenasa no es indispensable para la sobrevivencia de S. coelicolor. La ausencia de esta enzima desequilibra el flujo del carbono a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y afecta la producción de esporas y antibióticos en esta bacteria. 12 ABSTRACT. The malate dehydrogenase is an enzyme that catalyzes the oxidation of malate to oxaloacetate, reversible and last reaction in tricarboxylic acid cycle. In aerobic organisms this cycle provides energy and the intermediaries serve as precursors for the synthesis of secondary metabolites through other biosyntheticpathways. In Streptomyces coelicolor the lack of enzymes that catalyze initial reactions of this cycle impacts both differentiation and antibiotic production. To determine the impact of the lack a key enzyme in the tricarboxylic acid cycle, the aim of this study is perform a physiological and biochemical characterization of a mutant lacking malate dehydrogenase of S. coelicolor. To achieve this aim, a S. coelicolor mutant without the gene coding for malate dehydrogenase was obtained by utilizing PCR targeting. Later the mutant and wild type strains were grown in liquid minimal medium with different carbon sources for 72 h. Every 24 h, samples of culture were taken to measure growth and enzymatic activity of malate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase (IDH) and α- ketoglutarate dehydrogenase (α-KGDH). Furthermore, both strains were grown in solid minimal medium with different carbon sources and every 24 h the formation of spores and antibiotic production were observed. The mutant strain was able to grow in all tested carbon sources. However. when glucose or casaminoacids were used as carbon source the mutant strain grew less than the wild type strain. In regard to enzymatic activity, differences were observed only on casaminoacids, wherein in mutant strain the activity of IDH was higher and the activity of α-KGDH was lower than wild type strain. Respecting morphological characteristics, when casaminoacids were used as carbon source the mutant strain growth was delayed and decreased formation of spores and antibiotic production. In conclusion, the enzyme malate dehydrogenase is not essential for survival of S. coelicolor. The lack of this enzyme unbalances the carbon flux through tricarboxylic acid cycle and reduced the formation of spores and antibiotic production in S. coelicolor. 13 INTRODUCCIÓN. El género Streptomyces produce metabolitos secundarios que tienen diversas actividades biológicas. Los metabolitos más caracterizados son los antibióticos. Un 60% de estos compuestos son producidos por distintas especies de este género (Demain, 2006). La especie modelo es Streptomyces coelicolor, la cual produce dos antibióticos pigmentados: actinorodina y undecilprodigiosina (Bentley et al., 2002). Los antibióticos son sintetizados en vías biosintéticas específicas que necesitan compuestos y cofactores provenientes del metabolismo primario (Borodina et al., 2008). La vía central del metabolismo primario es el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el cual es la principal fuente de energía y además sus intermediarios pueden ser usados como precursores para la biosíntesis de otros compuestos (Nelson & Cox, 2013). En S. coelicolor se demostró que la expresión de las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos está asociada a la etapa de crecimiento (Novotna et al., 2003). Por otro lado, se observó que la falta de enzimas de este ciclo afectan la producción de antibióticos y la diferenciación morfológica (Viollier et al., 2001a; Viollier et al., 2001b). Además se sugirió que los estreptomicetos dependen de este ciclo no solo para la producción de ATP sino como una fuente principal de precursores para el metabolismo (Wu et al., 2005). La malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) es la última enzima de este ciclo que cataliza la conversión reversible de malato a oxaloacetato usando NAD o NADH como cofactor. La expresión del gen mdh es mayor durante la proliferación y disminuye en la fase estacionaria, es decir, está relacionada al crecimiento, cuando S. coelicolor crece en medio con glucosa (Mendoza, 2008). A pesar de la importancia de los estreptomicetos, hasta la fecha se conoce muy poco acerca de su metabolismo primario (Van Keulen et al., 2011), especialmente del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Debido a que este ciclo es una vía central en 14 el metabolismo y está relacionado con varios procesos fisiológicos es importante conocer la regulación y las propiedades de las enzimas que participan en él. Por esta razón estamos interesados en estudiar el papel de la enzima malato deshidrogenasa en el ciclo y en el crecimiento de S. coelicolor, a través de la eliminación del gen. Además, en este trabajo se estudiaron los perfiles de crecimiento de S. coelicolor y los perfiles de actividad de malato deshidrogenasa y otras enzimas que participan en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos como isocitrato deshidrogenasa (IDH) y α-cetoglutarato deshidrogenasa (α-KGDH). Además se observaron las características morfológicas de la mutante de S. coelicolor en medio sólido. 15 ANTECEDENTES. 1. EL GENERO Streptomyces. Los estreptomicetos son bacterias importantes en la industria porque producen una gran cantidad de enzimas hidrolíticas y metabolitos secundarios (Hodgson, 2000) con diversas actividades biológicas tales como, antibacterianos, antifúngicos antitumorales, insecticidas, herbicidas, antihelmínticos e inmunosupresores (Challis, 2014). Debido a esta importancia, hasta la fecha se conocen las secuencias genómicas completas de varias especies de Streptomyces, entre las cuales están Streptomyces coelicolor (Bentley et al., 2002), Streptomyces avermitillis (Ikeda et al., 2003), Streptomyces griseus IFO 13350 (Ohnishi et al., 2008), Streptomyces bingchenggensis (Wang et al., 2010), Streptomyces cattleya NRRL 8057 (Barbe et al., 2011), Streptomyces lividans 66 (Cruz-Morales et al., 2013), Streptomyces fulvissimus (Myronovskyi et al., 2013), Streptomyces collinus Tü 365 (Rückert et al., 2013) y Streptomyces albulus NK660 (Gu et al., 2014). Los cromosomas de estas bacterias son lineales, tienen un porcentaje de G-C mayor al 70% y miden entre 6 y 11 Mb. Además el cromosoma presenta una estructura, en la cual, los genes esenciales están en el centro del cromosoma y los genes adaptativos en los brazos (Hopwood, 2003). Ensayos de microarreglos mostraron que en condiciones de crecimiento no limitantes de S. coelicolor, los genes codificados en la región central se expresan más que los codificados en los brazos, mientras que en fase estacionaria la expresión de genes se distribuye a lo largo del cromosoma (Karoonuthaisiri et al., 2005) Los estreptomicetos habitan en el suelo, donde hay muchos otros microorganismos compitiendo por los nutrientes, lo que hace un ambiente pobre u oligotrófico. Por esta razón, los estreptomicetos son oligotrofos facultativos, ya que pueden vivir en ambientes pobres o ricos en nutrientes. Además el suelo tiene 16 fuentes de carbono muy variadas, por lo cual estos organismos desarrollaron muchas rutas degradadoras de carbohidratos (Hodgson, 2000). 1.1. Ciclo de vida. Los estreptomicetos no son móviles y debido al ambiente en el que viven es necesario tener estrategias para consumir la mayor cantidad de nutrientes y cuando éstos se acaben poder colonizar nuevos espacios. Por esta razón, estos organismos tienen un ciclo de vida complejo, en el que se pueden distinguir tres etapas de diferenciación, micelio vegetativo, micelio aéreo y esporas (Fig. 1). La señal para la diferenciación es la limitación de nutrientes (van Wezel et al., 2007). Fig 1. Ciclo de vida de Streptomyces coelicolor (Angert, 2005). 17 La especie Streptomyces coelicolor A3(2) se ha usado como modelo para este grupo bacteriano. Esta especie produce varios metabolitos secundarios, entre ellos, los antibióticos undecilprodigiosina, actinorodina, antibiótico dependiente de calcio (CDA, por sus siglas en ingles) y metilenomicina. Los genes de la biosíntesis de la metilenomicina están en el plásmido SCP1 (Bentley et al., 2002). En Streptomyces, las vías y la regulación del metabolismo secundario han sido extensamente estudiadas. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de su metabolismo primario a pesar de que éste es el productor de los precursoresnecesarios para la síntesis de metabolitos secundarios (Borodina et al., 2008; van Keulen et al., 2011). 2. METABOLISMO. El metabolismo es la transformación de compuestos orgánicos dentro de una célula mediante un conjunto de reacciones catalizadas por enzimas, que forman las vías metabólicas. El metabolismo se divide en anabolismo y catabolismo (Nelson & Cox, 2013). El anabolismo es la fase de síntesis de compuestos grandes y complejos a partir de precursores pequeños y sencillos, esta fase necesita un gran aporte de energía. En contraste, el catabolismo es la fase donde los compuestos grandes y complejos son degradados a moléculas pequeñas y sencillas, en esta fase se libera energía que se conserva en forma de ATP (Berg et al., 2012). Las vías anabólicas y catabólicas están coordinadas de manera recíproca, es decir, cuando una vía anabólica está activa, la vía catabólica está reprimida y viceversa (Nelson & Cox, 2013). Para realizar esta coordinación es necesario regular a las enzimas que catalizan reacciones no compartidas entre vías. La regulación se da por disponibilidad de sustrato y reacciones alostéricas de las enzimas que catalizan reacciones irreversibles en cada vía (Nelson & Cox, 2013). 18 En S. coelicolor se realizaron análisis proteómicos y metabolómicos durante el crecimiento diaúxico en glutamato/maltosa y se observó que los genes que codifican enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos se expresan más en la primer fase de crecimiento exponencial y se reprimen en respuesta a la falta de nutrientes en las fases de transición y estacionaria. Además los genes involucrados en el procesamiento de proteínas se expresan más en las fases de transición y estacionaria debido a la falta de nitrógeno (Novotna et al., 2003). 2.1. Consumo de nutrientes. En el suelo hay una gran variedad de biopolímeros (quitina, xilano y celulosa) que pueden ser utilizados como fuente de carbono. Los estreptomicetos habitan en el suelo por lo que en su genoma tienen la información necesaria para usar un amplio espectro de sustratos incluidos los biopolímeros (Bentley et al., 2002), que son degradados por enzimas extracelulares y llevados al interior de la bacteria por medio de transportadores específicos que reconocen mono o disacáridos (Hodgson, 2000). Debido a que los estreptomicetos pueden degradar estos compuestos son importantes en el reciclaje del carbono (Bertram et al., 2004). En S. coelicolor se describieron 45 permeasas ABC (casete de unión a ATP) para transportar celobiosa, celotriosa, α-glucósidos, lactosa, maltosa, maltodextrinas, ribosa, alcoholes de azúcar, xilosa y β-xilósidos. Mientras que la galactosa es transportada por una permeasa dependiente de sodio y el glicerol entra por difusión facilitada (Bertram et al., 2004). El glutamato y la N-acetil glucosamina se transportan por sistemas de fosfo-transferasas que favorecen su uso (Nothaft et al., 2003). La glucosa entra mediante una permeasa MFS (superfamilia principal de facilitadoras) llamada GlcP, la cual esta codificada en dos genes glcP1 y glcP2 (Fig. 2) (van Wezel et al., 2007). 19 Fig. 2. Esquema general de los sistemas de transporte de carbohidratos de Streptomyces coelicolor. Los azúcares representativos para cada transporte son fructosa (Fru) para PTS, maltosa (Mal) para ABC, glucosa (Glc) para simporte y glicerol (Gly) para difusión facilitada (Bertram et al., 2004). El uso de una determinada fuente de carbono puede influir en el crecimiento, la morfogénesis y la producción de antibióticos. Por esta razón, las bacterias han desarrollado mecanismos para regular el uso de las diversas fuentes de carbono coordinadamente, de manera tal que las fuentes preferenciales se ocupen primero (Parche et al., 2000). La capacidad de detectar y seleccionar las fuentes de carbono preferenciales ofrece una ventaja selectiva porque aumenta la probabilidad de supervivencia (Gubbens et al., 2012). El consumo preferencial de carbohidratos es regulado por un proceso conocido como represión catabólica por carbono (RCC) (Titgemeyer & Hillen, 2002; van Wezel et al., 2007). En bacterias modelo como Escherichia coli o Bacillus subtilis los sistemas fosfotransferasa (SFT) tienen un papel principal en la RCC (Brückner & Titgemeyer, 2002). 20 En estreptomicetos se ha encontrado que la producción de enzimas hidrolíticas está reprimida por glucosa (Butler et al., 1999). No obstante, esta represión no está relacionada con un SFT, sino que se realiza por medio de la enzima glucosa cinasa (Glk) (Guzmán et al., 2005; van Wezel et al., 2007). Mutantes que no tienen el gen glkA, que codifica para la glucosa cinasa, son incapaces de crecer en glucosa y no presentan control catabólico (Kwakman & Postma, 1994), además la restauración de la actividad de la enzima por la introducción de un gen glk de Zymomonas mobilis no restablece el control catabólico (Angell et al 1994; van Wezel et al., 2007). La glucosa cinasa (Glk) es producida constitutivamente en cultivos de S. coelicolor crecidos en glucosa y manitol. Sin embargo, la actividad de esta enzima en glucosa es más alta que la observada en manitol. Además la Glk forma un complejo con el transportador de glucosa GlcP para que el consumo de este carbohidrato sea eficiente (van Wezel et al., 2007). La formación de este complejo puede tener influencia sobre la represión catabólica por carbono (Chávez et al., 2009). En un estudio proteómico en S. coelicolor se demostró que la glucolisis y la vía de las pentosas fosfato son inducidas por glucosa aunque no esté presente la enzima GlkA. En contraste, la gluconeogénesis, sistemas de transporte de manitol y glicerol, algunas enzimas anapleróticas y producción de antibióticos se encuentran reprimidas por glucosa a través de GlkA. Esto nos indica que la GlkA no es la única vía por la cual se ejerce el control catabólico por glucosa (Gubbens et al., 2012). El SFT y la RCC pueden controlar otros procesos celulares. En S. coelicolor la limitación de nutrientes es la señal que promueve la diferenciación morfológica y metabólica, esto sugiere que hay un vínculo directo entre el uso del carbono, la producción de metabolitos secundarios y el desarrollo (van Keulen et al., 2011). Las mutantes nulas de los genes del SFT (ptsH, ptsI y ccr) no desarrollan micelio aéreo ni esporas (Rigali et al., 2006). 21 El SFT de la N-acetil glucosamina tiene comunicación cruzada con el regulador pleiotrópico DasR (Nothaft et al., 2010; Rigali et al., 2008). Concentraciones altas de este compuesto inhiben la diferenciación morfológica y la producción de antibióticos de S. coelicolor en condiciones ricas de nutrientes y las activan en medios pobres (van Wezel et al., 2009). 2.2. Respiración celular. En organismos aerobios, la respiración celular es el proceso por el cual la célula consume O2 y glucosa para producir CO2 y H2O. Este proceso se divide en tres etapas: glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos; y cadena respiratoria y fosforilación oxidativa (Nelson & Cox, 2013). La glucólisis se divide en dos fases, en la primera fase una molécula de glucosa es oxidada hasta formar dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato usando dos moléculas de ATP. Posteriormente el gliceraldehído-3-fosfato es convertido a piruvato generando cuatro moléculas de ATP y dos de NADH (Berg et al., 2012). En Streptomyces aureofaciens se estudió la regulación transcripcional del gen gap que codifica para la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH). Estos estudios mostraron que en ausencia de glucosa la transcripción se induce al inicio de la formación del micelio aéreo, mientras que en presencia de glucosa la transcripción ocurre durante la formación del micelio aéreo (Kormanec et al., 1997). En S. coelicolor se han encontrado tres genes (pfkA1,pfkA2 y pfkA3) que codifican para la enzima fosfofructocinasa (van Keulen et al., 2011). Análisis de expresión mostraron que la pfkA2 es la de mayor actividad, mientras que las otras dos tienen una actividad menor y juegan un papel específico en el metabolismo de esta bacteria (Siebring, 2010). En mutantes nulas en el gen pfkA2 se observó una mayor producción de antibióticos y mayor flujo a través de la vía de las pentosas fosfato (Borodina et al., 2008). 22 La vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) es la vía principal para la oxidación de la glucosa, sin embargo, la vía de Entner-Doudoroff (ED) y la vía de las pentosas fosfato (PPP, por sus siglas en inglés) también oxidan la glucosa (Fig. 3). En la vía ED, la glucosa-6-fosfato es convertida a gliceraldehído-3-fosfato y piruvato por medio de 3 reacciones, mientras que en la PPP, la glucosa 6-fosfato es convertida a gliceraldehído-3-fosfato y fructosa-6-fosfato por medio de ocho reacciones generando NADPH. El uso de estas vías es determinado por la necesidad de la célula por pentosas, NADPH y ATP (Berg et al., 2012; Nelson & Cox, 2013). Estas vías están conservadas en la mayoría de los seres vivos, sin embargo, el flujo de carbono que pasa a través de éstas es diferente en cada organismo y depende de las condiciones de crecimiento. Los flujos metabólicos de las bacterias Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas, Sinorhizobium meliloti, Rhodobacter sphaeroides, Zymomonas mobilis y Paracoccus versutus fueron analizados y posteriormente comparados con los flujos de las bacterias modelo E. coli y B. subtilis. Mediante este análisis comparativo se encontró que el metabolismo de las bacterias modelo no es cuantitativamente representativo porque se encontraron diferencias en el flujo a través de la vía de Entner- Doudoroff y la de las pentosas fosfato (Fuhrer et al., 2005). Los actinomicetos metabolizan la glucosa principalmente por la EMP y la vía de las pentosas fosfato (Gunnarsson et al., 2004). Análisis de flujo metabólico en Streptomyces lividans, mostraron que la distribución de los flujos entre estas vías es afectada por la tasa de crecimiento y la fuente de carbono. El flujo a través de la PPP incrementa cuando la tasa de crecimiento incrementa (Avignone Rossa et al., 2002). La misma tendencia fue observada en S. coelicolor (Obanye et al., 1996). En S. coelicolor se encontró que el principal papel de la PPP es la generación de precursores de biomasa (Borodina et al., 2008; Obanye et al., 1996). Sin embargo, en S. antibioticus, la PPP es la vía principal durante el crecimiento exponencial (Butler et al., 2002). 23 La primera enzima de la PPP es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que es codificada por el gen zwf. Dos genes que codifican para esta enzima (zwf1 y zwf2) se encontraron en S. coelicolor, mostrando que la proteína Zwf2 es la de mayor actividad (Ryu et al., 2006), sin embargo, las mutaciones sencillas de cualquiera de los dos genes incrementan la actividad de la enzima debido a la pérdida de la regulación cruzada entre los dos genes (Bushell et al., 2006). En S. lividans, la falta de los genes zwf1 o zwf2 incrementa cuatro veces la transcripción de los genes involucrados en la producción de antibióticos (Butler et al., 2002). La vía de ED es activa en varios actinomicetos como Nonomuraea, Streptomyces tenebrarius y Mycobacterium smegmatis. Esta vía no está activa en S. coelicolor debido a la falta del gen pgd que codifica para una enzima única de esta vía, la 6- fosfogluconato deshidratasa (Borodina et al., 2005; Gunnarsson et al., 2004). El producto final de las vías anteriores es el piruvato, compuesto que puede seguir tres rutas diferentes: fermentación, ciclo de los ácidos tricarboxílicos o gluconeogénesis. Cuando la célula necesita energía, el piruvato es descarboxilado para generar acetil-CoA (Nelson & Cox, 2013). En el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el acetil-CoA es condensado con oxaloacetato para formar citrato que a su vez es convertido a oxaloacetato mediante una serie de siete reacciones. En este ciclo se producen dos moléculas de CO2, tres de NADH, una de FADH2 y una de nucleósido trifosfato (ATP o GTP) (Berg et al., 2012). En la cadena respiratoria, el NADH y el FADH2 son oxidados generando protones y electrones que son transferidos al O2 por medio de varias moléculas acarreadoras. Durante la transferencia de electrones se libera energía que es conservada en forma de ATP gracias a la fosforilación oxidativa (Berg et al., 2012). 24 Fig. 3. Rutas principales del catabolismo de la glucosa. Embden-Meyerhof-Parnas (flechas negras), Entner-Duodoroff (flechas azules) y la vía de las pentosas fosfato (flechas rosas). GAP: gliceraldehido-3-fosfato, DHAP: dihidroxiacetona fosfato, Glk: glucosa cinasa, Pgi: fosfoglucosa isomerasa, Pfk: fosfofructo cinasa, Fba: fructosa-1,6- bifosfato aldolasa, Tpi: triosa-fosfato isomerasa, Gap: gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Pgk: fosfoglicerato cinasa, Pgm: fosfoglicerato mutasa, Eno: enolasa, Pyk: piruvato cinasa, KDPG: 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato, Zwf: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Pgd: 6-fosfogluconato deshidratasa, KDPGal: 2-ceto-3-deoxi-6- fosfogluconato aldolasa, S7P: sedoheptulosa-7-fosfato, E4P: eritrosa-4-fosfato, Pgl: 6- fosfoglucono-lactona, Ghd: 6-fosfogluconato deshidrogenasa, Rpe: ribosa-5-fosfato epimerasa, Rpi: ribosa-5-fosfato isomerasa, Tai: transaldolasa, Tkt: transcetolasa. 25 2.3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos es la ruta central del metabolismo porque en este ciclo convergen tanto vías catabólicas de carbohidratos, aminoácidos y ácidos grasos como vías anabólicas de aminoácidos y nucleótidos. Además este ciclo es el principal productor de energía y poder reductor en los organismos aerobios (Nelson & Cox, 2013). Al inicio del ciclo, un grupo acetil es condensado con oxaloacetato para formar citrato, compuesto de seis carbonos (C6). El citrato es transformado a isocitrato (C6), que posteriormente es descarboxilado generando una molécula de CO2 y formando α-cetoglutarato, compuesto de cinco carbonos (C5). El α-cetoglutarato es descarboxilado generando otra molécula de CO2 y formando succinil-CoA, compuesto de cuatro carbonos (C4). A continuación el succinil-CoA es transformado a succinato, compuesto que es deshidrogenado para formar fumarato. El fumarato es hidratado y forma malato. Finalmente el malato es deshidrogenado y forma oxaloacetato, compuesto con el que vuelve a iniciar el ciclo (Fig. 4). Cinco de los pasos de este proceso generan energía que es conservada en NADH, FADH2 y ATP o GTP (Nelson & Cox, 2013). El ciclo de los ácidos tricarboxílicos no se realiza igual en todos los organismos, principalmente se han reportado variaciones en las dos reacciones que transforman α-cetoglutarato a succinato. En Helycobacter pylori se reportaron que las enzimas α-cetoglutarato:ferrodoxina oxidoreductasa y una succinil- CoA:acetoacetil-CoA transferasa son las que catalizan estas reacciones (Corthésy-Theulaz et al., 1997; Hughes et al., 1998). Mientras que en Mycobacterium tuberculosis se reportaron la α-cetoglutarato descarboxilasa que genera semialdehído succínico y una deshidrogenasa que produce succinato (Tian et al., 2005). Además en H. pylori y en Corynebacterium glutamicum se encontró la enzima malato:quinona oxidoreductasa, la cual cataliza la oxidación de malato a oxaloacetato (Kather et al., 2000; Molenaar et al., 2000) 26 El flujo de carbono en este ciclo se regula principalmente a dos niveles: la producción de acetil-CoA a partir de piruvato (piruvato deshidrogenasa) y la entrada del acetil-CoA al ciclo (citrato sintasa). Debido a que el acetil-CoA puede ser producido en otras vías, la regulación del flujo se da en las reacciones catalizadaspor IDH y α-KGDH. Estas enzimas pueden ser reguladas por tres factores: disponibilidad de sustrato, acumulación de productos y reacciones alostéricas (Nelson & Cox, 2013). La expresión de los genes que codifican para las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos no es constitutiva ni coordinada. En E. coli estas enzimas se reprimen total o parcialmente en condiciones anaeróbicas, además las enzimas citrato sintasa, succinato deshidrogenasa y α-KGDH están sujetas a represión catabólica por glucosa (Nimmo, 1987). También se reportó que la IDH controla el flujo entre el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y ciclo del glioxalato mediante fosforilación (LaPorte & Koshland, 1982). En C. glutamicum se han reportado varios reguladores transcripcionales y post- transcripcionales de los genes que codifican para enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Uno de los reguladores es la fuente de carbono porque la transcripción de los genes gltA (citrato sintasa), acn (aconitasa), sdhCAB (succinato deshidrogenasa) y fum (fumarasa) es más alta cuando la bacteria crece en acetato en lugar de glucosa. Otros reguladores son las proteínas DtxR y RipA, las cuales reprimen la transcripción de aconitasa y succinato deshidrogenasa cuando hay limitación de hierro. Además se encontró que la proteína OdhI no fosforilada reprime al complejo α-KGDH (Bott, 2007). 27 Fig. 4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los átomos de carbono sombreados provienen del acetil CoA (Nelson & Cox, 2013). Mediante análisis in silico se calculó la frecuencia de uso de codones de las secuencias genómicas de S. coelicolor y S. avermitillis y se determinó que los genes que codifican enzimas involucradas en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y en la glucólisis tienen uso preferencial de codones y por ello están altamente expresados (PHX) en estos organismos (Wu et al., 2005). En contraste, en B. subtilis, Haemophilus influenzae, Synechocystis, Vibrio cholerae y E. coli estos genes no son PHX (Karlin et al., 2001). Esto nos podría indicar que el ciclo de los ácidos tricarboxílicos juega un papel muy importante en el ciclo de vida de Streptomyces. 28 En S. coelicolor se obtuvieron mutantes que no tienen los genes citA y acoA que codifican para la citrato sintasa y la aconitasa, respectivamente. En estas mutantes se observó deficiencia en la diferenciación morfológica y síntesis de antibióticos. En la ausencia del gen citA, las deficiencias se debieron a una acidificación del medio causada por acumulación de ácidos orgánicos (Viollier et al., 2001a). Sin embargo, la ausencia del gen acoA es la principal responsable de estas deficiencias (Viollier et al., 2001b). Esto nos indica que este ciclo está relacionado con la diferenciación morfológica y el metabolismo secundario de esta bacteria. En organismos aerobios, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos es una vía anfibólica porque participa en procesos catabólicos y anabólicos. En este ciclo se generan intermediarios que son precursores de la síntesis de varios compuestos. El oxaloacetato y el α-cetoglutarato son precursores de los aminoácidos aspartato y glutamato. Posteriormente estos aminoácidos son usados para sintetizar otros aminoácidos y nucleótidos. El oxaloacetato también es convertido a glucosa. El succinil-CoA y el citrato son precursores de porfirinas y ácidos grasos o esteroles, respectivamente (Nelson & Cox, 2013). Además, en S. coelicolor el acetil-CoA es uno de los precursores para la síntesis de actinorodina y undecilprodigiosina (Fig. 5) (Ryu et al., 2006). Fig. 5. Precursores de la síntesis de antibióticos en S. coelicolor. ACCasa, acetil-CoA carboxilasa. Modificado de Ryu et al., 2006 29 2.4. Rutas anapleróticas. El oxaloacetato, α-cetoglutarato, succinil-CoA y citrato abandonan el ciclo para servir de precursores en vías biosintéticas, sin embargo, son repuestos por reacciones anapleróticas. En condiciones normales, la salida y reposición de estos compuestos en el ciclo están en balance, por lo que sus concentraciones permanecen constantes (Nelson & Cox, 2013). Cuando las concentraciones de oxaloacetato o cualquier otro intermediario son bajas, el piruvato o el fosfoenolpiruvato (PEP) es carboxilado para generar más oxaloacetato o malato. Las reacciones de carboxilación son reversibles y catalizadas por las enzimas piruvato carboxilasa, PEP carboxicinasa, PEP carboxilasa y enzima málica (Fig. 6) (Nelson & Cox, 2013). Fig 6. Rutas anapleróticas de oxaloacetato. MDH, malato deshidrogenasa; MQO, malato:quinona oxidoreductasa; EM, enzima málica; PEPC, fosfoenolpiruvato carboxilasa; PEPS, fosfoenolpiruvato sintasa y PC, piruvato carboxilasa. 30 En Pseudomonas putida, la producción de oxaloacetato se da principalmente por la vía del piruvato. En esta vía actúan la enzima málica para formar piruvato y posteriormente la enzima piruvato carboxilasa genera oxaloacetato (del Castillo et al., 2007). En E. coli, el oxaloacetato puede reponerse por la vía del PEP. En esta vía intervienen la enzima málica para formar piruvato, posteriormente el piruvato es convertido a PEP y finalmente la enzima PEP carboxilasa genera oxaloacetato (van der Rest et al., 2000). En varios estreptomicetos, incluyendo S. coelicolor, se ha reportado que la PEP carboxilasa es la enzima involucrada en la formación anaplerótica de oxaloacetato (Hodgson, 2000). También se han encontrado enzimas málicas activas en S. aureofaciens (Hodgson, 2000) y S. coelicolor (Rodriguez et al., 2012). En S. coelicolor las enzimas anapleróticas no solo están activas durante la gluconeogénesis. Cuando la bacteria crece en presencia de glucosa como única fuente de carbono se puede detectar actividad de PEP carboxilasa. De hecho, la actividad de esta enzima se incrementa durante la producción de actinorodina (Bramwell et al., 1993). El ciclo del glioxalato es una vía anaplerótica que usa acetato como fuente de fosfoenolpiruvato para la síntesis de carbohidratos. En esta vía, el acetil-CoA es condensado con oxaloacetato para formar citrato, el cual es convertido a isocitrato. Posteriormente el isocitrato es convertido a succinato y glioxalato por la enzima isocitrato liasa. El glioxalato es condensado con acetil-CoA para formar malato por medio de la enzima malato sintasa. Finalmente, el malato es oxidado a oxaloacetato y el ciclo vuelve a empezar. El oxaloacetato producido también se usa para sintetizar glucosa (Nelson & Cox, 2013). En varias especies de estreptomicetos, incluyendo S. coelicolor, se demostró la presencia de malato sintasa al crecerlos en compuestos de dos carbonos como acetato, sin embargo, no se encontró actividad de isocitrato liasa en esta bacteria (Hodgson, 2000). 31 3. MALATO DESHIDROGENASA (MDH). La MDH (EC 1.1.1.37) es la última enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Esta enzima cataliza la interconversión entre malato y oxaloacetato usando NAD (P)+ como cofactor (Fig. 7). El equilibrio de esta reacción está desplazado hacia la formación de malato en condiciones termodinámicas estándar. Sin embargo, la concentración de oxaloacetato dentro de la célula es muy baja, lo que favorece que la reacción se realice hacia la formación de oxaloacetato (Nelson & Cox, 2013). Fig. 7. Reacción catalizada por la enzima MDH (Nelson & Cox, 2013). Esta vía no es la principal en la generación de oxaloacetato. En P. putida y Pseudomonas fluorescens se ha observado que el flujo a través de MDH es muy bajo y en su lugar se usa la vía del piruvato (Fuhrer et al., 2005). De hecho, en P. putida el 80% del oxaloacetato es generado a partir de piruvato (Del Castillo et al., 2007). 3.1. Isoformas de MDH. En eucariontes se han reportado varias isoformas de MDH, las cuales se distribuyen en diferentes organelos celularesy participan en diferentes rutas metabólicas (Gietl, 1992a). En células animales hay dos isoformas: una mitocondrial y una citosólica, sin embargo, en plantas hay isoformas de esta 32 enzima en glioxisomas, peroxisomas, cloroplastos, mitocondrias y citosol (Gietl, 1992b). En Sacharomyces cerevisiae hay tres isoformas de esta enzima: la mitocondrial (MDH1) que participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la citosólica (MDH2) que participa en la gluconeogénesis y la peroxisomal (MDH3) que participa en el ciclo del glioxalato (Gibson & McAlister-Henn, 2003). En bacterias también se han reportado isoformas de esta enzima pero su diferencia es la especificidad por el cofactor o su número de subunidades. En Methanobacterium thermoautotrophicum hay dos isoformas de MDH, una es específica de NAD+ y cataliza la interconversión de malato y oxaloacetato, la otra puede usar tanto NAD+ como NADP+ pero solo cataliza la reducción del oxaloacetato (Thompson et al., 1998). En R. sphaeroides 2R también hay dos isoformas, una dimérica (74 kDa) que participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y una tetramérica (148 kDa) que participa en el ciclo del citramalato, vía alterna al ciclo del glioxalato (Eprintsev et al., 2009). 3.2. Malato:quinona oxidoreductasa (MQO). La MQO (EC 1.1.99.16) es una enzima asociada a membrana que cataliza la oxidación de malato a oxaloacetato usando NAD+ como grupo prostético y quinonas como aceptores de electrones (Molenaar et al., 2000). Esta enzima se ha encontrado en diversas bacterias como Pseudomonas, Azotobacter, Mycobacterium, Micrococcus, Bacillus y C. glutamicum (Molenaar et al., 1998). Posteriormente también se reportó en E. coli, P. aeruginosa y H. pylori (Kather et al., 2000; Kretzschmar et al., 2002; van der Rest et al., 2000). Esta enzima cataliza la misma reacción que la MDH, sin embargo, los aceptores de electrones son diferentes. Debido a la diferencia de los aceptores, la energía libre de Gibbs (ΔG°´) de la reacción catalizada por ambas enzimas es muy diferente. La oxidación de malato catalizada por MDH tiene una ΔG°´=+28.6 Kj/mol, en contraste, esta misma reacción catalizada por MQO tiene una ΔG°´= - 55 o -18.9 Kj/mol dependiendo si el aceptor es ubiquinona o menaquinona. Esto 33 indica que si las dos enzimas están presentes al mismo tiempo catalizan las reacciones opuestas (Molenaar et al., 2000). En C. glutamicum y E. coli tanto la MDH citosólica como la MQO membranal están presentes. En C. glutamicum la eliminación del gen mqo resulta en mutantes que no crecen en glucosa, sin embargo, estas mutantes pueden crecer si se agrega nicotinamida en el medio debido a que los niveles de NAD+ aumentan favoreciendo la actividad de MDH (Molenaar et al., 2000). En contraste, en E. coli la eliminación del gen mdh resulta en mutantes que no crecen en glucosa, sin embargo, la MQO puede restablecer parcialmente sus funciones (van der Rest et al., 2000). En H. pylori no se ha encontrado un gen que codifique para la MDH, por lo que su ciclo de los ácidos tricarboxílicos se lleva a cabo mediante MQO (Kather et al., 2000). En P. aeruginosa la MQO es importante para el crecimiento en etanol y acetato como fuente de carbono (Kretzschmar et al., 2002). 3.3. Otras funciones de MDH. Debido a que la reacción hacia la formación de oxaloacetato es desfavorable, se ha sugerido que la MDH tiene otras funciones dentro de la célula (Molenaar et al., 1998). Se ha demostrado que esta enzima es importante en la protección del estrés oxidante (Oh et al., 2002; Singh et al., 2008). En una mutante de E. coli que no tiene el gen que codifica para la MDH se observó una mayor sensibilidad al H2O2 y a la radiación γ, esta sensibilidad disminuyó cuando se le agregaba oxaloacetato al medio (Oh et al., 2002). Además en P. fluorescens la MDH, la enzima málica y la piruvato carboxilasa participan en una vía que protege de ambientes oxidantes. Esta vía consiste en consumir NADH, compuesto pro-oxidante, por medio de la enzima MDH y producir NADPH, compuesto antioxidante, por medio de la acción de la enzima málica (Singh et al., 2008). 34 La MDH interacciona con otras proteínas para facilitar al paso de los sustratos en diferentes vías. En B. subtilis se observó que la MDH interactúa con otras dos enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, IDH y citrato sintasa formando un metabolón, particularmente se forma un complejo MDH-IDH que aumenta la actividad de IDH (Meyer et al., 2011; Bartholomae et al., 2013). En E. coli se reportó que la MDH interactúa con el complejo I de la cadena respiratoria para la transferencia directa del NADH (Amarneh & Vik, 2005). Además en S. cerevisiae se reportó que la MDH citosólica (MDH2) interactúa con la PEP carboxicinasa y la fructosa-1,6-bifosfatasa favoreciendo el flujo a través de la gluconeogénesis (Gibson & McAlister-Henn, 2003). 3.4. Estructura de MDH. Las secuencias de aminoácidos de las MDH de varios organismos eucariontes y procariontes tienen una identidad de 55-60% (Musrati et al., 1998). A pesar de que las secuencias de aminoácidos no estén muy conservadas entre especies, la estructura secundaria (40% α-hélices, 20% hojas-β y 40% asas) y la estructura terciaria de esta proteína es casi idéntica en la mayoría de las especies (Hung et al., 2013; Maloney et al., 2004) La mayoría de las formas procariontes de esta enzima son homólogas con la MDH mitocondrial, sin embargo, la MDH de Thermus flavus es homóloga a la MDH citoplásmica (Kelly et al.,1993) y la de Thermus thermophilus es más similar en secuencia de aminoácidos a la MDH cloroplástica NADP-dependiente (Hung et al., 2013). En procariontes esta enzima se puede encontrar de dos formas: homodimérica y homotetramérica. Cada subunidad está formada por 11 hojas β y de 9 a 12 α- hélices; y se pliega en dos dominios, un N-terminal en donde está el sitio de unión a cofactor y un C-terminal que contiene al sitio activo (Fig. 8) (Hung et al., 2013; Irimia et al., 2004). Se ha sugerido que la dimerización es crítica para la actividad de la enzima. La estabilidad de la unión entre subunidades se da a través de puentes de hidrógeno y contactos hidrofóbicos (Breiter et al., 1994). 35 El dominio de unión a cofactor está formado por una hoja β de seis hebras rodeadas por α-hélices en el N-terminal. El sitio de unión a cofactor tiene un potencial positivo mientras que el resto de la proteína es negativo (Hall & Banaszak, 1993). El dominio de unión a sustrato consta de 5 hojas beta torcidas antiparalelas rodeadas por 8 alfa-hélices (Hung et al., 2013). El sitio activo de la proteína se encuentra en medio del sitio de unión a cofactor y del de unión a sustrato (Kim et al., 1999; Lee et al., 2001). Cuando se forma el complejo ternario solo se da un cambio conformacional en una asa flexible que cierra el sitio activo, bloqueando la salida del sustrato y protegiéndolo del solvente (Hall & Banaszak, 1993; Hall et al., 1992; Dalhus et al., 2002). La posición del sustrato y el sitio activo cambian cuando el cofactor es agregado, el malato rota para acomodarse con el cofactor y la His177 (Hall et al., 1992). La actividad catalítica es controlada por una asa (Lee et al., 2001). Fig. 8. Estructura tridimensional de la enzima MDH de T. thermophilus (Hung et al., 2013). 36 3.5. Regulación de la actividad enzimática de MDH. La actividad de las MDH puede ser regulada por retroalimentación. Las MDH de Archaeoglobus fulgidus, Salinibacter ruber y Sacharopolyspora erythraea se inhiben en presencia de altas concentraciones de oxaloacetato (Langelandsvik et al., 1997; Madern & Zaccai, 2000; Mendoza, 2005), en contraste, la MDH de S. aureofaciens no se inhibe en presencia de este sustrato (Mikulásová et al., 1998). Las MDH de M. thermoautotrophicum, A. fulgidus y E.coli también se inhiben por la presencia de NADH (Langelandsvik et al., 1997; Thompson et al., 1998). Se ha observado que la actividad de esta enzima puede regularse por fuente de carbono o fase de crecimiento. En C. glutamicum las actividades de MDH y MQO responden a la fuente de carbono, resultando en una actividad 3.4 y 3.1 veces mayor en acetato que en glucosa (Molenaar et al., 2000). En S. erythraea crecida en fructosa la actividad llega a su máximo valor a las 72 h de cultivo y después disminuye, mientras que en glucosa la actividad se mantiene constante a lo largo del cultivo. En S. coelicolor crecido en MM con glucosa como fuente de carbono la actividad de la enzima aumenta hasta las 36 h y después disminuye, esto nos indica que esta enzima está relacionada a la fase de crecimiento o a la presencia de glucosa en el medio de cultivo (Mendoza von der Borch, 2008). 3.6. Regulación de la expresión del gen mdh. La expresión del gen mdh está regulada por represión catabólica en varios organismos. En T. thermophilus la expresión de este gen es mayor al crecer en malato que en glucosa como fuente de carbono, aunque en las dos condiciones se observa expresión basal del gen (Park & Kilbane, 2004). En E. coli el gen se expresa 10 veces más en piruvato que en glucosa en condiciones aeróbicas (Park et al., 1995). En S. erythraea la expresión se mantiene constante en glucosa, mientras que en fructosa se induce la expresión (Mendoza von der Borch, 2005). En Talaromyces emersonii este gen se expresa más cuando crece en mono o disacáridos como fuente de carbono, en contraste a lo que pasa en oligo o 37 polisacáridos revelando mayor actividad metabólica en fuentes de carbono más sencillas (Maloney et al., 2004). La expresión del gen mdh también puede ser regulada por otros factores. En E. coli la expresión del gen es regulada negativamente por la proteína ArcA especialmente en anaerobiosis y la disponibilidad de grupos hemo (Park et al., 1995). En S. coelicolor la expresión de este gen está asociada al crecimiento porque la transcripción aumenta en fase de crecimiento exponencial y disminuye cuando la bacteria deja de crecer usando glucosa y fructosa como fuente de carbono ((Mendoza von der Borch, 2008) 3.7. La MDH de Streptomyces coelicolor. Los genes que codifican para las enzimas involucradas en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos no se encuentran juntos en el genoma de esta bacteria (Fig. 9). El gen mdh que codifica para la enzima MDH de S. coelicolor está ubicado en la región central del cromosoma en el SCO 4827, la secuencia tiene 990 pb que corresponden a 329 aminoácidos (StrepDB, 2014). Fig. 9. Ubicación en el cromosoma de los genes que codifican para las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Las líneas anaranjadas representan 1000 SCO´s y las líneas azules representan los genes que codifican para la enzima indicada en cada caso (Mendoza, 2008). 38 El SCO4827 está rodeado por los SCO´s 4823-4830 (Fig. 10). Estos no codifican para proteínas relacionadas con el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y solo a dos se les conoce su función. El SCO4824 codifica a una proteína bifuncional tetrahidrofolato deshidrogenasa/ciclohidrolasa que participa en el metabolismo de moléculas con un solo carbono y el SCO4828 genera la proteína betaína aldehído deshidrogenasa involucrada en el metabolismo de aminoácidos (StrepDB, 2014). Los otros cinco SCO´s codifican para posibles proteínas que aún no ha sido comprobada su función. El SCO4823 que se encuentra a 3709 pb rio arriba del gen mdh es una posible secuencia blanco de regulación por BldA, los SCO4825 y 4826 codifican para proteínas de membrana, el SCO4829 codifica para una oxidoreductasa y el 4830 para una transportador ABC de glicina-betaina de unión a ATP (StrepDB, 2014). Fig. 10. Contexto genómico del gen mdh (SCO 4827). Las flechas rojas indican posiciones de transposones reportados para S. coelicolor. Tomado de StrepDB, 2014. 39 OBJETIVO GENERAL. Caracterización fisiológica y bioquímica de una mutante nula del gen malato deshidrogenasa de Streptomyces coelicolor (Δmdh). OBJETIVOS PARTICULARES. Obtener la mutante cicatrizada Streptomyces coelicolor Δmdh. Medir la actividad de MDH en la mutante S. coelicolor Δmdh. Medir la actividad de IDH y α-KGDH en la mutante S. coelicolor Δmdh. Medir el crecimiento de la mutante S. coelicolor Δmdh en diferentes fuentes de carbono. Observar las características morfológicas de la mutante S. coelicolor Δmdh en medio sólido con diferentes fuentes de carbono. 40 MATERIALES Y MÉTODOS. 1. MICROORGANISMOS. S. coelicolor M145, la cual no tiene los plásmidos SCP1 y SCP2 (Bentley et al., 2002). La mutante nula Δmdh::aac(3)IV que tiene un gen de resistencia a apramicina en lugar del gen mdh cromosomal. Esta sustitución de genes se realizó siguiendo el protocolo ReDirect como se muestra en la figura 11 (Gust et al., 2002). La mutante nula no polar Δmdh, la cual ya no tiene el gen de resistencia a apramicina en el cromosoma y que se obtuvo siguiendo el protocolo ReDirect (Gust et al., 2002), con ligeras modificaciones sugeridas por el Dr. Luis Servín. La cepa E. coli BW25113/pIJ790 se usó para la recombinación mediada por el sistema λ-RED. La cepa E. coli ET12567/pUZ8002 se usó para la conjugación con la mutante nula S. coelicolor Δmdh:: aac(3)IV. 2. MEDIOS DE CULTIVO. Medio LB. Triptona 10 g/L, NaCl 10 g/L y extracto de levadura 5 g/L. Medio 2xYT. Triptona 16 g/L, NaCl 5 g/L y extracto de levadura 10 g/L. Medio mínimo. MOPS 20.93 g/L, NaCl 5 g/L, K2HPO4 0.3 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, FeSO4·7H2O 0.02 g/L, ZnSO4·7H2O 0.05 g/L, MnCl2·4H2O 0.001 g/L, CoCl2·6H2O 0.001 g/L, CaCl2 0.001 g/L, PEG8000 50 g/L. Con casaminoácidos (MMCA). Casaminoácidos 5 g/L. Con glicerol 0.028 M (MMGLI). (NH4)2SO4 2 g/L y glicerol 0.028 M. Con glucosa (MMGLU). (NH4)2SO4 2 g/L y glucosa 0.028 M. Medio MS. Manitol 20 g/L, harina de soya 20g/L y agar 20 g/L. 41 Fig. 11. Esquema de los pasos del protocolo ReDirect. El cassette aac(3)IV-OriT se obtuvo del plásmido pIJ773. Las imágenes enmarcadas son los pasos para obtener el cósmido StD1-Δmdh. Modificado de Gust et al., 2002. 42 3. OBTENCIÓN DE LA CEPA MUTANTE NULA NO POLAR S. coelicolor Δmdh. 3.1. Obtención del cósmido StD1-Δmdh. El gen de resistencia a apramicina fue eliminado del cósmido StD1- Δmdh::aac(3)IV siguiendo la metodología del ReDirect (Gust et al., 2002) para obtener el cósmido StD1Δmdh (ver fig. 11). 3.2. Transformación de la cepa E. coli BW25113/pIJ790 con el cósmido StD1-Δmdh. A 60 µl de E. coli BW25113/pIJ790 electrocompetente se le adicionó 1 µl del cósmido StD1-Δmdh, se mezcló por pipeteo, y se colocó en una celda de electroporación para darle un pulso de 1600 V. Posteriormente se agregó 1 ml de LB y se incubó a 30°C durante 1 h. Al finalizar este tiempo se centrifugó a 5000 rpm por 10 min y se resuspendió en 1 ml de LB sin antibióticos. Se realizaron diluciones seriadas y se sembró en placas de LB con cloramfenicol (25 µg/ml), kanamicina (50 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml). Para verificar la presencia del cósmido en la cepa, se purificó ADN y se realizó una electroforesis (ver fig. 12). 3.3. Obtención del cassette aac(3)IV-OriT del plásmido pIJ784 para sustituir al gen bla. 5 µl del plásmido pIJ784 se digirieron con 3 µl de las enzimas EcoRI y HindIII Fast Digest (Fermentas) para obtener los fragmentos de 3000 y 1400 pb. Para comprobar la digestión se llevó a cabo una electroforesis horizontal en agarosa de bajo punto de fusión al 0.6% durante 12 h a 10 V. El fragmento de 1400 pb correspondiente al cassette se obtuvo del gel, se colocó en un tubo y sefundió a 50°C durante 10 min. A los 450 µl de agarosa fundida se les agregó 45 µl (1/10 vol.) de NaCl 5M y se incubó durante 5 min a 50°C, posteriormente se agregaron 234 µl (2/3 vol) de fenol saturado con NaCl y se incubó a 37°C, el tubo se agitó por 30 s y se centrifugó a 14,000 rpm durante 7 min. A continuación, a la fase acuosa se le agregaron 800 µl (1 volumen) de fenol/cloroformo, se agitó por 15 s y se centrifugó a 14,000 rpm durante 7 min. 43 Fig. 12. Esquema del proceso para obtener la mutante nula no polar S. coelicolor Δmdh. El gen bla es el gen de resistencia a ampicilina, el cassette aac(3)IV-OriT obtenido del plásmido pIJ784 ya tiene los oligonucleótidos que flanquean al gen bla. Modificado de Gust et al., 2002. 44 Se pasó la fase acuosa a otro tubo y se repitió el paso anterior sólo con cloroformo. La fase acuosa se cambió de tubo, se le agregó 1 volumen de isopropanol y se dejó 2 h a -20°C. La mezcla anterior se centrifugó a 14,000 rpm durante 10 min, se eliminó todo el sobrenadante, se dejó secar y se resupendió en 5 µl de agua. El fragmento purificado se mantuvo a -20°C. 3.4. Sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh por el cassette aac(3)IV-OriT. Para llevar a cabo la sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh, primero se realizó la transformación de la cepa de E. coli BW25113/pIJ790/StD1-Δmdh con el cassette acc(3)IV-OriT como se mencionó en el inciso 2. Posterior a la electroporación, se agregó 1 ml de LB y se incubó a 37°C durante 1 h para favorecer la recombinación entre el gen bla y el cassette. Las bacterias se centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de LB. Se realizaron diluciones y se sembraron en placas de LB con kanamicina (50 µg/ml) y apramicina (50 µg/ml). La sustitución del gen bla se verificó por digestión con las enzimas BamHI y SstI. La cepa de E. coli ET12567/pUZ8002 se transformó con el cósmido obtenido StD1- Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT como se mencionó anteriormente (ver fig. 12). 3.5. Conjugación de E. coli ET12567/pUZ8002/StD1- Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT y S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV-OriT. La conjugación entre estas cepas se realizó como lo indica el protocolo ReDirect (Gust et al., 2002). 4. COMPROBACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LA CICATRIZ EN EL GENOMA DE LA MUTANTE NULA S. coelicolor mdh::aac(3)IV-OriT. 4.1. Purificación de ADN. 25 µl de una suspensión de esporas de las colonias ApraS y KanS se inocularon en 25 ml de medio LB e incubaron durante 24 h a 30°C con agitación rotatoria a 200 rpm. Posteriormente 5 ml del cultivo se utilizaron para inocular 25 ml de medio LB con glicina al 0.5% y se incubaron otras 24 h en las mismas condiciones. El cultivo se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente, el pellet se lavó 45 dos veces con 10 ml de Tris 0.1 M (pH 7.0)-sacarosa 10%, se resuspendió en 1 ml del mismo buffer, se agregó 1 mg de lisozima y se incubó 15 min a temperatura ambiente para la formación de protoplastos. Finalmente, la purificación de ADN se realizó con el kit Fungal/bacterial DNA extraction siguiendo las instrucciones del fabricante (Zymo Research). 4.2. Amplificación de ADN por PCR. Para comprobar la presencia de la cicatriz en el cromosoma se llevó a cabo un PCR. La amplificación del DNA se realizó con los primers mdh1 (5´- TGACGGCTGGATCGATCTCT-3´) y mdh2 (5´-AAGGGTCTTATGGGTGCAGG-3´) mismos que se encuentran a 90 y 85 pb de distancia del gen mdh, respectivamente. Después de la amplificación, los productos de PCR se observaron en un gel de agarosa al 0.8%, esperando amplicones de 1175 pb en la cepa silvestre, 1552 pb en la mutante sustituida y 266 pb en la mutante cicatrizada (Fig. 13). Fig 13. Ubicación de los oligonucleótidos mdh1 y mdh2 con respecto al gen mdh. El cassette aac(3)IV-OriT y la secuencia cicatriz (C) sustituyen al gen mdh en el cromosoma, por lo que el tamaño de los fragmentos es diferente. 46 5. SUSPENSIÓN CONCENTRADA DE ESPORAS DE LAS CEPAS S. coelicolor M145 y Δmdh. La suspensión de esporas se realizó siguiendo la metodología reportada anteriormente (Mendoza von der Borch, 2008). La suspensión de esporas en glicerol al 20% obtenida se almacenó a -20°C por tiempo indefinido. 6. PRE-GERMINACIÓN DE ESPORAS. De la solución concentrada de esporas se tomó un ml. Las esporas se lavaron dos veces usando 1 ml de agua estéril y se resuspendieron en 100 µl de agua. Para la pre-germinación, los 100 µl de esporas lavadas se utilizaron para inocular 100 ml de medio 2xYT y se incubaron durante 12 h a 30°C con agitación rotatoria a 200 rpm. Las esporas germinadas se recuperaron por centrifugación a 5000 rpm por 10 min a temperatura ambiente y se resuspendieron en 14 ml de agua estéril. 7. CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO. Para obtener crecimiento disperso de S. coelicolor en medio líquido, los matraces se siliconizaron con Sigmacote (Sigma-Aldrich) y se les pusieron resortes de acero inoxidable. Un ml de las esporas germinadas se usó para inocular 100 ml de medio mínimo con: a) casaminoácidos 5 g/L (MMCA), b) glucosa 0.028 M (MMGLU) y c) glicerol 0.028 M (MMGLI). Los cultivos se incubaron a 30°C en agitación rotatoria a 200 rpm durante 72 h. 8. CUANTIFICACIÓN DE CRECIMIENTO. Cada 24 h se tomaron 5 ml de cultivo para medir la cantidad de proteína total por el método de Lowry usando albumina sérica bovina como estándar de acuerdo a la metodología reportada anteriormente (Flores & Sánchez, 1985). 9. EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS. Cada 24 h se tomaron muestras de 70 ml del cultivo, los cuales se centrifugaron a 10,000 rpm por 10 min a 4 °C. El micelio se lavó dos veces en amortiguador Tris- Cl 0.01 M pH 7.5 y se resuspendió en 1 ml de este buffer por cada gramo de 47 pellet. El micelio se sonicó en frío (equipo Vibra-Cell modelo 9130) durante 1 min en intervalos de 10 s. Posteriormente, la muestra se centrifugó a 14,000 rpm durante 10 min a 4 °C. El extracto libre de células (ELC) obtenido se usó para el ensayo de las actividades enzimáticas. 10. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE MDH. La actividad se midió por la disminución de la absorbancia a 340 nm debido a la oxidación del NADH. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador Tris- Cl pH 7.5, 0.1 mM de NADH, 0.2 mM de ácido oxaloacético y ELC en un volumen final de 1 ml (Mendoza, 2005). La reacción se inició por la adición del ELC. La actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADH oxidado por minuto por ml de extracto. La actividad se midió por duplicado. La actividad específica se reportó como µmoles de NADH oxidado por minuto por mg de proteína. 11. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE IDH. La actividad se midió por el aumento de la absorbancia a 340 nm debido a la reducción del NADP+. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador Tris-Cl pH 7.5, 0.05 mM de NADP+, 1.5 mM de ácido isocítrico, 2 mM de MnSO4 y ELC en un volumen final de 1 ml. La reacción se inició por la adición del ELC por duplicado. La actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADPH producido por minuto por ml de extracto. La actividad específica se reportó como µmoles de NADPH oxidado por minuto por mg de proteína. 12. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE α-KGDH. La actividad se midió por el aumento de la absorbancia a 340 nm debido a la reducción del NAD+. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador Tris- Cl pH 7.5, 0.5 mM de NAD+, 2 mM de ácido α-cetoglutárico, 5 mM de MgCl2, 0.2 mM de tiamina pirofosfato, 0.04 mM de coenzima A y ELC en un volumen final de 1 ml. La reacción se inició por la adición del ELC y se realizó por duplicado. La actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADH producido por minuto por ml 48 de extracto. La actividad específica se reportó como µmoles de NADH oxidado por minuto por mg de proteína. 13. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN EL EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS (ELC). La cantidadde proteína se determinó por el método de Bradford (Bradford, 1976) usando albumina sérica bovina como estándar. La concentración de proteínas se reportó en mg de proteína por ml de extracto. 14. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS. De la suspensión concentrada de esporas se tomó una muestra con el asa bacteriológica y se sembró por estría en cajas de los diferentes medios (MMCA, MMGLI, MMGLU, LB y MS). Para comparar la mutante (Δmdh) con la silvestre (M145) las cajas se dividieron a la mitad y cada una de las cepas se sembró en una mitad. Los cultivos se observaron cada 24 h durante 7 días. Las características que se observaron fueron la formación de micelio basal, micelio aéreo, esporas y producción de antibióticos. 49 RESULTADOS. 1. OBTENCIÓN DE LA MUTANTE NULA NO POLAR Streptomyces coelicolor Δmdh. El estudio del metabolismo primario en general y de las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en particular, es de gran interés ya que es poco lo que se conoce (van Keulen et al., 2011). En este sentido, en el laboratorio de la Dra. Flores se obtuvo, por el método del ReDirect, una mutante nula Δmdh::aac(3)IV que confiere la resistencia a apramicina (Gust et al., 2002) con el objeto de establecer que tan importante es este gen para el crecimiento y el metabolismo del carbono de esta bacteria. Sin embargo, el tener un gen de resistencia a antibióticos en lugar del gen mdh generaba dudas de si el efecto observado se debía a la falta del gen mdh o a la polaridad generada por el gen aac(3)IV . Por esta razón se obtuvó la mutante nula no polar, usando la técnica del ReDirect modificada para poder obtener la mutante carente del gen de MDH. Después de la conjugación entre E. coli ET12567/pUZ8002/StD1-Δmdh y la mutante S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV se obtuvieron cuatro colonias que fueron sensibles a kanamicina y apramicina, lo que indicaba el probable intercambio del gen acc por el de la secuencia cicatriz del cósmido StD1-Δmdh. De una de estas colonias se purificó ADN y se amplificó por PCR una región utilizando iniciadores que flanqueaban al gene de mdh. Para confirmar la presencia de la cicatriz en el genoma de S. coelicolor el ADN de la cepa mutante no polar Δmdh se comparó con el de la cepa silvestre (gen de mdh) y el de la cepa nula polar (cassette aac(3)IV). El gen mdh mide 990 pb, el cassette aac(3)IV-OriT tiene 1365 pb y la secuencia cicatriz tiene 81 pb. Los oligonucleótidos mdh1 y mdh2 están ubicados a 90 pb rio arriba y 85 pb rio abajo del gen mdh. Por lo tanto se esperaban bandas de 1165 pb para el gen mdh, de 1557 pb para el cassette aac(3)IV-OriT y de 256 pb para la secuencia cicatriz (ver fig. 13). 50 Como era de esperarse, en la cepa Δmdh se observa una banda de aproximadamente 256 pb correspondiente a la secuencia cicatriz, mientras que en la cepa Δmdh::aac(3)IV hay una banda de 1557 pb que corresponde a la secuencia del gen aac(3)IV y en la cepa silvestre amplificó una banda de 1165 pb correspondiente al gen mdh (Fig. 14). Fig. 14. Fragmentos de ADN de la cepa silvestre M145 (carril 2), mutante Δmdh::aac(3)IV (carril 3) y mutante no polar Δmdh (carril 4). 10 µl de la reacción de PCR descrita en Material y Métodos se cargaron en un gel de agarosa 0.8% y se corrieron durante 1.5 h a 80 V. Carril 1, marcador de peso molecular de 1 Kb (Fermentas). 1 2 3 4 250 1500 1000 10000 51 2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. Después de sustituir el gen mdh por la secuencia cicatriz era importante establecer que la mutante no tuviera actividad de MDH. Para esto, la cepa mutante S. coelicolor Δmdh y la cepa silvestre S. coelicolor M145 se cultivaron en medio líquido durante 72 h y la actividad se midió como se menciona en Materiales y métodos. Como se esperaba, en la mutante S. coelicolor Δmdh no hay actividad de la enzima MDH en ninguna de las fuentes de carbono usadas (Fig. 15). En contraste, en la cepa silvestre S. coelicolor M145 el perfil de actividad de esta enzima es modificado por la fuente de carbono. En presencia de casaminoácidos 0.5% como única fuente de carbono y nitrógeno, la actividad de esta enzima llegó al punto máximo a la 24 h y después disminuyó (Fig. 15A). En glicerol 0.028 M el punto máximo de actividad se alcanzó a las 24 h como en el caso anterior, sin embargo, la disminución de la actividad en este caso fue muy rápida (Fig. 15B). En contraste, al crecer en glucosa 0.028 M como fuente de carbono, la actividad de esta enzima aumentó durante todo el tiempo del cultivo (Fig. 15C). 52 Fig. 15. Perfiles de actividad de la enzima MDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh) fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria 200 rpm; cada 24 h se hicieron extractos libres de células, se midió la actividad enzimática y la cantidad de proteína por el método de Bradford. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes realizados por duplicado, las barras representan el error estándar. 53 3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IDH Y α-KGDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. Se ha reportado en B. subtilis que la MDH interactúa con la enzima IDH que también participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos; esta interacción resulta en el aumento de la actividad de IDH (Bartholomae et al., 2013). Por esta razón se decidió evaluar la actividad de IDH y su enzima subsecuente la α-KGDH, además al ver la actividad de estas enzimas se podría saber si el flujo de carbono es afectado por la falta de la enzima MDH. La actividad de IDH en la cepa S. coelicolor Δmdh fue menor que en la cepa silvestre en presencia de casaminoácidos como fuente de carbono, mientras que en las otras dos fuentes probadas la actividad de esta enzima fue igual en las dos cepas (Fig. 16). En casaminoácidos, la IDH alcanzó su actividad máxima a las 24 h y después disminuyó en las dos cepas, sin embargo, en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh la actividad de IDH fue menor (Fig. 16A). En glicerol y glucosa, la enzima tuvo el mismo perfil que el observado en casaminoácidos, sin embargo, en estas condiciones la actividad de esta enzima en las dos cepas fue igual (Fig. 16B y C). Además, la actividad de esta enzima de ambas cepas fue mayor en glicerol que en las otras dos fuentes de carbono probadas. La actividad de la α-KGDH fue mayor en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh que en la cepa silvestre S. coelicolor M145 en presencia de casaminoácidos, mientras que en glucosa y glicerol el perfil de actividad de esta enzima fue igual en las dos cepas (Fig. 17). En casaminoácidos, la α-KGDH alcanzó su máxima actividad a las 24 de cultivo y después disminuyó en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh, en contraste en la cepa silvestre S. coelicolor M145 la actividad de esta enzima fue muy baja (Fig. 17A). En glucosa y glicerol la actividad de esta enzima fue igual entre las dos cepas y el perfil de actividad fue igual al observado en casaminoácidos (Fig. 17B y C). Esta enzima tiene la mayor actividad en casaminoácidos en la cepa silvestre. 54 Fig. 16. Perfiles de actividad de la enzima IDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh) fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria 200 rpm; cada 24 h se hicieron extractos libres de células, se midió la actividad enzimática y la cantidad de proteína por el método de Bradford. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes hechos por duplicado, las barras representan el error estándar. 55 Fig. 17. Perfiles de actividad de la enzima α-KGDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh) fueron cultivadas
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