Caracterizacion-morfologica-y-molecular-del-cistacanto-de-polymorphus-brevis-van-cleave-1916-acanthocephala-en-peces-dulceacucolas-del-centro-de-Mexico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO	
  EN	
  CIENCIAS	
  BIOLÓGICAS	
  
INSTITUTO	
  DE	
  BIOLOGÍA	
  
BIOLOGÍA	
  EVOLUTIVA	
  Y	
  SISTEMÁTICA	
  
	
  
“Caracterización morfológica y molecular del cistacanto de 
Polymorphus brevis Van Cleave, 1916 (Acanthocephala) en peces 
dulceacuícolas del centro de México” 
	
  
TESIS	
  
QUE	
  PARA	
  OPTAR	
  POR	
  EL	
  GRADO	
  DE:	
  
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
(SISTEMÁTICA) 
	
  
PRESENTA:	
  
FRANCISCO JAVIER ALCÁNTAR ESCALERA 
	
  
TUTOR	
  PRINCIPAL	
  DE	
  TESIS:	
  DR.	
  GERARDO	
  PÉREZ-­‐PONCE	
  DE	
  LEÓN	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
   	
   Instituto	
  de	
  Biología,	
  UNAM	
  
COMITÉ	
  TUTOR:	
  DRA.	
  ELLA	
  VAZQUÉZ	
  DOMINGUEZ,	
  Instituto	
  de	
  Ecología,	
  UNAM	
  
	
   	
   	
  	
  DR.	
  MARTÍN	
  GARCÍA	
  VARELA,	
  Instituto	
  de	
  Biología,	
  UNAM	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  	
   	
  
	
   	
   	
  
 
MÉXICO, D.F. Marzo, 2013 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
POSGRADO	
  EN	
  CIENCIAS	
  BIOLÓGICAS	
  
INSTITUTO	
  DE	
  BIOLOGÍA	
  
BIOLOGÍA	
  EVOLUTIVA	
  Y	
  SISTEMÁTICA	
  
	
  
“Caracterización morfológica y molecular del cistacanto de 
Polymorphus brevis Van Cleave, 1916 (Acanthocephala) en peces 
dulceacuícolas del centro de México” 
	
  
TESIS	
  
QUE	
  PARA	
  OPTAR	
  POR	
  EL	
  GRADO	
  DE:	
  
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
 (SISTEMÁTICA) 
	
  
PRESENTA:	
  
FRANCISCO JAVIER ALCÁNTAR ESCALERA 
	
  
TUTOR	
  PRINCIPAL	
  DE	
  TESIS:	
  DR.	
  GERARDO	
  PÉREZ-­‐PONCE	
  DE	
  LEÓN	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
   	
   Instituto	
  de	
  Biología,	
  UNAM	
  
COMITÉ	
  TUTOR:	
  DRA.	
  ELLA	
  VAZQUÉZ	
  DOMINGUEZ,	
  Instituto	
  de	
  Ecología,	
  UNAM	
  
	
   	
   	
  	
  DR.	
  MARTÍN	
  GARCÍA	
  VARELA,	
  Instituto	
  de	
  Biología,	
  UNAM	
  
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
   	
  	
   	
  
	
   	
   	
  
 
MÉXICO, D.F. Marzo, 2013 
 IV 
 
UN M COORDINACiÓN 
~, 
Ciencias BiolÓgicas 
Dr. Isidro Ávila Martínez 
Director General de Administración Escolar, UNAM 
Pr esente 
Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico de! Posgrado en Ciencias 
Biológicas, celebrada el día 3 de diciembre de 2012, se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado 
de MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (SISTEMÁTICA) del alumno ALCÁNTAR ESCALERA 
FRANCISCO JAVIER con número de cuenta 97352767 con la tesis titulada " CARACTERIZACiÓN 
MORFOLÓGICA Y MOLECULAR DEL CISTACANTO DE POLYMORPHUS BREVIS VAN CLEAVE, 1916 
(ACANTHOCEPHALA) EN PECES DULCEACuicOLAS DEL CENTRO DE MEXICO", realizada bajo la 
dirección del OR. GERARDO PEREZ PONCE DE LEÓN : 
Presidente· 
Vocal : 
Secretario: 
Suplente: 
Suplente: 
DR. JUAN JOSE MORRONE LUPI 
DR. ROGElIO AGUILAR AGUILAR 
DRA. ELLA GLORIA VÁZQUEZ DOMiNGUEZ 
M, EN e LUIS GARCIA PRIETO 
DRA. ROSARIO MATA LÓPEZ 
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo. 
ATENTAMENTE 
" POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU" 
Cd. Universitaria, D.F., a 8 de febrero de 2013. 
AotJ~~,UJ· 
DRA. MARíA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA 
COORDINADORA DEL PROGRAMA 
c.c.p . Expediente del (la) interesado (a). 
Edif. de Posgrado P. B. (Costado Sur de la Torre 1I de Humanidades) Ciudad Universitaria c.P. 04510 Mcxico. 0.1-. 
Te!. 5623-0173 Fax: 5623-0172 hup:llpcb io!.posgrado.unam.mx 
 V 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 VI 
Agradecimientos 
 
Al Posgrado en Ciencias Biológicas de la UNAM; 
 
Al CONACyT por la beca otorgada durante mis estudios de posgrado; 
 
Al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Inovación Tecnológica (PAPIIT 
IN202111) por el apoyo otorgado a mi director de tesis para la realización del presente 
trabajo. 
 
Mi más sincero agradecimiento al director de esta tesis: Dr. Gerardo Pérez, por abrirme las 
puertas de su laboratorio y darme la oportunidad de realizar este logro importante para mí, 
por su confianza y tiempo, además de facilitarme las condiciones para desarrollar este 
proyecto que derivó en una publicación. 
 
A los Doctores: Ella Vazquéz y Martín García ser parte de mi comité tutoral y por los 
valiosos comentarios que realizaron para mejorar la calidad del trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 VII 
Agradecimientos personales 
 
 
A los Doctores: Juan José Morrone, Rogelio Aguilar, Ella Vázquez, Rosario Mata y al M. 
en C. Luis García por integrar el jurado del examen de grado y por sus sugerencias y 
comentarios para mejorar el escrito. 
 
A los Maestros en Ciencias, Berenit Mendoza por las imágenes de microscopía electrónica 
de barrido; Luis García por los facilitarme ejemplares depositados en la CNHE y por 
último, a Laura Márquez por la secuenciación del ADN. 
 
A los colegas, Andrés Martínez, David Hernández, Berenit Mendoza, Rogelio Aguilar, 
Rodolfo Pérez y Rosario Briosio por su apoyo durante el trabajo de campo. 
 
Una mención importante es a la M. en C. Liliana Cervantes por la ayuda técnica y consejos 
durante el trabajo de laboratorio. 
 
A mis compañeros y colegas del laboratorio, por las charlas que de algún modo sirvieron 
para la reflexión de este trabajo. Por ejercer un ambiente favorable durante mi estancia de 
maestría y por brindarme su amistad. 
 
A mis compañeros y amigos de la Facultad de Ciencias que, también, de alguna manera 
forman parte del camino de la investigación. Estan en mis recuerdos. 
 
A mi gran amiga desde la adolescencia: Ross, gracias por lo que más valoro; tu amistad. 
 
No puede faltar el agradecimiento hacia la gloriosa institución de la cual soy de extracción 
y canterano desde el bachiller… mi “alma mater”: LA UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTONOMA DE MEXICO. 
 
 
 
 
 VIII 
Dedicatoria 
 
Casi todos los que dedicamos algún trabajo incluímos a la familia; núcleo de la sociedad y 
que, de manera funcional, funge determinantemente para que un humano sea capaz de 
desarrollarse y amar, cumplir la misión que es contribuir a la humanidad. Este caso no es la 
excepción. 
 
Esta tesis esta dedicada a: 
 
“Madre”. Veáse, calor, seguridad, alimento. El amor de mi madre es incondicional; todo 
lo que necesito es ser su hijo, si lo tengo, es una bendición, y, si no, la belleza de la vida 
desaparece. Es el hogar de donde vengo, la naturaleza, el suelo. 
 
“Padre”. Veáse, pensamiento, la ley, el orden, la disciplina. Es el hombre que me mostró el 
caminohacia el mundo. 
 
“Hermanas”. Veáse, cuidado, respeto, conocimiento, prójimo, solidaridad. El amor 
fraternal que me han brindado esas tres mujeres, esta basado en que todos somos uno, en 
nuestra identidad (María Isabel, Dulce Berenice y “la tuza” Maricruz). 
 
Tienen mención también mi otra sangre: los primos y tíos y la energía de los abuelos. 
 
 
Dedicatoria especial 
 
…. y con “mención honorífica” el presente trabajo también esta dedicado a un ser que dejo 
huella en mí. Respeto, cuidado, conocimiento y preocupación, construyeron el amor que se 
mantuvo mientras viajamos juntos. Ahora nos bajamos en estaciones distintas. Si algún día 
volvemos a encontrarnos será hermoso Bea. 
 
 
 
Y a todos los humanos que directa o indirectamente fueron partícipes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 IX 
Índice 
 
Agradecimientos ........................................................................................................ vi 
Agradecimientos personales ………………………………………………………. vii 
RESUMEN …………………………………………………………………………. x 
ABSTRACT ………………………………………………………………………... x 
I. INTRODUCCIÓN 
I.I. Características del phylum Acanthocephala …………………………………….. 1 
I.II. Familia Polymorphidae Meyer, 1931 …………………………………………... 2 
I.III. Género Polymorphus Lühe, 1911 …………………………………………….... 2 
I.IV. Ciclo de vida de Polymorphus brevis ………………………………………….. 4 
I.V. Marcadores moleculares en acantocéfalos ……………………………………… 6 
I.VI. Uso del ADN mitocondrial: la región del gen Citocromo Oxidasa Subunidad 1 (Cox1) 
I.VII. Estudios de morfometría en acantocéfalos ……………………………………. 8 
 
II. JUSTIFICACIÓN ……………………………………………………………. 9 
 
III. OBJETIVO GENERAL 
III.I. Particulares ……………………………………………………………………. 10 
 
IV. HIPÓTESIS 
 
V. MATERIAL Y MÉTODO 
V.I. Recolecta del material helmintológico ………………………………………….. 10 
V.II. Estudio morfológico y morfométrico …………………………………………... 11 
V.III. Obtención de ADN genómico …………………………………………………. 15 
V.IV. Amplificación y purificación de los productos de PCR del gen (Cox 1) ……… 15 
V.V. Secuenciación de la región del gen Cox1 ………………………………………. 15 
V.VI. Alineamiento múltiple y análisis filogenéticos …………………………………16 
 
VI. RESULTADOS DISCUSIÓN 
Using DNA barcoding to link cystacanths and adults of the acanthocephalan Polymorphus 
brevis Van Cleave, 1916 in central Mexico …………………………………………. 18 
 
VII. CONCLUSIONES GENERALES ……………………………………………. 47 
 
VIII. REFERENCIAS ………………………………………………………………. 48 
 
 
 
 
 
 
 X 
RESUMEN: En helmintos, como en muchos otros grupos de parásitos, el uso de la región 
estándard del Código de Barras de la Vida para la identificación y el descubrimiento de 
especies, la subunidad I del gen mitochondrial citocromo oxidasa, ha sido muy limitado. 
En este trabajo se presenta un estudio integrativo del acantocéfalo Polymorphus brevis 
basado tanto en el código de barras del ADN como en un análisis morfológico. Las larvas 
(cistacantos) de P. brevis se encuentran comúnmente en el mesenterio de peces de agua 
dulce mientras que los adultos parásitan el intestino de aves ictiófagas. La taxonomía alfa 
de los helmintos parásitos está basada en los rasgos morfológicos observados únicamente 
en el estado adulto. La identificación de las larvas a nivel de especie basada en caracteres 
morfológicos solamente no es clara. En la actualidad, el código de barras de la vida ofrece 
una herramienta alternativa para correlacionar a los estados larvarios de organismos 
parásitos con los adultos que ya han sido descritos de sus huéspedes definitivos. En este 
estudio, se secuenciaron cistacantos recolectados de peces de agua dulce de varias 
localidades a lo largo del centro de México, así como los adultos de P. brevis en aves 
ictiófagas de varias regiones de México, para determinar si éstas eran conespecíficas. Con 
el fin de corroborar los resultados del estudio molecular, se realizó un análisis 
morfométrico por medio del programa de cómputo ‘Proboscis profiler’ diseñado 
recientemente para detectar heterogeneidad en acantocéfalos morfológicamente similares y 
está basado en análisis estadísticos multivariados de las dimensiones de los ganchos de la 
proboscis. Ambas fuentes de datos nos permitieron confirmar que los cistacantos que 
infectan a peces de agua dulce en el centro de México corresponden a una sola especie, P. 
brevis. 
 
ABSTRACT: In parasitic organisms, particularly helminths, the use of the mitochondrial 
cytochrome c oxidase subunit I gene as the standard DNA barcoding region for species 
identification and discovery has been very limited. Here, we present an integrative study, 
based on both DNA barcoding and morphological analyses, for acanthocephalans 
belonging to the genus Polymorphus, whose larvae (cystacanths) are commonly found in 
the mesentery of freshwater fishes while adults are found in the intestine of fish-eating 
 XI 
birds. The alpha taxonomy of parasitic helminths is based on adult morphological traits, 
and because of that larval forms cannot be identified to species level based on morphology 
alone. DNA barcoding offers an alternative tool for linking larval stages of parasitic 
organisms to known adults. In this study we sequenced cystacanths collected from 
freshwater fishes in localities across central Mexico, as well as adults obtained from fish-
eating birds, to determine if they were conspecific. In order to corroborate the molecular 
results, we conducted a morphometric analysis with ‘Proboscis profiler’, which is a 
software tool developed to detect heterogeneity in morphologically similar 
acanthocephalans based on the multivariate statistical analysis of proboscis hook 
dimensions. Both sources of information indicate that cystacanths infecting freshwater 
fishes in central Mexico belong to a single species, P. brevi 
 1 
INTRODUCCIÓN 
 
I.I. Características del Phylum Acanthocephala 
 
Constituido por más de 1, 200 especies, el phylum Acanthocephala es un grupo de 
helmintos endoparásitos estrictos que en su fase larvaria se encuentran en el hemocele de 
invertebrados y en su fase adulta en el tubo digestivo de vertebrados para completar su 
ciclo de vida. Son organismos blastocelomados, de cuerpo blando y cilíndrico, con simetría 
bilateral que se caracterizan por tener una estructura retráctil armada con ganchos llamada 
proboscis, que a su vez es conectada con otras estructuras hidráulicas que se presentan en la 
forma de un par de sacos llamadas lemniscos, mismos que facilitan la inversión y eversión 
de la misma. Los acantocéfalos carecen de sistema respiratorio, circulatorio y aparato 
digestivo, por lo que la exocitosis y endocitosis de los nutrientes que derivan del huésped 
se llevan a cabo a través del tegumento del cuerpo y son depositados en el sistema lacunar 
que funciona como un aparato circulatorio (Nickol, 1985; Kennedy, 2006). Como otros 
parásitos, los acantocéfalos juegan un papel importante en el mantenimiento de la 
diversidad genética y la estructura de las comunidades de sus huéspedes (Brooks y Hoberg, 
2006) y su estudio se ha incrementado debido al interés de ecológos y biólogos porque han 
sido propuestos como bioindicadores del deterioro de los ecosistemas (v. gr., Marcogliese y 
Cone, 1997). Otros autores como Sures et al. (1999) mencionan que los parásitos pueden 
servir para monitorear el ambiente por la variedad de formas en las que éstos responden a la 
contaminación antropogénica; particularmente los acantócefalos que parasitan el intestino 
de peces pueden acumular metales pesados en concentraciones mayores a las de los tejidos 
del huésped, ó inclusive, a las del ambiente. 
El phylum Acanthocephala está constituido por cuatro clases: Archiacanthocephala 
Meyer, 1931; Eoacanthocephala Van Cleave, 1936; Polyacanthocephala Amin, 1987 y 
Palaeacanthocephala Meyer, 1931; esta clasificación está basada en caracteres 
morfológicos, ecológicos y moleculares (Amin, 1985; Near et al., 1998; Monks,2001; 
García-Varela et al., 2002). Morfológicamente las clases se diferencian con base en 
caracteres como la localización del sistema lacunar, la persistencia del saco de ligamento en 
hembras, el número y forma de las glándulas de cemento presentes en machos, el número y 
 2 
tamaño de ganchos en la proboscis, y por características ecológicas como el tipo de 
huésped definitivo e intermediario (Amin, 1985). 
 
I.II. Familia Polymorphidae Meyer, 1931 
 Los polimórfidos (Palaeacanthocephala) son endoparásitos de distribución mundial 
que en estadio adulto se asocian con aves marinas ictiófagas, anátidos y mamíferos marinos 
como huéspedes definitivos, y crustáceos como huéspedes intermediarios. Asimismo, 
también usan peces, anfibios y reptiles como huéspedes paraténicos (Schmidt, 1985; 
Hoberg, 1986; Pichelin et al., 1998, Nickol et al., 1999, 2002). La familia está constituida 
aproximadamente por 127 especies clasificadas en 11 géneros (Schmidt, 1973; Dimitrova y 
Goergiev, 1994; Nickol, et al., 1999, 2002; Aznar et al., 2006; García-Varela et al., 2011). 
Los géneros de esta familia se diferencian morfológicamente por caracteres de la proboscis, 
el patrón de espinas en la región anterior del tronco y el número de glándulas de cemento (4 
a 8), así como por el tipo de huésped intermediario y definitivo que intervienen en su ciclo 
de vida (Cuadro 1). Más recientemente, caracteres moleculares han sido utilizados para 
separar a las especies (y géneros) de polimórfidos, (v.gr., García-Varela y Pérez-Ponce de 
León, 2008; Guillén-Hernandez et al., 2008; García-Varela et al., 2011). 
 
Cuadro 1. Géneros incluídos en la clasificación de la familia de Polymorphidae 
 
 
I.III. Género Polymorphus Lühe, 1911 
Las especies del género Polymorphus se distribuyen a nivel mundial como 
endoparásitos de aves ictiófagas y anátidos como huéspedes definitivos y anfípodos de agua 
Género Huésped intermediario Huésped definitivo 
Andracantha Schmidt, 1975 Crustáceos Aves ictiófagas 
Arhythmorhynchus Lühe, 1911 Crustáceos Aves ictiófagas 
Bolbosoma Porta, 1908 Crustáceos Cetáceos 
Pseudocorynosoma Aznar, et al., 2006 Anfípodos Anátidos 
Diplospinifer Fukui, 1929 Crustáceos Cetáceos 
Profilicollis Lühe, 1911 Decápodos Aves ictiófagas 
Hexaglandula Petrochenko 1950 Decápodos Aves ictiófagas 
Polymorphus Lühe, 1911 Anfípodos Aves ictiófagas y Anátidos 
Southwellina Witenberg 1932 Decápodos Aves ictiófagas y Anátidos 
Corynosoma Lühe, 1904 Anfípodos e Isópodos Pinípedos 
Ibirhynchus García-Varela et al., 2011 Decápodos Aves ictiófagas 
 3 
dulce como huéspedes intermediarios; asimismo, los miembros de este género utilizan 
peces dulceacuícolas, anfibios y reptiles como huéspedes paraténicos (Kennedy, 2006). El 
género cuenta con aproximadamente 30 especies, siendo P. minutus (Goeze, 1782) Lühe, 
1911 la especie tipo. No obstante, la situación taxonómica de Polymorphus ha tenido varias 
modificaciones a lo largo del tiempo desde que, en 1911, Lühe lo erigió, por lo cual la 
historia de su clasificación ha sido inestable. Algunos géneros han sido considerados como 
sinónimos de Polymorphus y otros han sido colocados como subgéneros, por lo que el 
número de especies que presenta el género es inestable ya que se han propuesto 
reasignaciones de especies de otros géneros y colocadas dentro de Polymorphus. El género 
Polymorphus se distingue morfológicamente de otros por la forma de la proboscis, la 
longitud del cuello, el patrón de espinas en la región anterior del tronco, la forma de los 
huevos, el número y arreglo de los testículos y forma de las glándulas de cemento (Amin, 
1992). 
Polymorphus brevis (Van Cleave, 1916) Salgado Maldonado, 1980, fue 
originalmente descrita como miembro del género Arhythmorhynchus Lühe, 1911, para 
describir una colección de parásitos recolectados del intestino de Botaurus lentiginosus 
Rackett, 1813 en Estados Unidos. Travassos (1926) asignó la especie al género 
Polymorphus Lühe, 1911. Posteriormente Van Cleave (1945) la regreso al género 
Arhythmorhynchus revisando ejemplares de museo adicionales, sin mencionar los criterios 
para su reasignación. Schmidt (1969), trató de establecer diferencias morfológicas entre los 
géneros Polymorphus y Arhythmorhynchus como la presencia de núcleos hipodérmicos en 
la región posterior del tronco. Más tarde, Atrashkevic (1979) señaló que únicamente, el 
carácter de presencia de núcleos hipodérmicos, no era suficiente para diferenciar los dos 
géneros de manera objetiva. Por lo anterior, P. brevis, es otra vez incluido de nuevo por 
Amin (1992) al género Polymorphus de acuerdo con la reasignación anterior de Travassos 
(1926). 
Morfológicamente la forma adulta de Polymorphus brevis se caracteriza por poseer 
un cuerpo robusto con un ensanchamiento marcado en la parte anterior del tronco; el cuerpo 
de las hembras tiene una longitud de 6.6 a 14 mm y una anchura de 6.8 a 9.6 mm, mientras 
que en machos es de 6.8 a 9.6 por 1.2 a 2.5 mm de ancho, la proboscis es ovoide y alargada, 
con un ensanchamiento bulboso en la parte media, además esta armada con 18 hileras 
 4 
longitudinales, con 13 a 14 ganchos por hilera. Los ganchos apicales y basales de la 
proboscis son los más pequeños, mientras que los más grandes se encuentran justo en el 
ensanchamiento de la parte media de la proboscis en los dos sexos (Cuadro 2). 
Polymorphus brevis presenta un cuello robusto y bien diferenciado del tronco y la 
proboscis, además de una constricción cubierta de espinas, existe una doble pared en el 
receptáculo de la proboscis y éste tiene una longitud de 1.036 a 1.15 mm; una anchura de 
0.28 a 0.37 mm en machos mientras que en hembras la longitud es de 0.99 a 1.18 mm por 
0.29 a 0.38 mm de ancho. El aparato reproductor masculino está constituido por 2 testículos 
en tándem situados inmediatamente después del receptáculo de la proboscis y 4 glándulas 
de cemento tubulares que se encuentran inmediatamente después del testículo posterior. El 
aparato reproductor femenino presenta un útero corto y los embriones son ovoides con 
prolongación polar en la membrana media con una longitud de 0.082 a 0.131 mm y una 
anchura de 0.016 a 0.074 mm. Machos y hembras presentan un poro genital terminal y 
subterminal, respectivamente (Salgado-Maldonado, 1980). 
 
Cuadro 2. Dimensiones de los ganchos de P. brevis de acuerdo con Salgado-
Maldonado (1980) (en milímetros). 
 Machos Hembras 
 Longitud Anchura Longitud Anchura 
Apicales 0.032-0.045 0.008-0.012 0.024-0.049 0.008-0.012 
Medios 0.45 0.012-0.016 0.036-0.057 0.012-0.020 
Basales 0.032-0.036 0.008 0.020-0.041 0.008 
 
I.IV. Ciclo de vida de Polymorphus brevis 
 En su forma larvaria, Polymorphus brevis se ha registrado en el mesenterio y 
cavidad corporal de por lo menos 23 especies de peces dulceacuícolas, 1 especie de anfibio 
y 1 de reptil del norte, centro y sur de México (García-Prieto et al., 2010) (Cuadro 3), 
aunque también se han registrado cistacantos en el intestino de algunos mamíferos 
terrestres de Norteamérica como consecuencia de infecciones accidentales (Foster et al., 
2007). El ciclo de vida de P. brevis inicia cuando los huevos son expulsados del intestino 
del huésped definitivo (aves ictiófagas y anátidos) por medio de las heces que, en algunos 
 5 
polimórfidos, pueden tardar de 23 a 25 días en aparecer en las heces después de la infección 
(Crompton y Whitfield, 1968). Los huevos son ingeridos por un anfípodo que actúa como 
huésped y dentro del hemocele se desarrollan dos estadios larvales: acantela y cistacanto 
(fase infectiva). Se ha estudiado la variedad de efectos que causa la larva de algunos 
polimórfidos en el anfípodo, como cambios en la coloración, en el comportamiento y 
cambios ultraestructurales del intestino como estrategias para facilitar la transmisión 
(William y Holmes, 1974, Dezfulli y Giari, 1999; Outreman et al., 2007; Kaldonski et al., 
2009).La infección ocurre cuando el ave ingiere al cistacanto. Dentro del intestino del ave, 
el cistacanto crece y termina su desarrollo y madurez sexual. Machos y hembras se 
reproducen y éstas últimas liberan huevos al ambiente. 
 
Cuadro 3. Registros previos de cistacantos de P. brevis en México (García Prieto et al., 
2010) 
Especie de huésped Distribución 
Characodon lateralis Ojo de Agua San Juan, Durango 
 Arroyo Santiago Tiacaque (Ixtlahuaca); Laguna Salazar 
(Ocoyoacac), Estado de México 
Girardinichthys multiradiatus Arroyo Santiago Tiacaque (Ixtlahuaca); Laguna Salazar 
(Ocoyoacac); Presa Ignacio Ramírez, Estado de México 
Xenotoca variata Presa Ignacio Allende, Guanajuato. 
Yuriria alta Río La Laja, Guanajuato. 
Chapalichthys encaustus Lago de Chapala, Jalisco 
Ictalurus dugesii Lago de Chapala, Jalisco 
Poecilia sphenops Lago de Chapala, Jalisco 
Poeciliopsis infans Lago de Chapala, Jalisco 
Algansea lacustris Lago de Pátzcuaro, Michoacán. 
Alloophorus robustus Lago de Cuitzeo, 
Lago de Zacapu 
Represa La Mintzita, Michoacán. 
Allotoca diazi Lago de Cuitzeo, 
Lago de Zacapu, Michoacán 
Chirostoma attenuatum Lago de Cuitzeo, Michoacán 
 
 
 6 
Chirostoma estor Lago de Cuitzeo, Michoacán 
Chirostoma grandocule Lago de Cuitzeo, Michoacán 
Cyprinus carpio Lago de Cuitzeo, Michoacán 
Goodea atripinnis Lago de Cuitzeo; 
Represa la Mintzita, 
Michoacán 
Micropterus salmoides Lago de Cuitzeo, Michoacán 
Chirostoma jordani Lago de Zacapu 
Chirostoma humboldtianum Represa La Mintzita, Michoacán 
Vieja synspila Cenote Los Cuates, Quintana Roo 
Heterandria bimaculata Lago de Catemaco, Veracruz 
Rhamdia guatemalensis Lago de Catemaco, Veracruz 
Vieja fenestrata Lago de Catemaco, Veracruz 
Ambystoma dumerilii Lago de Pátzcuaro, Michoacán 
Thamnophis eques Lago de Xochimilco Distrito Federal; 
Ciénaga de Lerma, Estado de México; 
Lago de Chapala, JALISCO; 
Lago de Pátzcuaro; Lago de Zacapu, Michoacán 
Thamnophis melanogaster Ciénaga de Lerma, Estado de México; 
Lago de Chapala, JALISCO; 
Lago de Cuitzeo; 
Lago de Pátzcuaro; Lago de Zacapu, Michoacán 
Kinosternon hirtipes Lago de Cuitzeo; 
Lago de Pátzcuaro; Lago de Zacapu, Michoacán 
 
I.V. Marcadores moleculares en acantocéfalos 
Las técnicas moleculares ofrecen una poderosa herramienta para la clasificación, 
generación de hipótesis filogenéticas, delimitación de especies y caracterización genética 
de la biota en el planeta. Los marcadores son moléculas (secuencias de ADN, ARN y 
proteínas) que aportan información genética y permiten detectar variación entre especies y 
poblaciones de organismos (Avise, 2004). Esta variación representa cambios a través del 
tiempo (sustitución nucleotídica) por eventos intrínsecos (mutación), extrínsecos (selección 
natural, deriva génica, fenómenos ecológicos, vicarianza) y permiten construir hipótesis y 
explicar procesos de especiación. El ARN ribosomal citoplasmático así como el ADN y 
ARN mitocondrial han sido utilizados ampliamente debido a que presenta regiones 
 7 
variables flanqueadas por regiones altamente conservadas que reflejan diferentes tasas de 
evolución, lo que permite su versatilidad al ser usados en estudios taxónomicos a diferentes 
niveles (Hillis y Dixon, 1991). Los marcadores más usados en acantocéfalos son la regiones 
codificantes de los genes 18S, 5.8S, las regiones de la subunidad menor (SSU) y la 
subunidad mayor (LSU) y las regiones no codificantes de los ITS`s 1 y 2 del ARN 
ribosomal citoplasmático (Near, 2002; García-Varela et al., 2005) . El gen Citocromo 
Oxidasa Subunidad 1 (Cox1) y la región del gen 16S son los marcadores más usados del 
ADN y ARN mitocondrial respectivamente. 
Winnepenninckx et al., (1995) realizó uno de los primeros estudios filogenéticos 
con caracteres moleculares usando el gen 18S para inferir las relaciones del grupo de los 
asquelmintos, constituido por los gastrotricos, platelmintos, kinorínquidos, priapúlidos, 
nemátodos, rotíferos y acantocéfalos. El análisis mostró que el Phylum Acanthocephala y 
Rotifera tenía un origen monofilético. Subsecuentemente, Garey et al. (1996 y 1998) 
usando el mismo gen y combinando caracteres morfológicos sugirieron que 
Acanthocephala fuera un subtaxón de Rotifera; sin embargo, los resultados de García-
Varela et al. (2000) fueron consistentes con los de Winnepenninckx (1995), encontrando 
que Rotífera y Acanthocephala formaron un grupo monofilético y qué este último es un 
grupo independiente dividido en cuatro clases (García-Varela et al., 2002; Verweyen et al., 
2011; Mallatt et al., 2012). García-Varela et al., (2000) consideraron que sus conclusiones 
difirieron con las de Garey et al., (1996 y 1998) debido a diferencias en el alineamiento de 
las secuencias, en la muestra de los taxones y diferencias en el método de inferencia 
filogenética. La región del gen 18S también se ha utilizado para estudios de diversificación 
parasitaria y en sistemática de acantocéfalos (Near, 2002; García-Varela et al., 2000). 
 
I.VI. Uso del ADN mitocondrial: la región del gen Citocromo Oxidasa Subunidad 1 (Cox1) 
 Las mitocondrias son orgánelos celulares citoplasmáticos y son los principales 
generadores de energía en forma de ATP dentro del ciclo de la cadena respiratoria. Su 
forma y número dentro de la célula es variable; presentan un complejo sistema de 
membranas, interna y externa, tienen su propia maquinaria de reproducción: presentan 
ribosomas y genoma propio. Precisamente, el ADN mitocondrial, ha sido uno de los 
principales marcadores moleculares para estudiar organismos en estudios filogenéticos, 
 8 
filogeográficos, ecológicos, de evolución molecular y biogeográficos. Contiene 
aproximadamente 16,569 pares de bases y en animales se diferencia del ADN nuclear 
porque presenta un genoma de estructura simple y circular, una alta tasa de mutación, es de 
herencia materna y es independiente del ADN nuclear, por lo que ha sido usado para 
delimitar e identificar especies, especies crípticas y describir variación genética 
intrapoblacional (Steinauer et al., 2007); no obstante, en algunos organismos se ha 
reportado la presencia de pseudogenes mitocondriales, los cuales están asociados con el uso 
de primers universales (Benesh et al., 2006) . La región del gen mitocondrial Cox1 también 
se ha usado para corroborar la determinación de especies en acantocéfalos, correlacionando 
secuencias de adultos con larvas (Guillén-Hernández et al., 2008). 
 
I.VII. Estudios de morfometría en acantocéfalos 
 El análisis morfológico forma parte importante en la descripción de una especie. La 
estructura final de la forma: el fenotipo, es resultado de una interconexión compleja entre 
las leyes morfogenéticas, condiciones ambientales, eventos ecológicos y fuerzas evolutivas 
determinísticas y estocásticas (Murray, 1990; Levin, 1992; Paterson y Banks, 2001). En 
helmintos parásitos, los atributos morfológicos son afectados en gran medida por el 
huésped, quién determina las condiciones ambientales en las que ellos viven (Hochberg et 
al., 1992, Koella et al., 1998). Los parásitos que presentan una amplia capacidad de 
infección en diferentes especies de huéspedes, también están sujetos a diferentes presiones 
selectivas (Riquelme et al., 2006) y puede afectar directamente su adecuación biológica 
(fecundidad y sobrevivencia) (George-Nascimento y Marín, 1992) 
Anteriormente la morfología estaba concentrada en la estructura observada del 
bauplan de un organismo, células, tejidos, órganos, dimensiones, formas y las relaciones 
entre ellos; es decir la forma era una cualidad de la estructura, sin embargo, no podía ser 
analizada cuantitativamente. Al estudio de la covariación de la forma con factores 
subyacentes se le conoce como morfometría (Toro Ibacache et al., 2010). Gracias a la 
aplicación de técnicas biométricas, instrumentos y programas computacionales, se ha 
logrado no solo objetivarla evaluación cuantitativa de los cambios sino también la 
evaluación cualitativa a través de la recuperación de la forma en estudio. En acantocéfalos, 
los métodos y análisis estadísticos más usados son los multivariados y univariados 
 9 
empleando caracteres discretos y continuos, de componentes principales (PCA) basados en 
matrices de correlación, pruebas “t” de Student para datos pareados, análisis de varianza, 
regresiones lineales, entre otros, con el objetivo de describir e identificar especies, detectar 
la presencia de especies crípticas, explorar patrones de variación morfológica inter e 
intraespecífica así como investigar el efecto que ejercen los huésped sobre el fenotipo de 
los parásitos (Riquelme et al., 2006). 
La morfometría de algunos caracteres como, los ganchos de la proboscis, se han 
utilizado recientemente en estudios evolución de estructuras de anclaje en acantocéfalos y 
correlacionar la producción de ganchos con el tipo de huésped y con el tamaño del gusano, 
asimismo para detectar especies crípticas y variación morfométrica en poblaciones con un 
rango geográfico amplio y a lo largo de una zona biogeográfica (Poulin, 2006; Wayland et 
al., 2004 y 2005; Wayland, 2010). Por consiguiente, en el presente trabajo se pretende 
ampliar el estudio en cuanto al uso de la morfometría de ganchos y utilizar por primera vez, 
esta metodología en estadios larvales con la intención de detectar potenciales morfotipos y 
correlacionarlos con el tipo de huésped (a nivel de familia) o a su distribución geográfica. 
 
II. JUSTIFICACIÓN 
Polymorphus brevis, en etapa de cistacanto (forma infectiva para las aves), se ha 
registrado en cuerpos de agua del centro de México, donde es relativamente frecuente, sin 
embargo, también se distribuye en el sureste y norte del país (García-Prieto et al., 2010); 
es un parásito con especificidad hospedatoria baja ya que presenta alta capacidad de 
infección en diferentes familias de peces, lo que permitiría suponer que se tratara de más de 
una especie debido a su variación fenotípica y genética. Además, su amplia distribución 
geográfica también podría ser un factor que determinara la posibilidad de que representara 
un complejo de especies. 
La identificación de la forma larvaria de P. brevis se ha hecho con base en algunos 
caracteres morfológicos, principalmente el número y disposición de ganchos de la 
proboscis, sin embargo, no se cuenta con un estudio específico que establezca la 
correlación de la presencia de estas larvas en peces con el adulto encontrado en aves de la 
misma región, y no se ha evaluado la posibilidad de que se cuente con más de una especie. 
Los caracteres moleculares ofrecen una excelente oportunidad para corroborar la 
 10 
determinación de esta especie, misma que se basa en caracteres morfológicos, así como 
para establecer dicha correlación entre larvas y adultos, como ha sido realizado con otras 
especies de acantocéfalos (Guillén-Hernández et al., 2008). El estudio morfológico, además 
del genético, nos servirá para demostrar si se trata de más de una especie de acantocéfalo o 
sólo se trata de una especie con variabilidad morfológica intraespecífica. 
 
III. OBJETIVO GENERAL 
 
• Determinar si los cistacantos recolectados de peces del centro de México 
representan una misma especie de acantocéfalo. 
 
III.I. Particulares: 
1. Realizar un análisis filogenético basado en secuencias de genes mitocondriales (Cox1) de 
cistacantos donde se incluyan muestras de adultos de P. brevis. 
2. Calcular las distancias genéticas usando la región del gen mitocondrial Cox1. 
3. Corroborar si las secuencias de los cistacantos son similares a las de adultos de P. brevis 
obtenidos en aves para demostrar la hipótesis de conespecificidad. 
4. Realizar la caracterización morfológica de los cistacantos de P. brevis recolectados en 
algunas especies de peces dulceacuícolas del centro de México por medio de un análisis 
multivariado. 
 
IV. HIPÓTESIS 
• Los cistacantos de P. brevis recolectados en peces del centro de México, representan 
una sola especie de parásito. 
 
V. MATERIAL Y MÉTODO 
V.I. Recolecta del material helmintológico 
Durante el verano-invierno y primavera-verano de 2009 y 2010, respectivamente, se 
recolectaron peces dulceacuícolas correspondientes a tres familias, 10 géneros y 15 
especies de 2 regiones hidrológicas en diez localidades del centro de México, en Michoacán 
y Estado de México (Cuadro 4). A los peces recolectados se les practicó una incisión sobre 
 11 
la superficie ventral. Posteriormente, algunos órganos internos fueron colocados en cajas de 
Petri con solución salina al 0.65% para revisarlos bajo el microscópio estereoscópico en 
busca de cistacantos que se encuentran en el mesenterio y en órganos tales como el hígado. 
El material helmintológico se conservó de dos maneras: los ejemplares destinados para el 
estudio molecular se preservaron directamente en etanol al 100%; este método permite la 
adecuada conservación de los organismos y del material genético, otro grupo de se colocó 
en agua destilada a 4°C de 8 a 12h para forzar la evaginación osmótica de la proboscis y 
posteriormente ser fijados en etanol al 70% para su identificación morfológica. 
Por otro lado, se utilizaron ejemplares de P. brevis adultos que habían sido 
recolectados previamente (Proyecto: PAPIIT-IN206906, M.G.V.) de aves ictiofágas 
(huéspedes definitivos), correspondientes a una familia, cuatro géneros y cuatro especies, 
en cinco localidades de los estados de Baja California Norte, Guanajuato, Guerrero y 
Michoacán (Cuadro 3). Estos ejemplares se utilizaron para el estudio molecular con el fin 
de comprobar si larvas y adultos son conespecíficos. Para el análisis morfométrico de los 
cistacantos, se adicionaron ejemplares depositados en la Colección Nacional de Helmintos 
(CNHE), Instituto de Biología, UNAM (Cuadro 2). 
 
V.II. Estudio morfológico y morfométrico 
Algunos ejemplares fijados para el estudio morfológico se preservaron en etanol 
absoluto y se procesaron para su estudio con microscopía electrónica de barrido (MEB) 
para la toma de imágenes que sirvieron para la caracterización morfológica de los 
cistacantos. Adicionalmente se revisó la descripción original de la especie realizada por 
Van Cleave (1916) y la redescripción hecha por Salgado-Maldonado (1981) con la 
intención de contrastar algunos caracteres diagnósticos tales como la forma de la proboscis, 
el número de hileras de ganchos en la proboscis, el número de ganchos por hilera y el 
patrón de espinación en la región anterior del tronco. 
 
 
 
 
 
 
 
 12 
Cuadro 4. Cistacantos de P. brevis recolectados en peces en diversas localidades del centro de 
México. 
Estado Localidad Coordenadas Familia Género Especie de 
huésped 
# de 
cistacantos 
Michoacán Cupatziro 19° 52” 51.3’ N, 
102° 12” 34.7’ O. 
 
Goodeidae 
 
Zoogoneticus 
 
purhepechus 13 
 Goodeidae 
 
Skiffia multipunctata 2 
 Las Adjuntas 19° 54” 39.3’ N, 
102° 12” 20.0’ O. 
 
Goodeidae 
 
Zoogonecticus 
 
purhepechus 1 
 Lago de 
Camecuaro 
19° 54” 2.3’ N, 
102° 12” 24.4’ O. 
 
Goodeidae 
 
Zoogonecticus 
 
purhepechus 5 
 Presa Caltzonzin 19°25'’ 14’ N, 
102°1'’ 2’ O. 
 
Goodeidae 
 
Allootoca catarinae 6 
 Zacapu 19° 49” 35’ N, 
101° 47” 10’ O. 
 
Aterinopsidae Chirostoma humboldtianum 14 
 Cyprinidae Notropis grandis 4 
 Goodeidae 
 
Alloophorus robustus 5 
 Goodeidae 
 
Skiffia lermae 1 
 Goodeidae Allootoca zacapuensis 1 
 Goodeidae Xenotoca 
 
variata 5 
 Goodeidae Zoogonecticus 
 
quitzeoencis 3 
 Pátzcuaro 19° 41” 00’ N, 
101° 53” 00’ O. 
 
Aterinopsidae Chirostoma 
 
estor 6 
 Goodeidae 
 
Alloophorus 
 
robustus 11 
 Aterinopsidae Chirostoma 
 
attenuatum 1 
 Goodeidae 
 
Goodea attripinis 2 
 Lago de la Luz 19° 56” 10.4’ N, 
102° 17” 57.8’ O.Goodeidae 
 
Chapalichthys 
 
encaustus 1 
Estado de 
México 
Canal Santiago 
Tiacaque 
19°40’22’’N, 
99°42’28’’O. 
Goodeidae 
 
Girardinichthys 
 
multirradiatus 
 
3 
 Laguna Salazar 19°21’05’’N, 
99°21’55’’W 
Goodeidae 
 
Girardinichthys 
 
multirradiatus 
 
1 
Total 9 3 10 15 85 
 13 
Para el análisis morfométrico se seleccionaron sólo los parásitos con la proboscis 
totalmente evaginada, se fijaron en etanol al 70%, se tiñeron usando la técnica de tinción de 
Paracarmín de Meyer y se montaron en preparaciones permanentes usando bálsamo de 
Canadá. Los ejemplares se midieron usando un microscopio óptico (Olympus modelo, 
BX40F-3, Japón) y un ocular micrométrico. El análisis morfométrico se baso en 4 
variables: (1) la longitud y (2) la anchura de la base los ganchos de (3) una hilera ventral y 
(4) una hilera dorsal (Fig. 1). Posteriormente se generó una base de datos con las 
dimensiones de los ganchos y se introdujeron en el programa de cómputo Acanthocephalan 
Proboscis Profiler (Wayland, 2010), que utiliza un análisis multivariado, con el objetivo de 
detectar heterogeneidad morfológica. La colección de datos obtenida se agrupó usando 
como criterio el tipo de huésped de los gusanos, es decir, cistacantos encontrados en peces 
de la familia Atherinopsidae, Goodeidae e Ictaluridae respectivamente para correlacionar 
los morfotipos que se llegaran a detectar. A partir de este análisis se determinó si las 
poblaciones representan una misma especie con variabilidad morfológica intraespecífica. 
Otros caracteres tales como la longitud y anchura de la proboscis, longitud y 
anchura del tronco y la longitud y anchura del receptáculo de la proboscis se usaron para 
caracterizar a los cistacantos de P. brevis. Las medidas de los organismos están en 
milímetros y se tomaron con un analizador de imágenes, mientras que las medidas para 
análisis multivariado están en micrómetros. Las preparaciones permanentes se depositaron 
en la Colección Nacional de Helmintos (CNHE) del Instituto de Biología, UNAM (Cuadro 
5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 14 
Cuadro 5. Ejemplares de cistacantos y adultos de P. brevis usados para el análisis morfológico 
y morfométrico. 
* Recolectas del presente estudio; MEB (Microscopía Electrónica de Barrido); ** Adultos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estado Localidad Familia Género Especie hosp # de ejemplares (No. de catálogo) 
Michoacán Lago de Camecuaro Goodeidae Zoogonecticus purhepechus 1 (8049*) 
 Cupatziro Goodeidae Zoogonecticus 
 
Skiffia 
purhepechus 
 
multipunctata 
2 (*) 
5 (MEB)* 
1 (8050*) 
 Zacapu Goodeidae Zoogonecticus quitzeoensis 2 (7829 y 7830) 
 Goodeidae Allootoca zacapuensis 1 (7828) 
 Goodeidae Alloophorus robustus 4 (3953) 
 Goodeidae Xenotoca variata 5 (7829) 
 Aterinopsidae Chirostoma humboldtianum 6 (3947) 
 Pátzcuaro Goodeidae Alloophorus robustus 5 (8047*) 
3 (MEB) 
 Goodeidae Goodea atripinis 1 (8051*) 
 Aterinopsidae Chirostoma 
 
Chirostoma 
 
estor 
 
attenuatum 
3 (570) 
1 (MEB) 
1 (620) 
 Cuitzeo Ardeidae Nycticorax nycticorax 11 (MEB)** 
Guanajuato Yuriria Ardeidae Egretta caerulea 4 (MEB)** 
Jalisco Lago de Chapala Ictaluridae Icthalurus dugesi 3 (3301) 
Estado de México Canal Santiago 
Tiacaque 
Goodeidae Girardinichthys multirradiatus 2 (5082) 
Total 4 9 4 10 14 61 
Figura 1. Características morfométricas de P. brevis (A) Perfil de la hilera de ganchos medidos de la proboscis. 
Para este estudio se consideraron dos hileras: dorsal (d) y ventral (v). En la figura (B) se ilustra el perfil del gancho 
y el método para la obtención de las dos medidas: longitud de la hoja del gancho (L) y la anchura de la base (a). 
A B 
d v 
L 
a 
 15 
V.III. Obtención de ADN genómico 
Los organismos preservados en etanol absoluto se colocaron en una solución de 
digestión que contenía 100 µl de la mezcla (10mM Tris HCl pH 7.6, 20 mM NaCl, 100 mM 
Na2 EDTA (pH 8.0), 0.1mg/ml de Proteinasa K y Agua inyectable. Posteriormente la 
solución con el tejido se incubó a 56 ºC durante toda la noche. Finalmente el DNA fue 
 aislado usando un kit de extracción de DNA (QIAGEN, DNeasy, Texas, USA) y 
resuspendido en 25 µl de agua inyectable. 
 
V.IV. Amplificación y purificación de los productos de PCR del gen Cox 1 
 La amplificación del gen mitocondrial Cox1 se llevó al cabo por reacción de PCR. 
La mezcla de reacción de PCR tuvo un volumen final de 25 µl: 3 µl de DNA genómico; 2.5 
µl de buffer de reacción 10X, 1.5 µl de MgCl2, 0.5 µl de dNTP ́s (Biogenica), 1 µl del 
primer 507 forward (5’- AGTTCTAATCATAARGATATYGG-3́); 1 µl del primer 588 
reverse (3 ́- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-5 ́) (Folmer et al., 1994); 0.2µl de 
la enzima Taq polimersa (Biogenica) y 15.3 µl de agua inyectable. Las muestras se 
incubaron en un termociclador (MJMini BIO RAD Inc) con un programa que consistió de 
un paso inicial de desnaturalización de 94°C por 2 minutos, un período de alineación de 1 
min. a 40°C y un período de extensión a 72°C por 1 minuto, seguido por 35 ciclos. El 
programa se completó con un período de extensión final de 72°C por 5 minutos. Los 
productos amplificados fueron evaluados por electroforesis en un gel de agarosa al 1% 
teñido con bromuro de etidio en un buffer de Tris-Boratos (TBE 1X). Los productos de 
PCR se purificaron usando columnas con SEPHADEX (GE Healthcare Ilustra™). 
 
V.V. Secuenciación de la región del gen Cox1 
La reacción de secuenciación de los productos de PCR contenía una mezcla de 
reacción: 3 µl de buffer, 1 µl del primer, 2 µl Big Dye (ABI PRISM® TERMINATOR 
v3.1), 3 µl de agua inyectable y 1 µl de DNA para un volumen final de 10 µl. Finalmente, la 
reacción de secuenciación se realizó en un secuenciador automático marca Perkin Elmer 
modelo 310. La herramienta BLASTn del NCBI, confirmó la amplificación del gen 
mitocondrial Cox1 en todos los individuos. 
 
 16 
V.VI. Alineamiento múltiple y análisis filogenéticos 
 Basado en 55 secuencias nucleotíticas de la región del Cox1 de las poblaciones de 
Polymorphus brevis, en donde 33 secuencias corresponden a cistacantos, 17 adultos, cinco 
secuencias obtenidas de la base de datos del GenBank que corresponden a dos secuencias 
de adultos de P. brevis y tres secuencias usadas como grupo externo (dos de Southwellina 
hispida y una de Hexaglandula corynosoma) (Cuadro 6), se realizó un alineamiento 
múltiple a través del programa Geneious Pro versión 5.1.4 (Drummond et al., 2011), 
aplicando la extensión con el programa MUSCLE (Edgar, 2004), evaluando estadísticos 
estrictos de alineación, más una revaluación manual a ojo, generando una base de datos de 
702 pb. La reconstrucción filogenética se realizó con el método de inferencia bayesiana 
usando el programa MrBayes (Huelsenbeck y Ronquist, 2001; 2005), con los siguientes 
parámetros: corridas de dos cadenas de Markov para 20, 000,000 de generaciones, 
partiendo de un árbol al azar, muestreando cada 1000 generaciones y un burnin de 5000. El 
programa JModelTest (Posada, 2008) se usó para la selección del modelo de tasa de 
sustitución nucleotídica para las tres posiciones de los codones; 1ªposición: TIM3 + G; 2ª 
posición: GTR + G; 3ª posición TIM2 + G, todos analizados con valores máximos de 
verosimilitud, con base en el criterio de Akaike. Dado que los valores de las probabilidades 
posteriores (pp) representan la probabilidad de que un clado sea verdadero, según el modelo 
de sustitución, las hipótesis y los datos (Huelsenbeck et al., 2002), más las consideraciones 
del supuesto de que los valores de pp representan mayor exactitud y frecuentemente más 
significativos que los de boopstrap (Wilcox et al., 2002; Alfaro et al., 2003, Erixon et al., 
2003), se adoptó el criterio de que los clados con pp ≥ 95% son altamente apoyados, 
mientras que los clados con pp menoresa este valor no se sustentan (Pedersen et al., 2007). 
Las distancias genéticas fueron calculadas por medio del programa PAUP (Swofford, 
2002). 
Los resultados filogenéticos en combinación con los resultados de los análisis 
morfológico y morfométrico, se utilizaron para corroborar la hipótesis de que los 
cistacantos de P. brevis corresponden a una misma especie de acantocéfalo con variabilidad 
morfológica intraespecífica. Los árboles obtenidos se analizaron y editaron con el programa 
FigTree (VERSION v1.3.1). 
 17 
Cuadro 6. Secuencias de ejemplares de cistacantos y adultos de P. brevis usadas en el 
estudio filogenético. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estado Localidad Especie huésped 
No. de 
Secuencias 
Michoacán Cupatziro Z. purepechus 3 
 S. multipunctata 2 
 Lago de Camecuaro Z. purepechus 3 
 Las Adjuntas Z. purepechus 1 
 Zacapu N.grandis 4 
 Ch. humboldtianum 3 
 A. robustus 1 
 S. lermae 1 
 Z. quitzeoensis 1 
 Pátzcuaro Ch. estor 2 
 A. robustus 3 
 G. attripinis 1 
 Presa Caltzonzin A. catarinae 6 
 Cuitzeo N. nycticorax (adultos) 12 
Estado de México Canal Santiago Tiacaque G. multiradiatus 1 
 Laguna Salazar G. multiradiatus 1 
Guanajuato Yuriria Egretta caerulea (adultos) 2 
Baja California Norte San Quintín 
Botaurus lentiginosus 
(adultos) 3 
 
 
Secuencias obtenidas de la base de datos del GenBenk (No de acceso 
GenBank) 
Veracruz H. corynosoma (EF467869) Nyctanassa violacea 1 
 S. híspida (EF467867) Tigrisoma mexicanum 1 
Tabasco S. híspida (EF467868) Egretta garzetta 1 
Guerrero P. brevis (adulto) (EF467861), Tetitlán. Egretta thula 1 
Michoacán P. brevis (adulto) (DQ089717), Cuitzeo. N. nycticorax 1 
total 7 14 18 55 
 18 
VI RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Los resultados y discusión del presente trabajo se presentan en el siguiente manuscrito: 
 
Using DNA barcoding to link cystacanths and adults of the acanthocephalan Polymorphus 
brevis in central Mexico 
 
F.J. ALCÁNTAR-ESCALERA*§, M. GARCÍA-VARELA*, E. VÁZQUEZ-
DOMÍNGUEZ†, AND G. PÉREZ-PONCE DE LEÓN* 
* Departamento de Zoología, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de 
México, Ap. Postal 70-153, Ciudad Universitaria, México D.F., C.P. 04510, México. 
§ Posgrado en Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México. 
† Departamento de Ecología de la Biodiversidad, Instituto de Ecología, Universidad 
Nacional Autónoma de México, Ap. Postal 70-275, Ciudad Universitaria, México D.F., 
C.P. 04510, México. 
Correspondence: Gerardo Pérez-Ponce de León, E-mail: ppdleon@ibiologia.unam.mx 
 
Abstract 
In parasitic organisms, particularly helminths, the usage of the mitochondrial cytochrome c 
oxidase subunit I gene as the standard DNA barcoding region for species identification and 
discovery has been very limited. Here, we present an integrated study, based on both DNA 
barcoding and morphological analyses, for acanthocephalans belonging to the genus 
Polymorphus, whose larvae (cystacanths) are commonly found in the mesentery of 
freshwater fishes while adults are found in the intestine of fish-eating birds. The alpha 
taxonomy of parasitic helminths is based on adult morphological traits, and because of that 
 19 
larval forms cannot be identified to species level based on morphology alone. DNA 
barcoding offers an alternative tool for linking larval stages of parasitic organisms to 
known adults. We sequenced cystacanths collected from freshwater fishes in localities 
across central Mexico and adults obtained from fish-eating birds, to determine if they were 
conspecific. In order to corroborate the molecular results, we conducted a morphometric 
analysis with ‘Proboscis profiler’, which is a software tool developed to detect 
heterogeneity in morphologically similar acanthocephalans based on the multivariate 
statistical analysis of proboscis hook dimensions. Both sources of information indicate that 
cystacanths infecting freshwater fishes in central Mexico belong to a single species, P. 
brevis. 
Keywords: Acanthocephala, cytochrome c oxidase sibunit I, endoparasite, Polymorphidae, 
life-cycle. 
 
Introduction 
The diversity and life cycles of parasitic helminths are poorly understood (Poulin & 
Morand 2004). Molecular tools offer an unprecedented opportunity to include new 
components in our discovery and description of parasite biodiversity (Nadler & Pérez-
Ponce de León 2011). This effort has resulted in an increased rate of species discovery, 
proving that the DNA barcoding initiative (Hebert et al. 2003) appears to have broken 
ground for the ‘New Taxonomy’ approach. Recent years have witnessed an increase in the 
use of this approach to uncover helminth parasite diversity or to delineate species (e.g., 
Hansen et al. 2007; Ferri et al. 2009; Oceguera-Figueroa et al. 2010; Locke et al. 2010a, 
2010b; Bergmame et al. 2011). Moszczynska et al. (2009) developed COI PCR primers 
specific for Diplostomatidae (Digenea), suggesting that these sequences are useful for 
 20 
species-level identification of larval stages and to screen samples for cryptic species, which 
are believed to be present in Diplostomum. The authors noted the advantages of molecular 
approaches, including barcoding, for species identification of digeneans, often encountered 
as larval stages that usually can only be identified to genus. These COI primers were used 
by Locke et al (2011) and Caffara et al (2011) to link larvae and adults of digeneans 
(diplostomids and clinostomatids, respectively) in a wide geographic range across northern 
parts of North America. To the best of our knowledge, these are the only published records 
in which DNA barcoding was used to elucidate a parasitic life-cycle by linking larvae with 
adults, although other molecular markers have proven to be useful for such task, e.g., 
Georgieva et al. (2012) and Born-Torrijos et al. (2012). 
 Adult acanthocephalans are endoparasites inhabiting the digestive tract of 
vertebrates, while their larval forms (cystacanths) develop in arthropods. In particular, 
adults of the Polymorphidae are intestinal parasites of marine mammals, fish-eating birds, 
and waterfowl distributed worldwide. The life-cycle typically includes a crustacean 
(amphipod, copepod, or decapod) as an intermediate host and may include fishes, snakes, 
frogs, and toads as a paratenic host (Schmidt 1985). Currently, the family Polymorphidae 
contains 11 genera, with approximately 127 species diagnosed by having a spinose trunk, 
bulbous proboscis, double-walled proboscis receptacle, and from four to six tubular cement 
glands (Schmidt 1973, 1985; Amin 1985; Aznar et al. 2006). The life-cycle of our species 
of interest, Polymorphus brevis has not been elucidated but, apparently, eggs are released 
from the definitive hosts (fish-eating birds) with the feces. Once in the water, eggs are 
eaten by an amphipod that represents the intermediate host, where three larval stages are 
developed (acantor, acanthella and cystacanth). Freshwater fishes and other aquatic 
vertebrates are paratenic hosts that feed upon amphipods and where the cystacanth 
 21 
reencysts. The life-cycle is completed when paratenic hosts are eaten by fish-eating birds 
and the adult parasites establish in the intestine (see Kennedy 2006). 
 Polymorphus brevis was originally described as Arhythmorhynchus by Van Cleave 
(1916) as a parasite of the American bitter bird (Botaurus lentiginosus) in North America. 
The taxonomic position of this species has been unstable for decades; moreover, it has been 
shown, with molecular data, that this species belongs to a clade of polymorphids composed 
by four species, Hexaglandula corynosoma + Ibirhynchus dimorpha and Southwellina 
hispida + Polymorphus brevis (García-Varela et al. 2011, 2012). In Mexico,the 
cystacanths of this species have been found in 15 localities, 13 of them in freshwater bodies 
across central Mexico, while the rest come from northern and southeastern Mexico (García-
Prieto et al. 2010). In all published accounts identification was made solely based on the 
number of hook rows on the proboscis and the number of hooks on each row, although the 
life-cycle has never been experimentally completed and, as a consequence, there was no 
corroboration that these larval forms were in fact conspecific with P. brevis. In terms of 
hosts, cystacanths have been recorded parasitizing the mesentery and body cavity of 23 
species of freshwater fishes, one species of amphibian, and three species of reptiles. 
Likewise, adults have been recorded in five species of fish-eating birds (García-Prieto et al. 
2010). Here, we present data from an ongoing survey we are conducting to complete the 
inventory of the freshwater fish helminth fauna in Mexico. Larval forms are an abundant 
and prevalent component of freshwater fish communities, and our research program is now 
addressing the question of how many helminth species might be found as larval forms in 
that host group. A necessary step is to recognize potential morphospecies among larval 
forms by using conventional morphological traits. Our particular goals in this study are 
twofold: to show that the cystacanths of the acanthocephalan P. brevis, found in their 
 22 
paratenic freshwater fish hosts, exhibit some level of geographic and host-induced 
morphological variation, and to use DNA barcodes to corroborate if larval stages are 
genetically similar and for linking larval stages to know P. brevis adults. 
 
Materials and methods 
Specimen collection 
Cystacanths and adults of P. brevis were collected between May 2009 and July 2010. 
Eighty-five cystacanths were collected from 15 freshwater fish species representing 10 
genera and three families in nine localities of central Mexico. Fish were collected with 
seine nets and electrofishing. Hosts were dissected and all organs were removed from the 
body, placed in Petri dishes with saline 0.65%, and examined under a dissecting 
microscope. Seventeen fish-eating birds (Ardeidae) were collected from four localities of 
Mexico, 12 Nycticorax nycticorax, two Egretta caerulea, and three Botaurus lentiginosus 
(Table 1). Birds were captured with a shotgun, under the collecting permit FAUT 0202 
issued to MGV by the Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales (SEMARNAT). 
Individuals were dissected and the intestinal tract was removed from the body, separately 
placed in Petri dishes with saline 0.75% and examined under a dissecting microscope. 
 Specimens were either preserved in 100% ethanol and stored at 4ºC or kept on 
distilled water at 4ºC overnight to have the proboscis everted, to be finally fixed in 70% 
ethanol. Some specimens were stained with Mayer’s paracarmine, cleared with methyl 
salicylate, and mounted on permanent slides using Canada balsam, for morphological 
assessments. Voucher specimens were deposited in the Colección Nacional de Helmintos 
(CNHE), Instituto de Biología, UNAM, Mexico City, Mexico (Table 2). Museum 
specimens were studied as follows: Cystacanths, P. brevis ex Ictalurus dugesi, Lago de 
 23 
Chapala, Jalisco (3301); ex Girardinychthys multirradiatus, Canal Santiago Tiacaque, 
Estado de México (5082); ex Chirostoma estor, Pátzcuaro, Michoacán (II-183); ex 
Chirostoma humboldtianum, Zacapu, Michoacán (3947); ex Xenotoca variata, Zacapu, 
Michoacán (7829); ex Alloophorus robustus, Zacapu, Michoacán (3953); ex Allootoca 
zacapuensis, Zacapu, Michoacán (7828); ex Zoogonecticus quitzeoensis, Zacapu, 
Michoacán (7829). Some adults and cystacanths identified as P. brevis were prepared for 
scanning electron microscopy (SEM), with the aim of facilitating the observations of the 
anterior trunk spines and hooks of the proboscis. Specimens were washed in phosphate-
buffer (pH 7.3), fixed in hot 4% formalin, post fixed in 1% osmium tetroxide for 1h, 
dehydrated through a graded series of ethyl alcohol, subjected to critical point drying with 
carbon dioxide, and then sputter-coated with gold. They were mounted on metal stubs with 
silver paste, coated with gold and examined in a Hitachi Stereoscan Model S-2469N at 15 
kV. Avian definitive hosts were identified using the field guides of Howell and Webb 
(1995) and the American Ornithologists’ Union (1998). Fishes that served as paratenic 
hosts of cystacanths were identified following Miller et al. (2005). 
Morphometric analysis 
We conducted a detailed morphological analysis to study morphological variation between 
larvae from different fish species and localities across central Mexico. In order to search 
for potential morphometric differences among cystacanths collected from different host 
species, 45 specimens from 10 host species (in three families) obtained from nine localities 
were measured (Tables 1, 2). For this analysis, only cystacanths with the proboscis 
completely everted were considered. Morphometric analysis considered six main 
variables:, body length and width, proboscis length and width, and proboscis receptacle 
length and width. In addition, we measured size of the hooks of the proboscis, considering 
 24 
those extended in the apical (distal), medial and basal (proximal) area, for which two 
additional measurements were taken: hook size along an entire ventral row and hook size 
along an entire dorsal row; each hook was measured following the standard method 
described by Wayland (2010). In total, 750 measured hooks were considered. All 
measurements were expressed in millimeters. A multivariate statistical analysis of 
proboscis hook dimensions was done with the software Acanthocephalan Proboscis Profiler 
(Wayland, 2010), to detect morphological heterogeneity in morphologically similar 
acanthocephalans. 
Amplification and sequencing of DNA 
For molecular work, specimens were digested overnight at 56ºC in a solution containing 10 
mM Tris-HCl (pH 7.6), 20 mM NaCl, 100 mMNa2 EDTA (pH 8.0), 1% Sarkosyl, and 0.1 
mg/ml proteinase K. Genomic DNA of was extracted using the DNeasy Blood & Tissue Kit 
(Qiagen, Inc., California, U.S.A.) following the manufacturer’s instructions. A partial 
fragment of 702 base pairs of COI was amplified using the polymerase chain reaction 
(PCR) with the forward primer 5-AGT TCTAATCATAA(R)GATAT(Y)GG and reverse 5-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA (Folmer et al. 1994). All PCR reactions were 
performed in a final volume of 25 µl, including 1.25 µl 10X PCR buffer, 0.5µl 10mM 
dNTPs mixture (200 µM each), 1.25 µl 50 mM MgCl2, 0.25 µl of each primer (10 pmol), 2 
µl template DNA, 0.125 µl Taq DNA polymerase (0.625 units), and 19.4 µl sterile distilled 
water. The amplification condition consisted of denaturation for 2 min at 94ºC followed by 
35 cycles for 1 min at 94 ºC, annealing of 1 min at 40ºC and an extension for 1 min at 72ºC, 
followed of final extension held at 72 ºC for 5 min to complete elongation. The amplicons 
were purified by filtration using Sephadex™ G50 (GE Healthcare Ilustra™). Sequencing 
 25 
reactions were performed using Big Dye Terminator chemistry and incorporating the same 
primers as those used in PCR and were cleaned by filtration using Sephadex G50. The 
sequenced products were read on an ABI PRISM 3100 automated DNA sequencer (Applied 
Biosystems, Foster City, California). Chromatograms were checked using FinchTV 
(Geospiza Inc., Seattle, Washington) and overlapping fragments were assembled with the 
program BioEdit v.7.0.9 (Hall 1999). All sequences have been deposited in GenBank 
(accession numbers; see Table 2). 
 
Alignments and phylogenetic analyses 
A total of 55 sequences of COI corresponding to 33 cystacanths and 17 adults were 
obtained and readily aligned with other five sequences availablein GenBank (EF467861, 
DQ089717, EF467868, EF467867 and EF467869), corresponding to two adults of P. brevis 
and three that were used as outgroups: two Southwellina hispida and one Hexaglandula 
corynosoma, which are the sister taxa of Polymorphus brevis, according to molecular 
phylogenetic analyses (García-Varela & Pérez-Ponce de León 2008; Guillén-Hernández et 
al. 2008; García-Varela et al. 2011, 2012). The inferred COI protein sequences were 
obtained with Genious Pro v.5.1.4 (Drummond et al. 2011) and its extension to MUSCLE 
v.3.5 (Edgar 2004). A total of 21 haplotypes were found. Sequence divergence was 
estimated through uncorrected pairwise distance ("p") as implemented in PAUP* 4.0b10 
(Swofford 2002). MrBayes v3.0b4 (Huelsenbeck & Ronquist 2001, 2005) was used for the 
Bayesian analysis, sampling every 1,000 trees over 20,000,000 generations and burn-in of 
5,000. JModelTest (Posada 2008) was used to obtain the best model for the three codon 
position: 1st position: TIM3 + G; 2nd position: GTR + G; 3rd position: TIM2 + G, all 
analyzed through maximum likelihood under the Akaike criterion. Posterior probability 
 26 
values for clade support were obtained as estimated with MrBayes. 
 
Results 
Morphological and morphometric data 
Cystacanths of P. brevis exhibit some morphological variability and, in fact, some 
individuals show a slight development of the reproductive organs. Considering the 45 
specimens from different host species and localities measured in this study, results show 
that total length varied from 0.79 to 2.15 and total width from 0.38 to 0.89. Morphological 
results show that specimens have an ovoid proboscis with the maximum width found in the 
middle level, which is separated from the trunk by a relatively long neck and is armed with 
17 to 19 longitudinal rows of hooks (commonly 18), with 9 to 14 hooks per row 
(commonly 12-13) (Fig. 1). The anterior third of the trunk is armed with a single field of 
tegumental spines, which are hook or triangular-shaped if observed in lateral and frontal 
views, respectively (Fig. 1). The proboscis receptacle is double-walled, 0.68 to 1.57 long 
by 0.14 to 0.94 wide. Lemnisci extend along the anterior half of the trunk, reaching or 
slightly surpassing the end of the proboscis receptacle. Finally, in some specimens a male 
gonadal primordium is present; when present, testes are located in the middle region of 
body, next to the end of the proboscis receptacle. The measurements of the proboscis 
hooks showed wide variability: distal (apical) hooks 0.21-0.61 long, 0.007-0.20 wide; 
medial hooks 0.012-0.054 long, 0.05-0.035 wide; proximal hooks 0.017-0.061 long, 0.05-
0.016 wide. 
 Data for the multivariate statistical analysis of proboscis hook dimensions were 
standardized following the procedure described in Wayland (2010) and were compared 
considering the host family from which cystacanths were collected (Atherinopsidae, 
 27 
Goodeidae, Ictaluridae) with respect to hook length and width. Data showed no 
heterogeneity, indicating an overlap in hook size among individuals (Fig. 2). This result 
was further corroborated by performing a Principal Component Analysis (PCA), with PC1 
accounting for 65% and PC2 for 16% of the variation of the data set (Fig. 3). No groupings 
were found among individuals, a result that suggests there are no different morphospecies. 
Molecular analysis 
Cytochrome c oxidase subunit I gene sequences were obtained for 33 cystacanths and 19 
adults of P. brevis, from 11 and four host species, respectively. Bayesian inference showed 
that all samples nested together, forming a monophyletic group with 100% posterior 
probability support (Fig. 4). Southwellina hispida is the sister taxa of P. brevis, while H. 
corynosoma is at the basal position of the phylogenetic tree. The tree topology showed no 
congruence with respect to host groups or geographic distribution, i.e., no sequences 
belonging to particular host species (or even families), or particular localities, were nested 
together (Fig. 4). In addition to reciprocal monophyly of all sequences allegedly belonging 
to P. brevis, either as cystacanths or as adults, uncorrected pairwise “p” distances showed 
markedly low levels of genetic divergence: it varied among cystacanths from 0 to 1.6%, 
and 0 to 1.5% between cystacanths and adults. Also, genetic divergence between 
cystacanths and adults of P. brevis and S. hispida ranged from 21.6 to 24.1%, while 
divergence with respect to H. corynosoma ranged from 31.3 to 32.4% (see Table 3). 
 
Discussion 
In this study we initially conducted a morphometric analysis of Polymorphus brevis to 
evaluate potential morphological differences among larval forms due to host-induced 
morphological variability, considering that their cystacanths are found in a wide array of 
 28 
hosts and localities across central Mexico, and that all larval forms are potentially P. brevis. 
We followed the assumption made by Wayland (2010) that, because of the limited number 
of taxonomically informative characters in acanthocephalans, morphometric differences in 
size and shape of the proboscis hooks, which are not uniform among species or even among 
individuals of the same population, will have a potential taxonomic value. However, our 
results (meristogram and PCA; Figs. 2A, B, 3) did not show morphometric differences 
between hook length and width. 
 Morphological results were corroborated with the phylogenetic analyses, which 
revealed conspecificity for the P. brevis cystacanths. COI sequences exhibited very low 
intraspecific genetic divergence between larvae and adults and low uncorrected pairwise 
“p” distances, which ranged from 0 to 1.5% in comparison with the interespecific values 
(21.6 to 24.1% with respect to S. hispida and 31.3 to 32.4% with H. corynosoma). Similar 
COI divergence levels (0.05 to 1.5%) were found among isolates of H. corynosoma that 
included both cystacanths collected from the decapod crustacean Uca spinicarpa and adults 
from the yellow-crowned night herons, Nyctanacea violacea (Guillén-Hernández et al. 
2008). COI sequence divergence among adults obtained from fish-eating birds (herons, 
pelicans, cormorants, and anhingas) from 12 localities in Mexico, and cystacanths from 
paratenic hosts (cichlids) of S. hispida, the sister species of P. brevis, reached similar 
divergence values (0-1%) (García-Varela et al. 2012). 
 Criscione et al. (2005) suggest that one of the three key uses of molecular markers 
is linking morphologically indistinguishable life stages to adult stages of known species. In 
accordance, the present study represents a first step in the elucidation of the life-cycle of the 
acanthocephalan P. brevis, as COI sequences were used to link the adults found in the 
intestine of fish-eating birds and the cystacanths found in the body cavity and mesentery of 
 29 
freshwater fishes that act as paratenic hosts. Several studies have successfully followed a 
DNA barcode approach to link larval forms and adults with the consequent elucidation of 
life cycles of certain species of helminths, particularly digeneans (e.g., Caffara et al. 2011; 
Locke et al. 2011). Indeed, Benesh et al. (2006) and Moszczynska et al. (2009) have 
argued about the challenges of barcoding parasitic helminths and concluded that even with 
imperfectly universal primers, the standard region of COI is a practical target for barcoding, 
at least for digeneans. The results we obtained herein clearly indicate that COI is also 
useful in acanthocephalans, supporting the advantages of using mitochondrial genes in 
prospecting for cryptic species and the consequent species delimitation among genetic 
lineages (see Blouin 2002 and Vilas et al. 2005), and in elucidating aspects of the host-
parasite interaction (Steinauer et al. 2007). 
 Our study greatly contributes with the descriptionof freshwater fish helminth 
parasite biodiversity in Mexico, where such inventory, as conventionally understood, i.e., 
following a traditional taxonomic approach, is nearing completion for most helminth 
groups as suggested by Pérez-Ponce de León & Choudhury (2010). Linking larval stages 
found in freshwater fishes with adults that usually parasitize other aquatic and terrestrial 
vertebrates, most commonly fish-eating birds, enhances our opportunity to accurately 
describe freshwater fish helminth parasite biodiversity, as well as our understanding of the 
historical biogeography of the host parasite association in a transitional biogeographical 
area (see Pérez-Ponce de León & Choudhury 2005). Our study also contributes to the COI 
library of acanthocephalans. The advantages of using a DNA barcoding approach to enable 
species identification, recognition, and discovery have been recently reviewed for several 
metazoan taxa (e.g. Derycke et al. 2010; Bucklin et al. 2011), whereas Locke et al. (2011) 
pointed out that the development of a library of COI sequences will be a valuable resource 
 30 
for better understanding the life cycles and intermediate and definitive host spectra for 
helminths across large spatial scales, and a broad variety of host taxa.. For parasitic 
helminths, the potential uses of this tool are still in its initial stages, and the present study 
further support those research projects that have used DNA barcodes to link larval forms 
with adults, contributing to the elucidation of parasite life cycles. 
 
Acknowledgements 
We are grateful to Andrés Martínez, David Hernández, Berenit Mendoza, Rogelio Aguilar, 
Rodolfo Pérez and Rosario Briosio for their help during field-work. Andrés Martínez 
kindly provided some specimens for sequencing. We also thank Luis García Prieto for 
providing specimens deposited at the CNHE, Laura Marquez for her help with sequencing, 
and Berenit Mendoza Garfias for her help with the SEM micrographs. This research was 
supported by grants from the Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Inovación 
Tecnológica (PAPIIT) IN207213 and IN202111 to MGV and GPPL, respectively, and the 
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) 83043 and 179048 to GPPL and 
MGV, respectively. FJAE thanks the support of the Programa de Posgrado en Ciencias 
Biológicas, Universidad Nacional Autónoma de México to complete his MSc degree, and 
to CONACyT for granting a scholarship. This work is part of the fulfillment of the first 
author to complete his MSc program. 
 
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