Caracterizacion-polifasica-de-17-cepas-bacterianas-del-laboratorio-de-bacteriologa-de-la-FESI

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
 
 
 
 
 
“Caracterización polifásica de 17 cepas 
bacterianas del Laboratorio de Bacteriología 
de la FESI” 
 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE 
 
BIÓLOGO 
 
 
PRESENTA 
 
LUIS ENRIQUE RUÍZ MOLINA 
 
 
DIRECTOR DE TESIS 
 
M. en C. ALEJANDRO CRUZ MONSALVO REYES 
 
 
 
 
 Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México, 2016 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 2 
Índice 
 
1. ÍNDICE 
………………………………………………………………………..………………………………
…. 2 
 
2. DEDICATORIA 
……………………………………………………….……….…………………………… 6 
 
3. AGRADECIMIENTOS 
…………………………………………..…………….………………………. 7 
 
4. RESUMEN 
……………………………………………………………………………………………………. 8 
 
5. INTRODUCCIÓN 
………………………………………………………………………………………… 9 
 
6. MARCO TEÓRICO 
………………………………………………..……….…………………………… 11 
 
 6.1 MICROBIOLOGÍA E IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS … 11 
 6.2 BACTERIAS 
………………………………………………………………………............................. 13 
 6.2.1 MORFOLOGÍA 
…………………………………………………………………........................... 14 
 6.2.2 CLASIFICACIÓN 
………………………………………………………………......................... 15 
 6.3 ENFERMEDADES INFECCIOSAS EN HUMANOS ……………….…………….. 18 
 6.3.1 MEDIOS DE CULTIVO 
………………………………………..………………………………… 21 
 6.3.2 PRUEBAS BIOQUÍMICAS 
…………………………………………...………………………. 22 
 3 
 6.3.2.1 GRAM 
……………………………………………………….…………………………………………. 23 
 6.3.2.2 OF Y PRODUCCIÓN DE ÁCIDO 
………………………………………………………. 23 
 6.3.2.3 UREASA 
……………………………………………………………..……………………………….. 24 
 6.3.2.4 CATALASA 
…………………………………………………..…………………………………….. 25 
 6.3.2.5 OXIDASA 
……………………………………………..………………….………………………….. 25 
 6.3.2.6 MOVILIDAD 
…………………………………………………………................................... 25 
 6.3.2.7 INDOL 
…………………………………………………………..……………………………………. 26 
 6.3.2.8 PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIDRÓGENO …………..…………….. 26 
 6.4 CEPARIOS Y COLECCIONES DE CULTIVOS …………………………….………. 
28 
 6.5 BIOLOGÍA MOLECULAR 
…………………………………….……………………………….. 28 
 6.5.1 PCR 
………………………………………………………………………………………………………… 
28 
 6.5.2 SECUENCIACIÓN 
……………………………………………………………....................... 30 
 6.5.3 CARACTERIZACIÓN Y ESTUDIOS POLIFÁSICOS ……….………………… 31 
 
7. JUSTIFICACIÓN 
………………………………………………………………………………………….. 31 
 
8. OBJETIVOS 
…………………………………………………………………………………………………… 32 
 
9. MATERIALES Y MÉTODOS 
……………………………………………………………………….. 33 
 4 
 
 9.1 ACTIVACIÓN DE LAS CEPAS 
……………………………….……………………………….. 33 
 9.2 REVISIÓN DE LA MORFOLOGÍA COLONIAL ……………………….……………. 34 
 9.3 REVISIÓN DE LA MORFOLOGÍA CELULAR ………………..…………………….. 35 
 9.4 PRUEBAS BIOQUÍMICAS TRADICIONALES ……………………………............ 36 
 9.5 PRUEBAS BIOQUÍMICAS MINIATURIZADAS …………………………..………. 36 
 9.6 EXTRACCIÓN DE DNA 
…………………………………………………………………………. 38 
 9.7 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ………………………. 38 
 9.8 SECUENCIACIÓN 
………………………………………………………………………………….. 41 
 9.9 EDICIÓN DE SECUENCIAS Y CONSTRUCCIÓN DE DENDROGRAMA … 42 
 
10. RESULTADOS 
………………………..………………………………………………………………….. 43 
 
11. 
DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………………
………. 61 
 
12. 
CONCLUSIONES……………………………………………………………………………………
….. 65 
 
13. 
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………
……. 67 
 
14. 
ANEXO………………………………………………………………………………………………
……….. 70 
 14.1 CONDICIONES MÍNIMAS REQUERIDAS PARA INGRESAR Y 
 REGISTRAR UNA CEPA BACTERIANA AL CEPARIO DE LA FESI… 70 
 5 
 14.2 DESCRIPCIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS CLÁSICAS………. 71 
 14.3 EJEMPLO DE UN ELECTROFEROGRAMA……………………………….......... 75 
14.4 IMÁGENES DE UNA CARTA DE COLOR Y UNA HOJA DE REGISTRO 
 DEL KIT MINIATURIZADO DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANIS- 
 MOS BBL 
Crystal…………………………………………………………………......................... 76 
14.5 DENDROGRAMAS POR GÉNERO………………………………………………………… 
77 
15. GLOSARIO DE ABREVIATURAS ……………………………………………………………. 
79 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
 
 
 
 
Índice de tablas y figuras 
 
Tabla 
1……………………………………………………………………………………… 
39 
Tabla 
2…………………………………………………………………………………….. 
40 
Tabla 
3…………………………………………………………………………………….. 
45 
Tabla 
4……………………………………………………………………………………. 
47 
Tabla 
5…………………………………………………………………………………….. 
54 
Tabla 
6……………………………………………………………………………………. 
55 
Tabla 
7…………………………………………………………………………………….. 
56 
 7 
Tabla 
8……………………………………………………………………………………. 
59 
Figura 
1…………………………………………………………………………………….14 
Figura 
2……………………………………………………………………………………29 
Figura 
3……………………………………………………………………………………48 
Figura 
4……………………………………………………………………………………49 
Figura 
5…………………………………………………………………………………….50 
Figura 
6…………………………………………………………………………………….51 
Figura 
7…………………………………………………………………………………….51 
Figura 
8…………………………………………………………………………………….51 
Figura 
9…………………………………………………………………………………….51 
Figura 
10…………………………………………………………………………………..52 
Figura 
11……………………………………………………………………………………5
2 
Figura 
12…………………………………………………………………………………..53 
 8 
Figura 
13…………………………………………………………………………………..53 
Figura 
14………………………………………………………………………………….53 
Figura 
15…………………………………………………………………………………..60 
Figura 
16…………………………………………………………………………………..72 
2. DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
 
 
 
 
 
 
3. AGRADECIMIENTOS 
 10 
4. RESUMEN 
 
 La diversidad microbiológica, particularmente en bacterias, es tan 
diversa como los mismos ecosistemas en donde se encuentran, por lo que 
la determinación de estos organismos a dado pie a discusiones en la 
cuestión taxonómica, lo que dificulta su caracterización, clasificación y 
nomenclatura. El presente trabajo evaluó un espectro de métodos utilizados 
para caracterizar fenotípicamente y genotípicamente la clasificación de 
estos organismos procariotas. La caracterización polifásica pretende evaluar 
la diversidad morfológica, metabólica y genética, es decir, a diferentes fases 
y su comparación. Se realizaron caracterizaciones de morfología colonial, 
bioquímicas, pruebas miniaturizadas BBL crystal, microscopia óptica, 
microscopia de barrido y caracterización molecular que incluye extracción 
de DNA, amplificación de la región 16s rRNA por PCR y secuenciación y 
análisis de la misma. Se identificaron los géneros Bordetella, Moraxella, 
Acinetobacter y Micrococcus. El uso de microscopia electrónica de barrido 
pudo determinar características de los cocobacilos. La región 16S rRNA es 
crucial en sistemática bacteriana, aunque también es importante analizar 
otros marcadores moleculares para diferentes grupos bacterianos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
5. INTRODUCCIÓN 
 
 Las bacterias son microorganismos procariotas que están presentes en 
donde existan un mínimo de condiciones que permitan la vida, incluso en 
los hielos polares y los abismos submarinos. La gran mayoría de las 
bacterias no representan ningún riesgo para los animales, incluyendo al 
humano, pero algunas otras son capaces de provocar enfermedades 
potencialmente mortales. El cuerpo humano está habitado por una gran 
cantidad de especies de bacterias diferentes, tanto de manera ocasionalcomo de forma permanente (Murray et. al., 2013). 
 
 Los laboratorios de microbiología que trabajan con muestras clínicas de 
bacterias tienen como función principal realizar determinaciones de 
muestras de origen humano destinadas tanto a la promoción de la salud 
como al diagnóstico, evolución y tratamiento de las enfermedades (Alados 
et. al., 2009). Estos laboratorios frecuentemente albergan colecciones de 
cultivos denominadas “ceparios” que son almacenes de microorganismos, 
ya sean bacterias, hongos, virus o parásitos, así como parte y producto de 
ellos; ácidos nucleicos, proteínas o toxinas. La principal utilidad de éstas 
colecciones microbianas es el diagnóstico médico y la investigación 
(Robles, 2014). 
 
 Durante la última década, el diagnóstico rápido y confiable de los 
agentes causantes de enfermedades infecciosas ha comenzado a 
experimentar una revolucionaria transformación. El uso de técnicas 
microbiológicas convencionales, que requieren el crecimiento de los 
microorganismos, ha pasado a ser complementada con la aplicación de 
métodos moleculares de diagnóstico (Méndez-Álvarez y Pérez-Roth, 2003). 
Es evidente que aislar y caracterizar microorganismos no es suficiente, 
 12 
además se tienen que preservar las cepas aisladas de manera que sus 
características fenotípicas y genotípicas permanezcan sin cambios, lo cual 
servirá como referencia futura en nuevas investigaciones (Prakash et. al., 
2012). 
 
 La colección de cultivos microbianos (CCM) juega un papel importante 
en el uso sustentable de los recursos microbianos. También proporcionan el 
material biológico auténtico para investigaciones de alta calidad y de la 
enseñanza en forma de cepas de referencia y reactivos de control de 
calidad entre otros. Los avances en biología molecular han dado como 
resultado el continúo descubrimiento de nuevos taxones microbianos y 
cepas, por lo que existe la necesidad de presérvalos con la finalidad de 
hacerlos accesibles y de utilidad para la investigación, la enseñanza y 
explotación biotecnológica. Es difícil que los laboratorio individuales lleven a 
cabo ambas actividades, el de conservar los microorganismos y realizar su 
investigación propiamente dicha, debido a la falta de apoyo económico y de 
recursos humanos. Esta tarea se convierte en responsabilidad de la 
colección de cultivos microbianos (Sharma y Shouche, 2014). 
 
 Es así como surge la necesidad de establecer y mantener ceparios 
como el de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala (FESI), que cuente 
con material correctamente caracterizado por diferentes procedimientos y 
pueda proporcionar material de referencia y cepas tipo para investigaciones 
y servicios que nos permitan realizar proyectos de docencia en el proceso 
de aprendizaje-enseñanza tanto a nivel licenciatura como de posgrado, así 
como investigaciones de alta calidad. 
 
 
 
 13 
 
 
6. MARCO TEÓRICO 
 
6.1 Microbiología e importancia de los microorganismos 
 
 Los microorganismos desempeñan un papel fundamental para la vida 
en la Tierra, tanto en las actividades humanas como en las del resto de las 
formas de vida. Aunque son los organismos vivos más pequeños, en 
conjunto constituyen la mayor biomasa del planeta y en su ausencia nunca 
habrían podido surgir otras formas de vida ni tampoco mantenerse en la 
actualidad (Madigan et. al., 2009). Los microorganismos también son 
responsables de gran parte de la descomposición y reciclaje natural de 
materia orgánica en el ambiente, algunos sintetizan compuestos 
nitrogenados que contribuyen a la nutrición de otros seres vivos, otros 
contribuyen a la atmósfera al producir oxígeno a través de fotosíntesis 
(Ryan y Ray, 2011). 
 
 La microbiología estudia las células y cómo funcionan, especialmente 
las bacterias ya que éstas constituyen un grupo muy extenso que tiene una 
gran importancia tanto a nivel básico como aplicado. Además ésta misma 
disciplina también se encarga de estudiar la diversidad y la evolución de los 
diferentes tipos de microorganismos por lo tanto es posible decir que la 
microbiología es la base de las ciencias biológicas (Madigan et. al., 2009). 
 
 A pesar de todo el conocimiento en microbiología, ésta disciplina ha 
avanzado más en los últimos 25 años que en el resto de la historia. El uso 
de microorganismos cultivados abrió el camino de la microbiología industrial 
 14 
ya que ellos son la base de la fabricación de pan, vino, cerveza, queso, 
probióticos y la producción de sustancias químicas. Útiles también en el 
campo de la agricultura, contaminación ambiental y biodeterioro. El aspecto 
más negativo y que no se puede dejar de mencionar radica en su posible 
uso como armas biológicas (De la Rosa et. al., 2011). 
 
 Una de las razones más importantes para estudiar a los 
microorganismos es conocer la relación entre ellos y las enfermedades que 
producen y desarrollar formas de controlarlas. Aunque los microorganismos 
rara vez provocan una enfermedad, existen algunos que si lo hacen pero 
son relativamente pocos los grupos de microorganismos con potencial 
patógeno, es decir, con capacidad para enfermar a su hospedero (Murray 
et. al., 2013). 
 
 La microbiología médica data de los estudios de Pasteur y Koch, 
quienes aislaron gérmenes específicos y comprobaron a través del método 
experimental que podían causar enfermedades. Dichos esfuerzos, 
combinados con el trabajo realizado por Semmelweis y Lister condujeron a 
los grandes avances en salud pública que dieron inicio al descenso en las 
enfermedades y la muerte en poblaciones humanas (Ryan y Ray, 2011). 
 
 El término “flora normal” o “microbiota normal” es utilizado para 
describir a los microorganismos que frecuentemente se encuentran en 
diversas partes del cuerpo humano en individuos saludables. Los 
integrantes de la microbiota y el número de organismos representantes de 
ésta microbiota varían de acuerdo al área del cuerpo y a veces dependen 
de factores como la edad o el estado fisiológico. Es posible que los 
organismos de la microbiota normal mantengan una relación simbiótica con 
 15 
el hospedero o que simplemente habiten de manera comensal cuya relación 
con el hospedero es neutra (Ryan y Ray, 2011). 
 
 
Resistencia a los antibióticos 
 
 Las acciones de los antibióticos sobre las bacterias pueden interferir en 
diferentes funciones, tales como la síntesis de sus ácidos nucleicos, de 
proteínas, o para el procesamiento de aminoácidos o azúcares del medio, 
necesarios para la biosíntesis de sus paredes o membranas celulares y 
llegar a producir dos principales efectos: la muerte de la bacteria (agentes 
bactericidas) o sólo inhibir el desarrollo y reproducción del germen, (agentes 
bacteriostáticos) (Mendoza 2011). 
 
 Los organismos sufren variaciones que van determinando la evolución 
de las especies, y quedan consignadas como mutaciones en su genoma. 
Las bacterias pueden ser intrínsecamente resistentes a más de una clase 
de antimicrobiano o pueden tornarse resistencia por mutación de novo o vía 
la adquisición de genes de resistencia de otras bacterias. La mayoría de los 
determinantes de resistencia a antibióticos están codificados en elementos 
genéticos tales como plásmidos, transposones, integrones y paquetes de 
genes (Horcajada y Cantón 2014). 
 
6.2 BACTERIAS 
 
 Los procariotas forman dos dominios evolutivos, Arqueas y Bacterias, la 
mayor parte de los procariotas conocidos pertenecen al dominio Bacterias, 
en éste grupo hay especies patógenas causantes de enfermedades y 
 16 
también hay miles de especies no patógenas, todas ellas conforman una 
gran variedad de morfologías y fisiologías (Madigan et. al., 2009). 
 
 Las bacterias son las células vivientes más pequeñas con un tamaño 
promedio de entre 0.1 y 10 M, tienen una membrana citoplasmática 
rodeada a su vezpor una pared celular constituida por un polímero 
entretejido llamado peptidoglicano que le confiere a la célula una estructura 
rígida (Ryan y Ray, 2011). La célula bacteriana es a veces considerada 
como simple, debido a que carece de estructuras especializadas típicas de 
los eucariotas, sin embargo, a nivel molecular las bacterias utilizan 
estrategias sutiles y sofisticadas que implican un alto grado de organización 
estructural y funcional. Las bacterias de diferentes especies pueden diferir 
en gran medida tanto en su estructura como en su composición química; por 
ésta razón no hay una bacteria típica (Singleton, 2004). 
 
6.2.1 MORFOLOGÍA 
 
 Las bacterias son microorganismos procariotas, es decir, organismos 
unicelulares sencillos que se reproducen por división asexual y que carecen 
de membrana nuclear, mitocondrias, aparato de Golgi y de retículo 
endoplásmico. Poseen una pared celular compleja que puede ser de dos 
tipos, una con una gruesa capa de peptidoglicano y otra con una delgada 
capa de peptidoglicano y una membrana externa (Murray et. al., 2013). Su 
citoplasma sólo contiene ribosomas y un solo cromosoma de DNA de doble 
cadena (Ryan y Ray, 2011). (Ver fig. 1). 
 17 
 
 
De 
acuerdo con estudios de morfología en un contexto evolutivo, es probable 
que los miembros del dominio Bacteria se desarrollaran de un ancestro 
común con forma de bacilo, ya que los linajes más antiguos del árbol 
evolutivo sólo se encuentran organismos con forma de bastón, los cocos 
parecen ser una forma degenerada de los bacilos (Singleton, 2004). 
 
6.2.2 CLASIFICACIÓN Y TAXONOMIA 
 
 Las bacterias son los microorganismos más abundantes de la Tierra, se 
encuentran en todo hábitat. La identificación y agrupación de éstos 
microorganismos es de suma importancia en medicina, ya que la 
determinación de la especie causante de un proceso infeccioso es vital para 
administrar un tratamiento adecuado. Por lo anterior surge la necesidad de 
identificar a los patógenos humanos dando lugar a un gran desarrollo de 
técnicas para la identificación y clasificación de las bacterias (Molina 2010). 
 
 Bou et. al., en el 2011, revisaron de manera concisa los aspectos más 
destacables de los diferentes métodos de identificación bacteriana como 
Figura 1. Morfología general de una bacteria 
(https://www.blinklearning.com/Cursos/c381951_c15374961__Libro_digital.php) 
 18 
son las técnicas fenotípicas, los métodos moleculares y los métodos 
basados en proteómica, todos ellos utilizados en el laboratorio de 
microbiología con el fin de identificar el agente etiológico responsable del 
proceso infeccioso y para conocer las implicaciones 
patogénicas/patológicas, la evolución clínica y aplicar un tratamiento 
antimicrobiano eficaz. Concluyen su estudio manifestando que las técnicas 
fenotípicas permiten lograr la mayoría de los objetivos del trabajo 
microbiológico, sin embargo, muestran algunas limitaciones que son más 
evidentes en algunos microorganismos, pero esas limitaciones pueden 
sortearse con la aplicación de técnicas moleculares. 
 
 La clasificación bacteriana se sustenta en la publicación de la Revista 
Internacional de Bacteriología Sistemática (International Journal of 
Systematic Bacteriology) y el Manual Bergey de Bacteriología Sistemática 
(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology). La palabra “bacteria” se 
implementó para nombrar a todos los microorganismos procariontes 
unicelulares, sin embargo, la evolución molecular ha demostrado que los 
microorganismos procariontes se pueden agrupar en dos dominios, 
conocidos como “Bacteria” y “Archaea”, que evolucionaron de manera 
independiente desde un ancestro común. 
 
 La categoría básica es la “especie”, constituida por los individuos o 
cepas de gran parecido y con características comunes. La similitud de 
ácidos nucleicos homólogos, sobre todo de los RNA ribosómicos, es clave 
para definir la pertenencia a una especie determinada. Una cepa es el 
conjunto de individuos obtenidos en cultivo puro descendientes de un solo 
aislamiento. Un “clon” corresponde a los descendientes de un solo individuo 
por reproducción asexual (De la Rosa et. al., 2011). 
 
 19 
 Hasta hoy no se tiene un concepto ¨natural¨ de especie que sea 
funcional para la mayor parte de organismos, sobre todo para los que 
pertenecen al grupo de los procariontes (bacterias) (Cerritos, 2007). Pese a 
esto los conceptos que más se apegan a las características de las bacterias 
son el fenético que forma grupos de acuerdo con la similitud de una gran 
cantidad de caracteres incluyendo los moleculares, y el genético que surgió 
como una forma de resolver el problema de la aplicabilidad del concepto 
biológico de especie en microorganismos tales como los procariotas. En 
este sentido una especie es definida como un grupo de individuos con 
capacidad de intercambiar información genética por medio de la 
conjugación, transducción o transformación. Con el avance de las técnicas 
de biología molecular se propone que como una manera de reconocer y 
delimitar especies es que aquellas muestras que tengan más del 70% de 
hibridación DNA-DNA serán consideradas como una misma especie. 
 
CLASIFICACIÓN SEGÚN SU FORMA Y AGRUPACIÓN. 
 
 Las células bacterianas varían ampliamente en forma, según sea la 
especie. Las células redondas o esféricas sin importar la especie son 
llamadas “cocos”, por otro lado las células alargadas de cualquier especie 
se denominan “bacilos”. Cabe destacar que no todos los cocos tienen una 
forma esférica perfecta, y no todos los bacilos tienen exactamente dicha 
forma. Las células ovoides de forma intermedia entre cocos y bacilos se 
denominan “cocobacilos” (Singleton, 2004). 
 
Cocos: Incluyen las bacterias cuya forma es esférica u ovoide y 
generalmente son aerobios estrictos. 
 20 
Sarcinas: Son bacterias cocoides que se dividen en tres planos 
perpendiculares para formar paquetes de 8, 16, 32 o más cocos. Son 
anaerobios obligados. 
Estafilococos: Cuando los cocos se reúnen de manera irregular formando 
racimos se conocen como estafilococos. 
Bacilos: Son bacterias que tienen forma de bastoncillo. 
Espirilos: Son bacterias helicoidales con movilidad flagelar que se 
clasifican dentro de las gramnegativas. 
Espiroquetas: Son bacterias filiformes, flexibles, muy largas que presentan 
forma de espiral con diez o más vueltas. En algunas ocasiones con un 
flagelo en cada extremo. 
Esporas bacterianas: Algunos géneros bacterianos tienen la capacidad de 
responder a las condiciones adversas de su microambiente formando una 
estructura de resistencia llamada espora y se conocen como bacterias 
esporuladas (Molina 2010). 
 
6.3 ENFERMEDADES INFECCIOSAS EN HUMANOS 
 
 De las miles de especies de virus, bacterias, hongos y parásitos, sólo 
una mínima parte tienen algún tipo de participación en las enfermedades. 
Estas especies se denominan “patógenas”, y dentro de ellas existen grados 
de peligrosidad llamada “virulencia” la cual frecuentemente dificulta la tarea 
de distinguir entre microorganismos benignos o inofensivos y virulentos 
(Ryan y Ray, 2011). 
 
 Más de 300 especies microbianas relacionadas con el humano ejercen 
directa o indirectamente todo tipo de efectos favorables como la síntesis de 
vitaminas, procesos digestivos, estímulo inmunológico, etc. 
Excepcionalmente, sólo unas pocas especies y bajo determinadas 
 21 
circunstancias, pueden producir enfermedades en los humanos. La 
definición de microbiología en el ámbito de la salud se entiende como la 
ciencia que estudia los microorganismos capaces de producir 
enfermedades, de manera más completa, estudia las relaciones de 
morfología-estructura-composición y función microbiana, así como las 
alteraciones que producen los microbios en el hospedero humano (De la 
Rosa et. al., 2011). 
 
 Cuando un microorganismoinvade un hospedero y se multiplica en sus 
tejidos se establece una “infección”, pero si además a consecuencia de la 
infección el hospedero sufre algún daño o lesión en sus tejidos, se produce 
entonces una “enfermedad”. En el caso de que la infección no produzca 
daño alguno, hablamos de una “colonización”. Las enfermedades 
producidas como consecuencia de infecciones se denominan 
“enfermedades infecciosas” (De la Rosa et. al., 2011). 
Principales grupos bacterianos de interés médico 
 
 La mayoría de las bacterias de interés médico crecen y se multiplican 
bien en medios de cultivo sencillos. Después de sembradas en el medio de 
cultivo, para su multiplicación requieren ser incubadas a una temperatura 
adecuada, generalmente de 37°C. 
 
 En la superficie de los medios de cultivo sólidos a partir de una única 
célula se forman colonias que son agregados bacterianos, visibles 
macroscópicamente, formados por millones de bacterias. 
 
Cocos grampositivos 
 Staphylococcus aureus 
 Staphylococcus epidermidis 
 22 
 Streptococcus pyogenes 
 Streptococcus pneumoniae 
 Enterococcus faecalis 
 
Bacilos grampositivos 
 Corynebacterium diphtheriae 
 Listeria monocytogenes 
 Bacillus anthracis 
 
Cocos gramnegativos 
 Neisseria meningitidis 
 Neisseria gonorrhoeae 
 
Bacilos gramnegativos 
 Escherichia coli 
 Salmonella entérica 
 Shigella dysenteriae 
 Haemophilus influenzae 
 Campylobacter jejuni 
 Vibrio cholerae 
 Pseudomonas aeruginosa 
 
Bacterias anaerobias 
 Bacteroides spp 
 Clostridium spp 
 
Bacterias con características especiales 
 Legionella pneumophila 
 23 
 Treponema pallidum 
 Mycoplasma pneumoniae 
 Chlamydia trachomatis 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6.3.1 MEDIOS DE CULTIVO 
 
 El crecimiento de una célula bacteriana implica el aumento coordinado 
de la masa de sus partes constituyentes, normalmente el crecimiento 
conlleva a la división de una célula en dos células similares o idénticas, de 
ésta manera, cuando se habla de bacterias, el crecimiento y la reproducción 
están estrechamente ligados, y el término “crecimiento” se utiliza 
generalmente para referirse a ambos procesos (Singleton, 2004). 
 
 Al crecimiento bacteriano fuera de su hábitat natural, se le denomina 
“crecimiento en cultivo”. Un cultivo es una población de microorganismos 
que crecen en un medio artificial, y el soporte que permite el crecimiento de 
las bacterias recibe el nombre de “medio de cultivo”. Los medios de cultivo 
son mezclas complejas de sustancias químicas y/o productos naturales 
capaces de sustentar el crecimiento de las bacterias. Dichos medios pueden 
ser líquidos o sólidos (De la Rosa et. al., 2011). 
 
 24 
 Los medios de cultivo sólido son originalmente medios líquidos a los 
que se les añade una sustancia que les permite solidificar y adquirir 
consistencia, tal sustancia es “agar”. Actualmente los medios de cultivo que 
se utilizan en los laboratorios de microbiología clínica, se adquieren ya 
preparados por diversos fabricantes industriales. Existen diversos tipos de 
medios de cultivo: 
 Medios enriquecidos: Contienen la mayoría de factores 
necesarios para el crecimiento de casi todas las bacterias, incluso 
las exigentes. Estos medios suelen contener mezclas complejas de 
productos biológicos, como hidrolizados proteicos especiales de 
tejidos animales, extractos de tejido, sangre, hemoglobina, extracto 
de levadura, suplementos de vitaminas y coenzimas, etc. 
 Medios definidos: Su composición se conoce exactamente por 
estar compuestos de mezclas de sustancias químicas puras. 
 Medios selectivos: se les añaden determinadas sustancias que 
favorecen el crecimiento de unas especies de bacterias e inhiben el 
crecimiento de otras. 
 Medios de enriquecimiento: medios selectivos líquidos, 
especialmente preparados para el desarrollo selectivo de 
determinadas especies bacterianas que pueden estar en pequeñas 
cantidades en algunas muestras. 
 
 
6.3.2 PRUEBAS BIOQUÍMICAS 
 
 Los métodos tradicionales de identificación bacteriana se basan en las 
características fenotípicas de los microorganismos, es decir, las 
características “observables” como son la morfología, el tipo de crecimiento 
en un medio específico y propiedades bioquímicas y metabólicas. Para 
 25 
lograr su objetivo, los laboratorios microbiológicos recurren muy 
frecuentemente al cultivo de microorganismos porque permite el aislamiento 
del organismo en estudio y de esa forma se puede medir su sensibilidad a 
los antimicrobianos, entre otras características (Olmos, et., al. 2010). 
 
 En ningún caso, los métodos de identificación fenotípica, como lo son 
las pruebas bioquímicas, proporcionan una certeza absoluta sobre el género 
o la especie a la que pertenece un microorganismo, únicamente indican a 
cuál tiene mayor probabilidad de pertenecer, es decir, con que género o 
especie se encuentra más relacionado de acuerdo con sus características 
previamente observadas (Olmos, et., al. 2010). 
 
6.3.2.1 GRAM 
 
 Cuando se inventaron los primeros microscopios, surgió la necesidad 
de descubrir como teñir los tejidos para poder observar con claridad sus 
características morfológicas, ya que la mayoría de las células no 
fotosintéticas son incoloras. Se observó que algunos pigmentos como el 
carmín o la eosina se unían a determinados componentes de las células 
(Megías et. al., 2016). 
La tinción de Gram es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza 
dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos; 
Grampositivas y Gramnegativas. 
 
 Los principios de la tinción de Gram están basados en las 
características de la pared celular, las bacterias Gramnegativas poseen una 
pared celular constituida por una fina capa de peptidoglicano y una 
membrana celular externa, mientras que las bacterias Grampositivas 
poseen una pared celular gruesa formada de igual manera por 
 26 
peptidoglicano pero no cuentan con membrana celular externa. De esta 
manera la composición química y el contenido de peptidoglicano en la pared 
celular de ambos tipos de células determina las características tintoriales 
(López-Jácome, et. al., 2013). 
 
6.3.2.2 OXIDACIÓN – FERMENTACIÓN (OF) Y PRODUCCIÓN DE ÁCIDO 
 
 También conocida como prueba de Hugh y Leifson, sirve para 
determinar el tipo de metabolismo que emplea un determinado organismo, 
oxidativo (respiratorio) o fermentativo, de acuerdo a la utilización de un 
carbohidrato determinado que generalmente es glucosa. 
 
 La prueba se realiza en 2 tubos por muestra, los cuales contienen 
medio peptona-agar, el cual ya debe incluir el carbohidrato elegido y azul de 
bromotimol como indicador de pH, el cual colorea el medio de verde si se 
encuentra en el valor 7. Al inocular el medio (en ambos tubos) uno de ellos 
se recubre con parafina o aceite mineral para evitar que los 
microorganismos tengan contacto con el oxÍgeno ambiental. 
 
 Después de un periodo de incubación, se examinan los tubos para 
verificar la utilización del carbohidrato que se manifestará con la producción 
de ácido, indicada por el color amarillento del indicador de pH. Los 
organismos respiradores propician el viraje a color amarillo solamente en el 
medio cubierto con aceite mineral (Singleton, 2004). 
 
6.3.2.3 UREASA 
 
 Las ureasas son enzimas que hidrolizan urea a dióxido de carbono y 
amonio. La producción de ureasa se puede detectar mediante su cultivo en 
 27 
medio tamponado con fosfato que debe contener glucosa, peptona, urea y 
rojo fenol como indicador de pH el cual se mantiene amarillo en valores 
cercanos a 7 y rojo en valores cercanos a 8. 
 Cuando las bacterias crecen en este medio, las cepas que son ureasa 
positivas liberan amonio, el cual eleva el pH y da lugar al cambio de color 
del indicador a rojo (Singleton, 2004).6.3.2.4 CATALASA 
 
 La catalasa es una enzima que contiene hierro entre sus componentes 
y cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y 
oxígeno. Esta enzima es sintetizada por la mayoría de las bacterias 
aerobias ya que durante el metabolismo aerobio es cuando se lleva a cabo 
la destoxificación del peroxido de hidrógeno. La bacteria en cuestión se 
expone al peróxido de hidrógeno y la aparición de burbujas de oxígeno 
indican la presencia de catalasa (Singleton, 2004). 
 
6.3.2.5 OXIDASA 
 
 Esta prueba se diseño con la finalidad de detectar el tipo de cadena 
respiratoria que contiene un citocromo c terminal y que está asociado a la 
oxidasa. Las bacterias que poseen esta cadena respiratoria pueden oxidar 
productos químicos como el reactivo de Kovacs. El reactivo desarrolla un 
intenso color violeta cuando se oxida debido a que los electrones se 
transfieren sucesivamente desde este reactivo hasta el citocromo c y luego 
hasta el oxígeno a través de la oxidasa (Singleton, 2004). 
 
6.3.2.6 MOVILIDAD 
 
 28 
 Frecuentemente es posible determinar la movilidad de las bacterias 
mediante la observación en microscopio óptico a través de una preparación 
llamada “gota pendiente”, la cual se logra colocando una gota de cultivo que 
contenga bacterias vivas sin teñir en un cubreobjetos, el cual se colocará de 
manera invertida sobre un portaobjetos sin que la gota toque a éste último, 
para ello se colocan pequeñas porciones de plastilina entre ambos cristales 
para generar el espacio adecuado. 
 
 Existe un tipo de movimiento llamado “movimiento Browniano” que no 
debe ser confundido con la movilidad generada por las estructuras 
celulares, este movimiento son pequeños desplazamientos al azar que 
presenta cualquier partícula pequeña cuando se encuentra suspendida 
libremente en un medio líquido, estos movimientos se deben al bombardeo 
de las partículas por moléculas del líquido. 
 
 A veces la movilidad también se puede apreciar en la forma en que 
crecen los organismos en un medio sólido, las especies móviles pueden 
tender a propagarse hacia fuera del área inoculada del medio sólido, 
abriéndose paso a través de él y dejando la marca de su movimiento con 
miles de organismos que se encuentran presentes en la dirección recorrida 
(Singleton, 2004). 
 
6.3.2.7 INDOL 
 
 Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo 
bacteriano. Dicha liberación se debe a la degradación del aminoácidos 
triptófano mediante la enzima triptofanasa. 
Para la realización de esta prueba la bacteria se cultiva durante 24-48 horas 
en un caldo de triptona con NaCl al 0.5% (la triptona presenta abundante 
 29 
triptófano). Para la posterior detección del indol se usa el reactivo de 
Kovacs. El grupo indol generado se combina con el grupo aldehído del p-
dimetilamino benzaldehido del reactivo incorporado y se forma un complejo 
de color rojo (Winn et., al. 2008) 
 
6.3.2.8 PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIGRÓGENO 
 
 Es la capacidad de ciertas especies bacterianas para liberar azufre de 
los aminoácidos que contienen azufre u otros compuestos en forma de H2S 
es una característica importante para su identificación. Los métodos más 
utilizados para la detección de H2S y las fuentes de azufre y los indicadores 
son el medio SIM y el medio KIA. Todos los sistemas de detección de H2S, 
el parámetro es un sulfuro insoluble de un metal pesado, que produce un 
precipitado negro en el medio (Winn et., al. 2008). 
 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS MINIATURIZADAS, BBL CRYSTAL 
 
 El sistema de identificación BBL Crystal E/NF (Becton Dickinson 
Microbiology Systems, Sparks, MD) es un método de identificación 
miniaturizado que utiliza sustratos convencionales y cromogénicos 
modificados. Se utiliza para la identificación de bacterias gramnegativas 
aerobias clínicamente importantes que pertenecen a la familia de las 
enterobacterias y algunos de los bacilos gramnegativos fermentadores de la 
glucosa y no fermentadores de origen humano aislados con mayor 
frecuencia. Las pruebas utilizadas en el sistema Crystal incluyen 
fermentación, oxidación, degradación e hidrólisis de distintos sustratos, que 
comprenden sustratos ligados a cromógenos. 
 Luego de la inoculación, los paneles se incuban de arriba hacia abajo 
en una estufa de incubación, con una humedad del 40-60% durante 18 a 20 
 30 
horas a 35 a 37 C. después de la incubación, los paneles se leen de arriba 
hacia abajo, se examinan las celdas para observar cambios de color y se 
genera un número de perfil de 10 dígitos. 
 
 
 
 
6.4 CEPARIOS Y COLECCIONES DE CULTIVOS 
 
 García-Lozano y sus colaboradores de la Fundación Instituto 
Valenciano de Oncología en Valencia España, en el año 2013, expusieron 
la importancia que tiene la creación de colecciones de microorganismos 
(ceparios), a partir de muestras de origen humano, con el objetivo de 
obtener información útil para el desarrollo de nuevas tecnologías en la 
investigación biomédica. 
 
6.5 BIOLOGÍA MOLECULAR 
 
6.5.1 PCR 
 
 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) 
es unan reacción enzimática que amplifica millones de veces una secuencia 
específica de DNA. Para ello se utiliza la enzima DNA polimerasa que tiene 
la capacidad de sintetizar naturalmente el DNA en las células. 
Los elementos importantes para la reacción son la cadena molde, la enzima 
polimerasa, los oligonucleótidos, los desoxirribonucleótidos trifosfatados 
(dNTPs), el ión magnesio (Mg +), una solución amortiguadora y H2O. Todos 
los elementos anteriores interactúan en tres etapas principales de la PCR 
que son: desnaturalización, hibridación y extensión (Tamay de Dios, 2013). 
 31 
 
 
Figura 2. Etapas de la técnica de PCR 
 
 
 32 
6.5.2 SECUENCIACIÓN 
 
 Se refiere al orden consecutivo de los nucleótidos de una cadena de 
DNA o de RNA. Para llevar a cabo la secuenciación se emplean fragmentos 
cortos (generalmente de 10 a 20 nucleótidos) de DNA con una secuencia 
definida los cuales reciben el nombre de “primers”, oligonucleótidos, 
iniciadores o cebadores. 
Dichos cebadores se utilizan para dar inicio a la síntesis de cadenas nuevas 
de ácidos nucleicos. 
 
 En la actualidad la mayoría de las secuencias se realizan por el método 
de didesoxi diseñado por Fres Sanger que consiste en generar fragmentos 
de DNA de diferentes longitudes que están marcados con radioactividad o 
con un pigmento fluorescente. Las demandas en proyectos de investigación 
que involucran secuenciación a gran escala han promovido el desarrollo de 
sistemas de secuenciación automatizada del DNA, éstos sistemas 
automatizados siguen basándose en el método didesoxi de Sanger pero los 
cebadores o primers están marcados únicamente con pigmentos 
fluorescentes en lugar de radioactivos. 
 
 Los productos se separan por electroforesis y las bandas se detectan 
por espectroscopia de fluorescencia, de ésta manera las cuatro reacciones 
correspondientes a los cuatro nucleótidos involucrados se pueden correr en 
una misma reacción y cada una de ellas es escaneada por un láser de 
detección de fluorescencia, así los resultados son analizados por un 
ordenador que genera una secuencia en la que cada una de las cuatro 
bases se distingue por un color. A la representación gráfica de la secuencia 
obtenida se le conoce como electroferograma. 
 
 33 
 
6.5.3 CARACTERIZACIÓN Y ESTUDIOS POLIFASICOS 
 
 Para llevar a cabo la identificación de una bacteria generalmente el 
organismo se obtiene de un cultivo puro y después de una serie de 
observaciones, pruebas y ensayos se analiza frente a especies conocidas 
hasta que se encuentra una especie equivalente en cuanto a características 
se refiere. Sin embargo a veces ocurre que las características del 
organismo desconocido no coinciden de manera exactacon las de ninguna 
especie para la cual haya un manual de identificación, existen diversas 
explicaciones para ello como la existencia de una mutación o un plásmido 
que altere o confiera una o varias características típicas del organismo 
(Singleton 2004). 
 
7. JUSTIFICACIÓN 
 
 Los objetivos del trabajo científico con microorganismos pueden ser 
variados y pueden incluir investigaciones medioambientales, taxonómicas, 
de la agricultura y biomédicas, así como la búsqueda de nuevos productos 
que puedan tener valor comercial (Gonzáles S/A). 
 
 Los científicos que solicitan cultivos a las colecciones, esperan que los 
mismos estén correctamente identificados. Si no fuera así, los usuarios 
corren el riesgo de usar en sus investigaciones el microorganismo 
equivocado, provocando pérdida de tiempo, presupuesto y la publicación de 
resultados erróneos (WFCC, 2010). 
 
 Y es por lo anterior que surge la necesidad de hacer depósitos de 
microorganismos en una colección de cultivos, que proporcione servicios de 
 34 
conservación, rápido acceso y la provisión de una cepa de referencia única 
y conservada, con el objetivo de evitar que los científicos requieran llevar a 
cabo constantes procesos de caracterización e identificación al inicio de 
cada nuevo estudio. 
 
 
 
 
8. OBJETIVOS 
 
General: 
 Caracterizar polifásicamente 16 cepas bacterianas que forman parte del 
cepario del Laboratorio de Bacteriología de la FESI. 
Particulares: 
 Aplicar una batería de pruebas bioquímicas a las 16 cepas 
seleccionadas, para su identificación sistemática 
 Llevar a cabo pruebas moleculares (PCR y secuenciación) a las 16 
cepas seleccionadas. 
 Analizar la filogenia por medio del gen 16S rRNA para su identificación 
sistemática de las 16 cepas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35 
9. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Las muestras usadas en el presente estudio fueron proporcionadas por el 
cepario del Laboratorio de Fisiología Vegetal y Bacteriología de la FESI, el 
cual mantiene las cepas bajo una caracterización parcial. Dichas muestras 
fueron obtenidas a su vez de pacientes con infecciones en vías respiratorias 
bajas del Hospital General de México a los cuales se les practicaron lavados 
bronquiales. 
 
9.1 Activación de las cepas bacterianas 
 
 Las 17 cepas que integraron el presente trabajo se encontraban en 
criopreservación a una temperatura de -20°C. La elección de este lote de 
cepas estuvo relacionada directamente con la dificultad que existió en un 
trabajo previo (García, 2015) para identificarlas por medio de los métodos 
bioquímicos convencionales, además son cepas emergentes que fueron 
aisladas en condiciones que, según la literatura, no son comunes. 
 
 Las cepas se identificaron con una clave para cada una de ellas (dicha 
clave está conformada por las iniciales de los nombres de los pacientes de 
los cuales fueron aisladas a través de lavados bronquiales), las cuales se 
presentan a continuación: 
 GHI 
 GLE3 
 VFL 
 GLE5 
 AAA1 
 RRJ1 
 GLE6 
 GMO2 
 CMA 
 BVG 
 AMJ2 
 LGB 
 SRA 
 ZG12 
 36 
 LFS  TSD
 
 Con una asa de siembra se tomó un inóculo directo del criotubo para 
depositarlo en un tubo de ensaye con caldo BHI (Brain heart infusión) 
estéril, los tubos con los respectivos inóculos fueron puestos en baño de 
agitación por 24 horas a 36°C para favorecer el crecimiento de las cepas. 
Una vez que las cepas mostraron crecimiento en el caldo de cultivo fueron 
sembradas en cajas Petri con Agar BHI (Agar preparado con Caldo BHI y 
Agar Agar) y puestas en incubación a 37°C de 24 a 48 horas para propiciar 
el crecimiento de colonias. 
 
9.2 MORFOLOGÍA COLONIAL 
 
 Se hicieron observaciones y tomas fotográficas de las colonias crecidas 
en agar BHI y se llevó un registro de sus principales características 
morfológicas, las cuales son relevantes en el proceso de caracterización de 
las cepas. 
El registro recabó los siguientes datos: 
a) Tamaño (diámetro en mm) 
b) Color 
c) Forma 
d) Superficie 
e) Borde (margen) 
f) Consistencia 
g) Otros detalles 
La consistencia se revisó con el uso de un palillo de madera estéril, 
punzando y revolviendo mesuradamente la colonia. 
 
 
 37 
9.3 MORFOLOGÍA CELULAR 
 
 Se observaron muestras de las 16 cepas en Microscopio Electrónico de 
Barrido (MEB), para visualizar de mejor manera su morfología celular por 
individuo, para lo cual se utilizaron dos procedimientos diferentes para fijar 
las muestras. 
1- Fijación con alcohol 
Se colocaron 200 μl de solución salina fisiológica en un tubo 
Eppendorf para luego seleccionar una colonia bacteriana bien 
formada y disolverla en la solución salina. Posteriormente se 
adicionaron 200 μl de etanol al 70% y se pusieron a incubar durante 
90 minutos. 
Se adicionaron nuevamente 200 μl de Etanol al 70 % y se centrifugó a 
10000 rpm durante 1 minuto, después se decantó el sobrenadante y 
se añadió 1 ml de alcohol al 60% y se puso en incubación durante 90 
minutos y se retiró el sobrenadante. 
Se adicionó 1 ml de etanol al 70% y se centrifugó a 10000 rpm por 1 
minuto y posteriormente se eliminó el sobrenadante dejando 50 μl 
aproximadamente para resuspender la pastilla. Finalmente se 
observó la muestra en el MEB. 
2- Fijación con Glutaraldehido y Cacodilato 
Se colocaron 500 μl de solución salina fisiológica en tubo Eppendorf 
para posteriormente disolver en ella una colonia de bacterias 
previamente seleccionada. Se centrifugó a 10000 rpm por 1 minuto y 
se decantó el sobrenadante, después se adicionaron 500 μl de un 
buffer a pH 7 de glutaraldehido al 2.5% y cacodilato 100μM y se 
incubó durante 4 horas en agitación. Después se centrifugó a 10000 
rpm durante 1 minuto y se desechó el sobrenadante, luego se 
 38 
adicionaron 500 μl de cacodilato 100μM y se centrifugó nuevamente a 
10000 rpm por 1 minuto, se eliminó el sobrenadante. 
Las muestras fueron sometidas a un tren de deshidratación con 
etanol al 50%, 60%, 85% y 96% centrifugando y resuspendiendo 
entre cada concentración. 
 
VISUALIZACIÓN DE LAS MUESTRAS A TRAVES DEL MICROSCOPIO 
ELECTRONICO DE BARRIDO (MEB) 
 
 Después de haber fijado las muestras se recubrieron con iones de Oro 
mediante el uso de una ionizadora Denton Vacum desk IV y se ingresaron al 
MEB JEOL LV 6380 donde se observaron las muestras en un ambiente al 
alto vacío. 
 
9.4 PRUEBAS BIOQUÍMICAS CLÁSICAS 
 
Se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas consideradas básicas 
dentro del proceso de identificación bacteriana: 
 
1.- Tinción de Gram 
2.- Movilidad en gota pendiente 
3.- Prueba de Oxidación – Fermentación 
4.- Ureasa 
5.- Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno e indol y movilidad 
6.- Oxidasa 
7.- Catalasa 
 
9.5 Pruebas bioquímicas miniaturizadas BBL Crystal ID 
 
 39 
 Se utilizaron dos tipos de kits de identificación BBL Crystal ID, para 
Entéricos/no fermentadores y para Gram positivos. 
Ambos kits constaban de los siguientes componentes: 
a) Tapas del panel BBL Crystal, que contienen 30 sustratos 
deshidratados 
b) Bases para las tapas, que contienen 30 pocillos 
c) Tubos con SSF para preparar el inóculo 
 
 El procedimiento a seguir fue el recomendado por el fabricante BD 
Technologies. Con un asa de siembra se tomó una pequeña porción de una 
colonia bien formada para ser suspendida en la solución salina del tubo 
correspondiente hasta lograr que el líquido alcanzara el nivel 3 de la escala 
de Mcfarland. 
 Una vez lista la suspensión, ésta fue vertida en la canaleta de la base 
para rellenar los pocillos en un solo desplazamiento del líquido, 
posteriormente se ubicó la tapa en la dirección correspondiente sobre la 
base y se acoplaron ambas piezas presionando hasta escuchar el crujir de 
los plásticos, señal de que el acoplamiento fue exitoso y los sustratos 
deshidratados fueron inoculados dando piea las reacciones 
correspondientes. 
 El dispositivo fue puesto en una caja petri de cristal de 150 x 25 mm 
con una cama de algodón mojado para generar condiciones de humedad 
dentro de una incubadora a 37ºC por un periodo de 18 a 24 horas. 
 Posteriormente los pocillos fueron examinados a contraluz para 
observar con plenitud los cambios de color que fueron comparados con una 
carta de color (Figura 1). Los cambios de color son el resultado de 
actividades metabólicas de las bacterias y las reacciones se detectan por el 
uso de un indicador de pH en el sustrato del análisis, y los resultados se 
 40 
registraron en una hoja diseñada para tal efecto proporcionada por el 
proveedor del producto. (Figura 2). 
 
 
 
9.6 EXTRACCIÓN DE DNA 
 
 Para llevar a cabo las reacciones de PCR se extrajo y se purificó el 
material genético de los diversos cultivos por medio de la técnica de 
extracción con Fenol-Cloroformo. 
 Se tomó una colonia completa de cada cultivo y se suspendió en 750 µl 
de buffer AP, posteriormente la muestra se agitó a temperatura ambiente en 
un vortex Fisher Scientific a velocidad 4 por 30 minutos. 
 Una vez que la muestra se agitó en vortex, se centrifugó en un equipo 
HERMLE Z200 a 13,000 rpm durante 1 minuto y se obtuvo el sobrenadante, 
luego se limpió la muestra con solución de fenol-cloroformo en una 
proporción volumen-volumen y después se centrifugó por 3 minutos a 
13,000 rpm. Se obtuvo el sobrenadante. 
 A continuación se precipitó la muestra en 1 volumen de isopropanol y 
0.2 de ese volumen de acetato de amonio [10M] se agitó y centrifugó 15 
minutos a 13,000 rpm. 
 El material genético quedó compactado en el fondo del tubo por lo que 
se limpió la muestra con 300μl de etanol al 70% y se centrifugó a 13,000 
rpm durante 2 minutos. Este paso se repitió 2 veces. 
 Finalmente se resuspendió la pastilla en 50 µl de agua destilada estéril. 
 
9.7 REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PARA LA REGIÓN 
16S ribosomal 
 
 41 
OBTENCIÓN DE AMPLICONES A PARTIR DE DNA GENÓMICO 
 
 Una vez que se obtuvo el material genético aislado y purificado se 
procedió a realizar la reacción de PCR para las muestras obtenidas 
agregando los reactivos pertinentes en proporción calculada para una 
muestra de 15µl en cada tubo (Ver Tabla 1.) 
 
REACTIVOS Cantidad en µl 
Buffer 1.5 
MgCl2 0.75 
dNTP´s 0.3 
Primer FD 0.3 
Primer RD 0.3 
Taq Polimerasa 0.2 
H2O 9.15 
Tabla 1. Reactivos para reacción PCR en proporción calculada para 15 
μl. 
 
 Posteriormente los tubos con las muestras y los reactivos ya añadidos 
se ingresaron al termociclador BIORAD T100 para dar comienzo a los ciclos 
de temperatura que propiciaron el trabajo de la enzima Polimerasa y de los 
cebadores incluidos en cada muestra, dichos ciclos son: 
1. 94ºC, 3 min 
2. 94ºC, 1 min 
3. 56ºC, 0.30 min 
4. 72ºC, 2 min 
5. repetir desde el paso número 2, 30 veces 
6. 72ºC, 7 min 
7. 12ºC, ∞ 
 
 42 
 Los productos obtenidos en PCR punto final de aproximadamente 1600 
pb fueron observados en un gel de agarosa al 1% TBE 0.5X, las 
condiciones de electroforesis 65 miliamperios y 85 volts durante 40 minutos 
(Equipo de electroforesis EASY-CAST Modelo B2 con una fuente de poder 
THERMO EC135-90) utilizando MPM (KAPA Express DNA Lader 1 Kb) y 
usando como intercalante Midori Green. Posteriormente el gel fue colocado 
en una cámara de luz UV para visualizar y analizar el corrimiento de los 
productos de PCR. 
OBTENCIÓN DE AMPLICONES A PARTIR DE COLONIAS in vitro 
 
 Para este tipo de reacción de PCR, fue necesario tomar con un palillo de 
madera estéril una pequeña porción de cada colonia de bacterias y fue 
disuelta en su respectivo tubo, en el cual previamente se vertieron los 
reactivos necesarios para muestras de 15µl. (Ver Tabla 2). 
 
REACTIVOS Cantidad en µl 
Buffer 1.5 
MgCl2 0.75 
dNTP´s 0.3 
Primer FD 0.3 
Primer RD 0.3 
Taq. Polimerasa 0.2 
H2O 9.15 
Tabla 2. Reactivos para reacción PCR en proporción calculada para 15 
μl. 
 
 Posteriormente los tubos con las muestras y los reactivos ya añadidos 
se ingresaron al termociclador BIORAD T100 para dar comienzo a los ciclos 
de temperatura que propiciaron el trabajo de la enzima Polimerasa y de los 
cebadores incluidos en cada muestra, dichos ciclos son: 
1. 94ºC, 3 min 
 43 
2. 94ºC, 1 min 
3. 56ºC, 0.30 min 
4. 72ºC, 2 min 
5. repetir desde el paso número 2, 30 veces 
6. 72ºC, 7 min 
7. 12ºC, ∞ 
 
 Los productos obtenidos en PCR punto final de aproximadamente 1600 
pb fueron observados en un gel de agarosa al 1% TBE 0.5X, las 
condiciones de electroforesis 65 miliamperios y 85 volts durante 40 minutos 
(Equipo de electroforesis EASY-CAST Modelo B2 con una fuente de poder 
THERMO EC135-90) utilizando MPM (KAPA Express DNA Lader 1 Kb) y 
usando como intercalante Midori Green. Posteriormente el gel fue colocado 
en una cámara de luz UV para visualizar y analizar el corrimiento de los 
productos de PCR. 
 
9.8 SECUENCIACIÓN 
 
 Una vez obtenidos los productos de PCR se purificaron, dicha 
purificación se realizó con columnas CENTRI-SEP COLUMNS Princeton 
Separations que contienen Sephadex G50 que elimina todas las moléculas 
que no deben estar presentes cuando se ingrese la muestra en el equipo de 
secuenciación. 
 Las diferentes muestran se liofilizaron por 20 minutos a una 
temperatura de 50 ºC y al alto vacío para después resuspenderlas en 20μl 
de formamida pura, posteriormente las muestras se colocaron en tubos 
especiales recomendados por el fabricante del equipo secuenciador y se 
calentaron a 95ºC durante 5 minutos, inmediatamente después se colocaron 
en hielo (Ramírez et al. 2014). Alcanzado este punto las muestras estaban 
 44 
listas para ser analizadas por electroforesis capilar en el equipo de 
secuenciación Applied Biosystems HITACHI 3130x. 
 
 
9.9 EDICIÓN Y CONSTRUCCIÓN DEL ÁRBOL FILOGENÉTICO 
 
 Para editar las secuencias obtenidas de cada cepa se utilizó el software 
Geneious R6. Se descargaron de la base de datos del GenBank varias 
secuencias de organismos conocidos de los géneros encontrados como 
resultado de las pruebas bioquímicas para hacer un alineamiento múltiple 
con las secuencias de las cepas y editar de tal manera que se obtuvieron 
secuencias consenso. 
Las secuencias consenso obtenidas tras la edición fueron sometidas a un 
BLAST (Programa informático de alineamiento de secuencias útil para 
comparar secuencias problema con las que forman parte de una base de 
datos, pueden ser DNA, RNA o Proteínas) y a un BLAST filtrado (consiste 
en comparar las secuencias problema con secuencias pertenecientes a un 
grupo de organismos específico para reducir la búsqueda y aumentar la 
probabilidad de encontrar secuencias homólogas) para compararlas con las 
secuencias que existen en la base de datos del GenBank y obtener un 
porcentaje de similitud con alguna bacteria conocida. 
 
 Utilizando el mismo software Geneious R6 se construyó un 
dendrograma para agrupar a las cepas de estudio con sus respectivos 
grupos taxonómicos de acuerdo a la similitud entre las secuencias del gen 
16S. El modelo utilizado para la construcción del dendrograma fue el Jukes-
Cantor y el método de construcción del dendrograma fue el Neighbor-
Joining, con un grupo externo el cual fue un bacilo perteneciente al orden 
Lactobacillales. 
 45 
 
 
 
 
10. RESULTADOS 
 
 El presente estudio se realizó en el periodo comprendido entre los 
meses de Febrero y Agosto de 2016, de las 17 cepas bacterianas 
únicamente se cultivaron 16 ya que una no pudo ser activada, todas las 
cepas fueron aisladas de muestras clínicas pertenecientes al cepario del 
Laboratorio de Bacteriología de la FESI para ser analizadas morfológica, 
bioquímica y molecularmente, a continuación se presentan los resultados 
obtenidos. 
 
MORFOLOGÍA COLONIAL (VerTabla 3) 
 
 Se obtuvieron medidas similares de diámetro de colonia de las 
diferentes cepas (ver Tabla 1). La cepa GLE3 fue la única que mostró un 
valor de diámetro claramente superior con 4 mm. En contraste la cepa LGB 
tuvo un diámetro de colonia de apenas 0.5 mm. 
 
 En cuanto a la coloración, la mayoría de las cepas mostraron una 
tonalidad ligeramente amarillenta, que si bien pudo ser ese el color real de 
las colonias, también pudo deberse al color del medio BHI en el que fueron 
sembradas cuya tonalidad es marrón y al paso de luz a través de la colonia 
adquirir el mencionado tono amarillo. Se utilizó agar BHI para sembrar todas 
las cepas por el aporte nutrimental que proporciona al tipo de bacterias 
usadas en este estudio. Cabe destacar que las cepas GLE3 y LGB 
 46 
mostraron un tono de amarillo un poco más intenso en sus colonias y la 
cepa GHI presentó un tono grisáceo. 
 
 La forma adquirida por las colonias de las diferentes cepas fue circular 
a excepción de la cepa RRJ1 cuyas colonias se mostraron ligeramente 
ovaladas. 
 En cuanto a las características de las superficies de las colonias, 12 
cepas presentaron colonias con superficies convexas y brillosas, SRA1 y 
GHI tuvieron una superficie opaca con una elevación en el centro de la 
colonia. La cepa GLE3 fue de superficie plana y brillosa. 
 
 Catorce de las dieciséis cepas mostraron bordes coloniales de tipo liso y 
solo las cepas GLE5 y GLE3 tenían colonias con bordes irregulares. 
 
 La consistencia de las colonias resultó ser de tipo pastosa a excepción 
de TSD cuya consistencia era claramente viscosa. 
 Como detalles adicionales se pudo observar que las colonias de las 
cepas AMJ2, RRJ1, GLE6, SRA1, LFS, GLE5, GMO2, GHI, GLE3 y LGB 
eran translucidas, característica que se pudo apreciar gracias a la 
transparencia del medio de cultivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 3. Caracteristicas morfológicas de las colonias de las diferentes cepas utilizadas en este estudio. 
 48 
 
 
 
 
 
 
MORFOLOGÍA CELULAR (Ver Tablas 4 a 7) 
 
 Definir la forma celular de las cepas a través del miscroscópio de luz 
fue difícil por lo que se tuvo que recurrir a micrografías tomadas por el MEB, 
sólo de ésta manera se pudo observar que 11 de las 16 cepas tenían forma 
de tipo cocobacilo, las cepas TSD y GHI con forma de bacilos y las cepas 
GLE3, BVG y CMA con forma de cocos, arreglados en pares (diplococos). 
 
 Los cocobacilos tuvieron un tamaño de entre 1.14 y 1.82 M de largo y 
0.50 y 0.60 M de ancho con un promedio general entre las cepas que 
presentaron esta forma de 1.57 M de largo y 0.55 M de ancho. 
Los bacilos presentaron una media de 2.36 M de largo por 0.60 M de 
ancho lo que no deja dudas sobre su forma bacilar. 
De las 3 cepas con forma celular de coco GLE3 y CMA tuvieron diámetros 
similares de 0.73 y 0.65 M respectivamente y la cepa BVG mostró un 
diámetro promedio de 1.92 M. 
 
 
 
 
 
 
 
 49 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Forma y dimensiones de las diferentes cepas. 
 
 
CEPAS Forma 
Tamaño (μM) 
Longitudinal Transversal 
AAA1 Cocobacilos 1.81 0.55 
RRJ1 Cocobacilos 1.42 0.57 
LGB Cocobacilos 1.48 0.60 
VFL Cocobacilos 1.71 0.57 
ZG12 Cocobacilos 1.58 0.58 
GLE6 Cocobacilos 1.55 0.55 
GLE5 Cocobacilos 1.14 0.50 
GMO2 Cocobacilos 1.45 0.60 
LFS Cocobacilos 1.73 0.49 
TSD Bacilos 2.55 0.50 
GHI Bacilos 2.18 0.70 
AMJ1 Cocobacilos 1.82 0.54 
SRA1 Cocobacilos 1.65 0.54 
 Diámetro (M) 
GLE3 Cocos 0.73 
BVG Cocos 1.92 
CMA Cocos 0.65 
 50 
 
Figura 3. Fotografías de las cepas a)AMJ2, b)AAA1, c)RRJ1, d)VFL, e)GLE6 y 
f)LFS utilizadas en el presente estudio tomadas con MEB a un aumento de 
10,000X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(a) (b) 
(c) 
(d) 
(e) 
 51 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Fotografías de las cepas 
a)ZG12, b)SRA, c)GLE3, d)TSD, e)GHI y f)BVG utilizadas en el presente 
estudio tomadas con MEB a un aumento de 10,000X. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(f) 
 
 
 
 
(a) (b) 
 52 
 
Figura 5. Fotografías de las cepas 
a)GLE5, b)GMO2, c)LGB1 y d)CMA2 
utilizadas en el presente estudio 
tomadas con MEB a un aumento de 
10,000X. 
 
 
 
 
 
 
 
(c) 
(d) 
(e) 
(f) 
 
 
(a) (b) 
(c) (d) 
 53 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS (Ver Tabla 8) 
 
 Después de realizar una batería de 8 pruebas bioquímicas a las 
bacterias se encontró que 13 cepas fueron Gramnegativas (fig. 2), las cepas 
CMA, BVG y GLE3 fueron Grampositivas (fig. 3). Únicamente 3 cepas 
(AAA1, VFL1 y GMO2) presentaron movilidad durante la prueba de gota 
pendiente (fig. 4) mientras que en la prueba de movilidad en medio SIM solo 
AAA1 y SRA1 mostraron un resultado positivo (fig. 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Bacterias teñidas Gram negativas Figura 7. Bacterias teñidas Gram positivas 
Figura 8. Preparación para observar movimiento en gota pendiente. 
Figura 9. Movilidad de las bacterias en medio sólido 
SIM. 
 54 
 Durante la prueba de utilización de glucosa como única fuente de 
carbono se obtuvieron resultados positivos para 5 cepas, es decir, VFL1, 
ZG12, SRA1, LFS y TSD tuvieron metabolismo oxidativo (fig. 6). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Únicamente las cepas AAA1, VFL1 y GMO2 dieron positivo en la 
prueba de Ureasa (fig. 7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. A) Prueba negativa, bacteria con metabolismo fermentador. B) Prueba positiva, bacteria con 
metabolismo oxidativo. C) Prueba positiva, bacteria con metabolismo oxidativo en condiciones aerobias, en 
condiciones anaerobias no utliza la glucosa como fuente de carbono. 
Figura 11. Tubo izquierdo con bacterias Ureasa negativas. Tubo 
derecho con bacterias Ureasa positivas. 
 55 
 De las 16 cepas en cuestión, 8 arrojaron como positivo el resultado de 
la prueba de Oxidasa y el resto AAA1, RRJ1, GLE6, VFL1, ZG12, GLE5, 
GMO2 y LGB fueron negativas. (Fig. 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 En la prueba de Indol solamente la cepa VFL1 dio positivo (fig. 9 y 10) y 
en la prueba de producción de sulfuro de hidrógeno (SH2) todos los 
organismos dieron negativo. 
Finalmente en la prueba de Catalasa todas las cepas fueron positivas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 5. Resultados de las principales pruebas Bioquímicas que se requieren 
Figura 12. Almohadilla izquierda con bacterias Oxidasa 
negativas. Almohadilla derecha con bacterias Oxidasa positivas. 
Figura 13. Tubo con medio sólido SIM con bacterias Indol 
positivas. 
Figura 14. Tubo con medio sólido SIM con bacterias Indol 
negativas. 
 56 
para un estudio de caracterización. 
CEPAS 
Tinción 
de 
Gram 
Movilidad 
en gota 
pendiente 
Ureasa 
Metabolismo 
Oxidativo ó 
Fermentativo 
Oxidasa Indol 
Producción 
de Sulfuro 
de 
hidrógeno 
Movilidad 
en medio 
SIM 
Catalasa 
AMJ1 - - - F + - - - + 
AAA1 - + + F - - - + + 
RRJ1 - - - F - - - - + 
GLE6 - - - F - - - - + 
VFL1 - + + O - + - - + 
ZG12 - - - O - - - - + 
SRA1 - - - F + - - + + 
LFS - - - O + - - - + 
TSD - - - F + - - - + 
GLE5 - - - O - - - - + 
GMO2 - + + O - - - - + 
GHI - - - F + - - - + 
GLE3 + - - F + - - - + 
LGB - - - F - - - - + 
CMA + - - F + - - - + 
BVG + - - F + - - - + 
 
 57 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 6. Resultados de las pruebas bioquímicas miniaturizadas BBL Crystal ID E/NF. 
 58 
Tabla 7. Resultados de las pruebas bioquímicas miniaturizadas BBL Crystal ID Gram 
Positivas 
 
 
 
CEPAS AMJ2 CMA299 
PRUEBAS 
FCT × × 
FGC − − 
FVA + − 
FPH + − 
FGS − + 
FPY − − 
FTR + − 
FAR + + 
FGA − − 
FHO + + 
FGN + − 
FIS + − 
TRE + − 
LAC + + 
MAB − + 
SUC + + 
MNT + − 
MTT + + 
ARA + − 
GLR− − 
FRU + − 
BGL − + 
PCE − − 
PLN + + 
PHO + + 
PAM − + 
PGO + + 
URE − − 
ESC − − 
ARG + − 
 59 
 Después de obtener todos los resultados de las pruebas bioquímicas 
tanto clásicas como miniaturizadas (Ver Tablas 9 y 10) y con el uso del 
Manual para la identificación de bacterias de importancia médica Cowan 
and Steel’s (Barrow y Feltham, 2003) se llegó a la conclusión de que las 
cepas que se usaron en éste estudio son las siguientes: 
 
1. AAA1: Bordetella parapertusis 
2. RRJ1: Bordetella parapertusis 
3. LGB: Bordetella parapertusis 
4. GLE5: Acinetobacter calcoaceticus 
5. GMO2: Acinetobacter calcoaceticus 
6. GLE6: Acinetobacter sp 
7. VFL: Acinetobacter sp 
8. ZG12: Acinetobacter sp 
9. LFS: Moraxella sp 
10. TSD: Moraxella sp 
11. GHI: Moraxella sp 
12. AMJ1: Moraxella sp 
13. SRA1: Pseudomonas diminuta 
 
14. GLE3: Micrococcus sp 
15. BVG: Micrococcus sp 
16. CMA: Micrococcus sp 
 
 
 
 
SECUENCIACIÓN 
 
 60 
 Se obtuvieron 32 secuencias, 16 de ellas utilizando el primer FD y 16 
utilizando el primer RD, la mayoría de ellas de aproximadamente 700 bases, 
de manera que al alinearlas se obtuvieron fragmentos de aproximadamente 
1400 bases. Hubo secuencias muy cortas para algunas cepas, las cuales no 
se pudieron alinear ni obtener por consiguiente una secuencia consenso. 
 
ALINEAMIENTO MÚLTIPLE Y EDICIÓN DE SECUENCIAS 
 
 La edición se llevó a cabo tomando una secuencia conocida del 
GenBank de cada género presente en las muestras (Acinetobacter, 
Bordetella, Moraxella, Pseudomonas y Micrococcus) (Tabla 11) dichos 
géneros fueron el resultado de la identificación por pruebas bioquímicas de 
acuerdo al manual Corwan de Identificación para bacterias de importancia 
médica. Se realizó un alineamiento múltiple entre la secuencia del GenBank 
y las secuencias obtenidas pertenecientes a los organismos de los géneros 
correspondientes. 
 
 Tras una minuciosa comparación y edición en la secuencia de 
nucleótidos se obtuvo una secuencia consenso para cada una de las 16 
cepas, a éstas secuencias consenso se les realizó un BLAST para obtener 
un porcentaje de similitud con secuencias de organismos conocidos dentro 
de la base de datos del GenBank. 
 
 
 
 
 
 
 61 
Tabla 8. Determinación de las cepas según los resultados de las pruebas 
bioquímicas, de las secuencias consenso obtenidas posteriores a la 
secuenciación y de las secuencias consenso obtenidas después de la 
secuenciación pero comparándolas con los géneros arrojados por las 
pruebas bioquímicas clásicas preliminares. 
CEPAS Determinación 
de las cepas 
por pruebas 
Bioquímicas. 
Determinación de las 
cepas de acuerdo con 
el BLAST realizado a 
las secuencias 
consenso. 
Determinación de las cepas 
de acuerdo con el BLAST 
filtrado realizado a las 
secuencias consenso 
AAA1 
Bordetella 
parapertusis 
Klebsiella pneumoniae 
(93%) 
Bordetella sp. (83%) 
AMJ2 Moraxella sp. Escherichia coli (97%) Moraxella pluranimalium (87%) 
CMA Micrococcus sp. 
Bacillus 
sporothermodurans 
(94%) 
Micrococcus sp. (91%) 
GLE6 Acinetobacter sp. 
Bacillus 
sporothermodurans 
(92%) 
Acinetobacter iwoffii (88%) 
GMO2 
Acinetobacter 
calcoaceticus 
Raoultella planticola 
(97%) 
Acinetobacter calcoaceticus 
(95%) 
LFS Moraxella sp. 
Bacillus 
sporothermodurans 
(89%) 
Moraxella sp. (84%) 
LGB 
Bordetella 
parapertusis 
Klebsiella sp. (90%) Bordetella sp. (80%) 
RRJ1 
Bordetella 
parapertusis 
Klebsiella sp. (88%) Bordetella sp. (85%) 
VFL Acinetobacter sp. Klebsiella sp. (92%) 
Acinetobacter radioresistens 
(90%) 
 
 
 
 62 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 15. Dendrograma construido a partir de las secuencias consenso del 16S rRNA de las cepas en estudio y 
de secuencias del mismo gen de los géneros arrojados por las pruebas bioquímicas preeliminares, además de 
un grupo externo (KX851512 Lactobacillales) obtenidas del GenBank. 
 63 
11. DISCUSIÓN 
 
 Un factor importante a tomar en cuenta son las características 
morfológicas como ha sido mencionado, en donde estas características 
fenotípicas son útiles o en algunos casos esenciales para la diferenciación 
de taxones desde filos y orden hasta especies y cepas. Sin embargo la 
variación es amplia entre toda la diversidad existente por lo que resulta 
insuficiente solo tomar en cuenta este factor. 
 
 Se realizó un registro de la morfología colonial recabando datos como 
la forma y el tamaño, entre otros, con el fin de coadyuvar a la identificación y 
determinación de las especies, los datos morfológicos de la colonias son 
muy homogéneos y no arrojan información suficiente para discriminar entre 
las cepas del presente estudio, lo cual puede ser apoyado por Moore et. al., 
en el 2010, quienes mencionan que las características de la morfología 
colonial no están necesariamente correlacionadas con las relaciones 
evolutivas de los procariotas, es decir, esas características pueden estar 
determinadas por el ambiente y no por expresión de su genotipo. Como un 
ejemplo de ello tenemos la coloración de las colonias que era de manera 
predominante ligeramente amarillenta que si bien pudo ser ese el color real 
de las colonias, también pudo deberse al color del medio BHI en el que 
fueron sembradas cuya tonalidad es marrón y al paso de luz a través de la 
colonia adquirir el mencionado tono amarillo. 
 
 Con lo mencionado anteriormente y según lo explica Cerritos en el 
2007, los caracteres fenotípicos son determinados por la información 
genética y el efecto ambiental, la interacción entre estos dos factores puede 
dar el resultado fenotípico, es decir aquello que puede ser observable. Por 
lo tanto es posible que las diferencias a nivel morfológico no existan a nivel 
 64 
genético y lo que se observe sea simplemente producto de una plasticidad 
fenotípica. Por lo que al tomar caracteres con plasticidad fenotípica o que 
han experimentado convergencia evolutiva, los límites de una especie 
pueden ser erróneos. 
 
 Los resultados obtenidos con las pruebas bioquímicas clásicas y 
miniaturizadas arrojaron 4 géneros y 2 especies, estos resultados fueron 
utilizados para seleccionar las secuencias del GenBank que se usaron para 
editar las secuencias ayudado de los electroferogramas, sin embargo y 
como lo mencionan Topic et. al., en el 2004 y Moore et. al., en el 2010 es 
importante reconocer que los caracteres con plasticidad fenotípica son difícil 
de identificar con estas pruebas. 
 
 En los procariotas, el método fenético (pruebas bioquímicas clásicas) 
es el que más se aplica para el reconocimiento y delimitación de especies, 
pero la gran cantidad de homoplasias que pueden existir en estos 
caracteres hacen de la sistemática bacteriana un sistema completamente 
artificial sobre todo al nivel taxonómico de especie según lo mencionado por 
Cerritos en 2007. 
 
 La caracterización e identificación de microorganismos ha sido 
realizado por excelencia con pruebas bioquímicas, una caracterización 
realizada como una prueba determinante en la identificación de estos, sin 
embargo es común que existan interpretaciones erróneas de los resultados 
arrojados por los kits de pruebas bioquímicas miniaturizados (Topic et. al., 
2004) 
 
 Algunas de las cepas tratadas en el presente trabajo fueron 
consideradas como atípicas al momento de ser aisladas de las vías 
 65 
respiratorias superiores de pacientes del Hospital General de México en un 
trabajo anterior (García, 2015) por la ubicación poco usual de donde fueron 
aisladas, lo que indica que sus características fenotípicas se han modificado 
para poder establecerse en un ambiente diferente al que usualmente 
habitan y es así como se puede recomendar lo mismo que Moore et. al., en 
2010, en un estudio polifásico el conjunto específico de métodos y análisis 
debe variar con respecto al microorganismoanalizado. 
 
 La microscopía de barrido, una técnica utilizada en el presente estudio, 
resulto importante dentro del estudio polifásico como lo recomienda 
Komárek en 2016, así como las técnicas de fijación de microorganismos 
utilizadas en el mismo, la resolución para la determinación de la forma es 
sumamente importante, y aun mas cuando se pretende reconocer la forma 
de coco-bacilo. En el presente estudio se pudo contribuir con las 
dimensiones promedio longitudinales y trasversales de los cocobacilos, las 
cuales pueden servir de referencia para otros trabajos, el promedio obtenido 
fue 1.57 μm longitudinales y 0.55 μm transversales lo cual describe 
claramente la forma específica de coco-bacilo y es posible diferenciarlos de 
las formas bacilos y cocos. 
 
 Para llevar a cabo la identificación molecular se utilizó el marcador 16S 
rRNA el cual es de primordial importancia cuando hablamos de sistemática 
bacteriana como lo menciona Yarza et. al., en el 2008 a pesar de lo 
mencionado por Bou et. al., en 2011 que aseguran que la homología 
genética del gen 16S rRNA presente en determinados géneros bacterianos 
no permite realizar una identificación a nivel de especie o géneros. Por lo 
tanto el presente trabajo propone como una alternativa el uso de otros 
marcadores como pueden ser el 23S rRNA, el espacio intergénico entre el 
 66 
16S y el 23S rRNA, el rpoB (subunidad β de la RNA polimerasa) o el gyrB 
(subinidad β de la DNA girasa). 
 
 Tomando en cuenta que de las 9 cepas que fueron analizadas por 
métodos moleculares solo 2 pudieron ser identificadas hasta especie se 
recomienda que en estudios posteriores sea el gen rpoB el utilizado en lugar 
del 16S rRNA por ser más adecuado para la identificación a nivel de 
especies y subespecies como lo considera Bou et. al., en 2011. 
 
 De las 16 cepas estudiadas solo para 9 se obtuvieron secuencias 
consenso obtenidas a partir de la revisión y edición de los electroferogramas 
obtenidos, para hacer alineamientos múltiples ya que para estos 
procedimientos es altamente recomendable que las secuencias obtenidas 
sean de buena calidad según lo comenta Yarza et. al., en 2008, además de 
que ellos mismos proponen que dicha caracterísica sea obligatoria para 
depositar las secuencias en las bases de datos públicas para disminuir la 
tasa de errores en la información registrada. 
 
 Se realizaron dos BLAST a las 9 secuencias consenso, el primero con 
un filtro para comparar con secuencias de sus mismos géneros según las 
pruebas bioquímicas tradicionales y el segundo fue un BLAST sin ningún 
filtro, obteniendo porcentajes de similitud menores a 97% excepto para dos 
secuencias en el BLAST filtrado donde se encontraron las especies 
Escherichia coli y Raoultella planticola, ambas con 97% de similitud con sus 
respectivos géneros lo que nos indica que solo estas dos cepas pertenecen 
efectivamente a las especies mencionadas tomando en cuenta el criterio de 
Yarza et. al., del 2008 donde determinan que para que dos organismos 
sean considerados de la misma especie no debe existir mas del 3% de 
discrepancia entre sus secuencias del marcador 16S rRNA. 
 67 
 
 En los dendrogramas obtenidos de acuerdo a las diferentes secuencias 
utilizadas tanto de las muestras como de las descargadas del GenBank se 
observa que las cepas en estudio quedan intercaladas entre las secuencias 
de los géneros con los que se les comparó, apoyando así la determinación 
final a pesar de lo publicado por Yarza et. al., en 2008 que ponen de 
manifiesto la incapacidad para representar la genealogía de un 
microorganismo por sucesos como el cruce genético de genes ribosomales 
o la transferencia horizontal de genes. 
 
12. CONCLUSIONES 
 
De las 17 cepas que conformaron el presente trabajo sólo 16 pudieron ser 
cultivadas y 9 de ellas se identificaron al menos hasta género, obteniendo 4 
géneros (Bordetella, Moraxella, Acinetobacter y Micrococcus). 
 
 La morfología colonial no aporta suficientes datos en un estudio de 
caracterización bacteriana como lo es éste, sobre todo si se trata de cepas 
aisladas de ambientes muy similares. 
 
 La morfología celular, en cambio, es de gran ayuda para diferenciar 
entre grupos bacterianos según su forma (bacilos, cocos, cocobacilos), en 
ocasiones es muy complicado lograr identificar la forma celular a través del 
microscopio óptico aun cuando las células estén teñidas, por esto es 
importante hacer uso del MEB. 
 
 Las pruebas bioquímicas clásicas siguen siendo hasta hoy el método 
más efectivo para llevar a cabo la identificación de un microorganismo, pero 
 68 
debe ser complementado con técnicas moleculares y micrografías en MEB. 
Todo lo anterior es lo que compone a un estudio polifásico. 
 
 El marcador molecular 16S rRNA sigue siendo de gran importancia en 
sistemática bacteriana pero existen otros marcadores que pueden ser más 
útiles para ciertos grupos bacterianos ya que en algunos de ellos existe una 
alta homología genética que impide realizar una identificación a nivel de 
especie o incluso de género usando el 16S rRNA. Algunas opciones de 
marcadores o dianas moleculares son: 
 Espacio intergénico del 16S – 23S rRNA: El número, tamaño y 
composición de las regiones intergénicas del 16S – 23S rRNA es lo 
que le confiere la característica de marcador molecular ya que 
presenta un alto grado de diversidad observado en diferentes 
géneros, especies e inclusive en cepas. 
 23S rRNA: Puede ser usado cuando el 16S no proporciona resultados 
concluyentes. 
 rpoB (subunidad β de la RNA polimerasa): Las secuencias de rpoB 
muchas veces presentan mayor calidad que las del 16S rRNA, 
además, existe mayor correlación en la similitud de la secuencia del 
rpoB con el criterion de inclusión en la misma especie de la 
hibridación DNA – DNA. Por último, es muy probable que éste 
marcador no esté sometido a transferencia horizontal. 
 gyrB (subunidad β de la DNA girasa): Por su presencia en unicopia, 
permite la discriminación e identificación entre especies muy 
relacionadas, es de gran utilidad por presentar una tasa de 
sustituciones sinónimas mayor que la del 16S rRNA. 
 
 Las secuencias de calidad alta son necesarias para compararlas con 
las que se encuentran en las bases de datos en búsqueda del mayor 
 69 
porcentaje de similitud entre ellas, pero también para poder construir 
árboles filogenéticos y poder representar de manera correcta líneas 
evolutivas. 
 
 
13. LITERATURA CITADA 
 
1. Alados, J; Alcaraz, M; Aller, A; Miranda, C; Pérez, J. y Romero, P. 2009. 
Diseño de un Laboratorio de Microbiología Clínica. Enferm Infecc 
Microbiol Clin, 2010;28(7):453-460. 
2. Barrow, G. y Feltham, R. 2003. Cowan y Steel’s Manual para la 
identificación de bacterias médicas. 3ra Edición. Ed. Cambridge 
University Press. Reino Unido. Pp 317. 
3. Bou, G; Fernández-Olmos, A; García, C; Sáez-Nieto, J. y Valdezate, S. 
2011. Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de 
microbiología. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2011;29(8):601–608. 
4. Cerritos, F. 2007. Capítulo 10, La especie como unidad evolutiva: uso de 
marcadores moleculares para su reconocimiento y delimitación, con 
especial énfasis en microorganismos. Aparece en: Eguiarte, L. y Aguirre, 
X. Ecología molecular. Ed.Instituto Nacional de Ecología, SEMARNAT. 
México. Pp 573. 
5. De la Rosa, M; Prieto, J. y Navarro J. 2011. Microbiología en ciencias de 
la salud. Ed. Elsevier 3ª edición. España. Pp 351. 
6. García, J. 2015. Tesis de Licenciatura. Aislamiento de Bacterias 
Aerobias en Lavados Bronquiales de Pcientes del Hospital General de 
México. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. UNAM. Pp 71. 
7. Gonzáles S/A. Aseguramiento de la Calidad de las Colecciones de 
Cultivos Microbianos. Grupo de Aseguramiento de la Calidad. Dirección 
 70 
Calidad. Centro Nacional de