FUNDAMENTOS DE LA BIOTECONOLOGIA GENOMICA - Diana Solorzano

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FUNDAMENTOS 
DE LA BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
FUNDAMENTOS 
DE LA BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
r 
Miguel Ángel Reyes-López 
(Coordinador y editor) 
José Luis Hernández-Mendoza 
Netzahualcóyotl Mayek-Pérez 
(Editores) 
} 
Primera edición: noviembre 2010 
Diagramación: Varia Visual, Marisol Solis 
Corrección: Ángel Fosado 
Responsabilidad del Contenido: 
El contenido científico del presente libro es responsabilidad 
exclusiva de los autores correspondientes. 
FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
Miguel Ángel Reyes-López 
José Luis Hernández-Mendoza 
Netzahualcóyotl Mayek-Pérez 
© Miguel Ángel Reyes-López, José Luis Hernández-Mendoza, Netzahualcóyotl Mayek-Pérez 
© Centro de Biotecnología Genómica 
© Instituto Politécnico Nacional 
© Consejo Tamaulipeco de Ciencia y Tecnología (Cotacyt) 
© Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica Conacyt - Gobierno del estado 
de Tamaulipas. 
© Plaza y Valdés, S.A. de C.V. 
Centro de Biotecnología Genómica 
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ISBN: 978-607-402-319-0 
Impreso en México / Printed in México 
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Agradecimientos 
Los editores y autores de esta obra agradecen el apoyo económico 
para su publicación a las siguientes instituciones: 
Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional 
Consejo Tamaulipeco de Ciencia y Tecnología (Cotacyt) 
Fondo Mixto de Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica Conacyt - Gobierno 
del estado de Tamaulipas 
índice 
Prólogo 
Hugo A. Barrera-Saldaña 11 
Capítulo I 
Los ácidos nucleicos y su cuantificación 
José A. Narváez-Zapata, 
Claudia P. Larralde- Corona 
e Isabel C. Rodríguez-Luna 13 
Capítulo II 
Enzimas de restricción 
Ana M. Sifuentes-Rincón 
y Xóchitl F. De la Rosa-Reyna 47 
Capítulo III 
Aplicaciones de la tecnología del ADN recombinante 
Juan M. González-Prieto, 
Sanjuana Hernández-Delgado, 
Krystal Lira-Méndez 
y Netzahualcóyotl Mayek-Pérez ; 61 
Capítulo IV 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
Mario A. Rodríguez-Pérez 95 
Capítulo V 
Secuenciación 
Elma L. Salazar-Marroquín, 
Víctor R. Moreno-Medina 
y Miguel A. Reyes-López 123 
Capítulo VI 
Expresión génica 
Ninfa Rosas-García, 
Alejandro Sánchez-Várela 
y José L. Hernández-Mendoza 149 
Capítulo VII 
Caracterización de la expresión génica 
Netzahualcóyotl Mayek-Pérez, 
Sanjuana Hernández-Delgado, 
Krystal Lira-Méndez 
y Juan M. González-Prieto 173 
Capítulo VIII 
Bioinformática 
Aldo Segura-Cabrera 
y Maurilio González-Paz 221 
Capítulo IX 
Proteómica 
Xianwu Guo-Zhou 
y Miguel A. Reyes-López 253 
Resumen del libro de fundamentos 
de la biotecnología genómica 275 
Autores 277 
Prólogo 
Una de las razones por la que este Centro de Biotecnología Genómica (CBG) nació en 1999, fue para que algún día llegase a convertirse en el referente por excelencia de la mejor investigación y aplicación de la biotecnología 
moderna. Para ello se sustentó su fundación en sólidos grupos de investigación, una 
infraestructura sin parangón en la región y un programa de formación de recursos 
humanos original, nacido como se debe, con buenos maestros, magníficos laborato-
rios y un regla de oro: retar a los alumnos a superar a sus maestros. 
Varias han sido las estrategias que se han seguido para alcanzar esta visión. Este 
documento representa un testimonio más del quehacer, conocimiento y compromiso 
por divulgar para compartir, de los magníficos investigadores que apasionadamente 
llevan hoy la antorcha que no hace mucho nosotros portábamos. Es un tratado de 
biología molecular y sus aplicaciones, que fundamenta y bautiza como moderna y 
ahora genómica, a la en realidad milenaria biotecnología. 
Son nueve capítulos que van desde cómo aislar y cuantificar los ácidos nucleicos, 
hasta cómo arrancarles sus secretos mediante el análisis teórico soportado por pro-
gramas de cómputo, gracias a los cuales hoy es posible manejar las masivas cantida-
des de información que los proyectos genómicos vierten día con día a los bancos de 
datos. Les complementan a estos, sendos capítulos que resaltan la utilidad de valio-
sas herramientas moleculares como las enzimas de restricción, la recombinación del 
ADN, la amplificación millonaria in vitro de genes, el desciframiento de la estructura 
primaria del ADN, así como sobre nuestro entendimiento de la expresión génica y 
de las técnicas que echamos mano para estudiarla. 
Éstos se ilustran con didácticas figuras, en algunos casos incluyen recuentos históri-
cos, en otros incorporan "recetas de laboratorio" y rematan con valiosas citas bibliográ-
ficas. Y aunque ha sido inevitable repetir conceptos en varios capítulos, sirva ello para 
beneficiar la comprensión de los mismos, sobre todo a la luz de los escasos textos sobre 
el tema a disposición de nuestros jóvenes aspirantes a incursionar en esta especialidad 
de espectaculares progresos, de la que en mi humilde opinión aún no vemos lo mejor. 
11 
FUNDAMENTOS DE LA BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
Fue sin duda gracias al increíble apoyo solidario de muchos líderes y colabo-
radores que desde su gestación, y sobre todo en los primeros cuatro años de vida 
del proyecto, se selló el futuro brillante de este magnífico Centro. Hoy es gracias 
a los autores de cada capítulo y al esfuerzo de sus editores, que la saga continúa. 
Mi agradecimiento por su leal compromiso, mis mejores augurios de satisfacción 
para los lectores que sabrán usar este manual para sumarse a la cruzada para traducir 
el conocimiento genómico en más y mejores técnicas para apoyar la modernización 
y competitividad del campo mexicano, y en buena hora por nuestra alma mater 
adoptiva, el IPN, pilar de la modernización de la técnica al servicio de la patria. 
Hugo A. Barrera Saldaña 
Profesor Titular. Facultad de Medicina 
de la Universidad Autónoma de Nuevo León. 
Monterrey, Nuevo León, México 
Fundador y Primer Director del CBG-IPN 
12 
Introducción 
Los ácidos nucleicos son biopolímeros que existen tanto en el núcleo de las cé-lulas, así como en células bacterianas que no tienen núcleo y en los virus. Es-tas moléculas tienen primordial importancia porque determinan la síntesis de 
las proteínas y son el factor genético que determina las características hereditarias 
de todos los organismos vivos (información genética). En los ácidos nucleicos el 
grado de polimerización puede llegar a ser extremadamente alto, con moléculas 
constituidas por centenares de millones de nucleótidos en una sola estructura co-
valente. De la misma manera que las proteínas son polímeros lineales aperiódicos 
de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo son de nucleótidos. La aperiodicidad de la 
secuencia de nucleótidos implica la existencia de información. De hecho, los ácidos 
nucleicos constituyen el depósito de información de todas las secuencias de aminoá-
cidos de todas las proteínas de la célula. Existe una correlación entre ambas secuen-
cias, lo que se expresa diciendo que ácidos nucleicos y proteínas son colineales; la 
descripción de esta correlación es lo que llamamos CódigoGenético, establecido de 
forma que a una secuencia de tres nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un 
aminoácido en una proteína. La función de los ácidos nucleicos no se reduce, por otra 
parte, a contener la información necesaria para la síntesis de las proteínas celulares. 
Hay secuencias regulatorias que controlan la expresión de las diferentes unidades ge-
néticas, por sí mismas o a su vez controladas por otras moléculas (hormonas, factores 
13 
Capítulo I 
Los ácidos nucleicos y su cuantificación 
José A. Narváez-Zapata 
Claudia P. Larralde- Corona 
Isabel C. Rodríguez-Luna 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
de crecimiento, señales químicas en general); asimismo existen ácidos nucleicos 
implicados en la transmisión y procesado de la información genética, así como con 
funciones catalíticas (ribozimas). 
Estructura y características fisicoquímicas de los ácidos nucleicos 
Los ácidos nucleicos tienen una estructura polimérica lineal. Son polinucleótidos for-
mados por condensación de sus monómeros (los nucleótidos, unidad de repetición). 
Cada nucleótido está formados por tres moléculas funcionales: 1) ácido fosfórico, 
2) un azúcar de cinco carbonos, la cual puede ser la ribosa ó la desoxirribosa (véase 
Figura 1); y 3) una base nitrogenada, perteneciente a la familia de las purinas ó a la 
de las pirimidinas (véase Figura 2). Estos tres componentes están unidos de manera 
similar en dos tipos de nucleótidos principales, los cuales se distinguen por el tipo de 
azúcar que contienen. En el caso del ácido ribonucleico (ARN), contiene a la ribosa, 
mientras que en el ácido desoxirribonucleico (ADN) encontramos a la desoxirribosa. 
β D RIBOSA β D DESOXIRRIBOSA 
Figura 1. Azúcares presentes en los ácidos nucleicos. 
ADENINA CITOCINA GUANINA TIMINA URACILO 
Figura 2. Bases nitrogenadas pirimídicas y púricas presentes en los ácidos nucleicos. 
14 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
En cuanto a las bases nitrogenadas, existen cinco tipos, y tres de ellas son comu-
nes en ambos ácidos nucleicos: adenina (A), guanina (G) y citosina (C), mientras que 
timina (T) solo se encuentra en el ADN y el uracilo (U) solamente en el ARN (véase 
Figura 2). Una característica química común que comparten el ADN y el ARN es que 
son ácidos fuertes debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. 
Tanto en el ARN como en el ADN SUS nucleótidos están conectados mediante los 
carbonos 3' y 5' de sus azúcares, por lo que la cadena resultante tiene polaridad 
(dirección) en la cual un extremo tiene un carbono 5' libre, y el otro extremo un car-
bono 3' libre (véase Figura 3). Por convención una cadena de nucleótidos se describe 
en la dirección 5' a 3'. La secuencia de bases en las cadenas de ambos ácidos nuclei-
cos es esencial para su capacidad de transferencia de información genética. El ARN 
típicamente es de cadena sencilla, sin embargo, debido a la posibilidad de aparea-
miento de bases intra e intermoleculares, se presentan estructuras secundarias que 
juegan un papel muy importante en su funcionalidad, como se explica más adelante. 
La estructura de una molécula de ADN consiste en dos cadenas de polinucleótidos 
enrolladas en una doble hélice. 
El esqueleto principal de cada cadena lo constituyen unidades de desoxirribosa 
(azúcar) fosfatada. En el interior de la doble hélice se encuentran las bases púricas 
y pirimídicas y la secuencia de éstas cuatro bases son las que llevan la información 
genética. Una base nitrogenada en una posición de la cadena principal se aparea 
con una base de la cadena complementaria de una manera precisa: la adenina con la 
timina, y la citosina con la guanina, presentándose además la formación reversible 
de puentes de hidrógeno, formándose 2 puentes entre el par A-T, y 3 puentes en el 
par C-G (véase Figura 4), y resultando en una gran similitud geométrica, la cual es 
necesaria para la correcta conformación y estabilidad de la molécula de ADN (véase 
Figura 5). 
Una de las características más importantes que le da la especificidad del aparea-
miento de bases es su naturaleza complementaria (véase Figura 5), lo cual significa 
que a partir de la secuencia de una de las cadenas se puede conocer la secuencia de 
la otra, es decir, una cadena es molde de la otra y viceversa. Puestas juntas, esta 
polaridad y complementaridad determinan el proceso de replicación, durante la cual 
se crea una molécula hija de ADN a partir de la molécula original (molde). 
La estructura del ADN se mantiene gracias a los enlaces de hidrógeno establecidos 
entre las bases, por una parte, y a una interacción de naturaleza hidrofóbica que se 
da entre pares de bases contiguos, la interacción de apilamiento (stacking), en donde 
los pares de bases sucesivos se apilan unos sobre otros como una pila de monedas, y 
una vuelta completa de la hebra contiene 10 pares de bases, lo cual resulta en una longi-
tud axial de 34 Á. El ADN puede presentar variaciones en su conformación tridimensio-
nal. Por ejemplo, la forma B es la que aparece con un grado importante de hidratación 
15 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Figura 3. Formación direccional de enlaces fosfodiéster en una cadena de polinucleótidos. 
16 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
Figura 4. Direccionalidad y formación de puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas de las dos 
cadenas complementarias del ADN. 
Figura 5. Esquematización de la duplicación fiel 
(replicación) de la secuencia de nucleótidos de 
una molécula de ADN a partir de su naturaleza 
complementaria. 
17 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
y es la que presenta el ADN in vivo. Fue propuesta por Watson y Crick en su trabajo 
original de 1953, y se caracteriza por ser dos cadenas de polinucleótidos enrolladas 
una en torno a la otra, constituyendo una doble hélice dextrógira de tipo plectoné-
mico (lo cual quiere decir que para separar una de otra es preciso desenrollar pre-
viamente la hélice). Las bases están en planos aproximadamente perpendiculares al 
eje mayor de la doble hélice y dirigidas hacia dentro de la estructura, mientras que 
el continuo desoxirribosa-fosfato se dirige hacia el exterior. Otras características es-
tructurales del ADN-B son las siguientes: la forma del anillo furanósico de la pentosa 
es la llamada endo-2' lo cual quiere decir que el carbono 2' está claramente fuera del 
plano que aproximadamente marcan los carbonos 1', 3', 4' y el oxígeno hemiacetáli-
co; y por otra parte, que la situación de la base respecto a la pentosa es anti-, es decir, 
base y pentosa se sitúan hacia lados opuestos del enlace glicosídico. 
La conformación A del ADN aparece en cristales de baja hidratación y menor gra-
do de polimerización que el ADN-B. Asimismo, es la conformación favorecida en el 
ARN de doble hélice y en los híbridos ADN-ARN. Se trata de una estructura más ancha 
y corta que el ADN-B, que consta, al igual que éste, de una doble hélice dextrógira 
formada por dos polinucleótidos enrollados plectonémicamente que cursan asimis-
mo con polaridades opuestas. El ADN-A muestra el mismo patrón de apareamiento 
de bases que el ADN-B (A-T y G-C) pero a diferencia de éste, los planos de los pares de 
bases están situados oblicuamente respecto al eje mayor de la doble hélice. En el 
DNA-A los surcos tienen aproximadamente la misma anchura y las bases púricas se 
sitúan en anti-, como en el DNA-B. A diferencia de éste, la disposición del anillo fu-
ranósico de la pentosa es endo-3'. La conformación Z del ADN se presenta en zonas 
ricas en el par G-C; se trata también de un doble polinucleótido en enrollamiento 
plectonémico, con polaridades opuestas, y en el que el patrón de apareamiento de 
bases es el mismo. No obstante, hay algunas diferencias importantes entre la con-
formación Z y las otras dos. En primer lugar, las hélices son levógiras a diferencia 
de las conformacionesA y B. El conjunto es una doble hélice más estrecha y alar-
gada que el ADN-B; una diferencia notable es que las purinas están en conformación 
syn-, es decir, la base y la pentosa están situados del mismo lado que el enlace gli-
cosídico. Otra diferencia estructural es que en el ADN-Z desaparece por completo el 
surco ancho mientras que el surco estrecho se hace aún más estrecho y profundo. 
El hecho de que las dos cadenas del ADN estén unidas por puentes de hidrógeno 
le da la característica de que pueden ser separadas al calentar la solución donde se 
encuentren disueltas. Regiones de ADN ricas en el par A-T requerirán menor tem-
peratura de calentamiento para separarse que regiones abundantes en el par G-T, 
debido al mayor número de puentes de hidrógeno que se encuentran en este último 
caso. El proceso de disociación (melting) de la molécula de ADN se monitorea cuan-
tificando la absorbancia de la solución a 260 nanómetros, y dado que una cadena 
18 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
i 
de polinucleótidos tiene un mayor poder de absorbancia que cuando se encuentra 
apareada, la disociación del ADN se mide como un incremento en la absorbancia glo-
bal de la solución. La temperatura de disociación (Tm) nos indicará entonces la tem-
peratura a la cual el valor de la absorbancia está a la mitad de los valores límite que 
se obtienen cuando la solución está completamente como doble hélice y cuando está 
completamente disociada. Por consiguiente, el valor de Tm está correlacionado con 
el contenido del par G-C de la muestra de ADN. Por ejemplo, la bacteria Escherichia 
coli, con un 50% de contenido G-C tienen una Tm de 69°C, mientras que el conteni-
do de G-C del 68% que tiene Pseudomonas aeruginosa resulta en una Tm de 76°C. 
Esta diferencia de composición de bases de hecho es utilizada como una herramien-
ta de caracterización de especies. El rango de contenido G-C que se ha cuantificado 
para diferentes organismos varía entre el 23% al 75%. Una de las virtudes de la 
estructura de la molécula de ADN es que, una vez que la temperatura de la solu-
ción baja, las cadenas complementarias pueden aparearse nuevamente para volver 
a formar la doble hélice, proceso que se denomina hibridación, y la cual constituye 
también una herramienta muy importante en la tecnología del ADN recombinante y 
en análisis en el área de la medicina y la ecología. 
Importancia biológica del Ácido Desoxirribonucleico (ADN) 
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un biopolímero cargado de toda la información 
hereditaria de la célula. Cuando una célula se divide, cada célula hija recibe al menos 
una copia completa del ADN de su progenitor, lo cual resulta que ellas tengan un gran 
parecido en forma y función a la célula madre. La manera en que se guarda la infor-
mación en este larguísimo biopolímero es a través de la secuencia de sus monómeros 
(nucleótidos). La función primaria del ADN es entonces guardar las instrucciones para 
la síntesis de moléculas de ARN de secuencia y longitud específicas, y algunas de las 
cuales a su vez son utilizadas para la síntesis de proteínas específicas. Un segmento de 
ADN que codifica la secuencia de una molécula de ARN es llamado gen y el producto re-
sultante (ARN funcional ó una proteína) será entonces la expresión bioquímica tangible 
de la información contenida en el ADN. La expresión de parte o de toda la información 
genética primaria o fenotipo de una célula eucariótica, que en concreto se encuentra 
localizada dentro del núcleo celular y está codificada en el ADN, adopta la forma de po-
lipéptidos, que se sintetizan en el citoplasma. Dado que el ADN genómico no es un con-
tenido citoplasmático normal, las células necesitan mecanismos para llevar a cabo la 
transferencia de la información necesaria desde el núcleo a la maquinaria citoplasmáti-
ca sintetizadora de proteínas. En resumen, la información genética transcrita en el ADN 
puede ser duplicada en más ADN, durante la replicación, o bien traducida a proteínas. 
19 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Importancia biológica del Ácido Ribonucleico (ARN) 
La expresión de los genes conduce a la síntesis de moléculas de ARN a partir de un 
molde de ADN, un proceso conocido como transcripción. El ARN se fabrica sólo a 
partir de una de las cadenas de la hélice de ADN de doble cadena. La transcripción 
está catalizada por una enzima, la polimerasa de ARN, y sigue reglas similares a 
las de la replicación. El ARN presenta similitudes con el ADN, aunque en el ARN 
el azúcar presente es la ribosa y el uracilo reemplaza a la timina. La extracción 
del ARN de una célula produce varios tipos moleculares básicos: ARN ribosomal, de 
transferencia y mensajero, más una cantidad limitada de otras moléculas de ARN 
pequeñas. La función global de estos tres tipos de ARN es la de leer e implementar 
las instrucciones genéticas contenidas en el ADN. 
El ARN mensajero (ARNm) es complementario a la secuencia de un gen espe-
cífico en el ADN, y su función es llevar la información del ADN a otra parte de 
la célula (ribosomas), donde se lleva a cabo la traducción de esa información. 
Dado que la longitud de un gen puede ser muy variable, también lo puede ser 
su ARNm, aunque típicamente se encuentran en el rango de 103 a 104 nucleóti-
dos. La traducción de la información que lleva el ARNm se lleva a cabo en un 
conjunto de proteínas específicas en los ribosomas, las máquinas encargadas 
de la síntesis de las proteínas, el cual está formado en hasta un 65% por ARN 
ribosomal (AROT) el cual puede ser de varios tamaños según su coeficiente de 
sedimentación (s), típicamente 5s, 16s y 23s en procariontes, y 5s, 7s, 18s y 28s 
en eucariontes. 
Finalmente el ARN de transferencia (ARNÍ) comprende un grupo de moléculas 
de ARN, más bien pequeñas, cada una con especificidad de unión a un aminoá-
cido concreto; se encargan de acarrear los aminoácidos a los ribosomas, donde 
se incorporan al polipéptido en formación, participando en el proceso de traduc-
ción en el ribosoma. Las moléculas de ARN mensajero (ARNm), fabricadas sobre el 
ADN molde, contienen la información que será traducida a proteínas. La secuencia 
de bases del ARNm determina la secuencia de aminoácidos. 
Extracción y aislamiento de los ácidos nucleicos 
El uso de ADN para su análisis o manipulación requiere que éste sea aislado y pu-
rificado para la obtención de resultados confiables. Se han establecido una gran 
diversidad de protocolos para la obtención de ADN de una gran variedad de mues-
tras, sin embargo, todos poseen etapas en común, las cuales serán descritas a 
continuación. 
20 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
Extracción de ADN. El ADN es obtenido de células a través de métodos que rom-
pen las paredes celulares y disuelven las membranas. Sin embargo, paralelamente, 
esta etapa debe prevenir la fragmentación del ADN por tratamientos mecánicos y 
la degradación del mismo por procesos enzimáticos. En general, cuando una cé-
lula es expuesta a condiciones traumáticas (tales como los métodos de extracción 
de ADN) se liberan al medio grandes cantidades de enzimas ADNasas, las cuales se 
encargan de destruir el ADN expuesto para prevenir posibles errores en sus secuen-
cias (mutaciones) ó para impedir su transferencia a otras células (Ausubel y otros, 
2002). En general para la primera etapa en la extracción del ADN se emplean solu-
ciones amortiguadoras de extracción, los cuales mantienen el pH entre 7 y 8, lo 
que incrementa la vida media y viabilidad del ADN, por lo que se utilizan también 
algunas sales como el EDTA (véase Cuadro 1) que funcionan como agentes quelan-
tes de los cofactores de las enzimas ADNasas, algunos detergentes muy concen-
trados para solubilizar las membranas como el SDS, agentes biológicos, como las 
enzimas pectinasas para disolver las paredes celulares y agentes inhibidores de pro-
teínas como el DTT y P-mercaptoetanol los cualesdesestabilizan algunas ADNasas. El 
empleo y la concentración de los diversos reactivos varía de acuerdo a las característi-
cas de la fuente de extracción del ADN. A pesar de lo anterior, la cantidad de ADNasas 
liberadas durante el proceso de extracción es muy alfa, por lo que hay que asegurar 
la estabilidad del ADN controlando la temperatura del proceso, ya que temperatu-
ras extremas muy frías o muy calientes inhiben a las enzimas ADNasas. Lo anterior 
se logra al emplear nitrógeno líquido para asegurar temperaturas muy bajas y el baño 
María para asegurar temperaturas muy altas. Adicionalmente, se puede incrementar 
la velocidad de extracción para impedir una mayor exposición del ADN a los agentes 
Cuadro 1. Principales reactivos empleados para la extracción 
y concentración de los ácidos nucleicos (Sambrook y Rusell, 2001) 
Extracción 
de ácidos 
nucleicos 
Concentración 
de los ácidos 
nucleicos 
Reactivo 
Isotiocianato 
de Guanidina 
EDTA 
CTAB 
SDS 
Acetato de Amonio 
Cloruro de Litio 
Cloruro de Sodio 
Acetato de Sodio 
2 
Solución Stock 
10 M 
0.5 M 
0.1 M 
10% 
10.0 M 
8.0 M 
5.0 M 
3.0 M 
1 
Concentración Final 
3M 
lmM 
lmM 
0.5% 
2.0-2.5 M 
0.8 M 
0.2 M 
0.3 M 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
degradadores. La velocidad de extracción se puede incrementar usando morteros, 
vortex y homogenizadores. Lo anterior exige adicionalmente un cuidado mayor del 
proceso para impedir la fragmentación del ADN (Sambrook y Russell, 2001). 
Limpieza del ADN. Una vez liberado el ADN durante el proceso de extrac-
ción se hace necesaria la purificación del mismo para aislarlo de los agentes 
degradadores. Adicionalmente, los agentes contaminantes conducen a que el 
ADN no sea viable para posteriores aplicaciones moleculares. Los agentes con-
taminantes pueden degradar el ADN a largo plazo, e inhibir algunas reacciones 
enzimáticas tales como la acción de las polimerasas, las cuales son usadas para 
amplificar o secuenciar el ADN. Se utilizan una gran variedad de formas para pu-
rificar el ADN, una de las más usadas es el empleo del detergente catiónico CTAB, 
el cual en condiciones de baja fuerza iónica precipita preferentemente ADN y en 
condiciones de alta fuerza iónica forma complejos con proteínas y polisacáridos 
ácidos. De esta forma, es posible purificar el ADN cambiando la concentración 
de sal en el amortiguador de extracción. Otros reactivos ampliamente emplea-
dos para la purificación de los ácidos nucleicos son las sales caotrópicas, las 
cuales tienen la capacidad de desnaturalizar las proteínas interfiriendo con sus 
estructura terciaria, por lo que son muy empleadas para inactivar ADNasas y 
ARNasas. En el caso particular de las ARNasas, los agentes caotrópicos poseen un 
papel muy importante debido a que las ARNasas están constituidas de ARN y, por 
lo tanto, son inmunes a la mayoría de los agentes químicos con actividad proteo-
lítica. Entre las sales caotrópicas más empleadas se encuentran el isotiocianato 
de guanidina y el cloruro de guanidina. En general es posible eliminar proteínas 
y metabolitos secundarios del ADN al emplear lavados con solventes orgánicos. 
Los solventes que más se emplean son el cloroformo para separar proteínas y el 
fenol para separar polisacáridos. En la mayoría de los casos se utilizan diversas 
etapas de purificación y limpieza del ADN de acuerdo a las características de la 
muestra (Sambrook y Russell, 2001). 
Concentración del ADN. Una vez liberado el ADN durante el proceso de extrac-
ción el siguiente paso consiste en la concentración del mismo para su uso posterior 
en las diversas aplicaciones moleculares. De entre los diversos métodos que hay en 
la literatura el más usado es la precipitación con alcohol. El alcohol elimina el agua 
alrededor de los ácidos nucleicos y expone a los grupos fosfatos cargados negati-
vamente. Los iones positivos de las sales disueltas se unen a estos grupos fosfa-
tos y reducen las fuerzas repulsivas entre las diferentes cadenas de polinucleótidos, 
conduciendo a que estos formen complejos muy densos que finalmente precipitan. 
Se usan diversas sales para lograr este propósito. Entre las sales más comunes se 
encuentran el acetato de amonio, que tiene la ventaja de reducir la precipitación de 
polímeros contaminantes, tales como oligonucleótidos y polisacáridos. Sin embargo, 
22 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
los iones amonio inhiben algunas enzimas usadas en las reacciones posteriores en 
el ADN, por lo que a veces no se recomienda su uso. Otras sales ampliamente usadas 
son el cloruro de litio recomendada para precipitar selectivamente ARN, el cloru-
ro de sodio que se recomienda cuando el amortiguador de extracción contiene SDS 
y el acetato de sodio, el cual es el más utilizado en las precipitaciones preparati-
vas. La elección de la sal a usar durante el proceso de extracción depende de las 
características particulares de la muestra (Ausubel y otros, 2002). Por otra parte, 
es posible purificar el ADN empleando técnicas bioquímicas convencionales como la 
cromatografía de afinidad, usando columnas de hidroxiapatita. En esta técnica 
los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos se unen con el calcio presente en la co-
lumna; posteriormente éstos son eluidos con amortiguadores de fosfato. Este mé-
todo es particularmente útil para la concentración de ADN con alto peso molecular 
independientemente si se encuentra en hebra simple ó doble. Existen otros tipos de 
columnas para aplicaciones específicas del ADN como son las columnas de Sephadex 
y Bio-Gel P-60 cuyo principio es la exclusión por tamaño. Sin embargo, el método 
empleado deberá corresponder a las características del ADN y a SU posible aplicación 
en la concentración de ADN (Sambrook y Russell, 2001). 
Protocolo modificado de extracción con CTAB 
(bromuro de cetil-trimetil-amonio) (Sambrook y Rusell, 2001) 
El protocolo se basa en el tratamiento inicial de la muestra vegetal molida (puede 
ser también utilizado en hongos) con una solución de CTAB caliente, extracción de bs 
proteínas con una solución de cloroformo-alcohol isoamílico, seguido de la precipi-
tación del complejo ADN-CTAB con isopropanol. La pastilla de ADN resultante después 
de centrifugar se lava, seca y resuspende. Dependiendo del tejido que se trate pu-
dieran requerirse pasos adicionales de purificación para remover ARN, polisacáridos, 
polifenoles y otros contaminantes. En el protocolo que se presenta a continuación se 
incluye un tratamiento con RNasa y precipitación con acetato de amonio, para elimi-
nar el ARN y remover algunos polisacáridos. 
Reactivos 
• Nitrógeno líquido. 
• Solución amortiguadora de extracción: CTAB al 2% p/v, NaCl 1.4 M, EDTA 20 
mM, Tris-HCL 100 mM, pH8.0, β-mercaptoetanol al 0.2% (añadido inmedia-
tamente antes de usarse). 
23 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
• Solución de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1). 
• Solución de RNasa: 10 mg mL-1 de RNasa A en Tris-HCl 10 mM, NaCl 15 mM, 
pH 7.5, hervir por 15 min, enfriar a temperatura ambiente y guardar a -20°C. 
• Isopropanol al 100%. 
• Solución de lavado: etanol al 70%, acetato de amonio 10 mM. 
• Solución amortiguadora de TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0. 
• Solución de acetato de amonio 7.5 M. 
Metodología 
1. Moler en un mortero hasta 3 g de tejido fresco ó 0.5 g de material liofilizado 
hasta volverlo un polvo fino utilizando nitrógeno líquido. El nitrógeno no es 
indispensable para el material liofilizado, pero facilita el molido. En caso de 
tejido fresco es importante que el material molido no se descongele antes 
de agregarlo a la solución amortiguadora de extracción, ya que de lo con-
trario las enzimas liberadas degradarán rápidamente el ADN. Si no se tiene 
nitrógeno líquido, el material puede molerse en la solución amortiguadora 
de extracción caliente, pero esto resultará en una menor calidad y rendi-
miento de ADN. 
2. Transferir el polvo lo más rápidamenteposible a 15 mL de solución amorti-
guadora de extracción a 60°C en un tubo con tapa de polipropileno, revolvien-
do los posibles agregados con la ayuda de una espátula. 
3. Incubar por 30 min a 60°C en un baño maría, mezclando suavemente cada 10 
min. La temperatura y tiempo pueden ser optimizadas de acuerdo al tejido ó 
especie utilizados. 
4. Añadir 1 volumen de solución de cloroformo-alcohol isoamílico, tapar nue-
vamente el tubo y agitarlo por 10 min con la mano ó en un agitador orbital. 
La agitación debe ser suave pero con suficiente fuerza y constancia para per-
mitir la emulsificación de las fases. 
5. Centrifugar por 10 min (5 mil xg) a temperatura ambiente. Dependiendo de 
la pureza del ADN deseada la fase superior (acuosa) puede ser re-extraída 
de una a varias veces con solución fresca de cloroformo-alcohol isoamílico. 
6. La fase acuosa final se transfiere a un tubo de centrífuga. Se añade la solución 
de RNasa a una concentración final de 100 μg mL', se mezcla e incuba a tem­
peratura ambiente por 30 min. 
7. Se añaden 0.6 vol de isopropanol frío y se agita suavemente por inversión va-
rias veces. El complejo ADN-CTAB debe observarse como una pelusa o redecilla 
blanquecina, el cual se recupera enrollándolo en un gancho de vidrio formado 
24 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
en la punta de una pipeta Pasteur, transfiriéndolo a la solución de lavado (paso 8) 
y dejándolo secar (paso 9). Si la muestra se ve simplemente floculenta, turbia 
ó definitivamente clara después de haberla mezclado con el isopropanol frío 
(lo cual no es inusual), el precipitado se colecta centrifugando a baja veloci-
dad (2 mil xg) a 4°C. Si una pastilla es visible, se continúa con el paso 8. Si 
no, la solución se guarda a -20°C de 30 min toda la noche y se centrifuga 
nuevamente a 2 500 xg. 
8. Se añaden 20 mL de la solución de lavado, se agita suavemente por unos mi-
nutos, y se precipita por centrifugación (10 min a 5 mil xg y 4°C). Este paso 
remueve el CTAB residual. 
9. Se invierten los tubos y se dejan secar boca abajo sobre una toalla de pa-
pel por aproximadamente una hora. Hay que tener especial cuidado en que 
la pastilla no se desprenda del fondo del tubo. La pastilla no debe tener al final 
etanol residual así como tampoco estar demasiado seco, ya que en ambos casos 
la re-suspensión se dificulta. 
10. Se añade un volumen apropiado de solución amortiguadora de TE (1 mL, por 
ejemplo) dependiendo de los pasos subsecuentes de purificación elegidos, y 
se deja disolver la pastilla por difusión (sin agitar) a 4°C. La duración de éste 
último proceso dependerá de la pureza del ADN obtenido y de la presencia de 
polisacáridos contaminantes. El ADN de alto peso molecular requiere varias 
horas para disolverse. 
Tratamiento opcional con acetato de amonio 
1. Añadir 0.5 vol de solución de acetato de amonio 7.5 M, mezclar y enfriar en 
hielo por 15 min. 
2. Centrifugar por 30 min (10 mil xg, 4°C) y transferir el sobrenadante a un 
tubo nuevo. 
3. Añadir 2 vol de etanol 96%, mezclar por inversión y guardar a -20°C 
por 1 h. 
4. Centrifugar por 10 min (5 mil xg, 4°C), lavar la pastilla con etanol 70% y 
centrifugar nuevamente. 
5. Drenar la pastilla y disolver en un volumen apropiado de solución amorti-
guadora TE. 
El protocolo anterior puede ser escalado a menor cantidad de material inicial, para 
lo cual deberán usarse en tubos de microcentrífuga. Es de hacer notar que el protocolo 
descrito es también adecuado para usarse en la extracción de ADN de hongos. 
25 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Extracción de ADN a partir de un cultivo bacteriano (TSNT) 
(Sambrook y Rusell, 2001) 
Reactivos 
• Solución amortiguadora de TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0. 
• Solución de lisis 2 (TSNT): 2% Tritón X-100, 1% sos, 100 mMNaCl, 10 mM Tris. 
• HClpH 8.0 (para prepararla tomar 4 mL Tritón X-100, 10 mL de SDS al 20%, 
4 mL de NaCl 5 M y 2 mL Tris-HCl pH 8, disolver en 50 mL de agua destilada 
y aforar a 200 mL). 
• Solución de cloroformo-octanol. 
Metodología 
1. Colocar 500 μL de un cultivo bacteriano en un tubo eppendorf de 1.5 mL y 
centrifugarlo a 10 mil rpm durante 2 min. 
2. Descartar el sobrenadante y resuspender la pastilla de bacterias obtenida en 
100 μL de TE IX. 
3. Agregar 400 μL de solución de lisis 2 y 10 mL de proteínasa K (10 mg mL1). 
4. Agregar 500 μL de cloroformo-octanol y agitar vigorosamente. 
5. Centrifugar a 8 mil xg durante 5 min. 
6. Recuperar el sobrenadante y agregar 500 μL de cloroformo-octanol, agitar 
vigorosamente y centrifugar igual que en el paso 5. 
7. Tomar el sobrenadante y precipitar el ADN agregando 2 vol de alcohol 100% y 
0.1 vol de acetato de sodio 3 M, pH 7.52. 
8. Incubar a -20°C durante 1 h. 
9. Centrifugar y lavar la pastilla con etanol 70%. 
10. Centrifugar, secar la pastilla y resuspender en 50 μL de TE IX. 
Protocolo modificado para extracción de ADN genómico de sangre 
(Sambrook y Rusell, 2001) 
El tipo de muestra más común para el análisis del material genético de un animal 
es la sangre, por lo cual se presentan dos protocolos alternativos, que sin embargo 
también pueden adaptarse a otros tejidos. La solución de Chomczynski se utiliza 
para purificar el ADN genómico a partir de células o tejido de origen animal y vegetal, 
26 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
o de bacterias y levaduras. El ADN se purifica en dos pasos: un paso de lisis celular y 
homogenización con la solución de Chomczynski y otro de precipitación con alcohol 
etílico. La simplicidad y rapidez de este método permiten el procesamiento simul-
táneo de gran número de muestras y la reproducibilidad y pureza del ADN obtenido 
permite su uso posterior en cualquier aplicación en biología molecular. 
Reactivos 
• Solución de Chomczynski (ó solución desnaturalizante). 
•• Tiocianato de guanidina 4 M. 
- Citrato de sodio 25 mM, pH 7. 
- 2-mercaptoetanol 0.1 M. 
- Sarcosil (N-lauril sarcosina) al 0.5%. 
Método de preparación: a una botella nueva de tiocianato de guanidina de 
100 g se le añaden directamente 117.2 mL de agua, 7 mL de citrato de sodio 
0.75 M (pH 7), 10.5 mL de sarcosil 10%. Se entibia a 65°C para tener una buena 
disolución. El 2-mercaptoetanol se añade justo antes de utilizar la solución, aña-
diendo 7.2 μL por mililitro de solución. 
• Buffer de lisis. 
Sacarosa 0.32 M. 
Tris 10 mM, pH 7.5. 
MgCl2 5 mM. 
Tritón X-100 1%. 
Metodología 
I) Lisis y Homogenización: 
1. A un volumen de 300 μL de sangre agregar buffer de lisis en proporción 
1: 5 (para 300 μL de sangre, adicione 1 500 μL de buffer de lisis), y agitar 
suavemente hasta lograr lisis celular (± 20 pipéteos suaves). 
2. Centrifugar a 4 mil rpm por 10 min y en forma manual desechar el sobre-
nadante teniendo cuidado de no descartar el pellet obtenido. 
3. Añadir 1 mL de solución de Chomczynski y lisar el precipitado por pipe-
teo suave y repetido. 
27 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
4. Centrifugar el homogenizado por 10 min a 10 mil rpm a temperatura am-
biente. Transfiera el sobrenadante a un microtubo nuevo. Este paso permi-
te eliminar fragmentos insolubles, ARN y polisacáridos. 
II) Precipitación del ADN genómico: 
1. Precipitar el ADN añadiendo 0.5 mL de alcohol etílico absoluto por 
cada mililitro de solución de Chomczynski usada en el paso de homo-
genización. 
2. Mezclar por inversión e incubar por 1-3 min a temperatura ambiente. 
Debido al pequeño tamaño de la muestra utilizada inicialmente, el ADN 
no formará precipitado visible. Por esta razón, se debe centrifugar a 
10 mil rpm por 1-2 min a temperatura ambiente para precipitar el ADN. 
3. Lavar el precipitado de ADN con 1 mL de alcohol etílico al 95%. Agitar por 
inversión y centrifugar a 10 mil rpm por 1-2 min. Repetir este paso. 
4. Desechar el sobrenadante vertiendo el contenido manualmente y dejar se-
car por 5 min temperatura ambiente. Sacar el exceso de alcohol utilizandouna micropipeta, cuidando de no sacar la pastilla. 
5. Disolver el precipitado de ADN en una solución de hidróxido de sodio 8 mM 
por pipeteo suave y repetido (utilice 50 μL para resuspender). 
Protocolo de fenol caliente para la extracción de ADN 
de biopelículas ambientales (Narváez-Zapata y otros, 2005) 
El método de extracción descrito a continuación es una optimización del proce-
so de lavado fenol: cloroformo descrito preliminarmente por Sambrook y Rusell 
(2001) y que ha sido aplicado en plantas. Este método, de acuerdo a los autores, 
resulta ser eficiente para la remoción de contaminantes, principalmente de poli-
sacáridos y proteínas, empleando combinaciones de fenol: cloroformo, ya que la 
combinación de los dos tipos de solventes orgánicos resulta ser más eficiente que 
uno solo. Así mismo, el fenol resulta ser adecuado para la desnaturalización de 
las proteínas, mientras que el cloroformo actúa inhibiendo la actividad de las 
RNasas. El empleo posterior de cloroformo remueve cualquier residuo de fenol 
que pudiera haber quedado en la preparación de los ácidos nucleicos obtenidos 
(Sambrook y Rusell, 2001). Dado que una de las principales características de 
las biopelículas es una alta concentración de polisacáridos y otros contaminan-
tes orgánicos originarios de las microorganismos presentes y del sustrato, como 
primer paso es necesario implementar una remoción de contaminantes y de 
28 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
protección de los ácidos nucleicos, con el fin de obtener ADN con un grado de pu-
reza y concentración adecuadas para su posterior amplificación por PCR. Los pasos 
críticos del protocolo se describen brevemente a continuación, cabe señalar que 
una descripción detallada de los diferentes pasos se realiza más adelante. 
Primeramente es necesario establecer un amortiguador de extracción adecuado 
para este tipo de muestras que no incluya enzimas costosas. Adicionalmente, se 
debe escalar el volumen del amortiguador a pequeñas cantidades con el fin de op-
timizar velocidad y costos. El amortiguador seleccionado es el Tris-HCl, ya que ha 
demostrado ser adecuado para mantener la integridad y viabilidad del ADN durante 
mucho tiempo, a la solución se adiciona con EDTA y SDS, con el fin de desestabili-
zar los cofactores de las enzimas ADNasas y disolver las membranas celulares de 
las bacterias, respectivamente. La solución final se ajusta a 10 mM Tris pH 7.5, 1 
mM EDTA y 0.5% SDS, abreviada como TES. Otro aspecto importante con respecto 
a la extracción es la cantidad de material biológico que resulta ser adecuada para 
el aislamiento exitoso del ADN; es decir, la cantidad mínima de biopelícula que 
es necesaria para obtener una buena concentración de ADN, ya que un exceso de 
muestra podría obstaculizar la acción del amortiguador de extracción, debido a 
una sobresaturación de contaminantes. 
El segundo paso consiste en determinar las condiciones de los lavados con sol-
ventes orgánicos, tales como la cantidad de fenol: cloroformo y las temperaturas 
de los reactivos adecuadas para la remoción de los residuos celulares, así como 
los tiempos y temperatura de las centrifugaciones involucradas en estas etapas de 
limpieza del ADN. El tercer paso consiste en determinar las condiciones adecuadas 
para la concentración del ADN, procediéndose a definir las cantidades de sal y alcohol 
necesarias para la precipitación del ADN liberado. Las condiciones iniciales son esta-
blecidas a partir de las propuestas por (Sambrook y Rusell, 2001) para isopropanol 
(1 V de buffer de extracción / 1 V de alcohol), etanol (1 V de buffer de extracción / 
2.5 V de alcohol) y NaCl (1 V de buffer de extracción / 0.1 V de la sal). En la etapa 
final, es necesario implementar dos lavados extras con etanol absoluto y al 70% 
en la pastilla de ADN aislado, encaminados a la remoción de residuos de fenol y 
contaminantes orgánicos restantes tales como los polisacáridos, abundantes en las 
biopelículas marinas. 
Reactivos 
• Solución amortiguadora de TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH8.0. 
• Solución amortiguadora de TES: 10 mM Tris pH 7.5, 1 TΠMEDTA, 0.5% SDS. 
• Fenol pH 8. 
29 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
• Fenol: cloroformo 5: 1 precalentado a 65°C. 
• Isopropanol. 
• NaC15M. 
El método final basado en fenol caliente para la extracción de ADN de biopelículas 
marinas se describe a continuación. 
Metodología 
I) Extracción, limpieza y concentración inicial: 
1. Raspar aproximadamente 0.5 gramos de biopelícula con un bisturí estéril. 
2. Resuspender el material biológico en aproximadamente 1.2 mL de buffer 
TES (10 mMTris pH 7.5, 1 mMEDTA, 0.5% sos) en un tubo Eppendor. 
3. Tomar 400 μL y pasar a un nuevo microtubo. 
4. Adicionar 400 μL de fenol: cloroformo 5: 1 precalentado a 65°C, fenol pH 8. 
5. Incubar a 65°C por 30 min, vortex cada 5 min. 
6. Enfriar a -20°C por 5 min. 
7. Centrifugar a 4°C por 15 min a 12 mil rpm. 
8. Tomar la fase acuosa y transferir a un nuevo microtubo. 
9. Agregar nuevamente 400 μL de fenol: cloroformo 5: 1, vortex 3 veces 
30 segundos. 
10. Centrifugar a 4°C por 5 min a 12 mil rpm. 
11. Tomar la fase acuosa y agregar 400 μL de cloroformo frío, vortex 3 veces 
30 segundos. 
12. Centrifugar 5 min a 12 mil rpm. 
13. Tomar la fase acuosa, pasar a un nuevo tubo, agregar 1 mil μL de isopro­
panol y 20 μL de NaCl. 
14. Precipitar a - 20°C por 30 min (en esta etapa se puede almacenar el ADN). 
15. Centrifugar a 12 mil rpm, 30 min a 4°C. Resuspender la Pastilla en 50 μL 
de buffer TE. 
II) Primer Lavado Extra: 
1. Aforar a 100 μL la preparación de adn con buffer te. 
2. Agregar 2.5 volúmenes de etanol y 0.5 volúmenes de NaCl. 
3. Precipitar a -20°C durante 30 min. 
4. Centrifugar a 12 mil rpm, 30 min a 4°C. 
30 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
III) Segundo Lavado Extra: 
1. Decantar sobrenadante, agregar a la pastilla de ADN 2.5 volúmenes de eta-
nol y 0.5 volúmenes de NaCl. 
2. Precipitar a -20°C durante 30 min. 
3. Centrifugar a 12 mil rpm, 30 min a 4°C. 
4. Resuspender la pastilla en 50 μL de agua estéril. 
Extracción de ADN metagenómico por el método de sílice 
(Roj as-Herrera y otros, 2008) 
Uno de los principales retos de la biotecnología vigente es conocer los cambios 
que actualmente sufre la microdiversidad del planeta en función de la gran varie-
dad de hábitats naturales y de los cambios que ocurren en el mundo, producto de 
eventos naturales y de la intervención humana. Hasta la fecha, se desconoce una 
parte muy grande de esta microdiversidad debido principalmente a que las técni-
cas que se implementaban consideraban únicamente a los microorganismos que 
podían ser cultivados bajo condiciones específicas de nutrimentos, temperatura y 
osmolaridad. Esto sin considerar el amplio rango de microambientes donde éstos 
se desarrollan y las relaciones biológicas que imperan entre ellos. Lo anterior 
provocó que se conociera muy poco de aquellos microorganismos que viven en 
ambientes extremos y/o de aquellos que viven en relaciones simbióticas muy par-
ticulares con otros seres vivos. Todos estos microorganismos fueron clasificados 
como no cultivables y continúan siendo un reto para la microbiología moderna. 
Todos los microorganismos comparten secuencias de ADN que han coevolucionado 
con ellos mismos y que pueden ser usadas para su clasificación e identificación. 
Entre éstas, destaca la secuencia del ADN ribosomal que ha sido empleada recien-
temente en el análisis de muestras ambientales ya sea en ambientes extremos o 
en microorganismos que viven en relaciones simbióticas. Está aplicación es co-
múnmente llamada como "no cultivable" y el ADN resultante es frecuentemente 
llamado ADN metagenómico. El método de extracción que se aplica en este tipo 
de muestras no emplea lavados orgánicos ni precipitaciones con alcohol para pu-
rificar el ADN. El método fue inicialmente desarrollado a partir de polvo de diato-
meas,el cual contiene elevadas cantidades de dióxido de silicio y se basa en que 
el ADN pueden unirse a este compuesto en presencia de altas concentraciones de 
sales caotrópicas como el ioduro de sodio (Koo y otros, 1998). Dichas sales tienen 
la capacidad de desnaturalizar proteínas interfiriendo con su estructura terciaria 
(Ausubel y otros, 2002). 
31 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Reactivos 
• Solución amortiguadora de TEN: 100 mM Tris-HCI (pH 8.0), 50 mM EDTA 
(pH8.0), 500mMNaCl 
• Lisozima (10 mg/mL). 
• SDS 20%. 
• Acetato de potasio 5 M. 
• Suspensión de silica. 
• Alcohol al 70%. 
Metodología 
Centrifuga y trabaja con el pellet 
1. Pulverizar 0.5 g de muestra en 1 mL de amortiguador TEN (100 mM 
Tris-HCI pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 500 mM NaCl) utilizando un 
homogenizador ó macerar con nitrógeno líquido, colocándolo en 
un microtubo. 
2. Vortex 1 min hasta la completa resuspensión y adicionar 20 μL de liso-
zyma (10 mg mi/1) (PVPP, en caso de muestras con elevados niveles de 
fenolización). 
3. Incubar 1 h con agitación leve a 37°C, posteriormente enfriar en hielo 
10 min y calentar a 65°C por 5 min, repetir dos veces más el choque 
térmico. 
4. Adicionar 100 μL de SDS 20%, vortex 1 min e incubar 30 min a temperatura 
ambiente (vortex cada 5 min). 
5. Centrifugar a 10 mil g por 10 min, transferir el sobrenadante a un nuevo 
tubo y agregar 500 μL de acetato de potasio 5 M, incubar a 65°C por 5 min 
y luego colocar en hielo por 20 min. 
6. Centrifugar a 20 mil xg por 30 min a 4°C, transferir el sobrenadante a un 
nuevo tubo y agregar 200 μL de la suspensión de sílice (2 g of SiO2 en 
50 mL de agua), mezclar suavemente por 3 min. 
7. Centrifugar a 16 mil xg por 2 min y descartar el sobrenadante. 
8. Lavar la pastilla de ADN con alcohol al 70%, resuspender el ADN en 30 μL de 
agua, incubar a 55°C por 5 min. 
9. Centrifugar a 16 mil g por 2 min y transferir el sobrenadante con el ADN 
resuspendido a un nuevo tubo. 
32 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
Extracción de ARN 
El aislar y purificar ARN es un proceso que requiere de un alto grado de control en 
equipo y procedimientos a utilizar, y se debe evitar a toda costa la presencia de 
ARNasas, por lo que, antes de describir un protocolo de extracción típico, a conti-
nuación se dan una serie de indicaciones que aumentarán la posibilidad de éxito al 
trabajar con éste tipo de ácidos nucleicos. 
Manipulación efectiva del ARN 
1. Es recomendable separar material para su uso exclusivo con ARN, y usar 
siempre guantes, que deberán cambiarse frecuentemente, así como cubre-
boca y cofia. 
2. El material plástico deberá ser nuevo, estéril y libre de ARNasas. 
3. Para la vidriería, deberá ser lavado y horneado a 180°C durante al me-
nos 8 h. El material plástico (polipropileno) deberá ser enjuagado con 
cloroformo. 
4. La cámara de electroforesis deberá ser lavada con una solución de deter-
gente, enjuagada con agua destilada, después enjuagada con etanol, y se 
deberá llenar con una solución de H202 3%, dejar reposar 10 min a tem-
peratura ambiente, y ser finalmente enjuagada con agua tratada con DEPC 
(dietilpirocarbonato) al 0.1%. 
5. Los reactivos deberán manipularse con espátulas horneadas, y el agua a 
utilizar deberá ser esterilizada. 
6. Siemp're y cuando los reactivos lo permitan, las soluciones deberán tratarse 
con DEPC al 0.1% por al menos 12 h a 37°C, y luego calentarse a 100°C por 
15 min, o autoclavearse 15 min a 15 Ib pulg^2 en ciclo húmedo. {NOTA: no 
aplicar este tratamiento a soluciones de Tris o cualquier otro compuesto 
aminado). 
7. Usar un inhibidor de ARNasas proteico (hay varios nombres comerciales 
de esa proteína, y que son similares al inhibidor de la angiogenina), o se 
puede usar la arcilla denominada Macaloid. 
8. Para romper las células e inactivar las ARNasas al mismo tiempo, se 
puede utilizar una solución de hidrocloruro de guanidina y tiociana-
to de guanidina, y luego agregar un agente reductor, por ejemplo el 
β-mercaptoetanol. 
33 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Protocolo de extracción de ARN 
(Cold Spring Harbor Protocol, 2006) 
Este protocolo está optimizado para hongos y levaduras. Se basa en una precipitación 
selectiva del ARN por la sal LiCl, la cual tiene más afinidad por el ARN que por el ADN. 
Reactivos 
• Solución LETS. 
LiCl 0.1 M. 
EDTA 10 m M . 
SDS 0.2%. 
Tris-HCl 10 mM, pH 7. 
Metodología 
1. Inocular precultivos de las cepas toda la noche. 
2. Inocular 100 mL de medio fresco con estos precultivos ajustando a uno D.O.600 
= 0.1 y recuperar hasta D.O.600 0.6 a 1.0. 
3. Centrifugar los 100 mL del cultivo por 5 min a 3 mil 500 rpm y 4°C. 
4. Lavar con H20 libre de ARNasas (unos 10 mL), volver a centrifugar. 
5. Congelar la pastilla a -80°C toda la noche (opcional). 
6. Mantener las muestras en hielo. 
7. Preparar microtubos de 2 mL con perlas de vidrio. 
8. Poner las células y añadir 500 μL de LETS y 500 μL de fenol. 
9. Romper las células con seis agitaciones de 30 s con periodos de 30 s en hielo 
entre los distintos pases. 
10. Centrifugar a 4°C durante 5 min a 13 mil rpm. 
11. Recoger el sobrenadante en microtubos y extraer con fenol-cloroformo 25: 25 
frío. Agitar en el vértex. 
12.Centrifugar a 4°C durante 5 min a 13 mil rpm. 
13. Recuperar el sobrenadante y extraer con cloroformo frío. Agitar en el vórtex. 
14. Centrifugar a 4°C durante 5 min a 13 mil rpm. 
15. Recuperar el sobrenadante y precipitar con 1 vol de LiCl 5 M. 
16. Guardar a -20°C durante 3 h (preferentemente toda la noche). 
17. Centrifugar a 4°C durante 15 min a 13 mil rpm. 
18. Lavar con EtOH 70% (unos 500 μL). 
34 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
19. Dejar secar la pastilla. 
20.Resuspender en 500 μL de H 20. 
21. Precipitar con 1/10 del vol de AcNa 3 M y 2 vol de EtOH absoluto. 
22.Guardar a -20°C por 2 h. 
23. Centrifugar a 4°C durante 15 min a 13 mil rpm. 
24.Lavar con EtOH 70%. 
25. Secar 1-2 min al vacío. 
26.Resuspender en un volumen apropiado (30-50 μL) y cuantificar una dilución 
1/50 en el espectrofotómetro a 260 y 280 nm para determinar la calidad y 
cantidad del ARN obtenido. 
Protocolo de extracción de ARN de plantas 
(Narváez-Zapata y otros, 2002) 
El método desarrollado emplea fenol caliente en el buffer de extracción y una preci-
pitación selectiva con urea y LiCl (De Vries y otros, 1988; Schuler y Zielinski, 1989). 
El método se describe a continuación: 
Reactivos 
• Amortiguador de lisis: 50 mM Tris-HClpH 8.5, 10 mM EDTA, 200 mMNaCl. 
• Fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (50: 49: 1). 
• Ethanol absoluto. 
• NaC15M. 
• Urea 8 M. 
• LiCl 10 M. 
• Acetato de Potasio 3 M. 
• Solución amortiguadora de TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mMpH8.0. 
Metodología 
1. Un gramo de tejido es macerado con nitrógeno líquido, posteriormente es resus-
pendido en 20 mL de amortiguador con 50 mMTris-HClpH8.5,10 IΠMEDTA, 200 
mMNaCl y 20 mL de solución fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (50: 49:1). 
2. La suspensión se incuba 10 min a 80°C en agitación constante e inmediata-
mente se enfria en hielo. 
35 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
3. Posteriormente se centrifuga a 8 mil xg durante 5 min en una centrífuga 
Beckman J2-21. El sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo y se centri-
fuga una vez más con un volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 
(50: 49: 1). 
4. Recuperar el sobrenadante y precipitar con un volumen de isopropanol a 
-20°C durante 30 min y se centrifugó a 8 mil xg por 30 min. 
5. Posteriormente la pastilla obtenida es resuspendida en 5 mL de amortigua-
dor TE y se realiza una segunda precipitación con dos volúmenes de etanol 
absoluto frío y 0.1 vol de NaCl 5 M, durante 30 min a -20°C, para limpiar 
del exceso de fenol. 
6. Posteriormente se centrifugar a 7 mil xg por 20 min y se resuspender en 
0.5 mL de buffer TE. 
7. En este punto el ARN se encuentra contaminado con ADN y polisacáridospor lo 
que se realiza una precipitación selectiva con 0.25 vol de urea 8 M y 0.25 vol 
de LiCl 10 M durante 12 horas a -20°C. 
8. El ARN se recupera al centrifugar a 15 mil xg durante 30 min a 4°C, la pas-
tilla obtenida se resuspende en 0.5 μL de buffer TE y se vuelve a precipitar 
con dos volúmenes de etanol absoluto frío y 0.1 vol de AcK 3 M durante 20 
min a 20°C. 
9. La pastilla se recupera centrifugando a 15 mil xg con 4°C durante 20 
min. El ARN obtenido se resuspende en 0.5 mL de agua y se le agrega un 
volumen de etanol al 20%, posteriormente a la resuspensión se le agrega 
un volumen de cloroformo, se agita brevemente, y se centrifuga a 3 mil xg 
para obtener un sobrenadante, el cual se transfire a un nuevo tubo donde 
se precipita el ARN nuevamente con 2.5 volúmenes de etanol absoluto y 
0.1 vol de NaCl, se almacena a -80°C para su uso posterior. 
10. La cantidad de ARN aislado se cuantifica por espectofotometría a 260 nm 
y su integridad se verifica en un gel de agarosa al 1% no desnaturalizante 
corrido a 60 volts durante 1 hora. 
Optimización de la fracción de ARNΠI 
(Rodríguez-Ávila y otros, 2008) 
En algunas ocasiones los rendimientos del ARN total no son suficientes o no son via-
bles para la manipulación posterior del mismo, sobre todo, cuando se usan fraccio-
nes de ARN mensajero a partir de muestras con potenciales sustancias contaminantes. 
Por lo anterior se presenta un protocolo para optimizar muestras de ARN total para la 
obtención de fracciones enriquecidas de ARN mensajero de alto peso molecular. 
36 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
Reactivos 
• Cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1). 
• β-mercaptoetanol. 
• DNasa I 10X. 
• rDNasa I. 
• Reactivo de Inactivación de la DNasa I. 
Metodología 
1. Las muestras de ARN total deben ser purificadas utilizando una partición orgá-
nica inicial del lisado celular con 0.5V de una solución de cloroformo: alcohol 
isoamílico (24: 1) y 0.1V de β-mercaptoetanol. 
2. Posteriormente, debe aplicarse algún sistema comercial de extracción o bien 
alguno de los protocolos ya descritos anteriormente. 
3. La muestra de ARN total y final debe ser purificada del ADN contaminante 
que con frecuencia suele aislarse en los procesos de purificación del mis-
mo. Se procede a la eliminación del ADN contaminante presente con 0.1V 
de buffer 10X DNasa I y 1 μL de rDNasa I (2 U/μL). Dicha mezcla de reac­
ción se dejó incubando a 37°C por 30 min, para posteriormente proceder a 
adicionar 0.1V de reactivo de inactivación de la DNasa I; dejar incubando 
nuevamente las muestras, pero en esta ocasión a temperatura ambiente y 
durante 2 min. Finalmente, se procede a centrifugar por 1.5 min a 10 mil 
xg y 4°C, transfiriendo el sobrenadante conteniendo al ARN libre de ADN a 
un nuevo tubo. 
4. El ARN mensajero resultante puede ser guardado para aplicaciones posteriores 
a -80°C. 
Protocolos de cuantificación de ácidos nucleicos: 
espectrofotometría y electroforesis 
Cuantificación de los ácidos nucleicos 
Actualmente, se emplean dos tipos de métodos para medir la cantidad de áci-
dos nucleicos en las preparaciones obtenidas a través de los diversos protocolos 
de extracción. Si la muestra es pura, es decir, sin cantidades significativas de 
37 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
contaminantes como pueden ser proteínas, fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos, 
la medición espectrofotométrica resulta ser el método de elección por ser simple 
y preciso. El método consiste en términos generales en cuantificar la cantidad de 
rayos uv absorbidos por las bases nitrogenadas. Por otro lado, si la cantidad 
de ADN obtenida es muy pequeña o bien, si la muestra contiene cantidades sig-
nificativas de impurezas, la cantidad de ácidos nucleicos puede ser estimada a 
través de la intensidad de fluorescencia. Lo anterior se logra por intercalar en el 
ADN agentes fluorogénicos tales como el bromuro de etidio o el Hoechst 33258 
los cuales fluorescen cuando el ADN es expuesto a radiación uv (Sambrook y 
Rusell, 2001). 
Espectrofotometría 
Se emplea principalmente para preparaciones de ácidos nucleicos libres de impure-
zas. El ADN se cuantifica a 260 nm. El rango de absorbancia entre 260 y 280 nm se 
emplea comúnmente para comprobar la contaminación de preparaciones de ADN y 
ARN con proteínas. Sin embargo, al realizar cuantificaciones de ácidos nucleicos se 
puede incurrir fácilmente en errores, ya que los ácidos nucleicos presentan absor-
bancias elevadas a 260 nm y, sólo niveles significativos de contaminación por proteí-
nas podrían causar un cambio en el rango de absorbancia de 260-280 nm (Sambrook 
y Rusell, 2001). Los coeficientes específicos de absorción del ADN y del ARN pueden 
ser afectados por la fuerza iónica y el pH de la solución. Por tanto, la cuantificación 
de los ácidos nucleicos solamente se podrá efectuar cuando la fuerza iónica de la 
solución es baja y el pH está rigurosamente controlado (Sambrook y Rusell, 2001). 
Por otro lado, este método de cuantificación solo permite emplear volúmenes de 
solución con concentraciones de ácidos nucleicos de 5 ug mL~' hasta 90 ug mL~' 
(Sambrook y Rusell, 2001). 
Cuantificación de ácidos nucleicos y oligonucleótidos 
por espectrofotometría 
Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta debido a la pre-
sencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de las cadenas de ADN. La 
absorción de luz ultravioleta (uv) por el ADN es una característica de la mo-
lécula, que es usada eficientemente para determinar su concentración. Cada 
una de las bases tiene su propio y único espectro de absorción y por lo tanto 
contribuye de manera diferente a la propiedad total de absorción de uv de una 
38 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
molécula de ADN. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de contribución de 
cada una de las bases al espectro de absorción de uv de una molécula de ADN 
de doble cadena de alto peso molecular (dsADN) puede ignorarse. Sin embargo, 
esas contribuciones son más significativas cuando se trata de oligonucleótidos 
y deben ser consideradas si se requiere determinar correctamente la concen-
tración. Los ácidos nucleicos tienen un máximo de absorción a una longitud de 
onda de 260 nm. A esta longitud por lo tanto, la absorción es proporcional a la 
concentración molar. 
C (pmol/μL) = (A260 * 100 * Factor de dilución) / (1.54 *nA + 0.75*nC + 1.17 
*nG + 0.92 * nT) 
En la fórmula: 
C, es la concentración calculada en picomoles por microlitro (pmol μL '̂)• 
A260, es la absorbancia a 260 nm. 
El denominador consiste de la suma de los coeficientes de cada base multiplica­
dos por el número de veces que aparece en el oligonucleótido. El factor de dilución 
es igual a el volumen final de la dilución dividido entre la cantidad de alícuota para 
la dilución. 
Para ADN de doble cadena: 
Protocolo para medir la absorbancia de un oligonucleótido 
1. Encender y dejar estabilizar la lámpara de uv (se recomiendan alrededor de 
20 min) del espectrofotómetro para su calentamiento y seleccionar la longi-
tud de onda a 230 y 260 nm. 
2. Usar agua bidestilada en una celda de cuarzo y utilizarla como blanco de re-
ferencia (una celda de plástico no trasmite eficientemente la luz ultraviloleta y 
por lo tanto NO debe utilizarse para este procedimiento). 
3. A 990 μL de agua bidestilada en un tubo de 1.5 mL, agregar 10 μL de solución 
de oligonucleótido, mezclar bien y transferir a la celda de cuarzo que se utilizó 
para el blanco. 
4. Leer la absorbancia a 230 y 260 nm de la muestra. 
39 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
Notas: 
1. A 260 nm, el ADN debe mostrar una absorbancia máxima. 
2. El valor de la lectura a 230 nm (longitud de onda mínima) está influenciado 
por la cantidad de sales presentes en la muestra. 
La cantidad de oligonucleótido también se expresa como Unidades de Densidad 
Óptica (D.O.); esto es, la cantidad de oligonucleótidodisuelto en 1 mL de agua con 
un valor de A260 igual a 1.0 en una celda de 1 cm de longitud, y se calcula por la 
ecuación: 
Unidades D.O. = A,,„ * volumen del stock * factor de dilución 
El valor de A260 se convierte a μg mL'
1 usando el coeficiente de extinción para 
SSADN la cual es 1 mL por cada 33 μg para una celda de 1 cm de longitud. Por lo 
tanto, para un valor de D.O. de 1.0, en principio la muestra contiene 33 μg de SSADN 
por mililitro o en la ecuación: 
1 unidad de D.O. de SSADN = 33 μg 
La concentración de ARN se determina por el mismo protocolo que el utilizado 
para la medición de ADN. Sin embargo, se aplica la siguiente relación: 
1 unidad A260 de ARN = 40 μg mL"
1 
Las preparaciones puras de ARN tienen una relación A260 / A280 de 2.0 
Concentración de ARN (μg μL-1) = (D.o.260nm * factor de dilución * 40) /1 000 
Fluorometría 
El Hoechst 33258 es un marcador fluorescente de la clase de los bis-benzimidazole 
y tiene una alta especificidad por el ADN de doble hebra. La concentración de ADN es 
estimada mediante la construcción de una curva estándar tomando como referencia 
una concentración conocida de ADN (10-250 ng/mL). La intensidad de la emisión es 
aproximadamente 1 mil veces mayor que la concentración de ADN contenida en la 
muestra. Este tipo de análisis no se puede efectuar en condiciones extremas de pH 
y concentraciones elevadas de sales y detergentes, ya que estos factores afectan los 
40 
Principios básicos de la electroforesis 
Las mezclas complejas de moléculas tales como proteínas, ADN O ARN se separan 
en un campo eléctrico de acuerdo al tamaño y a su carga eléctrica. La electricidad 
empuja las moléculas a través de los poros del gel, que es una sustancia firme 
como la gelatina. El gel puede hacerse de manera que sus poros tengan distintas 
dimensiones para separar las moléculas según el rango específico de tamaños y 
formas. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las más grandes. 
Las moléculas ARN y ADN pequeñas, de unos pocos cientos de pares de nucleótidos o 
menos, por lo general se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. 
Las moléculas de mayor tamaño tienen problemas para desplazarse a través de la 
cerrada trama de la poliacrilamida y en general se fraccionan en el gel de agarosa, 
que tiene mayor porosidad. 
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas; se disuelve en so-
lución amortiguadora caliente, se vierte en un molde y luego se forma el gel 
descendiendo simplemente la temperatura. El gel con agarosa en baja concen-
tración (0.8%) se emplea para separar fragmentos de ADN de mayor tamaño. 
La separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel se basa en 
principios similares a los que operan durante el fraccionamiento de proteínas 
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. 
41 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
resultados obtenidos por este método; las preparaciones del ADN a analizar deben 
estar libres de bromuro de etidio. Este método es eficiente para preparaciones que 
contienen bajas concentraciones de ADN y ARN (Sambrook y Rusell, 2001). 
Transiluminador uv 
Es un método rápido y sensible que utiliza la fluorescencia producida por los rayos 
uv como resultado de la intercalación de moléculas de bromuro de etidio en el 
ADN. Para ello, es necesario realizar una electroforesis horizontal en gel de agarosa 
adicionado con 0.5 μg mL^1 de bromuro de etidio. El gel de agarosa separa frag­
mentos de ADN de acuerdo a su peso molecular, mientras que el bromuro de etidio 
intercalado en los ácidos nucleicos emite fluorescencia al suministrar radiación 
ultravioleta, permitiendo su visualización y documentación fotográfica. Adicio-
nalmente, es necesario cuantificar la fluorescencia de un ADN de concentración 
conocida (estándar) para estimar la concentración de la muestra problema (Sam-
brook y Rusell, 2001). 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
A diferencia de las proteínas, todas las moléculas de ácidos nucleicos, cualquie-
ra que sea su longitud, tienen una densidad de carga similar (número de cargas 
negativas por unidad de masa) y, por lo tanto, todas tienen potencial equivalente 
para desplazarse en un campo eléctrico. El gel de poliacrilamida o agarosa su-
ministra la resistencia necesaria para el desplazamiento, de modo que cuanto 
mayor sea el peso molecular de una molécula de ARN o ADN, más lentamente se 
desplaza a través del gel. 
La sensibilidad de la electroforesis en gel es tan grande que con esta técnica 
se pueden separa moléculas de ADN o de ARN que solo difieren por un nucleó-
tido, característica que le confiere un gran valor como método para secuen-
ciar ADN. Dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, 
el parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) es realmente la 
relación carga/masa. Sin embargo, el efecto de retardo debido al gel depende 
del tamaño molecular. Como resultado neto, la electroforesis separa los frag-
mentos de ácido nucleico según su tamaño o longitud, expresado en nucleó-
tidos (si son de hebra sencilla) o en pares de bases (si son de doble hebra, 
caso común del ADN). ES por ello posible, establecer una curva de calibrado 
que relacione la movilidad con la longitud en pares de bases (PB). Para conse-
guir una recta se suele representar tamaño versus 1/movilidad o log (tamaño) 
versus la movilidad. 
Las múltiples bandas de ADN en un gel pueden ser detectadas si han de ais-
larse unas de otras. El ADN de doble cadena es teñido por agentes catiónicos 
aromáticos planares como el ion etidio, el anaranjado de acridina o la profla-
vina (véase Figura 6). Estos agentes se unen al ADN dúplex por intercalación, 
exhibiendo fluorescencia bajo una luz uv. Hasta 50 ng de ADN pueden ser de-
tectados por la tinción con bromuro de etidio. Los ácidos nucleicos de una 
Bromuro de etidio Naranja de acridina 
Figura 6. Moléculas de los agentes intercaladores. 
42 
JOSÉ A. NARVÁEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRÍGUEZ-LUNA 
sola hebra también estimulan la fluorescencia del etidio, pero en una menor 
cantidad de la que ocasiona el ADN dúplex (véase Cuadro 2). 
Reactivos 
Solución amortiguadora TBE 5X (pH final 8.3). 
• 54 g Tris base. 
• 27.5 g ácido bórico. 
• 20 mL de 0.5 M EDTA pH 8. 
Metodología 
1. Disuelva 1.5 g de agarosa en 100 mL de solución TBE 0.5 X y caliente la mez-
cla hasta lograr la disolución total de la agarosa. 
2. Una vez disuelta la agarosa, deje enfriar hasta aproximadamente 55°C an-
tes de vaciar en el molde. El grosor típico del gel, para este tipo de análisis, 
es de alrededor de 0.5 cm. Tenga en cuenta que el tamaño del orificio en 
donde se aplicará la muestra, esta determinado por el grosor del gel y por 
el grosor del peine. 
3. Una vez que el gel se ha formado, retire el peine y los extremos de la cámara 
(si estos han sido sellados para la preparación del gel). 
4. Coloque el gel con cuidado en la cámara de electroforesis y agregue su-
ficiente solución TBE 0.5 X para cubrir el gel. Evite la presencia de bur-
bujas de aire atrapadas entre el gel y la cámara, así como en los orificios 
formados por el peine. 
Agarosa 
(%) p/v 
1.0 
1.5 
2.0 
Fuente: elaboración 
Cuadro 2. Características de movilidad del ADN 
durante la electroforesis en geles de agarosa 
propí 
Rango 
de separación (PB) 
350-7 000 
200-4 000 
100-2 000 
a. 
4 
Xilencianol 
equivale a: 
6 500 PB 
3 000 PB 
1 500 PB 
3 
Azul de bromofenol 
equivale a: 
1 000 PB 
450 PB 
240 PB 
CAPÍTULO I. Los ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU CUANTIFICACIÓN 
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) como método 
para la verificación de la viabilidad de los ácidos nucleicos 
La PCR es una técnica análoga al proceso de replicación del ADN que tiene lugar 
en las células y hoy día es una de las técnicas moleculares que ha tenido mayor 
impacto en los estudios de biología molecular. Una de las razonesdel éxito de 
esta técnica se debe a que es un método simple y relativamente fácil; por tal mo-
tivo, se emplea frecuentemente en el análisis del ADN, así como en los procesos 
moleculares que se llevan a cabo en las células (Walker y Rapley, 2000). Por otro 
lado, la PCR es un método sensible y específico para la detección y monitoreo de 
microorganismos presentes en muestras ambientales complejas. La detección 
exitosa y la caracterización del ADN microbiano requieren de una eficiente ex-
tracción de ADN, además de la adecuada purificación de los contaminantes que 
pudieran inhibir la PCR. 
44 
JOSE A. NARVAEZ-ZAPATA, CLAUDIA P. LARRALDE-CORONA E ISABEL C. RODRIGUEZ-LUNA 
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46 
Las enzimas de restricción se producen en las bacterias como un mecanismo de defensa en contra de la infección por fagos. Estas proteínas fueron des-cubiertas hace más de 30 años por Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel 
Nathans, y su uso entre los biólogos moleculares se hizo común desde final de los 
70's. Aunque el descubrimiento y caracterización de las enzimas de restricción per-
mitió en gran medida el desarrollo de lo que hoy se conoce como "tecnología del ADN 
recombinante", actualmente el principal uso de las enzimas de restricción se ha aco-
plado a nuevas tecnologías principalmente la Reacción en Cadena de la Polimerasa. 
Este capítulo contiene información general de las enzimas de restricción y especí-
fica sobre la aplicación de las endonucleasas de restricción tipo II en la búsqueda y 
caracterización polimorfismos en regiones específicas del genoma. 
Historia y orígenes 
Uno de los principales resultados de los estudios en genética bacteriana fue el 
descubrimiento de las endonucleasas de restricción. Éstas, se definen como en-
zimas que reconocen específicamente secuencias de ADN y cortan sus cadenas ya 
sea en el sitio de reconocimiento o a cierta distancia de éste. La descripción de 
los sistemas de restricción fue el resultado del establecimiento de los mecanismos 
47 
Capítulo II 
Enzimas de restricción 
Ana M. Sifuentes-Rincón 
Xochitl F. De la Rosa-Reyna 
Introducción 
CAPÍTULO II. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 
de infección de los bacteriófagos, en donde se observó que un fago podía cre-
cer adecuadamente en una cepa A de bacterias, sin embargo cuando éste in-
fectaba una cepa B (de la misma especie que la A) su crecimiento se disminuía 
considerablemente. Adicio-nalmente se observó, que las pocas partículas fágicas 
recuperadas de la infección de la cepa B, adquirían la capacidad de infectar eficien-
temente a ésta cepa pero disminuían su capacidad de infectar la cepa A. Este fenó-
meno fue denominado variación controlada por el hospedero, ya que el fenotipo 
(infectividad) del fago claramente se correlacionaba con el hospedero. Con estos 
resultados se sugirió que algún componente específico para la replicación del fago 
estaba siendo modificado de manera específica por la cepa hospedera, este com-
ponente resultó ser el ADN. Estudios posteriores demostraron que la disminución 
del crecimiento de fagos en cepas no específicas era causada por la degradación de 
su ADN, la cual se inicia con el corte específico seguida por el corte total y al azar 
de esta molécula. El genoma de la bacteria y el del fago de infección específica 
se protege de la degradación mediante un mecanismo de modificación específico 
de la molécula de ADN, basado en la metilación del ADN en secuencias cortas que 
son específicamente reconocidas y digeridas por las endonucleasas cuando no 
hay metilación, por lo tanto existe invariablemente un sistema de modificación 
(SM) por cada sistema de restricción (SR), el cual es además específico de cada 
cepa bacteriana. En algunos SM/SR tanto la enzima de restricción como la de mo-
dificación son proteínas separadas que actúan independientemente; sin embargo, 
en otros las dos actividades se presentan en subunidades o dominios de una sola 
proteína. 
Clasificación de las endonucleasas de restricción 
Existen cuatro tipos de enzimas de restricción. Esta clasificación está basada en su 
composición de subunidades, posición de corte, especificidad de secuencias y reque-
rimiento de co-factores. 
Endonucleasas de restricción del tipo I (ER I), 
tipo III (ER III) y tipo IV (ER IV) 
Las enzimas de restricción clasificadas como tipo I, III y IV se consideran de impor-
tancia bioquímica y son consideradas como modelos de estudio para ciencia básica, 
pero tienen poco valor práctico y su uso en la construcción de recombinantes es 
prácticamente nulo. Ambos tipos de enzimas son proteínas complejas que presentan 
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ANA M. SIFUENTES-RINCÓN Y XÓCHITL F. DE LA ROSA-REYNA 
actividad de endonucleasa y metilasa. Las ER I son el sistema de restricción más 
complejo, las enzimas que pertenecen a este tipo se caracterizan por tener tres diferentes 
subunidades. Para cortar, requieren la presencia de Mg+2, ATP y S-adenosilmetionina. 
Sus sitios de reconocimiento no están bien definidos y el corte del ADN se puede 
presentar a distancias de 400 a 7 mil pb del sitio que reconocen. Las ER III hacen 
cortes en el ADN de doble cadena a aproximadamente