Clonacion-expresion-y-caracterizacion-de-alfa-neurotoxinas-de-serpientes-de-coral-mexicanas

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
 
CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE α-NEUROTOXINAS DE 
SERPIENTES DE CORAL MEXICANAS 
 
 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
 
 
 
PRESENTA: 
QFB. Jaime Felipe Guerrero Garzón 
 
 
 
TUTOR 
Dr. Alejandro Alagón Cano 
Instituto de Biotecnología UNAM 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR 
Dr. Gerardo Corzo Burguete 
Instituto de Biotecnología UNAM 
Dr. Baltazar Becerril Luján 
Instituto de Biotecnología UNAM 
 
 
México, D. F., Noviembre, 2014	
  
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
	
   1	
  
	
  
	
  
	
  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el Departamento 
de Medicina Molecular y Bioprocesos del Instituto de 
Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de 
México, bajo la tutoría del Dr. Alejandro Alagón Cano y 
la asesoría técnica del M. en C. Alejandro Olvera 
Rodríguez. Se agradece el apoyo financiero para la 
realización del presente trabajo a DGAPA a través del 
proyecto IN205212, a CONACYT a través del proyecto 
INFR-2014 #224494, a CONACYT por la beca 
#486308 otorgada para estudios de posgrado y a 
Inosan Biopharma S. A. de C. V. por haber 
proporcionado el apoyo económico para la escritura de 
la tesis. 
	
   2	
  
Agradecimientos académicos y técnicos 
 
Agradezco al Dr. Alejandro Alagón el haberme permitido realizar mis 
estudios de maestría en su laboratorio, así como su asesoría y la revisión de mi 
tesis. 
 
Al M. en C. Alejandro Olvera Rodríguez por su importante aportación en la 
asesoría técnica de mi proyecto y los consejos brindados. 
 
A los doctores Gerardo Corzo Burguete y Baltazar Becerril por formar parte 
de mi comité tutoral y por sus consejos. 
 
A mi jurado de tesis; Dra. Laura Alicia Palomares Aguilera, Dr. César 
Ferreira Batista, Dra. Clarita Olvera Carranza, Dr. Lourival Domingos Possani 
Postay y Dr. José Estuardo López Vera. 
 
A los Doctores José Estuardo López Vera, Fernando Zamudio y Rita 
Restano Cassulini por las colaboraciones y aportes en el presente proyecto. 
 
A los técnicos del laboratorio; M. en C. Herlinda Catalina Clement Carretero, 
Biol. Felipe Olvera Rodríguez, Biol. Héctor Cardozo Torres y Ricardo Mondragón 
Cortes, por su valiosa asesoría técnica a lo largo de mi proyecto. 
 
A la M. en C. Melisa Bénard Valle, M. en C. Edgar Enrique Neri Castro, M. 
en C. Arlene Calderón Corona, Biol. Sergio Bárcenas Arriaga y al Biol. Irving 
Giovanni Archundia Jimenez por sus aportaciones técnicas en mi proyecto y por 
sus consejos. 
 
 
 
 
 
 
	
   3	
  
Dedicatorias 
 
 
Quiero dedicar esta tesis a mis padres y hermana, los cuales siempre me 
han apoyado incondicionalmente y creído en mi, y que a pesar de la distancia 
siempre me sentí cobijados por ellos. De la misma forma agradezco a mis abuelos 
y al resto de mi familia. 
 
Dedico también este trabajo a mi novia Paulina por ser mi equilibrio en 
todos aspectos de mi vida y por su apoyo incondicional durante todo este tiempo, 
eres el amor de mi vida. Además, quiero agradecer a sus padres y hermanas por 
recibirme siempre con los brazos abiertos y hacerme sentir parte de su hogar. 
 
Dedico este trabajo a todos mis compañeros, amigos y familia del 
laboratorio Alagón-Corzo “Los venenosos”, por compartir todas estas experiencias 
conmigo, por darme consejos y por brindarme muchas sonrisas; Doc Alagón, Doc 
Corzo, Meli, Miguel, Mafer, Ulises, Francia, Gigio, Raúl, Nico, Selma, Vianey, Ray, 
Edgar, Mario, Majo, Fanny, Checo, Irving, Memo, Belem, Luis, Areli, Arlene, Daya, 
Irene, Yeli, Pichón, Angélica, Rick, Dany, Felipe, Herli e Hilda. 
 
Agradezco profundamente a mis roomies y grandes amigos; Manuel, López 
y David por todas las experiencias que pasamos juntos y por saber que siempre 
puedo contar con ustedes. 
 
Agradezco la convivencia y amistad con mi vecina Daniela, mis amigos de 
generación; Memo, los Rodrigos, Iván, Fran, Jesús, Benito y Caheri. También 
agradezco a Irene y Alma. Y por supuesto a Toño y Gloria por toda la ayuda 
administrativa. 
Sin todos ustedes este trabajo no se hubiera realizado. 
 
Hogar es donde habita el corazón… 
Plinio el Joven 
	
   4	
  
Índice 
	
  
Página 
1. Resumen	
  ...................................................................................................................................	
  6	
  
2. Introducción	
  ............................................................................................................................	
  7	
  
2.1 Serpientes de coral	
  .....................................................................................................................	
  8	
  
2.2 Epidemiología	
  ................................................................................................................................	
  8	
  
2.3 Venenos de serpientes de coral	
  ............................................................................................	
  9	
  
2.4 Fosfolipasas A2	
  ...........................................................................................................................	
  10	
  
2.5 Familia de toxinas de tres dedos (3FTx’s)	
  .......................................................................	
  11	
  
2.6 Neurotoxinas	
  ...............................................................................................................................	
  14	
  
2.6.1 α-Neurotoxinas	
  .....................................................................................................................................	
  14	
  
2.7 Péptido señal conservado en la familia 3FTx’s	
  .............................................................	
  15	
  
3. Antecedentes	
  .......................................................................................................................	
  17	
  
4. Justificación	
  .........................................................................................................................	
  21	
  
5. Hipótesis	
  ................................................................................................................................	
  22	
  
6. Objetivo general	
  ..................................................................................................................	
  22	
  
6.1 Objetivos particulares	
  ..............................................................................................................	
  22	
  
7. Materiales y métodos	
  ........................................................................................................	
  23	
  
7.1. Venenos	
  ........................................................................................................................................	
  23	
  
7.2 Serpientes	
  .....................................................................................................................................	
  23	
  
7.3 Purificación de RNA total	
  .......................................................................................................	
  23	
  
7.4 Oligo específico para amplificación de cDNA	
  ...............................................................	
  24	
  
7.5 Amplificaciónde cDNA mediante la técnica 3´RACE	
  .................................................	
  24	
  
7.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)	
  .................................................................	
  25	
  
7.7 Electroforesis en geles de agarosa para separar ácidos nucleicos	
  .....................	
  25	
  
7.8 Purificación de banda de producto de PCR	
  ....................................................................	
  25	
  
7.9 Clonación de insertos en los vectores de clonación pCR TOPO 2.1 y pST-Blue-
1	
  ................................................................................................................................................................	
  26	
  
7.9.1 pCR TOPO 2.1 (Invitrogen®)	
  .......................................................................................................	
  26	
  
7.9.1 pST-Blue-1 (Novagen®)	
  ..................................................................................................................	
  26	
  
7.10 Transformación de células competentes XL1-Blue	
  ..................................................	
  26	
  
7.11 Aislamiento de clonas	
  ...........................................................................................................	
  27	
  
7.12 Purificación de plásmido	
  ......................................................................................................	
  27	
  
7.13 Ensayos de restricción	
  .........................................................................................................	
  27	
  
7.14 Secuenciación de insertos	
  ..................................................................................................	
  28	
  
7.15 Análisis bioinformático de secuencias	
  ..........................................................................	
  28	
  
7.16 Cromatografía de fase reversa	
  ...........................................................................................	
  28	
  
7.17 Análisis se secuencia del N-terminal y espectrometría de masas (EM) de las 
fracciones purificadas FV y FVI del veneno de M. diastema y la toxina 
recombinante rD.H	
  ............................................................................................................................	
  29	
  
7.18 Clonación del inserto D.H en el vector de expresión comercial pQE30	
  ...........	
  30	
  
7.19 Pruebas de expresión de la proteína recombinante D.H	
  ........................................	
  31	
  
7.20 Condiciones óptimas de expresión de la toxina recombinante D.H (rD.H)	
  .....	
  32	
  
7.21 Purificación de la toxina recombinante D.H (rD.H)	
  ....................................................	
  32	
  
	
   5	
  
7.22 SDS-PAGE	
  ..................................................................................................................................	
  33	
  
7.23 Western Blot	
  ..............................................................................................................................	
  34	
  
7.24 Pruebas de letalidad; cálculo de la DL50	
  ........................................................................	
  35	
  
7.25 Ensayos de electrofisiología en ovocitos de rana (Xenopus laevis)	
  .................	
  35	
  
7.26 Esquema de inmunización en conejos	
  ...........................................................................	
  36	
  
7.27 Ensayos de reconocimiento de la toxina rD.H por E. L. I. S. A.	
  ...........................	
  36	
  
7.28 Ensayos de neutralización	
  ..................................................................................................	
  38	
  
8. Resultados	
  ............................................................................................................................	
  40	
  
8.1 Purificación de transcritos que codifican para 3FTx´s a partir de las glándulas 
de veneno	
  .............................................................................................................................................	
  40	
  
8.2 RT-PCR de los transcritos que codifican para 3FTx´s mediante 3´RACE	
  ..........	
  40	
  
8.3 Clonación de las secuencias de 3FTx´s en el vector pCR TOPO 2.1	
  ...................	
  41	
  
8.4 Análisis bioinformático de las secuencias de 3FTx´s	
  ................................................	
  43	
  
8.5 Identificación de la toxina que codifica la secuencia D.H en los venenos de M. 
tener (Texas) y M. diastema	
  ..........................................................................................................	
  48	
  
8.6 Clonación de la secuencia D.H en el vector de expresión pQE30	
  .........................	
  49	
  
8.7 Expresión de la toxina recombinante rD.H en algunas cepas de E. coli	
  ............	
  51	
  
8.8 Determinación de la DL50 de la toxina rD.H en ratones	
  ..............................................	
  55	
  
8.9 Ensayos de unión de la toxina rD.H al receptor nAChR muscular fetal murino
	
  ..................................................................................................................................................................	
  56	
  
8.10 Reconocimiento hacia la toxina rD.H por los sueros anti-rD.H producidos en 
conejos.	
  .................................................................................................................................................	
  57	
  
8.11 Determinación de la potencia neutralizante de los sueros anti-rD.H 
producidos en conejos, contra la toxina rD.H en ratones	
  ...............................................	
  57	
  
9. Discusión de resultados	
  ..................................................................................................	
  59	
  
10. Conclusiones	
  .....................................................................................................................	
  72	
  
11. Referencias	
  .........................................................................................................................	
  73	
  
12. Anexos	
  ..................................................................................................................................	
  77	
  
I Lista de símbolos y abreviaturas	
  .............................................................................................	
  77	
  
II Índice de figuras	
  ............................................................................................................................	
  80	
  
III Índice de tablas	
  .............................................................................................................................	
  82	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
   6	
  
1. Resumen 
 
Las toxinas de tres dedos (3FTx’s) conforman una familia de toxinas muy versátil. 
Dentro de esta familia, las α-neurotoxinas son las que tienen una mayor relevancia 
desde el punto de vista clínico. Se sabe que en los venenos de serpientes de coral 
norteamericanas se encuentran en muy baja proporción. Esta peculiaridad junto a 
sus características fisicoquímicas, hacen que sean poco reconocidas por el 
sistema inmune. Consecuentemente, no se produce una alta cantidad de 
anticuerpos neutralizantes anti-α-neurotoxinas cuando se desarrollan antivenenos 
a partir de inmunizaciones con veneno completo. Lo anterior resulta en que el 
reconocimiento y neutralización por antivenenos de coralillos sea baja. 
Probablemente ésta sea la razón por la cual los antivenenos de serpientes de 
coral varían en su potencia neutralizante hacia los venenos de diferentes especies. 
En el presente trabajo se encontraron las secuencias de varios transcritos que 
codifican para 3FTx´s provenientes de cuatro especies de serpientes de coral 
mexicanas; cuatro codifican para α-neurotoxinas del tipo I. Se encontró que la 
secuencia del transcrito D.H proveniente de la serpiente M. diastema se expresa a 
nivel de proteína y forma parte del veneno. Por ello se decidióexpresar la toxina 
recombinante D.H (rD.H) en un sistema bacteriano, con el fin de obtener 
cantidades suficientes de toxina, para realizar su caracterización y evaluar su 
actividad como inmunógeno. La toxina rD.H se obtuvo con un muy buen 
rendimiento (4.2 mg/litro), de forma soluble y activa. Posteriormente, se llevó a 
cabo un esquema de inmunización en conejos y se generaron sueros anti-rD.H. 
Se probó la potencia neutralizante de los sueros, y se encontró que uno de ellos 
es capaz de neutralizar los efectos de la rD.H. Se propone que la toxina 
recombinante puede ser utilizada para reforzar los esquemas de inmunización 
tradicionales (veneno completo) con el fin de desarrollar antivenenos más eficaces. 
 
 
	
   7	
  
2. Introducción 
 
Todas las serpientes venenosas se encuentran clasificadas dentro del 
infraorden Caenophidia, que incluye a las familias; Acrochordidae, Colubridae, 
Atractaspidae, Viperidae y Elapidae (Keogh, 1998). Los coralillos pertenecen a un 
grupo de serpientes coloridas de tamaño medio que forman parte de la familia de 
los Elápidos (Elapidae) (Uetz, et al., 2010), éstas habitan en regiones tropicales y 
subtropicales de Asia y del continente Americano. Algunos autores dividen a la 
familia Elapidae en dos subfamilias: Hydrophiinae y Elapinae (McDowell, 1987). A 
la primera pertenecen las serpientes marinas, cuya distribución se extiende en 
todo el océano Índico y sudoeste del Pacífico; el único representante americano 
comprobado de esta subfamilia, Pelamis platurus, se distribuye desde Asia hasta 
las costas de México, Centro y Sudamérica. La segunda subfamilia, Elapinae, 
tiene una amplia distribución que comprende casi todo el continente Americano 
(desde el sur de Estados Unidos hasta Argentina), África (excepto la zona del 
Sahara), el sur de Asia, el archipiélago Indoaustraliano hasta Nueva Guinea, 
Australia, Tasmania, las Islas Solomon y Fiji (Pough, 1998). La subfamilia 
Elapinae representa el 43% de las especies de elápidos (Keogh, 1998), agrupados 
en una vasta diversidad de géneros que comprenden, entre otras, a las cobras 
(Naja, Ophiophagus), las mambas (Dendroaspis), los elápidos australianos 
(Notechis, Oxyuranus, Pseudechis) y las serpientes de coral americanas o 
coralillos (Micrurus, Micruroides y Leptomicrurus). Las serpientes de coral 
comprenden el 59% de la familia de los elápidos, y aproximadamente el 59% de 
las especies de coralillos se encuentran en América (Uetz, et al., 2010). El género 
Micrurus es el más grande dentro de las serpientes venenosas, ya que está 
conformado por 76 especies y, además, habitan en una gran variedad de 
ecosistemas. Campbell y Lamar (2004) describen la presencia de 16 especies de 
serpientes de coral en México. 
 
 
	
   8	
  
2.1 Serpientes de coral 
	
  
Las serpientes de coral, también conocidas como “coralillos”, son 
generalmente pequeñas y delgadas; su cabeza es aproximadamente igual ó un 
poco más ancha que el cuerpo, y rara vez sobrepasan un metro y medio de 
longitud. Poseen glándulas de veneno largas y delgadas que se extienden a 
ambos lados de la cabeza por debajo del ojo. Cada glándula está constituida por 
dos partes; la glándula principal, encargada de la producción de veneno; y una 
glándula accesoria productora de mucosa cuya función no está aún bien definida. 
Las secreciones producidas son llevadas a un conducto, que finalmente se 
conecta con el colmillo inoculador (Roze, 1999). 
2.2 Epidemiología 
	
  
Se ha estimado que ocurren alrededor de cinco millones de casos de 
mordeduras de serpientes venenosas al año a nivel mundial, de los cuales 
aproximadamente 40,000 son mortales. En América, la mayoría de los accidentes 
por mordedura de serpiente son provocados por vipéridos, mientras que menos de 
un 5% es provocado por los coralillos (Russell, et al., 1997). Sin embargo, estos 
envenenamientos tienen que ser tratados como emergencias médicas, debido a 
que existe un riego considerable de muerte por insuficiencia respiratoria. Por tanto, 
todos los casos deben de considerarse graves (Manok, et al., 2008). 
 
Existe poca información respecto a la morbi-mortalidad ocasionada por 
mordeduras de coralillos en México, aunque se ha descrito que la potencia letal de 
estos venenos es alta (Carbajal-Saucedo, 2004; DeRoodt, et al., 2004). Según 
datos del Instituto Mexicano del Seguro Social, las regiones de mayor incidencia 
de mordeduras de serpientes en nuestro país están ubicadas en Quintana Roo, el 
sur de Veracruz, Tlaxcala, Nayarit y Durango. De 3,794 pacientes que se 
presentaron para ser tratados entre los años 1994 y 2000; el 44.9% fueron 
mordidos por cascabeles, el 42.8%, por nauyacas y sólo un 4% por coralillos. De 
los pacientes restantes, el 3.6%, fueron agredidos por otras serpientes y en el 
	
   9	
  
5.1% de los casos, la serpiente no pudo ser identificada (Zavala, et al., 2002). 
 
Los síntomas causados por venenos de coralillos en humanos son 
principalmente neurotóxicos; parálisis de los músculos de la laringe, faringe y 
mandíbula, ptosis palpebral (caída de los párpados superiores), oftalmoplejia 
(incapacidad para mover voluntariamente los globos oculares), sialorrea 
(salivación excesiva) y parálisis de cuello y extremidades. En casos severos 
puede causar la muerte por insuficiencia respiratoria debida a la parálisis del 
diafragma (Vital-Brazil, y Fontana, 1983-1984; Moraes, et al., 2003; Vital-Brazil, et 
al., 1987). 
2.3 Venenos de serpientes de coral 
	
  
Los venenos de serpientes son mezclas complejas de proteínas y 
polipéptidos farmacológicamente activos. Algunos de sus componentes presentan 
efectos letales y debilitantes como consecuencia de sus actividades neurotóxicas, 
cardiotóxicas, coagulopáticas y necróticas (Kini y Doley, 2010). 
En general, la transmisión neuromuscular parece ser el principal blanco de 
las proteínas contenidas en venenos de elápidos; ya sea actuando a nivel pre-
sináptico, post-sináptico ó con ambos mecanismos (Vital-Brazil, et al., 1987). 
 
Estudios que se han desarrollado en las últimas décadas muestran que las 
componentes de los venenos de serpientes pertenecen a un número reducido de 
súper-familias de proteínas, enzimáticas y no-enzimáticas. Algunas de las familias 
bien caracterizadas son la de toxinas de tres dedos (3FTx), la de inhibidores de 
proteasas, la de lectinas, la de fosfolipasas A2 (PLA2), la de proteasas de serina y 
la de las metaloproteasas. Los miembros dentro de cada familia comparten 
características en común a nivel de secuencia primaria, secundaria y terciaria (Kini 
y Doley, R. 2010). 
 
Los venenos de elápidos se caracterizan por ocasionar efectos 
principalmente neurotóxicos, aunque también se han descrito en animales de 
	
   10	
  
laboratorio, efectos pro y anticoagulantes, así como miotóxicos y cardiotóxicos 
(Alape-Girón, et al., 1997). Entre los componentes tóxicos aislados de estos 
venenos, destacan tres grupos principales: bloqueadores de canales de K+, como 
las dendrotoxinas; fosfolipasas A2 (PLA2) de tipo I, como la taipoxina; y α-
neurotoxinas, las cuales pertenecen a la familia de toxinas de tres dedos (3FTx’s), 
como es el caso de la α-bungarotoxina (Alape-Girón, et al., 1999). Dentro de los 
venenos de varias serpientes de coral los componentes más abundantes son 
péptidos pertenecientes a la familia 3FTx’s y las PLA2 (Fry, et al., 2003; Tsetlin, 
1999; Olamendi-Portugal, et al., 2009) . 
 
2.4 Fosfolipasas A2 
	
  
Las PLA2 presentes en los venenos de serpiente se clasifican de forma 
general en tres grupos: PLA2 de grupo I, presentes en los venenos de elápidos; 
PLA2 del grupo II, aisladas del veneno de vipéridos; y las PLA2 del grupo III, 
aisladas originalmente de veneno de abeja, y posteriormente descritas en venenos 
de escorpión, cnidarios y heloderma. 
 
Las PLA2 de tipo I poseen masas moleculares de entre 13 y 15 KDa; su 
actividad catalítica consisteen hidrolizar el enlace éster en la posición sn-2 de los 
glicerofosfolípidos, dando como resultado la liberación de un lisofosfolípido y un 
ácido graso. Se pueden encontrar como monómeros ó como dímeros (Fisher, y 
Jain, 2001; Alape-Girón, 1997). En los venenos de coralillos, el efecto más 
relevante ocasionado por estas enzimas es la β-neurotoxicidad (alteración de la 
neurotransmisión a nivel presináptico, impidiendo la liberación de acetilcolina). Sin 
embargo, se ha reportado la existencia de PLA2 con efectos directos sobre el 
músculo esquelético y cardiaco, las cuales fueron denominadas miotoxinas 
(Morales, et al., 2003). 
Las PLA2 con actividad β-neurotóxica son uno de los grupo de toxinas de 
serpiente con mayor potencia letal conocido (DL50 de entre 1 y 1.25 mg/kg) (Alape-
Girón, 1997). En preparaciones neuromusculares producen un efecto trifásico 
	
   11	
  
característico de la transmisión del impulso nervioso: durante la primera fase se 
observa una inhibición de la liberación del neurotransmisor; posteriormente se 
presenta un breve aumento en esta liberación; y, finalmente, se observa una 
disminución progresiva de la respuesta nerviosa que finaliza con su total ausencia 
(Caccin, et al., 2006). 
2.5 Familia de toxinas de tres dedos (3FTx’s) 
	
  
Las toxinas de tres dedos componen una superfamilia de polipéptidos no-
enzimáticos cuyos miembros contienen entre 60 y 74 residuos de aminoácidos 
(Dufton and Hider, 1988; Endo and Tamiya, 1991). Las 3FTx’s se encuentran en 
los venenos de Elápidos (cobras, kraits y mambas), hidrófidos (serpientes 
marinas) y culúbridos; así como en vipéridos y crotálidos (Jiang et al.,1987; Pahari 
et al., 2007; Pawlak et al., 2006, 2009). Estas toxinas son ricas en puentes 
disulfuro; contienen de cuatro a cinco de este tipo de enlace, de los cuales cuatro 
se encuentran altamente conservados en todos los miembros de la familia (Endo y 
Tamiya, 1991). 
 
Todas las proteínas de la familia 3FTx’s poseen un patrón de plegamiento 
similar; el cual consiste en tres asas extendidas a partir de un núcleo central que 
contiene los cuatro puentes disulfuro conservados (Ménez, 1998; Tsetlin, 1999); 
resultando en un peculiar parecido a tres dedos de una mano, de ahí el nombre de 
“toxinas de tres dedos”. Sin embargo, a pesar del alto grado de similitud en 
estructura, estos péptidos difieren unos de otros en sus actividades biológicas 
(Fry, et al., 2003). 
 
Se ha reportado la existencia de péptidos endógenos en vertebrados con 
una estructura muy similar a las 3FTx`s, por lo que se propone pudieran estar 
emparentados evolutivamente con las toxinas de elápidos. Algunos de estos 
péptidos juegan un papel importante en la adhesión celular, otros son utilizados en 
el sistema del complemento (CD59), en linfocitos (Ly6), y algunos son secretados 
en el cerebro (Lynx1) (Fleming et al. 1993; Gumley et al., 1995). 
	
   12	
  
Los integrantes de esta familia de toxinas divergen en sus actividades 
biológicas. Las α-neurotoxinas son antagonistas del receptor nicotínico de 
acetilcolina muscular nAChR (Chang, 1979; Changeux, 1990; Tsetlin, 1999); las κ-
neurotoxinas reconocen al nAChR neuronal (Grant y Chiappinelli, 1985); las 
toxinas muscarínicas, con selectividad a distintos tipos de receptores muscarínicos 
(Jerusalinsky y Harvey, 1994); las fasciculinas inhiben a la acetilcolinesterasa 
(Cervenansky et al., 1991); las calciseptinas bloquean los canales de calcio tipo L 
(de Weille et al., 1991; Albrand et al., 1995); las cardiotoxinas (citotoxinas) forman 
poros en las membranas celulares (Bilwes et al., 1994); las dendroaspinas 
(mambinas), antagonisan varios procesos de adhesión celular (inhibición 
plaquetaria) (McDowell, et al., 1992); y las β-cardiotoxinas que se unen a los 
receptores adrenérgicos β1 y β2 (Rajagopalan, et al., 2007). Además, se sabe que 
algunas cardiotoxinas se unen con alta afinidad a la heparina (Tjong, et al., 2007), 
así como a proteínas que interactúan con los canales de potasio (Lin, Y. L., et al., 
2004), y a la integrina ανβ3 (Wu, et al., 2006). Sin embargo, para la mayoría de 
3FTx´s descritas en los venenos de varios elápidos, y aquéllas que se han inferido 
a partir de secuencias de transcritos, se desconoce aún su función biológica. Fry 
et al., (2003) clasifica a las 3FTx´s en 33 grupos de acuerdo a su actividad 
biológica y grado de homología a nivel de secuencias de aminoácidos (Tabla 1). 
Veinte de los grupos fueron categorizados como “grupos huérfanos” debido a que 
se desconoce su actividad biológica. Lamentablemente, la relación filogenia-
función es un concepto muy poco considerado para hacer una clasificación. Por 
otro lado, la mayoría de las toxinas a las que se les ha descrito una actividad han 
sido estudiadas por ensayos de unión a algún receptor en particular. También, se 
debe de tener presente que los estudios de letalidad son un indicador muy pobre 
del mecanismo de acción de una molécula y que muchas moléculas bioactivas no 
son necesariamente tóxicas ó letales. 
 
 
 
 
	
   13	
  
Tabla	
  1.	
  Clasificación	
  de	
  las	
  3FTx´s	
  por	
  Fry,	
  y	
  colaboradores,	
  2003	
  
 
Grupo N-terminal Secuencia C-terminal 
 
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
 
 
	
  
	
  
Tx. inhibitorias Acn ThCYSHTTTSRAIpp CGENS CYRKSRRHPPKMVLGRG CG CPPGDDYLEVK CCTSPDKCNY 
Tx. antiplaquetarias hICYNpLGTKPPTTET Ct-DS CYK.IWp..sh..IRRG CG CFTPRGDMPtPh CCCSDK CNL 
Toxinas de Ca2+ tipo L RICYoHKASLPRATKT CVENT CYKMFIRTpRpYISERG CG CPTAMWPYQTE CCKGDR CNK 
Citotoxinas tipo IA LkCnkip.haKT CPtGKNLCYKMaMsus.pIPVKRG CIDVCPKsShLVKYV CCNTD+ CN 
Citotoxinas tipo IB LKCHNKlVPFLSKT CP-GKNLCYMoh.hhPhIPIKRG CTDsCPKSSLLVpVh CCppDK CN 
Ntx. tipo alpha I hECHNQQSSQsPTTps CsG.ETNCYKKpWpDHRGhhhERG CG CpoVKpGlPlN CCTTD+ CNp 
Ntx. tipo alpha II hpCahTss..hpups CPsGpplCYsKoWCUuaCupRGKhl-LG CAATCPp. sKst.cip CCSTDs CNPaPhh… 
Ntx. tipo alpha III LTCYKuhpsTVV CKPHETICYchhIPATHGNAI.sRG CuTSCPGG.+PV CCpTDL CNK 
Neurotoxinas kappa +TCLISPSSTPQT CPpGQDICFhKs.CDpaC..RGPVIEQG CsATCPpFRSNYRSLL CCTTDN CNH 
Muscarínicas tipo A LTCVpoKSIFGITTEs CPDGQNLCFK+haYlsP+h.-hThG CAATCPhspNhc.h. CCCpTDKCNp 
Muscarínicas tipo B RICHSQMSSQPPTTTF CRVNS CYRRTLRDPHDPRGTIIIVRG CG CPRMKPGTKLE CCTSDK CNV 
Muscarínicas tipo C LhCVKEK.lFu.TTEs CPDGQNiCFpphHhIhPG+YK+TRG CAATCPhhpNRDVI. CCSTDK CNL 
Toxs. sinergísticas LTCVTGKSIGGISTEE CAAGQKhC.KKWTKMGPKLYDVSRG CTATCPKADEYGCVK CCpTD+… 
Grupo huérfano I RLCLSDYSIFSETIEI CPDGHNFCFKKFPKGITRLPWVIRG CAATCPKAEARVYVD CCARDK CNR 
Grupo huérfano II LTCL.CPEhaCsKhph ChNGEKICFK+hppR+.huhRYhRG CAsTCP.sKPR-hVp CCSTD+ CN+ 
Grupo huérfano III RKCLIKYSQANESSKT CPSGQLLCLKKWEIGNPSGKEVKRG CVATCPKPhKNEIIQ CCAKDK CNt 
Grupo huérfano IV MKCKICpFDTCRAGELKV CASGEKYCFKESWREARGTRIERG CAATCPKGSVYGL.VL CCTTDD CN 
Grupo huérfano V MQCKTCSFYTCPNSET CPDGKNICVKRSWTAVtGDG.KREIRRE CAATCPPSKLGLTVF CCTTDN C. H 
Grupo huérfano VI FTCFTTPSDTSET CP.GpNICYEKRWsuHth.IEKG CVASCPpFES+a+aLL CCRIp-NCNp 
Grupo huérfano VII IICRTRDTYQIPITFTN CEEGHV CYKYSTTETTPNRILIHRG CAAKCPKRLRVI CCSTDK CNK 
Grupo huérfano VIII TICYNHLoRTsETTEI CPDSWYFCYKISLADGNDVRIKRG CAAKCPKRLRVI CCSTDK CNK 
Grupo huérfano IX KTCFNDDLsNPKTTEL CRHShYFCFKNShIAGGVERhpRG CSLTCPDIKYNGKYIY CCTRDN CNA 
Grupo huérfano X RICYSHKLLQAKTTKT CEENS CYKRSLPKIPLIIIGRG CG CPLTLPFLRIK CCTSDK CN 
Grupo huérfano XI MICYSHKTPQsSATIT CEEKT CYK+.VsKlPulIluRG CG CPpKEhFht.IH CCRSDK CNE 
Grupo huérfano XII IVCYKRHASDSQTTT CLSGI CYKKITRGISRPEMG CG CPQSSRGVKV CCMRDK CNG 
Grupo huérfano XIII RKCFNSPGRLVSKP CPEGNNLCYKMSNRMYPPGFNVRRG CAETCPRRNRLLEVV CCCDTDN CNK 
Grupo huérfano XIV LICHNRPLPFLHKT CPEGQNICYKMTLKKTPMKLSVKRG CAATCPSERPLVQVE CCKTDK CNW 
Grupo huérfano XV LKCHNT.LPFIYKT CPEGpNLCFKuTLK.FPhKhslKRG CAssCPKsSuLlKhV CCsTDK CN 
Grupo huérfano XVI RKCLNTPLPLFYKT CPEGKDLCYKMNFKLLPKKLSIKRG CTDTCPKSSLLVKVV CCDTDKCNK 
Grupo huérfano XVII ENCNMCVRPYPFMSS CCPEGQDRCYKSYWVNENtKQctYHGKYPVhLERG CVTACoGPGSGSIYNLYT CCPTNR CGSSSTSG 
Gpo. huérfano XVIII LKCHHKAQFPNIETQ CKWQTL CFQRDVKPHPSSMIVLRG CTSSCKGAM CCATDL CNGPSTPST 
Grupo huérfano XIX hECYRCGVSGCHL+hT CSAcEpFChK.hN+ISs.hWhG CscTCTE.-TwphYpK CCTTNL CNh 
Grupo huérfano XX LECYQhSKVVT CpPEppFCYSDshh.F.NH.VyhSG Co.aCRss.oGE+ CCTTDR CNt 
Las	
   secuencias	
   de	
   3FTx’s	
   clasificadas	
   dentro	
   de	
   cada	
   grupo	
   comparten	
   por	
   lo	
   menos	
   un	
   75%	
   de	
   similitud	
   con	
   la	
   secuencia	
  
consenso,	
  además	
  de	
  las	
  posiciones	
  de	
  las	
  cisteínas.	
  	
  Las	
  letras	
  minúsculas	
  dentro	
  de	
  la	
  tabla	
  representan	
  a	
  un	
  tipo	
  de	
  aminoácido	
  
presente	
   en	
   la	
   secuencia	
   consenso,	
   que	
   no	
   está	
   definido,	
   pero	
   que	
   puede	
   identificarse	
   de	
   acuerdo	
   a	
   sus	
   propiedades	
   fisico-­‐
químicas	
  	
  y/o	
  grupo	
  químico	
  que	
  posea	
  en	
  su	
  cadena	
  lateral:	
  Alcohol	
  =	
  o	
  =	
  S,	
  T;	
  alifático	
  =	
  l	
  =	
  I,	
  L,	
  V;	
  cualquiera	
  =	
  .	
  =	
  A,	
  C,	
  D,	
  E,	
  F,	
  G,	
  
H,	
  I,	
  K,	
  L,	
  M,	
  N,	
  P,	
  Q,	
  R,	
  S,	
  T,	
  V,	
  W,	
  Y;	
  aromático	
  =	
  a	
  =	
  F,	
  H,	
  W,	
  Y;	
  cargado	
  =	
  c	
  =	
  D,	
  E,	
  H,	
  K,	
  R;	
  hidrofóbico	
  =	
  h	
  =	
  A,	
  C,	
  F,	
  G,	
  H,	
  I,	
  H,	
  L,	
  M,	
  R,	
  
T,	
  V,	
  W,	
  Y;	
  negativo	
  =	
  -­‐	
  =	
  D,	
  E;	
  polar	
  =	
  p	
  =	
  C,	
  D,	
  E,	
  H,	
  K,	
  N,	
  Q,	
  R,	
  S,	
  T;	
  positivo	
  =	
  +	
  =	
  H,	
  K,	
  R;	
  pequeño	
  =	
  s	
  =	
  A,	
  C,	
  D,	
  G,	
  N,	
  P,	
  S,	
  T,	
  V;	
  
minúsculo	
  =	
  u	
  =	
  A,	
  G,	
   S;	
  presente	
   en	
   “giros	
  y	
   vueltas”	
   junto	
  a	
  una	
  P	
  ó	
  G	
  =	
   t	
   =	
  A,	
  C,	
  D,	
  E,	
  G,	
  H,	
  K,	
  N,	
  Q,	
  R,	
   S,	
  T.	
   Las	
   cisteínas	
   se	
  
encuentran	
  resaltadas	
  en	
  color	
  negro.	
  Toxina	
  (Tx),	
  Acetilcolinesterasa	
  (Acn),	
  Neurotoxina	
  (Ntx).	
  
	
   14	
  
2.6 Neurotoxinas 
	
  
Un gran número de miembros de la familia 3FTx’s son neurotoxinas. Estas 
toxinas interfieren con la transmisión colinérgica en varios sitios post-sinápticos de 
los sistemas nervioso central y periférico. De acuerdo a su selectividad por ciertos 
receptores, éstas pueden ser clasificadas como toxinas nicotínicas y toxinas 
muscarínicas. Las más diversas y conocidas son las primeras, entre las que se 
encuentran las α-neurotoxinas que se unen al receptor nicotínico de acetilcolina 
muscular (nAChR) y las κ-neurotoxinas que son antagonistas competitivos de los 
nAChR neuronales (Kini, y Doley, 2010). 
2.6.1 α-Neurotoxinas 
 
Son altamente tóxicas para mamíferos (ratones) con dosis letales medias 
(DL50) que van de 0.04 a 0.3 mg/kg. Actúan a nivel de la placa neuromuscular 
uniéndose al receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR) con alta afinidad, 
impidiendo la unión del neurotransmisor acetilcolina y ocasionando un bloqueo del 
impulso nervioso (Chang, 1979). Se han secuenciado más de 150 α-neurotoxinas, 
correspondientes a una gran variedad de especies de elápidos (Yee-Siew et al., 
2004). 
 
Dependiendo de sus secuencia de aminoácidos y/o estructura terciaria, las 
α-neurotoxinas se clasifican en: α-neurotoxinas de cadena corta, α-neurotoxina de 
cadena larga, α-neurotoxinas de cadena larga atípica, y en α-neurotoxinas no-
convencionales (Tabla 2) (Servent y Menez A. 2001; Nirthanan, et al., 2003). Si 
bien el blanco molecular primario de esta categoría de 3FTx’s es el receptor 
nAChR muscular, se sabe que algunas toxinas además interactúan con otros 
subtipos de receptores nAChR y, en el caso de algunas toxinas no-convencionales, 
que se encuentran poco caracterizadas, puede existir cierta promiscuidad hacia 
varios receptores. Por tanto, esto hace de las α-neurotoxinas un grupo 
heterogeneo (Nirthanan, y Gwee, 2004). 
	
   15	
  
	
  
	
  
	
  
Tabla	
  2.	
  Clasificación	
  de	
  las	
  3FTx´s	
  con	
  actividad	
  α-­‐neurotóxica	
  de	
  los	
  venenos	
  de	
  serpiente	
  que	
  interactúan	
  con	
  el	
  
receptor	
  nicotínico	
  	
  de	
  acetilcolina	
  muscular.	
  
Clasificación Características Estructurales Blanco molecular primario 
Otras 
moléculas 
blanco 
Fuente 
α-Neurotoxinas de 
cadena corta 
Monómeros de 3FTx´s de 
60-62 residuos de 
aminoácidos con 4 
puentes disulfuro 
conservados 
Alta afinidad por receptor 
(α1)2β1γδ nAChR muscular 
ó Torpedo (Kd de 10-9-10-11M 
aproximadamente) 
 
 
 
- 
Especies de Elapidae y 
Hydrophidae . Ejemplos típicos 
en donde se encuentran la 
erabutoxina-α (Laticauda 
semifasciata) y la toxina-α 
(Naja nigricolis). 
α-Neurotoxinas de 
cadena larga 
Monómeros de 3FTx´s de 
66-74 residuos de 
aminoácidos con 4 
puentes disulfuro 
conservados y un puente 
disulfuro adicional en la 
punta del loop II 
Alta afinidad por receptor 
(α1)2β1γδ nAChR muscular 
ó Torpedo (Kd de 10-9-10-11M 
aproximadamente) 
Alta afinidad 
antagonista por 
el receptor α7 
nAChR 
neuronal 
Aislados de especies de 
Elapidae. Ejemplos típicos 
incluyen a la α -bungarotoxina 
(Bungarus multicinctus), y α-
cobratoxina (Naja kaouthia). 
α-Neurotoxinas de 
cadena larga atípicas 
Monómeros de 3FTx´s de 
69 residuos de 
aminoácidos con 4 
puentes disulfuro 
conservados 
Alta afinidad por receptor 
(α1)2β1γδ nAChR Torpedo 
(Kd de 10-11M 
aproximadamente) 
 
 
- 
Toxinas Lc-a y Lc-b, aisladas 
exclusivamente de Laticauda 
colubrina (Hydrophidae). 
α-Neurotoxinas no-
convencionales 
Monómeros de 3FTx´s de 
65-67 residuos de 
aminoácidos con 4 
puentes disulfuro 
conservados y un puente 
disulfuro adicional en la 
punta del loop I 
Algunas (WTX, Naja 
kaouthia) tienen baja 
afinidad por el receptor 
nAChR (α1)2β1γδ muscular 
ó Torpedo (Kd >10-6M 
aproximadamente) y otras 
(Candotoxina, Bungarus 
candidus) tienen alta afinidad 
(Kd de 10nM 
aproximadamente) 
 
 
 
 
 
- 
Exclusivas de especies de 
Elapidae. Ejemplos típicos 
incluyen a candoxina (Bungarus 
candidus), WTX (Naja 
kaouthia), Wntx-5 (Naja 
sputatrix). 
Tabla	
  modificada	
  de	
  Nirthanan,	
  S.	
  and	
  Gwee,	
  M.	
  2004.	
  
 
2.7 Péptido señal conservado en la familia 3FTx’s 
 
Se han realizado alineamientos de cDNAs de α-neurotoxinas de cadena 
larga, α-neurotoxinas de cadena corta, κ-neurotoxinas, homólogos de 
neurotoxinas, cardiotoxinas, y CLBPs (cardiotoxin-like basic protein), y se ha visto 
que las regiones de las secuencia de nucleótidos que codifican para el péptido 
señal de 21 aminoácidos y la región 3´-UTR, se encuentran altamente 
conservadas (Tamiya, et al., 1985; Chang y Lin, 1997). No sólo la secuencia 
nucleotídica que codifica para el péptido señal si no también la secuencia de 
aminoácidos del mismo están muy conservados (Figura 1). Esto sugiere que éstas 
proteínas deben de estar emparentadas evolutivamente. 
 
 
	
   16	
  
 
	
  
	
  
	
  
	
  
 
 
 
 
Todos los genes de las 3FTx’s comparten una organización similar. Se 
componen de tres exones y dos intrones. El exón 1 codifica una gran parte del 
péptido señal (18 residuos de aminoácidos). El exón 2 codifica para la secuencia 
restante del péptido señal (3 residuos de aminoácidos) y la región N-terminal de la 
proteína madura. El exón 3 codifica para la porción C-terminal, seguido de la 
región no codificante 3´ (3´-UTR). Las secuencias de los intrones de éstos genes 
comparten un alto nivel de identidad, sin embargo las regiones que codifican para 
proteína (exones), son diferentes, a excepción del péptido señal. La estructura 
genética que tienen en común y el alto grado de identidad a nivel de secuencia 
refleja que los genes que codifican para proteínas de la familia de tres dedos 
pudieran tener un ancestro en común (Chang, 1997). 
 
 
 
 
MKTLLLTLLVVTIVCLDLGYT	
  
	
  
Figura	
  1.Alineamiento	
  de	
  secuencias	
  de	
  aminoácidos	
  del	
  Péptido	
  señal	
  (PS)	
  de	
  las	
  3FTx’s	
  	
  de	
  diferentes	
  especies	
  de	
  elápidos	
  de	
  varias	
  
partes	
   del	
   mundo:	
   MLatA1,	
   Micrurus	
   laticollaris;	
   TXM38_OPHHA,	
   Ophiophagus	
   hannah;	
   M1,	
   Dendroaspis	
   angusticeps;	
   BM14,	
   Bungarus	
  
multicinctus;	
   SNTX7,	
  Pseudonaja	
  textilis;	
  NXS1_HYDPR,	
  Hydrophis	
  peronii.	
  Las	
   líneas	
  superiores	
   indican	
   la	
  disposición	
  de	
   los	
  puentes	
  disulfuro	
  
conservados.	
  	
  En	
  la	
  parte	
  superior	
  izquierda	
  se	
  encuentra	
  el	
  PS	
  que	
  corresponde	
  a	
  21	
  aminoácidos.	
  Alineamiento	
  creado	
  en	
  Clustal	
  W,	
  Jalview.	
  
	
  
	
   17	
  
3. Antecedentes 
	
  
A la fecha, se encuentran reportadas en la literatura varias α-neurotoxinas 
que forman parte de los venenos de algunas especies de Micrurus: doce 
completas (Rosso et al., 1996; Olamendi-Portugal et al., 2009; Dokmetjian et al., 
2009; Moreira et al., 2010; Carbajal-Saucedo, et al., 2013), once incompletas 
(Alape-Girón et al., 1996; Dokmetjian et al., 2009; Moreira et al., 2010), y tres 
homólogos (Silveira de Oliveira et al., 2000). Sin embargo, provenientes de 
especies mexicanas, sólo la MlatA1 (Carbajal-Saucedo, et al., 2013) y la FVI del 
veneno de M. tener (Tamaulipas) (Bénard-Valle, et al., 2013) son las que se 
encuentran reportadas. Por otro lado, dentro de nuestro grupo de trabajo, existe 
un gran interés en estudiar el resto de las 3FTx´s que se encuentran en estos 
venenos, para poder comprender más acerca de la evolución de estas toxinas y el 
papel biológico que pudieran llevar a cabo. 
 
Bénard-Valle, et al., (2013) reportaron la presencia de algunas 3FTx´s en el 
veneno de M. tener que no son letales en ratones pero si en serpientes. Por lo que 
muchas 3FTx´s que se pensaba inactivas tal vez no habrían sido estudiadas en el 
modelo adecuado, lo que abre un abanico de posibilidades a estudiar en un futuro. 
	
  
Carbajal-Saucedo en su tesis doctoral, y otros colaboradores, realizaron la 
caracterización inmunoquímica del veneno de Micrurus laticollaris. El veneno fue 
fraccionado en una columna de intercambio catiónico (Figura 2), posteriormente 
se determinó la letalidad y la actividad fosfolipasa A2 de cada una de las 
fracciones, también se llevó a cabo el análisis del veneno por Western blot. Se 
observaron dos grupos de componentes letales: el primero de tipo α-neurotoxina; 
el segundo grupo está formado por cerca de 19 fracciones tipo fosfolipasa A2. 
El primer grupo se pasó por una cromatografía de fase reversa (inserto de 
la Figura 2), y se purificó a una α-neurotoxina verdadera, que fue llamada MlatA1. 
Se determinó su secuencia aminoacídica y su masa molecular por espectometría 
de masas. La MlatA1 posee una secuencia muy similar a la α-neurotoxina de 
cadena corta presente en el veneno de M. nigrocinctus. Finalmente, se realizaron 
	
   18	
  
ensayos de unión al nAChR expresado en ovocitos de Xenopus laevis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se produjeron dos sueros experimentales: el primero se obtuvo mediante la 
inmunización de un caballo con el veneno completo de M. laticollaris; el segundo 
fue desarrollado por medio de la inmunización en conejos con la α-neurotoxina 
MlatA1 purificada a partir del veneno de M. laticollaris. Se observó que el suero 
de caballo antiveneno completo es capaz de reconocer y neutralizar la letalidad 
del veneno completo y las fracciones PLA2. Sin embargo, la α-neurotoxina MlatA1 
apenas es reconocida, y no fue neutralizada por este suero. Al llevarse a cabo las 
neutralizaciones con el suero de conejo anti-MlatA1, se observó que aunque 
contiene anticuerpos capaces de reconocer a la neurotoxina, estos no son 
neutralizantes. 
 
Por otro lado, en la tesis de licenciatura de Melisa Bénard se determinó el 
nivel de reconocimiento cruzado de los venenos de varias especies de coralillos 
por parte del suero antiveneno completo de M. laticollaris, utilizando las técnicas 
de Western blot y pruebas de ELISA. También determinó que existen diferencias 
importantes en la capacidad de neutralización de los venenos por parte del suero 
antiveneno de M. laticollaris. Además, mediante Western blots llevados a cabo con 
el suero anti-MlatA1 contra venenos de varias especies de coralillos, se encontró 
que en algunas especies se reconocía un componente de alrededor de los 6.5kDa; 
sin embargo, en algunos otros no hubo reconocimiento. Este hallazgo indica la 
Figura	
  2.	
  Separación	
  por	
  cromatografía	
  del	
  los	
  componentes	
  del	
  veneno	
  de	
  M.	
  laticollaris.	
  El	
  veneno	
  fue	
  cargado	
  en	
  una	
  columna	
  de	
  
intercambio	
  catiónico	
  MonoS	
  (FPLC	
  System,	
  Pharmacia)	
  en	
  buffer	
  A	
  (50mM	
  acetato	
  de	
  amonio	
  pH	
  4.7).	
  La	
  elución	
  se	
  llevó	
  a	
  cabo	
  con	
  un	
  
gradiente	
  de	
  0-­‐60%	
  de	
  buffer	
  B	
  (Buffer	
  A	
  +	
  2	
  M	
  NaCl)	
  en	
  80min	
  con	
  un	
  flujo	
  de	
  1	
  ml/min.	
  La	
  concentración	
  de	
  proteína	
  fue	
  medido	
  por	
  
absorbancia	
  a	
  280	
  nm.	
  La	
  separación	
  de	
   la	
   fracción	
  2	
  MonoS	
  fue	
   llevada	
  a	
  cabo	
  por	
  una	
  RP-­‐HPLC	
  C18	
  (Cromatografía	
  de	
  fase	
  reversa	
  en	
  
columna	
  C18).	
  Sólo	
  la	
  fracción	
  2.1	
  fue	
  estudia	
  y	
  se	
  le	
  llamó	
  MlatA1.	
  Imagen	
  tomada	
  de	
  Carbajal-­‐Saucedo,	
  A.,	
  et	
  al.,	
  2013.	
  
	
  
	
   19	
  
existencia de al menos dos grupos antigénicos de α-neurotoxinas presentes en los 
venenos de Micrurus. 
 
Se midió la capacidad neutralizante del antiveneno comercial Coralmyn® 
(que se produce usando veneno de M. nigrocinctus como inmunógeno), así como 
la del suero antiveneno de M. laticollaris, contra los venenos de diferentes 
especies de coralillos (Tabla 3). Se observó que las neutralizaciones para ambos 
antivenenos fueron muy variables. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por lo anteriormente descrito, es muy importante tomar en cuenta la 
reactividad inmunoquímica cruzada de las diferentes α-neurotoxinas presentes en 
los venenos de serpientes de coral con el fin de obtener antivenenos de amplio 
espectro. Sin embargo, la definición de los venenos de coral que debieran 
utilizarse como inmunógeno no es suficiente para obtener buenos niveles de 
anticuerpos neutralizantes en los antivenenos dada la pobre respuesta hacia las 
α-neurotoxinas. La pobre respuesta de anticuerpos puede explicarse por su baja 
proporción en los venenos; una manera para darle la vuelta a este problema es 
suplementar la inmunización con α-neurotoxinas. 
Tabla	
  3.	
  Potencia	
  neutralizante	
  relativa	
  de	
  los	
  anti-­‐venenos	
  anti-­‐M.	
  lat	
  y	
  Coralmyn,	
  contra	
  los	
  venenos	
  de	
  varias	
  especies	
  
de	
  coralillos.	
  
Reportada	
   en	
   mg	
   veneno/ml	
   de	
   anti-­‐veneno.	
   Ensayo	
   no	
   desarrollado	
   (ND).	
   Tabla	
   tomada	
   de	
   la	
   tesis	
   de	
  
licenciatura	
  de	
  Melissa	
  Bénard,	
  2009.	
  
	
  
	
   20	
  
Sin embargo, la purificación de α-neurotoxinas a partir de venenos de 
serpientes de coral es poco práctica; no sólo para la producción de antiveneno a 
escala comercial sino también para llevar a cabo investigación básica. La principal 
limitación, como ya se apuntó en el párrafo anterior, es debida a la baja proporción 
de α-neurotoxinas en los venenos de corales mexicanos. Por lo que, en su tesis 
doctoral, Alejandro Carbajal propuso la producción de la MlatA1 de forma 
recombinante (rMlatA1) en un sistema bacteriano. Para ello diseñó un oligo 
(antxPS primer) que reconoce de forma específica a la secuencia de nucleótidos 
que codifica para el péptido señal de la toxina (Figura 3). De esta forma, a partir 
del RNA extraídode glándulas de veneno de M. laticollaris, realizó una RT-PCR 
utilizando la técnica de 3´RACE. Los cDNAs resultantes que codificaban para la 
MlatA1, fueron amplificados mediante PCR utilizando el antxPS primer y un oligo 
dT. Posteriormente, la secuencia fue clonada en un vector de expresión (pQE60), 
y se utilizó para transformar células de E. coli BL21. Obtuvo una pobre expresión 
de proteína soluble, y ésta resultó toxicológicamente inactiva (probablemente 
debido a un mal plegamiento en su estructura terciaria). Por otra parte, la rMlatA1 
fue reconocida por los anticuerpos anti-MlatA1 nativa, sugiriendo la presencia de 
epítopes conservados entre la proteína nativa y la recombinante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
	
  
	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  M	
  	
  	
  	
  	
  	
  K	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  T	
  	
  	
  	
  	
  	
  L	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  L	
  	
  	
  	
  	
  L	
  	
  	
  	
  	
  	
  	
  T	
  
antxPS	
  primer	
  (5´ATG	
  AAA	
  ACT	
  CTG	
  CTG	
  CTG	
  AC	
  3´)	
  
Figura	
  3.	
  antxPS	
  primer.	
  Oligo	
  que	
  reconoce	
  a	
  los	
  nucleótidos	
  que	
  codifican	
  
para	
  el	
  péptido	
  señal	
  en	
  3FTx´s	
  de	
  elápidos.	
  
	
  
	
   21	
  
4. Justificación 
	
  
Se ha visto que el reconocimiento de los sueros antiveneno completo de 
serpiente de coral hacia las α-neurotoxinas purificadas es muy bajo, y además no 
son neutralizantes. Esto pudiera deberse a que este tipo de toxinas se encuentran 
en poca proporción dentro del veneno. Por otro lado, su tamaño relativamente 
pequeño (6-7 KDa) comparado con el de las β-neurotoxinas (PLA2 de tipo I) (13-15 
KDa) (que se encuentran en mayor proporción en los venenos de serpientes de 
coral norteamericanas), pudiera ocasionar que las toxinas de mayor tamaño sean 
inmunodominantes hacia las α-neurotoxinas, y por tanto, que la respuesta inmune 
sea muy limitada. 
 
Por tal motivo, es de suma importancia conocer las α-neurotoxinas 
presentes en los venenos de diferentes especies de coralillos y, posteriormente, 
reforzar las inmunizaciones tradicionales (mezcla de venenos completos) con 
dosis considerables de este tipo de toxina, y así lograr un antiveneno más potente 
y de amplio espectro. 
 
Sin embargo, la principal limitación es la obtención de venenos de 
serpientes de coral y la subsecuente purificación y caracterización de α-
neurotoxinas. Las limitaciones fundamentales son la dificultad para colectar 
serpientes de su entorno natural, lograr la supervivencia de los especímenes en 
cautiverio, obtener veneno suficiente (5-10 mg por extracción) y las pérdidas 
importantes de toxinas, recursos y tiempo para su purificación. 
 
Una alternativa para poder resolver este problema, pudiera ser la 
producción de α-neurotoxinas recombinantes. 
 
Al mismo tiempo, el conocimiento de la gran variedad de 3FTx´s presentes 
en estos venenos, ayudará a entender la evolución de esta familia de péptidos y a 
comprender su relevancia biológica. 
	
   22	
  
5. Hipótesis 
	
  
La producción de α-neurotoxinas recombinantes a partir del RNA de 
glándulas de veneno provenientes de cuatro especies de serpientes de coral 
mexicanas, permitirá desarrollar inmunógenos capaces de reforzar los esquemas 
de inmunización tradicionales, con el fin de mejorar la cobertura y potencia de los 
antivenenos de serpientes de coral ya existentes y entender la historia evolutiva y 
función de las 3FTx de elápidos americanos. 
6. Objetivo general 
 
Clonar secuencias de 3FTx, secuenciar, expresar y caracterizar las 
proteínas de tres dedos con actividad α-neurotóxica provenientes de las especies: 
M. laticollaris, M. browni, M. diastema y M. tener, a partir de transcritos obtenidos 
de sus glándulas de veneno. 
6.1 Objetivos particulares 
	
  
1. Clonar, secuenciar y realizar un análisis bioinformático de las secuencias 
de transcritos que codifican para las 3FTx´s. 
2. Expresar las secuencias tipo α-neurotoxinas en un sistema bacteriano. 
3. Realizar ensayos de actividad biológica de las toxinas recombinantes. 
4. Generar sueros anti-α-neurotoxinas recombinantes en conejos. 
5. Probar la potencia neutralizante de los sueros producidos en ratones. 
 
 
 
 
	
  
	
   23	
  
7. Materiales y métodos 
 
7.1. Venenos 
 
Los venenos se obtuvieron por extracción manual de un especímen de M. 
diastema colectado en Coatzacoalcos Veracruz (No. Catálogo MV08). Éstos se 
resuspendieron en amortiguador de acetato de amonio 20 mM pH 4.7. 
Posteriormente, fueron liofilizados y almacenados a 4 ºC. Cuando éstos fueron 
requeridos, se disolvieron en acetato de amonio 20 mM y la cantidad de proteína 
se determinó por absorbancia a 280 nm, asumiendo que una unidad de 
absorbancia es igual a 1 mg/ml de proteína.	
  
 
7.2 Serpientes 
	
  
Todas los especímenes fueron congelados a -70 ºC al momento de morir 
para su conservación (Tabla 4). 
Tabla	
  4.	
  Catálogo	
  e	
  información	
  de	
  la	
  localidad	
  de	
  los	
  ejemplares	
  de	
  especies	
  de	
  serpientes	
  de	
  coral	
  utilizadas	
  en	
  este	
  
estudio.	
  
	
  
Especie Estado Localidad Fecha de muerte No. de catálogo 
Micrurus laticollaris Morelos Tlaquiltenango 9/noviembre/2011 HK158 
Micrurur laticollaris Colima Carretera a Ixtlahuacán Desconocido HK035 
Micrurus diastema Veracruz Misantla 25/noviembre/2010 HK157 
Micrurus browni Chiapas 
Carretera 230 Norte de 
Villa Flores 
17 /abril/2013 MV05 
Micrurus tener Tamaulipas 
 
Valle Hermoso 70km al sur 
de Matamoros 
 
 
6/noviembre/2013 
 
- 
 
7.3 Purificación de RNA total 
 
Se purificó el RNA total del par de glándulas de veneno de cada especie 
analizada. Las glándulas fueron homogenizadas en reactivo de Trizol® (1 ml/100 
mg; Gibco BRL); después, se adicionó cloroformo (1/5 parte del volumen total) y el 
homogenizado se centrifugó a 14,000 x g por min. La fase orgánica se desechó, 
	
   24	
  
posteriormente se adicionó isopropanol (1/10) a la fase acuosa, la mezcla se 
incubó a temperatura ambiente por 10 min, se centrifugó a 14,000 x g por 5 min. 
La pastilla de RNA se lavó dos veces con etanol (75%) y posteriormente se secó 
a 37 ºC. Finalmente se disolvió en agua DEPC (dietilpirocarbonato) y se guardó a -
70 ºC. 
 
7.4 Oligo específico para amplificación de cDNA 
	
  
Varios grupos han descrito que la secuencia de nucleótidos que codifica para el 
péptido señal se encuentra altamente conservado en toda la familia de 3FTx´s de 
los venenos de los elápidos de todo el mundo (Chang, 2007). En el laboratorio del 
Dr. Alejandro Alagón Cano del Instituto de Biotecnología de la UNAM, Carbajal-
Saucedo, A. desarrolló el oligo antxPS, 5´ATGAAAACTCTGCTGCTGAC3´(Tm = 
58 ºC), que fue utilizado para amplificar específicamente los cDNA’s de 3FTx´s. 
7.5 Amplificación de cDNA mediante la técnica 3´RACE 
 
El cDNA que codifica para las 3FTx´s fue amplificado mediante la técnica 
de 3´RACE con el kit comercial 1st Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV) 
de Roche®. El RNA total, purificado de las glándulas con el reactivo de Trizol 
(Gibco), fue reverso-transcrito. Para ello se utilizó un oligo-d(T) acoplado a una 
secuencia adaptadora (RACE1-AP) 
5’GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3’. Las condiciones utilizadas 
fueron: 10 min a 25 ºC; 60 min a 42 oC; 5 min a 99 oC; y finalmente las muestras 
se almacenaron a -70 ºC. 
 
 
 
 
 
	
   25	
  
7.6 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
 
Para llevar a cabo la reacción, se agregaron 5 µl de amortiguador de PCR 
10X con Mg2+ (Boheringer Mannheim), 4 µl dNTP´s (10 mM), 1 µl primer forward 
(20 mM) 5’GACTCGAGTCGACATCGATT3’ (RACE4-AUP), 1 µl primer reverse 
(20 mM) 5’ATGAAAACTCTGCTGCTGAC3’ (AntxPS), 1 µl templado (200 ng/ml), 
0.5 µl Taq polimerasa, a un volumen final de 50 µl. La reacción se realizó bajo las 
siguientes condiciones: 1 ciclo a 94 ºC por 5 min,30 ciclos con periodos de 94 ºC 
por 1min; 58 ºC por 1 min; 72 ºC por 1 min, con una extensión final a 72 ºC por 10 
min. 
7.7 Electroforesis en geles de agarosa para separar ácidos 
nucleicos 
 
Los geles de agarosa se prepararon al 1% en amortiguador TAE 1X (40 mM 
Tris-HCl, 20 mM ácido acético glacial, 1 mM EDTA pH 8.0 y 1 µg/ml bromuro de 
etidio). Las muestras se prepararon agregando amortiguador de carga que 
contenía 0.25%, azul de bromofenol, 0.25%, xilen cianol, 0.25%, ficoll 400. La 
electroforesis se realizó a un voltaje constante de 100 V. 
 
7.8 Purificación de banda de producto de PCR 
 
Los fragmentos amplificados en la PCR se purificaron utilizando el kit 
comercial High Pure PCR Product Purification (RocheTM), siguiendo las 
especificaciones de la casa comercial. 
 
 
	
  
 
	
  
	
   26	
  
7.9 Clonación de insertos en los vectores de clonación pCR TOPO 
2.1 y pST-Blue-1 
 
7.9.1 pCR TOPO 2.1 (Invitrogen®) 
 
Se llevó a cabo en un volumen de reacción de 6 µl, en donde 4 µl 
corresponden al inserto de interés, 1 µl de solución salina y 1 µl de vector pCR 
TOPO 2.1 (Invitrogen®). La mezcla se incubó 5 min a temperatura ambiente y 
quedó lista para realizar la transformación de células competentes. 
 
7.9.1 pST-Blue-1 (Novagen®) 
 
Se llevó a cabo en un volumen de reacción de 10 µl, en donde 4 µl 
corresponden al inserto de interés, 1 µl de vector pST-Blue-1 (Novagen®), 1 µl de 
amortiguador 10x ligasa T4 (Novagen®), 1 µl de ligasa T4 (Novagen®) y 3 µl de 
agua tetradestilada. La mezcla se incubó a 16 ºC durante 2 horas para que 
ocurriera la ligación del inserto en el vector linealizado. Una vez terminada la 
ligación, la construcción quedó lista para la transformación de células competentes. 
7.10 Transformación de células competentes XL1-Blue 
 
Una vez que el inserto de interés se clonó en el vector, le fueron 
adicionados en frio 100 µl de células competentes XL-Blue preparadas en el 
laboratorio. La mezcla se incubó en hielo durante 30 min. Posteriormente se dio 
un choque térmico a 42 ºC por 30 segundos, se adicionó 200 µl de medio nutritivo 
SOC (Triptona 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l, glucosa 3.6 g/l, cloruro de potasio 
(KCl) 0.186 g/l, cloruro de sodio (NaCl) 0.5 g/l, cloruro de magnesio (MgCl2) 0.96 
g/l, estabilizado a pH 7) y se incubaron a 37ºC durante una hora. 200 µl de 
solución XGal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) (15 mg/ml DMSO 
(Dimetilsulfóxido)) y 20 µl de IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) 100 mM 
	
   27	
  
se adicionaron a una placa de cultivo LB (Luria Bertani) con ampicilina (80 µg/ml). 
Finalmente, se inoculó la placa de cultivo LB con las células transformadas, y se 
dejó crecer a 37 ºC durante 14 a 16 horas. 
7.11 Aislamiento de clonas 
 
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se sacaron las cajas Petri 
con LB. Se corroboró la presencia de colonias, y las cajas fueron colocadas en el 
refrigerador durante media hora. Se volvió a verificar la población de colonias y 
solamente se marcaron las de color blanco, que son las colonias que 
hipotéticamente incorporaron la construcción inserto-vector. Se tomó una colonia 
aislada con la ayuda de una punta estéril, y se resuspendió en 10 µl de agua 
tetradestilada estéril. Un µl se utilizó para realizar una PCR de colonia, y el resto 
se utilizó para inocular un tubo de ensaye con 3 ml de medio LB con ampicilina (80 
µg/ml). El cultivo se dejó crecer en una incubadora a 37 ºC con agitación 
constante de 200 rpm (revoluciones por minuto) durante 14 a 16 horas. 
 
7.12 Purificación de plásmido 
 
Los plásmidos fueron purificados utilizando el kit comercial High Pure 
Plasmid Isolation Kit (RocheTM), siguiendo las especificaciones de la casa 
comercial. 
 
7.13 Ensayos de restricción 
 
Los ensayos se llevaron a cabo en un volumen de reacción de 10 µl, de los 
cuales, 8 µl fueron de la construcción plásmido-inserto, 0.5 µl agua tetradestilada, 
1 µl de amortiguador 10x para EcoR1 (New England Biolabs Inc.®) y 0.5 µl de 
enzima de restricción EcoR1 (R0101S, New England Biolabs Inc.®) (20,000 U/ml). 
La reacción se incubó 1 hora a 37 ºC. 
	
   28	
  
7.14 Secuenciación de insertos 
 
La secuenciación de insertos obtenidos de las clonas positivas fueron 
realizadas en un sistema automático en la Unidad de Síntesis y Secuenciación de 
ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM. 
 
7.15 Análisis bioinformático de secuencias 
 
Las secuencias fueron analizadas con los softwares 4-picks y Gene 
construction kit®. Mediante el programa Jalview/Clustal W se llevaron a cabo 
alineamientos entre las secuencias obtenidas, tanto a nivel de nucleótidos como 
de aminoácidos. Se hizo una búsqueda de proteínas similares en la base de datos 
del NCBI utilizando el programa Basic Local Aligment Research Tool (BLAST) 
para cada secuencia encontrada. 
 
7.16 Cromatografía de fase reversa 
 
Los componentes de los venenos fueron separados en un sistema de 
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, Agilent, CA). Se utilizó una 
columna Analítica C18 (Vydac® TP column, CAT No. 218TP104). Se cargaron en 
la columna 1.0 mg (Unidades de absorbancia a 280 nm) de veneno. La columna 
se estabilizó en buffer A (H2O + 0.1% TFA) y la elución se llevó a cabo 
incrementando linealmente la concentración de buffer B [0 a 60% ACN 
(acetonitrilo) + 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) en 60 min] con una velocidad de 
flujo de 1 ml/min. Se colectaron fracciones y se determinó la absorbancia de éstas 
a 280 nm. Finalmente, se obtuvieron los cromatogramas para cada veneno. 
 
 
	
  
	
   29	
  
7.17 Análisis se secuencia del N-terminal y espectrometría de 
masas (EM) de las fracciones purificadas FV y FVI del veneno de 
M. diastema y la toxina recombinante rD.H 
 
Las fracciones FV y FVI purificadas a partir del veneno de M. diastema y la 
toxina recombinante rD.H se analizaron por espectrometría de masas, y se 
secuenció el N-terminal mediante degradación de Edman. Los análisis fueron 
llevados a cabo mediante una colaboración con el Dr. Fernando Zamudio del 
Instituto de Biotecnología de la UNAM. 
Tanto las fracciones FV y FVI, obtenidas a través de RP-HPLC a partir del 
veneno de M. diastema y la toxina recombinante rD.H purificada, se cargaron en 
un espectrómetro de masas Finnigan LCQFleet (Thermo Scientific, San Jose, CA) 
acoplado a un sistema de ionización por electro-spray (ESI). Se inyectaron por 
infusión directa usando como fase móvil acetonitrilo al 50% + ácido acético al 
0.1%, la velocidad de flujo fue de 10 µl/min. El voltaje de spray fue de 1.9 kV y la 
detección iónica se realizó en modo positivo. Los datos de espectrometría fueron 
adquiridos de forma manual utilizando el software Tune Plus, y el software Xtract 
se utilizó para deconvolucionar el “envelope de cargas” de las señales m/z. Las 
masas moleculares se determinaron como el promedio de masas teniendo en 
cuenta la contribución de los isótopos pesados y no las masas monoisotópicas. 
 
Las fracciones de interés purificadas mediante HPLC fueron reducidas con 
DTT y alquiladas con yodoacetamida, como se ha descrito previamente por 
nuestro grupo (Corzo et al., 2009), posteriormente, se determinó la secuencia de 
aminoácidos del N-terminal mediante degradación de Edman automática. La 
secuencia se obtuvo por medio de en un secuenciador de proteínas PPSQ-31A 
Shimadzu Scientific Instruments, Inc. (Columbia, Maryland, USA). Cada fracción 
(aproximadamente 250 pmol) fue absorbida en un disco de fibra de vidrio 
(Shimadzu) tratado con TFA. 
 
	
  
	
   30	
  
7.18 Clonación del inserto D.H en el vector de expresión 
comercial pQE30 
Se diseñó un par de oligos para amplificar la secuencia del gen D.H. Estos 
incorporaron en la secuencia los sitios de restricción; Bam HI y Hind III; y un codón 
de paro. La PCR se llevó a cabo de acuerdo a las condiciones anteriormente 
descritas. 
antxFPMDH (antx ForwardPéptido Maduro D.H) 27 nucleótidos Tm 58 ºC 
5’ GGA TCC ATG ATA TGT CAC AAC CAA CAG 3’ 
 BamH I antxDH 
 
antxRPMDH30 (antx Reverse Péptido Maduro D.H pQE30) 29 nucleótidos Tm 58 ºC 
5’ AAG CTT TTA AGC GTT GCA TTT GTC TGA TG 3’ 
 Hind III Stop antxDH 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La secuencia amplificada se corrió en un gel preparativo de agarosa al 1%, 
la banda se cortó y purificó siguiendo la metodología anteriormente mencionada. 
Se purificó el plásmido pQE30 (QIAGEN®) (Figura 4), y tanto el plásmido como el 
inserto purificado fueron digeridos con las enzimas de restricción BamH I y Hind III 
(Roche) siguiendo la metodología anteriormente mencionada. Una vez digerido el 
plásmido pQE30, se desfosforiló con la enzima fosfatasa alcalina (Roche) (1 U/µl) 
a 37 ºC durante 1 hora con 30 min, la reacción se detuvo a 65 ºC durante 15 min. 
Tanto el inserto digerido como el plásmido pQE30 digerido y desfosforilado, 
se corrieron en un gel preparativo de agarosa al 1%, las bandas se cortaron y 
Figura	
  4.	
  Esquema	
  del	
  vector	
  pQE30.	
  PT5:	
  Promotor	
  T5.	
  lac	
  O:	
  Operador	
  lac.	
  RBS:	
  Sitio	
  de	
  unión	
  a	
  ribosoma.	
  
ATG:	
  Codón	
  de	
  inicio.	
  6xHis:	
  Tag	
  (cola)	
  de	
  secuencia	
  de	
  6	
  Histidinas.	
  MCS:	
  Sitio	
  múltiple	
  de	
  clonación.	
  Stop	
  codon:	
  
Codón	
  de	
  paro:	
  En	
  los	
  3	
  marcos	
  de	
  lectura.	
  Col	
  E1:	
  Origen	
  de	
  replicación	
  Col	
  E1.	
  Ampicillin:	
  Gen	
  de	
  resistencia	
  a	
  
ampicilina.	
  
	
   31	
  
purificaron. Posteriormente, se determinó la concentración del inserto (secuencia 
de D.H) y el vector pQE30 purificados, comparando las intensidades de las 
bandas de las muestras con las de los marcadores de peso molecular. 
Se realizó la reacción de ligación con una relación 1:9 de plásmido e inserto. 
Se probaron 2 ligasas T4 de proveedores diferentes (New England Biolabs Inc, y 
Roche) (400,000 U/ml). La reacción se llevó a cabo a 16 ºC durante 16 horas, 
siguiendo las especificaciones de los proveedores. 
Posterior a la ligación, la construcción D.H-pQE30 se utilizó para 
transformar células competentes XL1-Blue, siguiendo la metodología previamente 
mencionada. 
7.19 Pruebas de expresión de la proteína recombinante D.H 
 
Una vez obtenida la construcción D.H-pQE30, se llevaron a cabo pruebas 
de expresión en la cepa XL1-Blue. Se probaron colonias al azar, utilizando como 
control, la misma clona a probar pero sin inducir con IPTG. 
Las condiciones de expresión fueron; cultivos en tubo de ensayo de 3 ml de 
medio LB con ampicilina (Amp) (80 µg/ml), inducidos con 0.1 mM IPTG durante 
toda la noche a 30 ºC con agitación de 200-250 rpm. 
Se escogió una clona sobreproductora, posteriormente se le extrajo 
plásmido y se mandó a secuenciar para verificar que la secuencia de la 
construcción D.H-pQE30 fuera la correcta. 
La construcción D.H-pQE30 se utilizó para transformar las cepas; M15 
(pREP4) (QIAGEN®), BL21 Gold DE3 (Stratagene, Agilent, CA) y Origami DE3 
(Novagen®). 
Se probaron las mismas condiciones de inducción que se utilizaron con la 
cepa XL1-Blue, a excepción de las cepas M15 y Origami, en las cuales la única 
variante fue la adición del antibiótico kanamicina (Kan). 
Posteriormente, se escogió una clona sobreproductora de cada cepa. Se 
indujo la expresión de la proteína cambiando la temperatura a 16 ºC, el tiempo de 
incubación a 24 horas y el volumen de cultivo a 50 ml de medio LB en matraces, 
manteniendo la misma concentración de IPTG. 
	
   32	
  
7.20 Condiciones óptimas de expresión de la toxina recombinante 
D.H (rD.H) 
 
Las condiciones óptimas de expresión de la toxina rD.H en forma soluble y 
activa fueron las siguientes; D.H-pQE30 en cepa Origami DE3. Pre-inóculo de la 
cepa sobreproductora, crecido en un matraz con 50 ml de medio LB con Amp y 
Kan a 37 ºC con 200-250 rpm durante toda la noche. 
Se inoculó con 10 ml de pre-inóculo un matraz con 500 ml de medio LB 
mas Amp y Kan. Se dejó crecer a 37 ºC con 200-250 rpm hasta que se obtuvo una 
densidad óptica (DO) de entre 0.6 y 0.8. Posteriormente, se indujo la expresión de 
la toxina recombinante con 0.1 mM IPTG a 16 ºC con 200-250 rpm durante 24 
horas. 
7.21 Purificación de la toxina recombinante D.H (rD.H) 
 
El cultivo (1 litro) se centrifugó a 8000 rpm durante 20 min a 4 ºC. El 
sobrenadante se desechó, y el precipitado se resuspendió en 4 ml de buffer de 
lisis; BugBuster (Novagen®). Se adicionaron 4 µl de benzonaza (Nucleasa) (25 
U/µl) (Novagen®), posteriormente, 13 µl de una dilución 1:100 de lisozima (30 
KU/µl) (Novagen®). Se dejó incubar durante 20 min a temperatura ambiente, con 
agitación suave. Posteriormente se centrifugó por 25 min a 13000 rpm a 4 ºC. Se 
colectó el sobrenadante y se mantuvo a temperatura ambiente para su 
purificación. La purificación se realizó con una columna de afinidad a níquel con la 
resina Níquel-nitriloacético (Ni-NTA Novagen®). Se colocó un filtro en la columna 
(8 cm x 1.5 cm con capacidad para 10 ml), posteriormente se adicionaron 3 ml de 
resina Ni-NTA/50% metanol y se equilibró con 20 ml de PBS 1X (8 g NaCl (J.T. 
Baker), 0.2 g KCl (J. T. Baker), 1.44 g Na2HPO4 anhidro (J. T. Baker), 00.24 g 
KH2PO4 anhidro (J. T. Baker) en 800 ml de agua bidestilada, pH ajustado a 7.2 
con NaOH 10 N, aforo a 1 litro). El sobrenadante se transfirió a la columna y se 
recirculó a flujo muy lento, el recirculante se volvió a pasar por la columna. 
Posteriormente la columna se lavó con amortiguador PBS 1X hasta que se dejó de 
detectar proteínas en el eluente. Se realizó un segundo lavado con amortiguador 
	
   33	
  
PBS 1X con 25 mM de Imidazol (para preparar 100 ml de Imidazol 5 M; disolver 
34 g de Imidazol (Sigma- Aldrich) en 100 ml de agua bidestilada) hasta que se 
dejó de detectar proteínas en el eluente. Se eluyó con amortiguador PBS 1X con 
250 mM de Imidazol y se colectó en varias fracciones hasta que se dejó de 
detectar proteínas en el eluente. 
 
Se corrió un gel SDS-PAGE en condiciones reductoras al 15% con las 
fracciones purificadas. Se seleccionaron las muestras que contenían la mayor 
cantidad de proteína purificada y se juntaron en un “pool” (mezcla). 
Posteriormente se dializó contra 10 volúmenes de buffer PBS 1X utilizando una 
membrana de diálisis de ester de celulosa (CE), con un corte de 500-1000 Da y 
diámetro de 10 mm (Spectra/Por® Biotech), con tres cambios de amortiguador 
cada 2 horas. 
Se determinó la concentración de la proteína dializada mediante el método de 
cuantificación del Ácido Binciconínico (BCA) (Smith, et al., 1985) utilizando un kit 
comercial (BCA-Pierce®, Thermo Scientific) y una curva estándar con albúmina 
sérica bovina (BSA); stock a 2 mg/ml en 0.9% NaCl y 0.05% azida de sodio. 
Para su conservación, se adicionó azida de sodio al 10% hasta obtener una 
concentración final de 0.02%. Posteriormente, la proteína se alicuotó y almacenó 
a -20 ºC. 
 
7.22 SDS-PAGE 
 
Para observar la expresión y la purificación de la proteína recombinante, se 
realizó una separación electroforética mediante el método descrito por Laemmli, 
1970. Se utilizó una matriz de acrilamida/bis-acrilamida al 15% para preparar el 
gel separador, y 4% para el gel concentrador. Las muestras se prepararon en 
condiciones reductoras con amortiguador de carga 5X (Tris 1 M pH 6.8, glicerol, 
dodecilsulfato sódico (SDS) 1%, azul de bromofenol 10%, DTT) y se 
desnaturalizaron a una temperatura de 90 a 100 ºC durante 5 min. Después, se 
cargaron en los pozos del gel y se corrieron a 90 V constantes durante 15 min, 
	
   34	
  
posteriormente a 110 V durante 90 min aproximadamente. El gel se tiñó con azul 
brillante de Coomassie G-250 (50% metanol + 10 ác. acético + 0.2% de azul de 
Coomassie G250) y desteñido con solución de destinción (10% metanol + 10% 
ácido acético).7.23 Western Blot 
 
Las proteínas separadas por medio de SDS-PAGE se transfirieron a una 
membrana de nitrocelulosa (0.45 µM HATF, Millipore®), utilizando una cámara 
semi-húmeda HEP-1 (OWL®) con corriente constante (400 mA) durante 1 hora con 
un amortiguador de transferencia (39 mM glicina, 48 mM Tris-base, 0.037% SDS, 
20% metanol). La membrana se bloqueó con una solución de leche (Svelty, 
Nestlé®) al 5% en amortiguador TBST (5 ml Tris HCl pH 7.5 1 M, 15 ml NaCl 5 M, 
250 µl Tween 20, aforar a 500 ml con agua destilada) durante 2 horas. 
Posteriormente, se lavó 3 veces con TBST 1X durante 30 min con agitación 
suave. 
Después, se incubó con un anticuerpo primario (anticuerpo policlonal de 
conejo anti-rMlatA1 glicosilada (1:2000) y/o anticuerpo monoclonal comercial de 
ratón anti- 6X histidinas acoplado a peroxidasa (Roche®) (1:5000)) durante 1 hora, 
y se lavó 3 veces con TBST 1X durante 30 min con agitación suave. 
Para revelar los Western Blots tratados con el anticuerpo anti- 6X histidinas 
acoplado a peroxidasa, se utilizó el reactivo comercial TMB (Life Technologies®). 
Por otro lado, para los Western Blots tratados con el anticuerpo policlonal de 
conejo anti-rMlatA1 glicosilada, se lavaron 3 veces con TBST 1X durante 30 min 
con agitación suave. Posteriormente se adicionó un anticuerpo secundario de 
cabra monoclonal anti-conejo comercial acoplado a fosfatasa alcalina (Millipore®). 
Se incubó durante 1 hora y después se lavó 3 veces con TBST 1X durante 30 min. 
Para revelar se utilizaron los reactivos comerciales del kit BCIP/NBT (Invitrogen®). 
 
 
	
  
	
   35	
  
7.24 Pruebas de letalidad; cálculo de la DL50 
 
Se determinó la dosis letal media (DL50) de la toxina recombinante, 
inyectando por vía intravenosa diferentes cantidades de toxina purificada (6, 4.75, 
3.5, 2.8, 2.25 y 1.0 µg) en grupos de 5 ratones de la cepa CD1 de entre 18 y 20 g 
de peso. Se registraron las muertes de los ratones para cada dosis después de 24 
horas de su administración, posteriormente se analizó la relación de la mortalidad 
(%) como función de la dosis de toxina (log) mediante una gráfica sigmoidea de 
dosis-respuesta, usando el programa Prism 4 (GraphPad Software, CA). La 
potencia letal se expresó como la dosis letal media (DL50), la cual se define como 
la dosis de toxina (µg) capaz de matar al 50% de los ratones. 
 
7.25 Ensayos de electrofisiología en ovocitos de rana (Xenopus 
laevis) 
 
Los ensayos electrofisiológicos fueron realizados en el laboratorio del Dr. 
Estuardo López Vera del Instituto de Ciencias del Mar y Limnología, UNAM. El 
estudio se realizó con el receptor nAChR muscular fetal (αβγδ) murino, expresado 
en ovocitos maduros de Xenopus laevis. Las construcciones de las subunidades 
del receptor fueron microinyectadas en el núcleo de los ovocitos (23 nl cDNA, 10 
µg de cada subunidad del receptor). Posteriormente, los ovocitos se depositaron 
en una caja Petri y se almacenaron con una solución de amortiguador ND96 (96 
mM NaCl, 2.0 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, y 5 mM HEPES (pH 7.1-7.5)) 
y gentamicina al 0.1%, durante 24 horas. 
Para realizar las lecturas de electrofisiología, se utilizó la técnica de voltaje 
clamp con dos microelectrodos, como se describe a detalle por Cartier y 
colaboradores (1996). El ovocito se colocó en una cámara cilíndrica con una 
capacidad de aproximadamente 30 µl, con un flujo constante de solución ND96. 
Se ajustó una corriente de -70 mV. Los receptores de acetilcolina (ACh) fueron 
estimulados con pulsos de ACh 100 µM con duración de 1 segundo, separados 
entre sí por lapsos de 1 min. La toxina [2 µM] se administró directamente a la 
	
   36	
  
cámara, posteriormente se dejó un periodo de incubación de 5 min antes de iniciar 
el lavado y proseguir con los pulsos de ACh. 
7.26 Esquema de inmunización en conejos 
 
Se diseñó un esquema de inmunización para conejos Nueva Zelanda 
adultos, de aproximadamente 16 semanas de duración, utilizando como 
inmunógeno la toxina recombinante D.H purificada (Figura 5). Todas las 
administraciones fueron vía subcutánea, con un incremento gradual de la dosis y 
un orden alternado de adyuvantes; completo de Freund (CF) (CFA, Rockland, PA), 
incompleto de Freund (IF) (IFA, Rockland, PA), y alúmina (Alum) (Imject-Alum, 
Thermo-Scientific, USA). También se administró sin adyuvante (Sn) en un solo 
punto de cada esquema. 
Diez días después del la última inmunización, los conejos se sangraron a blanco 
mediante punción cardiaca. Finalmente, se separaron los sueros mediante 
centrifugación, y se guardaron a -20 ºC. 
 
7.27 Ensayos de reconocimiento de la toxina rD.H por E. L. I. S. A. 
 
Preparación de soluciones: 
 
Buffer Tris-HCL 1 M: 
Pesar 121.1 g de Tris-hidroxi-aminometano (Tris-base) y disolver en 800 ml de 
agua purificada. Ajustar el pH a 8 con HCI concentrado, con ayuda de un 
potenciómetro y aforar a un litro. 
 
Figura	
   5.	
   	
   Esquema	
   de	
   inmunización	
   de	
   la	
   toxina	
   recombinante	
   D.H	
   en	
   conejos.	
   Adyuvantes:	
   Completo	
   de	
   Freund	
   (CF);	
  
Incompleto	
  de	
  Freund	
  (IF);	
  Alúmina	
  (Alum);	
  Sin	
  adyuvante	
  (Sn).	
  
	
  
Conejo&32
Número Fecha Dosis%(µg) Tipo adyuvante
1 22-nov-13 2 CF
2 29-nov-13 4 IF
3 06-dic-13 20 Alum
4 20-dic-13 40 IF
5 07-ene-14 100 Alum
6 21-ene-14 300 IF
7 31-ene-14 300 Sn
8 18-feb-14 500 IF
9 04-mar-14 750 Alum
10 18-mar-14 750 IF
Conejo&41
Número Fecha Dosis%(µg) Tipo adyuvante
1 05-nov-13 2 CF
2 12-nov-13 2 IF
3 22-nov-13 2.5 Alum
4 29-nov-13 5 IF
5 09-dic-13 10 Alum
6 20-dic-13 50 IF
7 07-ene-14 100 Sn
8 21-ene-14 300 IF
9 31-ene-14 500 Sn
10 15-feb-14 500 IF
Conejo&55
Número Fecha Dosis%(µg) Tipo adyuvante
1 29-nov-13 2 CF
2 06-dic-13 4 IF
3 13-dic-13 20 Alum
4 20-dic-13 40 IF
5 07-ene-14 100 Alum
6 21-ene-14 300 IF
7 31-ene-14 300 Sn
8 18-feb-14 500 IF
9 04-mar-14 750 Alum
10 18-mar-14 750 IF
	
   37	
  
Buffer de carbonatos pH 9.5: 
Pesar 4.2 g de NaHCO3 y llevar a 450 ml con agua purificada, ajustar el pH de la 
solución a 9.5 con NaOH 5 N bajo agitación y seguimiento del pH con ayuda de un 
potenciómetro, aforar a 500 ml. 
 
Solución de bloqueo: 
25 ml de HCl 1 M pH 8 + 2.5 g de gelatina predisuelta en 100 ml de agua caliente 
(50-60 ºC). Después de atemperar, agregar 1 ml de Tween 20 y aforar a 500 ml 
con H2O. 
 
Solución de lavado: 
Tomar 30 ml de NaCI 5 M + 50 ml de Tris-HCl 1 M pH 8.0 + 0.5ml tween 20 y 
aforar a un litro con H2O. 
 
Buffer vehículo o de reacción: 
Tomar 25 ml de Tris/HCI 1 M pH 8 + 50 ml de NaCl 5 M + 100 mg de gelatina 
predisuelta en 100 ml de agua caliente (50-60 ºC), una vez atemperado agregar 1 
ml de Tween 20, aforar a 500 ml con H2O. 
 
Solución de revelado: 
Tomar 1 ml de buffer para ABTS 10X Roche + 75 µl de ABTS del stock de 50 
mg/ml y llevar a 10 ml con H2O. 
 
Desarrollo del ELISA 
1. Sensibilización: se sensibilizaron placas de 96 pozos MaxiSorb (NUNCTM Brand 
Products). Para ello, se preparó una solución de antígeno (rD.H) con una 
concentración de 5 µg/ml en buffer de sensibilizado. Posteriormente, se colocaron 
100 µl/pozo hasta el pozo 11, en el 12 sólo solución sin antígeno. Se dejó 
incubando 1hora a 37 ºC. 
2. La placa se lavó con 200 µl/pozo del buffer de lavado (3 veces). 
3. Bloqueo: se adicionaron 200 µl/pozo de la solución de bloqueo, y 
	
   38	
  
posteriormente se incubó durante 2 horas a 37 ºC. 
4. Se lavó la placa igual que en el paso 2. 
5. Primer anticuerpo: Se dispensaron 100 µl de buffer de reacción/pozo desde el 
pozo 2 hasta el 11; luego se colocaron 150 µl de una dilución (1:30) del suero de 
conejo anti rD.H en el primer pozo, y a partir de éste se tomaron 50 µl, que luego 
se depositaron en el segundo, se mezclaron repetidamente (4-6 veces) y así 
sucesivamente hasta llegar al décimo pozo. En éste último, luego de mezclar, se 
descartaron 50 µl para que todos los pozos contuvieran el mismo volumen/pozo. 
En los