Clonacion-y-analisis-estructural-de-la-region-promotora-del-gen-nasipp-de-nicotiana

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUíMICA 
Clonación y análisis estructural de la región 
promotora del gen NaSIPP de Nicotiana 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TíTULO DE 
QUíMICA FARMACÉUTICA BIOLOGA 
PRESENTA 
Renata Salcedo Sánchez 
Ciudad Universitaria, CDMX 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO 
Presidente 
Vocal 
Secretario 
1 er Suplente 
2do Suplente 
J. Eleazar Martínez Barajas 
Felipe Cruz García 
Francisco Javier Plasencia de la Parra 
Samuel Canizales Quinteros 
Aurora Lara Núñez 
SITIO DONDE SE DESARROLLO EL TEMA 
Laboratorio 104, Departamento de Bioquímica, Conjunto E. Facultad de Química. 
Universidad Nacional Autónoma de México 
ASESOR DEL TEMA 
Dr. Felipe Cruz García 
SUPERVISOR TÉCNICO 
M. en C. Yuridia Cruz González Zamora 
SUSTENTANTE 
Renata Salcedo Sánchez 
AGRADECIMI ENTOS 
El presente trabajo se realizó bajo la tutela del Dr. Felipe Cruz García en el Laboratorio 
104 del Departamento de Bioquímica de la Facultad de Química de la Universidad 
Autónoma de México. 
Este proyecto fue financiado por el proyecto CONACYT 236602, el Programa de Apoyo 
a la Investigaci6n y Posgrado de la Facultad de Química (PAI P) 5000-9128 Y por el 
Programa de Apoyo a Proyectos de Investigaci6n e Innovaci6n Tecnol6gica (PAPIIT-
IN217816) Y por medio del cual recibí una beca para la realización de esta tesis. 
11 
111 
fNDICE 
Resumen .................................................................................................................................... 1 
Antecedentes ................................................ ............ ............ ............ ............ ............ .................. 2 
Polinización y fecundación en plantas ..................................................................................... 2 
Autoincompatibilidad ................................. ............ ............ ............ ............ ............ .................. 3 
Promotores eucariontes ........................................................................................................ 15 
Justificación ...................................... ............ ............ ............ ............ ............ ............ ................ 29 
Hipótesis .............. ............ ......................................................................................................... 30 
Objetivos ................... .. .......... ............ ............ ............ ............ ............ ............ ............ ................ 30 
Metodología .............................................................................................................................. 31 
Extracción de DNA genómico por el método de CT AB .......................................................... 31 
Obtención de fragmentos de la secuencia río arriba de NaS/PP por el método de genome 
walking, mediante el kit Universal GenomeWalker 2.0 .......................................................... 32 
Clonación de las secuencias obtenidas por el método de DNA walking ................................ 39 
Análisis bioinformático del promotor potencial de NaS/PP .................................... ................ 43 
Resultados ................................................................................................................................ 44 
Extracción de DNA genómico (DNAg) ....................................................... ............ ................ 44 
Obtención de la secuencia del promotor potencial de NaS/PP ....... ............................. .......... 44 
Análisis bioinformático del promotor potencial. .............................. ............ ............ ................ 55 
Discusión .................................................................................................................................. 68 
Conclusión ................ .. .......... .. .......... ............ ............ ............ ............ ............ ............ ................ 75 
Perspectivas ........ ............ ......................................................................................................... 75 
Referencias ...................................... ............ ............ ............ ............ ............ ............ ................ 76 
Anexo 1. Materiales y Equipos .................................................................................................. 83 
Anexo 2. Elementos reguladores identificados ......................................................................... 89 
IV 
Resumen 
Dado que la mayoría de las angiospermas son hermafroditas se incrementa el riesgo de 
autopolinización y por ende de la autofecundación, lo que ocasiona depresión genética por 
endogamia. Para contender con esto, muchas especies desarrollaron mecanismos 
genéticos de Autoincompatibilidad (Al) el cual se basa en un reconocimiento célula-célula 
que regula la aceptación o rechazo del polen incompatible (polen propio o de individuos 
genéticamente relacionados). 
El sistema de Al en la familia Solanaceae es de tipo gametofítico, por lo que el fenotipo de 
incompatibilidad del polen es determinado por su propio genoma haploide. El 
reconocimiento y rechazo del polen incompatible está dado por la interacción haplotipo S-
específica entre las proteínas S-RNasa y SLF que se encuentran codificadas en el locus 
multialélico S. Además de las determinantes del locus S, existen genes o factores 
modificadores (GM) que también se requieren para el mecanismo de Al como: HT-B, 120K 
Y NaStEP, entre otros. 
La proteína NaStEP se expresa en estigmas maduros de especies Al de Nicotiana como N. 
afata. En estudios de silenciamiento con RNAi se dio evidencia de que NaSteP es crucial 
para que ocurra la respuesta de Al. Asimismo, mediante ensayos de doble híbrido, de 
complementación bimolecular y de complementación transitoria, se demostró que la 
proteína NaSIPP interacciona físicamente con NaStEP en el tubo polínico. 
Debido a que NaSfPP presenta expresión específica en polen maduro de especies Al de 
Nicotiana, el objetivo de este proyecto fue clonar y analizar la estructura de su promotor 
para identificar motivos de expresión espacio-temporal, además de elementos típicos de 
una región promotora. La clonación del promotor de NaSIPP se realizó mediante la técnica 
DNA walking, un procedimiento basado en PCR. Seguido de la clonación de esta región 
con potencial de ser un promotor y su análisis bioinformático. 
Mediante las aproximaciones experimentales anteriores se clonó una región de 1140 pb rio 
arriba del sitio de inicio de la traducción. Esta zona contiene elementos conservados en el 
núcleo del promotor como la Caja TATA, la Caja CG y la Caja CAAT. Asimismo, se 
encontraron elementos de transcripción especifica en polen maduro como los reportados 
para genes de la familia LA T de Sofanum fycopersicum y G 10 de N. tabacum. 
1 
Antecedentes 
Polinización y fecundación en plantas 
El proceso de polinización involucra muchas interacciones, reconocimiento de eventos y 
señales, muchos de los cuales requieren una regulación espacial y temporal muy 
precisa. Consiste básicamente en la llegada del polen al estigma de la flor, su 
hidratación,germinación y crecimiento del tubo polínico a través del pistilo hasta el 
ovario, donde encontrará a un óvulo donde descargará los núcleos espermáticos para 
que ocurra la fecundación, este es un proceso complejo y altamente regulado. 
Los granos de polen maduros normalmente se encuentran deshidratados al momento 
de abandonar la antera para mantenerse viables hasta llegar a una flor (que en el mejor 
de los casos será de la misma especie). Cuando aterrizan sobre un estigma maduro 
absorben agua y la hidratación promueve su actividad metabólica. El flujo de agua es 
indispensable y para ello participan acuaporinas como canales de agua (Chrispeels et 
al., 1999), algunos lípidos de cadena larga (Preuss et al., 1993), así como proteínas de 
recubrimiento del polen PCP's (pollen·coat·proteins) (Mayfield y Preuss, 2000; Mayfield 
et al., 2001). 
La hidratación va acompañada de un reordenamiento de los componentes 
citoplasmáticos que mantienen el citoesqueleto de actina funcional y el establecimiento 
de un gradiente de [Ca 2+], apical; con esto el grano de polen puede germinar y crecer 
(Franklin· Tong, 2002). 
Una vez que el tubo polínico germinó, crece a lo largo del estilo hasta alcanzar el ovario 
donde se llevará a cabo la fecundación. Aunque no está totalmente elucidado el 
mecanismo, se sabe que existe un incremento en la [Ca2+], seguido de la fusión de la 
célula espermática con la ovulocélula, esto sugiere que el aumento en la concentración 
de calcio activa una cascada de señalización que propicia el inicio de procesos post· 
fecundación (Franklin·Tong, 2002). 
2 
Autoincompatibil idad 
Las angiospermas son el grupo de plantas más exitoso y dominan la vegetación de la 
Tierra ya que conforman aproximadamente el 90% de las especies (Niklas, 1997). Este 
éxito es en parte consecuencia del conjunto de adaptaciones reproductivas que 
evolucionaron con la flor (como la polinización por insectos o animales). Dado que el 
95% de las flores son hermafroditas (Delia porta y Calderon-Urrea, 1993), es decir que 
contienen los órganos masculinos (estambres) y femeninos (carpelos/pistilos), la co-
sexualidad de las flores incrementa el riesgo de autopolinización (donde el polen se 
deposita sobre el estigma desde anteras de la msma planta) y autofecundación (ocurre 
cuando los óvulos de una flor son fecundados por el polen de la misma) lo que favorece 
la endogamia (Hiscock y Mcinnis, 2003). Para evitar esto, las plantas han desarrollado 
adaptaciones fisiológicas y morfológicas. Estas estrategas son: 
• Dicogama: maduración diferencial (en tiempo) de los órganos reproductivos 
• Hercogamia: separación espacial de carpelo y estambres 
r 
Floura 1 Molfologla de la angiosperma 
hermafrodita (Carn pbell y Reece, 2007) 
Aunque estas adaptaciones evitan en 
gran medida la autopolinización, no 
resuelven el problema de reproducción 
con individuos genéticamente 
relacionados. Para resolver esto, 
muchas especies desarrollaron 
mecanismos genéticos de 
Autoincompatibilidad (Al) siendo más 
eficientes para evitar la endogamia. 
Estos mecanismos se basan en un 
reconocimiento célula-célula que regula 
la aceptación o rechazo del polen, por lo 
que el polen incompatible (polen propiO o de individuos genéticamente muy 
relacionados) se rechaza inhibiendo el crecimiento del tubo polínico de manera 
específica (Franklin-Tong y Franklin, 2003) y propicia la reproducción cruzada. Estos 
mecanismos contribuyeron en gran medida al éxito evolutivo de mJchas angiospermas 
3 
por lo que se cree que actualmente el 60% de las plantas angiospermas presentan 
mecanismos de Al (Hiscock y Kües, 1999). 
La Al se puede clasificar según la morfología de la flor en heteromórfica y 
homomórfica. Se denomina heteromórfica cuando la flor presenta más de una 
morfología, en cuanto a la diferencia de longitud entre el pistilo y el estambre; mientras 
que en la homomórfica, el pistilo y los estambres se encuentran a la misma altura. En 
la Al heteromórfica, las zonas de rechazo pueden variar entre familias, especies e 
inclusive entre individuos, por lo que la habilidad de las plantas de rechazar su propio 
polen normalmente es incompleta y se suplementa con otras barreras en el estigma, el 
estilo y el ovario. Por el contrario, en las plantas homomórficas la expresión tejido 
específica de genes (en pistilo, estilo y ovario) representa una mejor clasificación de los 
mecanismos de Al. Existen dos clases principales de Al homomórfica a nivel genético: 
la gametofítica (AIG) y la esporofítica (AlE) que son definidas por el comportamiento 
del fenotipo S (Sterility) del polen y el reconocimiento de lo propio y no propio 
(Nettancourt, 2001). Estos sistemas de Al se clasifican para su estudio en tres tipos 
según la familia de plantas en la que se han estudiado: Al tipo Brassicaceae, Al tipo 
Papaveraceae y Al tipo Solanaceae [Figura 2]. 
4 
Autoincompatibilidad Homomórfica 
Sistemas genéticos que evitan la endogamia en plantas 
Esporofítico Gametofítico 
(Brassicaceae) (Solanaceae,Plantaginaceae, Rosaceae V Papaveraceae) 
Factores No dependiente de S-RNasa Dependiente de S-RNasa 
locus 5 
adicionales (Solanaceae, Plantaginaceae, (Papaveraceae) 
Rosaceae) 
I 
DF: SRK, SLG ARCl, MlPK, locus S Genes 
DM: SPll/SCR THL1, KAPP, Jocus S modificadores 
SNXl 
DF: PrsS 
DF: S-RNasa HTB, 120K, 
DM: PrpS 
DM: SLF NaStEP 
Figura 2. Clasi fi cación de los sistemas de Autoincompatibilidad homomórfica . DF: determi na nte 
femenina; DM: determinante ma sculina. Datos tomados de (de Nerrancourl, 2001; Hernández-Navarro 
et a l., 2009) 
La Al se define como "la incapacidad de una planta hermafrodita fértil de generar 
cigotos después de la autopolinización" y es controlada por el locus S (Sterility) 
multialélico, el cual determina la especificidad en el reconocimiento del polen . En este 
locus se encuentran al menos dos genes estrechamente ligados, uno expresado 
específicamente en polen o determinante masculina y otro expresado en pistilo o 
determinante femenina. Los productos de estos genes interaccionan en el tubo polínico 
para determinar si el polen es compatible o no (Nettancourt, 2001). Ambas 
determinantes son polimórficas y se heredan como una misma unidad de segregación, 
las variantes de este complejo de genes se denominan haplotipo S (Takayama y 
Isogai , 2005). 
Aunque el locus S codifica las determinantes de especificidad, en la mayoría de los 
sistemas como Brassicaceae y los basados en S-RNasa (siendo la excepción 
Papaveraceae) existen otros genes o factores no ligados al locus S que se requieren 
para el mecanismo de Al además de las determinantes de especificidad (McClure et al., 
2000). 
5 
Pist ilo 5]5z 
0 O O • • • 5áz 5,354 5]5,3 S, S, Só S. 
prOgenieS i 5]5,3 5]54 
5z5 3 5z54 
Firura 3. Rechazo del polen en Al 
esporofítica, donde el fenotipo de 
incompatibilidad del polen es determinado 
por el genoma dploide de la antera en 
que se produce 
s , 
progeniei 
Figura 4. Rechazo del polen en Al 
gametofTtica, donde el fenotipo de 
incompatibilidad del polen es 
determinado por su propiO genoma 
haploide. 
Autoincompatibilidad Esporofítica 
En la Al E, el fenotipo de incompatibilidad del 
polen es determinado por el genoma diploide 
de la antera (esporofita) en que se desarrolla 
[Figura 3[. La proteína S provenientes de las 
células tapetales diploides de la antera 
proporcionan, por medio del recubrimiento, los 
alelas S al polen. Este tipo de Al está presente 
en muchas familias como Brassicaceae, 
Asteraceae, Convolvulaceae, Betulaceae, 
Caryophyllaceae, Sterculiaceae y 
Polemoniaceae, pero se ha estudiado de 
manera extensa y a nivel molecular sólo en 
Brassicaceae (Hernández-Navarro el al. , 
2009). 
Autoincompatibilidad Gametofítica 
En la AIG, el fenotipo de incompatibilidad del 
polen es determinado por su propio genoma 
haploide, por lo que el polen es rechazado 
cuando el haplotipo Sdel polenes igual a alguno 
de los dos haplotipos S del pistilo. Si los 
haplotipos no coinciden el polen es aceptado 
[F igura 4]. La Al G se considera como el tipo de Al 
más común, ya que ocurre en 60-90 especies. A 
nivel molecular se ha estudiado principalmente 
en las familias Solanaceae, Rosaceae, 
Scrophulariaceae y Papavaraceae. Dos sistemas 
de AIG con mecanismos diferentes se han 
investigado con detalle a nivel molecular: el 
6 
primer sistema es no dependiente de S-RNasa y se ha estudiado en la familia 
Papavaraceae; mientras que el segundo sí es dependiente de S-RNasa y se ha 
caracterizado de manera extensa en miembros de la familia Solanaceae (Hernández-
Navarro et al., 2009). 
Al tipo Solaneceae 
En especies de las familias Solanaceae, Rosaceae y Scrophulariaceae la 
determinante femenina de la AIG es la ribonucleasa S-RNasa (McClure et al., 1989). 
una proteína altamente polimórfica en la población y que se acumula en 
concentraciones altas en el estigma, el estilo y el ovario. 
La S-RNasa es una glicoproteína estilar cuya función como determinante S-específica 
se determinó mediante estudios de pérdida y ganancia de función en N. alata y Petunia 
inflata, los cuales demostraron que la S-RNasa controla el comportamiento de 
autoincompatibilidad en pistilo y por tanto es esencial para el rechazo del polen 
incompatible (Lee et al., 1994; Murfett et al., 1994). 
Por estudios de mutagénesis del codón que codifica a una histidina de su sitio activo de 
la S-RNasa, fue posible abolir su actividad de ribonucleasa y con ello la capacidad de 
rechazar el propio polen en plantas transgénicas de P. inflata, lo cual demostró que el 
mecanismo bioquímico de Al involucra la actividad ribonucleasa de la S-RNasa (Huang 
et al., 1994). Mediante marcaje radioactivo del RNA de polen se demostró que éste se 
degrada específicamente después de una cruza incompatible pero no así después de 
una cruza compatible, ya que el RNA ribosomal y mensajero son degradados se 
impide la continuación del crecimiento del tubo polínico por lo que se considera a la 
determinante femenina una citotoxina altamente específica (McClure et al., 1990). 
Un indicio sobre la identidad de la determinante masculina se obtuvo a partir de la 
secuenciación y análisis del locus S de Antirrhinum hispanicum (miembro de la familia 
Scrophulariaceae) a partir del cual se encontró el gen AhSLF-S2 que codifica para una 
proteína con Caja F, el cual se expresa específicamente en granos de polen del mismo 
haplotipo-S (Lai et al., 2002). A partir de este resultado, se encontraron más genes con 
7 
Caja F en otras especies, siendo el gen SLF/SFB de Pranus mume miembro de la 
familia Rosaceae (Entani et al., 2003) el que contenía todas las características para ser 
la determinante masculina como son: a) localizarse en una región altamente divergente 
del locus S, b) exhibir diversidad haplotipo S específica y c) tener expresión específica 
en el polen (Takayama y Isogai, 2005). Con esta secuencia como base se encontró a la 
determinate masculina PiSLF de P. inflata (miembro de la familia Solanaceae). sobre el 
cual se comprobó que SLF es la determinante masculina, esto mediante ensayos de 
transformación en los cuales sólo los granos de polen transformados con SLF con el 
mismo haplotipo S del pistilo eran rechazados (SUacic et al., 2004). 
Es importante destacar que SLF contiene Caja F ya que muchas proteínas con Caja F 
(F box) se caracterizan por ser componentes del complejo E3 de ligasa de ubiquitina, 
llamado SCF constituido por Skp1, cullin-1 (una proteína de Caja F) y Rbx1. Este 
complejo está involucrado en la ubiquitinación y degradación específica de proteínas 
blanco mediante el proteasoma 26S, de forma que SLF podría ser parte del complejo 
SCF (Moon et al., 2004; Hua y Kao, 2006). 
Además de S-RNasa y SLF se requieren otros genes para que se lleve a cabo de 
manera exitosa el mecanismo de rechazo del polen, entre estos factores se encuentran: 
HT-B (McClure et al., 1999). 120K (Hancock et al., 2005), NaStEP, y probablemente 
Nap11 y NaTrxh (Cruz- Gracía et al., 2005; Juárez-Oíaz et al., 2006). 
• HT-B 
Para identificar secuencias (aparte de la S-RNasa) que participan en el rechazo del 
polen, se escanearon bibliotecas de cONA de N. alata por hibridación diferencial, a 
partir de esto se encontró una clona posteriormente denominada HT-B (High-Top Band) 
de expresión específica en estilo presente en la especie Al N. alata, pero no en la 
especie AC N. plumbaginifolia; posteriormente, mediante estudios de pérdida de 
función en plantas transgénicas se encontró que al no estar presente HT -B la planta 
pierde la capacidad de rechazar su propio polen (McClure et al., 1999), por lo que 
participa directamente en el sistema de Al. Cabe mencionar que se han encontrado 
8 
homólogos de HT-B en otros géneros de Solaneceae como Solanum (O-Brien et al., 
2002). 
Se sabe que cuando el pistilo no expresa a HT-B, la S-RNasa permanece 
compartimentalizada, incapaz de producir el rechazo del polen en cruzas incompatibles. 
Asimismo, se sabe que en una cruza compatible HT-B se degrada en el tubo polínico y 
la S-RNasa permanece secuestrada. Por lo contrario, en una cruza incompatible HT-B 
permanece estable; por lo que se ha sugerido su estabilidad es crucial para el 
mecanismo de Al (GoIDra~ et al., 2006; Franklin-Tong, 2008). 
• 120K 
La glicoproteína 120K cuya masa molecular aparente es de 120 kOa, se encuentra de 
manera abundante en pistilo de N.alata y se localiza en la matriz extracelular del tracto 
de transmisión además de estar conservada en muchas especies de Solanaceae; en 
pistilos polinizados la glicoproteína 120K pasa del tracto de transmisión y se concentra 
en la matriz extracelular adyacente al tubo polínico y también está presente en el 
citoplasma y la pared celular del tubo polínico (Lind et al., 1994; 1996). Al analizar la 
unión de la S-RNasa a otras proteínas estilares se encontró que 120K se une a la S-
RNasa como parte de un complejo con otras proteínas estilares (Cruz-García et al., 
2003; 2005). 
Para determinar la importancia de 120K en el mecanismo de rechazo del polen en 
Nicotiana, se crearon híbridos transgénicos con RNAi para suprimir su expresión, lo que 
resultó en líneas deficientes para rechazar su propio polen de manera S-específica, 
pero la supresión de 120K no mostró efecto sobre una polinización compatible 
descartando un función en el crecimiento del tubo polínico (Hancock et al., 2005). 
• NaStEP 
Para identificar factores específicos de pistilo que estuvieran involucrados en la 
interacción pistilo-polen se escanearon bibliotecas de cONA de Nicotiana, de las cuales 
se identificó una secuencia de RNA altamente expresado en pistilos maduros de N. 
alata (Al) pero indetectable en pistilos maduros de N. plumbaginifolia (AC), a partir de 
9 
esto se identificó la secuencia de NaStEP !.!!f.. Elata Stigma Expressed Protein) el cual 
tiene homología con inhibidores de proteasas tipo Kunitz. Por ensayos de 
inmunohistoquímica y western blot se demostró que NaStEP se localiza 
específicamente en estigmas de Nicotiana Al y se deposita en vacuolas estigmáticas 
pero es liberada en el exudado estigmático durante la polinización (Busot et al., 2008). 
Para determinar si NaStEP está involucrado en el mecanismo S-específico de rechazo 
del polen, se realizaron ensayos de silenciamiento con RNAi en híbridos de N. alata x 
N. plumbaginifolia, las plantas con NaStEP suprimida aceptaron el polen sin importar su 
haplotipo S y se produjo el crecimiento del tubo polínico hasta la base del pistilo. Por 
ensayos de inmunolocalización se detectó que NaStEP se relocaliza en la superficie del 
estigma hacia al tubo polínico y entra el tubo polínico en cruzas compatibles e 
incompatibles, siendo su función sobre procesos internos del tubo polínico. Dado que 
NaStEP pertenece a la familia de inhibidores de proteasatipo Kunitz, se evaluó su 
actividad sobre la estabilidad de HT-B, la cual disminuyó en tubos polínicos de pistilos 
con supresión de NaStEP polinizados con polen compatible e incompatible. Estos datos 
sugieren que NaStEP es necesario para mantener la estabilidad de HT -B en el tubo 
polínico durante la respuesta de rechazo del polen aunque no se ha demostrado el 
mecanismo específico (Jimenez-Duran et al., 2013). 
• NaSIPP 
Para identificar proteínas que presentan interacción con NaStEP dentro del tubo 
polínico se realizaron ensayos de doble híbrido en levadura, a partir de bibliotecas de 
cONA de polenltubo polínico y por análisis de secuencia se encontró que estas 
proteínas presentan similitud con el transportador de fosfato mitocondrial o TFM 
(responsables del transporte de fosfato dentro de la matriz mitocondrial donde es 
utilizado para la fosforilación oxidativa de ADP a ATP), esta proteína fue nombrada 
NaSIPP (N. alata Self-incompatibility Pollen Protein) (García-Valencia, 2013). 
La interacción física entre NaStEP y NaSIPP se comprobó mediante ensayos de doble 
híbrido en levadura y de complementación bimolecular de la fluorescencia (BiFe) en el 
hipocotilo de A.thaliana. Por microscopía de fluorescencia en tubos polínicos de 
10 
N.tabacum se observa que la proteína NaSIPP se encuentra localizada en mitocondrias 
del tubo polínico (García-Valencia et al., en revisión). 
Mediante RT-PCR se sabe que NaSIPP se expresa de manera abundante en polen y 
aunque su expresión es indetectable en etapas tempranas del desarrollo de la antera, la 
expresión aumenta considerablemente en la madurez del polen. El mRNA de NaSIPP 
está presente en especies auto incompatibles de Nicotiana pero no se ha detectado en 
auto compatibles, aunque el genoma de estas especies contiene secuencias 
homólogas a NaSIPP (García-Valencia et al., en revisión). 
La interacción de NaSIPP con NaStEP y el patrón con el cual se expresa hacen a este 
gen un fuerte candidato para participar en el mecanismo de rechazo del polen. 
Modelos de rechazo del polen en Al tipo Solanaceae 
Se han propuesto dos modelos para el mecanismo de rechazo del polen dependiente 
de S-RNasa en Al tipo Solanaceae, estos modelos tratan de explicar cómo es posible 
que las S-RNasas llevan a cabo la inhibición del crecimiento del tubo polínico en cruzas 
incompatibles. El primer modelo involucra la degradación de estas S-RNasas en el 
citoplasma (Hua et al., 2008), mientras que el segundo incluye su 
compartimentalización en vacuolas dentro del tubo polínico (GoIDra~ et al., 2006; 
McClure y Franklin-Tong, 2006). 
A. Modelo de la degradación de la S-RNasa 
Este modelo se basa fundamentalmente en la capacidad que tiene SLF (debida a la 
Caja F) de degradar proteínas mediante proteasoma 26S. Se ha propuesto que tras 
entrar al tubo polínico, la S-RNasa "no propia" interacciona con SLF (lo que constituye 
una cruza compatible) de forma que la S-RNasa es ubiquitinizada para su posterior 
degradación mediante el proteasoma 26S, evitando su efecto citotóxico sobre el tubo 
polínico; mientras que en una cruza incompatible en la cual interaccionan la S-RNasa 
"propia" con SLF no se lleva a cabo la degradación de la S-RNasa y su efecto citotóxico 
inhibe el crecimiento del tubo polínico (Hua y Kao 2006; Hua et al., 2008) [Figura 5]. 
11 
Aunque existe evidencia de que la 5-RNasa podrla ser degradada vla el proteasoma 
265, algunos de los datos que soportan este ITKldelo se obtuvieron en sistemas in vitro 
o en organislTKls heterdlogos, adem:is de que no considera algunos aspectos 
ilTflortantes COITKl: a) la gran cantidad de 5-RNasa que se aculTlJla dentro del tubo 
pollnico previo al rechazo del polen, b) las protelnas estilares HT-B, 120Ky Na5tEP y c) 
existe al menos un caso en el cual SLF esta ausente en una planta auto incompatible, 
por lo que 5LF no es esencial para la degradacidn de 5-RNasa "no propia" en lodos los 
casos (Hernandez-Navarro et al., 2009). 
A. 
® 
~ 
O 
E,ti lo S ,S, 
B. 
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O 
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Polen rompati !>e oS, 
® .. A. 
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Polen ¡nrompa!i !>e S, 
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SLF, SLF. S,-RNa,a 
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De~radadón 
ele S-RN • . <> 
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De¡¡radadoo de RNA 
'i) • 
'" Ubiquitina nm t""om. 
FiglJa 5. Modeb de la de<Jadación. A) En una polinizaci:'Jn compatible, la planta S, S, con polen 
S" las S·RNasas S, y S, inlffaccionan flJeftemente con SLF, y se ubiquitinan para su postero 
degadaci:'Jn. B) En una polinización incompatible, la planta S,S, con polen S" SLF, inlffacciona 
débilmente con S,·RNasa, pcr lo que la maycrfa de la S"¡~Nasa se encuem-a li~e para inhibi" el 
crecimiento del tubo polfnioo. Modifk:a<b de Heulilndez·Navarro el aL, 2009 
12 
B. Modelo de compartimentalización de la S-RNasa 
Este modelo incorpora la observación de que el tubo polínico internaliza la S-RNasa 
propia y no propia mediante endocitosis para mantenerlas en vacuola y que HT -B es 
degradada en cruzas compatibles pero permanece estable en cruzas incompatibles. En 
una cruza compatible se conserva la integridad de las vacuolas permitiendo que 
continúe el crecimiento del tubo polínico, mientras que en una cruza incompatible las 
vacuolas que contienen a la S-RNasa se rompen y es liberada al citoplasma donde 
degrada el RNA llevando al rechazo del polen. En este modelo la interacción entre la S-
RNasa propia o no propia y SLF determina directamente la especificidad del rechazo 
del polen (GoIDra~ et al., 2006; McClure y Franklin-Tong, 2006) [Figura 6]. 
Este modelo incorpora la participación de genes modificadores (HT -B, 120K Y NaStEP) 
y explica cómo el tubo polínico maneja la gran cantidad de S-RNasa por medio de la 
compartimentalización, además de suponer que la ruptura de las vacuolas que 
contienen la S-RNasa es una consecuencia de la interacción específica entre las 
determinantes S-RNasa y SLF; este modelo contiene poca información sobre la 
determinante SLF y factores de expresión en polen (Hernández-Navarro et al., 2009). 
Dada la expresión diferencial (especie, tejido y etapa de desarrollo) de los factores que 
participan en el mecanismo de rechazo del polen en Al tipo Solanaceae, es importante 
estudiar la estructura de sus promotores como una ruta para el estudio de su regulación 
y generar datos que contribuyan a elucidar este mecanismo. 
13 
A. 
B. 
Polinización compali tJ~ 
Eslrto S,S, 
® O 
O® 
Eslrto S,S, 
HT-B 
® O 
o ® 
Polinizadó fl incompJl i b~ 
• • 
S1-RNasa S;>-RNasa 
Po~n 53 
--) ® O 
) 
• 
120K 
/ 
.- "--
O ® 
. ® O 
r I 
\ O ® . '3r. --
' . _ .... _ ~ ... O 
... 0 ------
®"-.-O 
, SLF. SLF, 
Floura 6 Modelo de compartimentalizociOn. A) En una cruza compatible ertre una plarta 5 ,52 y polen 
53, ambas S-RNasas entran por endocitosis al tubo polrnico jurto con HT-B y 120K No hay 
interoccion especrfica entre S,-RNasa y S2-RNasa con SLF3, HT-B es degradado por una protefna 
estabilizadora (PP) hpotetica y como consecuerr:ia la S-RNasa se mantiene recluida en vocuolas. B) 
En una cruza incompatible entre LIIla planta 5,52 con polen 5" ambas S-RNasas entran por 
endocitosis al tubo polrnico y pennanocen en vacuolas en etapas tempranas. El reconociniento 
especrfico entre S,-RNasa y SLF, evitan la degradocion de HT-B, la vocuola se rompe y libera S-
RNasas al citoplasma. Modificado de Hernandez-Navarro el al., 2009 
14 
Promotores eucariontes 
La transcripción de un gen que codifica una proteína es precedido por múltiples 
eventos, estos incluyen la descondensación del locus, el rearreglo del nucleosoma, la 
modificación de histonas y la unión de los factores de transcripción a las regiones 
activadoras y al promotor que permiten el reclutamiento de la maquinaria de 
transcripción al núcleo del promotor (5male y Kadonaga, 2003). 
Los elementos reguladores en Gis son una colección de sitios de unión para factores 
de transcripción y otras secuenciasde DNA no codificantes que pueden activar de 
forma definida específica la transcripción de un gen según factores espacio temporales, 
las mutaciones que afectan el funcionamiento de estas secuencias contribuyen a la 
diversidad fenotípica entre especies. Hasta la fecha los elementos reguladores en Gis 
más estudiados son los promotores y las secuencias activadoras (Wittkopp y Kalay, 
2011 ). 
Un promotor es la región del DNA que tiene como función regular la transcripción de un 
gen, se localiza normalmente en la región 5' río arriba del sitio de inicio de la 
transcripción o T55 (Transcription Start Site). El inicio de la transcripción es regulado en 
gran parte por la unión coordinada de muchas proteínas (también llamadas factores de 
trascripción o TF 's) a la región promotora y a regiones activadoras en algunos genes. 
Combinaciones específicas de sitios de unión de TF 's al DNA pueden proveer 
información que sugiera un contexto de expresión particular, es decir, los factores 
fisiológicos o ambientales que dirigen la expresión del gen, esta es la orientación del 
análisis de muchos métodos computacionales (Fickett y Hatzigeorgiou 1997; 
Yamamoto et al., 2007). 
La regulación de la transcripción depende de la disponibilidad y la actividad de los TF 's 
así como del tipo, número, posición y combinación de los elementos reguladores 
presentes en el promotor y otras regiones cercanas. El nivel de expresión de un gen a 
nivel del promotor está controlada en la mayoría de los casos por los elementos en Gis 
que se localizan río arriba del T55. 
15 
La información que se obtiene de la caracterización y clasificación de un promotor es 
importante para contribuir al entendimiento de los procesos que median la regulación 
biológica. 
Es importante mencionar que además de la regulación transcripcional debida a la 
secuencia del promotor, existe la regulación epigenética que consiste en cambios 
heredables en la función de los genes que ocurren sin un cambio en la secuencia del 
ADN. Este tipo de regulación incluye, entre otros, tres mecanismos principales: 
metilación de DNA, modificación de histonas y RNA's pequeños (Allis y Jenuwein 
2016). Con el conocimiento de este nivel de regulación, es importante tomar con 
cautela cualquier aseveración sobre la regulación transcripcional de un gen específico 
que considere solamente la secuencia de su promotor, aunque para fines de 
simplicidad muchas investigaciones se centran en un solo tipo de regulación. 
Estructura del promotor eucarionte 
Estructuralmente, un promotor se divide en región distal y región proximal, la región 
proximal comprende desde el TTS hasta aproximadamente ,250 pb e incluye una 
región llamada núcleo del promotor o core promoter, el cual contiene la secuencia 
necesaria para guiar la iniciación de la transcripción de manera correcta, ésta incluye el 
TSS y regiones conservadas como la Caja TATA (TIA o AlT) alrededor de ,25 pb, otros 
elementos como el iniciador (Inr), elemento reconocido por el factor de transcripción 
TFIIB, elemento de reconocimiento B (BRE) Y el elemento río abajo del promotor o DPE 
(downstream promoter element). Estos elementos se encuentran conservados de 
manera general en muchos organismos eucariontes (Butler y Kadonaga, 2002). 
El complejo de preiniciación de la transcripción (PIC) reconoce al núcleo del promotor e 
inicia la transcripción, el PIC incluye además de la RNA polimerasa 11 los factores de 
transcripción TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF Y TFIIH (también llamados factores 
generales o basales de la transcripción), siendo algunos de estos a su vez complejos 
proteicos. Los factores de transcripción basales se llaman así ya que son los factores 
mínimos necesarios para llevar a cabo la transcripción desde el núcleo de promotor 
aislado en un sistema in vitro. La mayoría de los estudios realizados sobre los factores 
16 
de trascripción basales, se han hecho en promotores que contienen la Caja TATA 
como elemento esencial del núcleo del promotor (Smale y Kadonaga, 2003) aunque no 
todos los promotores contienen este motivo. 
Núcleo del Promotor (Gore Promoter) 
El núcleo del promotor es la región del promotor en la cual la enzima RNA polimerasa 11 
y los TF"s inician la transcripción. La RNA polimerasa purificada puede sintetizar RNA a 
partir de DNA pero no reconoce el núcleo del promotor, este proceso requiere de los 
TF"s antes mencionados, los cuales no interaccionan de manera general en todos los 
promotores (Juven-Gershon y Kadonaga, 2010). 
Se ha encontrado que secuencias reguladoras sensibles a la dirección se encuentran 
en el núcleo del promotor, esto es consistente con la idea de que el núcleo del promotor 
dicta la dirección de la transcripción (Figura 7). El ejemplo más significativo de estas 
secuencias es la Caja TATA (Yamamoto et al., 2007). El núcleo del promotor es diverso 
en términos estructurales y de función, existen varias secuencias que pueden contribuir 
a la actividad de promotor, por lo que no hay elementos del núcleo con extensión 
universal (Juven-Gershon y Kadonaga, 2010). La diversidad en la estructura y función 
del núcleo del promotor además de la variedad de los factores de transcripción 
contribuyen a la complejidad de los organismo. 
BRE 
TFIlB 
Recognition 
Elemclll 
GGGCGCC CCA 
-40 
I 
TATA Box 
TATAAAAG T A 
BREU TATA BREd 
Inr OPE 
InitialOr DownSlream eore 
Promoter Elemenl 
+1 
Drosophila TCAGTT T C G 
Mammal. PyPyANÁPyPy 
AGAC A G TT C 
+1 
Inr MTE DPE 
+40 
I 
Figura 7. Motivos comunes en 
el núcleo del promotor. Un 
promotor puede contener 
algunos, uno o ninguno de 
estos elementos, ya que no 
existen elementos universales 
del núcleo se cree que aún 
existen motivos por descubrir 
Modificado de Juven-Gershon 
y Kadonaga (2010). 
Los motivos más importantes que se han identificado del núcleo del promotor son la 
Caja TATA, el elemento Inr y los motivos BRE. DPE Y MTE asf como las islas CpG, 
17 
varios autores sugieren la existencia de muchos otros elementos aún por descubrirse 
(Butler y Kadonaga 2002; Juven-Gershon y Kadonaga 2010; Porto et al. 2014). 
• Caja TATA 
Presente en promotores de organismos eucariontes, este elemento es el más conocido 
y fue el primero en ser descubierto. En un estudio comparativo de tipo perfil LDSS, se 
encontró que la Caja TATA es el elemento más conservado en mamíferos y plantas 
(Yamamoto et al., 2007). Este elemento fue identificado en los promotores de genes 
codificantes de proteínas, por la comparación de las secuencias que flanquea en 5-
estos genes en Drosophila, mamíferos y virus. Ensayos de transcripción in vitro 
demostraron que mutaciones en la Caja TATA usualmente reducían o eliminaban la 
actividad del promotor (Smale y Kadonaga, 2003). 
La secuencia de la Caja TATA es reconocida por la proteína de unión a la Caja TATA 
(TBP), la cual es una subunidad del factor de transcripción TFIID, de esta forma TBP 
también interacciona con TFIIB y la secuencia río arriba a la Caja TATA; lo que indica 
que estos dos factores de transcripción pueden tener un papel importante en el 
reconocimiento del núcleo del promotor; el elemento TFIID es el factor que se une de 
formas específica sobre una región del DNA (Butler y Kadonaga, 2002; Fickett y 
Hatzigeorgiou, 1997). 
La influencia de la secuencia TATA para dirigir la dirección de la trascripción no es 
decisiva y depende también de la interacción de otros factores como el TSS y regiones 
activadoras (Cox et al., 1997). Esta propiedad posteriormente descrita como 
sensibilidad a la dirección también fue evaluada para Arabidopsis en ensayos in silico al 
buscar si la secuencia complementaria de la Caja TATA estaba presente en la región 
promotora (Yamamoto et al., 2007). 
La secuencia de la Caja TATA Y la de la proteína TBP se encuentran conservadas 
desde arqueobacterias hasta humanos. Aunque es el motivo más común presente en el 
núcleo del promotor,sólo se ha encontrado en el 10-15% de los promotores en 
mamíferos (Juven-Gershon y Kadonaga, 2010). 
18 
• Elemento iniciador Inr 
Presente en el núcleo de algunos promotores, usualmente incluye el TSS y se 
encuentra indistintamente de que el promotor contenga la Caja TATA; ambas 
secuencias interactúan con el factor TFII O por lo que la ausencia de la Caja TATA en 
un promotor puede ser compensada por Inr y cuando se encuentran ambas funcionan 
conjuntamente (Fickett y Hatzigeorgiou, 1997). Este elemento puede unirse a varias 
proteínas y puede dirigir el inicio de la transcripción. Los factores asociados a TBP 
(TAF's) que reconocen la secuencia de Inr son el TAF1 y TAF2 (Juven·Gershon y 
Kadonaga, 2010). 
• Motivo BRE 
El motivo BRE (TFIIB Recognition Element), inicialmente fue identificado como una 
secuencia de unión direccionalmente específica para TFIIB y se localiza junto a la Caja 
T ATA. La evidencia de la existencia de este elemento localizado inmediatamente arriba 
de la Caja TATA (-12%) se obtuvo por medio de experimentos con promotores 
mutantes de arqueobacterias. Las interacciones de TFIIB con BRE se obtuvieron por 
medio de estudios de cristalografía con rayos x del complejo TFIIB·TBp·DNA ( 
Lagrange et al. 1998; Juven·Gershon y Kadonaga, 2010). 
• Motivo DPE 
El motivo DPE (downstream core promoter element) se identificó como un sitio de 
reconocimiento para TFIID que se encuentra río abajo del elemento Inr y se conserva 
su secuencia de Drosophila a humanos; este motivo parece no estar presente en 
Saccharomyces cerevisiae (Butler y Kadonaga, 2002). Los promotores dependientes de 
DPE generalmente contienen sólo el elemento Inr y el DPE. En plantas este elemento 
se encuentra en una gran cantidad de promotores de respuesta a diferentes estímulos 
ambientales, se puede encontrar en diferentes sitios y en diverso número de copias río 
arriba del TSS (Sawant et al., 2001). 
El factor de transcripción TFIID reconoce los motivos y se une a Inr y DPE, como 
resultado de mutaciones en alguno de los dos motivos se pierde la unión de TFIID al 
núcleo del promotor. El motivo DPE se encuentra más comúnmente en promotores que 
19 
carecen de la Caja TATA Y como ocurre naturalmente en los promotores que no 
contienen este elemento las mutaciones en la secuencia de DPE resulta en una 
disminución significativa de la actividad transcripcional basal (Burke y Kadonaga, 1997; 
Juven-Gershon y Kadonaga, 2010). 
Elementos reguladores 
Las interacción entre elementos reguladores río arriba del TSS con factores de 
transcripción específicos de secuencia (SSTFs) determinan el tiempo, lugar y nivel de 
actividad de todos los genes no constitutivos dentro de una red de expresión altamente 
controlada, estos incluyen elementos de respuesta a la luz, elementos de respuesta a 
giberelinas, elementos de respuesta al ácido abscísico entre otros. 
• Elemento de respuesta a la luz (LREs) 
Muchas plantas han desarrollado complejos sistemas biológicos para percibir y 
responder a la luz, estos sistemas se basan en tres clases de foto receptores: 
fitocromos, receptores de luz azul y receptores de luz UV; la señal absorbida por estos 
regula la transcripción de un gran número de genes que codifican para la síntesis de 
proteínas relacionadas con fotosíntesis y cascadas de señalización. Extensivos 
análisis de mutación y deleción sobre las regiones promotoras de genes inducidos por 
luz permitieron identificar elementos involucrados en el control de la transcripción 
mediada por luz, algunos de los más importantes son la Caja 1, Caja G y Caja H, estos 
motivos se presentan en diversas combinaciones ya que ningún motivo identificado ha 
demostrado respuesta a la luz por sí solo, no se ha encontrado ningún elemento 
universal pero sí se han encontrado estos motivos en genes que no son regulados por 
la luz (Fankhauser y Chory, 1997; Komarnytsky y Borisjuk, 2003). 
Los únicos factores de transcripción de los cuales existe evidencia suficiente de su 
importancia en la transcripción mediada por luz, son los factores HY5 y PIF3 de 
Arabidopsis, los cuales interaccionan con la Caja G (Viczián et al., 2005). 
20 
• Elementos de respuesta a ácido giberélico (GAREs) 
Las hormonas giberelinas (GAs) son potentes fitohormonas cruciales para el desarrollo 
y crecimiento en plantas, incluyendo germinación de la semilla, elongación del tallo, 
expansión de la hoja, maduración del polen e inducción de la floración (Daviere y 
Achard, 2013). 
La mayoría de los componentes de la vía de señalización de GAs se han identificado en 
arroz y Arabidopsis siendo los componentes clave en Arabidopsis el receptor GIDI, 
inhibidores del crecimiento DELLA (DELLAs) y las proteínas SLEEPY1 (SL Y1) Y 
SNEEZY (SNZ) de Caja F. El mecanismo de acción más aceptado es que las proteínas 
DELLAs restringen el crecimiento de la planta, mientras que GAs promueven el 
crecimiento al superar el efecto de DELLAs. La formación del complejo GA-GID1-
DELLA (encontrado por ensayos de interacción en levaduras) estimula la degradación 
de DELLAs, las proteínas de la Caja F (SL Y1 Y SZN) catalizan la unión de una cadena 
de poliubiquitina a las proteínas DELLAs para su posterior degradación en el 
proteosoma. Esta degradación elimina el efecto inhibidor del crecimiento (de Lucas et 
al., 2008; Bai et al., 2012; Daviere y Achard, 2013). 
• Elementos de respuesta al ácido abscísico (ABREs) 
El ácido abscísico (ABA) es una hormona de plantas muy importante, ya que modula la 
respuesta a estrés abiótico, coordina la transducción de señales en vías involucradas 
con la respuesta a estrés ambiental como la sequía, alta salinidad, calor y frío. Se sabe 
que todos estos factores incrementan los niveles endógenos de ABA (Cruz et al., 2014). 
La complejidad de la expresión genética dependiente de ABA sugiere que funciona a 
través de redes intrincadas, estudios recientes sobre sistemas biológicos proponen un 
modelo en el que la cascada de señalización de ABA incluye más de 500 interacciones 
entre 138 proteínas diferentes (Lumba et al., 2014). 
En plantas la susceptibilidad o tolerancia al estrés es una acción coordinada de 
múltiples genes de respuesta a estrés, los niveles de ABA se ajustan constantemente 
en respuesta a las condiciones del ambiente y varios factores de transcripción 
21 
específicos como DREB2A12B, AREBl Y MYC/MYB regulan la expresión de genes de 
respuesta a ABA al interaccionar con su elemento correspondiente (Tuteja, 2007). 
Obtención y análisis de regiones promotoras 
La obtención de regiones promotoras usualmente inicia con la identificación de genes 
que se expresan bajo ciertas condiciones fisiológicas o ambientales (Porto et al., 2014). 
Existen dos acercamientos indispensables, el funcional y el estructural para los cuales 
se han desarrollado diversos sistemas. 
La identificación de secuencias promotoras inicia con la identificación de genes que se 
expresan diferencial mente, existen técnicas que identifican esta característica como el 
PCR de transcripción reversa o RT-PCR (semicuantitativo). PCR en tiempo real o RT-
qPCR (cuantitativo) y Northern blot. Posterior a la identificación de genes con expresión 
diferencial se pueden encontrar regiones reguladoras al realizar un escrutinio de 
bibliotecas genómicas, siempre que se haya secuenciado total o parcialmente el 
genoma del organismo de interés o de miembros del mismo género. También se 
pueden emplear métodos para caminar en el genoma (genome walking) y PCR termal 
de entrelazado asimétrico o TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced polymerase 
chain reaction) (Porto et al., 2014). 
Identificación de regiones reguladoras 
A partir de la secuencia de DNA río arriba del TSS de un gen con expresión diferencial, 
se pueden identificar las regiones reguladoras al compararlas con las bases de datos 
disponibles. Existen diversas bases de datos de secuencias reguladoras sobre lascuales se pueden obtener los alineamientos, éstas contienen elementos del núcleo del 
promotor así como otros elementos reguladores identificados y caracterizados, 
descripciones y referencias de publicaciones (Porto et al., 2014). Algunas de estas 
bases de datos se presentan en la Tabla 1. 
22 
Tabla 1. Bases de datos disponibles para la identificación de secuencias reguladoras. Modificado de 
Porto et al. 2014 
Base de datos Utilidad 
Servidor que permite identificar secuencias de unión a 
CON REAL 
http://conreal.niob.knaw.nl/ 
factores de transcripción que están conservados entre dos 
secuencias promotoras ortólogas 
ConSite Permite exploroar los sitio de unión a facores de 
http://consite.genereg.netl transcripción compartidos entre dos secuencias genómicas 
Base de datos de factores de transcripción. 
JASPAR Core Plantae Organismos: Zea mays, Hordeum vulgare, Pisum sativum, 
http:/ ~aspar. genereg. netl Petunia hybrida, Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana, 
Triticum aestivum, 
jPREdictor Predicción de elementos reguladores en Cis a escala de 
http://bibiserv.techfak.uni- genoma completo. Se basa en la predicción de Clusters de 
bielefeld.de~predictor motivos individuales y la combinación arbitraria de estos 
Análisis multigenoma de la posición y patrón de elementos 
MAPPER de regulación. Plataforma para la identificación de sitios de 
http://snpper.chip.org/mapper/mapper- unión a factores de transcripción en múltiples geno mas. 
main Organismos: humano, ratón, D. melanogaster, C.elegans y 
S.cerevisiae 
Herramienta para la búsqueda de sitios de unión a factores 
Matinspector 
de transcripción, a partir de las bases de datos: 
-Genomatix promoter database: promoters of annotated 
https:llwww.genomatix.de/online_help/help 
_mati nspector Imatinspector _hel p. html 
gens 
-Genomatix promoter database: promoters of al genes 
-Genomatix EIDoraro genomes 
Programa para encontrar motivos reguladores a nivel de 
PhyloNet genoma, basado en varias secuenciasde genomas 
http://stormo.wustl.edu/PhyloNetl relacionados de manera evolutiva. Predice motivos 
conservados. 
PLACE 
Búsqueda de motivos reguladores en plantas 
Organismos: N. tabacum, A. thaliana, Zea mays, So/anum 
https:llsogo.dna.affrc.gojp 
Iycopersicum, etc. 
Busqueda de elementos de 
PlantCare 
regulación en cis, sobre 
http://bioinformatics.psb.ugent.be/ 
promotores de plantas. 
Organismos: N. tabacum, A. thaliana, Zea mays, So/anum 
webtools/plantcare/htmll 
Iycopersicum, etc. 
23 
Análisis Estructural y Funcional 
Existen dos tipos de estrategias en cuanto al análisis estructural de un promotor, el de 
tipo individual y el que analiza toda la secuencia promotora en conjunto. El análisis 
individual de cada motivo sólo es relevante cuando el promotor cuenta con motivos 
importantes para la inducción del gen en ciertas condiciones o se cree que contiene un 
motivo aún no estudiado, mientras que el análisis en conjunto se enfoca más a 
caracterizar los promotores de ciertos organismos, componentes más comunes y 
patrones de localización que en conjunto se pretende que puedan predecir la actividad 
del promotor. 
Una vez que se obtiene la secuencia probable del promotor de interés, lo más común 
es la transformación de plantas o bacterias y la implementación de técnicas que 
permitan estimar el nivel de expresión de cierta señal, ya sea de forma cualitativa o 
cuantitativa y así determinar el tipo de actividad del promotor. Esto también nos indica si 
la secuencia obtenida corresponde al promotor y está completa, es decir si es funcional 
o no. 
Clasificación de los promotores 
Los promotores se clasifican de acuerdo a su actividad, la cual promueve la expresión 
de un gen en el organismo, en ciertos tejidos con determinada intensidad y en 
condiciones fisiológicas y ambientales determinadas. El estudio de las regiones 
promotoras se centra en el entendimiento global de la regulación de la expresión de un 
gen, secuencias aisladas de promotores y los elementos que contribuyen son críticos 
para la regulación de transgenes, incluyendo genes codificantes y no codificantes, estos 
últimos para la regulación por medio del silenciamiento con miRNA interferentes. 
Para fines de aplicación biotecnológica, los promotores se pueden clasificar de la 
siguiente forma (Hernandez-Garcia y Finer, 2014): 
a) promotores constitutivos: activos en la mayoría de los tejidos y etapas de desarrollo 
b) promotores espacio-temporales: contienen actividad tejido específica o actividad en 
alguna etapa 
c) promotores inducibles: regulados por alguna señal externa química o física 
24 
Promotores constitutivos 
Los genes bajo el control de promotores constitutivos son aquellos que se expresan en 
la mayoría de las células durante el desarrollo del organismo y mantienen niveles de 
expresión constantes en los tejidos todo el tiempo; sin embargo, sólo muy pocos 
promotores son constitutivos en un sentido estricto, muchos de los promotores 
clasificados como constitutivos muestran una bajan expresión en muchos tejidos y 
elevada en otros tejido de crecimiento rápido como el meristemático o vascular en 
plantas. 
Transgénesis vegetal: Promotor del virus de mosaico de Coliflor 
(CaMV355) o promotor 355 
En transgénesis vegetal se ha empleado extensivamente este promotor ya que se 
expresa en todos los tejidos y durante las etapas de desarrollo en muchas plantas, 
debido a que se conocen los elementos que conforman este promotor es posible 
modificarlo para modular su actividad. Los estudios sobre este promotor iniciaron hace 
más de tres décadas y continúan hasta la fecha debido a sus aplicaciones en 
transgénesis vegetal. 
Odell y colaboradores (1985) analizaron los efectos de deleciones en la región 5 'del 
promotor del virus de mosaico de coliflor (CaMV35S) en callo y diferentes partes de la 
planta de tabaco; para denotar el efecto de las deleciones se analizaron los transcritos 
de RNA producidos, este ensayo demostró que una deleción en la región ·46 que 
contiene la Caja TATA produce una baja proporción de transcritos correctamente 
iniciados, que como se mencionó antes es uno de los motivos más importantes del 
núcleo del promotor. La importancia de este estudio radica en exponer la necesidad de 
identificar las regiones del promotor que son esenciales para que una región promotora 
tenga actividad constitutiva. 
Promotores espacio-temporales 
Los promotores espacio· temporales tienen actividad tejido específica o actividad en 
alguna etapa del desarrollo, a diferencia de los RNAi expresados en altos niveles y de 
forma constitutiva, la sobreexpresión de ciertos genes codificantes para proteínas es 
25 
innecesaria y hasta cierto punto dañina para las células del organismo. Por ejemplo, la 
expresión constitutiva de genes codificantes de proteínas relacionadas con tolerancia al 
estrés y respuesta de defensa puede llevar a fenotipos desfavorables e inesperados. 
Los promotores espacio-temporales proporcionan un control más preciso de los genes 
nativos y los transgenes además de restringir la expresión en ciertas células, tejidos y 
etapas de desarrollo. Un promotor espacio-temporal de un transgen puede presentar 
ligeras fugas en tejido o tiempo inesperado dependiendo del gen original del promotor, 
otras causas son la pérdida de elementos reguladores durante la clonación del 
promotor, cambios en la regulación mediada por cromatina y la influencia de secuencias 
activadoras localizadas en la proximidad del locus transgénico. Los promotores 
específicos de semilla aislados de genes con expresión disminuida o aumentada 
durante el desarrollo de la semilla son los más reportados (Hernandez-Garcia y Finer, 
2014). 
Promotores de expresión específica en polen de Solanum Iycopersicum: 
LA T52, LA T56 Y LA T59 
Los genes LA T52, LA T56 Y LA T59 de S. Iycopersicum, se identificaron a través del 
estudio del mRNA que se acumula en el polenmaduro tras la mitosis de la microspora 
(McCormick et al., 1987). LAT56 Y LAT59 codifican proteínas similares entre sí (54% de 
identidad de aminoácidos) que muestran similitud de secuencia con pectin liasas, 
LAT52 codifica una proteína que muestra 32% de identidad de aminoácidos con la 
proteína Zm13 específica de polen de maíz (Hanson et al., 1989) y es esencial para la 
hidratación y germinación normal del polen (Muschietti et al., 1994). 
El análisis de secuencia sobre los promotores de estos tres genes identificaron la 
existencia de elementos reguladores que son importantes para la expresión diferencial 
durante el desarrollo del polen (Twell et al., 1991). En los tres promotores se encuentra 
la secuencia motivo PB (TGTGGTT), que ésta repetida tres veces en LAT52 (Bate y 
Twell, 1998) y una sola vez en LAT56 y LAT59. Los promotores LAT52 y LAT56 
comparten una secuencia de 12 pb denominada Caja 52/56 que abarca el motivo PB y 
26 
esta relacionada con el motivo Caja 11 del promotor del gen (beS-3A preserte en 
chfcharo (Gilmartin y Chua, 1990). Un motivo c:l ferente es cOrfllartido ertre LAT56 y 
LAT59 denominado Caja 56/59, el cual se preserta en posi ciones relativas similares en 
ambos genes [FigLTa 8]. Estudios de deleción sobre el promotor en plantas 
transgéri cas y expresiÚll transitoria (Twell el al., 1990) demostraron Cfle sólo la regiún 
proximal al rx-omotor mfnimo «200 pb) son necesarias para dirigir la expresiún tejido-
especffica en polen y tipos celulares especfficos del esporofita dL.J<mte el desarrollo 
(Twell et al. , 1991 ). 
11. 
b. 
PBron mollr 
PBII[ _ -H~ C"'!"TiG TGTGGTT AATCACC 
I 1I1 1 11 J 1 11 
PBIl _ -1 12 TGTTTT TGTGGTT GTAA AAA 
11 I 
-191 
11 1111 1 1 1 
PHI - -1 02 AT"'TT'" TGTGGTT AT .... T .... TG 
1 1 11 11 
... - .... T ... TG 
11 1I 111 1 1 11 
rb<;S-JA Do"'J - 156 ATCTTG TGTGGT T 
LATI2 _ -1 02 
LAT56 _ -112 
LAT56 _ -109 
LAT59_ -120 
AT"'TT A 
I I 
AATATG 
AAGCAA 
I I 
TGGAAT 
TGTGGTT"',"'TA 
1 1111 1I 1111 1 
TGTGGTTAT"'TA 
TG -83 
AA -153 
561598ot; 
GAAT'M'GTG'" 
111 111111 
GAAATTGTG A 
CAC"'CCA 
11 
TGG"'CAT 
Figl..-a 8. IVId.N"OS conservadosen los 
promoIOres de los genes LAT. (a) 
5inUud 00 .sectJeocD que rodea el 
rnctivo PB en el promoIOr de LA T52 Y la 
Caja 111 del promct.or rbcS-3A. (~ Caja 
52/56 y Caja 56/59. Extrafdode (Twell 
el al 1991 ) 
Estudios posteriores erfoca dos a analizar la identidad, orgarizaciún y fund ún de los 
elemertos reguadores que controlan la exrx-esiÚlltejido especffica del promotor LA T52 
demostraron Cfle los elementos reguadores mas importantes cOrfllrenden tres 
regiones independientes A, B y C, cada uno sLliciente para activar al rx-omotor mfnimo 
CaMV 35s de manera tejdo especffi ca en polen [Fi9Jra 9]. La reg ún C funciona como 
una uridad mfnima fundonal de expresiún en polen y su funcionalidad depende de la 
presenda del motivo AGAAA (en la subregiún C1) y/o motivo TCCACCAT A (en la 
subre!"jón C2), estos dos motivos en conjlJ1to con el motivo PB conforman una fuerte 
unidad activadora de la transcripdÓl1 en polen. Ana lisis de mLíadón c:lrigida 
demostraron que PBlGAAA y GAAAI TCCACCATA pueden formar urida des 
activadoras especificas de polen débiles, mientras que la cOrrDinaciún PBI 
27 
TCCACCATA es inactiva (Bate y Twell. 1998). Medi ante ensayos de pérdida y 
ganan cia de función se enconu6 que durante las etapas terl1lranas de desarrollo del 
polen las re giones A+B juntos prorrueven la acti vidad del promoto r y en etapas tardTas 
de desarrollo las ues regiones prorrueven la activid ad lo qu e su giere una regulaci 6n 
b i f~sic a (Bate y Twell. 1998). 
-T 
• 
• A 
.n. 
.. S-C • 
Fig ura 9. '-lapa luooonal de la 
reg ion pro rmw ra LAT52 Extr al' do 
de (Bae y T_eII1 99B) 
En N. labacum se idenlific6 el horrt> logo de LAT56 denorri nado 9 10. que de igual 
fOrrTe muestran sj rrili tud de secuencia con pectin liasas y est~ regul ado por un 
promotor de polen con expre sj6n en etapas tardias del desarrollo . Este promotor 
contiene l os motivos regul adores TGTGGTT ( PB core) y GTGA (parte de la Caja 
56/59 ) (Rogers el al .. 2001) . 
Promotores inducibles 
Las pl antas sobreviven en los ani:>iente s constantemente cani:> iantes al aju star su 
metabolismo para adaptarse dada su in capacidad de evadir condiciones ani:> ienta le s 
adversas. es por ello que las plantas somet ida s a estr és bi 6tico o abióti co errit en 
senal es que inducen una resp uesta ce lular al estrés. esta respuesta se divide en: 
recepción de sel'ial. transducci ón de la senal. activa ción de genes y alteraci 6n 
bioqu Trrica. El estrés es percibido en la meni:>ran a ce lular por receptores que generan 
segundos rrensajeros (calci o. inosito l fosfato) para asl modular lo s nweles de ca lcio 
inllacelular los cuales interacci onan con sensores de ca lc io que inician cascadas de 
fosfor il ación que culrrinan en la expresión de genes que pueden ser de dos tipos: los 
que codifican prote inas con funci6n enzim'itica o estructural y los que codifican 
proteinas reguladoras como facto res de lIansaipción ( Shinozaki y Yamagu chi-
Shinozaki , 1987: M ahaja n y Tutej a. 2005:). 
Los promotores inducibles son los responsables de la respuesta a estímulos 
ambientales y proveen una regulación precisa de la expresión de transgenes a través 
de estímulos externos. Este tipo de promotores se pueden clasificar como de respuesta 
a estímulos endógenos (hormonas), de respuesta a estímulos externos físicos (estrés 
biótico y abiótico) y de respuesta a estímulos químicos (Hernandez-Garcia y Finer, 
2014). 
Justificación 
Los genes no ligados al locus S implicados en la respuesta de autoincompatibilidad de 
tipo gametofítica en Solanaceae se expresan específicamente en los órganos 
reproductivos en etapas cercanas a la antesis, es decir que poseen expresión espacio-
temporal. NaSIPP codifica una proteína de expresión en polen presente sólo en 
especies Al de Nicotiana, la cual interacciona con la proteína NaStEP que es esencial 
para la respuesta de rechazo del polen, por lo que es un fuerte candidato para formar 
parte de los genes modificadores como HT-B, 120K Y NaStEP. El patrón de expresión 
específico que presentan estos genes es el resultado de mecanismos de regulación 
altamente específicos, que aún no se han estudiado a fondo, por lo que conocer la 
región promotora de NaSIPP (ya que el genoma de N. alata no se encuentra 
secuenciado) brindará información útil para esclarecer los mecanismos que regulan la 
expresión de los genes involucrados en la respuesta de autoincompatibilidad en 
Nicotiana. 
29 
Hipótesis 
La expresión específica espaciotemporal de NaSIPP se debe a que su región 
promotora contiene elementos reguladores como los encontrados en otros 
promotores de expresión en polen maduro 
Objetivos 
Objetivo General 
• Clonar la región promotora de NaSIPP y realizar el análisis bioinformático de 
la misma 
Objetivos Particulares 
• Clonar la región promotora NaSIPPde N. alata 
• Analizar la secuencia promotora e identificar posibles elementos reguladores 
de expresión específica. 
30 
Metodología 
Extracción de DNA genómico por el método de CTAB 
~ La extracción de DNA genómico se realizó por el método de CT AB (bromuro de 
hexadeciltrimetilamonio) amortiguador al 3% [Ver Anexo 1], este amortiguador 
funciona como detergente catiónico para solubilizar membranas y desplazar 
cationes unidos al DNA. 
Procedimiento 
1. Triturar 1 g de tejido (hoja) congelado y transferir a un tubo de 2 mL 
2. Adicionar 700 IJL de amortiguador CTAB con 1 % ¡3-mercapto etanol y mezclar con 
vortex. Preparar esta mezcla al momento 
3. Incubar a 65°C por 60 minutos, invertir el tubo cada 15 minutos 
4. En campana de extracción adicionar 400 IJL de cloroformo:alcohól isoamílico (Al) 
(24:1) y mezclar con vortex 
5. Centrifugar por 7 minutos 3500rpm 
6. Transferir la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo7. Adicionar 1 IJL de RNasa A (20 mg I mL). Incubar 30 minutos a 3rC 
8. En campana de extracción adicionar 400 IJL de cloroformo:AI (24:1) y mezclar con 
vortex 
9. Centrifugar por 7 minutos a 3500rpm 
10. Transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo 
11. Adicionar 500 IJL de isopropanol y 1 IJL de glucógeno para precipitar el DNA e 
incubar toda la noche a -20°C 
12. Centrifugar por 10 minutos a 11 OOOrpm 
13. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet con 500 IJL de agua grado PCR 
14. Adicionar 500 IJL de F enol-Cloroformo-Alcohol isoamílico (PCI) a la muestra de DNA 
y mezclar bien con vortex suave 
15. Centrifugar por 3 minutos a 8000rpm 
16. Transferir la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo de 1.5 mL 
31 
17.Adicionar 50 ~L de acetato de sodio 3M pH 5.5 frío y 1 mL de etanol 100% frío, 
Incubar 1 hora a -20°C 
18. Centrifugar por 10 minutos a 11 OOOxg 
19. Remover el sobrenadante y lavar con 400 ~L de etanol 70% 
20. Centrifugar por 5 minutos a 11 OOOxg 
21. Remover el etanol y secar al aire por 10 minutos 
22. Resuspender el DNA en 200 ~L de agua grado PCR 
23. Cuantificar el DNA utilizando NANODROP y almacenar a -20°C 
'Protocolo modificado de (Doyle y Doyle, 1990) 
Obtención de fragmentos de la secuencia río arriba de 
NaSIPP por el método de genome walking, mediante el kit 
Universal GenomeWalker 2.0 
~ El método de DNA walking permite encontrar secuencias desconocidas adyacentes 
a una región conocida del DNA genómico. Esto se logró mediante la construcción de 
"bibliotecas" que son fragmentos de DNA genómico ligados a adaptadores (no 
clonados), cada biblioteca se construyó con DNA completamente digerido con una 
enzima de restricción diferente que deja extremos romos, posteriormente cada 
conjunto se ligó por separado a un adaptador. Después de la construcción de las 
bibliotecas se realizó un PCR anidado (variante del PCR convencional que 
comprende dos rondas de amplificación con distintos aligas en cada una, con el fin 
de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la reacción), primero se montó 
una reacción con el aligo externo específico [Ver Tabla 2] del gen más el aligo 
externo que se une al adaptado [Ver Anexo 1] y después este producto se utilizó 
como molde de la segunda PCR la cual emplea el aligo interno específico del gen 
más el aligo interno del adaptador para obtener productos más específicos [Figura 
10]. 
32 
DNA Genómico 
:¡;:.. Digest ión 
:¡;:.. Ligación a adaptadores 
... Oral y EcoRV Pvu ll y Stul 
Fragmento de 
DNA genómico 
5· -
N -,... -
m -
-
-
... 
.,, _ 1 
GSPl "1 
.P2 ......... 1 
GSP2 .. 
>- Amplificación de la 
secuencia 
- GSP2 
- GSPl N 
--S' .•. 
PCR 
primario 
PCR secundario 
Adaptad 
Construcción de Bibliotecas 
1. Calidad de DNA genómico 
Figura 10. Diagrama simplificado 
del protocolo para walking de 
DNA. Donde GSP1 = oIigo externo 
especmco del gen, GSP2= aligo 
interno específico del gen, AP1 = 
aligo externo del adaptador, AP2= 
aligo Interno del adaptador. 
Modificado de (Laboratories 
Clontech.2014) 
Cargar el DNA genómico purificado de hoja en un gel de agarosa al 0.6%1 EtBrlTAE 
junto con un marcador de peso molecular de 1 kb (Thermo Scientific GeneRuler 1 kb 
Plus DNA Ladder) 
• Evaluar la pureza del DNA genómico mediante digestión con enzimas de estricción 
Dral, EcoRI, Pvu// y Stul. 
a) En un tubo de 0.5 mL combinar lo siguiente e incubar a 37'C toda la noche/ON 
(16-18h). 
5 ~L 
1.6 ~L 
2 ~L 
11.4~L 
20 ~L 
DNA genómico 
Enzima (10U/ ~L) 
Amortiguador de restricción 10X 
Agua desionizada 
Volumen total 
b) Correr una electroforesis con 5 ~L de cada reacción en un gel de agarosa al 
0.6%/ EtBrITAE. 
33 
2. Digestión de DNA genómico 
Para construir la biblioteca se deben montar cinco reacciones: cuatro correspondientes 
al DNA genómico de N. alata y una de DNA genómico humano como control positivo 
(incluido en el kit. Ver Anexo 1). 
a) Marcar cinco tubos de 1.5 mL como se muestra a continuación 
DL-l DNA genómico de N. alata digerido con Oral 
DL-2 
DL-3 
DL-4 
Control positivo 
DNA genómico de N. alata digerido con EcoRV 
DNA genómico de N. alata digerido con Pvul/ 
DNA genómico de N. alata digerido con 5tul 
DNA genómico humano digerido con Pvul/ 
b) En cada tubo por separado combinar lo siguiente 
25 I-IL DNA genómico (0.1 I-Ig/I-IL) 
81-1L 
lOI-lL 
571-1L 
lOOI-lL 
Enzima de restricción (10U/I-IL) 
Amortiguador de restricción 10X 
Agua desionizada 
Volumen total 
c) Mezclar suavemente por inversión e incubar 2 horas a 3rC 
d) Mezclar la reacción por vortex a baja velocidad por 10 segundos e incubar O/N a 
3rC 
e) Realizar una electroforesis con 5 I-IL de cada reacción en un gel de agarosa al 
0.6%1 EtBrlTAE para verificar que la digestión se completó 
3. Purificación de DNA genómico 
~ La purificación de las bibliotecas se realizó mediante el "kit Nucleo Spin Gel and 
PCR Clean-up" como se indica en el siguiente protocolo: 
a) Ajustar las condiciones de unión del DNA 
Mezclar los 95 I-IL restantes de cada reacción de digestión con 200 I-IL de 
Amortiguador NTl 
b) Unión de DNA 
34 
Colocar una columna "Nucleo Spin Gel and PCR Clean-up" en un tubo 
colector (2 mL) y cargar la muestra obtenida del paso anterior 
Centrifugar por 30 segundos a 11000xg, descartar el líquido y colocar la 
columna de nuevo en el tubo colector 
c) Lavar la membrana de sflice 
Adicionar 700 I-IL de Amortiguador NT3 a la columna. Centrifugar por 30 
segundos a 11000xg. Descartar el líquido y colocar la columna de nuevo en el 
tubo colector 
d) Secar la membrana de sílice 
Centrifugar por 1 minuto a 11000xg para remover completamente el 
Amortiguador NT3. Asegurarse de que la columna no entre en contacto con el 
líquido al quitarla del tubo colector 
e) Eluir el DNA 
Colocar la columna en un tubo nuevo de 1.5 mL y adicionar 20 I-IL de 
Amortiguador NE (precalentado a 70°C), incubar a temperatura ambiente por 1 
minuto. Centrifugar durantel minuto a 11 OOOxg. 
f) Estimar el rendimiento de DNA 
De cada tubo de reacción tomar 1 I-IL Y correr en un gel de agarosa 6%/EtBrlT AE 
4. Ligación de DNA genómico a adaptadores GenomeWalker 
~ Las bibliotecas y el control positivo se ligaron a los adaptadores proporcionados en 
el kit [Ver Anexo 1] según el siguiente protocolo: 
a) De cada tubo (DL-l, DL-2, DL-3, DL-4 Y control positivo). transferir 4.8 I-IL de 
DNA digerido y purificado a tubos nuevos de 0.5 mL, a cada uno adicionar: 
1.9 I-IL Adaptador GenomeWalker (25I-1M) 
0.81-1L Amortiguador de ligación 10X 
0.5 I-IL T 4 DNA ligasa (6U/I-IL) 
b) Incubar a 16°C en termociclador O/N 
c) Incubar a 70°C por 5 minutos para detener la reacción 
d) A cada tubo adicionar 32 I-IL de TE 10/1 pH 7.5 [Ver Anexo 1] para un volumen 
final de 40 I-IL 
e) Mezclar por vortex a baja velocidad de 10-15 segundos 
35 
DNA walking 
~ Se diseñaron dos pares de aligas según las recomendaciones del protocolo; cada 
par se diseñó específicamente para cada uno de los dos walking de DNA realizados 
como se muestra en la Tabla 2. Las especificaciones para cada PCR realizado se 
encuentran en los Cuadros 1, 2 Y 3 
1. Diseño de aligas para PCR anidado 
Tabla 2 Oligos diseñados para DNA walking 
% 
Procedimeinto Oligo Secuencia Longitud TM 
GC 
GSPl TGCTCCTTGAGCAGAACACCAAAACC 26 61 50 
DNA walking 1 
GSP2 GACCACAGCTCATAACACCTCCAAAAG 27 59 48 
GSP3 CACTCAACATGTAACCCTCCATAAAAGCTG 30 59 43 
DNA walking 2 
GSP4 CTGAATGCGCACTATCGCATGGGCTACT 28 64 53 
2. PCR primario 
a) Marcar ocho tubos para PCR de 0.5 mL para emplearlos como se muestra en el 
siguiente plan [Tabla 3]. 
Tabla 3 Plan de etiquetado de tubos para el PCR primario 
Tubo DNAmolde 
lA DL-l (Dra~ 
2A DL-2 ( EcoRV) 
3A DL-3 (Pvum 
4A DL-4 (Stu~ 
5A -
6A 
Control positivo para la construcción de 
bibliotecas' 
7A -
8A Control positivo de PCR" 
, -DNA Genomlco humano dlgendo con Pvull 
" Biblioteca control de DNA humano 
Oligo 
OligoReverse 
DNAwalking DNAwalking 
Forward 
1 2 
APl GSPl GSP3 
APl GSPl GSP3 
APl GSPl GSP3 
APl GSPl GSP3 
APl GSPl GSP3 
APl PCPl PCPl 
APl PCPl PCPl 
APl PCPl PCPl 
b) Preparar PCR mix para las ocho reacciones más un tubo adicional. Mezclar por 
vortex y centrifugar brevemente 
36 
9 reacciones 
175.5 iJL 
22.5 iJL 
4.5 iJL 
4.5 iJL 
4.5 iJL 
211.5iJL 
H20 desionizada 
1 OX Advantage 2 PCR amortiguador 
dNTP (10 mM) 
AP1 (10 iJM) 
Advantage 2 polymerase mix (50X) 
Volumen total 
c) Adicionar 23.5 iJL del PCR mix a cada tubo marcado 
d) Para cada reacción 1 A a 5A adicionar 0.5 iJL de GSP a cada tubo. Para las 
reacciones 6A a 8A adicionar 0.5 iJL de PCPl 
e) Adicionar 1 iJL de cada biblioteca al tubo correspondiente 
f) Adicionar agua los tubos 5A y 7 A 
g) centrifugar brevemente los tubos 
h) Realizar el ciclo termal de PCR como se indica: 
Cuadro 1. Condiciones de ciclo termal de PCR primario para cada DNA walking 
DNA walking 1 DNA walking 2 
• 7 ciclos: • 7 ciclos: 
94'C 25s 94'C 25s 
72'C 3min 72'C 3min 
• 32 ciclos: • 37 ciclos: 
94'C 25s 94'C 25s 
67'C 3min 67'C 3min 
• 1 ciclo: • 1 ciclo: 
67'C 7min 67'C 7min 
i) Analizar 5 iJL de cada producto de PCR primario en una electroforesis con gel 
de agarosa 1.5%/EtBr 
3. PCR secundario 
a) Marcar ocho tubos para PCR de 0.5 mL para emplearlos como se muestra en el 
siguiente plan [Tabla 4]: 
37 
Tabla 4 Plan de etiquetado de tubos para el PCR secundario 
DNAmolde Oligo 
Oligo Reverse 
Tubo DNAwalking DNAwalking 
(tomado del PCR primario) Forward 
1 2 
lB lA AP2 GSP2 GSP4 
2B 2A AP2 GSP2 GSP4 
3B 3A AP2 GSP2 GSP4 
4B 4A AP2 GSP2 GSP4 
5B 5A AP2 GSP2 GSP4 
6B 6A' AP2 PCP2 PCP2 
7B 7A AP2 PCP2 PCP2 
8B 8A** AP2 PCP2 PCP2 
, 
DNA Genómlco humano dlgendo con Pvull 
" Biblioteca control deDNA humano 
b) Empleando un tubo nuevo para cada muestra, diluir cada PCR primario en agua 
desionizada [Cuadro 2], para un volumen final de 50 I-IL. 
Cuadro 2. Diluciones empleadas para cada DNA walking 
DNA walking 1 
Dilución 1 :50 
DNA walking 2 
Dilución 2:50 
c) Preparar PCR mix para las ocho reacciones más un tubo adicional. Mezclar por 
vortex y centrifugar brevemente 
9 reacciones 
175.5 I-IL 
22.51-1 L 
4.51-1L 
4.51-1L 
4.51-1L 
211.51-1L 
H20 desionizada 
1 OX Advantage 2 PCR amortiguador 
dNTP (10 mM) 
AP2 (10 I-IM) 
Advantage 2 polymerase mix (50X) 
Volumen total 
d) Adicionar 23.5 I-IL del PCR mix a cada tubo marcado 
e) Para cada reacción 1 B a 5B adicionar 0.5 I-IL de GSP a cada tubo. Para las 
reacciones 6B a 8B adicionar 0.5 I-IL de PCP2 
f) Adicionar 1 I-IL de cada PCR primario diluido al tubo correspondiente 
g) Centrifugar brevemente los tubos 
38 
h) Realizar el ciclo termal de PCR como se indica: 
Cuadro 3. Condiciones de ciclo termal de PCR secundario para cada DNA walking realizado 
DNA walking 1 DNA walking 2 
• 5 ciclos: • 5 ciclos: 
94'C 25s 94'C 25s 
72'C 3min 72'C 3min 
• 20 ciclos: • 25 ciclos: 
94'C 25s 94'C 25s 
67'C 3min 67'C 3min 
• 1 ciclo: • 1 ciclo: 
67'C 7min 67'C 7min 
i) Analizar 5 IJL de cada producto de PCR secundario en una electroforesis con 
gel de agarosa 1.5%/EtBr 
Clonación de las secuencias obtenidas por el método de 
DNAwalking 
Purificación del amplicón 
~ En cada walking de DNA se seleccionó una biblioteca que contuviera una banda de 
alto peso molecular, definida y abundante [Cuadro 4]. Ver sección de Resultados. 
Cuadro 4. Biblioteca y banda seleccionada en cada Walking de DNA 
DNA walking 1 DNA walking 2 
Bilioteca EcoRV 
Banda 2B -1000 pb 
Biblioteca Oral 
Banda lB -700 pb 
1. Extracción de banda seleccionada de gel de agarosa 
a) Cargar los 20 IJL restantes de la biblioteca seleccionada en un gel de agarosa 
1 %/EtBr y correr electroforesis 
b) Extraer del gel la banda seleccionada y colocar en un tubo de 1.5 mL 
previamente pesado 
2. Purificar la banda según el siguiente protocolo incluido en el kit NucleoSpin Gel 
and PCR Clean-up [Ver Anexo 1]. 
39 
Extracción de ONA de geles de agarosa 
a. Solubilizar el fragmento de gel 
Por cada 100 mg de gel de agarosa adicionar 200 IJL de Amortiguador 
NT1. Incubar la muestra 5 minutos a 50°C, mezclar por vortex brevemente 
cada 2 min hasta que el gel esté completamente disuelto 
b. Unir DNA 
Colocar una columna NucleoSpin en un tubo colector y adicionar hasta 
700 IJL de muestra. Centrifugar 30s a 11000xg, descartar el flujo y colocar 
la columna en el tubo colector 
c. Lavar la membrana de silica 
Adicionar 700 IJL de Amortiguador NT3 a la columna. Centrifugar por 30s 
a 11000xg, descartar el flujo y colocar la columna en el tubo colector 
d. Secar la membrana de silica 
Centrifugar por 1 min a 11000xg para remover el Amortiguador NT3 
completamente 
e. Eluir el DNA 
Colocar la columna en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL. Adicionar 15 
IJL de Amortiguador NE e incubar a temperatura ambiente por lmin. 
Centrifugar 1 min a 11 OOOxg. 
3. Cuantificación por NANODROP 
Ligación a plásmido pGEM- T Easy. Promega 
~ Para cada producto purificado (2B y 1 B) se realizó una ligación al plásmido pGEM-T 
Easy [Ver Anexo 1] según el siguiente protocolo de ligación, las especificaciones 
para cada ligación se muestran en el Cuadro 5. 
1. Centrifugar brevemente el tubo del plásmido 
2. Realizar la reacción de ligación 
40 
Cuadro 5. Reacciones de ligación a plásmido para cada inserto 
Ligación 1 (Inserto 2B) Ligación 2 (Inserto 1 B) 
Plásmido pGEM-T Easy 0.5 ~L Plásmido pGEM-T Easy 0.5 ~L 
DNA Ligasa T4 1 ~L DNA Ligasa T4 1 ~L 
2X Rapid Ligation 6 ~L 2X Rapid Ligation 6 ~L 
Amortiguador Amortiguador 
Inserto 2B 25ng Inserto 1 B 17.5ng 
H,O cbp12 H,O cbp12 
ligación 3:1 (mserto: plásmldo), el cálculo se realizó con la herramienta onlme blomath 
(http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.ht mL ?calc=ratio) 
3. Incubar O/N a 4°C 
Transformación de células quimiocompetentes de Escherichia coli 
Top 10 
Para cada plásmido (2B y 1 B) transformar una alícuota de células competentes como 
se indica a continuación 
1. Colocar la alícuota de células en hielo 
2. Adicionar 100ng de plásmido 
3. Incubar 30min en hielo 
4. Tratar con shock térmico a 42°C por 2min 
5. Incubar en hielo 1 min 
6. Adicionar 4 volúmenes de medio SOC (400 I-IL) 
7. Incubar en agitación a 3rC por 2h 
8. Centrifugar y descartar el sobrenadante 
9. Resuspender en 100 I-IL de medio LB 
10. Inocular Caja Petri con medio sólido LB/Ampicilina/X-gaIIlPTG como se 
especifica en el protocolo del plásmido pG EM-T Easy [Ver Anexo 1] 
11.lncubar a 3rC O/N 
41 
Selección de colonias transformantes recombinantes 
~ Se seleccionaron colonias de cada transformación (plásmido 2B y plásmido 1 B) Y 
se evaluó que contuvieran el inserto de DNA por medio de ensayos de digestión, 
como se indica: 
1. En condiciones de esterilidad, con un palillo estéril tomar una colonia blanca 
(descartar cualquier colonia azul). Almacenar a 4°C hasta confirmar que los 
resultados son correctos 
2. Inocular por picadura una placa de agar LB/Ampicilina/X-galllPTG 
3. Con la misma muestra inocular 5 mL de medio LB más Ampicilina (1001-19/ mL) 
en tubo 
4. Incubar la placa a 3rc O/N y almacenar a 4°C hasta confirmar que los 
resultados son correctos 
5. Incubar los tubos a 3rc O/N con agitación, posteriormente en esterilidad tomar 
una alícuota de 500 I-IL, centrifugar y resuspender el pellet en 1 mL de medio LB 
más glicerol 15%, congelar y almacenar a -70°C 
6. Purificar plásmido según el siguiente protocolo incluido en el kit Hybrid -Q 
Plasmid Rapidprep GeneAl1. [Ver Anexo 1] 
Protocolo rápido 
a. Centrifugar a 13000xg por 1 min alícuotas del cultivo líquido un tubo de 1.5 
mL para microcentrífuga hasta obtener el pellet de 3 mL de cultivo 
descartando el sobrenadante cada vez 
b. Resuspender el pellet de bacterias en 170 I-IL de Amortiguador SI 
c. Adicionar 170 I-IL del Amortiguador S2 y mezclar invirtiendo el tubo de 3 a 
4 veces 
d. Adicionar