Clonacion-y-caracterizacion-del-gen-fur-de-actinobacillus-suis

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
IZTACALA 
 
CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN fur DE Actinobacillus suis. 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
B I Ó L O G O 
 
P R E S E N T A : 
 
G. YMURI RIVERA RAMOS. 
DIRECTOR DE TESIS: DR. ERASMO NEGRETE ABASCAL 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Genética de la Facultad de 
Estudios Superiores Iztacala de la Universidad Nacional Autónoma de México. 
Contando con el apoyo del programa PAPIIT Proyecto IN203707 y PAPCA FESI-
UNAM 2009. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INDICE. 
 
RESUMEN _________________________________________________________1 
INTRODUCCIÓN ____________________________________________________2 
Familia Pasteurellaceae _______________________________________________2 
Género Actinobacillus ________________________________________________2 
Actinobacillus suis ___________________________________________________3 
FACTORES DE VIRULENCIA __________________________________________5 
Colonización _______________________________________________________6 
Cápsula (CPS) ______________________________________________________6 
Lipopolisacáridos (LPS) _______________________________________________7 
Toxinas ____________________________________________________________8 
PROTEASAS ______________________________________________________ 9 
Clasificación de las Proteasas __________________________________________9 
Mecanismo de acción de las metaloproteasas ____________________________ 10 
IMPORTANCIA DEL HIERRO _________________________________________10 
PROTEÍNA FUR ___________________________________________________ 13 
ANTECEDENTES __________________________________________________16 
JUSTIFICACIÓN ___________________________________________________18 
HIPÓTESIS _______________________________________________________18 
OBJETIVO GENERAL _______________________________________________18 
OBJETIVOS PARTICULARES_________________________________________18 
MATERIAL Y MÉTODOS _____________________________________________19 
Crecimiento bacteriano ______________________________________________19 
Aislamiento del DNA cromosómico de A. suis y amplificación del probable gen fur ______19 
Clonación del producto de PCR y selección de las clonas transformantes _______19 
Análisis in silico ____________________________________________________20 
RESULTADOS _____________________________________________________21 
Aislamiento del ADN cromosómico de Actinobacillus suis ____________________21 
PCR _____________________________________________________________21 
Secuenciación _____________________________________________________23 
Alineamiento múltiple del gen fur de Actinobacillus suis _____________________24 
Alineamiento múltiple de la proteína Fur de Actinobacillus suis _______________25 
Clonación _________________________________________________________26 
DISCUSIÓN _______________________________________________________27 
CONCLUSIONES ___________________________________________________29 
BIBLIOGRAFÍA ____________________________________________________ 30 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
Actinobacillus suis es una bacteria Gram negativa perteneciente a la familia 
Pasteurellaceae considerada uno de los principales agentes patógenos del tracto 
respiratorio superior de animales bovinos y porcinos. Este microorganismo obtiene el 
hierro necesario para su crecimiento de las transferrinas y hemoglobina del 
hospedero. El hierro es esencial para el metabolismo crecimiento bacteriano, ya que 
actúa como cofactor de un gran número de enzimas. Fur (ferric uptake regulatos) es 
una proteína autorregulable que responde a la concentración de hierro en el medio 
y que actúa como represor transcripcional de promotores regulados por hierro, 
contiene un motivo de unión al ADN y 2 sitios de unión con el hierro. Los genes 
regulados por la proteína Fur constituyen el llamado regulón Fur, cuya mayor parte 
está implicada en la captación de hierro. En A. suis se ha demostrado la presencia 
de genes y proteínas involucradas en captación de hierro a través de transferrina 
porcina y hemoglobina. En el presente trabajo por medio de PCR se obtuvo un 
amplificado de 477 pb, utilizando ADN cromosómico de A. suis como templado y los 
oligonucleótidos previamente diseñados para el gen fur de Avibacterium 
paragallinarum. La secuencia de aminoácidos obtenida presentó un 90% de similitud 
con las secuencias reportadas para genes fur de A. pleuropneumoniae, A. 
pleuroneumoniae L20 y Av. paragallinarum. La secuencia traducida dio como 
resultado una proteína de 154 aminoácidos, con un peso molecular de 17850.3 
Daltones y un PI teórico de 5.33. Esta secuencia conserva los dominios de unión al 
DNA y de hierro típicos de las proteínas Fur descritas en diferentes 
microorganismos. A. suis contiene en su genoma un gen fur el cual puede participar 
en captación de hierro y regulación de la expresión de diferentes genes relacionados 
con virulencia. 
 
 
 
INTRODUCCIÓN. 
 
 
FAMILIA Pasteurellaceae: 
 
La clasificación de esta familia se llevaba a cabo en base a una serie de 
características fenotípicas determinadas, tal es el caso del requerimiento de 
Nicotidamina Adenín Dinucleótido (NAD ó factor V y hemina o factor X) como 
factores de crecimiento y por su capacidad de causar enfermedades a vertebrados, 
principalmente a mamíferos y aves (Maclnnes & Borr, 1990. Moller & Killan, 1990). 
La familia Pasteurellaceae estaba inicialmente compuesta por 4 géneros principales: 
Haemophilus, Actinobacillus, Pasteurella y Mannheimia, aunque recientemente se 
han incluido nuevos géneros como son: Lonepinella, Gallibacterium, 
Phocoenobacter, Avibacterium, Histophilus y Volucribacter, entre otros. Todos estos 
constituyen patógenos importantes en animales, ya que son capaces de colonizar 
diferentes tejidos, invadiendo principalmente las mucosas de los tractos respiratorios 
y genitales de varias especies, incluyendo el ser humano (Cristensen & Bisgard, 
2004). 
 
GÉNERO Actinobacillus: 
 
Los taxas reportados hasta la fecha para el género Actinobacillus constan de 22 
especies, de las cuales 19 de ellas se consideran como parte de la flora normal de 
algunos animales, sin embargo, pueden llegar a provocar enfermedades en bovinos, 
carneros, caballos, cerdos e incluso humanos (Kuhnert, et al. 2003; Slavic, et al. 
2000; Moller & Killan 1990). 
 
Tres especies de este género (Actinobacillus pleuroneumoniae, A. suis y A. equuli) 
se encuentran frecuentemente asociadas con serias enfermedades del cerdo (las 2 
primeras) y del caballo (la tercera), siendo Actinobacillus pleuroneumoniae el único 
considerado como patógeno primario (Bossé, et al. 2002). 
Actinobacillus suis. 
 
Es una bacteria Gramnegativa (Fig. 1.) caracterizada por primera vez por Van 
Dorssen & Jaartsveld (1962), y originalmente fue considerada un comensal del tracto 
respiratorio de animales (Kim & Phillips. 1976). 
 
 
Fig. 1. Esquema en elque se muestra la constitución de las membranas de una bacteria Gram-
negativa (www.genomasur.com/lecturas/Guia01.htm). 
 
La infección que provoca A. suis, al igual que otras bacterias, se divide en 3 etapas 
básicas: Colonización, evasión de los mecanismos de limpieza del hospedero y daño 
a los tejidos. Aunque aún no se posee un esquema completo sobre la patología de 
infección por A. suis (Bossé, et al. 2002). 
 
A. suis es una bacteria patógena que se encuentra en el tracto respiratorio superior, 
genital y digestivo de diferentes animales (principalmente en los cerdos), también se 
ha aislado de animales domésticos como son los gatos y los perros (Jeannotte, et al. 
2002). Aunque este microorganismo es considerado como un organismo comensal, 
bajo condiciones aun no conocidas puede producir infección asociada con múltiples 
signos clínicos tales como: disnea, tos, debilidad, fiebre, abscesos, cianosis, 
hemorragias en los oídos, abdomen y piel, además de la aparición de lesiones 
cutáneas parecidas a erisipelas. Las lesiones patológicas producidas por A. suis 
incluyen varios tipos de neumonía, pericarditis, miocarditis, endocarditis, artritis, 
fluídos en cavidades corporales, pequeños focos blanquecinos de necrosis hepática 
y linfodenopatías en cerdos lactantes y adultos. También puede ocasionar muerte 
repentina (Maclnnes & Desrosiers, 1998; Slavic, et al. 2000). 
 
 
Fig. 2. Fotografía en microscopio de Actinobacillus suis 
(www.affrc.go.jp/AVEM/english/em_en/bacteria/actinobac/actinoba2.jpg). 
 
Si la velocidad de reproducción bacteriana excede la velocidad de eliminación por 
parte de los mecanismos defensivos de los animales hospederos, una importante 
población de bacterias se acumulará gradualmente dentro del hospedero y en un 
determinado momento provocará una enfermedad (Bossé, et al. 2002). En animales 
sanos la eliminación ocurre principalmente gracias a los macrófagos (alveolares, 
intestinales e intravasculares), siendo predominantes los que se encuentran en el 
tracto respiratorio (Bertram, 1985. Sibille & Revnolds, 1990). 
 
Los macrófagos alveolares están estratégicamente ubicados en los espacios 
superficiales aéreos entre los alvéolos, y son estas las primeras células que se 
encuentran como mecanismo de defensa. Los macrófagos intravasculares del 
pulmón se adhieren a las células endoteliales de los vasos sanguíneos y son 
rápidamente transportados a las áreas inflamadas y/o necrosadas en el pulmón del 
cerdo infectado. Los macrófagos Intravasculares se especializan en la función 
citolítica, mientras que los alveolares se encargan de las funciones fagocíticas 
(Bertram. 1985. Pabst. 1996). 
 
Una respuesta inflamatoria surge con la finalidad de aislar y destruir agentes dañinos 
o reparar los tejidos u órganos dañados es iniciada cuando el organismo combate 
agentes patógenos y sus factores de virulencia durante una infección. Esto ocurre 
principalmente en tejidos vascularizados (en este caso el pulmón, por A. suis). La 
inflamación comienza cuando los macrófagos del hospedero inician una cascada de 
eventos en donde se reclutan a todos los leucocitos de la circulación de alrededor 
del endotelio y la membrana basal del tejido infectado (Kvietys & Sandig. 2001. 
Opdenakker, et al. 1998). Una vez en el tejido, los leucocitos interactúan con la 
bacteria, los factores de virulencia y los mediadores inflamatorios, los cuales son 
activados (Star, et al. 2004) como una medida para controlar dicha colonización. Si 
esto mecanismos son superados, se produce una enfermedad. 
 
FACTORES DE VIRULENCIA DE A. suis. 
 
Después de que las bacterias patógenas se han adherido a las células del 
hospedero, la capacidad de infectar dependerá de la habilidad que tengan para 
adquirir los nutrientes esenciales para su desarrollo. En el tracto respiratorio, la 
variedad y cantidad de carbohidratos y otros nutrientes se encuentra restringida para 
los patógenos (Macfadyen, et al. 1996). Los mecanismos encargados de vencer 
estas limitaciones nutricionales están considerados como los mecanismos de 
patogenicidad o factores de virulencia causantes de las enfermedades (Bossé, et 
al. 2002). 
 
Al igual que otros miembros de la familia Pasteurellaceae, A. suis presenta 
diferentes factores de virulencia como son: cápsula (CPS), los lipopolisacáridos 
(LPS) y diversas proteínas que secretan al medio extracelular como Toxinas RTX 
(repeats in toxins), hemolisinas y una metaloproteasa (Maclness & Desrosier., 1999. 
Negrete Abascal, et al. 2004). 
 
COLONIZACIÓN: 
Es la habilidad que tiene un patógeno para adherirse a células o tejidos del 
hospedero y de poder multiplicarse dentro de éste. La mayoría de las veces, la 
adhesión es un requisito necesario para que pueda producirse una enfermedad. Un 
estudio in vivo de A. pleuroneumoniae reveló que este tipo de bacterias no se une al 
epitelio traqueal o de los bronquios, sino que posee una íntima adherencia a los 
cilios de los bronquios y a las células epiteliales de los alvéolos (Dom. et al. 1994). 
En el momento en que el patógeno permanece en el tracto respiratorio, se vuelve 
una colonización estable, siendo un preludio a la infección pulmonar, sin embargo, 
también depende de la naturaleza del microorganismo que infecte al animal, ya sean 
en forma de partículas en aerosol o secreciones mucosas (Kaltrieder. et al. 1976). 
Aunque A. pleuroneumoniae y A. suis poseen muchas similitudes tanto estructurales 
como de factores de virulencia y padecimientos, recientes estudios sugieren que las 
diferencias entre las proteínas OmpA (Outer membrane protein A) de estas bacterias 
generan diferencias en su forma de interactuar con sus hospederos. La proteína 
OmpA provee a A. suis de mayor resistencia ante antibióticos y agentes 
antimicrobiales (Ojha, et al. 2010). A diferencia de A. pleuroneumoniae, la cepa A. 
suis es resistente al líquido biliar y al suero del hospedero (Maclnnes & Desrosiers, 
1999). 
 
CÁPSULA (CPS): 
En bacterias Gram-negativas la cápsula está compuesta de polisacáridos 
polianúricos altamente hidratados. La cápsula tiene un papel importante al delimitar 
el acceso de ciertas moléculas a la membrana celular, participa en la adherencia a 
superficies e incrementa la tolerancia a la desecación (Boyce & Adler. 2000). La 
cápsula es considerada como uno de los más importantes factores de virulencia que 
poseen los agentes patógenos, protegiéndolos incluso contra los anticuerpos y 
fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares (Inzana, et al. 1988). 
 
En el caso de A. suis, la cápsula es la responsable de provocar una respuesta 
inflamatoria en los pulmones. El antígeno K es el mediador contra el efecto 
bactericida del suero y de esta forma inhibir la fagocitosis, ya que es un componente 
capsular, dándole mayor capacidad de resistencia a A. suis. Gracias a la presencia 
de la cápsula, A. suis puede llegar a sobrevivir poco más de 90 minutos dentro de 
los macrófagos; durante este tiempo libera toxinas RTX que provocan la lisis de 
estos fagocitos (Crijsen, et al. 1992). 
 
Los polisacáridos capsulares y los lipopolisacáridos (LPS) son los factores que 
contribuyen mayormente a una resistencia contra el efecto bactericida del suero. En 
un estudio sobre la importancia de la cápsula como factor de virulencia realizado en 
cerdos con una mutante acapsulada del serotipo 5A de A. pleuroneumoniae. La 
mutante no capsulada fue susceptible al efecto bactericida del suero in vitro, a 
diferencia de un serotipo capsulado (Ward, et al. 1998). 
 
LIPOPOLISACÁRIDOS (LPS): 
Son polímeros complejos compuestos por ácidos grasos que componen la mayor 
parte de la membrana externa en bacterias Gram negativas. Son los encargados de 
inducir la respuesta inmunológica, infiltración masiva de neutrófilos y una activación 
de mediadores biológicos por parte del organismo afectado. Este proceso es quizá el 
responsable decausar daño en el epitelio pulmonar y en las células endoteliales al 
fomentar una mayor permeabilidad en las paredes del tejido (Slavic, et al. 2000, 
Idris, et al., 1993). 
 
En experimentos con preparaciones crudas de LPS se observó que existen 
diferencias notables en los antígenos somáticos O (cadenas O) de A. suis; al 
estudiar una gran cantidad de aislados de esta bacteria (151), se describieron 2 tipos 
diferentes de antígenos O, sugiriendo que las bacterias que portan el serotipo O2 se 
encuentran relacionadas con infecciones severas, a diferencia de las que poseen el 
serotipo O1 (Slavic, et al. 2000). 
 
Los LPS juegan un papel importante en la adherencia A. pleuropneumoniae a la 
tráquea porcina, esto se sugirió por observaciones en aislamientos de bacterias que 
se encontraban adheridas en gran número a la tráquea del hospedero (Paradis, et 
al. 1994), además de que se han encontrado glicoesfingolípidos en las células 
epiteliales respiratorias como posibles receptores de LPS de A. pleuroneumoniae 
(Abul-Milh, et al. 1999). 
 
TOXINAS: 
Las bacterias patógenas producen muchas sustancias tóxicas, estas proteínas 
(principalmente enzimas) son directa o indirectamente tóxicas para las células del 
hospedero, llegando incluso a matarlas. Sin embargo requieren mecanismos de 
regulación especializada y factores de adhesión para potenciar su expresión, 
liberación y efectos dentro del hospedero (Finlay & Falkow. 1997). 
 
Las toxinas RTX (repeats in toxins) pertenecen a una familia homogénea de 
proteínas formadoras de poros que se encuentran presentes en diferentes bacterias 
Gram-negativas. Estas toxinas están ampliamente distribuidas en especies 
altamente patógenas, especialmente en la familia Pasteurellaceae, siendo 
determinantes dentro de los factores de virulencia en la patogénesis de diversos 
animales incluyendo al humano (Frey & Kuhnert. 2002). 
 
La mayoría de las consecuencias patológicas de la pleuroneumonía en cerdos se 
atribuye a las toxinas Apx, las cuales tiene efectos citotóxicos en varios tipos 
celulares, afectando directamente el tejido e indirectamente cuando estimulan la 
reacción inflamatoria por activación fagocítica (Frey. 1995). 
 
A. Suis produce 2 toxinas Apx, las cuales son fuertemente hemolíticas y citotóxicas; 
estas se encuentran muy relacionadas con las toxinas Apx I y Apx II de A. 
pleuroneumoniae, además de Apx IV, la cual está presente en todos los serotipos. 
Sin embargo, aunque presentan una secuencia de aminoácidos idéntica, los genes 
que codifican (ApxICABD var. suis y ApxIICABD var. suis) presentan diferencias. Las 
toxinas Apx de A. suis provocan lisis de diferentes células inmunes y no inmunes, 
causando diferentes niveles de daño en el tracto respiratorio del hospedero 
(Maclness & Desrrosiers. 1998. Ostaainjen, et al. 1997. Kamp, et al. 1994). 
 
El principal factor de virulencia que participa en la resistencia a la fagocitosis por los 
macrófagos y los polimorfonucleares son las toxinas RTX (ApxI, ApxII y ApxIII) las 
cuáles son producidas en varias combinaciones por los distintos serotipos de A. 
pleuroneumoniae (Frey, et al. 1993). 
 
PROTEASAS. 
 
Las proteasas son necesarias fisiológicamente para los seres vivos. Algunas 
bacterias patógenas secretan proteasas, las cuales son enzimas que degradan 
parcial o totalmente las proteínas que estructuran los tejidos del hospedero y de esta 
manera facilitan su invasión (González Pedrajo & Dreyfus. 2003) estas proteasas 
causan hidrólisis de grandes péptidos en fragmentos pequeños para facilitar su 
absorción (Rao, et al. 1998). 
 
CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEASAS. 
Según el Comité Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, las proteasas se 
clasifican en 4 subgrupos de 3 grupos (hidrolasas). Son clasificadas en base a 3 
criterios. 1) Tipo de reacción catalítica, 2) Naturaleza química del sitio catalítico, y 3) 
Reacción evolutiva estructural (Rao, et al. 1998). 
 
Según el aminoácido en su sitio activo, las proteasas so catalogadas en 4 grupos. 
Aspartato-proteasas: Dependen de un Ac. aspártico para su actividad catalítica. 
Cisteín-proteasas: Dependen de un intermediario covalente que consiste en 
cisteína o histidina. Serín-proteasas: Se caracterizan por la presencia de un grupo 
serina dentro de su sitio activo. Metalo-proteasas: Son las más diversas por sus 
tipos catalíticos, se caracterizan por requerir de un ión metálico divalente para su 
actividad, siendo este un átomo de zinc catalíticamente activo que puede ser 
remplazado en algunos casos por otro metal como el cobalto o el níquel sin que 
pierda su actividad (Rao, et al. 1998). 
 
Diferentes miembros de la familia Pasteurellaceae como: P. multocida, M. 
(Pasteurella) haemolytica. Av. paragallinarum y más específicamente miembros del 
género Actinobacillus como A. pleuroneumoniae y A. suis, secretan metaloproteasas 
al medio extracelular (Negrete Abascal, et al. 2004. García, et al. 2004. Rivero. 
2005). Jiménez González (2005) generó un banco genómico en E. coli DH5a a partir 
del DNA genómico de A. suis. De este banco genómico identificó y caracterizó una 
clona que expresaba actividad proteolítica similar a la expresada por la cepa 
silvestre. 
 
Mecanismo de acción de las Metalo-Proteasas. 
Son las más diversas de todos los tipos de proteasas, se caracterizan por el 
requerimiento de un ión metal divalente para su actividad. Estas incluyen enzimas de 
una gran variedad de orígenes como: toxinas hemorrágicas de veneno de 
serpientes, termolisinas de las bacterias y colagenasas de algunos organismos entre 
otras más. Las metaloproteasas son una de 3 clases de proteínas más antiguas y 
pueden estar presentes en bacterias, hongos y otros organismos. Estas proteasas 
difieren ampliamente en sus secuencias y estructura, pero la gran mayoría contiene 
un átomo de zinc catalíticamente activo, y en algunos casos puede ser reemplazado 
por otro metal como el cobalto o el níquel sin la pérdida de su actividad. El 
mecanismo catalítico conduce a la formación de un intermediario tetraédrico no 
covalente después de que es llevado a cabo un ataque por una molécula de agua la 
cual se une al zinc sobre el grupo carbonilo del enlace móvil. Posteriormente este 
intermediario tetraédrico es descompuesto por transferencia de un protón del ácido 
glutámico al grupo saliente. Estas enzimas dependen de la presencia de un catión 
divalente y pueden ser inactivadas por diálisis o por la adición de un quelante (Rao, 
et al. 1998). 
 
IMPORTANCIA DE LA ADQUISICIÓN DE HIERRO. 
 
El hierro es el más importante micronutriente usado por todos los organismos. Este 
metal es esencial para el metabolismo celular; actúa como cofactor de un gran 
número de enzimas tales como las catalasas, peroxidasas, oxidasas y citocromos 
que participan en la síntesis de pirimidinas y aminoácidos (Wackett, et al. 1989). 
 
Las bacterias necesitan una concentración de hierro entre 10-6 y 10-8 M para su 
crecimiento. En condiciones anaeróbicas (pH fisiológico) el hierro se encuentra en su 
estado Fe+2 que es su forma más soluble, y por lo tanto es fácilmente aprovechado 
por las bacterias sin la necesidad de mecanismos especializados, lo obtienen sin 
dificultad a partir del medio externo. En condiciones de acidez (pH 3), la 
concentración de Fe+3 soluble es de 10-8 M, suficiente para cubrir las necesidades de 
la mayoría de las bacterias acidófilas. Los organismos superiores disponen de 
mecanismos constitutivos para mantener un bajo nivel de hierro extracelular, 
basados en proteínas que secuestran los iones de hierro, como son las transferrinas, 
hemoglobina, hemopexina, ferritina y albúmina. Existen 3 tipos de transferrinas: 
serotransferrina, que se encuentra en el plasma líquido y linfático; lactotransferrina, 
localizada en los fluidos seminales e intestinales (moco cervical, leche, etc.); 
ovotransferrinas, encontrada en la albúminade los huevos (Ratledge & Dover. 
2000). 
 
Un organismo patógeno que requiere hierro para su desarrollo debe ser capaz de 
adquirirlo de su hospedero a pesar de que éste se encuentre restringido en el 
ambiente. Mientras que muchos patógenos utilizan sideróforos (moléculas de bajo 
peso caracterizadas por su afinidad al ión férrico) para la adquisición de hierro (Fig. 
3.), los miembros de la familia Pasteurellaceae y Neisseriaceae pueden obtener el 
hierro directamente de las proteínas de su hospedero por mecanismos 
independientes regulados por receptores de transferrinas (Tfs) (Bahrami, et al. 2003. 
Ratledge & Dover. 2000. Byers & Arsenaux. 1998). La adquisición de hierro mediada 
por receptores Tfs (Fig. 4.), implica dos proteínas superficiales del receptor que unen 
las proteínas A y B (TbpA y TbpB respectivamente) (Gray-Owen & Schryvers. 
1996.). En el caso de los sideróforos, las bacterias Gram negativas captan los 
complejos Fe-sideróforo mediante receptores en la membrana externa (como FepA, 
FecA y FhuA). Las bacterias a menudo presentan múltiples receptores de 
especificidad para los sideróforos, e incluso pueden llegar a captar sideróforos 
producidos por otras bacterias (Andrews et al., 2003). 
 
 
 
 
Fig. 3. (A) Esquema de un sideróforo octaédrico hexadentado. (B) Sideróforo unido a un ión 
férrico (www.uni-marburg.de/fb15/ag-oberthuer/research). 
 
A. suis puede adquirir hierro a partir de la transferrina porcina, pero no de la 
transferrina de otras especies de animales como la del ser humano. La membrana 
de A. suis capta específicamente transferrinas porcinas; puede crecer bajo 
condiciones restringidas de hierro, y se ha sugerido que esto ocurre por medio de 
sideróforos y receptores reprimibles por hierro análogos a los Tbp´s: TbpA y TbpB 
(ej. los llamados lbp´s), de otros miembros de la familia Pasteurellaceae (Bahrami, et 
al. 2003. Gray-Owen & Schryvers. 1996. Schryvers & González. 1990). 
 
 
Fig. 4. Esquema de una transferrina en ausencia (A) y presencia (B) de moléculas de hierro 
(Bigas Terricabras. 2007). 
 
PROTEÍNA FUR. 
 
Los estudios sobre el control de la homeostasis del hierro se han enfocado 
extensamente en Fur (ferric uptake regulador), proteína que responde a la 
concentración del hierro celular. Es un polipéptido que actúa como represor 
transcripcional de promotores regulados por hierro; el Fe+2 actúa como corepresor 
(Escolar, et al. 1999). En la proteína Fur se identifican 2 dominios: un dominio C-
terminal, responsable de la unión con los iones metálicos, así como de la interacción 
con la proteína que dan lugar a la dimerización. El extremo N-terminal contiene un 
motivo de unión al ADN helix-turn-helix (HTH) involucrado en el reconocimiento y 
anclaje al ADN (Stojiljkovic & Hantake. 1995). La estructura de esta proteína se 
encuentra formada por 3 hélices-α seguidas de cadenas-β, siendo similares a las 
regiones de unión al ADN descritas en otros reguladores como son: CAP, LexA o 
DtxR (González de Pedro, et al. 2001). 
 
La regulación de la expresión del gen fur es muy compleja, ya que es autorregulable 
y está sujeta a represión catabólica, con lo que se liga su expresión con el 
metabolismo de la célula, y además es regulada también por la respuesta al estrés 
oxidativo. Bajo condiciones ricas en hierro, Fur se une al ión divalente y forma el 
complejo Fe+2-Fur, adquiriendo una configuración en su dominio N-terminal capaz de 
unirse a secuencias blanco palindrómicas de la cadena de ADN conocidas como 
Cajas Fur o cajas de hierro formada por 19 pares de bases 
(GATAATGATAATCATTATC), inhibiendo la transcripción de genes regulados por 
Fur downstream (río abajo). En situaciones contrarias, cuando el hierro es escaso, 
disminuye la concentración del complejo Fe+2-Fur y se liberan regiones operadoras 
reguladas por hierro, permitiendo que la ARN polimerasa acceda a promotores de 
genes para la síntesis de sideróforos y otras proteínas reguladas por hierro, 
permitiendo la expresión de dichos genes (Fig. 5.) (Hantke. 2001). Además se ha 
reportado que la proteína Fur también es una Zinc metaloproteína, ya que contiene 
un sitio de unión para zinc, esencial para su función (Jacquamet, et al. 1998). 
 
 
Fig. 5. Mecanismo de acción de la proteína Fur. A altas concentraciones, el hierro se une a la 
proteína Fur y el complejo Fe-Fur a su vez se une a la caja Fur, reprimiendo así los genes que 
se encuentran bajo su control. A bajas concentraciones de hierro, el complejo apo-Fur no 
puede incorporarse a la caja Fur del ADN y por lo tanto se transcriben los genes regulados por 
esta (Bigas Terricabras. 2007). 
 
La unión de Fur a las cajas fur adyacentes al promotor es suficiente para bloquear la 
transcripción in vitro, por lo que se ha sugerido que Fur no recluta otro represor ni 
excluye alguna proteína activadora (Litwin & Calderwood. 1993). Además, la 
proteína Fur también puede regular la captación de hierro de forma indirecta a través 
de varios sistemas de transducción de señal de 2 componentes reguladores: AraC-
like en la síntesis de sideróforos y sistemas de absorción, y factores sigma de 
función extracitoplásmica. Fur también puede regular positivamente la expresión de 
algunos genes como son los que codifican la proteína Superóxido dismutasa (Soda), 
las ferritinas Bfr y Ftn, la aconitasa Acn, la fumarasa FumC y diversas proteínas que 
regulan la respuesta al estrés ácido (Hantke. 2001). 
 
Los genes regulados por la proteína Fur constituyen el llamado regulón Fur, cuya 
mayor parte está implicada en la captación de hierro, en la biosíntesis y transporte 
de sideróforos, en la codificación de proteínas de la membrana externa receptoras 
de las moléculas transportadoras de hierro del huésped y en el metabolismo del 
hierro como son las bacterioferritinas. Además de su participación en la captación de 
hierro (Shite, et al. 2002). 
 
Fur además de regular la expresión de otras proteínas implicadas en el metabolismo 
celular, tales como las Aconitasas PurR o MetJ, o proteínas que participan en la 
respuesta del estrés oxidativo como la superóxido dismutasa Soda, regula también 
la expresión de algunos factores de virulencia como colicinas, hemolisinas de 
Escherichia coli y Vibrio cholerae, o la exotoxina A de Pseudomona aeruginosa; por 
lo que la acción de estas toxinas permitirá el acceso a fuentes de hierro como son 
las ferritinas o del grupo “hemo” de la hemoglobina, ubicadas en el interior de la 
célula hospedera (Escolar, et al. 1999). 
 
La proteína Fur también parece controlar genes cuyos productos están implicados 
en la síntesis de flagelos, como el gen flhD, principal activador del sistema de 
biosíntesis de flagelos, además también se han detectado la presencia de cajas fur 
en los promotores de genes implicados en los procesos de regulación y transducción 
de señales de quimiotaxis tanto en E. coli como en V. Cholerae (Panina, et al. 2001). 
 
 
 
ANTECEDENTES. 
 
 Bahrami, et al. (2003) demostraron la capacidad de Actinobacillus suis para 
obtener hierro a partir de la transferrina de cerdo por mecanismos mediados 
por receptores análogos a los ya descritos para otros miembros de la familia 
Pasteurellaceae. 
 
 Bigas Terricabras. (2007) en su tesis expone la importancia de los genes fur y 
thyA en la patogénesis de Haemophilus parasuis, donde logró aislar y 
caracterizar el gen fur de H. parasuis así como también la creación de 
mutantes de este mismo para probar la viabilidad de la bacteria con el gen 
defectuoso. 
 
 Cox, et al. (2003) reportaron que los receptores de hemoglobina producidos 
por P. multocida (HgbA y HgbB) y por A. pleuroneumoniae (HgbA) son 
reprimidos por hierro y contienen una putativa caja Fur, que se identificó río 
arriba del gen hgbB de P. multocida. 
 
 Grifantini, et al. (2003) luego de realizar análisis con Neisseria meningitidis 
mencionan que en algunos organismosFur solo puede actuar como un 
regulador positivo en el control de la expresión genética, a través de la 
interacción entre la proteína Fur y la región del operador de genes activados 
por hierro. 
 
 Hsu, et al (2003) clonaron y caracterizaron el gen fur de Actinobacillus 
pleuroneumoniae, además de ser capaz de complementar una mutante furΔ 
de E. coli a partir de un análisis transcripcional de los promotores divergentes 
del operón de la toxina I (apxICABD) y el operón de absorción de hierro 
(afuABC) de A. pleuroneumoniae. Con esto demuestra que Fur y Ca+2 regulan 
positivamente la transcripción de apxICABD, mientras que Fur es un represor 
para afuABC. 
 
 Negrete-Abascal, et al (2004) descubrieron que Actinobacillus suis secreta 
metaloproteasas con actividad proteolítica en el medio de crecimiento, 
además de mencionar el nivel de actividad a diferentes temperaturas, también 
demostraron una similitud en las reacciones de las metaloproteasas de A. 
pleuroneumoniae y A. suis. 
 
 Bahrami & Niven (2005) estudiaron la adquisición de hierro por A. suis: a 
partir de hemoglobina, identificando y caracterizando un gen que codifica para 
un receptor de hemoglobina, en donde se amplificaron los genes hugZ y hgbA 
para poder determinar si era posible que la bacteria obtuviera hierro a partir 
de la hemoglobina. 
 
 Harasty et. al (2006), realizaron una identificación de genes fur-regulados por 
A. actynomycetemcomitas, creando una cepa mutante fur- la cual fue 
caracterizada determinando su respuesta al estrés por ácido en el ambiente. 
 
 Chantes Guerra (2007) identificó y caracterizó el gen fur de Av. 
paragallinarum diseñando oligonucleótidos específicos para éste en base a 
secuencias de genes fur reportadas para diferentes miembros de la familia 
Pasteurellaceae. A partir del DNA genómico de Av. paragallinarum, logró 
amplificar por PCR un fragmento de aproximadamente 500 pb. La banda del 
producto del PCR fue purificada, clonada y secuenciada usando primers 
universales (M13 Reverse y Forward) corroborando satisfactoriamente la 
identidad del gen fur. 
 
 
 
 
 
JUSTIFICACIÓN. 
 
El hierro es un elemento esencial para el crecimiento bacteriano. En diferentes 
microorganismos patógenos, se han descrito genes cuyos productos determinan 
factores de virulencia y/o participan en la captación de hierro y que se encuentran 
regulados por la proteína Fur. En A. suis se ha demostrado la presencia de genes y 
proteínas involucradas en captación de hierro a través de transferrina porcina y 
hemoglobina, pero la presencia y participación de un gen fur en este microorganismo 
no ha sido descrito, a pesar de ser uno de los agentes patógenos bovinos y porcinos 
más importantes. Por lo cual es importante identificar este gen en A. suis y su índice 
de similitud con otros genes fur reportados para diferentes miembros de la familia 
Pasteurellaceae. 
 
HIPÓTESIS. 
 
A. suis posee un gen fur con una secuencia similar a otras reportadas en organismos 
pertenecientes a la familia Pasteurellaceae como Av. paragallinarum y A. 
pleuroneumoniae. 
 
OBJETIVO GENERAL. 
 
Clonar y caracterizar molecularmente el gen fur de Actinobacillus suis. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES. 
 
 Obtener un amplificado del gen fur de A. suis. 
 Purificar el producto del gen fur de A. suis. 
 Clonar y secuenciar el gen fur de A. suis. 
 Analizar la secuencia in silico y determinar su similitud con otras secuencias 
fur ya reportadas. 
MATERIAL Y MÉTODOS. 
 
Crecimiento bacteriano. 
 
La cepa utilizada de Actinobacillus suis forma parte de la colección de cepas del 
laboratorio. El crecimiento de la bacteria se realizó en el medio de cultivo de Base de 
Agar sangre suplementado con sangre (10-20 g/ml), y se incubó a 37°C. Para el 
cultivo en agar sangre, la bacteria se propagara en condiciones de microaerofília 
incubando las placas en un recipiente herméticamente cerrado en atmósfera 
húmeda y una vela que se mantiene encendida hasta que se apaga al consumirse el 
oxígeno contenido en el recipiente (Terzolo et al. 2000). 
 
Aislamiento del DNA cromosómico de A. suis y amplificación del probable gen 
fur. 
 
El DNA genómico de A. suis se obtuvo usando el método de extracción descrito por 
Sambrook et al. (1989). Las condiciones de PCR para amplificar el posible gen fur de 
A. suis fueron estandarizadas usando DNA cromosómico y los oligonucleótidos 
previamente diseñados por Chantes Guerra (2007). El producto de PCR se observó 
en un gel de agarosa al 1%, después de someterlo a una separación electroforética. 
En caso de presentar impurezas, el producto se limpió mediante el uso de un Kit de 
purificación de productos de PCR y gel Wizard® SV de Promega para garantizar la 
pureza de la muestra. 
 
Clonación del producto de PCR y selección de las clonas transformantes. 
 
La clonación se realizó bajo las siguientes condiciones: Se colocaron 4 µl del 
producto de PCR fresco + 1 µl de solución de sal + 1µl del vector TOPO (pCR® 2.1-
TOPO), se mezcló cuidadosamente y se incubó por 5 minutos a temperatura 
ambiente. Después se realizó la transformación de células competentes de E. coli 
DH5α siguiendo el protocolo descrito por Sambroock et al. (1989). La selección de 
las transformantes se efectuó en placas de medio LB que contenían Ampicilina (100 
µg/ml), IPTG (50 µg/ml) y X-gal (40 µg/ml), obteniendo colonias blancas y azules, de 
las cuales se seleccionaron las colonias blancas debido a que el fragmentó del gen 
fur de A. suis interrumpe el gen lacZα del pCR2.1 TOPO por lo que las colonias 
lacZα negativas son las que tienen el inserto; generando las clonas pCR2.1 TOPO-
fur. 
 
Análisis in silico. 
 
El análisis in silico de la secuencia obtenida del posible gen fur de Actinobacillus suis 
se llevó a cabo al compararlo con secuencias ya reportadas en los bancos de genes, 
utilizando el programa “nucleotide blast” de la página: 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Para la conversión de la secuencia obtenida a 
una cadena de aminoácidos, se ocupó el programa “traslate tool” que se encuentra 
en la página: http://www.expasy.ch/tools/. Mientras que para realizar la tabla de 
comparación entre las distintas secuencias (obtenida y otras de comparación), se 
usó el programa de alineación múltiple que está en la página: 
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://www.expasy.ch/tools/
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html
RESULTADOS. 
 
 Aislamiento del ADN cromosómico de Actinobacillus suis. 
 
El ADN genómico de A. suis se obtuvo usando el método de extracción descrito por 
Sambrook, et al. (1989) como se observa en la figura 6. 
 
Fig.6. La columna de la izquierda (1) está el marcador de 1Kb. A la derecha (2) se muestra la 
banda de ADN de A. suis. 
 
 
 PCR. 
 
Para poder amplificar el probable gen fur de A. suis se emplearon los 
oligonucleótidos previamente diseñados por Chantes Guerra A. (2007) para el gen 
fur de A. paragallinarum, los cuáles fueron: 
 
 
 
 
PRIMERS SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS T (Cº) 
Fur upper 5´ ATGTCTGAAGAAAATRYWAAA 3´ 52.4 
Fur lower Hd 5´ TTAATCTTTTTTATCTTTTG 3´ 48.03 
SÍMBOLOS: R=A+G, Y=C+T, W=A+C 
 
Las condiciones de PCR estandarizadas para amplificar el gen fur de A. suis a partir 
del ADN cromosómico obtenido fueron: Desnaturalización a 95ºC por 5 min. 
Alineamiento a 30 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 1 minuto a 43ºC y 1:30 minutos a 
72ºC. Extensión final de 10 minutos a 72ºC y 3 minutos a 15ºC. 
 
El producto obtenido fue de un tamaño cercano a los 500 pb que presentó 
reminiscencias de material genético de bajo peso como se observa en la figura 7: 
 
 
Fig. 7. A la izquierda (1) se observa el marcador de 100 pb en el cual se resalta la banda que 
indica los 500 pb. A la derecha (2) se encuentra el amplificado del posiblegen fur. 
 
 
Para eliminar estas impurezas, el producto fue purificado siguiendo las instrucciones 
del kit de purificación de productos de PCR y gel Wizard® SV de Promega, 
obteniendo un producto puro y sin ningún otro residuo (Fig. 8). 
 
Fig. 8. A la izquierda (1) el marcador de 100 pb. A la derecha (2) se encuentra el producto 
purificado del gen fur. 
 
 
 Secuenciación: 
 
Después de ser purificado, el producto fue secuenciado utilizando los oligos Fur 
upper y Fur forwar. La secuencia obtenida de este amplificado fue de 477 
nucleótidos y se muestra abajo. 
 
GAATTCGCCCTTATGTCTGAAGAAAATGCTAAACTTCTTAAAAGTGTTGGCTTAAAAGTAACCG
AGCCTCGCTTAACCATTCTTGCGTTAATGCAACAACATCGCGATCAAATGCAGCACTTTTCTGC
AGAAGATATTTACAAACTCTTATTAGAACAAGGTTCTGATATTGGTTTAGCAACGGTTTACCGTG
TATTAAACCAATTTGAAGAGGTTGGTATTTTACTTCGCCATAACTTTGATGCGAACAAAGCGGTA
TTCGAGCTTAACGTAGAGCAAGAACACGATCATATTATCTGTATGGATTGCGGTAAGGTATTTG
AATTTAAAGATCCGGATATCGAACGCCGTCAGCGCGAAATCAGTCAACAACATGGTATGGAAT
TAGCGACTCACAGCTTATATCTCTATGCTAAATGTAATGACATTGCGCATTGTGATTCATCAAAA
GATAAAAAAGATTAAAAGGGCGAATTC 
 
Al analizar esta secuencia mediante el programa Nucleotide blast de NCBI 
(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), dicha secuencia presentó un 90% de identidad con 
la secuencias reportadas para los genes fur de Actinobacillus pleuropneumoniae 
(AF330229.1), Actinobacillus pleuroneumoniae L20 (CP000569.1) y un 85% de 
identidad con la de Avibacterium paragallinarum (FJ004891.1). 
 
La secuencia del gen fur de A. suis fue traducida in silico con el programa Translate 
tool de ExPASy (www.expasy.ch/tools/dna.html) obteniéndose una proteína de 154 
aminoácidos, la cual al ser analizada en el programa ProtParam de ExPASy 
(www.expasy.ch/tools/protparam.html), indicó que la proteína putativa tiene un peso 
de 17850.3 Daltones y un PI (Potencial Isoeléctrico) teórico de 5.33: 
 
E F A L M S E E N A K L L K S V G L K V T E P R L T I L A L M Q Q H R D Q M Q H F S A E D I Y 
K L L L E Q G S D I G L A T V Y R V L N Q F E E V G I L L R H N F D A N K A V F E L N V E Q E H 
D H I I C M D C G K V F E F K D P D I E R R Q R E I S Q Q H G M E L A T H S L Y L Y A K C N D I 
A H C D S S K D K K D 
 
 Alineamiento múltiple del gen fur de Actinobacillus suis. 
 
Para comparar la secuencia del amplificado de fur de A. suis con las de otros genes 
fur previamente reportados, se realizó un alineamiento de estas secuencias 
utilizando el programa de comparación de la página 
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi y el programa de alineación múltiple de la 
página: http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Como se observa en la 
figura 9, el alineamiento de las secuencias nos indica una alta identidad del gen fur 
de A. suis con las secuencias fur de A. pleuroneumoniae (90%), A. pleuroneumoniae 
L20 (90%) y A. paragallinarum (85%). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=126096280&dopt=GenBank&RID=WTH7H2RJ012&log$=nuclalign&blast_rank=3
http://www.expasy.ch/tools/dna.html
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html
 
Fig. 9. Alineamiento del gen fur de A. suis con las secuencias fur de A. pleuroneumoniae, A. 
pleuroneumoniae L20 y Av. paragallinarum. En color rojo se muestran los nucleótidos 
idénticos en las todas secuencias, en azul, identidad en al menos 3 nucleótidos y en negro 
aquellos que son distintos o que solo 2 son iguales. 
 
 
 Alineamiento múltiple de la proteína Fur de Actinobacillus suis. 
 
El alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la proteína Fur de A. suis con 
las otras proteínas Fur mostró un 96% de identidad con las secuencias reportadas 
para A. pleuropneumoniae (AF330229.1), A. pleuroneumoniae L20 (CP000569.1) y 
Av. paragallinarum (FJ004891.1). El análisis también permitió identificar que la 
secuencia de aminoácidos de la proteína Fur de A. suis conserva los dominios de 
unión al ADN (Helix-Turn-Helix) y al hierro como se ha descrito para otras 
secuencias Fur (Fig. 10). 
 
 
 
 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=126096280&dopt=GenBank&RID=WTH7H2RJ012&log$=nuclalign&blast_rank=3
 
Fig. 10. Alineamiento de las secuencias de aminoácidos de la proteína Fur de A. suis con las 
secuencias de Fur de A. pleuropneumoniae, A. pleuroneumoniae L20 y Av. paragallinarum, en 
las cajas verdes se encierra el dominio de unión al ADN y en las cajas azules se encierra el 
dominio de unión al metal. 
 
 
 Clonación. 
 
Posteriormente a su amplificación y purificación, el gen fur de A. suis fue clonado en 
el vector pCR 2.1 TOPO (Invitrogen), generando el plásmido pCR 2.1 TOPO-fur. Con 
este plásmido se transformaron células competentes de E. coli DH5α. La selección 
de las transformantes se realizó en placas de medio LB suplementadas con 
Ampicilina (50 µg/ml), IPTG (50 µg/ml) y X-gal (40 µg/ml); se seleccionaron las 
colonias blancas debido a que el fragmento del gen fur de A. suis interrumpió el gen 
lacZα del pCR 2.1 TOPO (Fig. 11). Para comprobar que las clonas seleccionadas 
tuvieran el inserto, se realizó una digestión con la enzima EcoRI, observándose la 
liberación del fragmento de aproximadamente 500 pb. 
 
 
 
Fig. 11. Placa de medio LB con Ampicilina, Xgal e IPTG en donde aparecen las colonias azules 
que no pudieron absorbieron el inserto. En un círculo rojo se denotan las colonias blancas que 
asimilaron el gen fur de Actinobacillus suis. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DISCUSIÓN. 
 
Con la finalidad de contribuir al entendimiento de los mecanismos de patogenicidad 
de A. suis, en el presente trabajo se obtuvo e identificó el gen fur perteneciente a 
esta bacteria. El producto de este gen fur puede ser el regulador transcripcional que 
se encuentra involucrado tanto en la adquisición y transporte de hierro así como en 
la expresión de diferentes factores de virulencia de A. suis (Escolar et al. 1999). 
 
En diferentes microorganismos patógenos Fur se encarga de la regulación positiva 
de algunos genes como son la superóxido dismutasa SodB, las ferritinas Bfr y Ftn, la 
aconitasa Acn, la fumarasa FumC y diversas proteínas que regulan la respuesta al 
estrés ácido (Hantake, 2001), además de regular negativamente un gran número de 
genes como tonB y el operón afeABCD del sistema de transporte de Fe (Rhodes et 
al. 2005). También regula los genes SoxR y SoxS de la respuesta al estrés oxidativo, 
los genes ydeP y RyhB de respuesta de adaptación al pH ácido y el gen aceB del 
metabolismo celular (Oglesby et al. 2005). En A. suis podría existir una regulación 
por parte de Fur de genes similares, este proceso tendria que ser probado 
posteriormente. 
 
Con los oligonucleótidos diseñados para amplificar el gen fur de A. paragallinarum 
(Negrete Abascal et al, 2009) se pudo amplificar el gen fur de A. suis, obteniendo 
como producto una banda de 477 pb (Fig. 7), tamaño similar a los reportados para 
genes fur de A. pleuroneumoniae de 450 pb (Hsu et al. 2003) y Av. paragallinarum 
con 453 pb (Chantes Guerra. 2007, Negrete Abascal et al, 2009). Esto sugiere un 
origen común entre genes fur de diversos microorganismos. 
 
El alineamiento de la secuencia obtenida mostró una identidad del 90% con las 
secuencias del gen fur reportadas para A. pleuropneumoniae y del 85% con la 
secuencia reportada para Av. paragallinarum (Fig. 9), sugiriendo un posible origen 
común para este tipo de reguladores. 
 
La secuencia nucleotídica obtenida fue analizada por el programa Traslate tool de la 
página www.expasy.ch/tools/protparam.html, mostrando que la proteína Fur de A. 
suis posee los dos dominios descritos para otras proteínas Fur y que determinan su 
acción como regulador transcripcional, uno de estos es el dominio amino terminal 
(del aminoácido 42 al 55 y del 62 al 69) que contiene el sitio de unión al ADN Helix-
Turn-Helix (HTH), y el otroes el dominio carboxilo terminal (del aminoácido 92 al 96 
y del 99 al 104), que contiene 1 sitio de unión para el metal Fe +2 (Chantes Guerra. 
2007). 
 
El alineamiento múltiple de la secuencia de aminoácidos traducida in silico indicó un 
96% de identidad con las secuencias reportadas para A. pleuropneumoniae 
(AF330229.1), A. pleuroneumoniae L20 (CP000569.1) y Av. paragallinarum 
(FJ004891.1). Estos resultados sugieren que la proteína Fur de A. suis posee un 
origen común con las proteínas Fur estas otras bacterias, debido a los sitios de 
conservación amino terminal y carboxilo terminal observados dentro de las 
secuencias, lo que indica una correlación con otras bacterias Gram negativas; 
sugieriendo también que este mecanismo de regulación por Fur está muy 
generalizado en el mundo bacteriano. Algunos organismos utilizan mecanismos 
similares de captación y transporte de hierro, como el sistema exbB-ExbD-TonB, el 
cuál está regulado por Fur. Este argumento ha sido corroborado al demostrar que la 
proteína Fur de E. coli reconoce las cajas Fur de otros microorganismos, inclusive 
Gram positivas, por lo que al parecer esta secuencia regulatoria está muy bien 
conservada evolutivamente (Escolar et al. 1999). 
 
El peso molecular descrito para proteínas Fur de diferentes microorganismos oscila 
entre los 17-18 kDa (Haraszthy et al. 2002). La secuencia de aminoácidos codificada 
por este gen fur de A. suis fue de 17.8 kDa de peso. El análisis de la secuencia 
mostró que esta posee un PI (Potencial Isoeléctrico) teórico de 5.33, ligeramente 
más ácido que el reportado de 5.56 para Av. paragallinarum (Chantes Guerra. 2007). 
 
http://www.expasy.ch/tools/protparam.html
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=126096280&dopt=GenBank&RID=WTH7H2RJ012&log$=nuclalign&blast_rank=3
La importancia de Fur como regulador de diferentes genes que participan en el 
metabolismo, transporte y captación de hierro, en respuesta a las condiciones 
ambientales como estrés oxidativo, además de su participación en el control de 
diferentes factores de virulencia (Litwin et al. 1993) resalta la importancia de la 
continuidad de este estudio, ya que Fur regula genes que participan en la 
patogénesis de esta bacteria de enorme interés productivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONCLUSIONES. 
 
 
 A. suis posee un gen fur. 
 
 La secuencia nucleotídica de fur de A. suis presenta una alta identidad con la 
secuencia fur reportada para A. pleuroneumoniae (90%), A. pleuroneumoniae 
L20 (90%) y A. paragallinarum (85%). 
 
 La secuencia de aminoácidos de Fur presenta 94% de identidad con las 
secuencias reportadas para A. pleuroneumoniae, A. pleuroneumoniae L20 y 
A. paragallinarum. 
 
 La secuencia de aminoácidos presenta los dominios de unión a metal y Helix-
Turn-Helix característico de las proteínas Fur. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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	Portada
	Índice
	Introducción 
	Factores de Virulencia
	Proteasas
	Importancia de la Adquisición de Hierro
	Proteína Fur
	Antecedentes
	Justificación Hipótesis Objetivos
	Material y Métodos
	Resultados PCR
	Discusión 
	Conclusiones
	Bibliografía