Clusiaceae-de-Mexico--identificacion-genetica-por-medio-de-codigo-de-barras-y-desarrollo-preliminar-de-un-metodo-para-cuantificar-la-actividad-de-proteasa-vih-1

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
Clusiaceae de México: Identificación genética por medio 
de código de barras y desarrollo preliminar de un método 
para cuantificar la actividad de proteasa (VIH-1) 
 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
PRESENTA 
Ximena Navarro Zayas 
 
 MÉXICO, D.F. 9 de Febrero AÑO 2015 
 
JURADO 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesora: Carmen Adriana Mendoza Rodriguez 
VOCAL: Profesora: Maria Benita Leonor Fernández 
SECRETARIO: Profesora: Sandra Alicia Santillán Hernández 
1er. SUPLENTE: Profesora: Perla Deyanira Maldonado Jiménez 
2° SUPLENTE: Profesora: Tzventanka Dimitriva Dinkova 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: INSTITUTO DE QUÍMICA. UNAM, 
MÉXICO. 
 
 DIRECTORA DE TESIS: 
Sandra Alicia Santillán Hernández 
Asesor Técnico: 
Ricardo Reyes Chilpa 
 
SUSTENTANTE: 
 XIMENA NAVARRO ZAYAS 
 
 
 
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 Clusiaceae de México: Identificación genética 
por medio de código de barras y desarrollo 
preliminar de un método para cuantificar la 
actividad de proteasa (VIH-1) 
Índice 
I. Lista de tablas………………………………………………………………………....…..i 
II. Lista de figuras………………………………………………………………………...…ii 
1. Introducción………………………………………………………………………….……1 
2. Antecedentes………………………………………………………………………...…...2 
2.1. El uso de código de barras (Barcodes)…………………………………...…....2 
2.1.1. Código de barras (rbcL, matK, ITS)……………………………………...…....6 
2.2. Familia Calophyllaceae....................................................................................8 
2.2.1. Género Calophyllum………………………………………………………...…...9 
2.2.2. Quimiotipos……………………………………………………………………....12 
2.3. Otras familias y género relacionados con la familia Calophyllacea: 
Clusiaceae…………………..…………………………………………………………...13
2.4. Compuestos naturales presentes en especies de la familia Clusiaceae y 
Calophyllaceae con actividad antiviral…………………………………………..…16 
2.5. VIH (Virus de inmunodeficiencia humana)……………………………………20 
2.5.1. Ciclo de replicación del VIH-1………………………………………………...20 
 
 
 
4 
 
2.5.2. Terapia antiretroviral…………………………………………………………....22 
3. Justificación…………………………………………………………………………………...24 
4. Planteamiento de Problema……………………………………………………………...…24 
5. Objetivos Generales………………………………………………………………………....24 
6. Objetivos Particulares……………………………………………………………………….25 
7. Hipótesis…………………………………………………………………………………….…25 
8. Metodología……………………………………………………………………………………26 
 8.1. Material Biológico………………………………………………………………….26 
 8.2. Extracción, Amplificación, Secuencuación de ADN………………………...27 
 8.3. BLAST (Basic Local Alignment Tool)………………………………………….28 
 8.4. Construcción de árboles filogenéticos…………………………………….….29 
 8.5. Actividad inhibitoria de extractos de especies de la familia Clusiaceae e 
Calophyllaceae sobre la enzima proteasa del VIH-1………………………………..….....32 
9. Resultados…………………………………………………………………………………..…33 
 9.1. Alineamiento de secuencias y análisis filogenético………………………..33 
 9.2 Resultado de inhibición de la enzima proteasa………………………………53 
10. Discusión……………………………………………………………………………………..54 
11. Conclusión…………………………………………………………………………………...57 
12. Bibliografía………………………………………………………………………………..….60 
ANEXO 1….........................................................................................................................66 
 
 
 
5 
 
 
I. Lista de Tablas 
 Página 
Tabla 1. Especies pertenecientes al género Clusia, dentro de la familia Clusiaceae. 15 
Tabla 2. Medicamentos más usados y su clasificación de acuerdo a su mecanismo de 
acción. 
23 
Tabla 3. Especies ocupadas para el estudio de investigación en código de barras. 26 
Tabla 4. Número de accesos del GeneBank, NCBI, de especies de la familia Clusiaceae 
consideradas en la investigación. 
29 
Tabla 5. Claves de herbario. 30 
Tabla 6. Claves de herbario para especies del género Clusia 30 
Tabla 7. Distancias relativas entre dos secuencias de las especies del género Calophyllum 
para el marcador del ITS 
49 
Tabla 8. Valores en Unidades de Fluorescencia Relativa (UFR) y porcentaje de inhibición de 
la curva de calibración de Pepstatina A (uM). 
67 
Tabla 9.Valores de porcentaje de inhibición de extractos de cada especie 69 
 
 
 
 
 
i 
 
 
 
6 
 
II. Lista de Figuras 
Fig. 1 Ubicación del gen matk dentro del intron del gen trnK. 7 
Fig. 2 Flor de Calophyllum brasiliense. 10 
Fig. 3 Distribución de Calophyllum brasiliense en México. 10 
Fig. 4 Calophyllum brasiliense. A. rama con inflorescencia femenina; B. flor masculina; C. flor 
femenina; D. rama con frutas. 
11 
Fig. 5 Distribución de especies pertenecientes a la familia Clusiaceae. 14 
Fig. 6 Clusia guatemalensis. 15 
Fig. 7 Estructura de los compuestos calanólidos, inófilums y cardatólidos. 17 
 Fig. 8 Compuestos aislados de especies del género Calophyllum. 18 
 Fig. 9 Compuestos aislados de especies del género Clusia. 19 
 Fig. 10 Ciclo de replicación del VIH (infoSIDA). 22 
 Fig. 11 Reacción del Kit ProteinOne. 32 
 Fig. 12 Gel de agarosa al 1% para la confirmación de presencia de ADN después de la 
realización de PCR touchdown ITS. 
34 
 Fig. 13 Gel de agarosa al 1% para la confirmación de presencia de ADN despues de la 
realización de PCR touchdown ITS. 
34 
 Fig. 14 Gel de agarosa al 1% para la confirmación de presencia de ADN después de la 
realización del PCR touchdown del ITS. 
35 
 Fig. 15 Descripción de la secuencia con número de acceso KC484699, dentro de la base de 
datos de NCBI. 
37 
ii 
 
 
 
 
7 
 
 Fig. 16 Descripción de la secuencia con número de acceso KC493365, dentro de la base de 
datos de NCBI. 
39 
 Fig. 17 Descripción de la secuencia con número de acceso KC174558, dentro de la base de 
datos de NCBI. 
41 
 Fig. 18 Descripción de la secuencia con número de acceso KC493367, dentro de la base de 
datos de NCBI. 
43 
 Fig. 19 Comparación de secuencias del QT1 y QT2 de la especie Calophyllum brasiliense, la 
comparación se realizó por medio de BLAST de NCBI. 
44 
 Fig. 20 Árbol filogenético de algunas especies pertenecientes al género Calophyllum. 47 
 Fig. 21 Árbol filogenético de algunas especies pertenecientes al género Clusia. 51 
 Fig. 22 Curva de inhibición de la actividad de proteasa con respecto a la concentración de 
pepstatina A. 
68 
 Fig. 23 Porcentaje de inhibición vs Unidades de Fluorescencia Relativa (UFR). 68 
 
 
iii 
 
 
 
1 
 
1. Introducción 
La identificación y clasificación de los seres vivos ha sido a lo largo de los años una 
herramienta fundamental para comprender el basto mundo que nos rodea. Un sistema 
eficiente es primordial para lograr este objetivo. Muchas especies tienen un parecido 
morfológico entre sí lo que hace difícil su diferenciación, así que es fundamental 
incorporar nuevas técnicas y metodologías para lograr una clasificación botánica mas 
funcional. 
Los marcadores genéticos han sido de gran ayuda para la identificación y clasificación de 
numerosos organismos animales y vegetales. En este contexto, el uso de marcadores 
genéticos en organismos vegetales plantea un reto importante,esto se debe a que 
inicialmente se pretendía usar el genoma mitocondrial en plantas de la misma manera que 
en animales. Sin embargo, esto no se pudo llevar acabo debido a la baja tasa de cambios 
que presentan las secuencias del genoma mitocondrial en plantas, lo que da como 
resultado una pobre discriminación a nivel de especie. Por esta razón, a lo largo del tiempo 
se han propuesto varias regiones génicas que pudieran servir como marcadores, tales 
como el ITS (espaciador interno transcrito, ribosomal), el rbcL (cloroplastos), y el matK 
(cloroplastos), entre otros. 
La familia Clusiaceae está compuesta por 46 géneros y alrededor de 1000 especies 
descritas representadas por plantas herbáceas, arbustos y árboles corpulentos. 
Recientemente, un grupo de especies fue separada de esta familia para dar lugar a la 
familia Calophyllaceae, la cual consta de 14 géneros, dentro de los cuales está el género 
Calophyllum, con aproximadamente 179 especies aceptadas (CONABIO, 2012; Stevens, 
1980). Las especies pertenecientes a este género han tenido un gran interés debido a que 
se ha descubierto que ciertos compuestos que poseen estas especies tienen actividad 
contra el virus de inmunodeficiencia humana tipo I (Reyes-Chilpa y Huerta Reyes, 2009). 
Para el presente trabajo, se seleccionaron algunas especies de los géneros Calophyllum y 
Clusia, pertenecientes a las familias Calophyllaceae y Clusiaceae, respectivamente, esto 
 
 
 
2 
 
con el fin de poder realizar un análisis filogenético para la óptima identificación, 
diferenciación y clasificación. Se prestó especial atención a la especie Calophyllum 
brasiliense debido a que estudios químicos y anatómicos previos han sugerido la existencia 
de tres quimiotipos (fenotipos químicos) en México (Huerta-Reyes et al, 2004; García-
Zebadúa et al, 2011) sugiriendo un proceso de diversificación en curso. Desde el punto de 
vista farmacológico, también es importante determinar las diferencias en sus secuencias de 
ADN, ya que solo dos de los tres quimiotipos presentan compuestos con potencial actividad 
inhibitoria de ciertas enzimas víricas participantes en el ciclo de replicación del VIH-1 
(Reyes-Chilpa y Huerta Reyes, 2009; García-Zebadúa et al, 2011). 
 Finalmente, se seleccionaron algunas especies de estas familias para probar sus extractos 
crudos contra la enzima vírica proteasa del virus de inmunodeficiencia humana tipo I (VIH-
I). 
2. Antecedentes 
2.1. El uso de Código de Barras (Barcodes) 
La morfología ha sido por muchos años uno de los primeros pasos para la identificación y 
clasificación de muchos organismos alrededor del mundo, y aproximadamente 1.7 millones 
de especies han sido descritas y nombradas bajo el sistema de Linneo (Hawksworth y 
Kalin-Arroyo, 1995). Sin embargo, el número total de especies sobre el planeta continua 
siendo desconocida aunque se stima que existen más de 100 millones de especies 
(Barcod of Life Database, 2009). 
En los últimos años, los avances científicos y tecnológicos nos han brindado la posibilidad 
de analizar los organismos a un nivel más específico y con ello llegar a una clasificación e 
identificación más eficiente y exacta. El empleo de regiones del genoma como marcadores 
genómicos fue el resultado de un avance tecnológico significativo en el uso de técnicas de 
biología molecular, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la 
secuenciación (Dorado, 2010). 
 
 
 
3 
 
La diversidad de las moléculas que constituyen a los organismos nos brinda la oportunidad 
de seleccionar algunas de ellas y compararlas, ya sean proteínas, ADN, ó ARN, con el fín 
de clasificarlos de manera más eficiente (Karp, 2005). Independientemente del tipo de 
molécula seleccionada, es necesario establecer una base de datos en la cual cada 
investigador pueda depositar sus resultados y de esta manera ser comparados con los 
generados por otros científicos, además es de gran importancia una base de datos que 
permita la confirmación de datos obtenidos por el investigador (Hollingsworth, 2011). 
El código de barras de ADN consiste en emplear una pequeña secuencia de una región 
estandarizada del genoma, como una herramienta para la identificación de especies 
(Hollingsworth, 2011). Los primeros estudios realizados se enfocaron en el genoma 
mitocondrial, en especial en el gen del citocromo oxidasa subunidad 1 (cox 1), con el que 
se logró la clasificación y el estudio de muchas especies de animales (Hollingsworth, 2011; 
Kher et al, 2011), pero el verdadero reto consistió en plantear un código de barras eficaz 
para la clasificación de plantas. No es factible emplear el genoma mitocondrial como código 
de barras en las plantas de la misma manera que se utiliza en los animales, debido a que 
mientras el genoma mitocondrial en animales es altamente conservado y con una gran tasa 
de sustituciones, en plantas presenta una baja tasa de sustitución en bases y 
frecuentemente encontramos rearreglos debido a la transferencia de genes entre diferentes 
genomas (mitocondria, cloroplastos, núcleo) y entre especies (Hollingsworth, 2011). 
 De acuerdo a Kress y colaboradores (2005) las características que un código de barras 
debe cumplir para poder clasificar y diferenciar organismos de manera eficaz son las 
siguientes: 
 Esta región debe de estar estandarizada, es decir que sea posible estudiar la misma 
región del genoma en diferentes grupos taxonómicos, de tal manera que el uso de estas 
secuencias sea reproducible. 
 La secuencia de una región del gen debe de ser similar en individuos de la misma 
especie, pero diferente a los de especies que no pertenecen a esta, lo cual nos brinda la 
capacidad de diferenciación interespecífica. 
 
 
 
4 
 
 La región de ADN utilizado debe contener la suficiente información genética para una 
pronta y eficaz identificación de la especie. 
 La secuencia debe contar con sitios conservados y sitios variables que nos permitan 
discernir entre grupos taxonómicos, así como una alta capacidad de amplificación y 
secuenciación. 
 La región de ADN seleccionada debe de ser corta para permitir la amplificación de ADN 
degradado. 
Cabe mencionar que muchas de las principales investigaciones en el manejo y 
estandarización del uso de códigos de barras fueron realizadas por el Consorcio de códigos 
de barras para la vida (CBOL por sus siglas en inglés). En el caso de plantas, se formó un 
grupo especial de trabajo (Plant Working Group) el cual propuso el uso de dos regiones 
estandarizadas del genoma de cloroplastos (rbcL y matK) como códigos de barras para 
plantas. Esto fue publicado por Plant Working Group, en el año del 2009. En este se 
postula el uso de dos locis acoplados, esto reduciría el costo y el tiempo de análisis, en 
comparación con el uso de tres secuencias distintas, también se postuló el uso de tres locis 
distintos provenientes del genoma de cloroplastos (matk, rbcL, trnH-psbA). 
El uso de códigos de barras radica en el hecho de poder construir una base de datos que 
contenga todas las secuencias que se han ocupado como barcodes, por lo mismo el CBOL 
decidió formar el grupo de trabajo de bases de datos DBWG, (Data Base Working Group) 
los cuales se encargarían de elaborar una biblioteca de códigos de barras que esté 
integrada por otros sistemas de información acerca de la biodiversidad de las especies. El 
DBWG trabaja conjuntamente con NCBI (National Center of Biotechnology Information) 
para crear una biblioteca de códigos de barras que sean de acceso público, y las bases de 
datos creadas por grupos de investigación podrán aportar sus avances para enriquecer de 
manera activa la base de datos de códigos de barras generada por CBOL y NCBI. Además 
de brindar información genética, las bases de datos contarán con voucher de las especies 
analizadas para una completa identificación de la misma, y en el caso de que la especie 
aún no seaidentificada, se le colocara una etiqueta que así lo mencione (no identificado). 
 
 
 
5 
 
Conforme al CBOL, Plant Working Group (2009) los beneficios que brindan el uso de dos 
regiones son los siguientes: 
 La traducción de secuencias de codones de paro o cambios en el marco de lectura puede 
ser usada para identificar errores de base o pseudogénes. 
 Las regiones pueden ser alineadas para permitir el análisis carácter-base, esto es que 
cada base es un carácter (entendiendo carácter como al punto de comparación para 
determinar la relación evolutiva entre las especies), y los posibles caracteres son las bases 
adenina, citosina, guanina y timina. 
 La longitud de regiones conservadas codificantes facilitara otras formas de análisis 
comparativo de las secuencias de códigos de barras. 
Con base en los puntos antes mencionados e investigaciones recientes, las regiones del 
genoma más utilizadas son las del cloroplasto (rbcL) y el nuclear (ITS) (Álvarez y Wendel, 
2003; Chen et al, 2010; Newmaster et al, 2006). Pero ¿cuál de estas dos regiones funge 
como un mejor marcador? Para esto debemos de tener en cuenta la calidad del ADN que 
se va a recuperar después de haber realizado su extracción. Es decir, es más complicado 
recuperar ADN de calidad que pueda ser usado como código de barras a partir del núcleo 
que del cloroplasto. Esto se debe a dos cosas, la primera es que el genoma de cloroplasto 
contiene más copias por célula, lo que brinda una mayor cantidad de ADN extraído, y la 
segunda es que en el caso del genoma núcleo-ribosomal existe la membrana nuclear, que 
brinda una mayor protección al ADN, dificultando el proceso de extracción (Kress et al, 
2005; DataWorking Group CBOL, 2009). 
 
 
 
 
 
 
 
6 
 
2.1.1. Códigos de barras (rbcL, matK, ITS) 
El genoma del cloroplasto en las plantas terrestres se considera pequeño, de alrededor de 
120-200 kb, y se caracteriza por contener dos segmentos repetidos que separan dos 
regiones, una larga y una pequeña. Dentro de cada región se pueden identificar las 
secuencias que tienen potencial para ser consideradas códigos de barras, por ejemplo, 
dentro de la región larga del genoma del cloroplasto podemos encontrar rbcL, matK, trnF y 
en el caso de la región pequeña hallamos al ndhF (CBOL, Plant Working Group, 2009). Es 
importante enfatizar que dentro de uno de los dos segmentos repetidos encontramos al gen 
16S (Eguiarte et al, 2003). El uso del genoma del cloroplasto puede tener ciertas ventajas y 
desventajas, y entre las ventajas que presenta el uso de este genoma y de sus respectivas 
secuencias es el alto número de copias que facilita su obtención de una manera más 
eficiente y con una mejor calidad, tiene una estructura más estable y contiene una herencia 
uniparental, esto es debido a que es un análogo del genoma mitocondrial en animales 
(Eguiarte et al, 2003). Las desventajas que posee el uso del genoma de cloroplasto es que 
presenta una evolución conservada que para efectos de un análisis filogenético no 
proporciona suficiente información para una diferenciación intraespecífica (Newmaster et al, 
2006). De la misma manera este tipo de genoma presenta una alta tasa de transferencia 
génica de una especie a otra e incluso con los distintos tipos de genomas particulares de la 
especie (nuclear, ribosomal, de cloroplasto) de la planta (CBOL, Plant Working Group, 
2009). 
A continuación se mencionaran las características de tres regiones usadas como códigos 
de barras en el genoma de cloroplastos: 
 rbcL 
El gen rbcL se encuentra en la región larga del genoma de cloroplasto y es el responsable 
de codificar la región larga de la ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa. La subunidad 
pequeña es codificada por el gen rbcS y entre las dos unidades forman el complejo 
conocido como rubisco. La enzima rubisco es la encargada de fijar el CO2 atmosférico en 
 
 
 
7 
 
las plantas. Generalmente el gen rbcL tiene una longitud de 1428-1434 bp y la presencia de 
indels (inserciones-deleciones) son muy raros (Newmaster et al, 2006). 
 matK 
El gen matK representado en el figura 1 se encuentra dentro del genoma de cloroplastos. 
Es un gen que recientemente ha tenido un gran uso como código de barras. Este gen fue 
sugerido como código de barras por el CBOL y en su última reunión con el NCBI se 
estableció que tanto el gen rbcL como el matK son los códigos de barras establecidos para 
plantas (Hilu y Barthet, 2008). 
Este gen también conocido como orfK, es un gen muy variable que consta de alrededor de 
1500-1600 bp y se encuentra localizado dentro del intron del gen trnK en cloroplastos. Se 
sabe que está relacionado con el splicing de intrones del grupo II que codifican para tARN 
lys (Hilu y Liang, 1997). 
 
Fig.1 Ubicación del gen matk dentro del intron del gen trnK. El gen matK se encuentra dentro del 
intron del gen trnK, las zonas colocadas en cajas representan regiones codificantes, y las líneas de 
unión representan regiones espaciadoras (Hilu y Liang, 1997). 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
La siguiente región usada como código de barras pertenece al genoma núcleo-ribosomal 
 ITS 
ITS, espaciador interno transcrito, por sus siglas en inglés Internal Transcribed Spacer, ha 
sido una región del genoma núcleo-ribosomal muy utilizada en los últimos años, debido a 
que posee una alta capacidad para discernir e identificar organismos a nivel de especie y a 
su amplio uso por la comunidad científica (Hollingsworth, 2011; Álvarez y Wendel, 2003; 
Chen et al, 2010). Las características que favorecen su uso como código de barras (Álvarez 
y Wendel, 2003) son: 
 
 Herencia biparental.- La región del ITS comprende el ITS2, la subunidad 5.8S e ITS1, las 
cuales mantienen una herencia biparental (Baldwin et al, 1995). 
 Universalidad.- El ITS presenta oligonucleótidos ya establecidos para su uso como 
primers, a pesar de esto aún falta diseñar más oligonucleótidos (primers) que permitan la 
amplificación más específica y de mejor calidad de esta región de nrADN. 
 Uniformidad intragenómica.- Se sabe que las familias de multigenes en general y en 
particular el ITS están bajo un efecto de evolución concertada. Esto es debido a que los 
arreglos dentro y entre secuencias promueven la tendencia de una fuerza evolutiva que 
conlleva a la diversidad y también puede conservar la identidad genética (Pimentel, 2006). 
 Variabilidad intergenómica.- Se observó que las variaciones genéticas de la región del ITS 
brindan la capacidad de realizar análisis filogenéticos a nivel de especie, género o familia 
(Álvarez y Wendel, 2003). 
 
2.2. Familia Calophyllaceae 
Calophyllaceae es una familia de plantas pertenecientes al orden las Malpighiales que es 
reconocida por la clasificación del sistema APG III (Angiosperm Phylogeny Group III 
system). La mayoría de los géneros incluidos en esta familia fueron reconocidos 
previamente en la tribu Calophylleae de la familia Clusiaceae. El Grupo de APG determinó 
que la división de este clado de géneros en su propia familia era necesaria (CONABIO, 
2012). 
http://en.wikipedia.org/wiki/APG_III
http://en.wikipedia.org/wiki/Calophylleae
http://en.wikipedia.org/wiki/Clusiaceae
 
 
 
9 
 
 
2.2.1. Género Calophylum 
Reino: Plantae 
Subreino: Tracheobionata 
División: Magnoliophyta 
Clase: Magnoliopsida 
Subclase: Dilleniidae 
Orden: Malpighiales 
Familia: Calophyllaceae 
Subfamilia: Kielmeyeroideae 
Tribu: Calophylleae 
Género: Calophyllum 
 
Calophyllum es un género de árboles con 200 especies tropicales siempreverdes que 
pertenecen a la familia Calophyllaceae. Estas especies se encuentran en Madagascar, 
África oriental, sur y sudeste de Asia, islas del Pacífico, Indias Occidentales y 
Sudamérica. En el continente americano se encuentran 8 especies, de las cuales 
Calophyllum brasiliense es la de mayor distribución pues crece en Selvas Húmedas en 
México,América Central y Suramérica. Alcanza hasta 30m de altura y 80 cm de diámetro, 
presenta hojas lustrosas (CONABIO, 2012, figura 5). Calophyllum brasiliense es la única 
especie que pertenece a este género presente en México. Su distribución en la república 
mexicana se presenta en la figura 3. 
 
 
 
10 
 
 
Fig. 2 Flor de Calophyllum brasiliense, Joảo Medeiros 
 
Fig. 3 Distribución de Calophyllum brasiliense en México (Pennington y Sarukhán, 2005). 
 
Se han aislado, tanto de hojas como de corteza de Calophyllum brasiliense, varios 
compuestos de entre los cuales se encuentran cumarinas dipirano-tetracíclicas que han 
mostrado actividad contra el virus de inmunodeficiencia humana tipo I, tanto de las 
 
 
 
11 
 
especies asiáticas del genero Calophyllum (Kashman et al, 1992), como de la especie 
americana C. brasiliense (Huerta-Reyes et al, 2004). Sin embargo, se ha encontrado que 
esta especie no es químicamente homogénea, pues en México se ha descrito que existen 
al menos dos poblaciones químicamente diferentes también llamados quimiotipos (QT). 
Uno de estos quimiotipos produce cumarinas dipirano-tetracíclicas antivirales (Huerta-
Reyes et al, 2004), mientras que el otro produce cumarinas tipo mammea inactivas contra 
este virus (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 2009). 
 
Fig 4. Calophyllum brasiliense. A. rama con inflorescencia femenina; B. flor masculina; C. flor 
femenina; D. rama con frutas, Distribución de Calophyllum brasiliense en México (Pennington y 
Sarukhán, 2005). 
 
 
 
 
12 
 
2.2.2. Quimiotipos 
Las diferencias químicas que pueden presentar especímenes de la misma especie se 
llaman quimiotipos (Dellacassa, 2010), esto es, son fenotipos químicos (Desjardins, 2008). 
La distribución biogeográfica de los quimiotipos de una especie de planta puede responder 
a dos factores importantes (Dellacassa, 2010): 
 Factores ecológicos 
 Respuesta a condiciones genéticas de la especie 
 
Los quimiotipos presentan características propias, por lo tanto la presencia de estos habla 
de una capacidad de respuesta a las condiciones ambientales y geográficas, como son 
ubicación geográfica, el suelo, el clima, la exposición solar, etc., a las cuales están 
expuestos cada espécimen dentro de la misma especie. Esta adaptación es consecuencia 
de una variación genética que puede ser trasladada a un nuevo habitat generando una 
distribución biogeográfica de cada quimiotipo. Durante los últimos años se han observado 
que muchas especies de flora presentan quimioformas distintas, o variedades químicas, 
conocidas actualmente como quimiotipos. Estas especies son homogéneas desde el 
punto de vista morfológico pero químicamente polimorfas (Dellacassa, 2010). 
 
En el caso de C. brasiliense se describieron originalmente dos quimiotipos (Huerta-Reyes 
et al, 2004; Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 2009) posteriormente se describió un posible 
tercer quimiotipo con base en su perfil cromatográfico (García-Zebadúa et al, 2011). Las 
hojas y otros órganos de los tres quimiotipos no presentan diferencias morfológicas 
apreciables, por lo que solo es posible disitinguirlas al analizarlas químicamente. 
Recientemente se ha estudiado la anatomía (histología) de las hojas, encontrando 
algunas diferencias notables entre el quimiotipo 1 y 2, en especial densidad de venas 
secundarias, presencia de hipodermis o no, y número de capas de parénquima. El tercer 
quimiotipo no se ha estudiado a nivel anatómico (García-Zebadúa et al, 2011). 
 
 
 
 
13 
 
El quimiotipo uno (QT1) se localiza básicamente en el sur de Veraruz, en el área de La 
Sierra de Santa Marta y se extiende a el área de Chimalapas en Oaxaca; aunque un 
espécimen se ha encontrado en el estado de Guerrero (Atoyac). El QT1 es escaso por lo 
tanto se puede considerar endémico. Contiene cumarinas tipo mammea en altas 
concentraciones (García-Zebadúa et al, 2011). 
 
El quimiotipo dos (QT2) esta ampliamente distribuido en la costa mexicana del Pacífico 
(Guerrero, Jalisco y Michoacan), como tambén en la costa mexicana del Atlantico 
(Veracruz y Tabasco), y es el más abundante. Contiene cromanonas como el ácido 
apetálico en altas concentraciones, así como cumarinas tetracíclicas como los calanólidos 
e inofilos (García-Zebadúa et al, 2011). 
 
Los especímenes del quimiotipo tres (QT3) se encuentran principalmente en Oaxaca, 
Veracruz y Chiapas, y es considerado el segundo más abundante (Fonseca, 2008). 
Contiene en bajas concentraciones cromanonas como el ácido apetálico, 
dipiranocoumarinas tetracíclicas como los inofilos. Esto hace que su perfil cromatográfico 
no sea igual al del quimiotipo 2 (Fonseca, 2008). 
 
2.3. Otras familias y géneros relacionados con la familia Calophyllaceae: 
Clusiaceae y Hipericaceae 
La familia Clusiaceae se encuentra distribuida en regiones pantropicales y templadas (Fig. 
5) (Stevens, 2008). Esta familia se presenta en forma de árboles o arbustos, raras veces 
hierbas, las hojas son simples, siempreverdes, engrosadas, los frutos que presenta esta 
familia suelen ser bayas, drupa o cápsula (Stevens, 2008). Algunas especies 
pertenecientes a la familia Clusiaceae tienen una gran importancia económica, debido a la 
producción de sus frutos comestibles, fármacos y tintes (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 
2009; CONABIO, 2012). 
 
 
 
14 
 
Esta familia originalmente comprendía una gran cantidad de especies género 
Calophyllum que de acuerdo algunos autores deben separarse para dar lugar a una 
nueva familia: Calophyllaceae. De esta forma Clusiaceae ha quedado reducida a las 
especies del género Clusia, principalmente 
 
Fig. 5 Distribución de especies pertenecientes a la familia Clusiaceae 
 
Reino: Plantae 
División: Magnoliophyta 
Clase: Magnoliopsida 
Orden: Malpighiales 
Familia: Clusiaceae 
Subfamilia: Clusioideae 
Tribu: Clusieae 
Género: Clusia 
Clusia es un género perteneciente a la familia Clusiaceae, que comprende entre 140 y 
150 especies originarias de América tropical y subtropical, de las cuales 10 son propias de 
México (Tabla 1). Sus especies son arbustos y árboles pequeños y medianos de hasta 20 
 
 
 
15 
 
m de altura, de follaje perennifolio (CONABIO, 2012). Las hojas son opuestas, de 5-20cm 
de largo y 5-10cm de ancho, las flores son blancas, blanco verdosas, amarillas o rojas, 
con 4-9 pétalos. La fruta es una cápsula corácea marrón verdosa que se abre para liberar 
varias semillas de cubierta carnosa, como se puede observar en la figura 6 (CONABIO, 
2012). 
Tabla 1. Especies pertenecientes al género Clusia (Clusiaceae) que se encuentran en 
México. 
Género Especies 
Clusia C. flava, C. guatemalensis 
C. lundelli, C. massoniana, C. minor, C. pringlei, 
 C. quadrangula, C. rosea, C. salvinii, C. tetratrianthera 
 
 
 
 
 
Fig.6 Clusia guatemalensis, A. L. de MacVean 
 
 
 
 
 
 
16 
 
 2.4. Compuestos naturales presentes en especies de la familia Clusiaceae y 
Calophyllaceae con actividad antiviral 
La familia Clusiaceae está compuesta de alrededor de 36 géneros y 1600 especies, con 
una distribución pantropical. El género dentro de esta familia es Clusia con cerca de 300 
especies (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 2009) y dentro de la familia Calophyllaceae es 
Calophyllum, con alrededor de 200 especies (Kearns et al, 1998). Algunas especies de 
estas dos grandes familias presentan compuestos con una actividad anti-VIH, siendo los 
siguientes compuestos más importantes (Huerta-Reyes et al, 2004) los siguientes: 
 
 Cúmarinas 
El (+) calanólido A (Fig. 7) fue aislado por primera vez de brotes y frutos de Calophyllum 
lanigerum, árbol tropical que crece en Malasia, el cual se caracterizó como un inhibidor 
potente de la TR (transcriptasa reversa) del VIH-I (Kashman et al, 1993). Actualmente, se 
encuentra dentro de ensayos clínicos fase II/III y de superar las fases clínicas se podría 
catalogar como el primer fármacoextraído originalmente de una especie vegetal (Reyes-
Chilpa y Huerta-Reyes, 2009). En 1993 se aislaron dos nuevas dipinocumarinas de las 
hojas de C. inophyllum de Malasia, los inofilos B y P, que igualmente presentaban una 
actividad inhibidora de la enzima transcriptasa reversa del VIH-I (Reyes-Chilpa y Huerta-
Reyes, 2009) y posteriormente se asilaron los cordatólidos A y B de las hojas de C. 
cordato-oblongum de Sri Lanka. Dichos compuestos inhibieron la actividad in-vitro de la TR 
del VIH-1 (Dharmaratne et al, 1998). 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
 
Compuesto R 
Calanólido Prenilo 
Inofilums Fenilo 
Cardatólidos Metílo 
Fig.7 Estructura de los compuestos calanólidos, inófulims y cardatólidos. 
 
Dentro del género Calophyllum se han extraído ciertos compuestos que presentan actividad 
antiviral contra el VIH-1. Del árbol tropical Calophyllum lanigerum se han aislado las 
dipiranocumarinas tetracíclicas (+)-calanólido A, calanólido B y calanólido C (Fig. 8), los 
cuales mostraron una potente inhibición sobre la TR del VIH-1 (Dharmaratne et al, 1992). 
Del Calophyllum inophyllum procedente de Malasia se aislaron cumarinas de tipo inofilum 
(Fig. 8) las cuales inhiben la replicación del VIH-I (Patil et al, 1993) 
 
 
 
 
 
18 
 
 
 Calanólido A Calanólido B 
 
 
 
Calanólido C Inophyllum B 
Fig. 8 Compuestos aislados de especies del género Calophyllum 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
 Benzofenonas y Xantonas 
Diversas benzofenonas preniladas han sido aisladas de especies pertenecientes a los 
géneros Allanblackia, Clusia, Garcina, Symphonia y Vismia (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 
2009). 
Los compuestos que se han aislado de especies de Clusia son: clusianona, 7-
epiclusianona, 18,19-dihidroxiclusianona, nemorosona y propolona A (Fig. 9), las cuales 
han mostrado cierta actividad antiviral (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes, 2009). 
 
7- epi-clusianona 18,19-di-hidroxi-clusianona 
 
 Nemorosona Propalona 
 Fig. 9 Compuestos aislados de especies del género Clusia 
 
 
 
20 
 
2.5. VIH (Virus de inmunodeficiencia humana) 
El virus de inmunodeficiencia humana pertenece a la familia de los Retroviridae, género 
Lentivirus, y se le denomina retrovirus debido a su capacidad de transcribir su genoma de 
una copia de ARN a una de ADN a través de una enzima viral llamada transcriptasa 
reversa (TR) (Levy, 2008). El blanco de este tipo de virus es animales, y su contraparte 
humana está relacionada con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) el cual se 
caracteriza por una baja significativa en la cantidad de células CD4+ y el desarrollo de 
enfermedades oportunistas que atacan al huésped, lo que origina la diseminación del VIH 
(Dimas y Hernández, 2002). 
 
Existen dos tipos de VIH, VIH-1 y VIH-2. Ambos virus están muy emparentados 
filogenéticamente y su principal diferencia es serológica, debido a que reside en las 
glicoproteínas de superficie (Levy, 2008). 
 
El VIH tipo 1se distribuye alrededor del mundo pero presenta una alta prevalencia en África 
Central, Europa, Asia y Estados Unidos. en cambio el VIH tipo 2 se localiza particularmente 
en el oeste de África (Levy, 2008). 
Al 30 de septiembre de 2011 en México se habían diagnosticado y registrado 151,614 
casos acumulados de SIDA (VIH-1), de los cuales 123,706 (82%) eran hombres y 26,900 
(18%) mujeres; y se habían registrado 36,714 casos acumulados de VIH, de los cuales 
26,697 (72.8%) eran hombres y 10,017 (27.2%) mujeres (CENSIDA). 
 
2.5.1. Ciclo de Replicación del VIH-1 
El ciclo de replicación del virus consta de 6 fases (Fig. 10) (http://infosida.nih.gov/): 
I. Enlace y fusión 
El VIH empieza su ciclo de vida cuando se une a un receptor CD4+ y a uno de los co-
receptores presentes en la superficie del linfocito T CD4+. Posteriormente el virus fusiona 
su envoltura con las células huésped, para poder liberar su material genético (ARN) dentro 
de la célula hospedera. 
http://infosida.nih.gov/
 
 
 
21 
 
 
II. Transcripción inversa 
Una enzima viral, mejor conocida como transcriptasa reversa (TR) transcribe la cadena 
simple de ARN vírico en una cadena doble de ADN vírico. 
 
III. Integración 
El ADN del VIH recién transcrito es integrado al núcleo de la célula anfitriona, en donde una 
enzima viral denominada integrasa oculta el ADN vírico dentro del ADN de la célula 
hospedera. El ADN del virus que ha sido integrado se le denomina provirus y puede 
permanecer en estado de latencia por varios años. 
 
IV. Transcripción 
Cuando la célula hospedera recibe una señal para volverse activa, el provirus usa una 
enzima propia de la célula hospedera llamada ARN polimerasa para comenzar la 
transcripción y generar copias del material genómico del VIH y segmentos más cortos 
denominados ARN mensajeros (ARNm) los cuales son utilizados como molde para la 
síntesis de proteínas largas de VIH. 
 
V. Ensamblaje 
La siguiente enzima vírica presente en esta fase de replicación es conocida como proteasa, 
la cual corta las cadenas largas de proteínas del VIH en pequeñas proteínas individuales. A 
medida que las proteínas pequeñas del VIH se unen en copias del material genético del 
ARN del virus, se ensambla una nueva partícula del viral. 
 
VI. Gemación 
El nuevo virus ya ensamblado sale de la célula hospedera. En esta fase el virus toma parte 
de la membrana de la célula hospedera, a esta envoltura le brotan combinaciones de 
proteínas y azúcar, mejor conocidas como glicoproteínas del VIH, las cuales son 
 
 
 
22 
 
necesarias para que el virus se pueda unir a los receptores CD4+ y a sus co-receptores. 
Ahora estas nuevas copias pueden pasar a infectar a otras células. 
 
 
 
Fig. 10 Ciclo de replicación del VIH (infoSIDA) 
 
 
 2.5.2. Terapia antiretroviral 
El tratamiento contra el virus de inmunodeficiencia humana, ha mejorado desde que se 
utilizó una terapia antiretroviral combinada en el año 1996. Esta terapia es mejor conocida 
como HAART (Highly Active Antoretroviral Therapy) la cual se basa en la administración de 
dos clases de fármacos distintos, uno denominado inhibidores no nucleosídicos de la 
 
 
 
23 
 
transcriptasa reversa (NNRTIs), y el segundo grupo denominado inhibidores de proteasa 
viral (PI). En la tabla 2 se muestran los medicamentos más utilizados y su mecanismo de 
acción (Pirrone, 2011). Ambas clases de fármacos tienen como objetivo disminuir el estado 
de replicación del virus y aumentar los niveles de CD4+ (Lancet, 2008). 
 
Tabla 2. Medicamentos más usados y su clasificación de acuerdo a su mecanismo de 
acción (Pirrone, 2011). 
 
NRTI 
Inhibidores 
Nucleósidos de la 
Transcriptasa 
Reversa 
NNRTI 
Inhibidores no 
Nucleósidos de la 
Transcriptasa Reversa 
PI 
Inhibidores de 
Proteasa 
Fusion 
Inhibidores de 
Fusión o 
Entrada 
Combivir (lamivudina 
+ zidovudina) 
Epivir (lamivudina o 
3TC) 
Hivid (zalcitabina o 
ddc) 
Retrovir (zidovudina, 
ZDV o AZT) 
Trizivir (AZT + 3TC + 
abacavir) 
Videx (didanosina o 
ddl) 
Viread (tenofovir) 
Zerit (stavudina/d4T) 
Ziagen (abacavir) 
Rescriptor (delavirdina) 
Sustiva (efavirenz) 
Viramune (nevirapina) 
Agenerase (amprenavir) 
Crixivan (indinavir) 
Fortovase (saquinavir) 
Invirase (saquinavir) 
Kaletra (lopinavir + 
ritonavir) 
Norvir (ritonavir) 
Viracept (nelfinavir) 
Agenerase 
(amprenavir) 
Crixivan (indinavir) 
Fortovase (saquinavir) 
Invirase (saquinavir) 
Kaletra (lopinavir + 
ritonavir) 
Norvir (ritonavir) 
Viracept (nelfinavir) 
En Fase III: 
Fuzeon (T-20 o 
Efurtivide) 
 
 
 
 
24 
 
3. Justificación 
La finalidad de la presente investigación es en primera instancia probar la eficacia de tres 
marcadores genéticos (ITS, rbcL, matK) para la identificación, clasificación y análisis 
filogenético de plantas pertenecientes a las familias Clusiaceae y Calophyllaceae,prestando especial atención en la especie Calophyllum brasiliense, debido a la presencia 
de tres quimiotipos diferentes dentro de esta especie, los cuales se distribuyen en territorio 
mexicano con una morfología similar. En segundo termino se evaluará la actividad 
inhibitoria de ciertos extractos contra la proteasa del virus de inmunodeficiencia humana 
tipo 1 (VIH-1). 
4. Planteamiento del Problema 
El descubrimiento de nuevas especies de plantas y la re-clasificación de algunas de ellas a 
través de métodos morfológicos actualmente ha sido insuficiente, ya que algunas especies 
no presentan diferencias morfológicas que permitan diferenciarlas como especies distintas. 
La clasificación genética a través de códigos de barras es una herramienta novedosa que 
ayuda a complementar a la clasificación morfológica usual. 
De acuerdo con estimaciones realizados por el Centro Nacional para la Prevención y 
Control del SIDA (CENSIDA) y de manera conjunta con la ONUSIDA, en México existen 
220,000 personas adultas infectadas por el VIH (Córdoba, 2009), de los cuales solo la 
mitad reciben terapia antiretroviral. Las plantas han sido objeto de estudio para la obtención 
de compuestos con actividad antiretroviral. 
 
5. Objetivo General 
 Obtener un marcador genético eficiente para la identificación de plantas de las 
familias Clusiaceae y Calophyllaceae. 
 Utilizar el mejor marcador para establecer si existen diferencias a nivel genético 
entre los tres quimiotipos de Calophyllum brasiliense presentes en México. 
 
 
 
25 
 
 Contribuir a desarrollar un método que permita evaluar el efecto de extractos 
crudos pertenecientes a especies de estas familias sobre la enzima proteasa del 
VIH-1. 
 
 
6. Objetivos Particulares 
 Determinar los posibles marcadores genéticos que se pueden utilizar para la 
identificación y clasificación de plantas pertenecientes a las familias Clusiaceae y 
Calophyllaceae. 
 Establecer si existen diferencias a nivel genético entre los tres quimiotipos de 
Calophyllum brasiliense presentes en México. 
 Probar la eficiencia de los marcadores genéticos seleccionados para la 
identificación, clasificación y el análisis filogenético de plantas pertenecientes a las 
familias Clusiaceae y Calophyllaceae. 
 Desarrollar protocolos que permitan llevar a cabo de manera eficiente la extracción 
de ADN a partir de material vegetal y la obtención de productos de PCR para su 
posterior secuenciación. 
 Utilizar el mejor marcador genético para poder construir un árbol filogenético que 
ayude a la diferenciación de los QT de Calophyllum brasiliense. 
 Determinar de manera preliminar el efecto inhibidor de extractos de especies 
pertenecientes a las familias Clusiaceae y Calophyllaceae sobre la proteasa del 
VIH-1. 
 
7. Hipótesis 
 El ITS, el gen rbcL y el gen matK son códigos de barras eficaces para discernir a 
nivel intra e inter especie. 
 Se puede construir un árbol filogenético con las secuencias de ITS obtenidas de las 
especies pertenecientes a las familias Clusiaceae y Calophyllaceae con el objetivo 
de conocer su relación evolutiva. 
 
 
 
26 
 
 A través del ITS se puede construir un árbol filognético el cual pueda diferenciar de 
manera eficiente los quimiotipos de la especie Calophyllum brasiliense. 
 Dentro del territorio mexicano se pueden encontrar los tres quimiotipos distintos que 
pertenecen a la especie Caliphyllum brasiliense. 
 Los extractos crudos de ciertas especies pertenecientes a los géneros Calophyllum 
y Clusia, presentarán actividad anti VIH-I. 
 
8. Metodología 
8.1. Material Biológico 
Se recolectaron especies de las familias de las Clusiaceae y Calophyllaceae de distintos 
lugares del país. A continuación se muestra en la tabla 3 las especies colectadas: 
Tabla 3. Especies ocupadas para el estudio de investigación en código de barras 
Especie Lugar de procedencia 
Calophyllum brasiliense Quimiotipo 1 Magallanes, Veracruz 
Calophyllum brasiliense Quimiotipo 2 Veracruz 
Calophyllum brasiliense Quimiotipo 2 Magallanes, Veracruz 
Calophyllum brasiliense Quimiotipo 3 Chiapas 
Calophyllum brasiliense Carretera Oaxaca- Tuxtepec 
Clusia cuadrangula Jardín Botánico, CU UNAM 
Clusia guatemalensis Tuxtla, Veracruz 
Clusia sp. Oaxaca 
Clusia guatemalensis Carretera Oaxaca-Tuxtepec 
Clusia sp. Carretera Oaxaca-Tuxtepec 
 
 
 
 
 
27 
 
8.2. Extracción, amplificación y secuenciación de ADN 
La extracción del ADN genómico total de los especímenes seleccionados se inició con la 
fragmentación de las hojas por medio de nitrógeno líquido, posteriormente se extrajo el 
ADN a través del uso de kit Power Plant DNA isolation de MoBio, el cual tiene como 
fundamento el uso de una extracción mecánica através del uso de balines, asi como una 
extracción química, con compuestos químicos propios y exclusivos del kit, los cuales 
eliminan cualquier traza de compuestos con activida de inhibir el PCR, tales compuestos 
polifenólicos. A través de una electroforesis en gel de agarosa al 1% se confirmó la 
presencia de ADN. 
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue utilizada para amplificar un fragmento 
que abarca el ITS1-5.8-ITS2 del ADN ribosomal utilizando los primers N-nc18s10 (5`-AGG 
AGA AGT CGT AAC AAG-3`) y C26A (5´- GTT TCT TTT CCT CCG CT 3`). Ambos primers 
fueron escogidos basándonos en la investigación realizada por Wen y Zimmer (1996). El 
Protocolo de PCR que fue utilizado consistió en un calentamiento inicial de 94ºC por un 
minuto, temperatura de alineamiento 53ºC que decrece 1ºC cada 6 ciclos, seguidos de 36 
ciclos a 48ºC, seguidos de 2 minutos a 50ºC y finalmente 72ºC por 2 minutos (Notis, 2004). 
Posteriormente se corroboró la presencia de ADN amplificado a través de electroforesis en 
gel de agarosa al 1% y bromuro de etidio como revelador, en este caso se requerían ver 
una banda definida con un tamaño de aproximadamente 650 bp a 850 bp. 
La amplificación del rbcL se llevó acabo por medio del uso de los primers rbcLaF (5`- ATG 
TCA CCA CAA ACA GAG CTA AAG C-3`) (Levin et al, 2003) y rbcLaR (5´- GTA AAA TCA 
AGT CCA CCR CG-3`) ( Kress y Erickson, 2007). El protocolo de PCR que se utilizó fue de 
95ºC por un minuto, seguido de 35 ciclos de 95ºC por 30 segundos, 51ºC por 50 segundos 
y 68ºC por 5 minutos (Kress y Erickson, 2007). Se corroboró la presencia de ADN 
amplificado por medio de una electroforesis en gel de agarosa al 1% revelado con bromuro 
de etidio y de la misma manera se verificó la presencia de bandas de tamaño entre 650 a 
850 bp. 
 
 
 
28 
 
Finalmente se realizó la amplificación de la región matk de cloroplasto con dos pares de 
primers, el primero sirvió para la amplificación de la región matk de especies de la familia 
Calophyllaceae, 1053Fm1 (5`CAATRTCATTTTWMTGTRTG-3´) y 1159Rm1 (5`- 
TSTARYATTTGACTYCGKACCACBG-3´), con las siguientes condiciones de reacción: 
94ºC por 3 minutos, seguido de 40 ciclos con 94ºC por 30 segundos, 50º por 40 segundos, 
72ºC por 1 minutos y una extensión final del 72ºC por 10 minutos. El segundo para 
especies de la familia Clusiaceae 1053Fm2 (5- TCAATRKCATTTTTHTGTRTGG-3´) y 1159 
Rm2 (5`- AGCATTTGACTTCGTAYCRCTG-3´) con las siguientes condiciones de reacción 
94ºC por 3 minutos, seguido de 40 ciclos con 94ºC por 30 segundos, 53.2ºC por 40 
segundos, 72ºC por 1 minutos y una extensión final del 72ºC por 10 minutos. Para la 
obtención de los primers como para las condiciones nos basamos en lo descrito por Ruhfel 
y colaboradores (2011). 
Los productos de PCR se cuantificaron y su pureza se midió en un Nanodrop 2000 Thermo 
Scientific en el Instituto de Investigaciones Biomédicas Sede del Tercer Circuito Exterior 
Edificio "B", 1er. piso, Lab.B. Los productos de PCR fueron secuenciados con los mismos 
primers que se utilizaron para amplificar y para ello se ocupó el método BIG DYE 
Terminator en un ABI PRISM 3100 del Instituto de Investigaciones Biomédicas,UNAM. Se 
verificaron las identidades de las secuencias generadas para cada planta a través del 
GenBank de NCBI. 
8.3. BLAST (Basic Local Alignment Tool) 
Cada secuencia generada se comparó con otras secuencias ya existentes en la base de 
datos de NCBI, utilizando la herramienta bioinformática BLAST para nucleótidos. 
Todas las secuencias se subieron a la página de NCBI, BLAST TOOL en formato FASTA 
para ser comparadas. 
 
 
 
 
 
29 
 
8.4. Construcción de árboles filogenéticos 
Para la construcción de los árboles filogenéticos se ocuparon secuencias generadas por 
nosotros y también contenidas en el GeneBank, y donde se incluyó Mesua férrea como 
un grupo externo para el árbol del género Calophyllum, para el árbol del género Clusia se 
colocó a Mammea americana como grupo externo. 
Tabla 4. Número de accesos del GeneBank, NCBI, de especies de la familia 
Calophyllaceae consideradas en la investigación. 
Taxón GenBank número de 
acceso ITS 
GenBank número de 
acceso rbcL 
 
Calophyllum brasiliense 
CT1 
 
KC484699 
 
KC493367 
Calophyllum brasiliense 
CT2 
KC493365 KC493366 
Calophyllum brasiliense 
CT3 
KC174558 KC493368 
Calophyllum brasiliense AY625643 JQ591092 
Calophyllum sp. AY625642 *NA 
Calophyllum leleanii AY625641 AY625022 
Calophyllum inophyllum AY625640 AY625020 
Calophyllum soulattri AY625639 AY625021 
Calophyllum goniocarpum AY625638 HQ332015 
Calophyllum vexans AY625637 HQ332024 
Calophyllum inophyllum AB110820 *NA 
Mesua férrea AY625635 AY625024 
 
 
 
 
 
30 
 
Tabla 5. Claves de herbario 
Taxón Clave de Herbario 
Calophyllum brasiliense C. Notis 387 (FLAS) 
Calophyllum inophyllum C. Notis 391 (FLAS) 
C. brasiliense QT2 IMSS 15866-1 
C. brasiliense QT3 IMSS 15523 
C. brasiliense QT1 IMSS 15436-1 
 
Tabla 6. Claves de herbario de especies colectadas del género Clusia, entre paréntesis se 
encuentran los número con los que se idetificaron las especies en el árbol filogenético. 
Taxón Clave de Herbario 
Clusia lundelli (1) 136723 
Clusia lundelli (2, 3) 136704 
Clusia lundelli (4, 5) 136732 
Clusia guatemalensis (1,2) 136724 
Clusia quadrangula (1) 134789 
Clusia sp. (1,2) 133678 
Clusia sp (3,4,5) 133679 
Clusia sp. (6,7) 133680 
Clusia sp. (8) 133681 
 
 
 
31 
 
Para la construcción de árbol se realizó un alineamiento de secuencias con MUSCLE 
(Edgar, 2004). El alineamiento de las secuencias resultó con la presencia de múltiples gaps 
(ausencia de nucleótidos). Por lo tanto se realizaron dos métodos para manejar estos gaps. 
1. Todos los gaps fueron excluidos del alineamiento, utilizando Gblocks v.0.910b 
(Castresana, 2000; Talavera y Castresana, 2007) 
http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html (alineamiento 1) 
 
2. Solamente los gaps localizados al inicio y al final de las secuencias fueron removidos 
manualmente (alineamiento 2). 
 
3. Para poder aprovechar la información filogenética que llegaran a brindar los indels 
(inserciones y deleciones de nucleótidos dentro de una secuencia genética) 
 
4. se importó a DnaSPv5 (Librado y Rozas, 2009) para poder codificar los gaps usando la 
opción “ASIS” (alineamiento de indels) 
El alineamiento 1 se ocupó para obtener el número de bases sustituidas por sitio entre 
secuencias, a través del parámetro de Kimura-2 (Kimura, 1980) y eliminado todas las 
posiciones con datos faltantes por medio de MEGA versión 5 (Tamura et al., 2011). 
Para la construcción de los árboles filogenéticos se ocuparon tres métodos: 
 Método de las distancias (NJ, Neighbor Joining) 
 Máxima Parsimonia (MP) 
 Inferencia de Bayes (BI, Bayes Inference) 
Para cada método se ocupó un alineamiento distinto, para NJ se ocuparon ambos 
alineamientos (1, 2), para MP se ocupó un alineamiento de indels y otro donde se trataron 
los gaps como caracteres faltantes y por último BI ocupó el alineamiento 2 y el 
alineamiento 1 o alineamiento por indels. 
http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
 
 
 
32 
 
En el caso NJ y MP se ocupó el programa PAUP 4.0b10 (Swofford, 2003); El análisis de 
Bayes fue realizado con el programa MrBayes 2.3 (Huelsenbeck y Ronquist, 2001; 
Ronquist y Huelsenbeck, 2003) 
 
8.5. Actividad inhibitoria de extractos de especies de la familia Clusiaceae, 
Calophyllaceae e Hypericaceae sobre la enzima proteasa del VIH-1. 
 
Para la realización del ensayo de proteasa se ocupó el kit HIV Protease Assay Kit de la 
marca Protein One, con una placa de 96 pozos fondo plano negro. El fundamento del kit es 
la emisión de fluorescencia debida al rompimiento del péptido marcado en un sitio 
específico. La ruptura es debida a la proteasa, por lo tanto si los compuestos presentan 
actividad inhibitoria sobre esta enzima el corte del péptido no existirá y por ende la emisión 
de fluorescencia será poca o nula. Éste método también es conocido como método de 
transferencia lineal de energía (FRET), su fundamento es la interacción que ocurre a muy 
corta distancia (<100 Å) entre dos estados de excitación electrónica de dos moléculas 
fluorescentes, en las que la longitud de onda de una de ellas coincide con la excitación de 
la otra (Blanco, 2009). A continuación en la figura 11 se muestra la forma en que actúa el 
kit. 
 
Fig. 11 Reacción del kit ProteinOne 
 
En primera instancia se preparó una mezcla maestra,el cual contiene agua desionizada, 
solución estándar fluorecente, DTT, buffer 2X, sustrato de la proteasa del VIH-1. 
Posteriormente, se realizó una curva patrón, iniciando con una concentración de pepstatina 
 
 
 
33 
 
A (inhibidor de proteasa ácida) de 2.0 μM y decreciendo hasta 0.0156μM. Los extractos de 
ciertas especies vegetales seleccionadas se disolvieron en una solución que contenía 
dimetilsulfóxido (DMSO) al .05% para una concentración final de 10 mg/ml. 
 
En la placa se colocó la curva patrón, el control negativo (sin pepstatina A), el control 
positivo (con pepstatina A), el blanco (solo buffer) y cada extracto se colocó por triplicado 
en una cantidad de 4 μL por pozo, la cual se llevó a un volumen final de100 μL con la 
mezcla maestra. La reacción inició en el momento que se agregó la mezcla maestra. La 
placa se incubó a una temperatura de 25°C y se realizó la lectura a los 60 minutos en un 
fluorómetro marca Gemini XPS a dos longitudes de onda distintas, una de emisión y otra de 
excitación (485-525 nm, respectivamente). Debido al posible ruido de fondo que genera el 
instrumento se hizo una corrección en los datos, con la siguiente fórmula: 
 
UFR= UFmuestra-UF 
Donde UFR son las Unidades de Fluorescencia Relativa y UF son las Unidades de 
Fluorescencia (ruido de fondo). 
 
9. Resultados 
9.1. Alineamiento de secuencias y análisis filogenético 
Las secuencias generadas tanto para las especies de los géneros Calophyllum y Clusia de 
ambos sentidos de la cadena de ADN del ITS y del rbcL fueron comparadas con las ya 
reportadas en la base de datos de NCBI, en el caso de matk no se realizó la comparación 
debido a que no se pudieron obtener secuencias de buena calidad. Posteriormente las 
secuencias que identifican cada una de las especies del género Calophyllum fueron 
depositadas en el GeneBanK de NCBI con un número de acceso reportado en la tabla 4. A 
continuación se muestran algunos geles de agarosa al 1% para la confirmación de 
presencia de ADN después de la realización del PCR de ciertas muestras seleccionadas. 
 
 
 
34 
 
En los geles de agarosa se puede observar si las muestras son adecuadas para realizar la 
cuantificación de ADN y su posterior secuenciación. 
 
Fig. 12 Gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia 
de ADN después de realizar el PCR touchdown del ITS. 
Las muestras están presentadas de izquerda a derecha 
de la siguiente manera Calophyllum brasiliense Quimiotipo 
1, Calophyllum brasiliense Quimiotipo 2, Calophyllum 
brasiliense Quimiotipo 3. 
 
 
Fig.13 Gel de agarosa al 1% para confirmar la presencia de 
ADN después de realizar el PCR touchdown del ITS. Las 
muestras están presentadas de izquierda a derecha de la 
siguiente manera Clusia sp. (1), Clusia sp. (2), Clusia 
guatemalensis (1), Clusia sp. (3), Clusia sp. (4), Clusia sp. (8). 
A las muestras de Clusia sp. se les colocó un número debido 
a que son especiemenes de la misma especie pero 
colectadas de diferente lugar. 
 
600-700 bp 
 
 
 
35 
 
 
 
Fig. 14 Gel de agarosa al 1% para la confirmación de presencia de ADN después de la realización 
del PCR touchdown del ITS; las muestras están presentadas de izquierda a derecha de la siguiente 
manera Clusia quadrangula, Clusia lundelli (1) 
A continuación se presentan algunos ejemplos de las secuencias de especies colectadas 
por nosotros, las cuales fueron obtenidas por una secuenciación tipo Sanger realizada en el 
Instituto de Investigaciones Biomédicas; posteriormente fueron introducidas en la base de 
datos de NCBI. 
 
 
 
 
600-700 bp 
600-700 bp 
 
 
 
36 
 
 
Secuencias de ITS. 
1. Calophyllum brasiliense internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal 
RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence QT1 
GenBank: KC484699 
>gi|532578965|gb|KC484699.1| Calophyllum brasiliense internal transcribed spacer 1, 
partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed 
spacer 2, partial sequence 
 
CCTGCCCNGCAGACCGACCCGCGAACCCGTGCAAGATTGTCGGGGGCGGGGGGGT
CCTCCCCTCGTCGCCGCAGCCCGTCGGGGGCGCCGGGTGCGCCCGGCCGCCCGTC
GGCGCAACGAACCAACCCCGGCGCAGGACGCGCCAAGGAATCGCAAAAATAGAGCA
GGAGGAGACCCCCCGTCGTCCCCGTAACGGCGGACGCGACGGGGNCGTCGTCCTC
TNGTATCGAGTCAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGNCTCTCGCATCGATGAA
GAACGTAGCGAAATGCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGT
CTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGT
CACGCATCGTCGCCCCCCGCGCCCCCCTTCCCCGGGGGGGCCGAACGACGGGGGC
GGACAATGGTCTCCCGTGCGCTCCCGCTCGCGGTTGGCCCAAATACGAGTCCCCGG
CAACGGTAGCCACGGCAAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGAGAACGTCGTGCGCGC
CCGTTGCGCCCGGTACCCGTCGACCCCGTGCATATCCGTCCAGGAAGCTCGCACGG
CGACCCCAGGTCA 
 
 
 
 
37 
 
 
 
 
 
Fig. 15 Descripción de la secuencia con número de acceso KC484699, dentro de la base de datos 
de NCBI. 
 
 
 
38 
 
2. Calophyllum brasiliense voucher IMSSM:15866-1 internal transcribed spacer 1, partial 
sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed 
spacer 2, partial sequence 
GenBank: KC493365.1 
 
>gi|532578898|gb|KC493365.1| Calophyllum brasiliense voucher IMSSM:15866-1 internal 
transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; 
and internal transcribed spacer 2, partial sequence 
 
TTGTCGANCTGCCCAGCAGANCGACCCGCGAACCCGTGCAACGATTGTCGGGGCGG
GGGGTCCTCCCCTCGCCGCCGCAGCCCGTCGGGGGCGCCGGGTGCGCCCGGCCG
CCCGTCCGTCGGCGCAACGAACCAACCCCGGCGCAGGACGCGCCAAGGAACCGAA
AAAATAGAGCAGGGGGAGACCCCCCGTCGCGAGACGGGGGCGTCGTCCTCCCGTAT
CGAGTCAAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGT
AGCGAAATGCGATACCTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGA
ACGCAAGTTGCGCCCNAAGCCTTCTGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACGC
ATCGTCGCCCCCCGCGCCCCCCCTTCCNCGGGGGGGCCGAACGACGGGGGCGGAC
AATGGTCTCCCGTGCGCTNCCGCTCGCGGNTGGCCCAAATACGAGTCCCCGGCNAC
GGTAGCGACGGCAAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACAACGTCGTGCGCGCCCC
GTTGCGCCCGGTACCCG 
 
 
 
 
 
39 
 
 
 
 
Fig. 16 Descripción de la secuencia con número de acceso KC493365, dentro de la base de datos 
de NCBI. 
 
 
 
 
 
 
40 
 
3. Calophyllum brasiliense voucher IMSSM:15523 internal transcribed spacer 1, partial 
sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete 
sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence 
GenBank: KC174558.1 
>gi|532578958|gb|KC174558.1| Calophyllum brasiliense voucher IMSSM:15523 internal 
transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed 
spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence 
 
 
 
GTCGANCCTGCCCAGCNNNCGNCCCGCGNACCCGTGCNACGATTGTCGGGGCGGG
GGGTCCTCCCCTCGCCGCCGCAGCCCGTCNGNGGCGCCGGGTGCGCCCGGNCGC
CCGTCCGTCGGCGCAACGAACCAACCCCGGCGCAGGACGCGCCAAGGAACCGAAA
AAATAGAGCAGGGGGAGANNCCCCGTCGCGAGACGGGGNCGTCGTCCTCCNGTATC
GAGTCNAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGTA
GCGAAATGCGATACCTGGTGTGANTTGCAGAATNCCGCGNACCATCGAGTCTTGAAC
GCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTCTNNCCGANGGCACGCCTGCCTGGCGTCACGCATC
GTCGCCCCCCGCGNCCCCCCTTCCCCGGGGGGCCGAACGACGGGGCGGACAATGG
TCTCCCGTGCGCTCNCGCTCGCGGTTGGCCCAAATACGAGTCCCCGGCAACGGTAG
CGACGGCAAGCGGTGGTTGAGAGACCCTCGGACAACGTCGTGCGCGCCCCGTTGC
GCCCGGTACCCGTCGACCCCGNTGCATATCCGTCCAGGAATGCTCGCACGGCGACC
CCAGGTCAGGCGGGA 
 
 
 
 
41 
 
 
 
Fig. 17 Descripción de la secuencia con número de acceso KC174558, dentro de la base de datos 
de NCBI. 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
Secuencias del gen rbcL 
1. Calophyllum brasiliense ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large 
subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast 
GenBank: KC493367.1 
>gi|532578923|gb|KC493367.1| Calophyllum brasiliense ribulose-1,5-bisphosphate 
carboxylase/oxygenase large subunit (rbcL) gene, partial cds; chloroplast 
 
TATTATACTCCTGAATATGAAACCAAAGATACTGATATCTTAGCAGCATTCCGAGTAAC
TCCTCAACCTGGAGTTCCACCTGAGGAAGCAGGAGCTGCGGTAGCTGCGGAATCTTC
TACTGGTACATGGACAGCTGTGTGGACCGATGGGCTTACCAGTCTTGATCGTTATAAA
GGACGATGCTACCACATCGAACCCGTTGCTGGAGAAGAAAATCAATATATTGCTTATG
TAGCTTACCCCTTAGACCTTTTTGAAGAAGGTTCTGTTACTAATATGTTTACTTCCATT
GTAGGTAATGTATTTGGATTCAAAGCCCTACGCGCTCTACGGCTGGAGGATTTGCGA
ATCCCTCCTGCTTATTCTAAAACTTTCCAAGGCCCGCCTCATGGCATCCAAGTTGAAA
GAGATAAATTGAACAAGTATGGTCGCCCCCTATTGGGCTGTACTATTAAACCTAAATT
GGGGTTATCCGCTAAGAATTACGGCAGAGCATGT 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
 
 
 
 Fig. 18 Descripción de la secuencia con número de acceso KC493367, dentro de la base de datos 
de NCBI. 
 
 
 
44 
 
 
Con la obtención de las secuencias, se prosiguió a realizar la comparación de las mismas 
por medio de BLAST, a continuación se presenta un ejemplo de una comparación entre la 
secuencia del ITS de Calophyllum brasiliense QT1 (KC484699) y Calophyllum brasiliense 
QT2 (KC493365), las cuales fueron especies colectadas por nosotros. 
 Fig. 19 Comparación de secuencias del QT1 y QT2 de la especie Calophyllum brasiliense, la 
comparación se realizó por medio de BLAST de NCBI 
 
 
 
45 
 
 
Fig. 19 Comparación de secuencias del QT1 y QT2 de la especie Calophyllum brasiliense, la 
comparación se realizó por medio de BLAST de NCBI (Continiación) 
 
Las secuencias obtenidas por el marcador rbcL no mostraron diferencias entre especies 
del mismo género; al realizar el árbol filogenético se observó que Calophyllum brasiliense 
solo presentaba dos sustituciones con respecto al grupo externo (Mesua ferrea). Por lo 
tanto rbcL no brinda información suficiente para realizar un análisis filogenético. A pesar de 
 
 
 
46 
 
que rbcL brinda secuencias de alta calidad, no es capaz de ayudar a discernir entre 
quimiotipos de la especie de Calophyllum brasiliense ni tampoco entre las especies del 
género Clusia cuyas secuencias para realizar el analisis se tomaron de la base de datos de 
NCBI y de secuencias generadas por nosotros. 
Las secuencias del ITS proporcionaron fragmentos de un tamaño de 565-700 bp, el cual es 
el usualmente reportado para angiospermas (Liston et al., 1996). Todas las secuencias 
generadas por ITS fueron comparadas en el BLAST de NCBI. Las secuencias obtenidas 
para ITS fueron alineadas con las base de datos de NCBI bajo el programa de BLAST, esto 
con el fin de comparar las secuencias de los quimiotipos de C. brasiliense con las 
secuencias previamente reportadas para esta especie. 
Con los resultados del alineamiento se pudo observar que C. brasiliense QT2 y QT3 tienen 
una mayor similitud con C. brasiliense reportada previamente por Notis (No. AY625643.1), 
mientras tanto C. brasiliense QT1 tiene una mayor similitud con C. inophyllum (No. 
AY625640.1) también reportada previamente por Notis (2004). 
Para determinar la relación filogenéticaentre las especies pertenecientes al genero 
Calophyllum, se utilizaron las secuencias de la región del ADN ribosomal ITS-5.8S, tanto 
reportadas previamente como las generadas por nosotros. Después de eliminar todos los 
gaps usando Gblocks (alineamiento 1) las secuencias tuvieron un tamaño de 441 bp, con 
29 caracteres parsimonia. El alineamiento tuvo un tamaño de 594 bp y 29 caracteres 
informativos parsimonia. Noventa y siete sitios con indels fueron codificados como datos 
binarios. El GTR + I model fue el modelo de evolución molecular seleccionado por 
MrModeltest. 
Con la ayuda de los diferentes métodos de construcción de árboles filogenéticos (NJ, MP y 
BI) se construyeron tres tipos de árboles, lo cuales tienen similitud con los reportados por 
Notis (2004). 
 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/48429363?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=1&RID=XCP2G16901N
 
 
 
47 
 
 
 
 
 
 
Fig. 20 Árbol filogenético de algunas especies pertenecientes al género Calophyllum. 
En la figura 20 se muestra este árbol filogenético en el cual se observa que existe una 
relación evolutiva entre los quimiotipos 2 y 3 de la especie C. brasiliense, ya que el 
 
 
 
 
48 
 
porcentaje de similitud entre ellos es de alrededor del 85% con respecto a las secuencias 
analizadas del espaciador interno transcrito. En el caso del quimiotipo 1 se puede observar 
un parentesco más cercano con C. inophyllum, con alrededor del 75%. Se ocupó a Mesua 
férrea como grupo externo para poder establecer la raíz del árbol y como grupo ajeno a las 
especies pertenecientes a la familia Calophyllaceae. 
El análisis filogenético permitió observar una estrecha relación filogenética entre los QT2 y 
QT3 que están estrechamente relacionados, debido a que solo difieren en dos indels, el 
primero de un nucleótido y el segundo de dos nucleótidos. El QT1 difiere de esta especie 
en 5 indels, de 2, 4, 18, 2 y 5 nucleótidos de longitud respectivamente, y en una sustitución 
de 8 nucleótidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
49 
 
Tabla 7. Distancia relativa entre todas las secuencias de especies del género Calophyllum 
para el marcador de ITS. 
 QT1 QT2 QT3 C. 
inophy
llum 
C. 
inophyllu
m 
C. 
brasiliense 
C. 
goniocar
pum 
C. soulattri C. 
vexan
s 
C. 
leleanii 
C. sp. 
C. brasiliense 
QT2 
0.012 
C. brasiliense 
QT3 
0.012 0.000 
C. inophyllum 0.020 0.022 0.022 
C. inophyllum 0.015 0.017 0.017 0.005 
C. brasiliense 0.012 0.000 0.000 0.022 0.017 
C. goniocarpum 0.040 0.043 0.043 0.051 0.045 0.043 
C. soulattri 0.035 0.043 0.043 0.051 0.045 0.043 0.025 
C. vexans 0.045 0.038 0.038 0.056 0.050 0.038 0.051 0.051 
C. leleanii 0.035 0.038 0.038 0.045 0.040 0.038 0.050 0.051 0.032 
C. sp. 0.043 0.045 0.045 0.053 0.048 0.045 0.053 0.053 0.040 0.017 
Mesua ferrea 0.083 0.091 0.091 0.100 0.094 0.091 0.086 0.077 0.100 0.097 0.105 
 
 
 
 
 
 
50 
 
También se realizó un árbol filogenético de especies de la familia Clusiacea. En este árbol 
no se incluyó al género Calophyllum y como grupo externo se tomo a Mammea americana 
con número de acceso de GenBank de AY625613. 
Las secuencias obtenidas para nuestras muestras de especies del género Clusia tuvieron 
un tratado inicial similar al de las secuencias de Calophyllum. En el caso de este segundo 
árbol se realizó la comparación de las secuencias por medio del BLAST de NCBI, y 
posteriormente se realizó el alineamiento de las secuencias. En este caso los gaps dentro 
de las secuencias no se tomaron en cuenta como un carácter a evaluar para la 
construcción del árbol, recordando que los gaps pueden contarse o ignorarse como 
carácter, teniendo en cuenta que el método para la realización de este segundo árbol fue 
el Neighbor-Joining, el cual no toma en cuenta los gaps, solo los indels ya que estos 
pueden ser mutaciones ancestrales que nos brinden las diferencias entres distancias 
evolutivas y distancias topológicas para la construcción del árbol. 
El siguiente árbol se realizó bajo el método de Neighbor-Joining con 100 réplicas de 
bootstrap, esto es obtener un sesgo o varianza de los datos que se quieren analizar y de 
esta manera realizar contrastes de hipótesis de los datos, con el fin de dar el sustento 
estadístico. 
 
 
 
51 
 
 
Fig. 21 Árbol filogenético de algunas especies pertenecientes al género Clusia. 
 
 
 
52 
 
 
Fig. 21 Árbol filogenético de algunas especies pertenecientes al género Clusia (continación). 
 
 
 
53 
 
9.2. Resultados inhibición de la enzima proteasa 
La enzima viral proteasa es un blanco para atacar el ciclo de replicación del virus de 
inmunodeficiencia humana, por lo cual es de suma importancia cuantificar si un 
compuesto o extracto pueden inhibirla. En primera instancia se hizo una curva de 
calibración con una proteína (Pepstatina A) que inhibe la proteasa del VIH (control 
positivo). De esta manera se pudo comparar la eficiencia de los extractos como 
inhibidores de la proteasa al comparar su efecto con el observado para la Pepstatina A. 
Al repetir numerosas ocasiones esta metodología se encontraron varios problemas: a) 
aunque la pepstatina teóricamente debería haber presentado un porcentaje de inhibición 
del 100%, el mejor resultado fue de 88%, b) los resultados para cada extracto no eran 
reproducibles entre ensayos (kits). 
Se examinó si la falta de reproducibilidad era consecuencia del equipo ocupado para la 
cuantificación (Fluorómetro) no se encontrara en las condiciones óptimas, por lo cual se 
decidió realizar una curva de calibración para determinar la eficacia del equipo utilizado el 
compuesto fluorescente, fluoresceína. El resultado de esta cuantificación fue satisfactorio, 
ya que se obtuvieron curvas de calibración reproducibles, desechando la idea de que el 
equipo no funcionara. Los problemas encontrados se atribuyen en primera instancia a que 
los kits y la enzima al ser productos de importación no se transportaron y almacenaron en 
la aduana con las condiciones más óptimas de temperaturas (-70°C) para su 
conservación, dando como resultado la disminución de la actividad de los compuestos, en 
especial de la enzima proteasa. Se trato de encontrar un nuevo proveedor, pero no se 
encontró a alguno pudiera entregar el kit de manera satisfactoria. Por lo tanto se 
presentan los mejores resultados obtenidos y para posteriores ensayos se recomienda: 
• Corroborar que el kit a utilizar haya cumplido con las condiciones de transporte y 
almacenamiento. 
• Realizar curvas de calibración tanto del equipo (fluorómetro) como de los reactivos 
del Kit. 
 
 
 
54 
 
• Manejar con sumo cuidado y bajo las condiciones adecuadas de temperatura y luz 
los reactivos. 
• Realizar replicas de las muestras con mismas condiciones y variables, 
estadísticamente se recomiendan hacer mas de 3 replicas por muestra. 
Debido a la discrepancia de los datos, solo se colocara a motivo de ejemplo en el anexo 
1, resultados obtenidos de una cuantificación en triplicado. 
 
10. Discusión 
Al realizar el análisis filogenético de las diferentes especies de la familia Clusiaceae y 
Calophyllaceae utilizando las secuencias del gen rbcL se observó que éste no era un 
marcador eficaz para ayudar a diferencair entre especies pertenecientes al mismo género; 
por otra parte al realizar el análisis de las secuencias de los quimiotipos de la especie C. 
brasiliense, se observo que las secuencias obtenidas para los tres quimiotipos tampoco 
presentaron diferencias. De tal manera que el uso de este gen como marcador genético 
solo proporcionó en primera instancia el género del espécimen a estudiar, por tanto 
suponiendo el caso en el cual tengamos tres especies de géneros diferentes, e 
intentaramos hacer un árbol filogenético utilizando el gen rbcL, en primera instancia 
podríamos observar los tres géneros en tres cladosdiferentes dentro del cladograma, pero 
si tenemos especies que suponemos son del mismo género este gen no nos brindaría las 
diferencias evolutivas que presentan las especies. El uso de este gen puede ser útil para 
realizar una primera diferenciación entre especímenes de diferente género que se 
desconozcan. 
Por otro lado, el segundo marcador que se estudió fue el espaciador interno transcrito (ITS) 
el cual permitió observar un nivel alto de divergencia genética entre los quimiotipos de C. 
brasiliense. Con la ayuda de este marcador se pudieron encontrar diferencias genéticas 
entre los tres quimiotipos de C. brasiliense. Con este marcador se observó que QT1, el cual 
 
 
 
55 
 
no tiene actividad contra TR, difiere de QT2 y QT3 los cuales si presentan actividad anti 
VIH. La morfología de los tres quimiotipos es muy similar, por lo tanto, el uso de este 
marcador para poder diferenciar entre los quimiotipos es de suma importancia. 
Este mismo marcador (ITS) fue el ocupado para generar el segundo cladograma de las 
especies del género Clusia. De igual manera podemos ver que nuestras muestras 
presentan una relación evolutiva y de distancias mas cercana con una especie que con 
otra, es decir la especie tomada del jardín botánico, Clusia quadrangula (colocado en color 
azul dentro del cladograma) presenta una relación evolutiva cercana a Clusia quadrangula 
secuencia tomada de la base de datos de NCBI. En cuanto a la especie Clusia 
guatemalensis 1 y 2 se muestra que divergen del mismo ancentro, por lo tanto es muy 
seguro que nuestras dos muestras colectadas estén correctamente catalogadas e 
identificadas como Clusia guatemalensis. De igual manera, podemos observar que las 
especies colectadas por nosotros de Clusia lundelli (1,2,3,4,5) y Clusia sp. (1,2,3,4,5,6,7) 
presentan un estrecha relación entre ellas, recordadon que el Método de Neighbor-Joining 
se basa en un método de distancias, es decir nos da la relación evolutiva entre especies 
representadas como las hojas dentro del cladograma. También podemos observar que 
Clusia sp (8) presenta una relación estrecha con Clusia flava, ya que las ramas que las 
separan esta muy juntas y son cortas, recordando que el método de Neighbor-Joinging nos 
brinda una relación entre las distancias evolutivas y las distancias topológicas entre dos 
vecinos o Unidades Taxonómicas Operacionales (OTU´s,operational taxonomic unit). 
También podemos observar que la especie Clusia torresii es la que presenta una mayor 
distancia evolutiva con respecto a el cluster de nuestras muestras.Esto se puede ver, ya 
que es la especie que presenta una rama más larga dentro del cladograma, lo que nos dice 
que es una especie más alejada evolutivamente con respecto a nuestras especies a 
estudiar. 
Como ya se mencionó antes, la región del ITS está compuesto por ITS1, 5.8S e ITS2 y al 
realizar un PCR de esta región se amplifican un segmento corto del ITS1 (no se amplifica 
todo), el segmento 5.8S y un segmento corto de ITS2. El ITS1 y el ITS2 son fragmentos 
 
 
 
56 
 
más divergentes entre especies, mientras que el locus 5.8S es un locus conservado. De 
esta manera la complementariedad de estos dos segmentos hacen que el ITS sea un 
marcador muy eficaz para la diferenciación e identificación de especies, al igual que para la 
elaboración de estudios filogenéticos. 
A pesar de que el ITS es un buen marcador debido a las partes que lo componen (un 
segmento conservado y otro no conservado) puede presentar ciertos problemas. Uno de 
los cuales es que el segmento de ITS amplificado pertenezca a un hongo, resultado de la 
mala limpieza de la planta desde el inicio de la extracción, dejando partículas de hongos en 
la superficie de la planta. En este caso, esto solo se sabría hasta hacer la comparación de 
nuestra secuencia obtenida con las que se encuentran en el GenBank. Otro inconveniente 
consiste en la dificultad para obtener secuencias de buena calidad, lo cual es difícil en 
comparación con las secuencias que se obtienen al amplificar la región del rbcL. 
En cuanto al gen matK, no se pudieron obtener secuencias de buena calidad para ser 
comparadas con la base de datos de NCBI, a pesar de que se probaron varios condiciones 
de PCR variando la temperatura y tiempo de alineamiento de los primers, pero todas ellas 
sin éxito. Se concluyó que la reacción en cadena de la polimerasa generaba estructuras 
secundarias con los primers utilizados, no permitiendo que estos se unieran al extremo 
5´de la secuencia a amplificar. 
En el presente trabajo también se realizó el desarrollo experimental preliminar para 
determinar la actividad inhibitoria de extractos de ciertas especies selecionadas de las 
familias de plantas Clusiaceae, Calophyllaceae algunas especies del género Vismia y del 
género Amphyterygium, estas ultimas muestras proporcionadas por Rocio Gómez Cancino, 
sobre la enzima proteasa del VIH-1. Se eligieron los extractos crudos de especies 
mexicanas pertenecientes a estas debido a que plantas procedentes de Sri Lanka 
pertenecientes a la familia Calophyllaceae presentaron compuestos que inhiben enzimas 
involucradas en la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (la transcriptasa 
reversa). Teniendo como sustento que especies pertenecientes a la familia Calophyllacea 
presentaban este efecto inhibidor de la transcriptasa reversa, quisimos conocer si estos 
 
 
 
57 
 
efectos también podía tener como blanco la enzima proteasa, presente de igual manera en 
el ciclo de replicación del VIH-1, pero no solo es interesante saber si los extractos inhiben a 
la enzima proteasa, sino también estudiar si familias cercanas a la familia Calophyllacea 
podían presentar este efecto inhibidor, teniendo en cuenta la relación evolutiva que existe 
entre las familias Calophyllacea, Clusiaceae e Hypericaceae. Con estos antecedentes se 
procedió a determinar si los compuestos presentes en los extractos crudos presentaban 
esta actividad antiviral sobre la proteasa del VIH. 
Como control positivo se ocupó Pepstatina A, compuesto que presento el mayor porcentaje 
de inhibición (mayor al 77%). En los ensayos efectuados algunos de los extractos probados 
obtuvieron un porcentaje de inhibición arriba del 50%, esto resulta prometedor. Sin 
embargo, al repetir múltiples veces este ensayo se tuvieron varias dificultades, ya que los 
datos no fueron reproducibles, por lo que los resultados no pueden considerarse 
concluyentes. Lo anterior se atribuye en primera instancia a las condiciones de 
almacenamiento y transporte del kit ajenas a nosotros por ser un producto de importación, 
pues el tiempo que permanecían los Kits en la aduana eran meses y se duda que en 
condiciones de refrigeración. 
 
11. Conclusiones 
En el presente trabajo se realizó el estudio filogenético entre distintas especies de las 
familias Clusiaceae y Calophyllaceae, utilizando secuencias provenientes de ADN núcleo- 
ribosomal y ADN de cloroplastos. Al hacer la comparación entre las secuencias resultantes 
se concluyó que la región que se puede ocupar como marcador genético y por lo tanto 
como código de barras debido a su divergencia genética fue el ITS, recordando que la 
construcción de un árbol filogenético se basa en un carácter a comparar, esto es importante 
ya que se debe aclarar que la diferenciación de las especies es resultado de la 
diferenciación del ITS para cada especie, pero no solo la divergencia genética es un factor 
importante, ya que los sitios conservados dentro de la secuencia del ITS son útiles para 
 
 
 
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corroborar la pertenencia de las especies a un género en particular. Cabe señalar que 
existen otros genes, como el rbcL o matK, que también pueden ser usados como código de 
barras. En nuestro caso donde solamente ocupamos algunas especies pertenecientes a la 
familia Calophyllaceae y Clusiaceae el gen matK no brindó información consistente