Construccion-de-un-vector-viral-que-contenga-la-secuencia-mnima-promotora-para-el-receptor-a-androgenos-de-rata

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN 
“Construcción de un vector viral que 
contenga la secuencia mínima promotora 
para el receptor a andrógenos de rata.” 
TESIS.
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
Licenciado en Bioquímica Diagnóstica 
Presenta. 
Monserrat Alina Reyes Romero. 
Asesor: 
M en C. Adriana González Gallardo 
Co.Asesor: 
Dr. Raúl Gerardo Paredes Guerrero 
Cuautitlán Izcalli, Estado de México 2017. 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
Agradecimientos y créditos. 
Cambié mi vida, mi tiempo y mi forma de pensar por ti. Hoy doy mi vida, mi alma y mis 
energías por sacarte adelante y enseñarte a vivir. Le pido a la vida que me permita vivir 
muchos años para acompañarte en lo dulce y lo amargo; no puedo vivir tu vida, pero si 
espero que la compartas conmigo. Darte grandes alas para que vueles más alto que yo; no 
quiero que seas como yo; espero que seas mucho mejor. 
 
Agradecimientos y créditos. 
 
Agradecimientos. 
 
El agradecimiento más grande a mi mamá, por cada momento, por cada haz de 
paciencia y tenacidad, por inculcar en mí, el amor a la Universidad Nacional 
Autónoma de México, por nunca dejar de creer que lograría más de lo que yo 
imaginaba y sobre todo, por nunca dejar que hiciera las cosas sola. 
A Dios por que inclusive ahora sigue cambiando mi camino y mis planes, volviéndolos 
mejores de como yo lo pensaba. 
A mi Chata, por el gran amor que me permitió llegar a este punto de mi vida. 
A mi abuelo, que me enseñó el mundo de la medicina y a mi padre por prestarme un 
día aquella revista sobre genética. 
A Rubén y mi tía Karina por ser más que familia, ser hermanos que me han apoyado 
de una u otra forma y hemos compartido muchos momentos juntos que guardo y 
atesoro. 
A mi familia, ya que en cada etapa de desarrollo académico me apoyaron 
abriéndome las puertas de sus casas, tendiéndome la mano para que el viaje fuera 
menos largo y menos pesado. 
Erick, gracias por las pláticas que en ellas encontraba respuestas y preguntas para 
este trabajo, por el amor y por acompañarme al realizarlo, por lo que surgió entre los 
dos y aun ahora continua dándonos lo más bonito de la vida, Mauricio. 
Alfredito Díaz, gracias por los kilómetros recorridos y por saber que cuento con 
usted, tanto de día, como de noche. 
 
A mi segunda casa, la Universidad Nacional Autónoma de México, porque todo lo 
que sé académicamente lo aprendí en sus diversas aulas y laboratorios, por darme 
los mejores maestros en mi área y las mejores oportunidades de desarrollo. Gracias 
Maestros, Gracias Doctores porque en sus palabras encontré conocimiento, pero 
sobre todo preguntas. Se llama UNAM, se apellida Alma Máter, pero le decimos 
segunda casa 
A mis asesores. Maestra Adriana, gracias por su paciencia, enseñanzas e infinito 
apoyo, mostrándome que un asesor da más que su apoyo en el desarrollo de un 
trabajo, enseña y apoya en los momentos de la vida del alumno dejando reflexiones 
y nuevos criterios para la resolución de problemas. Dr. Raúl, por la confianza al 
brindarme la oportunidad en trabajar con su laboratorio. Dra. Edith Garay Rojas, 
gracias por el apoyo y materiales para la realización de las reacciones. 
A la Unidad de Proteogenómica por el ambiente y calidez durante la realización del 
trabajo; a la Dra. Anaid Antarmián, por su paciencia al explicarme muchos aspectos 
sobre la acción de las secuencias promotoras y permitirme realizar el trabajo en la 
unidad. A Michael Jeziorski, por apoyarme en la realización de las reacciones de 
secuenciación. 
A mis amigos y compañeros del Laboratorio D-13, “Conducta sexual y Neurogénesis” 
en especial Enrique Min, Miriam y Alan Márquez, por los momentos de diversión y 
apoyo. Así como la Dra. Wendy Portillo por su calidez. 
A mis amigos Zayra, hoy te puedo decir que estoy aquí y no pasó nada, Cesar, que te 
digo, soy Bioquímica, eso lo dice todo y a Alejandro por los años de amistad en los 
que nos vimos ingresando a la Universidad; cerrando y abriendo ciclos académicos y 
personales. Amigos aún nos falta mucho, gracias por compartir tantos momentos 
increíbles y los que nos faltan por recorrer. 
 
Agradecimientos y créditos. 
 
Créditos. 
 
 
 
El presente trabajo e investigación se realizó gracias al Instituto de Neurobiología de 
la Universidad Nacional Autónoma de México en los Laboratorios de “Conducta 
sexual y Neurogénesis” y la “Unidad de Proteogenómica” bajo la dirección de: 
 
 
 
M en C. Adriana Gonzáles Gallardo. 
Dr. Raúl Paredes Guerrero. 
 
 
 
Y con el apoyo del Sistema Nacional de Investigadores-CONACYT, con el proyecto 
“Construcción de un vector viral que contenga la secuencia promotora para el 
receptor a andrógenos de rata”. 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE. 
Índice de Figuras 10 
Índice de Tablas 11 
Índice de Anexos 12 
Abreviaturas 13 
Simbología 15 
I Introducción 16 
I.I Andrógenos. Definición y Bioquímica 16 
I.II Generalidades del receptor a andrógenos 22 
I.III Mecanismo de acción del receptor a Andrógenos 28 
I.IV Patologías 29 
I.V Generalidades del promotor para andrógenos de rata 31 
I.VI Biología molecular en optogenética, el uso y diseño de vectores virales 32 
II Justificación 43 
III Objetivos 44 
IV Materiales y Métodos 45 
IV.I Obtención de DNA Genómico 45 
*Extracción de DNA genómico 45 
*Cuantificación y pureza del DNA Genómico 45 
IV.II Amplificación de la región mARP de rata 46 
*Diseño de oligonucleótidos 41 
*Optimización de las condiciones de PCR para la amplificación 
de la secuencia mARP a partir de DNA genómico 47 
*Electroforesis 49 
*Purificación del producto de PCR 50 
IV.III Clonación del producto de PCR al vector pGEM®-T Easy 51 
*Ligación del producto de PCR al vector 51 
*Transformación bacteriana Escherichia coli 51 
*Purificación del plásmido pGEM®-T Easy 52 
*Restricción con EcoRI 53 
*Secuenciación del plásmido pGEM®-T Easy 54 
 
 
IV.IV Amplificación de la secuencia mARP a partir del plásmido pGEM®-T Easy 54 
*Diseño de oligonucleótidos 54 
*Optimización de las condiciones de PCR para la amplificación 
de la secuencia mARP a partir del plásmido pGEM®-T Easy 55 
*Purificación de la secuencia 57 
*Secuenciación del producto de PCR 58 
IV.V Clonación de la secuencia mínima promotora para el receptor a andrógenos en 
el vector de Optogenética 58 
IV.V.I Preparación de la secuencia mínima promotora para el receptor a 
andrógenos para la ligación 58 
IV.V.II Construcción de los vectores para optogenética 53 
*Restricción de los vectores de clonación para optogenética 53 
*Purificación de los vectores 57 
*Defosforilación de los vectores. 57 
IV.V.III Ligación de la secuencia mínima promotora para el receptor a 
andrógenos al vector de optogenética 61 
*Ligación 61 
*Purificación del plásmido lentiviral para optogenética 62 
*Restricción del plásmido lentiviral para optogenética 62 
IV.VI Producción de partículas virales 63 
*Cultivo celular 63 
*Pase celular 63 
*Producción viral 64 
*Transfección con Polietanolamina (PEI) 64 
*Recolección viral 66 
*Concentración de las partículas virales 67 
*Infección de partículas virales control a células HEK 293. 67 
V Resultados 68 
V.I Amplificación de la región mARPa partir de DNA genómico 68 
*Extracción, purificación y cuantificación de DNA genómico 68 
*Optimización de las condiciones de PCR para la amplificación de la 
secuencia mARP a partir de DNA genómico 69 
V.II Clonación de la secuencia mARP en el plásmido pGEM®-T Easy 71 
*Ligación de la secuencia mARP en el plásmido pGEM®-T Easy 71 
*Transformación de bacterias 73 
*Purificación del plásmido 73 
*Restricción con EcoRI 74 
*Secuenciación del vector pGEM®-T Easy 75 
V.III Construcción de los vectores de optogenética 79 
*Amplificación de la secuencia mARP a partir del mARP-pGEM®-T
Easy 79 
*Preparación de los vectores de clonación para optogenética 86 
*Ligación de la secuencia mARP al vector de optogenética 89 
*Restricción del plásmido de optogenética 90 
*Secuenciación del Plásmido de Optogenética 91 
V.IV Producción de partículas virales 96 
*Infección de partículas virales control a células HEK293 96 
VI Discusión 97 
VIII Conclusiones 113 
VIIIa Perspectivas 114 
IX Referencias 115 
X Anexos 127 
Anexo I CLONACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR AL VECTOR pGEM®-T Easy 127 
Anexo II CLONACIÓN DE LA SECUENCIA mARP EN EL PLÁSMIDO DE OPTOGENÉTICA. 128 
Anexo III VECTOR pHR-SIN SEWe 135
 
Índice de Figuras. 
Figura 1 Mecanismo de regulación para la hormona testosterona. 17 
Figura 2 Estructura de los andrógenos 18 
Figura 3 Biosíntesis de los estrógenos 20 
Figura 4 Esquematización del receptor a andrógenos 22 
Figura 5 Superfamilia de receptores nucleares humanos 26 
Figura 6 Estructura del dominio de unión a ligando de AR 27 
Figura 7 Unión del dominio DBD a las secuencias de DNA ARE 29 
Figura 8 Rodopsinas en optogenética 34 
Figura 9 Ciclo de replicación lentiviral 37 
Figura 10 Estructura genética no modificada de VIH 40 
Figura 11 Representación esquemática de la tercera generación del sistema lentiviral. 42 
Figura 12 Amplificación de la región mARP 71 
Figura 13 Mapa del vector pGEM®-T Easy 72 
Figura 14 Transformación de bacterias XL Blue con pGEM®-T Easy 73 
Figura 15 Restricción con EcoRI 75 
Figura 16 Electroferograma del vector pGEM®-T Easy-mARP sentido 3'-5' 76 
Figura 17 Electroferograma del vector pGEM®-T Easy-mARP sentido 5'-3' 77 
Figura 18 Alineamiento de la secuencia para la región mARP 78 
Figura 19 Mapa de restricción del vector Lentiviral 80 
Figura 20 Mapa de restricción del vector Adenoviral 80 
Figura 21 Mapa de restricción de la región mARP amplificada 81 
Figura 22 Amplificación de la región mARP para Lentivirus 83 
Figura 23 Amplificación de la región mARP para Adenovirus 84 
Figura 24 Restricción de la secuencia mARP para MluI 85 
Figura 25 Restricción del vector Adenoasociado 87 
Figura 26 Restricción para el vector Lentiviral 88 
Figura 27 Restricción para el vector de Optogenética 91 
Figura 28 Secuenciación 3’-5’ clona 2 Optogenética. 92 
Figura 29 Secuenciación 3’-5’ clona 9 optogenética. 93 
Figura 30 Secuenciación parcial del vector de Optogenética. 94 
Figura 31 Mapa de restricción del vector Lentiviral modificado con la región mARP 95 
Figura 32 Células HEK 293 infectadas con virus control. 96
 
Índice de Tablas. 
Tabla 1 Oligonucleótidos para la amplificación genómica de mARP 47 
Tabla 2 Reactivos utilizados para la PCR punto final con gradiente de temperatura 48 
Tabla 3 Programa del termociclador para la PCR para la amplificación de la secuencia mARP a 
partir de DNA genómico. 49 
Tabla 4 Oligonucleótidos con sitios de restricción para la amplificación de la secuencia mARP 55 
Tabla 5 Programa del termociclador para la PCR 56 
Tabla 6 Condiciones de la amplificación para la región mARP con los sitios de restricción para 
Lentivirus 57 
Tabla 7 Mezcla de plásmidos para la transfección 65 
Tabla 8 Mezcla de plásmidos para la transfección control 65 
Tabla 9 Mezcla de reacción para la transfección 66 
Tabla 10 Resultado de la extracción de DNA genómico 68 
Tabla 11 Oligonucleótidos para la amplificación de la región mARP 69 
Tabla 12 Combinaciones de oligonucleótidos utilizadas 70 
Tabla 13 Gradiente de temperatura. Condiciones de amplificación para cada muestra 70 
Tabla 14 Resultados de la extracción y purificación del plásmido 74 
Tabla 15 Oligonucleótidos con sitios de restricción para la amplificación de la región mARP 82 
Tabla 16 Purificación de la reacción de amplificación con los oligonucleótidos con sitios de 
restricción 85 
Tabla 17 Resultado de la purificación de Vectores de Optogenética 88 
 
Índice de Anexos. 
Anexo I Clonación del producto de PCR al vector pGEM®-T Easy 
Tabla 1. Reactivos utilizados para la ligación. 127 
Tabla 2. Reactivos utilizados para la restricción con la enzima EcoRI 127 
Anexo II Clonación de la secuencia mARP en el plásmido de Optogenética. 
Tabla 1. Reactivos utilizados para la PCR punto final para la amplificación con los 
oligonucleótidos diseñados con los sitios de restricción. 128 
Tabla 2. Reactivos utilizados para la restricción con BamHI 128 
Tabla 3. Reactivos utilizados para la restricción con MluI 129 
Tabla 4. Reactivos utilizados para la restricción PacI 129 
Tabla 5. Reactivos utilizados para la defosforilación de los vectores 129 
Tabla 6. Reactivos utilizados para la ligación al vector de optogenética. 130 
Figura 1. Electroferograma con los sitios de restricción para MluI 131 
Figura 2. Electroferograma con los sitios de restricción para BamHI 132 
Figura 3. Electroferograma con los sitios de restricción para PacI 133 
Figura 4. Electroferograma con los sitios de restricción para BamHI. 134 
Anexo III VECTOR pHR-SIN SEWe 
Figura 1 Mapa del vector pHR-SIN SEWe 135 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abreviaturas. 
 
- Negativo 
+ Positivo 
A Adenina 
Acetil-CoA Acetil coenzima A 
ACTH Adrenocorticotrópica hipofisiaria 
ACTH Hormona adrenocorticotropa 
agar LB Agar Luria-Bertani 
AR Receptor a andrógenos 
AR-A Receptor a andrógenos tipo A 
AR-B Receptor a andrógenos tipo B 
ARE Elementos de respuesta a andrógenos 
bp Par de base 
C# Carbono 
C Citocina 
caja TATA Secuencias repetidas de Timina y Adenina 
cDNA DNA complementario 
CO2 Dióxido de carbono 
DBD Dominio de unión a DNA 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
dNTP Desoxirubonucleótido trifosfatado 
EDTA Ácido etilendiaminotetracético 
eNpHR 
Halorodopsina de Nastronomonas spp. Para aplicación en optogenética 
mejorada. 
ER-a Receptor a estrógenos alfa 
ER-b Receptor a estrógenos beta 
EYFP Proteína amarilla fluorescente mejorada 
FTa Fase tardía 
FTe Fase temprana 
G Guanina 
GnRH Hormona liberadora de gonadotrofina 
gp Glicoproteína 
GR Receptor a glucocorticoides 
GRE Elementos de respuesta a corticoides 
HIV Virus de inmunodeficiencia humana 
 
HIV-1 Virus de inmunodeficiencia humana serotipo 1 
Hsp Chaperona 
HBSS Solución balanceada en sales Hank’s 
IPTG Isopropil-β-D-1-TIOGALACTOPIRANOSIDO 
 
Kb Kilo base 
kDa Kilo daltones 
Lac Lactosa 
LDL Lipoproteína de baja densidad 
LH Hormona luteinizante 
LTRs Región de repetidos largos en tándem 
mARP Región mínima promotora para el receptor a andrógenos 
N Nitrógeno 
NADPH Nicotinamin dinucleótido fosfato 
NH2 Grupo amino 
NLS Sitio de unión nuclear 
NTD Región amino terminal 
O2 Oxígeno 
pAAV Plásmido de virus Adenoasociado 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
PEI Polietanolamina 
pH Potencial de Hidrógeno 
pLenti Plásmido de virus lentiviral (pLenti-mARP-eNpHR 3.0-EYFP) 
PPT Tramos de polipurinas 
RNA Ácido ribonucleico 
RNATD Región amino terminal del receptor a andrógenos 
RRE Elementos rev-responsive 
SDS Dodecilsulfato sódico 
SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida 
T Timina 
TAR Región de activación TAT 
Tm Temperatura de fusión 
V2.0 Versión 2.0 
V.V Vector viral 
X-GAL 5-Bromo-4-cloro-3-indolyl β-D-galactopiranósido 
 
 
 
 
 
Simbología. 
Unidades de concentración 
uM Micro molar 
mM Mili molar 
M Molar 
 
Unidades de distancia 
cm Centímetro 
 
Unidadde frecuencia 
rpm Revoluciones por minuto 
 
Alfabeto griego 
 alpha 
 beta 
 phi 
 
Unidades de peso 
ng Nanogramo 
ug Microgramo 
mg Miligramo 
 
Unidades de temperatura 
°C Grado Celsius 
 
Unidad de tiempo 
s Segundo 
min Minuto 
h Hora 
 
Unidades de volumen 
uL Microlitro 
mL Mililitro 
 
Otra Simbología 
® Marca registrada 
™ Marca no registrada 
% Porcentaje 
16 
I) INTRODUCCIÓN 
I.I ANDRÓGENOS. DEFINICIÓN Y BIOQUÍMICA. 
Los andrógenos son moléculas proteicas con acción hormonal, las 
cuales tienen un importante impacto en la expresión de las características 
fenotípicas. En los individuos masculinos, desarrollan caracteres primarios y 
secundarios interviniendo en el proceso de espermatogénesis, aunque sus 
acciones parecen estar mediadas por las células de Sertoli (Brikmann, 2011, 
Silverthorn, 2009). En los individuos femeninos, se observa que estos 
intervienen durante los procesos menstruales, en el embarazo, en el que se 
ve que la testosterona circulante es convertida a estrógenos en la placenta. 
Las células encargadas de la producción hormonal son los gónadas, 
estas proveen principalmente los niveles de testosterona en suero (Luu-The 
& Bélanger A, 2008). La producción se observa en mayor medida en los 
individuos masculinos ya que los testículos, particularmente las células de 
Leydig, secretan en mayor medida la hormona al torrente sanguíneo 
(Silverthorn, 2009); estas células también secretan precursores androgénicos 
como pregnenolona y progesterona y son estimuladas por la hormona 
luteinizante. En los individuos femeninos la producción de estas hormonas se 
encuentra en las células de la teca en los ovarios (Voet, 2006). Otras células 
que regulan en menor medida la producción hormonal, son el hígado y las 
células de la zona reticular de las glándulas suprarrenales. 
17 
La producción hormonal está regulada por un mecanismo de 
retroalimentación (ver Figura 1). 
 
FIGURA. 1. Mecanismo de regulación para la hormona testosterona. La GnRH producida 
en el hipotálamo, actúa sobre la hipófisis anterior estimulando la producción de LH y FSH. 
La LH estimula la producción y liberación de testosterona por las células de Leydig del 
testículo. A medida que la testosterona en circulación sanguínea aumenta, la producción 
de GnRH por parte del hipotálamo se inhibe. La Testosterona también influye sobre la 
hipófisis mediante la supresión de la producción de LH. Como consecuencia de estos 
efectos inhibidores combinados, la secreción de LH por la hipófisis reduce. La FSH actúa 
sobre las células de Sertoli, las cuales reducen la hormona proteica inhibina. Esta hormona, 
a través de otra vía de retroalimentación negativa, inhibe la formación de FSH en la 
hipófisis. (Curtis, 2008) 
18 
Las células productoras de andrógenos se distinguen de las 
esterogénicas debido a que no se encuentra co-localización de citocromo 
P450c17 (CYP17) y el citocromo b5. (Azziz, 2006; Voet, 2006). 
FIGURA 2. Estructura de los andrógenos. Estructuras de los andrógenos más comúnmente 
estudiados. (Azziz, 2006). 
La biosíntesis de las hormonas activas se realiza mediante la vía de la 
5-reductasa y aromatasa (Figura 2, Figura 3), la cual ha sido reconocida 
como la vía activa de formación de las hormonas, esta se realiza en las 
células de Leyding de los testículos en los casos del sexo masculino bajo la 
influencia de la LH (Luu-The & Bélanger A, 2008). El punto de partida de la 
biosíntesis de los andrógenos se encuentra en el colesterol, el cual es 
captado del plasma en forma de LDL-Colesterol o bien a partir del colesterol 
esterificado de las células, en ausencia de estas fuentes la producción de 
novo es a partir de acetil-CoA (Teijón Rivera J, 2006). El primer paso consiste 
en la separación oxidativa de una unidad de C6 de la cadena lateral del 
colesterol. Para ello son importantes dos hidroxilaciones y una reacción de 
19 
liasa, la monooxigenasa proveniente del Citocromo P-450, la 17 a-
hidroxylasa/17,20 –liasa, hidroxila en los carbonos C20 y C22, rompiendo el 
enlace sencillo, con la formación de un grupo ceto en C20 hasta la formación 
de 17-pregnenolona (C21). Este proceso implica la utilización de NADPH y O2 
(Teijón Rivera J, 2006). La oxidación del grupo 3-hidroxi a 3-oxo y la 
isomerización del doble enlace a genera finalmente 17-
hidroxiprogesterona, el precursor de la hormona y del cortisol, el cual es 
hidrolizado en C17; una liasa rompe oxidativamente el fragmento C2 
remanente de la cadena lateral, con lo que se origina androstediona, con dos 
grupos ceto en C3 y C17. La androstediona es el precursor común para los 
andrógenos y estrógenos. La reducción del grupo ceto-C17 rinde testosterona 
con un grupo ceto-C3, el andrógeno más común, el cual será posteriormente 
reducido a dehidrosterona por la 5-reductasa (Müller-Sterl, 200; Teijón 
Rivera J, 2006). Así pues toda la maquinaria enzimática que trabaja en esta 
biotransformación, es absolutamente específica para cada posición del 
esqueleto de carbono de no ser así se deriva en trastornos tanto físicos como 
psicológicos para el individuo, tal es el caso del déficit de 21-hidroxilasa en la 
cual la disminución de la síntesis esteroidea aumenta la secreción de la 
hormona adrenocorticotrópica hipofisiaria (ACTH) al disminuir el control que 
realizan habitualmente las hormonas periféricas por retrocontrol. La 
consecuencia es un aumento en la síntesis de progesterona que deriva hacia 
la síntesis de andrógenos, produciendo virilización en la niña y en el niño 
signos de madurez sexual prematura, en ambos sexos aceleración en el 
crecimiento y calcificación temprana de los núcleos de osificación con tallas 
finales pequeñas (Teijón Rivera J, 2006) (Luu-The & Bélanger A, 2008). 
20 
 
FIGURA 3. Biosíntesis de los estrógenos. Representación esquemática de la biosíntesis de 
los estrógenos, Dehidroproepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona 
(DHEAS), sulfato de dehidroproepiandrosterona, (DHEA sulfato), dihidrotestosterona (DHT) 
re hisroxiesteroi-deshidrogenasa (HSD). Tomado de Luu-The & Bélanger A, 2008. 
En el cerebro se observa que los andrógenos participan en aspectos 
importantes del desarrollo del sistema nervioso central, en la formación de 
circuitos neurológicos, y en el mantenimiento de las funciones durante la 
adolescencia. Están involucrados en la organización de circuitos neuronales 
durante periodos críticos del desarrollo adulto, en la organización para la 
programación de los circuitos neuronales durante periodos críticos del 
desarrollo fetal y de igual forma activan una variedad de conductas 
reproductivas y no reproductivas tales como la sexualidad y la agresión. 
Junto con los estrógenos, los andrógenos son responsables de muchas 
diferencias de género, incluyendo conductas dimórficas, las cuales pueden 
ser causadas por dos tipos de efectos de los andrógenos. Primero, estos 
tienen la capacidad de alterar permanentemente la estructura o el potencial 
funcional del cerebro durante el desarrollo, en segunda instancia, los efectos 
21 
en el comportamiento pueden ser activados temporalmente por una acción 
aguda de los andrógenos. Sin embargo, la identificación de los efectos puros 
que provocan los andrógenos en las neuronas, resulta complicado debido a la 
complejidad que desatan las vías de señalización esteroideas. 
En cuanto a la distribución cerebral que presentan los receptores, 
estudios de identificación neuronal han mostrado que se distribuyen en las 
zonas del proencéfalo, mesencéfalo, hipotálamo y médula espinal, de igual 
forma la cantidad de receptores que se halla entre las neuronas de una 
región y otra, es diferente entre los sexos. Esto implica que la conducta que 
puede desplegar uno y otro sexo esta mediada, entre otras cosas, por las 
neuronas andrógenicas. Estudios de tinción nuclear, evaluaronla expresión 
del AR en el cerebro humano, observando que ésta se aumenta en el cuerpo 
mamilar y en el hipocampo. A pesar de ello, el conocer la distribución de los 
receptores en las regiones cerebrales, no dilucida completamente el papel 
del área y el receptor en la modulación hormonal, pero aporta información 
importante (Li, 2009), por ejemplo, la región basolateral de la amígdala se 
encuentra involucrada en la respuesta que dan los andrógenos a las 
conductas agresivas. Pruebas realizadas muestran que una elevación de los 
receptores en las neuronas androgénicas provoca que se desplieguen 
conductas más agresivas comparado con los individuos con valores basales 
(Li, 2009). 
22 
I.II GENERALIDADES DEL RECEPTOR A ANDRÓGENOS. 
El receptor a andrógenos pertenece a la familia de receptores 
esteroideos (Figura 5), al subgrupo de la superfamilia de receptores 
nucleares, posee un rol de regulación transcripcional. Genéticamente la 
secuencia codificante para el receptor se encuentra localizada en el 
cromosoma X en el locus Xq11-Xq12, la región codificante comprende 2757 
nucleótidos que codifican para 8 exones, con intrones de tamaño variado que 
van desde los 0.7 hasta las 2.6kb. El producto es una proteína con un peso 
total de 110 kDa con 919 aminoácidos (Figura 4). El receptor posee dos 
isoformas, una de 87 KDa (AR-A) y otra de 110 kDa (AR-B). La isoforma A es 
una isoforma trunca de 187 aminoácidos en la región amino terminal (Eileen 
TAN, 2014 ; Li, 2009). 
FIGURA 4. Esquematización del receptor a andrógenos. Organización estructural del gen 
para el receptor a andrógenos en el locus Xq11.2-q12 del cromosoma X y la organización 
estructural el producto proteico. Obtenido de O. Brikmann, 2011. 
23 
Los andrógenos ejercen su acción específica mediante la utilización del 
receptor, el cual regula la transcripción de genes diana andrógeno sensible. 
Así pues AR es un factor de transcripción ligando-dependiente involucrado en 
la regulación diferencial de varios procesos fisiológicos transmitiendo el 
mensaje tanto de andrógenos naturales como sintéticos. Dentro de los 
eventos que se desatan tras la unión del ligando a su receptor es la iniciación 
de la diferenciación y desarrollo sexual durante la etapa juvenil (Makkonen 
H, 2011; Matsumoto, 2003). Este complejo juega un papel esencial en gran 
variedad de procesos fisiológicos, no solo en procesos reproductivos y de 
desarrollo de estructuras sexuales, tales como son la maduración de los 
conductos Wolffianos o la espermatogénesis, sino también en la regulación 
por si misma del receptor. 
El receptor está conformado por cuatro unidades funcionales que se 
describen a continuación: 
1) Una región amino terminal (NTD) con función de transactivador 
ó dominio A/B, que comprende del residuo 1-555, la cual es una 
región poco conservada que ocupa más de la mitad del tamaño del 
receptor, codificada por el exón 1. Esta región se ve afectada por el 
largo de los polipéptidos de glutamina los cuales, afectan 
directamente el tamaño del -hélice, estos cambios impactan 
conformacionalmente con la estructura proteica lo cual tiene un 
efecto en la interacción proteína-proteína. La disminución en los 
repetidos provoca reducción en la actividad, el aumento en estos 
deriva en una elevación en la actividad mientras que la eliminación 
24 
causa un incremento en la actividad hasta de 4 veces comparado 
con la proteína silvestre, lo cual explicaría la dependencia del 
receptor con la actividad transcripcional en el largo de los repetidos 
de poliglutamina. La estructura de la región permite la interacción 
con regiones proteicas de unión a caja TATA, factor de transcripción 
IIF y con la región intramolecular denominada LBD. Las interacciones 
con múltiples ligandos, son altamente específicas pero de poca 
afinidad esto sugiere que la región juega un papel crucial en la 
actividad del receptor (Eileen TAN, 2014) (Li, 2009) (Kun Lee, 2003). 
Hay estudios que muestran que adicionalmente el receptor 
posee una región que estabiliza los dímeros AR/ARE del complejo 
(Eileen, 2001; Matsumoto, 2003). 
2) Dominio de unión a DNA (DBD), que comprende los residuos 
555-623. Esta región es rica en cisteína y altamente conservada 
entre los receptores esteroideos. Estructuralmente la región está 
compuesta por un núcleo de dos dedos de zinc, cada uno con cuatro 
residuos de cisteína los cuales coordinan el anillo. Esta zona se une a 
elementos de unión de DNA (IR3) los cuales son medios sitios 
hexaméricos (5’-AGAACA-3’) separados por 3 pares de bases. La -
hélice del dedo de zinc ubicado en la región amino terminal (la 
hélice de reconocimiento), interactúa directamente con los 
nucleótidos de respuesta hormonal en el surco mayor del DNA. Los 
últimos tres aminoácidos ubicados en la región amino terminal 
denominados como caja P, son dominios conservados entre los 
25 
receptores a progesterona, mineralocorticoides, glucocorticoides y 
son responsables del reconocimiento específico de los elementos de 
respuesta a DNA. Paralelamente, la región contiene elementos ARE, 
los cuales permiten la activación específica del receptor; estos 
elementos poseen sitios intermedios hexaméricos en una 
orientación repetida. La selectividad del receptor está entrelazada a 
estos elementos, debido a la dimerización que posee este a través 
de la región distal y la región ASRND (secuencia de 4 aminoácidos) 
que permite que el receptor se una a la región del promotor (Eileen 
T, 2014; Li, 2009; Matsumoto, 2003; O. Brikmann, 2011.) 
3) Región pequeña de unión de la región DBD y carboxi-terminal, 
que comprende de los residuos 623-665. (Eileen TAN, 2014; Li, 
2009; O. Brikmann, 2011). 
4) Un dominio carboxi- terminal de unión a ligando (LBD) (Figura 6), 
comprende los residuos de 665-919, el cual se encuentra conectado 
a la región DBD por una secuencia flexible de 42 aminoácidos 
denominada LBD (Residuos 623-665) (Eileen TAN, 2014). 
26 
 
FIGURA 5. Superfamilia de receptores nucleares humanos. Comparación estructural de la 
súper familia de receptores nucleares humanos. Los receptores nucleares como el receptor 
a andrógenos (AR), glucocorticoides (GR) estrógenos alpha (ER-) y estrógenos beta (ER-
muestran similitudes estructurales en el dominio NH2-terminal, en el dominio de unión 
a DNA (DBD), y en el dominio de unión hormonal (HBD). El dominio NTD es un dominio 
poco homologo entre los receptores, mientras que DBD es un dominio con alta homología 
entre ellos. Tomado de Li, 2009. 
27 
 A) B) 
C) D) 
FIGURA 6. Estructura del dominio de unión a ligando de AR. Imagen tridimensional de la 
estructura del dominio de unión a ligando de AR en la cual se puede apreciar las 
estructuras de alpha hélice y beta plegada así como la unión al ligando 5-
dihidrotestosterona en cada imagen. La imagen A muestra una vista frontal del dominio, 
la imagen B, muestra una visión posterior al dominio. La vista C muestra la vista lateral 
derecha y la imagen D la vista lateral izquierda. Obtenida de Sack, 2001. 
Los niveles de expresión de AR varían de acuerdo al tejido, 
observándose mayormente en los órganos reproductivos y en menor medida, 
en órganos como el cerebro, riñones y hueso. 
28 
I.III Mecanismo de acción del receptor a andrógenos. 
La unión del ligando al receptor induce un cambio conformaciónal en 
éste, permitiendo la translocación nuclear del receptor mediante la 
importina , el aumento en la fosforilación, la formación de homodímeros y 
la interacción con el DNA. Es solo hasta que suceden estos eventos que el 
dímero del receptor se une a los elementos ARE. Una vez sucedido esto se 
reclutan un número de moléculas y complejos co-reguladores que sustentan 
el control transcripcional ligando-dependiente (K. Glass, 2000). Así pues, 
estudios han mostrado que la actividad transcripcional de AR está regulada 
por co-reguladoresdel AR tales como GATA-2, AR-FOXA1 y Oct1, los cuales 
impactan la selectividad y la ubicación en las regiones reguladoras de los 
elementos diana y activamente reclutan cofactores esenciales, para proceder 
al ensamblaje de la maquinaria transcripcional requerida para regular la 
expresión de los genes sensibles a andrógenos. Varios modelos de 
dimerización se han descrito para formación de los complejos con AR. La 
interacción más caracterizada es la dimerización mediada por DBD, la cual es 
esencial para la unión del receptor con el DNA y a su vez, la regulación de la 
transcripción. Interacciones adicionales potenciales en la dimerización, 
incluyen interacciones intermoleculares, entre RNATD y LBD conocidas como 
interacciones N/C y la dimerización LBD (Chiu Chan, 2014; Li, 2009). 
En su estado libre el receptor se encuentra ubicado en el citoplasma, 
formando un complejo con las chaperonas Hsp40, Hsp70 y Hsp90, el cambio 
conformacional del receptor que sucede con la unión al ligando provoca que 
29 
se exponga un sitio nuclear (NLS), el cual puede unirse a proteínas 
importadoras nucleares como son la importina , este complejo facilita la 
translocación del receptor al núcleo. Una vez en núcleo, el complejo forma 
dímeros con los elementos ARE y elementos enhancer específicos de genes 
diana los cuales son regulados por la actividad del receptor (Chiu Chan, 2014; 
Li, 2009). 
 
FIGURA 7. Unión del dominio DBD a las secuencias de DNA ARE. Se aprecia la unión 
proteica a la doble hélice de DNA (color morado) Obtenido de Shaffer, 2004. 
 
I.IV Patologías. 
La inhibición de la biosíntesis de los andrógenos o la disfunción del 
receptor, desencadenan durante la etapa fetal, un arresto de la formación de 
estructuras andrógeno-dependientes, lo que deriva en una masculinización 
inefectiva o nula, síndrome de feminización testicular, síndrome de 
insensibilidad a los andrógenos, que implica una respuesta nula de las 
células a responder a los andrógenos, cáncer de próstata, hipertrofias, 
neoplasia y disfunción de neuronas motoras (enfermedad de Kennedy), estos 
30 
desórdenes se observan principalmente en individuos masculinos (Eileen, 
2014; Matsumoto, 2003; S. Song, 1993) 
Otra de las patologías que se desarrolla es el seudohermafroditismo. 
En el caso de seudohermafroditismo masculino hay mutaciones en la zona 
DBD; los individuos afectados presentan niveles normales de andrógenos y 
un cariotipo normal. Al tener mutada la zona DBD las células de estos 
individuos no responden a los andrógenos originando un cuadro conocido 
como feminización testicular. La hiperplasia suprarrenal congénita, la cual es 
una de las causas de seudohermafroditismo femenino, en su mayoría de las 
veces implica la mutación de tipo recesivo del gen para 21-hidroxilasa. Este 
déficit enzimático implica la disminución de cortisol que en la hipófisis 
ocasiona un incremento en la liberación de ACTH, con hipertrofia del clítoris 
que en algunos casos puede confundirse con un pequeño pene. En la etapa 
adulta, se deriva en hirsutismo y alteraciones en los periodos menstruales 
(Oliva, 2004). 
Las causas de estas patologías son mutaciones en las secuencias, las 
cuales son por inserciones o eliminación de nucleótidos que provocan 
movimientos en los marcos de lectura, mutaciones puntuales por sustitución 
que provocan la generación del codón de paro, eliminaciones parciales o 
totales o bien mutaciones en los intrones lo cual afecta el proceso de corte y 
empalme splicing en el RNA (Eileen TAN, 2014). 
En el cerebro se han realizado diferentes estudios en animales, 
principalmente en rata, en los cuales se ha observado que el daño en 
31 
estructuras cerebrales tales como el área preóptica, el núcleo preóptico 
medial y en las estructuras cerebrales límbicas provoca la disminución de las 
concentraciones de testosterona sérica y por ende del libido (Antonio-
Cabrera, 2012; Portillo, 2006). 
I.V GENERALIDADES DEL PROMOTOR PARA ANDROGENOS DE RATA. 
Como ya es conocido, la transcripción de cada gen está controlada por 
regiones de DNA próximas al lugar donde se inicia la transcripción y a 
complejos proteicos, las cuales reconocen y se unen a las secuencias de 
regulación. 
De manera general, los promotores poseen secuencias consenso tales 
como la caja TATA o CCAAT las cuales sirven como iniciadores de 
transcripción. En 1990 Barend y cols. describieron la secuencia promotora 
para el receptor a andrógenos de rata, mediante un protocolo experimental 
que implicó técnicas de clonación y ensayos con S1-nucleasa, observando 
precisamente que esta secuencia no posee los sitios convencionales de los 
promotores, describiendo otras secuencias regulatorias tales como los 
elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE), una región hipervariable 
ubicada en el extremo 5’ (sitio de splicing), una región rica en GC que está 
comprendida de -1 a -300 y sitios de transcripción tales como SP1 que 
comprende los sitios -50 a -56; C/EBP en -1197; un elemento de unión de 
factores nucleares perteneciente a la familia de proteínas oncogénicas ets 
32 
ubicadas en los sitios -91,-402,-1502 y -193, un homebox de Drosophila para 
la proteína Zesta y el dedo de unión a zinc Zift268 en la posición -52 y -60. 
Adicionalmente se encuentran motivos consenso ubicados para la unión de 
proteínas PEA3 en -40., -1501 y -2148 así como para la proteína NFkB (en -
491 y para el heterodímero para fos/jun (AP1) en -93 y -2525 (S. Song, 1993). 
Dentro de los elementos regulatorios, en 1993 se encontró un región distal 
ubicada 2.6 Kb río arriba del promotor, es un elemento transactivador en 
posición cis; de igual forma en 1993 se encontraron elementos 
palindrómicos a los receptores andrógeno/glucocortico/progestéricos en las 
posiciones -179, -435, -507, -903, -1392 y -1479, mientras que en la posición -
621 se ubicó un medio sitio para el receptor a estrógenos (AGGTCA), lo cual 
implica que posiblemente el receptor se puede unir a esta secuencia 
palindrómica y dar una regulación de tipo esteroide al receptor para 
andrógenos (S. Song, 1993). 
 
I.VI BIOLOGÍA MOLECULAR EN OPTOGENÉTICA, EL USO Y DISEÑO DE 
VECTORES VIRALES. 
En la última década, la investigación en neurociencias se ha centrado 
en la utilización de la optogenética; una búsqueda realizada en la base de 
datos de National Center for Biotechnology and Information en febrero de 
2017 con el término “optogenetics” arrojó aproximadamente 3688 
resultados. Esta técnica es actualmente una de las más usadas para el 
entendimiento del funcionamiento celular neuronal. Se basa en el control o 
33 
monitoreo de la actividad neuronal e implica la combinación de 
métodos genéticos y ópticos, para controlar eventos específicos en 
ciertas células de tejidos vivos, incluso de mamíferos y otros animales, con la 
precisión temporal necesaria (en la escala temporal del milisegundo) para 
mantener el ritmo intacto de funcionamiento de los sistemas biológicos. La 
razón de este control tan rápido y preciso reside en el uso de la luz como 
agente inductor (Boyden, 2011; Knöpfel, 2012). 
La optogenética abarca el desarrollo de proteínas sensibles a la luz 
(naturales o modificadas químicamente), denominadas opsinas (Figura 8), las 
estrategias para introducir los genes que codifican dichas proteínas en las 
células o tejidos diana y por último la generación de sistemas de detección de 
los cambios de comportamiento producidos en dichas células y tejidos. Las 
opsinas, son proteínas con siete dominios transmembranales con un 
cromóforo, el retinal, son proteínas fotosensibles, las cuales están 
categorizadas en rodopsinas transportadoras (bombas de cloro sensibles a la 
luz y bombas de protones sensibles a la luz, archeorodopsinas, 
proteorodopsinas etc), y rodopsinas sensoriales (channelrodopsinas) 
(Boyden, 2011; Han, 2012). Para introducir los genesque codifican para estas 
proteínas en las neuronas es necesario el uso de V.V, generalmente 
Lentivirus y virus Adenoasociados los cuales poseen un genoma estructurado 
que incluye una secuencia promotora y una secuencia para la generación de 
una proteína reportera. 
34 
FIGURA 8. Rodopsinas en optogenética, Esquema de rodopsinas utilizadas en 
optogenética. (A) La chanelrodopsina es una proteína transmembranal que transporta de 
manera pasiva: sodio, potasio, calcio y protones, diminuyendo la polaridad de la neurona 
provocando su despolarización. (B) La halorodopsina actúa de manera activa permitiendo 
el paso de iones cloro al interior de la célula, hiperpolarizando la neurona. (C) La 
arqueorodopsina es una bomba activa de protones que permite que estos sean enviaos a 
la zona extracelular, lo cual provoca una hiperpolarización neuronal. Modificado por 
Monserrat Alina Reyes Romero de la figura 1 de Han, 2012. (Han, 2012) 
Para expresar la proteína, es necesario que se encuentre previamente 
un promotor, es en esta secuencia lo que volverá la técnica específica, ya que 
las neuronas que activen el promotor transcribirán y traducirán la secuencia 
de la halorodopsina para generar el canal. Paralelamente se transcribe y 
traduce una proteína reportera fluorescente, la cual se ubica en el citoplasma 
y podrá ser detectada posteriormente. 
El uso de vectores en la genética, ha posibilitado la transferencia de 
secuencias nucleotídicas a células, tanto de manera ex vivo como in vivo. 
Dentro de los V.V usados son los derivados de Retrovirus, Adenovirus, 
Herpresvirus y Parvovirus, todos conservan la capacidad de infectar células y 
son manipulados genéticamente para que transporten la secuencia 
nucleotídica objetivo, los más idóneos son aquellos que se integran durante 
35 
su ciclo biológico en el genoma, a la célula, teniendo menor interés aquellos 
que se mantienen como elementos episomales o aquellos que producen una 
respuesta inmunológica (F. Tresguerres, 2013). Uno de los vectores utilizado 
en optogenética es HIV. Este pertenece al grupo de vectores lentivirales, los 
cuales están divididos en vectores lentivirus de primates y de no primates 
como el felino (T. Saenz, 2004). 
Biológicamente pertenece a la familia Retroviridae. Es una familia de virus no 
oncogénicos pero que produce múltiples enfermedades multiorgánicas, 
caracterizadas por largos periodos de incubación así como de infección 
persistente. Se han reconocido 5 serogrupos los cuales infectan a mamíferos 
(Standford University, 2016). Genéticamente se caracterizan por 
retrotranscribir su genoma a copias de cDNA por medio de la enzima 
transcriptasa reversa, las copias se integran establemente al DNA de las 
células huésped por medio de la enzima integrasa (Sakuma, 2012). Lo cual 
hace a estos vectores ideales para transferir secuencias a células blanco; 
aunado a esto, este tipo de vectores ha resultado muy útil, debido a la 
capacidad que poseen de infectar e integrar su genoma tanto células en 
división como a células quiasentes (American Biological Safety Association, 
2016; Sakuma, 2012) . El vector utilizado más comúnmente es HIV-1, el cual 
contiene en su genoma 9 marcos de lectura abiertos que producen 15 
proteínas diferentes involucradas en el ciclo de infección, incluyendo 
proteínas estructurales y regulatorias. Adicionalmente, se encuentran 
elementos activos en cis los cuales son utilizados en varias etapas del ciclo 
viral. Se incluyen LTR’s, una región de activación TAR, sitios donadores y 
36 
aceptores splice, una señal de empaquetamiento y dimerización (, región 
RRE y tramos centrales y finales PPT. (Tiscornia G, 2006) 
De manera general, el ciclo de replicación de HIV-1 consiste en dos 
fases (Figura 9); una Fase Temprana y otra Fase Tardía. En la Fase Temprana 
ocurren procesos que involucran la unión de la partícula viral a la superficie 
celular. Este proceso es mediado por las proteínas de envoltura y los 
receptores CD4 y CCR5. El proceso de transcripción, en el cual se transcribe 
de una cadena de DNA proviral la cadena de RNA viral; en este punto el 
mecanismo de transcripción que utiliza la célula es ahora ocupado para la 
generacion de RNA viral, la importación e integración nuclear del DNA viral 
en la cual se involucra la enzima integrasa. En la otra, Fase Tardía, se 
incluyen procesos de traducción de RNA viral para producir la cadena de 
polipéptidos para que a partir de ésta se forme la proteína precursora Gag, 
conocida como PR55, posteriormente la unión de las proteínas GagPol y Gag 
así como el tráfico protéico de Proteínas de envoltura (Env) y proteínas 
regulatorias y accesorias a la membrana celular darán paso a la 
encapsidación del RNA viral y la liberación y maduración de los viriones. (O. 
Feed, 2015; The Aaron Diamond AIDS Reserch Center, 2016) 
37 
FIGURA 9. Ciclo de replicación lentiviral. En el que se aprecia la Síntesis de las proteínas 
virales, la unión a la membrana y la liberación y maduración viral. Modificado por M. 
Reyes de la figura 1 de O. Feed, 2015. La proteína de envoltura viral Env es desplazada por 
la vía secretora, del retículo endoplásmico rugoso (RER) al Aparato de Golgi para ser 
empaquetado en vesículas para ser desplazadas a la membrana de la célula receptora. La 
proteína precursora de Gag, (que contiene la matriz (MA), cápside (CA), nucleocápside (NC 
y el dominio p6) es sintetizado en el citosol a partir de un RNA vial largo. La poliproteína 
precursora de GagPol (que contiene a MA, CA, NC, a la proteasa, a la transcriptasa reversa 
y a los dominios de integración) es sintetizada como resultado de la traducción del RNA 
viral para originar a la proteína Gag. Gag se una al RNA viral y comienza a multimerizarse 
llegando a la membrana celular por una vía indefinida. Gag es anclada en la membrana 
celular en los microdominios lipídicos insertando los grupos amino-terinal en las zonas 
lipídicas y por una interacción directa con el fosfatidilinositol-(4,5)-bifosfato. El 
ensamblado de la partícula incorpora a la proteína ENV para posteriormente unir al 
complejo endosomal requerido por el transportador I (ESCRT-I) por la vía de asociación 
directa entre el motivo PTAP en p6 y el gen susceptible a tumor 101 (TSG101) subunidad de 
ESCRT-I. Además Gag se une de manera directa con ESCRT interactuando con la proteína X 
(ALIX), mediante el motivo XPXL de p6, a medida que avanza el proceso, ESCRT-III y el 
complejo de la proteína vacuolar 4 (VPS4) son unidos a la membrana, para la liberación de 
la partícula. La maduración, lo que lleva a la formación de la cápside nuclea,r es 
desencadenada por el anclaje proteolítico de Gag y la poliproteína GagPol por la proteasa 
viral. (O. Feed, 2015). Modificado por Monserrat Alina Reyes Romero de la figura 1 de O. 
Feed, 2015. 
38 
Los vectores generados con el VIH-1, han sido modificados para 
disminuir la posibilidad de que al infectarse un individuo, desarrolle una 
patología. En una estructura viral completa para este virus se encuentran 6 
secuencias genéticas: Env, Vif, Vpr, VPU, Nef y Tat, además de los elementos 
ya mencionados. De estas, para el desarrollo de los vectores virales fueron 
retiradas 6, sin alterar la capacidad infectiva dejando únicamente las 
secuencias de empaquetamiento y las de envoltura. Las secuencias activas en 
cis fueron separadas de aquellos factores activos en trans que son 
absolutamente requeridos para la producción, infección e integración viral. 
(American Biological Safety Association, 2016; Standford University, 2016; 
Tiscornia G, 2006) 
Para la experimentación con este vector es necesario considerar, tanto 
aspectos propios del vector, como del receptor. En el caso de vector, la 
naturaleza por ejemplo la generación a la que pertenece y el pseudotipo, el 
potencial de generar un virus que sea competente para la replicación, la 
naturaleza de la insercióndel transgen, por ejemplo la inserción de 
oncogenes conocidos, genes inmunoreguladores y genes metabólicos, el 
titulo viral y la cantidad total de administración. Por parte del Receptor, la 
naturaleza del receptor viral, es decir, si tiene susceptibilidad, patogenicidad, 
la exposición potencial previa que pudo haber tenido el receptor, así como el 
riesgo potencial para ambos Vector y Receptor de que existan eventos de 
mutagénesis. (American Biological Safety Association and Alliance, 2016). 
Dentro de los riesgos que se tienen en el manejo del vector hay que 
considerar la replicación completa de este, generando partículas 
39 
potencialmente patogenas y el potenical oncogénico derivado de eventos de 
mutagénesis. Estos riesgos se encuentran directamente relacionados con el 
sistema utilizado así como el transgen. (American Biological Safety 
Association and Alliance, 2016). Clínicamente se debe de considerar que el 
virus en su estado no modificado, se mantiene en el organismo por largos 
periodos, debido a la capacidad ya mencionada de integrar su material 
genético, teniendo como células blanco a infectarar a los macrófagos y en el 
caso de VIH, células T. Los lentivirus se replican, mutan y se someten a 
eventos de selección por las respuesta inmune del receptor; el virus cursa por 
tres etapas de infección: Inicial, que se caracteriza por una replicación viral 
acelerada así como la diseminación, que clínicamene se encuentra asociada 
con un periodo de enfermedad, en el cual se manifiestan síntomas como 
dolor de cabeza, nausea, vómito, mialgia, dolor articular; sintomas similares 
a un resfrío. Transcurrido este periodo, el receptor ingresa a un periodo de 
Latencia, en el cual el virus no es controlado por el sistemainmune y continua 
su replicación sin signos de enfermedad por parte del receptor. Por ultimo, se 
pasa por un periodo de Replicación elevada en el cual el virus se replica de 
una manera mas acelerada, dando lugar a la enfermedad caracterizada por la 
disminución de células T. Es importante considerar que para esta infección no 
hay una cura que elimine al virus, sino solo un conjunto de medicamentos 
que controlan la enfermedad que se produce: SIDA. (Standford University, 
2016). 
40 
Como medidas de seguridad para el manejo del virus, así como del 
vector, hay que considerar evitar la exposivión de membranas mucosas, con 
el uso de guantes y máscaras, cuidar el manejo de punzocortantes así como 
evitar la inhalación de aerosoles por medio de mascarillas y el contacto 
directo con la piel, utilizando la indumentaria adecuada como es el uso de 
bata y guantes. La desinfección se realiza con desinfectantes como el 
hipoclorito de sodio 1%, glutaraldehido 2% , formaldehido y etanol. 
(Standford University, 2016). 
FIGURA 10. Estructura genética no modificada de VIH. Modificada por Monserrat Alina 
Reyes Romero (Sakuma T, 2012) 
En particular para este vector, se han desarrollado 3 generaciones: La 
primera generación, se caracteriza en que la mayoría de las secuencias del 
virus natural se encuentran en un solo plásmido de expresión codificante 
para la envoltura. En la segunda generación, 5 de los 9 genes han sido 
eliminados, dejando las secuencias que codifican para la estructura viral y 
para la enzima y dos genes que codifican para las funciones transcripcionales 
y post-transcripcionales. En la Tercera generación, se utiliza un vector 
conformado por un sistema de 4 plásmidos: 3 denominados helper (pMLD, 
41 
pREV, pVSVG) los cuales contienen los factores de activación en posición 
trans requeridos para el empaquetamiento y uno que contiene el genoma del 
vector incluyendo el transgen o el “cassette” de silenciamiento, para ser 
colocado en la estructura lentiviral que contiene todas las secuencias que 
actúan en cis requeridas para la producción de RNA y empaquetado. 
(American Biological Safety Association, 2016; Tiscornia G, 2006). Los 
vectores de transferencia viral de esta generación pueden ser diseñados para 
expresar (constitutiva o condicionalmente) ambos transgenes y shRNAs en 
una unidad sencilla o múltiple de combinación. Esta generación ofrece 
ventajas sobre las generaciones previas debido a que se necesita un mayor 
número de eventos de recombinación para una replicación completa, 
disminuyendo la posibilidad de que se complete un ciclo de replicación. 
(American Biological Safety Association and Alliance, 2016). Como medida de 
seguridad adicional se eliminó la región promotora en la posición 3’LTR. 
Durante la transcripción reversa, la región proviral 5’LTR es copiada de la 
región 3’LTR, transfiriendo así la eliminación de la región 5’LTR; la 
eliminación de esta región en la integración del provirus es por lo tanto 
transcripcionalmente inactivo, previniendo la replicación viral subsecuente o 
la movilización en la célula (Tiscornia G, 2006). Cuando las células 293T 
provenientes de riñón en estado embrionario son transfectadas con los 
cuatro plásmidos, las partículas virales se acumulan en el medio 
(sobrenadante) y un título viral elevado puede ser obtenido por medio de 
ultracentrifugación (Tiscornia G, 2006). 
42 
FIGURA 11. Representación esquemática de la tercera generación del sistema lentiviral. El 
vector de transferencia es capaz de contener hasta una secuencia de ~8Kb, lo cual es 
adecuado para muchas aplicaciones. El plásmido de empaquetamiento (pMDL, pREV, y 
pVSVG) contiene los elementos activos en trans nombradas como Gag-Pol, Rev y l 
proteína de envoltura VSVG. El plásmido pMDL codifica para el precursor Gag-Pol que es 
eventualmente procesado para generar a la integrasa, a la transcriptasa reversa y a las 
proteínas estructurales. Mientras que las pro-proteínas estructurales son completamente 
necesarias para la producción viral, las enzimas integrasa y transcriptasa reversa están 
involucradas en eventos subsecuentes de infección. REV interactúa con los elementos RRE 
en el vector de transferencia mejorando la exportación de los elementos no modificados 
así como de los transcritos genómicos largos. La presencia de VSVG en la envoltura viral 
confiere a la partícula viral la habilidad de infectar a diferentes tipos de células, incluyendo 
de cultivos primarios, células troncales y embrionarias. El recuadro rayado representa la 
auto inactivación por eliminación en el promotor del LTR . (Tiscornia G, 2006) 
43 
II) JUSTIFICACIÓN.
La posibilidad de activar o silenciar diferentes tipos de células dentro 
de un órgano o sistema, principalmente en los circuitos neuronales en un 
momento preciso y de manera temporal ha resultado crítico para la 
comprensión de cómo los circuitos neuronales procesan diferentes tipos de 
información tanto emocional como cognitiva (Bernstein, 2011). Debido a que 
la optogenética implica introducir secuencias genéticas a la célula, 
aprovechando el desarrollo tecnológico y con éste, la utilización de vectores 
virales. Es de interés por parte del Instituto de Neurobiología de la 
Universidad Nacional Autónoma de México, el conocimiento del papel que 
tiene el receptor a andrógenos, sobre la conducta sexual en neuronas de la 
región ventral media cerebral de ratas. El trabajo tiene como finalidad la 
amplificación de la secuencia mínima promotora del receptor de Andrógenos 
de rata para la clonación de ésta en el vector FCK(1.3)-Enphr3.0- y la 
producción de partículas Lentivirales, que serán utilizadas a futuro como 
vehículos en inyecciones intracerebelares, así como realizar la modificación 
necesaria de la secuencia mARP para insertar a futuro ésta región, en 
plásmidos virales para la producción de virus Adenoasociados y de esta 
manera, evaluar la participación del área preóptica medial y del hipotálamo 
anterior en la conducta sexual. 
44 
III) OBJETIVOS.
General 
Construir un vector que contenga la secuencia mínima 
reguladora del promotor del receptor a andrógenosde rata y los 
elementos necesarios para su empleo en la técnica de optogenética 
mediante técnicas de biología molecular. 
Particular 
1.-Amplificar mediante la técnica de reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR) la región mínima promotora del receptor de 
andrógenos a partir de DNA genómico de rata. 
2.- Clonar la región mínima promotora del receptor de andrógenos de 
rata en el vector pGEM®-T EASY (PROMEGA®). 
3.- Confirmar la secuencia amplificada mediante secuenciación de 
Sanger. 
4.- Amplificar la región mínima promotora del receptor de 
andrógenos de rata con los pares de oligonucleótidos, diseñados con 
los sitios de restricción para el vector lentiviral y Adenoviral 
5.- Clonar la región mínima promotora del receptor de andrógenos de 
rata en el vector pLenti-CaMKIIa-eNpHR 3.0 EYFP 
45 
IV) MATERIALES Y MÉTODOS.
IV.I OBTENCIÓN DE DNA GENÓMICO.
*EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO.
La extracción se realizó acorde al protocolo reportado por Sambrook y 
cols. en el año 2006 del hígado de una rata se tomaron dos rebanadas y se 
cortaron en pequeños pedazos con una navaja. El tejido fraccionado se 
resuspendió en una solución de TNE [10mM Tris-HCl (pH 8.0), NaCl, y EDTA, 
10 ug/ml RNAasa A] y se homogeneizó. Se agregó SDS, 10% del volumen, 10 
mg/mL de proteínasa K y se incubó durante 3 horas a 56°C en agitación. 
Después la solución de digestión se pasó 10 veces por una jeringa. Terminado 
lo anterior se realizó una extracción con fenol-cloroformo, dos veces. 
Posteriormente se precipitó con un volumen 1/10 de acetato de sodio 3M y 
2 volúmenes de etanol. Se lavó dos veces con 10 mL de etanol al 70% y se 
dejó secar, el DNA se resuspendió en agua y almacenó a -20°C. 
*CUANTIFICACIÓN Y PUREZA DEL DNA GENÓMICO.
La concentración del DNA se determinó en un espectrofotómetro 
NanoDrop 1000 serie G5557 (Thermo Fisher Scientific Scientific). Su pureza 
se evaluó en base a la relación 260/280, considerándose un valor de cociente 
de aproximadamente 1.8 como una muestra pura, de lo contrario, la muestra 
se encuentra contaminada por proteínas o solventes. 
46 
Se colocó 1 uL de la muestra eluída con agua libre de nucleasas y se 
configuró el software para realizar la medición de ácidos nucleicos. Se colocó 
como blanco 1 uL de agua libre de nucleasas. La muestra es retenida por 
tensión superficial para posteriormente poder realizar la medición, actuando 
como un espectrofotómetro de haz simple. 
IV.II AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN MÍNIMA PROMOTORA PARA EL
RECEPTOR A ANDRÓGENOS DE RATA. 
*DISEÑO DE OLIGONUCLEOTIDOS.
La amplificación de mARP se realizó mediante la técnica PCR (por sus 
siglas en ingles) de punto final. Los oligonucleótidos utilizados (Tabla 1) se 
diseñaron tomando en cuenta las siguientes consideraciones: 
 El tamaño de los oligonucleótidos no excedió de 25 pb.
 El porcentaje de G/C no excedió del 60%.
 Se cuidó que el extremo 5’ tuviera por lo menos 3 G/C en los
últimos nucleótidos. 
 Se analizó que no se formaran estructuras secundarias y que no
presentaran complementariedad intercatenaria e intracatenaria entre 
las secuencias. El análisis se realizó con la plataforma de Integrated DNA 
Technologies (IDT) con los algoritmos de OligoAnalyzer. 
47 
Tabla 1. Oligonucleótidos para la amplificación genómica de mARP. 
Tm(°C) 
Secuencia sentido 
(1) TCACTGTAGAGGCCTGTAAAT 
53 
(2)CATGGGGAACATAACAATGTC 
CTTG 
56.3 
Secuencia antisentido 
(3)CACTGGAGTGGCTAGCTC 61.1 
(4)AGGTGGAAACGAAATGCAACAG 56.2 
Tabla 1. Oligonucleótidos para la amplificación genómica de mARP. Los oligonucelótidos 
diseñados fueron a partir de la secuencia reportada en NCBI con GI: L15617.1 para la 
amplificación de la secuencia mARP a partir de DNA genómico. 
*OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE PCR PARA LA
AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIA mARP A PARTIR DE DNA 
GENÓMICO 
Para encontrar la temperatura óptima de alineamiento en el ciclaje de 
PCR se realizó un gradiente usando diferentes temperaturas (60°C, 57.1°C, 
52°C), basado en el valor de Tm reportado por el proveedor de los 
oligonucleótidos diseñados (Tabla 1). 
48 
Los reactivos y concentraciones utilizados en la reacción de PCR fueron 
los siguientes (Tabla 2): 
Tabla 2. Reactivos utilizados para la PCR punto final con gradiente de 
temperatura. 
Reactivo. 
Volumen 
para 25 ul. 
Concentración final. 
Buffer de PCR 
(Invitrogen™) 10X. 
2.5 1X 
dNTP’s 10mM. 1 4mM 
MgCl2 (Invitrogen™) 
50mM.
1 2mM 
Secuencia Sentido 10uM. 2.5 1uM 
Secuencia antisentido 
10uM. 
2.5 1uM 
Taq DNA Pol 
(Invitrogen™). 
1uL -- 
Agua libre de nucleasas. Cbp --- 
DNA 50 ng/uL. 1 2 ng/ul 
Tabla 2. Reactivos utilizados para la PCR punto final con gradiente de temperatura. La 
tabla muestra los reactivos utilizados para la reacción así como las concentraciones y 
volúmenes utilizados para la amplificación de la región mARP a partir de DNA genómico. 
49 
La reacción de PCR se llevó acabo en el equipo C1000 Touch Thermay 
Cycler de Bio-Rad, quedando los ciclos de acuerdo a la Tabla 3. 
Tabla 3. Programa del termociclador para la PCR para la amplificación de la 
secuencia mARP a partir de DNA genómico. 
Proceso Temperatura (°C) Duración (min) No. De ciclos 
Desnaturalización. 95 3 1 
Desnaturalización. 95 0:45 
34 Alineamiento. 60°C/57.1°C/ 52°C 0:30 
Extensión. 72 2:25 
Extensión final. 72 10:00 1 
Enfriamiento. 4 Infinito 1 
Tabla 3. Programa del termociclador para la PCR para la amplificación de la secuencia 
mARP a partir de DNA genómico. La tabla muestra la programación que se realizó en el 
termociclador C1000 Touch Thermay Cycler de Bio-Rad para la amplificación de la 
secuencia mARP a partir del DNA genómico 
*ELECTROFORESIS.
El resultado de la reacción fue observado con electroforesis en gel de 
agarosa al 1% (Ultra Pure™ ™ Agarosa de Invitrogen™) teñido con GelRed™ ™ 
(Biotium) al 1X, en solución amortiguadora de TBE. El voltaje aplicado fue de 
88 mV en un tiempo aproximado de 40 min. Usando la fuente de poder 
EC105 de Thermo Fisher Scientific. La observación se realizó en un 
transiluminador de luz UV Gel Doc EZ Imager de Bio-Rad, a una longitud de 
onda de 234 nm y el software Image Lab 3.0 de Bio-Rad. Para determinar el 
tamaño del producto de PCR se utilizó el marcador de peso molecular 1 Kb 
Plus DNA Ladder (Invitrogen™). 
50 
*PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR.
Terminada la reacción, el producto fue purificado con el kit QIAquick® 
(Quiagen®), el cual permite retirar de la muestra oligonucleótidos, sales, 
polimerasas y nucleótidos utilizados en la reacción de amplificación. A partir 
de la muestra amplificada se adiciona el buffer PB el cual permite la 
precipitación del material genético; posteriormente es colocada en la 
columna de silica a la cual se adhiere el material genético, centrifugada a 
máxima velocidad durante 30s y se elimina el sobrenadante; posteriormente 
se lava la columna con el buffer PE, se centrifuga a máxima velocidad y 
elimina el sobrenadante, se centrifuga nuevamente y se transfiere la 
columna a un tubo limpio y eluye con 30 uL de agua libre de nucleasas. 
Finalmente, el DNA recuperado fue cuantificado en el NanoDrop siguiendo el 
procedimiento ya descrito. 
51 
IV.III CLONACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR AL VECTOR pGEM®-T Easy
*LIGACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR AL VECTOR.
Con el producto de PCR purificado se realizó la ligación al vector 
pGEM®-T EASY (PROMEGA®), el cual se encuentra de manera lineal 
mediante una restricción con la enzima EcoRV que se caracteriza por que en 
su extremo 3’ se encuentra con la base timina lo cual permite la ligación con 
el producto de PCR y previene la recircularización del vector. 
La reacción fue catalizada por la enzima T4 Ligasa (Invitrogen™) la cual 
actúa uniendo ambos extremos adhesivos complementarios covalentemente 
a través de un enlace fosfodéster 3’ 5’ (Lodish, 200). 
La reacción de ligación se realizó con los reactivos y concentraciones 
dadaspor el proveedor (Anexo I, Tabla 1) manteniendo una relación 
inserto:vector de 1:1 
Se mezcló todo con ayuda del vortex y se incubó a temperatura 
ambiente durante 60 minutos. Posteriormente se congeló para su posterior 
uso. 
*TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Escherichia coli
A una alícuota de 100 ul de bacterias Escherichia coli XL-BLUE 
químicamente competentes, se agregó 10 uL de la ligación y se incubaron 
en hielo por 5 minutos. Luego, se incubó a 42°C en un baño seco durante 3 
52 
minutos posteriormente se colocaron en hielo por 1 minuto. Se adicionó 
400uL de medio LB líquido sin antibióticos e incubó por 30 minutos a 37°C. Se 
centrifugó a 2500 rpm y resuspendió el pellet para realizar la siembra en 
placas con agar LB con ampicilina [1ug/ml]. Previo a la siembra se agregaron 
40 uL de X-GAL [20ug/ml] y 40 uL de IPTG [100 mM] los cuales permiten la 
selección de colonias Lac(-). El sembrado se realizó con perlas de vidrio y se 
dejó crecer por 12 horas a 37°C. Pasado el tiempo, se aislaron colonias 
blancas, las cuales se resuspendieron de manera independiente en un tubo 
de 50 mL con 7 mL de medio LB líquido con 1 u/ml de ampicilina, dejándose 
incubar a 37°C con agitación durante 12 horas para proceder a la purificación 
del plásmido . 
*PURIFICACIÓN DEL PLASMIDO pGEM®-T Easy.
La purificación del plásmido se realiza con el kit WIZARD® PLUS SV 
MINIPREPS DNA PURIFICATION SYSTEM (PROMEGA® ). El kit permite la 
purificación del plásmido menor a 20,000 bp de una manera simple y rápida, 
permitiendo su utilización posterior en técnicas de biología molecular, como 
la secuenciación. En una primera etapa, se lisan las células bacterianas para 
posteriormente realizar una centrifugación para eliminar los detritos 
celulares, posteriormente se coloca el sobrenadante en la columna para ser 
purificado. El desarrollo de la técnica es el siguiente: a partir del cultivo de 12 
horas de crecimiento se tomaron 3 mL y se centrifugaron a 4000 rpm 5 min., 
se eliminó el sobrenadante. El pellet se resuspendió en la solución de lisis, 
posteriormente se transfirió a la columna y centrifugó a máxima velocidad 
durante 1 min, se lavó la columna con 250 ul de la solución de lavado y 
53 
centrifugó a máxima velocidad en una microcentrifuga durante 3 minutos 
eliminando el sobrenadante, la operación se repitió nuevamente. Se secó la 
columna por un minuto centrifugando a máxima velocidad. Una vez seca la 
columna, ésta se pasó a un tubo limpio y el DNA se eluyó con 50 uL de agua 
libre de nucleasas, se dejó reposar durante 1 minuto y centrifugó finalmente 
durante 1 minuto a máxima velocidad. 
El plásmido se cuantificó en el equipo NanoDrop 1000 serie G5557 
(Thermo Fisher Scientific). 
*RESTRICCIÓN CON EcoRI.
Realizada la purificación, se confirmó la inserción de la secuencia al 
plásmido mediante la reacción de restricción con la enzima Eco RI. El vector 
contiene dos sitios de corte en el sitio 52 y 70, lo cual permite liberar al 
fragmento correspondiente a la secuencia mARP 
La reacción se llevó a cabo con los reactivos y concentraciones 
recomendados por el proveedor (Anexo I, tabla 2). La reacción se incubó a 
37°C por 1 hora, transcurrido el tiempo se inactivó la enzima mediante calor 
a una temperatura de 72°C durante 5 min y se transfirió el tubo de reacción a 
hielo para continuar con la inactivación enzimática y la verificación de la 
restricción por electroforesis en gel de agarosa al 1% (Ultra Pure™ Agarosa 
de Invitrogen™) teñido con GelRed™ (Biotium) al 1X, en solución 
amortiguadora de TBE. 
54 
*SECUENCIACIÓN DEL PLÁSMIDO pGEM®-T Easy
Una vez purificado el plásmido, se realizó la secuencia por el método 
de Sanger. Con la secuencia obtenida se realizó el alineamiento con la base 
de datos utilizando la plataforma digital de NUCLEOTIDE BLAST de NCBI. El 
alineamiento se realizó con el alogoritmo de megablast, no se colocó 
organismo y se excluyó modelos XM/XP, sin límites. 
IV.IV AMPLIFICACIÓN DE LA SECUENCIA mARP A PARTIR DEL
PLASMIDO pGEM®-T Easy 
*DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS
Confirmada la identidad de la secuencia mínima promotora del 
receptor de andrógenos, se diseñaron oligonucleótidos que tuvieran los sitios 
de restricción respectivos para la ligación con cada vector de optogenética 
(Tabla 4). Las condiciones de diseño de los oligonucleótidos fueron las ya 
mencionadas previamente, considerando que la secuencia palíndrome a 
incluir en el oligonucleótido no estuviera presente en la secuencia de la 
región mARP, de igual manera que esta secuencia palíndrome permitirá 
separar del vector de optogenética al promotor a-CamKII; esto con la 
finalidad de unir la secuencia mARP al vector de optogenética. Para dicho 
análisis se recurrió a la herramienta NEBcutter V2.0 de BioLabs®. La 
plataforma permite el corte de la secuencia por diferentes enzimas, 
mostrando el mapa virtual de la digestión. 
55 
Tabla 4. Oligonucleótidos con sitios de restricción para la amplificación de 
la secuencia mARP. 
Diseñado 
para el 
plásmido. 
Secuencia 
Tipo de 
sentido Tm(°C) 
ARPromBamHI 
pAAV y 
pLenti 
TTCGATTCACTGGATCCGCTAGCT 
Antisentido 
59.9 
ARPromPacI 
pLenti 
TAGTGATTTAATTAAAGAGGCCTG 
Sentido 
50.7 
ARPromPacIB pLenti GATTTAATTAATCACTGTAG Sentido 
42.0 
ARPromMluI 
pAAV 
GTGATTTCACGCGTGAGGCCTGTA 
Sentido 
61.3 
Tabla 4. Oligonucleótidos con sitios de restricción para la amplificación de la secuencia 
mARP. La tabla muestra la secuencia de oligonucleótidos utilizada para la amplificación de 
la región mARP a partir del vector pGEM®-T Easy, en la secuencia se aprecian las 
secuencias palíndromes agregadas para las enzimas de restricción, el nombre asignado a 
cada secuencia contiene el nombre de la enzima de restricción considerada. 
*OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES DE PCR PARA LA 
AMPLIFICACION DE LA SECUENCIA mARP A PARTIR DEL PLASMIDO 
pGEM®-T Easy . 
Para encontrar la temperatura óptima de alineamiento en el ciclaje de 
la PCR de los oligonucleótidos diseñados para el plásmido Adenoviral, se 
realizó un gradiente usando diferentes temperaturas (64.5°C, 61.4°C y 55°C) 
basado en el valor de Tm reportado por el proveedor de los oligonucleótidos. 
Los reactivos y concentraciones utilizados en la reacción de PCR para 
estos oligonucleótidos son los mencionados anteriormente (Tabla 2), 
56 
mientras que la reacción fue realizada en el equipo C1000 Touch Thermay 
Cycler bajo las condiciones de la Tabla 5. 
Tabla 5. Programa del termociclador para la PCR. 
Proceso Temperatura (°C) Duración (min) No. De ciclos 
Desnaturalización 95 3 1 
Desnaturalización 95 0:45 
34 Alineamiento 64.5°C, 61.4°C y 55°C 0:30 
Extensión 72 2:25 
Extensión final 72 10:00 1 
Enfriamiento 4 Infinito 1 
Tabla 5. Programa del termociclador para la PCR. La tabla muestra el programa que se 
introdujo al termociclador C1000 Touch Thermay Cycler para la amplificación de la 
secuencia mARP para Adenovirus. 
Por otra parte, para los oligonucleótidos diseñados con los sitios de 
restricción para el vector lentiviral se realizó la misma mezcla de reacción 
(Tabla 2), con los oligonucleótidos específicos para el vector (Anexo II, Tabla 
1), se probó una temperatura de alineamiento constante a 55°C. La reacción 
fue realizada en el equipo C1000 Touch Thermay Cycler bajo las condiciones 
de la Tabla 6. 
57 
Tabla 6. Programa del termociclador para la PCR. 
Proceso Temperatura (°C) Duración (min) No. De ciclos 
Desnaturalización 94 3 1 
Desnaturalización 94 0:45 
34 Alineamiento 55 0:30 
Extensión 72 2:25 
Extensión final 72 10:00 1 
Enfriamiento 4 Infinito 1 
Tabla 6. Programa del termociclador para la PCR. La tabla muestra el programa que se 
introdujo al termociclador C1000 Touch Thermay Cycler para la amplificación de la 
secuencia mARP para Lentivirus. 
Terminadas las reacciones de amplificación de las secuencias con los 
sitios de restricción, se cuantificó en un espectrofotómetroNanoDrop 1000 
serie G5557 (Thermo Fisher Scientific), se verificó con electroforesis en gel 
de agarosa al 1% (Ultra Pure™ Agarosa de Invitrogen™) teñido con GelRed™ 
(Biotium) al 1X, en solución amortiguadora de TBE y se purificó. 
*PURIFICACIÓN DE LA SECUENCIA.
Debido a la inespecificidad de la reacción, se aisló la banda 
correspondiente al peso esperado cortandola del gel y purificandola con el 
kit QIAquick® (Quiagen®). La banda cortada fue colocada en un tubo 
sometiéndola posteriormente en calor para pasar por el proceso de 
licuefacción. A la muestra, se le agregó isopropanol para precipitar el ácido 
nucleico de la mezcla y posteriormente se colocó en una columna de silica 
incluida en el kit, la cual se centrifugó a máxima velocidad por un minuto, 
58 
posteriormente se lavó la columna con el buffer de lavado, se centrifugó a 
máxima velocidad y eluyó con 100uL de agua. 
*SECUENCIACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR.
Obtenido y purificado el producto de PCR, se solicitó la secuención por 
el método de Sanger. El resultado se analizó con la herramienta NEBcutter 
V2.0 de BioLabs®. Para obtener la restricción virtual. 
IV.V CLONACIÓN DE LA SECUENCIA MÍNIMA PROMOTORA PARA EL
RECEPTOR A ANDRÓGENOS EN EL VECTOR DE OPTOGENÉTICA.
IV.V.I PREPARACIÓN DE LA SECUENCIA MÍNIMA PROMOTORA
PARA EL RECEPTOR A ANDRÓGENOS PARA LA LIGACIÓN
Para la inserción de la secuencia mARP en los vectores de 
optogenética, es necesario preparar los extremos de ésta para la unión a la 
secuencia del vector de optogenética. Se realizaron dos reacciones 
independientes, una para preparar la secuencia para ser unida al vector 
Adenoasociado y otra para el vector Lentivirus. 
Para preparar la secuencia a unir con el vector Adenoviral se realizó la 
digestión con las enzimas MluI y BamHI y para la secuencia que se unirá al 
vector Lentiviral las enzimas PacI y BamHI. 
59 
Para la restricción de la secuencia amplificada para el vector Adenoviral 
se realizó primero la digestión con la enzima BamHI (PROMEGA® ) (Anexo II, 
Tabla 2) de acuerdo a lo descrito por el proveedor, incubándose la reacción a 
37°C por 1 hora, transcurrido el tiempo, se inactivó la enzima mediante calor 
a una temperatura de 72°C durante 5 min y se transfirió el tubo de reacción a 
hielo. La segunda digestión se hizo con la enzima MluI (Anexo II, Tabla 3) de 
la manera descrita por él proveedor. Las reacciones se realizaron de acuerdo 
a lo indicado por el proveedor. Incubándose a 37°C por 1 hora, transcurrido 
el tiempo se inactivó la enzima mediante calor a una temperatura de 72°C 
durante 5 min y se transfirió el tubo de reacción a hielo. 
Por otra parte para la restricción de la secuencia para el vector 
Lentiviral, se realizó primero la digestión con la enzima BamHI (PROMEGA®) 
(Anexo II, Tabla 2), posteriormente se realizó una segunda digestión con la 
enzima PacI (Anexo II, Tabla 4). Las reacciones se realizaron de acuerdo a lo 
indicado por el proveedor. Incubándose a 37°C por 1 hora, transcurrido el 
tiempo se inactivó la enzima mediante calor a una temperatura de 72°C 
durante 5 min y se transfirió el tubo de reacción a hielo. 
Posteriormente se purificaron los productos de las reacciones con el kit 
QIAquick® (Quiagen® ). El producto no fue colocado en calor sino que se 
colocó directamente en la columna, fundamentándose la metodología de la 
misma manera descrita con anterioridad. Colocada la muestra en la columna 
fue lavada con los diferentes reactivos, el DNA fue eluido con 100 uL agua 
libre de nucleasas y recuperado en un nuevo tubo. 
60 
IV.V.II CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES PARA OPTOGENÉTICA
*RESTRICCION DE LOS VECTORES DE CLONACION PARA
OPTOGENÉTICA. 
Para la inserción de la secuencia mARP en los vectores de optogenética 
fue necesario eliminar de la secuencia la región CamKII-a de estos, para ello 
se realizó la digestión del vector Adenoviral con las enzimas MluI y BamHI y 
para el vector Lentiviral las enzimas PacI y BamHI. 
Los procedimientos realizados para la restricción de los vectores son 
los descritos anteriormente. Las reacciones de restricción fueron realizadas 
con los reactivos del Anexo I Tabla 2, Tabla 3, y Tabla 4. El DNA utilizado para 
la restricción fueron los plásmidos del proveedor. 
Terminadas las restricciones, éstas fueron confirmadas por 
electroforesis en gel de agarosa al 1% (Ultra Pure™ Agarosa de Invitrogen™) 
teñido con GelRed™ (Biotium) al 1X, en solución amortiguadora de TBE, y se 
procedió a su purificación. 
*PURIFICACIÓN DE LOS VECTORES.
Una vez realizadas las restricciones de cada vector y su respectiva 
electroforesis, se aisló, cortando del gel la banda más pesada, mayor a 5,000 
pb para el vector Adenoasociado y mayor a 9,000 pb para el vector Lentiviral; 
este fragmento fue purificado con el kit QIAquick® (Quiagen®). La 
61 
metodología fue la descrita anteriormente, el producto de la purificación se 
eluyó con 100uL de agua. 
*DEFOSFORILACIÓN DE LOS VECTORES.
Purificado el vector, se defosforilo para permitir la ligación de ambas 
secuencias por la enzima T4 Ligasa. Los reactivos utilizados se encuentran en 
el Anexo II, Tabla 5. La reacción se incubó a 16°C durante 12 horas y se 
transfirió el tubo de reacción a hielo. La enzima fue inactivada por calor y el 
producto fue cuantificado en el espectrofotómetro NanoDrop 1000 serie 
G5557 (Thermo Fisher Scientific Scientific). 
IV.V.III LIGACIÓN DE LA SECUENCIA MÍNIMA PROMOTORA PARA
EL RECEPTOR A ANDROGENOS AL VECTOR DE OPTOGENÉTICA. 
*LIGACIÓN
El vector de optogenética a ligar con la secuencia mínima promotora 
para el receptor a andrógenos es la secuencia correspondiente al vector 
lentiviral, la ligación se realiza usando las relaciones inserto:vector de 1:1 , 
3:1 y 3:2 . Los volúmenes utilizados se calcularon con la siguiente ecuación: 
62 
La reacción se realizó con la enzima T4 Ligasa (Invitrogen™) con los 
reactivos y concentraciones referidas por el proveedor (Anexo I, Tabla 1), 
dejando la reacción incubando durante 12 horas a 4°C; enseguida, se 
desactivó la enzima mediante calor a una temperatura de 72°C durante 5 min 
y se transfirió el tubo de reacción a hielo. Con el producto de la ligación se 
procedió a la transformación bacteriana de Escherichia coli de la manera 
descrita previamente. 
*PURIFICACIÓN DEL PLÁSMIDO LENTIVIRAL PARA OPTOGENÉTICA.
La purificación del plásmido se realizó con el kit WIZARD® PLUS SV 
MINIPREPS DNA PURIFICATION SYSTEM (PROMEGA® ). Se siguió la técnica 
descrita previamente; el DNA purificado se cuantificó en el equipo 
NanoDrop 1000 serie G5557 (Thermo Fisher Scientific). 
*RESTRICCIÓN DEL PLÁSMIDO LENTIVIRAL PARA OPTOGENÉTICA.
Para comprobar la ligación de la secuencia mARP con la secuencia del 
vector, se realizó la reacción de restricción del plásmido con las enzimas PACI 
y BAMHI tal cual fue descrita. 
63 
IV.VI PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS VIRLES.
*CULTIVO CELULAR.
Para realizar el empaquetamiento del vector viral se utiliza la línea 
celular HEK 293T. Para iniciar el cultivo, se descongeló una alícuota de 
células las cuales se encontraban criopreservadas en un pase máximo de 18 y 
a una concentración de 1X106 células. El proceso se realiza colocando 
primeramente la alícuota a 37°C, una vez descongeladada se adicionan 15 mL 
de medio de crecimiento DMEM (Gibco® by Life Technologies®) 
suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) (Gibcoby Life 
Technologies®) y 1% de mezcla de antibióticos (estreptomicina y penicilina) 
(Gibco® by Life Technologies®) se resuspenden suavemente las células, se 
siembran en una placas de 15 cm de diámetro y se incuban a 37°C en un 
ambiente de 5% de CO2. El trabajo se realiza en total esterilidad en una 
campana de flujo laminar de bioseguridad tipo II. Todos los medios y 
suplementos utilizados en el cultivo celular son previamente atemperados a 
37 °C (Zhang, 1999). 
*PASE CELULAR
Una vez alcanzada