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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA CREACIÓN DE UNA BASE DE ESPECTROS ESI-MS DE FLAVONOIDES. APLICACIÓN AL ESTUDIO DE OBJETOS DEL PATRIMONIO CULTURAL. TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA PRESENTA STEPHANY NIETO RIZO CIUDAD DE MÉXICO, AÑO 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. [ii] JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Alejandrina Acosta Huerta VOCAL: Emely Baché Ortega SECRETARIO: Paola Lucero Gómez 1° SUPLENTE: Noé Zúñiga Villareal 2° SUPLENTE: Xochiquétzal González Rodríguez SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORARIO DE QUÍMICA ANALÍTICA APLICADA AL PATRIMONIO LABORATORIO NACIONAL PARA LA INVESTIGACIÓN Y CONSERVACIÓN DEL PATRIMONIO CULTURAL (LANCIC)- INSTUTO DE QUÍMICA ASESOR DEL TEMA: Dra. Delia Paola Lucero Gómez ________________________ SUSTENTANTE: Stephany Nieto Rizo ___________________________ [iii] “Hay quienes se consideran perfectos, pero es solo porque se exigen menos de sí mismos” Herman Hesse. [iv] AGRADECIMIENTOS Esta investigación fue realizada con el apoyo de la beca de titulación del Programa UNAM-DGAPA-PAPIIT. (Proyecto IA203417). El presente trabajo investigación se realizó bajo el auspicio de CONACYT (Proyectos LN 232619 y LN 260779). Primeramente, quiero agradecer a la UNAM y a la Facultad de Química, por permitirme formar parte de tan distinguida institución académica para formarme a lo largo de mi bachillerato y licenciatura. Agradezco a la Dra. Paola Lucero por darme la oportunidad de desarrollar este trabajo en su laboratorio, por el tiempo, la paciencia y por la dirección de este proyecto de investigación, que a pesar de todas las dificultades que pasaron, decidir continuar dirigiendo el mismo, así como su valiosa amistad a pesar de que yo venía en el inventario del laboratorio. Agradezco a la Dra. Martha Sánchez de la Coordinación Nacional de Conservación del Patrimonio Cultural (CNCPC) del Instituto Nacional de Antropología e Historia (INAH), y al Dr. Orlando Zapata de la Escuela Nacional de Restauración, Conservación y Museografía por su confianza, apoyo y elaboración de las réplicas de teñido para el estudio de textiles arqueológicos de la Cueva de la Candelaria. Por la asesoría proporcionada para la fabricación de las lacas, y por la ayuda prestada para la constitución de la base de espectros de flavonoides, agradezco a la Dra. Josephin Kirby y al Dr. David Peggie de The National Gallery de Londres. Agradezco la cooperación e intercambio de información científica al Dr. Diego Tamburini y a la Dra. Joan Dyer del British Museum. M. en C. Lucero Ríos, por la realización de los análisis HPLC de la muestra arqueológica ocre y de las réplicas de tinción, por ello le agradezco su tiempo invertido en el presente proyecto. A la Q. Alejandrina Acosta y a la M. en H. Emely Bache, por la revisión del presente manuscrito. [v] AVANT PROPOS Presentación en Póster 1. Stephany Nieto Rizo y Paola Lucero-Gómez. Construcción de una base de espectros ESI-MS de flavonoides. Aplicación al estudio de objetos del patrimonio cultural. Noviembre del 2016. Ciudad Universitaria. 2. Stephany Nieto Rizo, Paola Lucero-Gómez, Tatiana Falcón, Elsa Arroyo, Josephin Kirby. Preliminar results on a HPLC-DAD method for analysis of mexican yellow dyes. Abril del 2016. Ciudad Universitaria. Ponencias 1. Lucero, P., Piña, C., Vázquez, A., & Nieto, S. (24 de octubre de 2016). Análisis Químico de residuos arqueológicos de cacao: Desarrollo de una metodología de manejo, pretratamiento y análisis de muestras usando HPLC-QTOF. Reunión Temática sobre Residuos Químicos en Objetos y Contextos Patrimoniales. Mérida, Yucatán. 2. Lucero, P., Nieto, S., Piña C. & Vázquez, A. (18 de agosto de 2016). Montaje de técnicas GC-MS y HPLC-DAD-QTOF para el estudio químico de materiales orgánicos encontrados en obras de artes y piezas arqueológicas mexicanas. Ciudad Universitaria. Articulo aceptado (Anexo 3). 1. Piña-Torres, C., Lucero-Gómez, P. Nieto, S., Vázquez, A., Bucio, L., Belio, I., Vega, R., Mathe, C., Vieillescazes C., Analytical strategy based on Fourier transformed infrared spectroscopy, principal component analysis and linear discriminant analysis to suggest the botanical origin of resins from Bursera. Application to archaeological Aztec Samples. Journal of Cultural Heritage. [viii] CONTENIDO I AGRADECIMIENTOS IV AVANT PROPOS V LISTA DE FIGURAS X LISTA DE TABLAS XIII ABREVIATURAS XIV 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 3 2.1 COLORANTES EN MÉXICO 3 2.2 PLANTAS TINTÓREAS 3 2.2.1 FLOR DE CEMPAXOCHILT (TAGETES SPP) 4 2.2.2 GUALDA (RESEDA LUTEOLA) 5 2.2.3 ZACATLAXCALLI (CUSCUTA TINTOREA) 6 2.2.4 GOBERNADORA (LARREA TRIDENTATA) 7 2.3 PROCESOS DE EXTRACCIÓN DE LOS COLORANTES 8 2.4 TIPOS QUÍMICOS DE COLORANTES 10 2.5 CONCEPTO DE MARCADOR MOLECULAR 11 2.6 FLAVONOIDES 12 2.7 LIGNANOS 14 2.8 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA EL ESTUDIO DE COLORANTES EN EL PATRIMONIO 15 2.9 DETECTOR QTOF 18 2.10 CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR EN HPLC-ESI-MS 21 2.11 CREACIÓN DE LIBRERÍAS ESI-MS 22 2.12 ANÁLISIS DE FLAVONOIDES POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS 23 2.13 ANÁLISIS DE LIGNANOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS 27 2.14 ANTECEDENTES HISTÓRICOS: LA CUEVA DE LA CANDELARIA 29 2.15 CESTA ARQUEOLÓGICA 31 2.16 PRESENTACIÓN DE UNA ESTRATEGIA DE ANÁLISIS DE OBJETOS DEL PATRIMONIO 32 3. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO 34 4. OBJETIVOS 35 4.1 OBJETIVO GENERAL 35 [ix] 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES 35 5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 37 5.1 MATERIALES UTILIZADOS 37 5.2 METODOLOGÍAS PARA LA OBTENCIÓN DE LACAS 39 5.2.1 PROCEDIMIENTO 1 39 5.2.2 PROCEDIMIENTO 2 39 5.3 COLECTA DE PLANTAS TINTÓREAS 40 5.5 PREPARACIÓN DE EXTRACTOS DE LARREA TRIDENTATA 42 5.6 PREPARACIÓN DE RÉPLICAS DE TINCIÓN. 43 5.7 MUESTRAS DE TEXTIL ARQUEOLÓGICOS 44 5.6 DESCOMPLEXACIÓN DE LACAS 45 5.6.1 METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN CON BF3 45 5.7 DESCOMPLEXACIÓN DE LOS PIGMENTOS DE TEXTILES 46 5.7.1 EXTRACCIÓN CON HCL AL 37 % V/V 46 5.7.2 EXTRACCIÓN CON ÁCIDO FÓRMICO 47 5.8 PROTOCOLO DE ANÁLISIS HPLC-DAD-QTOF 47 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 49 6.1 ANÁLISIS DE ESTÁNDARES DE FLAVONOIDES 49 6.2 ESTUDIO DE LACAS AMARILLAS 53 6.2.1 LACAS PREPARADAS A PARTIR DE TAGETES SPP 54 6.2.2 LACAS PREPARADAS A PARTIR DE CUSCUTA TINTOREA 58 6.2.3 LACAS PREPARADAS A PARTIR DE RESEDA LUTEOLA 61 6.3 ANÁLISIS DEL MATERIAL BOTÁNICO DE LARREA TRIDENTATA 63 6.4 ANÁLISIS DE MUESTRAS ARQUEOLÓGICAS 69 7. CONCLUSIONES 74 REFERENCIAS. 77 ANEXO 1 82 IDENTIFICACIÓN DE LA PROPIEDAD CULTURAL 82 ANEXO 2 83 ARTÍCULO ACEPTADO 83 [x] LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribución de la flor de cempaxochilt a lo largo de la República Mexicana. Pág. 4 Figura 2. Flor de cempaxóchilt.Pág. 4 Figura 3. Distribución de la planta tintórea Gualda en la República mexicana. Pág. 5 Figura 4. Reseda luteola. Pág. 5 Figura 5. Planta de Zacatlaxcalli. Imagen tomada del Códice Florentino libro XI. Pág. 6 Figura 6. Distribución de la planta Gobernadora a lo largo de la República Mexicana. Pág. 7 Figura 7. Planta Larrea trindentata. Pág. 7 Figura 8. Complejación entre las fibras del textil, el mordiente y el pigmento (Kirby, 2014; Pauk 2014). Pág. 8 Figura 9. Complejo formado entre el catión metálico y el pigmento. Pág. 9 Figura 10. Estructura química de los colorantes orgánicos. Pág. 11 Figura 11. Estructura básica de un flavonoide. Pág. 12 Figura 12. Clasificación de los flavonoides y azúcares. Pág. 13 Figura 13. Estructuras principales de lignanos. a) dibencilbutano, b) dibencilbutirolactona, c) dibenciltetrahidrofurano y d) dibencilfurofurano. Pág. 14 Figura 14. Esquema de componentes básicos de un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Eficiencia. Pág. 16 Figura 15. Esquema del detector con cuadrupolo de tiempo de vuelo (QTof). Pág. 18 Figura 16. Generación de iones. Pág. 19 Figura 17. Esquema de ESI con tecnología Jet Stream. Pág. 20 Figura 18. Alcance de ESI en comparación de otras técnicas de ionización. ESI (Electrospray Ionization), API (Atmospheric Pressure Ionization), APCI (Atmospheric Pressure Photo Ionization), APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionization), EI (Electron Ionization). Pág. 21 Figura 19. Fragmentación de los flavonoides (Claeys, 2004). Pág. 23 Figura 20. Esquema de fragmentación de kaempferol-3-O-glucósido (March, 2006). Pág. 24 Figura 21. Esquema de fragmentación de quercetina-3-O-galactósido (March, 2006). Pág. 25 Figura 22. Mecanismo general de fragmentación para flavonoides tipo Retro Diels Alder (Ma, 1997; Claeys, 2004). Pág. 26 [xi] Figura 23. Fragmentación de un lignano, ejemplo: matairesinol R1=H. Esquema tomado de (Yamamoto, 2004). Pág. 27 Figura 24. Esquema de fragmentación de dibencilbutirolactona en modo negativo (Sjöholm, 2008). Pág. 28 Figura 25. Diagrama de la Cueva de la Candelaria. Pág. 29 Figura 26. Cesta tejida con grecas hallada en la Cueva de la Candelaria. Pág. 31 Figura 27. Estrategia para análisis de objetos provenientes del patrimonio cultural. Pág. 33 Figura 28. Flores de cempaxóchilt. Pág. 40 Figura 29. Lacas amarillas obtenidas de (a) cempaxóchilt, (b) zacatlaxcalli y (c) gualda. Pág. 41 Figura 30. Réplicas de tinción en algodón con Larrea trindetata. a) primer día de tinción, b) segundo día de tinción y c) tercer día de tinción. Pág. 43 Figura 31. Muestras de hilado a) ocre y b) café, bajo el microscopio al x 2.0. Fotografías proporcionadas por Adriana Reyes García del CNCPC- INAH. Pág. 44 Figura 32. Hidrólisis de rutina en medio ácido dando como producto quercetina. Pág. 46 Figura 33. Cromatograma parcial a λ=254 nm de una laca Tagetes spp con procedimiento 1. Pág. 54 Figura 34. Estructura de la quercetagetina. Pág. 55 Figura 35. Cromatogramas parciales en TIC de las lacas de cempaxóchilt naranja fresco a) procedimiento 1 y b) procedimiento 2. Pág. 55 Figura 36. Cromatograma parcial en TIC de una laca de Tagetes spp amarillo seco procedimiento 1. Pág. 56 Figura 37. Cromatograma parcial en TIC de una laca de Tagetes spp (cempaxochilt bicolor) seca con procedimiento 1. Pág. 57 Figura 38 Estructura de patuletina. Pág. 57 Figura 39. Tagetes patula. Pág. 58 Figura 40. Cromatograma parcial en TIC de la laca de Cuscuta tintorea naranja elaborará con el procedimiento 2. Pág. 59 Figura 41. Cromatograma parcial λ= 254 nm de la laca de Cuscuta tintorea naranja elaborada con el procedimiento 2. Pág. 59 Figura 42. Cromatograma parcial en TIC de Cuscuta spp (Zacatlaxcalli verde), fresco elaborada con el procedimiento 1. Pág. 61 Figura 43. Cromatograma parcial en TIC de laca de Reseda luteola fresca elaborada con el procedimiento 2. Pág. 62 [xii] Figura 44. Cromatogramas parciales en TIC de las infusiones a diferentes tiempos de Larrea tridentata. a) 1er día, b) 2do día y c) más de dos semanas. Pág. 65 Figura 45. (a) Ácido nordihidroguayaretico, (b) Especie oxidada. Pág. 66 Figura 46. Compuestos tentativos a) gosipetina, b) 3-hidroxilarreatricina. Pág. 66 Figura 47. Cromatogramas parciales en TIC de: a) algodón primer día, b) algodón segundo día y c) algodón más de dos semanas. Pág. 67 Figura 48. Cromatogramas parciales en TIC de: a) Lino primer día y b) Lino más oxidado. Pág. 67 Figura 49. Cromatograma parcial en TIC obtenido a partir del análisis de la fibra café proveniente del cesto tejido con grecas. Pág. 69 Figura 50. Cromatograma obtenido del hilado café cesto tejido con grecas a λ= 254 nm. Figura 51. Lignanos presentes en el extracto proveniente del cesto tejido con grecas. a) dimetoxi-6,3-O-dimetrilguauaicin, b) dimetil-6,3-O- dimetolisoguaiacin Pág. 70 Pág. 71 Figura 52. Cromatogramas parciales en TIC: a) algodón en 2do día y b) muestra de textil arqueológico hilado ocre. Pág. 72 [xiii] LISTA DE TABLAS Tabla 1. Estándares de Flavonoides Pág. 37 Tabla 2. Flavonas presentes en la biblioteca. Pág. 38 Tabla 3. Flavonoles presentes en la biblioteca. Pág. 38 Tabla 4. Lacas amarillas. Pág. 41 Tabla 5. Extractos de Larrea trindetata. Pág. 42 Tabla 6. Réplicas de tinción. Pág. 43 Tabla 7. Gradiente. Pág. 47 Tabla 8. Condiciones de trabajo para DAD. Pág. 48 Tabla 9. Condiciones de análisis para el detector QTof. Pág. 48 Tabla 10. Fragmentación en ESI-MS y máximos en UV-Vis de estándares de flavonoides Pág. 50 Tabla 11. Fragmentos esperados teóricamente y obtenidos experimentalmente a partir de la fragmentación de los anillos A y B. Pág. 51 Tabla 12. Curvas de calibración de estándares de flavonoides. Detección a λ=254 nm. Pág. 52 Tabla 13. Flavonoides detectados en las lacas Pág. 53 Tabla 14. Concentración de flavonoides en lacas de Tagetes spp naranja. Pág. 56 Tabla 15. Flavonoides en laca de zacatlaxcalli elaborada con procedimiento 2. Pág. 60 Tabla 16. Flavonoides de la laca de Reseda luteola fresca elaborada con el procedimiento 2. Pág. 62 Tabla 17. Compuestos presentes en las infusiones y reproducciones de tinción con la planta gobernadora. Pág. 63 Tabla 18. Polímeros presentes en la cesta tejida. Tabla 19. Compuestos que presentan color en el hilado café. Pág. 70 Pág. 71 Tabla 20. Compuestos presentes en el textil. Pág. 72 [xiv] ABREVIATURAS HPLC High Performance Liquid Chromatography (Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia) MS Mass Spectrometry (Espectrometría de Masas) ESI Electrospray Ionization (Ionización por Electrospray) API Atmospheric Pressure Ionization (Ionización por Presión Atmosférica) APPI Atmospheric Pressure Photo Ionization (Fotoionización por Presión Atmosférica) APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Ionización Química por Presión Atmosférica) EI Electron Ionization (Impacto Electrónico) CG Cromatografía de Gases FORS Fiber Optics Reflectance Spectroscopy XFR X-Ray Flourescence (Flourescencia de Rayos X) QTof Quadrupole Time of Flight (Cuadrupolosencillo tiempo de vuelo) NIST National Institute of Standars and Technology DAD Diode Array Detection (Detector con Arreglo de Diodos) Bw Bandwidth (Ancho de banda) TIC Total Ion Chromatogram UV-Vis Ultravioleta-Visible CNCPC Coordinación Nacional de Conservación del Patrimonio Cultural MeOH Metanol HCl Ácido Clorhídrico PEG 300 Polietilenglicol 300 mL mililitros mg miligramos mm milímetros nm nanómetros % v/v porcentaje volumen/ volumen °C grados Celsius [1] 1. RESUMEN El patrimonio cultural se compone de un gran número de objetos entre los cuales se encuentran una gran cantidad de textiles, códices y murales que contienen compuestos orgánicos entre sus materiales constitutivos y, a su vez, se presentan diversos pigmentos y colorantes. Desde la antigüedad, se han explotado fuentes biológicas para la obtención de colorantes y pigmentos, debido a que el territorio mexicano cuenta con una gran diversidad de recursos naturales que pueden ser fuente de colorantes, sin embargo, la información botánica sobre los recursos a explotar, las técnicas de obtención y la aplicación de los mismos en la época precolombina, siguen siendo una incógnita hasta nuestros días, debido a la destrucción de las fuentes históricas después de la llegada de los europeos a Mesoamérica y a la escasez de fuentes documentales anteriores al siglo XVI y al relego de los saberes tradicionales por parte de la sociedad contemporánea. El propósito de presente trabajo fue crear una base de espectros ESI-MS y UV de flavonoides, para su posterior identificación en lacas y textiles tanto modernos como pertenecientes al patrimonio cultural. El desarrollo de la biblioteca ESI-MS de flavonoides constituyó una etapa indispensable en la identificación de estas moléculas, ya que las características de los espectros de masas obtenidos por esta técnica dependen directamente de las condiciones utilizadas para los análisis (temperatura y flujo del gas de impulsión, presión del nebulizador, voltaje del capilar, voltaje de la boquilla, temperatura del gas de secado y el flujo del gas de secado y voltaje de la energía de colisión), así como del diseño del detector y del fabricante del detector MS. Se generó una base de materiales la cual consistió en lacas, réplicas de tinción y extractos de plantas tintóreas. [2] Para la producción de lacas, se utilizaron algunas de las plantas que producen colores amarillos citadas por los cronistas del siglo XVI concretamente: cempaxochilt, gualda y zacatlaxcalli. Estas lacas fueron preparadas siguiendo los métodos de ese mismo siglo. Para su análisis, el presente proyecto precisó el desarrollo de un protocolo HPLC- DAD-QTof adaptado al estudio de colorantes orgánicos, presentes en objetos del patrimonio. Para concluir el presente trabajo, se aplicó el protocolo desarrollado en HPLC-DAD- QTof al estudio de una pieza arqueológica, una cesta multicolor proveniente de la Cueva de la Candelaria, en Torreón, Coahuila, susceptible a contener flavonoides. [3] 2. INTRODUCCIÓN 2.1 COLORANTES EN MÉXICO En el México pre Colombino existieron un gran número de pigmentos orgánicos, los cuales fueron utilizados entre una amplia gama de aplicaciones en la elaboración de códices como son el Cospi y el Fejérváry-Mayer (C. Miliani, 2011)35, el teñido de textiles, alimentos, etc. En libro XI del códice Florentino, escrito en el siglo XVI por F.B. Sagahún, “De las propiedades de los animales, aves, peces, árboles, hierbas, flores, metales y piedras, y de los colores”, se narra el proceso de obtención de los colorantes y de qué plantas o animales podían ser extraídos (Sahagún, 2016)49. Sin embargo, debido a la época en que este escrito fue redactado, la identificación botánica de las fuentes de colorantes resulta imprecisa y se presta a incertidumbres. 2.2 PLANTAS TINTÓREAS A lo largo y ancho del territorio nacional, se ha reportado el uso de distintas plantas con fines tintóreos, religiosos e inclusive medicinales, cuyo uso se conserva hasta nuestros días. Una planta tintórea produce grandes cantidades de moléculas que influyen a la coloración de la misma, estas moléculas pueden ser flavonoides, carotenoides, antraquinonas, lignanos y/o betalinas que producen tonos que van del amarillo tenue hasta el rojo. Como se mencionó anteriormente, hay varias fuentes que se explotan desde la época precolombina para producir tonalidades amarillas y cafés las cuales son el cempaxóchilt, la gualda y el zacatlaxcalli, de acuerdo con los cronistas del siglo XVI (Sahagún, 2016)49 en el caso de la planta Larrea tridentata se cuenta con antecedentes uso de tipo etnográfico. [4] 2.2.1 FLOR DE CEMPAXOCHILT (TAGETES SPP) La flor de cempaxochilt (Tagetes spp), es una flor anual típica mexicana (García, 2006)18 que se encuentra presente en los siguientes estados: Chiapas, Estado de México, Morelos, Puebla, San Luis Potosí, Sinaloa, Tlaxcala y Oaxaca (Vibrans, 2017)22. Figura 1. Distribución de la flor de cempaxochilt a lo largo de la República Mexicana. Esta flor (figura 2) es una fuente de flavonoides y carotenoides, los cuales le confieren su color característico, entre los principales flavonoides que contiene esta planta se encuentra la quercetagetina y la quercetina (González, 2012; Marquet, 2014)7,33, moléculas que pueden ser utilizadas potencialmente como marcadores moleculares para esta especie. Figura 2. Flor de cempaxochilt. [5] 2.2.2 GUALDA (RESEDA LUTEOLA) La planta tintórea Gualda (Reseda luteola) posee una flor de temporada. Esta especie se encuentra distribuida de la siguiente manera a lo largo del país: Aguascalientes, Coahuila, Ciudad de México, Durango, Hidalgo, Jalisco, Estado de México, Michoacán, Morelos, Nuevo León, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas (Vibrans, 2014)21, como se observa en la figura 3. Figura 3. Distribución de la planta tintórea Gualda a lo largo de la República Mexicana. Esta planta no solamente ha sido utilizada con fines tintóreos en México, sino también en otros países. Esto se debe primordialmente a su abundancia en Europa, Asia Occidental y en Norteamérica (Cristea, 2003)8, siendo muy utilizada para textiles y pinturas principalmente (Marques, 2009; Ferreira, 2003; Valianou, 2009)32,14,57. La composición molecular de la Reseda luteola (figura 4) incluye los siguientes flavonoides: luteolina, apigenina y crisoeriol los cuales se encuentran en la planta en forma de glucósidos (Petroviciu, 2010; Marquet, 2014)45,33. [6] Figura 4. Reseda luteola 2.2.3 ZACATLAXCALLI (CUSCUTA TINTOREA)A diferencia de las plantas mencionadas anteriormente (cempaxóchilt y gualda), el zacatlaxcalli (figura 5) es una planta tintórea parásita que se encuentra distribuida a lo largo de todo país, por ello ha sido ampliamente utilizada. Su composición molecular comprende principalmente los siguientes flavonoides: quercetina, kaempferol e isorhamnetina, así como los respectivos glucósidos de estas moléculas (Shibayama, 2004)64. Figura 5. Planta de Zacatlaxcalli. Imagen tomada del Códice Florentino libro XI. [7] 2.2.4 GOBERNADORA (LARREA TRIDENTATA) Las plantas mencionadas anteriormente se utilizan principalmente al sur del país a diferencia de la planta gobernadora (Larrea tridentata). Esta especie se distribuye en el norte del país en los siguientes estados: Aguascalientes, Baja California Sur, Chihuahua, Coahuila, Durango, Guanajuato, Nuevo León, Querétaro, San Luis Potosí, Sonora, Tamaulipas y Zacatecas (Vibrans, 2009)60. Figura 6. Distribución de la planta Gobernadora a lo largo de la República Mexicana. La planta gobernadora (Larrea tridentata), es llamada así ya que predomina en el paisaje del norte del país. Su perfil molecular esta conformado por lignanos y flavonoides entre los cuales se encuentran el ácido nordihidroguayaretico y gosipetina, respectivamente. Figura 7. Planta Larrea tridentata. [8] Cabe mencionar que los perfiles moleculares de los extractos de plantas tintóreas se ven influidos por factores tales como el tipo de suelo, el clima y la época anual de la colecta (Ocampo, 2008)41. 2.3 PROCESOS DE EXTRACCIÓN DE LOS COLORANTES En general, la obtención de los pigmentos a partir de una planta tintórea se realiza en disolución acuosa, la cual puede ser utilizada para llevar a cabo directamente la tinción de alguna fibra natural o para la obtención de lacas para su uso en pinturas, en ambos casos la planta se hierve en agua y posteriormente se filtra para retirar el material vegetal del extracto. Para llevar a cabo la tinción, después de la extracción del pigmento, se utilizan sustancias auxiliares (mordientes) que químicamente son ácidos o sales inorgánicas cuya función es facilitar la fijación del colorante sobre fibras naturales como son el algodón, la lana y la seda (Mayolo, 1989)35. La fijación del color se debe a la formación del compuesto de coordinación entre la fibra del textil, el mordiente y el pigmento, (Kirby, 2014; Pauk, 2014)24,43. Figura 8. Complejación entre las fibras del textil, el mordiente y el pigmento (Kirby, 2014; Pauk, 2014)24,43. [9] En la figura 8, se observa cómo el mordiente al disolverse en medio acuoso forma un catión que se coordina con la fibra y el agua como ligantes, posteriormente el agua se sustituye por la molécula orgánica del pigmento, consiguiendo así el compuesto final que corresponde al compuesto de coordinación. La obtención de las lacas se lleva a cabo por medio de la precipitación o adsorción de un colorante orgánico sobre un sustrato inorgánico insoluble, proceso mediante el cual se logra un compuesto de coordinación estable (Clementi, 2008; Degano, 2009; Bourhis, 2011)11,16,5, creando así la laca. Los sustratos más utilizados son las sales inorgánicas de aluminio, hierro, estaño y cobre (García, 2006)18, estas forman un complejo entre el catión metálico con las moléculas del pigmento orgánico (Vankar, 2000)58 como se mencionó anteriormente, se tiene un ejemplo de ello en la figura 9. Figura 9. Complejo formado entre el catión metálico y el pigmento. El uso de mordientes y soportes, así como el pH afectan directamente el color de tinción y la obtención de las lacas. El color obtenido depende de diversas condiciones las cuales deben ser controladas, primordialmente la temperatura, el pH y el orden de adición de los mordientes o soportes, según sea el caso. [10] 2.4 TIPOS QUÍMICOS DE COLORANTES Los colorantes orgánicos son moléculas que cuentan con sistemas de dobles enlaces conjugados. Estos sistemas absorben una longitud de onda de luz y reflejan otra lo cual les confiere un color característico, por su estructura molecular estos se pueden clasificar en: a) Índigoides, pueden ser extraídos de la planta Indigorifera ssp y los caracoles de la púrpura Murex spp (Rokero, 1995)47 y su tonalidad es azul. b) Flavonoides, se encuentran en los pétalos de las flores como el cempaxóchilt y la gualda, su tonalidad va de amarillo tenue hasta rojo. c) Dihidropiranos, se encuentran presentes en el palo de brasil (Vankar, 2000; Kirby, 2014)58,24 están relacionadas con las flavonas por su estructura molecular, dando coloraciones rojas. d) Carotenos, se encuentran presentes en diferentes fuentes vegetales como la zanahoria, en general son colorantes con una tonalidad entre amarillo y naranja. e) Antraquinonas, se encuentran presentes en algunas plantas como la garanza e insectos como la cochinilla y el quermes (Sanyova, 2006)55. Su coloración es roja. f) Naftoquinonas, se encuentran principalmente en plantas como el plúmbago y la drosera (López, 2011)29, y su coloración va del amarillo hasta el rojo intenso. g) Lignanos, se encuentran en plantas como la gobernadora (Vassao, 2010)15, su coloración va del amarillo al café. [11] N H N HO O O O O O (a) (b) (d) (e) (f) O CH3 CH3 CH3 CH3OH OH O O O OH O OH OHOH O ( c ) O O (g) Figura 10. Estructura química de los colorantes orgánicos. 2.5 CONCEPTO DE MARCADOR MOLECULAR El uso de los biomarcadores moleculares, operando en su modo más simple, consiste en relacionar estructuras o distribuciones que son “huellas químicas”, con compuestos y mezclas provenientes de organismos explotados en el pasado. Algunas pocas veces, la estructura de un único componente es suficiente para definir el origen de un material o residuo orgánico. Uno de los aspectos fundamentales del concepto de biomarcador es que su fuente pueda ser encontrada de acuerdo a los arreglos de los carbonos del mismo. Entre más únicas sean las estructuras en un organismo, será mayor la certeza de la presencia de un constituyente en particular de acuerdo al marcador observado (Evershed, 2008)12. Los metabolitos secundarios son producidos solo en una especie o un grupo de plantas taxonómicamente relacionadas (Maier, 1997)2. Los flavonoides y los lignanos son metabolitos secundarios por lo que se pueden utilizar como biomarcadores moleculares para la identificación botánica de pigmentos producidos a partir de plantas. [12] 2.6 FLAVONOIDES Los colorantes amarillos de origen vegetal están conformados principalmente por flavonoides (del latín Flavus, “amarillo”) y carotenoides, los cuales se utilizan desde la antigüedad para la tinción de textiles y como pigmentos en pinturas. Por su relativa estabilidad pueden ser utilizados como biomarcadores moleculares (Maier, 1997)2, para elucidar la fuente vegetal usada como materia prima por culturas antiguas o por un artista determinado, según sea el caso. Los flavonoides se encuentran presentes en una gran cantidad de alimentos y muchos de ellos tienen efectos antioxidantes, antiinflamatorios, antivirales e inclusive son utilizados como anticancerígenos (Agrawal, 2011)1. Químicamente los flavonoides son especies cromóforas que producen colores que van de amarillo tenue hasta el rojo debido a su estructura molecular que cuenta con tres anillos y un sistema π conjugado. Estos compuestos son polifenólicos polares cuya estructura consiste en dos anillos aromáticos (A y C) unidos por tres átomos de carbono que forman un heterociclo oxigenado (B). Los átomos de carbono en los anillos A y B se enumeran del 2 al 8, y los del anillo C desde el 2´ al 6´ como se observa en la figura 11. O OOH R1 R2 R3 AB C 8 7 6 5 4 3 2 1´ 2´ 3´ 4´ 5´ 6´ Figura 11. Estructura básica de un flavonoide. [13] La nomenclatura de los flavonoides depende de la(s) posición(es) en las que se encuentran sustituidos (figura 12). Estos compuestos pueden estar unidos a azúcares o grupos sulfatos (Zhang, 2007)67, su clasificación se presenta en la figura 12. O A C O O A B O O O O O O OH O + Chalcona Flavona Isoflavona Flavonona Flavonol O OH OH OH OH OH -D-Glucosa Antocianidina O OH OH OH OH OH O OH OH OH OH CH3 L-Arabinosa -D-Galactosa L-Ramnosa O OH OHOH CH3 C Figura 12. Clasificación de los flavonoides y azúcares. [14] 2.7 LIGNANOS Los lignanos al igual que los flavonoides son metabolitos secundarios polifenólicos, los cuales se encuentran presentes en diversas plantas y semillas, por ejemplo: en las semillas de linaza, las semillas de calabaza, el brócoli y la gobernadora (Li, 2014)27. Muchas de estas moléculas presentan actividad fisiológica, como anticancerígenos y antioxidantes (Li, 2014)27, inclusive algunos de ellos son utilizados para el tratamiento de la hepatitis viral y la protección del hígado (Moss, 2000)38. El esqueleto de los lignanos se forma a través de dos estructuras de fenilpropano enlazadas por el átomo central de sus cadenas laterales (Boluda, 2005). Existen cuatro tipos principales de esqueletos de los lignanos, con la estructura más simple: derivados de dibencilbutano, derivados de la dibencilbutirolactona, derivados de tetrahidrofurano y derivados de furofurano (Boluda, 2005). a) b) c) CH3 CH3 O O O d) O O Figura 13. Esqueletos principales de lignanos. a) dibencilbutano, b) dibencilbutirolactona, c) dibenciltetrahidrofurano y d) dibencilfurofurano. [15] 2.8 CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA EL ESTUDIO DE COLORANTES EN EL PATRIMONIO La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales se encuentra en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida. En cromatografía de líquidos, la fase móvil es un líquido y la fase estacionaria puede ser un líquido o un sólido. El tipo de fase que se elige depende de la naturaleza de los componentes a separar. La base para la separación es la adsorción (K de adsorción) de la muestra dentro o fuera del sólido adsorbente. La Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia (CLAE) o por sus siglas en inglés HPLC (High Perfomance Liquid Chromatography) es ampliamente utilizada para separar analitos polares, no volátiles y termolábiles. También permite realizar estudios cualitativos y cuantitativos de los mismos, dependiendo del tipo del detector al que se encuentre acoplado al cromatógrafo. El cromatógrafo de líquidos cuenta con los siguientes componentes básicos: un dispositivo que provee eluyente (sistema de bombas), un puerto de inyección, una columna que lleva a cabo la separación, uno o más detectores y el sistema de recolección de datos. En la figura 14 se presenta un esquema de un cromatógrafo de líquidos. [16] Figura 14. Esquema de componentes básicos de un Cromatógrafo de Líquidos de Alta Eficiencia. De acuerdo con la fase estacionaria sólida utilizada, la cromatografía se clasifica de la siguiente manera: ❖ Fase normal: es aquella en que la fase estacionaria es polar y la fase móvil es apolar. ❖ Fase inversa: es aquella en la fase estacionaria es apolar y la fase móvil es ligeramente polar. Los detectores que se utilizan en cromatografía de líquidos dependen de la naturaleza de los analitos a analizar, y deben de cumplir con ciertos requisitos como una alta sensibilidad, estabilidad y reproducibilidad. Uno de los detectores ampliamente utilizados es el espectrofotómetro de UV-Vis, su uso se encuentra limitado a la detección de analitos que absorben en la longitud de onda del UV y de la luz visible. A diferencia del espectrofotómetro de UV-Vis, el espectrómetro de masas permite la elucidación de los componentes a partir de la fragmentación de las moléculas en la muestra. [17] La técnica se basa en la medición de la relación masa/carga de las especies moleculares. Para obtener la medición, se requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, esta técnica posibilita la obtención del peso exacto de la molécula de interés. En el marco del presente estudio, de colorantes orgánicos, se utilizó una doble detección que implica el uso de los dos detectores anteriormente mencionados. La detección UV-Visible discrimina a los compuestos que no presentan color, esto permite enfocar el análisis en espectrometría de masas solamente en las moléculas que influyen en el color de una muestra, optimizando el tiempo de interpretación de los análisis. [18] 2.9 DETECTOR QTOF El detector QTof, por sus siglas en inglés Quadrupole Time of Flight (Cuadrupolo tiempo de vuelo), cuenta con una alta sensibilidad por lo que es ampliamente utilizado en el campo del estudio de los colorantes orgánicos presentes en el patrimonio cultural. Este instrumento logra una gran precisión y exactitud, difíciles de lograr con otro tipo de detectores, además, es compatible con diferentes tipos de ionización como lo es API (Atmospheric Pressure Ionization), MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) y ESI (Electrospray ionization). En la figura 15 se presenta el esquema del detector QTof. Figura 15. Esquema del detector con cuadrupolo de tiempo de vuelo (QTof). [19] El cuadrupolo de tiempo de vuelo cuenta con un nebulizador y una fuente de iones, los cuales generan las especies cargadas en alto vacío, el cuadrupolo cuenta con diversos sistemas para impedir que los iones generados se desvíen de su curso hacia al detector de masas. Posteriormente se encuentra el capilar por el cual pasan los iones y continúa con un detector de iones con acoplamiento óptico, para finalmente terminar con el detector de masas. Con este tipo de detector es posible realizar es el análisis MS/MS; este instrumento al contar con el cuadrupolo permite la selección de un ion sobre el cual se prosigue la fragmentación, obteniendo así espectros de MS/MS. El equipo con el que se realizaron los análisis del presente trabajo tiene una interface ESI. Este tipo de ionización por electrospray se lleva a cabo en cuatro pasos, la primera fase consiste en la formación de iones, la segunda es la nebulización para continuar con la desolvatación y por último la evaporación de los iones que pasan enseguida al espectrómetro de masas: en la figura 16, se observa la generación de microgotas debido a la desolvatación. Figura 16. Generación de iones. [20] En la figura 17 se observa la interface de ESI del equipo utilizado en el presente trabajo, esta interfaz cuenta con un Jet Stream el cual aumenta la sensibilidad, mediante el aumento de la focalización de las gotas generadas en el electrospray, además, de usar nitrógeno el cual ayuda a evaporar el disolvente generando gotas mucho más pequeñas, aumentando así la carga y reduciendo, por ende, el ruido en la respuesta y aumentando la señal obtenida. Figura 17. Esquema de ESI con tecnología Jet Stream. [21] 2.10 CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR EN HPLC-ESI-MS Las muestras que es posible analizar por medio de HPLC-ESI-MS pueden o no ser termolábiles, polares, además de ser iones en disolución, catecolaminas, sulfatos conjugados o aminas cuaternarias. De igual manera, se pueden analizar compuestos que presenten carga inducida o que contengan heteroátomos y que presenten carga múltipleen disolución, tales como: proteínas, péptidos y oligonucleótidos. En la figura 18 se observa el rango de aplicación de ESI-MS para el análisis de muestras en comparación de otras técnicas de ionización, como se puede apreciar la técnica ESI-MS presenta un amplio intervalo de alcance de análisis que va de pequeñas moléculas a macromoléculas. Figura 18. Alcance de ESI en comparación de otras técnicas de ionización. ESI (Electrospray Ionization), API (Atmospheric Pressure Ionization), APCI (Atmospheric Pressure Photo Ionization), APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionization), EI (Electron Ionization). P e s o M o le c u la r [22] 2.11 CREACIÓN DE LIBRERÍAS ESI-MS Las librerías existentes en espectrometría de masas como NIST (National Institute of Standars and Technology) no se pueden transferir a HPLC-MS debido a que las técnicas de ionización utilizadas en HPLC como lo son API (Atmospheric Pressure Ionization) y ESI (Electrospray Ionization) (Schreiber, 2000), son diferentes a la técnica de ionización por Impacto Electrónico (IE), que es la técnica en la cual se basa NIST. Además, en cromatografía de gases la energía de ionización utilizada en IE es un parámetro estándar fijo a 70 eV (Volná, 2008)61, en cambio en HPLC-MS la energía de ionización puede variar dependiendo de las necesidades del analista, complicando así la transferencia de librerías. Los principales parámetros que se deben controlar para la obtención de resultados reproducibles mediante esta técnica son los siguientes: temperatura y flujo del gas de impulsión sobrecalentado, presión del nebulizador, voltaje del capilar, voltaje de la boquilla, temperatura y flujo del gas de secado y el flujo del gas de secado y la energía de colisión. Otro parámetro que se debe adaptar es la polaridad utilizada que puede ser en modo positivo, negativo o dinámica. La elección de la polaridad depende de la naturaleza de los compuestos a analizar, es decir de los grupos funcionales que los analitos presenten. Cabe mencionar que se pueden obtener resultados diferentes en diferentes equipos debido a las diferencias de diseño entre fabricantes lo cual se manifiesta como diferencias en las abundancias de las fragmentaciones (Volná, 2008)61, lo cual puede afectar la identificación de los compuestos presentes en la muestra. Una vez que se establecieron las condiciones óptimas para la generación de la librería, se puede obtener muchísima información, puesto que la fragmentación del espectro de masas de un compuesto es característica, lo que permite la identificación de los mismos. [23] 2.12 ANÁLISIS DE FLAVONOIDES POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS Para el presente trabajo se eligió la polaridad negativa en el espectrómetro de masas, ya que estudios precedentes demuestran que la sensibilidad de análisis es superior para los flavonoides, debido a la generación de iones negativos. Además, la fragmentación se ve mayormente favorecida debido a la combinación de ESI-MS pues permite que en esta se lleve a cabo mucho más rápido (Fabre, 2001; Wu, 2004; Careri, 1999; Troalen, 2014)13,63,6,56. El tipo de ionización que se lleva a cabo mediante la polaridad negativa es la desprotonación generando iones negativos con carga -1 (Careri, 1999)6, este tipo de ionización es muy utilizada para especies fenólicas, ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, puesto que son especies que logran estabilizar este tipo de carga mediante la resonancia. Los flavonoides se fragmentan de una manera típica, como se muestra en la siguiente figura 19. En el caso de que en la estructura se encuentre glucosados, el primer fragmento generado procede de la pérdida del glucósido de la molécula. Figura 19. Fragmentación de los flavonoides (Claeys, 2004)10. Es importante señalar cómo se generan fragmentaciones diferentes debido a la sustitución de los flavonoides, en la figura 20 y en la figura 21, se muestran dos diferentes flavonoides los cuales se encuentran glucosados en la posición 3 y los diferentes iones generados. [24] Figura 20. Esquema de fragmentación de kaempferol-3-O-glucósido (March, 2006)31. En la figura 20 se observa el esquema de fragmentación para el flavonol kaempferol-3-O-glucósido, que presenta [M-H]- m/z=447, posteriormente el segundo fragmento más relevante en el esquema es el m/z= 285 el cual se obtiene debido a la pérdida del glucósido, además se tiene el fragmento m/z=284 debido a la pérdida de un protón en el kaempferol, del hidroxilo de la posición 3´ del flavonoide. Otros fragmentos que de igual forma se consideran para la identificación de los flavonoides son el fragmento m/z= 327 que se debe a la fragmentación del anillo del glucósido y los fragmentos m/z= 255 y 227 obtenidos directamente del kaempferol. En la figura 21 se observa el esquema de fragmentación de la quercetina-3-O- galactósido, y como se mencionó antes uno de los fragmentos más relevantes es el que corresponde a la pérdida del glucósido, [M-H]- de la quercetina-3-O-galactósido m/z=463, el fragmento m/z= 301 corresponde a la pérdida del galactósido. [25] Figura 21. Esquema de fragmentación de quercetina-3-O-galactósido (March, 2006)31. Existen otros fragmentos que se pueden observar en el esquema de la figura 21, que sirven para la identificación del flavonoide como el fragmento m/z=300 debido a la pérdida de un protón en la quercetina o el fragmento m/z=151 debido a la obtención de los anillos A y B del flavonoide y el fragmento m/z=271 obtenido a partir de la perdida de la cetona presente en la quercetina. Se deben de considerar la mayor cantidad de fragmentos para poder realizar una identificación completa de la molécula, Es imprescindible mencionar que con los esquemas anteriores no solamente se logran distinguir flavonoides por medio de la espectrometría de masas, sino que se logran identificar los glucósidos, así como en la posición en la que se encuentren estos debido a la fragmentación generada. [26] En la fragmentación de los flavonoides predomina una reacción Retro Diels-Alder (Claeys, 2004; Troalen, 2014)10,56 en la figura 22, se muestra el mecanismo Retro Diels-Alder para la obtención de los anillos A y B, los cuales corresponden al dieno y al dienofilo que formaban el ciclo. Figura 22. Mecanismo general de fragmentación para flavonoides tipo Retro Diels-Alder. (Ma, 1997; Claeys, 2004)10. Es imprescindible mencionar que el mecanismo sugerido en la figura 22 se propuso utilizando una polaridad positiva en la ionización. En la figura 22, se muestra cómo se obtienen los anillos A y B que anteriormente formaban el ciclo, es una reacción inducida por un sitio radical, en este caso, el oxígeno que forma el ciclo. Los intermediarios son estabilizados por medio de resonancia, haciendo posible la existencia de los mismos. [27] 2.13 ANÁLISIS DE LIGNANOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS En el presente trabajo, el análisis de los lignanos se llevó a cabo utilizando polaridad negativa. Estos metabolitos al ser compuestos polifenólicos son capaces de soportar la carga negativa generada mediante la ionización, debido a la resonancia que se genera. La figura 23 presenta el matairesinol la fragmentación típica de los lignanos (Yamamoto, 2004)64. Figura 23. Fragmentación de un lignano, ejemplo: matairesinol R1=H. (Yamamoto, 2004). A continuación, se muestra un esquema (figura 24) de cómo se lleva a cabo la fragmentación de otro lignano, la dibelcilbutirolactona en modo negativo. [28] Figura 24. Esquema de fragmentación de dibencilbutirolactona en modo negativo del lignano. (Sjöholm, 2008) Hay diversos fragmentos que caracterizan los espectros de masas de los lignanos, como lo son el m/z= 313 ó 317 obtenido por la pérdida de la lactona,en el cual se obtiene un anillo de tres carbonos, otro fragmento importante es el m/z= 327 obtenido de la perdida de la cetona de la lactona de la estructura principal, en el cual se propone como intermediario un anillo oxigenado, figura 24. Es importante tomar en cuenta el mayor número de fragmentos para la identificación de una molécula, ya que mediante ellos se puede ir describiendo la estructura de la misma por la pérdida de los grupos funcionales que la conforman. [29] 2.14 ANTECEDENTES HISTÓRICOS: LA CUEVA DE LA CANDELARIA La Cueva de la Candelaria se encuentra situada en la Sierra a la que se debe su nombre, en el estado de Coahuila en México, sus coordenadas son 25° 01´N, 102° 46´ W. El recinto mide 9 metros de alto, 1 metros de ancho y 15 metros de profundidad. En la figura 25, se puede observar un diagrama de la Cueva de la Candelaria (Huchet, 2013)23. Figura 25. Diagrama de la Cueva de la Candelaria. El recinto mortuorio data del año 1095 al 1315 d. C. (Anda, 1964)3, y se localiza en la zona de la Lagunera, el clima en la zona es árido lo cual hizo posible la conservación de una gran cantidad de fibras y textiles orgánicos que en otros contextos arqueológicos desaparecen con el tiempo por lo que la Cueva de la Candelaria es única en su tipo y uno de los sitios arqueológicos más importantes en el Norte de México. [30] La fauna que se encuentra en zonas aledañas es típica de una zona semi-desértica entre los cuales destacan lechugillas, nopales, candelilla, sangre de dragón, gobernadora, sotol, ocotillo, y el mezquite. Se sabe que fueron diferentes culturas las que habitaron esta zona del país, denominándose “laguneros”, los cuales se caracterizaron por compartir diferentes prácticas como la caza, la recolección de plantas y vegetales, siendo utilizadas no solamente para su alimentación, sino también para la obtención de fibras para sus textiles y para la obtención de colorantes orgánicos para la tinción de estos. En el recinto se encontraron 113 restos mortuorios (83 adultos y 33 adultos jóvenes) y diversos objetos arqueológicos, que se encuentran resguardados por el Instituto Nacional de Antropología e Historia (INAH). Entre estos materiales arqueológicos, se encuentran esteras, bandejas, marcos de madera y una gran cantidad de textiles (Pérez, 2015)44 que permiten comprender la tecnología utilizada por las culturas antiguas y su relación con el medio ambiente que los rodeaba. En los estudios anteriores al presente trabajo, llevados a cabo sobre los textiles de la Cueva, no se había logrado determinar la composición de los colorantes orgánicos. La identificación de los mismos es importante pues permitirá vislumbrar de mejor manera la tecnología desarrollada por las culturas del norte del país. Entre los textiles hallados en el recinto, se encontraron algunos cestos, los cuales han jugado un papel importante en las culturas antiguas (Pérez, 2015)44, cumpliendo diversas funciones como por ejemplo la recolección de alimentos, otros bienes y para su transporte. [31] 2.15 CESTA ARQUEOLÓGICA La pieza arqueológica que se estudió en este trabajo proviene de la Cueva de la Candelaria en Coahuila, se trata una cesta tejida con grecas, figura 26. Figura 26. Cesta tejida con grecas procedente de la Cueva de la Candelaria. La cesta fue tejida con fibras de agave utilizando la técnica de “twined basketry” (cestería trenzada), la cual presenta una decoración de grecas mediante hilos teñidos en colores ocre, café, rojo y negro. La cesta fue intervenida con fines de conservación en los años setenta con una solución de polietilenglicol (PEG 300) al 20% v/v, metilcelulosa al 0.1% m/v y almidón al 0.1% m/v con la finalidad de devolverle flexibilidad y firmeza a la fibra que constituye la cesta. [32] 2.16 PRESENTACIÓN DE UNA ESTRATEGIA DE ANÁLISIS DE OBJETOS DEL PATRIMONIO El estudio de los objetos del patrimonio cultural se lleva a cabo sobre una cantidad limitada de muestra, generalmente inferior a 1 mg (Sanz, 2012)51, además se presenta el inconveniente de que normalmente estas piezas se encuentran degradadas y presentan impurezas debido a retoques e intervenciones de conservación (Surowiec, 2007)54. Por ello, la creación y refinamiento de protocolos adaptados al análisis de estas muestras se realiza sobre materiales de referencia. Los materiales de referencia en el ámbito del estudio de los colorantes pueden ser los extractos de plantas o lacas preparadas a partir de la misma fuente vegetal, réplicas de textiles o de obras pictóricas y en el contexto mexicano réplicas de códices. La estrategia que se siguió para proponer un origen a la planta que tiñó las fibras de la cesta arqueológica de la Cueva de la Candelaria, consiste en lo siguiente: se estudió el perfil molecular de varios extractos de la planta Larrea tridentata, a su vez se hicieron réplicas de tinción utilizando la gobernadora como planta tintórea y se estudiaron los perfiles moleculares de los extractos del pigmento de las fibras, para finalmente comparar los perfiles moleculares con los extractos del colorante presente en las fibras ocre y café de la cesta arqueológica. En la figura 27, se muestra el esquema de la estrategia de trabajo propuesta. [33] Figura 27. Estrategia para análisis de objetos provenientes del patrimonio cultural. Muestra Moderna (Extracto, laca, réplica de tinción). Muestra Arqueológica: Contexto histórico. Referencias para modelar y caracterizar materiales del patrimonio. Análisis por medio de HPLC-DAD-QTof Interpretación de los resultados Caracterización de los colorantes modernos y arqueológicos. Sitio Arqueológico. Objeto Arqueológico: Cesta tejida y teñida. [34] 3. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO La creación de una biblioteca de espectros ESI-MS de flavonoides para el estudio de los colorantes amarillos propia para el laboratorio, es fundamental debido a que la fragmentación de los espectros de masas obtenidos por esta técnica depende de las condiciones utilizadas para los análisis, que ya se habían mencionado, como son la energía de colisión y la temperatura del gas de secado, el diseño del detector, la polaridad de la ionización, la temperatura del gas de impulsión sobrecalentado, el flujo del gas de impulsión, la presión del nebulizador, el voltaje del capilar, el voltaje de la boquilla, y el flujo del gas de secado. El desarrollo de los protocolos de análisis se realiza utilizando los materiales de referencia: lacas, extractos y réplicas de tinción. De la misma manera, la creación de un banco de lacas y réplicas de tinción de referencia es indispensable para investigar la influencia de las recetas de preparación y extracción sobre el perfil molecular de estos materiales. [35] 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL El presente trabajo tiene como objetivo principal la creación de una biblioteca de espectros UV-Vis y de ESI-MS de estándares de diversos flavonoides, que permita identificar estas moléculas en el perfil molecular de los colorantes amarillos presentes en objetos del patrimonio cultural. 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES 1. Colectar plantas tintóreas amarillas utilizadas tradicionalmente en el patrimonio cultural: Tagetes spp, Cuscuta spp, Reseda luteola y Larrea tridentata para conservarlas en un repositorio de materiales de referencia. 2. Realizar una búsqueda bibliográfica de recetas del siglo XVI, para la elaboración de lacas a partir de plantas tintóreas. 3. Preparar lacasa partir de las plantas tintóreas colectadas anteriormente siguiendo diferentes recetas del siglo XVI. 4. Preparar réplicas de textiles teñidos con estas plantas. 5. Desarrollar protocolos HPLC-DAD-QTof adaptados para llevar a cabo el estudio de colorantes amarillos provenientes de extractos vegetales, lacas y objetos del patrimonio. 6. Crear un repositorio de lacas y extractos, para el posterior análisis de los mismos utilizando los protocolos anteriormente desarrollados 7. Establecer una correlación entre el perfil molecular de la laca o extracto con su origen botánico: Tagetes spp, Cuscuta spp, Reseda luteola o Larrea tridentata utilizando la biblioteca UV-Vis y ESI-MS creada anteriormente. [36] 8. De manera paralela, se creará una biblioteca de espectros de UV-Vis y de ESI-MS de estándares de diversos flavonoides para poder detectar estas moléculas en el perfil molecular de materiales de interés. 9. Desarrollar una estrategia de estudio de colorantes en el patrimonio y aplicarlo al estudio de muestras de la cesta de la Cueva de la Candelaria susceptibles de contener colorantes orgánicos amarillos, con el fin de identificar la fuente taxonómica del colorante. [37] 5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 5.1 MATERIALES UTILIZADOS Se utilizó sulfato aluminio y de potasio dodecahidratado (AlK(SO4)2*H2O) fueron de Mallinckrodt. El carbonato de potasio degrado técnico, el HCl al 37% grado HPLC, el BF3 al 14% en metanol, el ácido fórmico al 98% y el metanol grado HPLC fueron de Sigma Aldrich. Se utilizaron filtros de membrana de 4 mm con un diámetro de poro de 0.22 µm de Millex. En el análisis cromatográfico se emplearon acetonitrilo grado HPLC, agua mili-Q y ácido acético > 99.7% v/v de Sigma Aldrich. La procedencia de los estándares de flavonoides utilizados para generar la biblioteca de ESI-MS y UV-Visible se resume en la tabla 1. Tabla 1. Estándares de Flavonoides. Flavonoide Fórmula Condensada Masa molecular Marca Apigenina C15H10O5 270.05 g/mol Sigma Aldrich Apigenina-7-O-glucósido C21H20O10 432.38 g/mol Roth Fisetina C15H10O6 286.24 g/mol Sigma Aldrich Genisteina C15H10O5 270.24 g/mol Sigma Aldrich Isorhametina-3-O-glucósido C22H22O12 478.41 g/mol Roth Kaempferol C15H10O6 286.24 g/mol Sigma Aldrich Kaempferol-3-O-glucósido C21H20O11 448.37 g/mol Sigma Aldrich Kaempferol-3-O-glucósido-7-O- rhamnosido C27H30O15 594.52 g/mol Roth Luteolina C15H10O6 286.24 g/mol Sigma Aldrich [38] Tabla 1. Estándares de Flavonoides (continuación). Flavonoide Fórmula Condensada Masa molecular Marca Luteolina-7-O-glucósido C21H20O11 448.37 g/mol Roth Luteolina-3´-7-O-diglucósido C27H30O16 610.52 g/mol Roth Morin C15H10O7 302.24 g/mol Sigma Aldrich Quercetina dihidratada C15H10O7 338.26 g/mol Roth Quercetina-3-O-galactósido C21H20O12 464.38 g/mol Sigma Aldrich Rhamnetina C16H12O7 316.26 g/mol Sigma Aldrich Rutina C27H30O16 610.52 g/mol Sigma Aldrich Las estructuras de los flavonoides (flavonas y flavonoles) que fueron analizados en este trabajo, se muestran a continuación en la tabla 2 y 3. Tabla 2. Flavonas presentes en la biblioteca. Estructura Flavona R1 R2 R3 Apigenina OH H OH Luteolina OH OH OH Tabla 3. Flavonoles presentes en la biblioteca. Estructura Flavonol R1 R2 R3 R4 R5 Rutina 3-O-rha-glu* H OH OH H Kaempferol OH H H OH H Quercetina OH H OH OH H Morin OH OH H OH H Rhametinaa OH H OH OH H Ishorhametina OH H OCH3 OH H Fisetina OH OH OH H H *3-O-rhamnosido-glucósido. aPosición 7 se encuentra metilada. [39] 5.2 METODOLOGÍAS PARA LA OBTENCIÓN DE LACAS A continuación, se presentan las metodologías utilizadas en el siglo XVI para la obtención de lacas amarillas (Kirby, 2014)24 y que fueron utilizadas en el presente trabajo para la obtención de las mismas. 5.2.1 PROCEDIMIENTO 1 Se pesaron 2.5 g de material vegetal, y se adicionaron 50 mL de agua mili-Q, el material se dejó infusionar durante 24 horas. Se agregaron 2.5 g de carbonato de potasio a la solución. Se calentó entonces la solución a 80 °C durante 45 minutos. Posteriormente se agregaron 6.5 ml de una disolución 0.35 M de sulfato doble de aluminio y potasio (KAl (SO4)2•12H2O). K2CO3 Se dejó precipitar la laca durante 12 horas. Después se filtró la solución, el filtrado se lavó con agua mili-Q y se dejó secar. 5.2.2 PROCEDIMIENTO 2 Se pesaron 2.5 g de material vegetal, y se adicionaron 50 mL de agua mili-Q, el material se dejó infusionar durante 24 horas, después la solución se calentó a 90 °C durante 30 min. Entonces se filtró la solución y se le adicionaron 2.5 g de sulfato doble de aluminio y potasio (KAl(SO4)2•12H2O) y 2.5 g de carbonato de potasio. Entonces se dejó precipitar la laca durante 12 hrs finalmente se filtró la solución y el filtrado se lavó con agua mili-Q y se dejó secar. [40] 5.3 COLECTA DE PLANTAS TINTÓREAS Para la preparación de las lacas amarillas, fue necesario llevar a cabo la recolección de las plantas tintóreas. Se obtuvo material vegetal de Zacatlaxcalli (Cuscuta tintorea) de origen certificado en la Ciudad de México. Se obtuvo Gualda de dos fuentes: una fue colectada en la Ciudad de México, y la segunda consistió en material vegetal seco de la marca Kremer. El material vegetal correspondiente a Larrea tridentata fue colectado por la Dra. Martha Sánchez y su equipo de trabajo, en las inmediaciones de la Cueva de la Candelaria, en Torreón. Las flores de cempaxóchilt (Tagetes spp) fueron compradas en el mercado permanente de la Central de Abastos en la Ciudad de México. Una vez colectadas las plantas tintóreas, se tuvo la precaución de no mezclar especies, por lo que para la flor de cempaxóchilt, se commpraron las plantas completas y no solo las flores, como se observa en la figura 28. Figura 28. Flor de cempaxochilt. [41] Una vez colectado el material vegetal se separó en dos lotes, el primero se congeló a - 50 °C, el segundo se deshidrató a temperatura ambiente, en ambos casos las plantas se envolvieron en papel aluminio para proteger el material vegetal de la luz. A partir de las diversas fuentes vegetales se prepararon las lacas de acuerdo con los procedimientos arriba mencionados. En la tabla 4 se describen las diferentes condiciones utilizadas para generar un banco de lacas de referencia, en la figura 29, se observan las mismas. Tabla 4. Lacas amarillas. Especie Estado Procedimiento Fecha de Colecta Fecha de preparación Zacatlaxcalli Seco 2 24/06/2015 09/06/2016 Zacatlaxcalli verde Fresco 1 06/05/2016 01/06/2016 Zacatlaxcalli Seco 1 24/06/2015 14/06/2016 Zacatlaxcalli Fresco 2 06/05/2016 02/06/2016 Cempaxochilt naranja Fresco 2 11/2015 07/06/2016 Cempaxochilt naranja Fresco 1 11/2015 05/06/2016 Cempaxochilt naranja Seco 1 11/2015 05/05/2016 Cempaxochilt naranja Seco 2 11/2015 07/05/2016 Cempaxochilt amarillo Fresco 1 11/2015 03/06/2016 Cempaxochilt amarillo Seco 1 11/2015 01/06/2016 Cempaxochilt bicolor Seco 1 11/2015 31/05/2016 Cempaxochilt bicolor Seco 2 11/2015 07/06/2016 Gualda Fresco 1 02/2016 24/02/2016 Gualda Fresco 2 02/2016 24/02/2016 (a) (b) (c) Figura 29. Lacas amarillas obtenidas de (a) Cempaxochilt, (b) Zacatlaxcalli y (c) Gualda. [42] 5.5 PREPARACIÓN DE EXTRACTOS DE LARREA TRIDENTATA Para Larrea tridentata se prepararon infusiones debido a que se buscaba su caracterización como pigmento de tinción de fibras. Las infusiones fueron preparadas por el equipo de la Dra. Martha Sánchez y del Dr. Orlando Zapata. Las reproducciones fueron realizadas utilizando la tecnología del post-clásico americano (1000-1600 d.C.), debido a que la pieza arqueológica que se estudió en el presente trabajo, corresponde a esa época.En la tabla 5 se resumen los tiempos durante los que se dejó infusionar el material vegetal de Larrea trindentata para la obtención de los correspondientes extractos. La primera infusión fue preparada extrayendo los colorantes de la planta durante un día, la siguiente infusión fue extraída durante cuarenta y ocho horas y finalmente la última infusión fue extraída durante dos semanas. Tabla 5. Preparación de extractos de Larrea trindetata. Extractos Color Un día Amarillo Dos días Rojo Más de dos semanas café [43] 5.6 PREPARACIÓN DE RÉPLICAS DE TINCIÓN. Las réplicas de textiles teñidos fueron elaboradas también por el equipo de los investigadores Martha Sánchez y Orlando Zapata. Se tiñeron 2 tipos de fibras: lino y algodón con las tres infusiones de la planta Larrea tridentata, mencionadas en la sección precedente. Puede observarse en la figura 30, el cambio de tonalidad de acuerdo con el tiempo de infusión en réplicas de algodón. Figura 30. Réplicas de tinción en algodón con Larrea trindetata. a) primer día de extracción, b) segundo día de extracción y c) tercer día de extracción. Para el teñido tanto el textil como el material vegetal se depositaron al mismo tiempo en 50 ml de agua destilada, bajo las siguientes condiciones y obteniendo las siguientes tonalidades: Tabla 6. Réplicas de tinción. Réplica de textil Color Algodón (un día de tinción en el extracto) Amarillo Lino (un día de tinción en el extracto) Amarillo Algodón (dos días de tinción en el extracto) Rojo Algodón (más de dos semanas de tinción en el extracto) Café Lino (más de dos semanas de tinción en el extracto) Café [44] 5.7 MUESTRAS DE TEXTIL ARQUEOLÓGICOS El muestreo se llevó a cabo en la cesta proveniente de la Cueva de la Calendaría, que se describió en la sección 2.15, de la cual se obtuvieron muestras del hilado ocre y café, en la figura 31 se observan los hilados que se estudiaron para el presente trabajo. Las muestras, fueron proporcionadas por la Dra. Martha Sánchez y el Dr. Orlando Zapata. Figura 31. Muestras de hilado a) ocre y b) café, bajo el microscopio al x 2.0. Fotografías proporcionadas por Adriana Reyes García del CNCPC-INAH Se utilizaron dos metodologías diferentes para la extracción del pigmento de las fibras. En el hilado color ocre se usó una hidrólisis suave con ácido fórmico y para el hilado de color café se llevó a cabo una extracción con ácido clorhídrico. a) b) [45] 5.6 DESCOMPLEXACIÓN DE LACAS A continuación, se describen las dos metodologías utilizadas para la descomplexación de los flavonoides presentes en las lacas de interés. El uso de HCl al 37% v/v es el método tradicionalmente utilizado para la descomplexación de las lacas, pero provoca una gran pérdida de información debido a la hidrólisis de los glucósidos, figura 32, por ello el presente trabajo utilizó una aproximación distinta, que implica el uso de BF3. La metodología, donde se utiliza BF3 al 4% v/v en metanol, preserva los glucósidos, pero presenta la desventaja de que se pueden llegar a obtener los ésteres correspondientes si se tienen presentes especies carboxílicas en la muestra original (Nowik, 2000), lo cual complica la interpretación de la composición molecular original de la muestra. 5.6.1 METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN CON BF3 Se pesó 1.0 mg de laca amarilla a la cual se le adicionaron 100 µL de BF3 al 4% v/v en metanol, la solución resultante se colocó en un baño ultrasónico, la reacción se llevó a cabo durante 24 horas. (Kirby, 1996)62. La solución resultante se pasó por un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0.22 µm. [46] 5.7 DESCOMPLEXACIÓN DE LOS PIGMENTOS DE TEXTILES Como se mencionó antes en el presente trabajo se utilizaron dos metodologías para el estudio de los textiles: la primera que implica el uso de HCl al 37% v/v y la segunda que implica el uso de ácido fórmico. En la figura 32, se presenta la reacción de hidrólisis de un flavonoide glucosado, llevada a cabo con HCl al 37% v/v. Figura 32. Hidrólisis en medio ácido de un diglucósido de quercetina. La metodología que emplea el ácido fórmico conserva los enlaces glucosídicos y provee perfiles moleculares más ricos, preservando más información acerca de la composición molecular del pigmento (Laursen, 2005; Zhang, 2008; Zhang, 2007)65,66,67. 5.7.1 EXTRACCIÓN CON HCL AL 37 % V/V Se pesa 1.0 mg de las fibras del textil y se le adicionan 150 µL de una disolución HCl:MeOH al 37 % v/v (1:1 % v/v) la cual se calienta a 40°C. Posteriormente se secó con N2. Finalmente, se redisuelve el extracto obtenido con 100 µL de una disolución MeOH: H2O (1:1 % v/v) y se filtra con una membrana con un diámetro de poro de 0.22 µm. [47] 5.7.2 EXTRACCIÓN CON ÁCIDO FÓRMICO Se pesa 1.0 mg de las fibras del textil al cual se le adicionan 400 µL de una disolución de metanol-ácido fórmico (95:5 % v/v) y se calienta a 40°C. Se seca el extracto con fuente de N2. Finalmente, se redisuelve el extracto obtenido con 50 µL de una disolución MeOH: H2O (1:1 % v/v) y se filtra con una membrana con un diámetro de poro de 0.22 µm. De lo anteriormente mencionado, se desprende que la selección del método de extracción de los colorantes a partir de textiles históricos es un paso clave, y la interpretación de los resultados debe tomar en cuenta el método utilizado. 5.8 PROTOCOLO DE ANÁLISIS HPLC-DAD-QTOF Se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta eficiencia (HPLC) acoplado a dos detectores, el primero fue un detector UV-Vis con Arreglo de Diodos y el segundo un espectrómetro de masas con cuadrupolo sencillo tiempo de vuelo (HPLC-DAD- QS-TOF), modelo G6530BA de la marca Agilent Technologies. Los análisis se realizaron usando una columna Poroshell 120 EC-C18 3.0 x 50 mm y 2.7 micras de Agilent. El gradiente utilizado consistió en una mezcla binaria de H2O miliΩ al 0.2 % v/v de ácido acético (A) y acetonitrilo al 0.2% v/v de ácido acético (B), el cual se muestra a continuación en la tabla 7. Tabla 7. Gradiente. Tiempo (min) 0.00 5.00 10.00 15.00 19.00 21.00 23.00 25.00 27.00 32.00 33.00 43.00 A% 98.0 90.0 50.0 40.0 30.0 30.0 20.0 10.0 0.0 0.0 98.0 98.0 B% 2.0 10.0 50.0 60.0 70.0 70.0 80.0 90.0 100.0 100.0 2.0 2.0 [48] La temperatura de la columna se mantuvo a 25 °C, con un flujo de 0.8 mL/min y el volumen de inyección fue de 1 µL. Las longitudes de onda monitoreadas con el detector de UV con arreglo de diodos (DAD) se muestran en la tabla 8 y los parámetros en el detector QTof, en la tabla 9. Tabla 8. Condiciones de trabajo para DAD. Monitoreo (nm) Bw Referencia (nm) Bw 210.0 4.0 630.0 8.0 254.0 4.0 630.0 8.0 275.0 4.0 630.0 8.0 330.0 4.0 630.0 8.0 540.0 4.0 630.0 8.0 Tabla 9. Condiciones de análisis para el detector QTof. Polaridad Negativa (NI) Voltaje capilar 3750 V Flujo del gas de secado 9 L/min Temperatura del gas de secado 275 °C Presión del nebulizador 37 psig Flujo del gas de impulsión 10 L Temperatura del gas de impulsión 300 °C Energía de colisión 10 eV Voltaje de la boquilla 1000 V Rango de masas 110-1000 m/z [49] 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 6.1 ANÁLISIS DE ESTÁNDARES DE FLAVONOIDES . En la tabla 10, se describe la fragmentación de los flavonoides en MS-ESI utilizando una energía de colisión de 10 eV, también se presentan los valores máximos característicos de los espectros UV-Vis a una longitud de onda de 254 nm. [5 0 ] Fórmula Molecular C27H30O16 C27H30O16 C21H20O12 C21H20O11 C27H30O15 C21H19O11 C22H22O12 C21H20O10 C15H10O6 C15H10O7 C15H10O7 C15H10O6 C15H10O5 C15H10O5 C15H10O6 C15H10O6 Masa Monoisotópica(Da) 610.1591 610.1521 464.0945 448.0956 594.1589 448.1010 478.2926 432.1035 286.0452 302.0408 302.0419 286.0483 270.1903 270.0507 286.0465 316.215 Peso molecular (Da) 610.518 610.521 464.379 448.38 594.522 448.38 478.406 432.381 286.239 302.236 302.238 286.239 270.240 270.052 286.239 316.265 Fragmentación 609.1483(100), 447.0935(12.69),285.0406(0.67) 609.156*(100), 301.0372(0.39), 300.0302 (2.37) 463.0859*(100) ,301.0318(3.85), 300.0252(5.86), 271.0229(1.02), 255.0316(0.4), 243.0314(0.47), 151.0008(0.13) 447.0944(100), 285.0393(3.56), 133.0277 (0.13) 593.1624* (100), 227.0372(0.41), 255.0316(0.49), 285.0425(2.24) 447.1059*(100), 327.0529(0.13), 285.0416(5.37), 284.0347(6.56), 255.0322(2.97), 227. 0368(3.02) 477.1117*(100), 314.0418(4.51), 243.0290(1.51), 138.04(0.19) 431.1009*(100), 341.1089(0.19), 269.0436(1.95), 268.0372(3.35) 285.0424*(100), 283.0264(34.94) ,257.0451(3.37), 255.0338(81.69), 241.0537(1.46), 213.0577(0.36), 153.0214(1.56), 163.0061(13.03),121.0313(2.72) 301.0371*(100), 299.0212(90.62), 271.026(33.96), 151.0048(11.85), 125.0255(4.14) 301.0376()300.031(16.26), 299.028*(100),179.0046(4.38), 151.0089(4.71), 121.0342(0.49) 285.0426*(100), 151.0047(0.16), 133.0301(1.69) 269.0582(100), 257.0442 (2.35), 241.0495(0.55) 225.0547(1.11), 201.0546(0.43), 133.0283(1.85) 269.0585*(100), 225.0579(0.75), 201.0567(0.51), 183.0462(0.3), 149.0255(0.97), 117.0356(9.88) 285.0577*(100), 241.0517(0.72), 213.0564(0.79),153.0186(0.41), 121.0305 (0.25) 315.063*(100), 300.0313(7.22), 272.0354(0.48), 165.0218(24), 121.0314(4.71) Máximos 207, 245, 268, 342 206, 256, 300, 355 207, 256, 300, 354 204,253, 266,349 196, 265, 295, 347 196, 208, 265, 295, 350 204,255, 268,354 204, 265, 340 205, 249, 315, 360, 490 200, 253, 298, 354 203, 255, 270, 370 209, 254, 267, 292, 350 192, 208, 260, 330 197, 210, 265, 335 197,220, 265, 299, 320, 366 205, 256, 371 Tiempo de retención 9.18 9.71 9.66 9.885 10.561 10.833 10.951 11.037 11.36 12.28 14.218 14.37 17.185 17.773 18.12 19.826 Flavonoide Luteonina-3,7-O- diglucosido Rutina Quercetina-3-O- galactosido Luteonina-7-O- glucósido Kampferol-3-O- glucosido-7- rhamnosido Kaempferol-3-O- glucósido Isorhamnetin-3- O-glucósico Apigenina-7-O- glucósido Fisetina Morin Quercetina Luteonina Genisteina Apigenina Kaempferol Rhamnetina Tabla 10. Fragmentación en ESI-MS y máximos en UV-Vis de estándares de flavonoides. [51] En la tabla 11, se puede comprobar que los fragmentos obtenidos a partir de una reacción Retro Diels-Alder, mencionados en la sección 2. 12 de este trabajo y que caracterizan principalmente a los flavonoides, se obtuvieron experimentalmente, donde se comparan con los fragmentos esperados teóricamente de los flavonoides. Tabla 11. Fragmentos esperados teóricamente y obtenidos experimentalmente a partir de la fragmentación de los anillos A y B. Flavonoide Fisetina Quercetina Kaempferol Estructura O O OH OH OH OH O OOH OH OH OH OH O OOH OH OH OH Fragmento esperado A=137 B=137 A=153 B=137 A=153 B=121 Fragmento obtenido experimentalmente A=137.0258 B=137.0258 A=153.0257 B=137.0313 A=153.0146 B=121.0263 Posteriormente, se llevó a cabo la obtención de las curvas de calibración de algunos de los estándares de los flavonoides, las cuales se presentan a continuación en la tabla 12. Las curvas de calibración fueron obtenidas a partir de cromatogramas UV- Vis a λ=254nm. [52] Tabla 12. Curvas de calibración de estándares de flavonoides. Detección a λ=254 nm. Flavonoide Intervalo mg/mL Coeficiente de correlación Ecuación Límite de detección LD mg/mL Límite de cuantificación LC mg/mL Apigenina 0.0008-1.3 0.996 A=1337.3C+28.967 0.01 0.04 Apigenina-7- O-glucosido 0.005-0.7 0.9981 A=580.86C-3.4542 0.04 0.18 Fisetina 0.6-0.0012 0.9999 A=3066.5C+7.0315 0.02 0.07 Kaempferol 0.0013-1.3 0.9554 A=3681.1C-152.4 0.02 0.03 Luteolina 0.0108-1.3 0.9989 A=3954.4C-94.294 0.14 0.15 Morin 3.3-0.002 0.9923 A=2613.8C-140.33 0.003 0.009 Rhamnetina 0.0075-0.25 0.9963 A=3304.4*C-6.5256 0.17 0.015 Quercetina 0.0075-1.0 0.9989 A=2095.4*C-16.886 0.23 0.15 Quercetina- 3-O- galactósido 0.01-0.6 0.9999 A=367.24*C+0.8379 0.7 0.22 Rutina 0.00354- 1.05 0.9985 A=332.96*C+1.0998 0.16 0.04 En la tabla 12, se observa el intervalo de trabajo para cada estándar cromatográfico, además de presentar el coeficiente de correlación de cada curva, el límite de detección y el límite de cuantificación para cada uno. Los coeficientes de correlación van de 0.9999 hasta 0.9554, el límite de detección 0.003 a 1.14 junto con el límite de cuantificación de 0.009 a 3.73. Es importante señalar que el límite de detección, así como el límite de cuantificación, dependen de la naturaleza del compuesto debido que la absorbancia es característica para cada molécula. [53] 6.2 ESTUDIO DE LACAS AMARILLAS Para el estudio de las lacas se aplicó el protocolo HPLC-DAD-QTof, y la identificación de los flavonoides presentes en las lacas se llevó a cabo utilizando la información en UV-Vis y TIC (Total Ion Chromatogram). Los flavonoides mencionados fueron identificados gracias a la librería creada en este trabajo, en la tabla 13, se resume el perfil molecular de las lacas analizadas y los flavonoides presentes en cada una de ellas. Tabla 13. Flavonoides detectados en lacas amarillas. Laca preparada a partir de Flavonoides T. ret. (min) Fragmentación Máximos Cempaxóchitl naranja fresca procedimento 1 Quercetagetina-7-O-glucósidoa Quercetagetinaa 8.89 9.82 479, 317, 167, 139, 111 317, 167, 139, 111 214, 253, 289, 355 206, 255, 275, 360 Cempaxóchitl naranja fresca procedimiento 2 Quercetagetina-7-O-glucósidoa Quercetagetinaa 8.7 10.57 479, 317, 167, 139, 111 317, 167, 139, 111 207, 260, 280, 360 206, 255, 275, 360 Cempaxóchitl naranja seca procedimiento 1 Quercetagetina-7-O-glucósidoa Quercetagetinaa 8.87 9.91 479, 317, 167, 139, 111 317, 167, 139, 111 207, 260, 280, 360 206, 255, 275, 360 Cempaxóchitl amarilla seca procedimiento 1 Quercetagetina-7-O-glucósidoa Quercetagetinaa 8.84 9.24 479, 317, 167, 139, 111 317, 167, 139, 111 207, 260, 280, 360 206, 255, 275, 360 Cempaxóchitl naranja bicolor seca procedimiento 1 Patuletina-7-O-glucósidoa Patuletina Quercetagetina-7-O-glucósidoa Quercetagetinaa 10.15 14.38 8.71 9.25 493, 331, 316 331, 316 479, 317, 167, 139, 111 317, 167, 139, 111 203, 258, 370 206, 255, 275, 360 207, 260, 280, 360 Zacatlaxcalli naranja fresca procedimiento 1 Quercetina-3-O-galactósido* Quercetina-3-O-arabinósidoa isorhametin-3-O-glucósido* Isorhamnetina* Quercetina* 9.75 10.42 11.06 11.76 14.26 447, 300,271, 151 433, 300,271,151, 121 447, 314, 243 315, 300, 271, 151 300, 299, 179, 151, 121 207, 256, 300, 354 205, 254, 265, 295, 355 204, 255, 268, 354 210, 255, 270,355 203, 255, 270, 530 Zacatlaxcalli naranja seca procedimiento 1 Quercetina-3-O-galactósido* Isorhametin-3-O-glucósido* Isorhamnetina* Quercetina* 9.87 11.01 11.96 14.82 447, 300,271, 151 447, 314, 243 315, 300, 271, 151 300, 299, 179, 151, 121 207, 256, 300, 354 204, 255, 268, 354 210, 255, 270,355 203, 255, 270, 530 Zacatlaxcalli verde fresca procedimiento 1 Quercetina-3-O-galactósido* Isorhametin-3-O-glucósido* Quercetina* 10.89 14.82 447, 300,271, 151 447, 314, 243 300, 299, 179, 151, 121 207, 256, 300, 354 204, 255, 268, 354 203, 253, 296, 538 Gualda
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