Contribucion-de-los-esfingolpidos-a-la-fluidez-de-la-membrana-plasmatica-de-arabidopsis-thaliana

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
Contribución de los esfingolípidos a la fluidez de la membrana plasmática 
de Arabidopsis thaliana
TESIS 
 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
 
Maestro en Ciencias 
 
 
PRESENTA: 
 
Q.F.B. Dora Luz Cano Ramírez
 TUTOR PRINCIPAL: 
 
 Dra. Marina Gavilanes Ruiz 
Facultad de Química, UNAM 
 
 
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR: 
 
Dra. Sobeida Sánchez Nieto 
Facultad de Química, UNAM 
Dr. Jorge Ramírez Salcedo 
Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
 
 
MÉXICO, D. F. JUNIO DE 2014 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
RECONOCIMIENTOS 
 
A la Q.F.B. Ma. Del Consuelo Enríquez Arredondo (Facultad de Química, UNAM) por la 
obtención de vesículas de membrana plasmática de Arabidopsis thaliana utilizadas en 
este trabajo y a su asesoría técnica. 
 
Al Dr. Edgar B. Cahoon (Center for Plant Science Innovation & Department of 
Biochemistry, University of Nebraska- Lincoln, E.U.A.) por proporcionarnos las semillas 
de las mutantes Atlcb2a-1, Atlcb2b hp/Atlcb2a y sbh1-1. 
 
Al Dr. Ángel Arturo Guevara García (IBT, UNAM), por la donación de las mutantes mpk3 
y mpk6. 
 
Al Dr. Néstor Carrillo (Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario de la 
Universidad Nacional de Rosario, Argentina), por haber proporcionado la línea 
transgénica pfld18-18. 
 
Al Dr. Jorge Ramírez Salcedo (IFC, UNAM), por su valiosa asesoría en la determinación 
de Polarización de la fluorescencia. 
 
Al Dr. Antonio Peña Díaz (IFC, UNAM), por permitirme trabajar en su laboratorio y usar 
su fluorómetro. 
 
Al Méd. Cir. Rodolfo Paredes Díaz (IFC, UNAM) por el procesamiento de las muestras 
para la microscopía electrónica de transmisión. 
 
A la Dra. Rebecca E. Cahoon (Center for Plant Science Innovation & Department of 
Biochemistry, University of Nebraska- Lincoln, E.U.A.) por la realización de la 
esfingolipidómica de las vesículas de membrana plasmática de Arabidopsis thaliana. 
 
A la Q. Laurel Fabila Ibarra (Facultad de Química, UNAM), por su valiosa ayuda en la 
construcción de la cámara de aclimatación y en el mantenimiento de las plantas 
usadas. 
 
A la estudiante de Biología Rebeca Juarez Contreras (Facultad de Ciencias) por su 
ayuda con los experimentos de fuga de electrolitos. 
 
El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por: 
 
 Dra. Marina Gavilanes Ruiz Facultad de Química, UNAM 
 Dra. Sobeida Sánchez Nieto Facultad de Química, UNAM 
 Dr. Jorge Ramírez Salcedo Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
 
La Q.F.B. Dora Luz Cano Ramírez realizó esta tesis de Maestría gracias a una beca de 
CONACYT (Reg. Núm. 419198) y a una beca de la DGAPA, UNAM, Proyecto PAPIIT 
IN210812. 
 
El trabajo de esta tesis se llevó a cabo gracias al financiamiento de la Facultad de 
Química, UNAM (PAIP 5000 9115), la DGAPA, UNAM (PAPIIT IN210812) y CONACYT 
(101521). 
 
 
 
 
INDÍCE 
1. RESUMEN 1 
2. 1. INTRODUCCIÓN 2 
1.1. Generalidades 2 
1.2. Fase Lipídica 3 
1.2.1. Composición 3 
1.2.2. Glicerofosfolípidos 4 
1.2.3. Esfingolípidos 4 
1.2.4. Esteroles 5 
1.2.5. Distribución intermembranal de los lípidos 5 
1.3. Propiedades membranales derivadas de la naturaleza y comportamiento de sus 
lípidos 
9 
1.3.1. Curvatura 9 
1.3.2. Grosor 10 
1.3.3. Asimetría transmembranal 10 
1.3.4. Mesomorfismo liotrópico 10 
1.3.5. Fluidez 11 
1.4. Fluidez membranal 11 
1.4.1. La fluidez membranal en la adaptación a bajas temperaturas en las 
plantas 
13 
1.4.2. Remodelación y recambio de lípidos de membrana en la tolerancia al 
frío 
17 
1.4.3. Uso de la polarización de la fluorescencia para determinar la fluidez 
membranal 
19 
2. HIPÓTESIS 21 
3. OBJETIVO GENERAL 21 
4. OBJETIVOS PARTICULARES 21 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 23 
 5.1. Germinación de semillas de Arabidopsis thaliana 26 
 5.2. Crecimiento de plantas adultas 27 
5.3. Silenciamiento de la subunidad LCB2b de la serina palmitoiltransferasa 
(SPT) en plantas adultas de Arabidopsis thaliana Atlcb2b hp/Atlcb2a 
(hp +) 
27 
5.4. Cosecha de plántulas y plantas de Arabidopsis thaliana 28 
5.5. Preparación de fracciones microsomales 28 
5.6. Purificación de vesículas de membrana plasmática 29 
5.7. Determinación de proteína 29 
5.8. Determinación de las condiciones para medir fluidez membranal por 
polarización de la fluorescencia usando DPH 
29 
5.9. Medición de la fluidez membranal por polarización de la fluorescencia 
de tres sondas membranales 
33 
5.10. Determinación del contenido de esfingolípidos totales y sus 
principales especies en vesículas de membrana plasmática 
34 
5.11. Tratamientos de aclimatación y congelamiento de plantas adultas de 
A. thaliana silvestre y mutantes 
34 
5.12. Registro fenotípico de los efectos de los tratamientos de aclimatación 
y tolerancia al congelamiento de las plantas de Arabidopsis thaliana 
35 
5.13. Medición de fuga de electrolitos de hojas de Arabidopsis thaliana 
expuestas a condiciones de aclimatación y congelación 
36 
5.14. Microscopía electrónica de transmisión 36 
5.15. Modelado molecular computacional 37 
5.16. Análisis estadístico 37 
6. RESULTADOS 38 
6.1. Aislamiento de fracciones microsomales de plántulas y plantas 
adultas de las líneas WT, GC-A, GC-B y GC-C 
38 
6.2. Localización de las sondas fluorescentes en la bicapa lipídica 39 
6.3. Caracterización de la fluidez de la fraccion microsomal, del tonoplasto 
y de la membrana plasmática proveniente de Arabidopsis thaliana 
tipo silvestre. 
41 
6.3.1. Polarización de la fluorescencia del DPH 42 
6.3.2. Polarización de la fluorescencia del TMA-DPH 48 
6.3.3. Polarización de la fluorescencia del PA 52 
6.4. Determinación de la fluidez membranal de plántulas provenientes de 
las líneas WT, GC-A, GC-B y GC-C 
56 
6.5. La glucosilceramida es importante para el retorno de la fluidez a bajas 
temperaturas. 
58 
6.6. Determinación de la Polarización de la fluorescencia de la membrana 
plasmática de plantas adultas tipo silvestre y sbh1-1 
60 
6.6.1. Polarización de la fluorescencia del DPH 60 
6.6.2. Polarización de la fluorescencia del TMA-DPH 62 
6.6.3. Polarización de la fluorescencia del PA 65 
6.7. Contenido de esfingolípidos en membranas plasmáticas aisladas de 
plantas silvestres y mutantes lcb2a-1, hp- y hp+ 
68 
6.8. Contribución del contenido de esfingolípidos totales en la membrana 
plasmática a la fluidez membranal (plantas lcb2a-1) 
72 
6.8.1. Polarización de la fluorescencia del DPH 72 
6.8.2. Polarización de la fluorescencia del TMA-DPH 75 
6.8.3. Polarización de la fluorescencia del PA 77 
6.9. Contribución del contenido de esfingolípidos totales en la membrana 
plasmática a la fluidez membranal (plantas hp-) 
80 
6.9.1. Polarización de la fluorescencia del DPH 80 
6.9.2. Polarización de la fluorescencia del TMA-DPH 83 
6.9.3. Polarización de la fluorescencia del PA 85 
6.10. Contribución del contenido de esfingolípidos totales en la membrana 
plasmática a la fluidez membranal (plantas hp+) 
88 
6.10.1. Polarización de la fluorescenciadel DPH 88 
6.10.2. Polarización de la fluorescencia del TMA-DPH 91 
6.10.3. Polarización de la fluorescencia del PA 94 
6.11. Caracterización de la respuesta de aclimatación a bajas temperaturas 
y resistencia a temperaturas congelantes 
97 
6.12. Adquisición de resistencia a temperaturas bajo cero mediante 
aclimatación a bajas temperaturas 
98 
6.12.1. Respuesta a la aclimatación en plantas WT de 
Arabidopsis. 
98 
6.12.2. Regulación negativa de la aclimatación mediada por 
MPK3 
100 
6.13. Plantas que resisten temperaturas bajo cero sin previa aclimatación 102 
6.13.1. Mutantes lcb2a-1 102 
6.13.2. Plantas pfld18-18 104 
6.14. Plantas incapaces de aclimatarse 106 
6.14.1. Plantas sbh1-1 106 
6.14.2. Plantas mpk6 108 
6.14.3. Plantas hp+ 110 
7. DISCUSIÓN 112 
7.1. Contribución de los esfingolípido a la fluidez de la membrana 
plasmática en hojas de Arabidopsis thaliana 
112 
 
7.1.1. Localización membranal de las sondas fluorescentes 
DPH, TMA-DPH y PA. 
112 
7.1.3. La membrana plasmática tiene transiciones de fase 113 
7.1.4. La histéresis es una propiedad inherente a membrana 
plasmática aislada de plantas tipo silvestre. 
115 
7.1.5. Los esfingolípidos trihidroxilados son importantes para 
la fluidez membranal 
116 
7.1.6. La energía de activación como parámetro del grado de 
orden lipídico 
118 
7.1.7. Los esfingolípidos disminuyen la fluidez de la 
membrana plasmática 
121 
7.2. Estudio del efecto de los esfingolípidos, MAP cinasas y ERO en la vía de 
señalización de bajas temperaturas y la modificación de la fluidez membranal 
en respuesta a aclimatación 
123 
7.2.1. Las plantas silvestres y las de la línea mpk3 adquieren 
resistencia a temperaturas bajo cero tras el periodo de 
aclimatación 
124 
7.2.2. Percepción de la temperatura en plantas 125 
7.2.3. Vía de señalización a bajas temperaturas 129 
7.2.4. Remodelación de la membrana plasmática y 
resistencia a congelamiento 
130 
7.2.5. Protección de las membranas tilacoidales que 
soportan la actividad fotosintética. 
134 
8. CONCLUSIONES PARTICULARES 135 
9. CONCLUSIÓN 136 
10. PERSPECTIVAS 137 
11. REFERENCIAS 138 
 
 
 
 
 
 
LISTA DE ABREVIATURAS 
ABA Ácido abscísico 
AC Aclimatadas 
AP Ácido fosfatídico 
BCL Base de cadena larga 
DPH 1,6 difenil 1-1,3,5–hexatrieno 
Ea Energía de activación 
ERO Especies Reactivas de Oxígeno 
FA Ácido graso 
Fd Ferredoxina 
Fld Flavodoxina 
FM 
Fracción Microsomal, mezcla heterogénea de membranas totales que incluyen 
membrana plasmática, de tonoplasto, vacuola, mitocondria, retículo endoplásmico, etc. 
GIPC Glicosil inositol fosforilceramida 
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia 
MS/MS Tandem Mass Espectrometry 
NA No Aclimatadas 
NO Óxido Nítrico 
P Polarización de la fluorescencia 
PA ácido cis-parinárico 
SPT Serina palmitoiltransferasa 
T Temperatura 
TMA-DPH 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-fenil-1,3,5-hexatrieno-p-tolueno-sulfonato 
TON 
Tonoplasto, membranas aisladas de tonoplasto mediante la técnica de 
free flow electrophoresis, donadas por la Dra. Rosario Vera-Estrella del IBT (UNAM). 
VLCFA Ácido graso de cadena muy larga 
VMP 
Vesículas de membrana plasmática purificadas mediante la partición de fases en 
polímeros acuosos. 
ΔP Cambio de polarización de la fluorescencia total 
 
NOMENCLATURA DE LAS LÍNEAS MODIFICADAS GENÉTICAMENTE DE 
Arabidopsis thaliana 
 
Nombre 
simplificado 
Características Uso en este estudio 
lcb2a-1 
Modificada en la subunidad LCB2A de la 
enzima SPT, tiene niveles basales de 
esfingolípidos en hojas totales. Diferente 
distribución de esfingolípidos en 
membrana plasmática. 
Fluidez de membrana plasmática, 
percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
hp- 
No esta silenciada la subunidad LCB2B 
en el fondo genético de la línea lcb2a-1, 
tiene niveles basales de esfingolípidos 
en hojas totales. Diferente distribución de 
esfingolípidos en membrana plasmática. 
Fluidez de membrana plasmática 
hp+ 
Silenciada en la subunidad LCB2B en el 
fondo genético de la línea lcb2a-1, 35% 
menor contenido de esfingolípidos en 
hojas totales comparada con la línea 
silvestre. Diferente distribución de 
esfingolípidos en membrana plasmática. 
Fluidez de membrana plasmática, 
percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
sbh1-1 Menor contenido de BCL tri hidroxiladas. 
Fluidez de membrana plasmática, 
percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
GC-A, GC-B y 
GC-C 
98% menos Glucosilceramida 
Fluidez de fracción microsomal de 
plántulas y plantas. 
pfld18-18 
Produce flavodoxina bacteriana en 
cloroplasto, la cual puede donar 
equivalentes reductores en reacciones 
como la reducción de tiorredoxina, lo 
cual previene la acumulación de ERO. 
Percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
mpk3 
Ausencia de la MPK3, involucrada en 
respuesta a estrés osmótico, oxidativo y 
percepción de elicitores bacterianos. 
Percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
mpk6 
Ausencia de la MPK6, involucrada en la 
vía de señalización a estrés por frío, 
sequía, salinidad y resistencia a 
patógenos, entre otros. 
Percepción a frío y resistencia a 
temperaturas congelantes. 
 
 
 
 
1 
 RESUMEN 
Los esfingolípidos son componentes esenciales en las plantas, en especial en las 
membranas plasmáticas, vacuolares y del retículo endoplásmico. Dada la gran diversidad, 
abundancia y propiedades fisicoquímicas de estas moléculas en las plantas, las alteraciones en su 
contenido y composición pueden proporcionar a las membranas la capacidad para detectar y 
afrontar cambios ambientales como los cambios de temperatura. Por otro lado, las plantas se 
desarrollan en una amplia variedad de climas y están sujetas a variaciones diarias de temperatura, 
por lo que deben ser capaces de percibir esos cambios y de generar las respuestas adaptativas 
correspondientes para evitar el daño por deshidratación y la muerte celular. 
En la primera parte de este trabajo, se analizó el contenido y la contribución de los 
esfingolípidos a la fluidez de membranas plasmáticas aisladas de de plantas de Arabidopsis, tanto 
silvestres como de varias líneas modificadas genéticamente en enzimas involucradas en la síntesis 
de los esfingolípidos. En la segunda parte de esta tesis, se realizó la caracterización fisiológica de 
la adaptación de las plantas al tratamiento por frío (Aclimatación) determinando la fluidez de 
membrana plasmática, la integridad de sus membranas y el registro fenotípico de sobrevivencia al 
congelamiento. 
Los resultados obtenidos demuestran que las vesículas de membrana plasmática son muy 
fluidas respecto a membranas de tonoplasto y totales, presentan claras transiciones de fase y 
tienen cambios de pendiente en respuesta a cambios pequeños de temperatura (2 °C), por lo que 
postulamos a la membrana plasmática como una estructura capaz de percibir cambios de 
temperatura mediante su fluidez en plantas. Determinamos que los esfingolípidos totales, y en 
especial los poco hidroxilados, disminuyen la fluidez y la Ea de la difusión, por lo que aumentan el 
orden en la bicapa lipídica. 
Los resultados de la segunda parte señalan que la rigidez de la membrana plasmática 
puede por sí sola desencadenar la señalización, adaptación y sobrevivencia a congelamiento. Se 
demostró por primera vez que la fluidificación de la membrana plasmática es una estrategia 
importante para proteger a la célula vegetal del daño por congelamiento y que los esfingolípidos 
trihidroxilados y la MPK6 forman parte de la vía de señalización que lleva a esta modificación de la 
fluidez en respuesta a bajas temperaturas. Adicionalmente, se encontró que la muerte por 
congelamiento se debe en gran parte al daño causado por altos niveles de especies reactivas de 
oxígeno provenientes del cloroplasto. También, observamos que las plantas con genotipos pfld18-18 y lcb2a-1 sobreviven a temperaturas extremas bajo cero sin requerir aclimatación a bajas 
temperaturas, por lo que podrían proveer de soluciones a la deficiencia de producción de alimentos 
en climas extremos. Los hallazgos de esta tesis son innovadores, ya que nos dan información 
tanto de la percepción, las moléculas mediadoras en la vía de señalización y la adaptación de la 
membrana plasmática en respuesta a cambios de temperatura. 
 
2 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1. Generalidades 
 
Las membranas biológicas son fundamentales para la función celular. Desde la 
compartimentalización subcelular hasta las interacciones célula-célula, las membranas proveen el 
orden necesario para la función y organización de los organismos unicelulares y de los tejidos y 
órganos de los metazoarios. Algunas de las funciones de las membranas incluyen la transducción 
de señales, la regulación del transporte de solutos, iones y proteínas, la generación de energía en 
forma de ATP y la realización de fenómenos de fusión (Yeagle, 2009). Las membranas son 
responsables de la permeabilidad selectiva que permite a la célula tomar los nutrientes necesarios 
así como de excluir la mayor parte de agentes dañinos. 
La arquitectura fundamental de las membranas biológicas es una bicapa lipídica, enriquecida con 
proteínas y carbohidratos. En general es permeable a sustancias no polares, mientras que las 
sustancias hidrofílicas penetran gracias a las proteínas que forman canales y transportadores. Esta 
permeabilidad selectiva permite a las células mantener gradientes de concentración y carga 
eléctrica, críticos para el metabolismo de la célula (Luckey, 2008). 
Los lípidos constitutivos de las membranas son anfipáticos, ya que contienen una porción 
hidrofóbica y otra hidrofílica e incluyen a los glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles. En las 
membranas biológicas, los dominios hidrofóbicos de los lípidos que la constituyen se agrupan 
espontáneamente, segregándose del medio acuoso, mientras que las cabezas polares se orientan 
fuera de la zona hidrofóbica hacia la parte acuosa formando la bicapa (Raudino y Sarpietro, 2010). 
La función de las proteínas membranales puede ser como enzimas, receptores, bombas, 
acarreadores o canales y se han clasificado como integrales o periféricas. Las proteínas integrales 
pueden ser de dos tipos: transmembranales y ancladas a los lípidos. Las proteínas 
transmembranales atraviesan por completo la bicapa lipídica y exponen partes de su estructura a 
ambos lados de la membrana. Para estas últimas, se requiere que segmentos de aminoácidos 
hidrofóbicos de 19 a 23 aminoácidos de longitud formen regiones con estructura secundaria de 
tipo α-hélice (para la mayoría de proteínas membranales conocidas), β-plegada o barril helicoidal. 
Otro tipo de proteínas de naturaleza hidrofílica, también llamadas de anclaje a lípidos, están unidas 
covalentemente a un lípido membranal, el cual se inserta en una de las monocapas. Por otra parte, 
las proteínas periféricas se asociadan a la membrana, pero su estructura (parecida a la de una 
proteína soluble) no penetra en la región hidrofóbica de la bicapa. La asociación con la membrana 
puede darse mediante su unión a proteínas integrales o por interacciones electrostáticas con las 
cabezas polares de los lípidos de la bicapa lipídica (Yeagle, 2009). 
 
3 
Los carbohidratos se encuentran en muchos de los componentes de las membranas biológicas, los 
cuales se hallan glicosilados y suelen ubicarse en la cara externa de la membrana como 
glicolípidos o proteínas glicosiladas. Los glicolípidos de las plantas incluyen ésteres de glucosa y 
sacarosa, esteril glucósidos, glicoesfingolípidos y glicosil diacilglicerol. Estos últimos son los más 
abundantes e incluyen a los galactosil y sulfoquinovosil diacilgliceroles (Heinz, 1996). 
Las membranas son estructuras dinámicas en constante movimiento tanto en su superficie como 
en el centro de la bicapa y en la dirección transversal o lateral. Esta movilidad se debe a su 
naturaleza fluida y permite que las proteínas interaccionen unas con otras de manera eficiente, así 
como entre ellas y los lípidos mediante asociaciones temporales, las cuales, si bien son 
transitorias, son importantes en la función celular (Luckey, 2008). 
 
1.2. Fase Lipídica 
1.2.1. Composición 
 
La matriz de las membranas celulares está constituida por lípidos anfipáticos; es decir, que 
contienen una región hidrofóbica y otra hidrofílica. La preferencia que tienen las regiones apolares 
de asociarse entre ellas (asociación dirigida entrópicamente por el agua del entorno), así como la 
tendencia de las regiones polares de interactuar con el medio acuoso circundante, son las bases 
físicoquímicas de la formación de las membranas biológicas. Los lípidos en las membranas 
proveen de estabilidad mecánica y al formar estructuras cerradas y continuas, permiten aislar 
espacialmente los procesos metabólicos del medio externo, del citoplasma y de los organelos, 
pero al mismo tiempo permiten el paso selectivo de solutos (van Meer et al., 2008). 
Además de servir de barreras semipermeables en las membranas, alojar las proteínas receptoras 
de las señales provenientes del exterior, ser el soporte de los primeros pasos de transducción de 
la mayoría de las señales externas, interactuar con las células vecinas a partir de los elementos de 
sus lípidos y proteínas, los lípidos proveen a la célula de la capacidad de formar vesículas, 
fusionarse y fisionarse, procesos esenciales para el mantenimiento de la estructura membranal, la 
división celular y el tráfico intracelular (Sprong et al., 2001). 
Los tipos principales de lípidos de membrana son los glicerofosfolípidos, los esfingolípidos y los 
esteroles. 
 
 
 
 
 
 
 
4 
1.2.2. Glicerofosfolípidos 
 
Los glicerofosfolípidos son los lípidos estructurales más abundantes en las membranas 
eucariontes y constan de una molécula de glicerol, dos moléculas de ácidos grasos, un grupo 
fosfato y un sustituyente que puede ser colina (fosfatidilcolina), etanolamina (fosfatidiletanolamina), 
serina (fosfatidilserina), inositol (fosfatidilinositol), glicerol fosfato o treonina. La región hidrofóbica 
de estas moléculas es el diacilglicerol (DAG), pudiendo ser las dos cadenas de ácido graso de 
diferentes longitudes, saturadas, o insaturadas en conformación cis en general (van Meer et al., 
2008; Yeagle, 2009; Raudino y Sarpietro, 2010). 
En las plantas, la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE) representan del 60 al 80% de 
todos los fosfolípidos estructurales. El resto lo constituyen el fosfatidilglicerol (PG), el 
fosfatidilinositol (PI), la fosfatidilserina (PS) y el ácido fosfatídico (AP), siendo este último producto 
de la activación de las fosfolipasas C y D. Los ácidos grasos que constituyen a estas moléculas 
son principalmente palmítico (16:0) y linoleico (18:2) con una representación del 20 al 60% y el 
ácido linolénico (18:3) con una del 7 al 26 % (Furt et al., 2011). 
 
1.2.3. Esfingolípidos 
 
Los esfingolípidos son derivados de la esfingosina, una base de cadena larga (BCL) con 18 
carbonos, dos residuos -OH en los C1 y C3 y una amina en el C2. La subsecuente acilación de la 
base en su grupo amida por un ácido graso de cadena larga da origen a las ceramidas que se 
metabolizan hacia esfingolípidos complejos gracias a la adición de una cabeza polar en la que 
prevalecen uno o varios carbohidratos y en muchos casos, un grupo fosfato. 
En las plantas, existen más de 500 moléculas distintas de esfingolípidos (Pata et al., 2010), ya que 
la BCL puede tener diferentes sustituyentes en posiciones específicas. Por ejemplo, la esfinganina 
puede ser hidroxilada en el carbono 4 y/o insaturada en el C4 o C8; en este último, la insaturación 
puede ser cis o trans. Con respecto a las cadenas de ácidos grasos que se unen a la esfingosina 
pueden variar en su longitud, la cualpuede ir desde los 16 a los 28 carbonos, siendo generalmente 
saturadas en el carbono 9 y pudiendo también presentar hidroxilaciones en el C2 (Markham et al., 
2013). 
Dependiendo de la naturaleza de la cabeza polar del esfingolípido complejo en la posición C1 de la 
BCL, se pueden distinguir dos clases principales de estas moléculas: los cerebrósidos, con uno o 
más residuos glicosilados (esfingolípidos neutros) y las inositol fosforilceramidas (IPCs, 
esfingolípidos acídicos), que se forman al unirse un grupo inositol monofosfato (Furt et al., 2011). 
Las IPC pueden ser poliglicosiladas para formar las glicosil inositol fosforilceramidas (GIPCs), que 
se ha demostrado son los esfingolípidos más abundantes en hojas de Arabidopsis thaliana con un 
 
5 
64 %, seguido de las glucosilceramidas (GluCer) (34 %) y las ceramidas (2%) (Markham et al., 
2006). 
 
1.2.4. Esteroles 
 
Los esteroles tienen una porción estructural altamente hidrofóbica constituida por un núcleo planar 
esteroideo de tres ciclos y una cadena alifática larga de 6 a 10 carbonos. Su parte polar sólo está 
formada por un grupo –OH en el C3. Las membranas animales contienen al esterol colesterol, 
mientras que las de levadura contienen ergosterol. Las plantas contienen múltiples tipos de 
esteroles, principalmente estigmasterol y sitosterol. La estructura de los fitosteroles difiere en el 
número y posición de los dobles enlaces en sus ciclos y en la naturaleza de la cadena lateral unida 
al C17 (Palta et al., 1993). Los fitosteroles pueden ser glicosilados al OH del C3 por un azúcar 
(glucosa, manosa, xilosa y galactosa) para formar esteril glucósidos (SGs), a los que 
posteriormente se les pueden unir acilos para formar esteril glucósidos acilados (ASGs). Los 
esteroles libres representan del 70 al 90 % del total de esteroles en la membrana plasmática en 
plantas. 
 
1.2.5. Distribución membranal de los lípidos 
 
La actividad de cada lípido está determinada por su localización membranal y su concentración 
local, producto del balance entre la síntesis, degradación y transporte de estas moléculas. Sin 
embargo, para entender las funciones biológicas de los lípidos, debemos contextualizarlos como 
mezclas bidimensionales anfipáticas en las membranas de las células en las que se encuentran. 
De esta manera, las células determinan las características de sus membranas controlando su 
composición lipídica. 
En principio, los organelos eucariontes difieren en las composiciones lipídicas que contribuyen a su 
identidad. Así, desde el retículo endoplásmico (RE) (60 mol % PC, 25 mol % PE, 10 mol % PI, 4 
mol % PS y 3.7 mol % esfingolípidos), la composición lipídica cambia gradualmente a lo largo del 
aparato de Golgi hasta la membrana plasmática (25 mol % PC, 15 mol % PE, 5 mol % PS, 30-40 
mol % colesterol y 10 mol % esfingolípidos) (van Meer et al., 2008). Sumado a este reparto 
diferencial, la distribución lipídica transmembranal simétrica del RE cambia hacia un arreglo 
asimétrico en la membrana plasmática, en donde los esfingolípidos están de preferencia 
localizados en la cara externa, mientras que la PS y PE se ubican en la cara interna de la 
membrana (Sprong et al., 2001). La composición lipídica de los endosomas y lisosomas es similar 
a la de membrana plasmática, excepto en que contienen ácido lisobifosfatídico en las vesículas 
internas (Kobayashi, 1999). 
 
6 
En las plantas, la composición lipídica membranal es también muy compleja, aunque no hay 
estudios detallados que precisen el lipidoma membranal. En la Tabla 1 se refiere la composición 
lipídica aproximada de las membranas celulares de varios tejidos de plantas (Moreau et al., 1998). 
Como podemos observar en la Tabla 1, los glucoesfingolípidos, esteroles libres y SGs abundan en 
el tonoplasto y la membrana plasmática. En estas dos membranas podemos distinguir que en 
promedio, hay más esteroles libres y glucoesfingolípidos en la membrana plasmática que en la 
membrana de la vacuola (tonoplasto). Los glicerofosfolípidos son las moléculas lipídicas más 
abundantes en todas las membranas y especialmente en plastidios, tilacoide, retículo 
endoplásmico y mitocondria. 
Por su parte, los esfingolípidos son muy abundantes en las membranas plasmáticas y del 
tonoplasto de todas las especies analizadas. 
De los glicerofosfolípidos, la PC no se encuentra en los tilacoides ni en la membrana interna de los 
plastidios, pero sí en la membrana externa. La PE y PS no están en los plastidios, aunque PE sí se 
encuentra en la membrana interna mitocondrial, tonoplasto y la membrana plasmática. La PG se 
encuentra predominantemente en las membranas del plastidio, mientras que el PI se sitúa en 
tonoplasto. 
Existen lípidos especiales y característicos de ciertas membranas en las plantas, como el 
monogalactosildiacilglicerol (MGDG), digalactosildiacilglicerol (DGDG) y los sulfolípidos, que son 
exclusivos de membranas plastídicas, o el difosfatidilglicerol (DPG), específico de la membrana 
interna mitocondrial. Por último, en la membrana del glioxisoma los ácidos grasos libres 
constituyen el 20 % de los lípidos estructurales (Moreau et al., 1998). 
 
7 
 
Tabla 1. Composición lipídica de las membranas celulares en planta (mol % del total). Se indican las referencias de las que fueron 
extraídos los datos. 
 
Membrana Plasmática 
Tejido 
Coleoptilo 
de maíz 
Células de 
raíz de Avena 
sativa L. 
Hojas de 
cebada 
Hojas de 
Ramonda 
serbica 
Hojas de 
tabaco 
Raíz 
Avena sativa 
L. de 4 
semanas 
Callos 
de 
Spartina 
patens 
Plántulas 
de A. 
thaliana 
Glicerofosfolípidos 58 79.5 36.6 30.6 38.5 44 11.9 63.8 
Glucoesfingolípidos - 9.4 16.4 6.6 20.6 7.8 20.6 4.4 
Esteroles libres (FS) 37 9 38.1 56.2 22.6 19.9 54.6 27.0 
Glucósidos de esterol 
(SG) 
1.2 <3 5.6 1.5 11.8 12.8 3.0 
Glucósidos de esterol 
acilados (ASG) 
3 3 2.9 5.1 10.0 - 1.9 
 
Hartmann y 
Benveniste 
(1987) 
Norberg y 
Lijenberg 
(1991) 
Uemura y 
Steponkus (1994) 
Quartacci 
et al. 
(2002) 
Mongrand 
et al. 
(2004) 
Andersson et 
al. (2005) 
Wu et 
al. 
(2005) 
Minami 
et al. 
(2009) 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
Tabla 1. Continuación… 
Membrana 
Retículo 
endoplásmico 
Tonoplasto Mitocondria Glioxisoma 
Tejido 
Coleoptilo 
de maíz 
Vigna 
radiata 
Células de Acer 
pseudoplatanus 
Hipocotiledón de 
soya 
Hydrilla 
verticillata 
Cotiledón de 
plántulas de 
algodón 
Glicerofosfolípidos 90 36.6 44.5 93 50.7 61 
Glucoesfingolípidos - 16.4 12.8 - - - 
Esteroles libres (FS) 8 38.1 5.11 - 10.7 - 
Glucósidos de esterol 
(SG) 
0.1 5.6 12.2 - - - 
Glucósidos de esterol 
acilados (ASG) 
1.2 2.9 10.9 - 
 
 
Hartmann y 
Benveniste (1987) 
Yoshida y 
Uemura 
(1986) 
Tavernier et al. 
(1993) 
Davy De Virville 
et al. (2002) 
Rozentsvet et 
al. (2012) 
Chapman y 
Trelease (1991) 
 
9 
 
1.3. Propiedades membranales derivadas de la naturaleza y comportamiento de sus 
lípidos 
 
1.3.1. Curvatura 
 
La forma geométrica de los lípidos de la membrana depende del tamaño relativo de su cabeza 
polar y las colas hidrofóbicas (Cullis y Kruijff, 1979). Por lo tanto, si las partes hidrofóbica e 
hidrofílica tienen aéreas transversales similares, la molécula tendrá una forma cilíndrica (por 
ejemplo, la PC y PS). Los lípidos con una cabeza polar pequeña como PE, son cónicos. Sin 
embargo, cuando la región hidrofóbica ocupa un área de superficie menor, la molécula tiene forma 
de cono invertido (LPC, esfingomielina) (Figura 1). Los esfingolípidos complejos, al tener grandes 
cabezas polares y colas saturadas (o con insaturaciones trans) forman moléculas cónicas 
invertidas muy estrechas en su parte hidrofóbica, por lo que se empaquetan mejor y en presencia 
de esteroles, dan cobertura a su pequeña cabeza polar según el modelo de sombrilla (Huang y 
Feigenson, 1999). 
El polimorfismo lipídico tiene un papel importante en la generación de la curvaturade las 
membranas, ya que la inclusión de PE a bicapas planares de PC impone una curvatura en la 
membrana que se puede usar para la formación de vesículas, la fusión y la fisión (Marsh, 2007). 
Un factor adicional que contribuye a esta característica de las membranas es la distribución 
asimétrica de los lípidos entre las monocapas de las membranas. De esta manera, los lípidos 
cónicos de PE están en la cara contraria a los que generan conos invertidos o cilíndricos. 
 
Figura 1. La forma molecular de los lípidos contribuye a la definición de la curvatura de las 
biomembranas. Se indican las formas cónicas y cilíndricas que tienen los lípidos según su 
estructura y los arreglos que pueden adoptar en regiones curvas o no curvas de la membrana 
(Sprong et al., 2001). 
 
10 
1.3.2. Grosor 
 
Una membrana que contiene en su mayoría esfingomielina, con o sin colesterol, es más gruesa 
que una compuesta de PC y colesterol, la cual a su vez es más gruesa que una compuesta de sólo 
PC. Debido a lo anterior, el colesterol sí tiene impacto en el grosor de una membrana compuesta 
de PC, pero no en una compuesta de esfingomielina, por lo que el cambio en el grosor de una 
membrana puede relacionarse con el colesterol sólo si está en presencia de fosfolípidos (Maulik y 
Shipley, 1996). Además, la longitud y grado de insaturación de las colas hidrofóbicas de los lípidos 
que constituyen la membrana también determinan su grosor. Esto implica que el grosor membranal 
está relacionado con la composición lipídica; sin embargo, se ha visto que el factor determinante 
de esta propiedad es el acomodo de las proteínas transmembranales (Mitra et al., 2004). 
 
1.3.3. Asimetría transmembranal 
 
En la membrana plasmática de las células de mamífero, la cara citosólica está compuesta 
generalmente por 40 % PE y 60 % PS y PC. Mientras que en la cara exterior tiene 60% de PC, 
10% PE y 30 % esfingomielina y glicoesfingolípidos. Esta distribución desigual entre ambas 
monocapas es la asimetría transmembranal característica de las membranas plasmática y de los 
endosomas (van Meer et al., 2008). 
En plantas se ha estudiado la asimetría de la membrana plasmática en avena, en donde los 
fosfolípidos, esteroles totales y glucosilceramidas tienen una distribución entre la cara citosólica y 
la apoplástica de 65:35, 30:70 y 30:70 (mol:mol), respectivamente (Tjellstrom et al., 2010). Por lo 
que en general, se mantiene la relación de abundancia de PS y PC en el lado citosólico y de 
esfigolípidos y esteroles en la cara contraria. 
 
1.3.4. Mesomorfismo liotrópico 
 
Los lípidos de las membranas biológicas pueden existir en múltiples asociaciones o arreglos. La 
organización lipídica de estas fases en bicapas lipídicas puede dividirse en 3 fases principales: la 
ordenada, la líquida-ordenada y la líquida-desordenada. Las fases que no son de bicapa como la 
hexagonal o cúbica, se pueden relacionar con eventos transitorios en la membrana como la fusión, 
fisión o formación de poros. La fase que se adopta depende del tipo de lípido, insaturación y 
longitud de las cadenas acílicas, temperatura, presión, cantidad de esteroles, etc. (Cacas et al., 
2012). 
De esta forma, las cadenas acílicas largas y saturadas se ordenan y empaquetan fuertemente en 
la fase ordenada, por lo que los movimientos laterales son muy lentos (10-3 µm2 s-1). En la fase 
 
11 
líquida-desordenada, los lípidos no están tan condensados y el grado de orden es bajo. Las 
cadenas acílicas (generalmente insaturadas) son móviles, además de que la difusión lateral es 
rápida (1 µm2 s-1), especialmente a altas temperaturas. La fase líquida-ordenada tiene un alto 
orden lipídico (como en la fase ordenada) y al mismo tiempo la difusión lateral de un líquido 
desordenado, debido a la presencia de esteroles (van Meer et al., 2008). Los esteroles por sí 
mismos no forman bicapas pero son componentes cruciales en la estructura, ya que regulan el 
orden lipídico dando características únicas de movilidad rotacional y alto orden conformacional, 
interactuando principalmente con esfingolípidos y PS disaturada. Los esteroles por lo tanto, 
optimizan las propiedades mecánicas de las membranas manteniendo su fase líquida (Furt et al., 
2011). 
 
1.3.5. Fluidez 
 
Las fases lipídicas líquidas, ya sean ordenadas o desordenadas, son estados físicos membranales 
asociados con la fluidez. Sin embargo, la fluidez no es una propiedad física bien definida, ya que 
sólo se refiere a la dinámica de las fases líquidas. En las membranas, esta ambigüedad se debe a 
que pueden ser fluidas en más de una dirección. Las moléculas lipídicas pueden tener libertad de 
movimiento tanto posicional (translacional) como intra-molecular (conformacional), por lo que las 
bicapas lipídicas pueden ser fluidas en ambos sentidos. Por lo tanto, la fluidez membranal se 
refiere: a la difusión rápida, al desorden dinámico en las variables translacionales y al desorden 
conformacional de las cadenas de ácidos grasos (Mouritsen, 2005). 
 
1.4. Fluidez Membranal 
 
Todas las partículas en los sistemas biológicos tienen movimiento browniano debido a la energía 
cinética de translación de las partículas dispersas, debida a la agitación térmica. Como resultado, 
las moléculas están en movimiento constante, colisionando entre ellas y rebotando de un lado a 
otro. La difusión es el efecto macroscópico del movimiento browniano. Los procesos de difusión 
tienen las siguientes características: 1) La velocidad de difusión depende de la temperatura, 2) las 
colisiones entre las moléculas disminuyen la difusión, por lo que a mayor densidad molecular del 
medio, menor es la velocidad de difusión y 3) la difusión tiende hacia la homogeneidad del medio, 
ya que las moléculas que colisionan no tienen una dirección preferente (Marguet et al., 2006). 
Por su parte, los lípidos de membrana son altamente móviles y sufren un margen amplio de 
procesos dinámicos. Constantemente cambian su conformación intramolecular (giros de los 
enlaces C-C), rotan, se proyectan hacia afuera de la membrana (bobbing) y difunden lateralmente 
(Mouritsen, 2005). 
 
12 
Mientras que la difusión lateral es muy rápida, la difusión transversal (flip flop) es muy lenta, ya que 
el proceso involucra el paso las cabezas polares de los lípidos a través del centro no polar de la 
membrana, lo cual es energéticamente desfavorable. Debido a lo anterior, la velocidad del flip flop 
es de varias horas, aunque para procesos como la incorporación de lípidos recién sintetizados, se 
lleva en menor tiempo gracias a la acción de enzimas (flipasas) que catalizan el flip flop usando la 
hidrólisis de ATP. 
En los casos de los lípidos y las proteínas de membrana, el modelo del mosaico fluido se enfoca 
en la difusión de estas las moléculas y sugiere una falta de organización lateral, lo cual implica 
homogeneidad y que no ocurren interacciones de largo alcance en la bicapa lipídica (Singer y 
Nicolson, 1972). Sin embargo, que no ocurran interacciones a largo alcance no significa que no 
existan de corto alcance. 
Las interacciones de corto alcance se deben a la composición heterogénea de las membranas, ya 
que las diferencias estructurales entre los componentes lipídicos, su grosor de las regiones 
hidrofóbica e hidrofílica, las fuerzas cohesivas y la entropía, resultan en un amplio intervalo de 
interacciones. La interacción diferencial de los componentes de la membrana es la fuerza motriz 
responsable de la segregación en dominios debido a una interacción preferencial de los 
componentes similares (Marguet et al., 2006). 
Aunque la entropía favorece una distribución molecular aleatoria en las membranas, la 
segregación molecular es más favorable debido a la minimización de la energía libre total (Almeida 
et al., 2005). Lo anterior resulta en la separación de fases y la organización en un gran número de 
dominios pequeños, en donde los componentes inmisciblesforman regiones separadas, con 
parámetros termodinámicos diferentes y en donde la entropía constantemente balancea y minimiza 
las interacciones no favorables. Sin embargo, el proceso de segregación molecular sigue siendo 
aleatorio por el movimiento browniano. Debido a lo anterior, moléculas individuales explorarán 
diferentes fases, pero quedan atrapadas transitoriamente en un dominio cuando existen 
interacciones favorables con las moléculas vecinas y existe baja probabilidad de intercambio en los 
límites de las fases (Dietrich et al., 2001). 
Además de la restricción de difusión de los lípidos de membrana por la segregación en dominios, 
las interacciones de las proteínas de membrana con el citoesqueleto obstaculizan la difusión de los 
componentes de la membrana. Estos procesos, junto con la transición de fases, llevan a la 
membrana a tener fluctuaciones que se perciben como variaciones locales de densidad o 
composición molecular. Las fluctuaciones están relacionadas con la heterogeneidad lateral de la 
membrana, la cual puede ser usada para modular la actividad de ciertas enzimas que están en 
contacto con la membrana (Mouritsen, 2005). 
 
 
 
13 
1.4.1. La fluidez membranal en la adaptación a bajas temperaturas en plantas 
 
Las plantas crecen y se desarrollan en un amplio margen de temperaturas que van desde los 50 
°C en el lugar más caluroso del mundo, el desierto de Azizia en Libia, hasta temperaturas bajo 
cero en la Antártida. Incluso en regiones templadas, la temperatura registrada en la hoja de una 
planta varía más de 20 °C en pocos minutos como resultado de su exposición a la radiación solar 
seguida de una repentina corriente de aire frío (Sharkey y Singsaas, 1995). 
Añadido a esto, a lo largo del año las plantas pasan gradualmente de temperaturas cálidas en 
primavera, hasta temperaturas muy bajas en invierno, cuando pueden congelarse y morir. El 
principal factor ambiental responsable de la adquisición de tolerancia al frío es la exposición previa 
a temperaturas bajas no letales entre 0 y 5 °C, un fenómeno conocido como aclimatación al frío, 
que incluye cambios transcripcionales y metabólicos que protegen del daño por congelación. Por 
ejemplo, el centeno no aclimatado (NA) muere por congelamiento a -5 °C, pero aquel que es 
expuesto a temperaturas bajas no congelantes puede sobrevivir a -30 °C (Steponkus et al., 1993). 
Esto también se aplica a la tolerancia al calor, ya que una exposición a temperaturas altas no 
letales lleva a la aclimatación correspondiente. 
Como se puede observar en la Tabla 2, la disminución de esfingolípidos y el aumento de 
fosfolípidos en la membrana plasmática son eventos comunes a todas las plantas aclimatadas. Los 
esteroles por su parte, no muestran una tendencia clara en la aclimatación. La cantidad de 
esfingolípidos de plantas expuestas a su temperatura óptima varía de especie a especie, 
dependiendo de la temperatura mínima óptima a la que pueden habitar, ya que las que pueden 
crecer en climas fríos tienen mayor cantidad de esfingolípidos endógenos que las plantas de 
climas templados o cálidos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
14 
Tabla 2. Composición lipídica reportada de la membrana plasmática de diferentes especies de plantas no aclimatadas y aclimatadas. Se 
presenta la composición membranal de las principales clases de lípidos en diferentes especies y el tratamiento de temperatura. Se indican 
las referencias de las que fueron extraídos los datos. Plantas aclimatadas (AC); plantas no aclimatadas (NA). 
 Plántulas 
Vigna 
 radiata 
 
Secale 
cereale 
 
Solanum 
tubesorum 
Solanum 
commersonii 
Hojas 
Avena 
primaveral 
Hojas 
Avena 
invernal 
Hojas 
Centeno 
invernal 
Arabidopsis 
thaliana 
Raíz 
Avena 
sativa 
L. 
Triticum 
aestivum 
Temperatura 
óptima (°C) 
20-40 10-15 15-20 - 6-24 6-24 10-15 25 6-24 10-24 
Temperatura 
NA (°C) 
26 15-20 18-20 18-20 15-20 15-20 15-20 23 - 20 
PL 48.9 31.7 46.4 48.3 28.8 28.9 36.6 46.8 78.8 37.1 
SL 6.8 16.2 6.5 6.1 27.2 30.4 16.4 7.3 9.4 28.5 
St 43.6 52.1 45 41.6 41.3 39.1 46.6 46 14.6 34.3 
Otros 0.7 - 2.1 4 2.7 1.7 0.4 - - 
St/PL 0.9 1.6 1 0.9 1.5 1.3 1.3 1.0 0.18 0.9 
Temperatura 
AC (°C) 
 2 2-4 2-4 2 2 2 2 - 2 
PL 41.9 46.8 51.1 36.8 39.5 43.3 57.1 75.7 43.2 
SL 6.8 5 4.9 24.2 22.5 10.5 4.3 4.7 17.6 
St 51.2 46.2 40.7 36.9 37.4 46 38.7 19.9 39.2 
Otros - 2 3.3 2.1 0.6 0.2 - - 
St/PL 1.2 1.0 0.8 1.0 0.9 1.1 0.7 0.26 0.9 
Referencias Yoshida 
& 
Uemura 
(1986) 
Lynch & 
Steponkus 
(1987) 
Palta et al. 
(1993) 
Palta et al. 
(1993) 
Uemura & 
Steponkus 
(1994) 
Uemura & 
Steponkus 
(1994) 
Uemura & 
Steponkus 
(1994) 
Uemura et 
al. (1995) 
Larsson 
et al. 
(2006) 
Bohn et 
al. (2007) 
La temperatura óptima se refiere a la temperatura óptima de crecimiento de la especie, la temperatura NA es la temperatura a la que se crecieron las 
plantas en cada estudio y la temperatura AC se refiere a la temperatura a la cual se expusieron las plantas al aclimatarse en cada estudio. En azul se 
indica la composición lipídica a la temperatura NA y en rosa la composició lipídica a la temperatura AC. 
 
15 
La información anterior deja en claro que debido a las variaciones de temperatura que enfrentan, 
las plantas deben ser capaces de detectar cambios en su ambiente y transducir las señales en 
respuestas fisiológicas adaptativas. 
En los mamíferos y plantas se ha encontrado que la elevación de la concentración de calcio 
citosólico es uno de primeros eventos que ocurren en la percepción de cambios en la temperatura, 
y aunque se ha apoyado la idea de que los canales de calcio son los sensores de temperatura, la 
evidencia muestra que la percepción de la temperatura es un evento que se lleva a cabo antes de 
la activación de los canales de calcio. Por ejemplo, en algas verde-azules se ha demostrado que la 
fluidez membranal juega un papel importante en la detección de frío previa al incremento de los 
niveles de calcio (Murata y Los, 1997). En la actualidad se conoce muy poco sobre los eventos 
tempranos de la detección de la temperatura por las plantas, así como de los mecanismos 
moleculares para contender con los cambios de temperatura; sin embargo, se ha señalado a la 
membrana plasmática como la base de la percepción de la temperatura por su función estratégica 
en la fisiología celular, porque es el sitio principal de daño por congelamiento, por sus propiedades 
dinámicas, y porque está bien descrito que su composición se afecta por la temperatura ambiental 
(Tabla 2). Debido a ello, la fluidez membranal es un buen candidato para ser un termómetro 
celular y un transductor de la señal de temperatura (Mikami y Murata, 2003). 
A nivel celular, el daño por congelación lleva a fugas en la membrana plasmática y los organelos. 
Mecánicamente, esto se atribuye a la deshidratación celular severa iniciada por la formación de 
hielo extracelular con un potencial químico menor, lo que resulta en una disminución del potencial 
hídrico fuera de la célula y la salida de agua del medio intracelular (Tomashow, 1999). Bajo estas 
condiciones, se forman estructuras lipídicas diferentes a las bicapas, como las formaciones de 
fases de tipo hexagonal inversa II (HII) y también ocurre la lisis inducida por expansión y las 
lesiones de "salto de fractura" (Uemura et al., 1995). Por lo tanto, una de las acciones clave en la 
aclimatación al frío es estabilizar a la membrana en contra del daño por congelación. Los 
mecanismos conocidos con los que se estabiliza la membrana son varios e incluyen la 
modificación estructural de los lípidos membranales y la acumulación de sacarosa y otros azúcares 
simples que ayudan a mantener a la membrana hidratada en condiciones de desecación y que 
evitan la fusión de membranas. Otras moléculas que estabilizan la membrana son los polipéptidos 
hidrofílicos y las moléculas crío-protectoras (Tomashow, 1999).Otras moléculas importantes en la aclimatación en frío en plantas, son las especies reactivas de 
oxígeno (EROs). Moléculas como el H2O2 aumentan en respuesta a frío, lo que eventualmente 
lleva a mayor expresión y actividad de enzimas antioxidantes en procesos de aclimatación, 
protegiendo a las membranas de daño por peroxidación (Zhou et al., 2012). 
 
 
16 
Las proporciones de esfingolípidos, así como la de esteroles libres disminuyen (Uemura et al., 
1995; Minami et al., 2009). 
Los esfingolípidos son muy abundantes en las membranas en plantas, si bien no hay estudios que 
aborden comparativamente la composición lipídica de las diferentes membranas de las plantas ni 
su cuantificación por técnicas modernas sensibles que abarquen la identificación del gran número 
de especies lipídicas presentes en las bicapas. Los esfingolípidos son sintetizados en un proceso 
que inicia con la condensación de la serina con la palmitoil-CoA, resultando una base de cadena 
larga (BCL), la cetodihidroesfingosina, la cual surge a través de una reacción de reducción, a la 
esfinganina. Esta BCL es acilada en su grupo amino por un ácido graso y glicosilada o fosforilada 
en su grupo 1-OH. 
Se ha propuesto que una parte reducida de los esfingolípidos de la membrana plasmática se 
agrupa en lo que se llaman “microdominios”. El concepto de microdominio membranal supone que 
los esfingolípidos tienden a asociarse con los esteroles y proteínas en la membrana plasmática 
distribuyéndose de una manera no uniforme y que en conjunto se mueven poco, formando 
pequeñas regiones que forman parte de la membrana pero cuyas unidades no se mezclan 
individualmente con el resto de los componentes (Simons and Ikonen, 1997). 
Se ha estudiado la composición de los microdominios membranales en preparaciones aisladas y 
conocidas como membranas resistentes a detergentes (DRM) en plantas de A. thaliana no 
aclimatadas (NA) y aclimatadas al frío (AC). Los resultados mostraron que los DRM AC tienen un 
aumento en la cantidad de esteroles y proteínas, lo que no sucede con los glucocerebrósidos y 
fosfolípidos (Minami et al., 2009). Sin embargo, la cantidad de glucocerebrósidos sí disminuye en 
la membrana plasmática de plantas aclimatadas, indicando que sí se están removiendo 
esfingolípidos de la fase líquida-desordenada, pero no de los microdominios (fase líquida-
ordenada). 
Se ha demostrado que la exposición de plantas de A. thaliana a temperaturas bajas no letales (4 
°C) lleva a la producción transitoria de la fitoesfingosina-1-fosfato (t18:0-P) y al aumento en la 
actividad de la MPK6 (Dutilleul et al., 2012). También se ha visto que la deficiencia de la 
insaturación Δ8 de los esfingolípidos de la membrana plasmática resulta en clorosis debida a la 
exposición prolongada a temperatura de 0 °C (Chen et al., 2012). Mientras que en el primer caso 
la BCL parece tener más bien un papel señalizador en la respuesta al frío, el caso de los 
esfingolípidos insaturados parece ser una respuesta celular estructural a la baja temperatura. En 
ambos casos, resulta claro que la fluidez membranal puede afectarse por los esfingolípidos y que 
esto puede ser importante en el funcionamiento de las membranas celulares en muchos de los 
procesos en los que participan, tales como secreción de componentes de la pared celular, fusión 
membranal, división celular, etc., y muy particularmente, en los fenómenos de adaptación a la 
temperatura ambiente. Sin embargo, son pocos los reportes en la literatura que abordan esta 
 
17 
relación entre los esfingolípidos y la fluidez membranal, lo que hace necesario investigar con más 
detalle el impacto de la cantidad y composición de los esfingolípidos en la fluidez membranal y su 
cambio en respuesta a bajas temperaturas. 
 
1.4.2. Remodelación y recambio de lípidos de membrana en la tolerancia al frío 
 
Como se detalló en la Tabla 2, la aclimatación al frío lleva a una modificación en la composición 
lipídica de la membrana plasmática. Las plantas tienen familias de enzimas especializadas en la 
regulación celular (síntesis de segundos mensajeros, modificación covalente por cinasas, 
mediadores de tráfico vesicular, re-arreglo del citoesqueleto, etc.), que participan en la 
remodelación de la membrana y la degradación de lípidos, dos formas de contender con las bajas 
temperaturas a nivel de la membrana. 
De estas enzimas, las más estudiadas en plantas son las fosfolipasas, las cuales se pueden 
clasificar en 4 tipos: fosfolipasas D, fosfolipasas C, fosfolipasas A1 (PLA1) y las fosfolipasas A2 
(PLA2) que se encargan de hidrolizar glicerofosfolípidos en diferentes posiciones. Cada tipo de 
fosfolipasa comprende una familia de enzimas que difieren en la especificidad de sustrato, 
cofactor que requieren y/o condiciones de reacción (Wang et al., 2012). 
La fosfolipasa D (PLD) cataliza la hidrólisis de glicerofosfolípidos para formar ácido fosfatídico 
(PA) y un grupo polar libre como la colina. A. thaliana tiene 12 genes para PLDs que codifican 
para las familias de enzimas PLDα, Dβ, Dγ, Dδ, Dε y Dζ. Cada familia está involucrada en 
diversos procesos fisiológicos y celulares como la regulación del cierre/apertura de los estomas, la 
señalización en respuesta a estrés por sequía (Sang et al., 2001), la cantidad de sal (Hong et al., 
2008) y en el remodelaje de los fosfolípidos de membrana en la tolerancia al frío (Li et al., 2004). 
La fosfolipasa C (PLC) hidroliza los fosfolípidos para producir diacilglicerol (DAG) y un grupo 
fosforilado de la cabeza polar. Las plantas tienen dos familias de PLCs, las específicas para PI 
(PI-PLC) y otras no específicas (NPC-PLC) que hidrolizan PC y PE. La expresión de PI-PLC se 
induce en respuesta a frío, sal, deshidratación y la hormona ácido abcísico (ABA) (Wang et al., 
2012). Las NPC-PCLs están involucradas en la degradación de los fosfolípidos y acumulación de 
digalactosildiacilglicerol (DGDG) en A. thaliana con deficiencia de fosfatos (Gaude et al., 2008). 
La fosfolipasa A (PLA) hidroliza los fosfolípidos para producir lisofosfolípidos y ácidos grasos 
libres. PLA1 y PLA2 liberan el ácido graso de las posiciones sn-1 y sn-2 respectivamente. Estas 
fosfolipasas están involucradas en la biosíntesis de ácido jasmónico y respuesta a patógenos 
(Wang et al., 2012). 
Se ha reportado que el remodelamiento de la composición lipídica de la membrana es esencial en 
la tolerancia al frío en A. thaliana, ya que se encontró que una enzima remodeladora de 
galactolípidos en la membrana externa del cloroplasto transfiere residuos de galactosil 
 
18 
provenientes de monogalactolípidos a diversos aceptores, formando oligogalactolípidos y 
diacilglicerol, los cuales mantienen la integridad de la membrana y evitan la formación de la fases 
de tipo hexagonal inversa II (Moellering et al., 2010). 
El recambio de esfingolípidos se lleva a cabo mediante enzimas llamadas ceramidasas que 
catalizan el corte del enlace amida para generar bases de cadena larga (BCL) y ácidos grasos. Se 
han reportado 3 clases de ceramidasas en eucariontes que difieren en su actividad con base en 
su pH óptimo y se clasifican como ácidas, neutras y alcalinas. En las plantas sólo se han 
encontrado genes homólogos de ceramidasas neutras y alcalinas. El recambio de esfingolípidos 
complejos está aún menos caracterizado en A. thaliana y sólo se han encontrado homólogos con 
porcentajes de identidad de 40 a 30 % con glucosilceramidasas y esfingomielinasas de otros 
eucariontes (Chen et al., 2009). 
Por otro lado, el contenido de ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) se ha asociado con la 
temperatura a la que crecen animales, peces, hongos, levaduras, plantas, cianobacterias y 
bacterias: a mayor temperatura menor grado de insaturación y viceversa (Los et al., 2013). 
Es importante destacar que el grado de insaturación lipídico se ajusta por cambios en las 
condiciones ambientales y es uno de losprincipales moduladores de la fluidez membranal. Las 
membranas acumulan más ácidos grasos insaturados a temperaturas frías que a cálidas (Falcone 
et al., 2004), lo cual hace que los lípidos se empaquen menos y por lo tanto las membranas con un 
alto contenido de ácidos grasos insaturados deben ser más fluidas. La remoción de hidrogenos en 
las cadenas lipídicas es realizada por miembros de la familia de desaturasas de ácidos grasos 
(FAD) y se piensa que su actividad se inhibe por temperaturas cálidas (Burgos et al., 2011). Sin 
embargo, estudios de la concentración de RNA de los genes FAD muestran que sus niveles varían 
muy poco en respuesta a calor o frío, por lo que su regulación debe estar dada por su degradación 
y no su síntesis. Los estudios en A. thaliana han demostrado que la aclimatación al frío resulta en 
el aumento de la proporción de fosfolípidos totales, con cambios pequeños en cada clase de 
fosfolípido y un aumento en la proporción de especies di-insaturadas de fosfatidilcolina y 
fosfatidiletanolamina, aunque las especies mono-insaturadas siguen prevaleciendo. 
En las plantas hay 3 desaturasas principales de ácidos grasos: la desaturasa Δ9, la Δ12 y la Δ15. 
En Arabidopsis se ha correlacionado la sn-2-palmitoil-desaturasa y la desaturasa Δ12, que se 
localizan en cloroplasto y que convierten al ácido oleico en ácido linoleico, con la sobrevivencia a 
bajas temperaturas (Murata y Los, 1997) y la desaturasa Δ12 microsomal que es esencial a 
temperaturas de 6 °C (Miquel y Browse, 1992). 
Como se puede deducir, el papel de las insaturaciones de los ácidos grasos es muy importante 
para la aclimatación, sin embargo, su contribución va más allá de los alcances y objetivos de este 
trabajo por lo que nos limitaremos a describir solo a los esfingolípidos. 
 
 
19 
1.4.3. Uso de la Polarización de la fluorescencia para determinar la fluidez membranal 
 
La polarización de la fluorescencia se basa en el principio de excitación fotoselectiva de 
fluoróforos mediante luz polarizada. La distribución electrónica en el estado basal y excitado de 
cualquier fluoróforo define la dirección en la cual las probabilidades de absorber o emitir un fotón 
son máximas, estas son las direcciones del momento dipolar de excitación o emisión. Cuando se 
excita con luz linealmente polarizada una molécula fluorófora, que tenga el momento dipolar de 
excitación alineado con la dirección del vector eléctrico de la luz de excitación, el fluoróforo 
absorberá esta luz. Ya que el proceso de absorción es mucho más rápido que la rotación 
molecular, el uso de luz linealmente polarizada crea una población de fluoróforos parcialmente 
orientada. Esto se conoce como fotoselección. Debido a que la emisión de un fotón por el 
fluoróforo en estado excitado requiere de mucho más tiempo que su absorción, el fluoróforo 
comúnmente se reorienta antes de que ocurra la emisión. Si esto ocurre, el fotón emitido ya no 
estará polarizado en la dirección del fotón de excitación, aunque los dipolos de excitación y 
emisión sean paralelos en la molécula. Por lo tanto, la polarización de la fluorescencia será menor 
mientras más se reoriente el fluoróforo entre el período de excitación y emisión. Con este principio 
es que la polarización de la fluorescencia se utiliza para determinar la fluidez membranal e incluso 
se ha usado para monitorear interacciones moleculares (Lentz, 1993). 
En la práctica, se utiliza un espectrofluorómetro equipado con polarizadores. La luz generada por 
la lámpara es polarizada vertical u horizontalmente antes de pasar por la celda. La intensidad de 
la luz emitida es entonces colectada por dos polarizadores orientados en la dirección vertical y 
horizontal, respectivamente. La luz es transmitida a través de tubos fotomultiplicadores y el equipo 
realiza los cálculos pertinentes utilizando las siguientes ecuaciones: 
 
P = (IVV – IVHG) / (IVV + IVHG) 
r = (IVV – IVHG) / (IVV + 2IVHG) o r = 2P/3 –P, 
Donde: 
P es la polarización de la fluorescencia 
r es la anisotropía 
IVV e IVH son las intensidades de luz emitida en la dirección vertical y horizontal respecto al haz de 
luz. 
G es el factor de corrección el cual depende del equipo e indica la sensibilidad de los 
fotomultiplicadores a las medidas de intensidad de luz (Mykytczuk et al., 2007). 
 
Para determinar la fluidez membranal mediante la polarización de la fluorescencia se ha utilizado 
un gran número de moléculas hidrofóbicas fluorescentes. En general, las sondas tienen una alta 
 
20 
señal de fluorescencia cuando se incorporan en membranas (acompañado por señales muy bajas 
en soluciones acuosas), lo cual permite utilizar concentraciones muy bajas de sonda en estudios 
de fluidez (Lentz, 1989). 
Por estar sujetas a la restricción rotacional impuesta por el orden del entorno lipídico, que es un 
ambiente muy ordenado, disminuye el movimiento de las sondas, lo que resulta en valores más 
altos de polarización. En el caso contrario, un ambiente desordenado llevará a que la sonda tenga 
facilidad de movimiento por lo que emitirá luz en todas direcciones, resultando en valores bajos de 
polarización. De esta manera, la polarización de la fluorescencia es inversamente proporcional a 
la fluidez membranal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
2. HIPÓTESIS 
 
 El contenido de esfingolípidos endógenos de la membrana plasmática tiene influencia en la 
fluidez membranal. 
 Las diferencias en la fluidez de la membrana plasmática son importantes para la 
percepción, transducción y/o adaptación a bajas temperaturas en plantas. 
 
3. OBJETIVO GENERAL 
 
 Determinar la fluidez de preparaciones membranales de líneas de A. thaliana con 
diferentes contenidos de esfingolípidos totales, o con perturbaciones en las vías de 
señalización asociadas a esfingolípidos y expuestas al proceso de aclimatación. 
 
4. OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Germinar y crecer plántulas o plantas adultas de A. thaliana Col-0 Wild Type (WT), y de las 
líneas Atlcb2a-1 (lcb2a-1), Atlcb2b hp/Atlcb2a (hp ±), sbh1-1, mpk6, mpk3 y pfld18-18. 
 Germinar y crecer plántulas o plantas adultas de las líneas GCS (GC-A, GC-B y GC-C). 
 Obtener tanto fracciones microsomales de plántulas como de plantas adultas de las líneas 
WT y GCS. 
 Obtener vesículas de membrana plasmática de plantas de las líneas WT y líneas lcb2a-1, 
hp ± MFZ, sbh1-1, mpk6, mpk3 y pfld18-18 tanto no aclimatadas como aclimatadas. 
 Determinar las condiciones para medir fluidez membranal por polarización de la 
fluorescencia usando 1,6 difenil 1-1,3,5–hexatrieno (DPH), el 1-(4-trimetilamoniofenil)-6-
fenil-1,3,5-hexatrieno-p-tolueno-sulfonato (TMA-DPH) y el ácido cis-parinárico (PA). 
 Determinar la polarización de la fluorescencia del DPH de fracciones microsomales 
obtenidas de plántulas y plantas adultas WT y GCS. 
 Determinar la polarización de la fluorescencia del DPH, TMA-DPH y PA de vesículas de 
membrana plasmática de las líneas antes mencionadas, con sus respectivos controles. 
 Determinar la pérdida de integridad de la membrana plasmática de las plantas aclimatadas 
y no aclimatadas por un ensayo de conductimetría. 
 
 
22 
 Determinar la ultraestructura de las membranas del tejido foliar de plantas no aclimatadas 
y aclimatadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
En el laboratorio disponemos de varias líneas de A. thaliana modificadas genéticamente que 
tienen diferencias cualitativas y cuantitativas en su contenido de esfingolípidos, o que presentan 
deficiencias en las proteínas de vías de señalización o de producción de EROs y que están 
relacionadas con la función de segundos mensajeros de las bases de cadena larga. Las 
modificaciones genéticas de las líneas utilizadas están construídas en el fondo genético de A.thaliana ecotipo Col-0, silvestre. Las líneas utilizadas son lcb2a-1, lcb2b hp/lcb2a, sbh1-1, GCS, 
mpk3, mpk6 y pfld18-18. En la Tabla 3 se describen las características de estas mutantes; Puede 
advertirse que las mutantes lcb2a-1, lcb2b hp/lcb2a, sbh1-1, GCS, fueron seleccionadas para ser 
usadas en este trabajo por su contenido anómalo de esfingolípidos totales y que muy 
posiblemente los de la membrana plasmática estuvieran afectados también. En el caso de la 
mutante lcb2a-1, si bien su contenido de esfingolípidos totales es normal, la expresión del gene 
LCB2a de la enzima serina palmitoiltransferasa (SPT) no se presenta (Dietrich et al., 2008). Esta 
línea resulta ser la progenitora de la línea lcb2b hp/lcb2a, la cual además contiene una horquilla 
inducible de RNAi que permite el silenciamiento del isogene LCB2B, con lo cual la expresión de la 
SPT disminuye y con ello el total de esfingolípidos en la planta (Dietrich et al., 2008). La mutante 
sbh1-1, no expresa a la hidroxilasa SBH1 de bases de cadena larga, y por ello expresa menos 
esfingolípidos trihidroxilados, lo cual compensa con dihidroxilados (Chen et al., 2008). Las 
mutantes GCS, no expresan a la glucosil ceramida sintasa, por lo cual las plantas contienen sólo 
una proporción reducida de glucosil ceramidas (no publicada). La mutante mpk3 no expresa a la 
MAP cinasa MPK3, involucradada en las vías de respuesta a estrés abiótico y biótico y tiene una 
redundancia funcional con la MPK6. Esta última es otra MAPK que se ha reportado en una vía de 
señalización mediada por bases de cadena larga (Saucedo-García et al., 2011). 
 
 
 
 
 
 
 
 24 
Tabla 3. Características genotípicas y fenotípicas de las líneas de A. thaliana modificadas genéticamente y usadas en este estudio.
Línea de Arabidopsis 
thaliana (Col-0) 
Construcción genética Características Contenido de esfingolípidos Referencia 
Silvestre (WT) Sin modificación Normal Basal 
lcb2a-1 
Inserción de un transposón en el gen 
que codifica para la subunidad LCB2a 
de la enzima Serina 
palmitoiltransferasa (SPT) 
Implicada en la gametogénesis y 
embriogénesis. Menos sensible a 
Fumonisina 
Basal Dietrich et al., 2008 
lcb2b hp/lcb2a 
1) Inserción de un transposón en el gen 
que codifica para la subunidad LCB2a 
de la enzima SPT 
2) Con un vector binario con la 
construcción de una horquilla de 
ARNi que en presencia del inductor 
(metoxifenazida), silencia el gene de 
la subunidad LCB2b de la SPT 
hp- plantas sin inductor metoxifenazida 
 
Basal 
Dietrich et al., 2008 
hp+ plantas con inductor metoxifenazida 
35 % de esfingolípidos menos 
que el control (después de 5 
días de inducción) 
GC-A, GC-B y GC-C 
Con un vector que contiene la 
construcción de una horquilla de 
ARNi que silencia el gene de la 
enzima glucosil ceramida sintasa 
Pequeñas y con hojas frágiles 
2 % de glucosil ceramida con 
respecto al control 
No publicada 
sbh1-1 
Inserciones de T-DNA en el gen que 
codifica para la hidroxilasa 1 de 
bases esfingoideas (SBH1) 
Menor contenido de LCB tri hidroxiladas 
30 % de esfingolipidos 
trihidroxilados menos que el 
control 
2 veces mayor contenido de 
esfingolipidos dihidroxilados 
que el control 
Chen et al., 2008 
pfld18-18 
Inserción del gen que codifica 
flavodoxina bacteriana 
La flavodoxina es un acarreador de 
electrones que previene la formación de 
ERO en episodios de estrés abiotico. 
Basal 
Tognetti et al., 
2006 
mpk6 
Inserción de T-DNA en el gen que 
codifica para la MAP cinasa 6 
 
Ausencia de la MPK6 
Resistente a la infección por patógenos y 
muerte celular programada por Fumonisina 
Basal 
Saucedo-García et 
al., 2011 
mpk3 
Silenciamiento mediante RNAi del 
gen que codifica para la MAP 
cinasa 3 
 
Ausencia de la MPK3 
 
Basal 
Saucedo-García et 
al., 2011 
 
25 
La mutante mpk6 se incluyó en este estudio porque se ha observado que la disminución de la 
temperatura lleva a la activación de la cinasa MPK6 y a un aumento de la fitoesfingosina 1-P 
(t18:1P) (Dutilleul et al., 2012), por lo que queremos investigar si esta vía de señalización es 
importante para regular la fluidez de la membrana en respuesta a bajas temperaturas. 
Por otro lado, la mutante pfld18-18 se incluyó debido a que se sabe que las EROs aumentan en 
respuesta a frío y aclimatación; sin embargo, la fuente de las mismas no es muy clara (cloroplasto, 
NADPH oxidasa, mitocondria), y con esta mutante buscamos dilucidar la contribución de las EROs 
provenientes del cloroplasto en el fenotipo y si estás moléculas funcionan como transductores en 
la respuesta a la señal de frío para activar genes que codifican proteínas para la remodelación de 
la membrana plasmática. 
 
El trabajo experimental desarrollado en esta tesis se organizó en dos fases: la primera (Esquema 
1) que tuvo como objetivo estudiar la contribución de los esfingolípidos a la fluidez de la membrana 
plasmática y fracción microsomal mediante el uso de mutantes en la vía de síntesis de 
esfingolípidos (líneas GC-A, GC-B, GC-C, sbh1-1, lcb2a-1, hp- y hp+); y una segunda fase 
(Esquema 2), la cual tuvo como objetivo investigar si las diferencias en la fluidez de la membrana 
plasmática son importantes para la percepción, transducción y/o adaptación a bajas temperaturas 
(Aclimatación) en plantas, usando algunas de las líneas mutantes en la vía de síntesis de 
esfingolípidos (sbh1-1, lcb2a-1 y hp+) además de las líneas mutantes en vías de señalización 
pfld18-18, mpk3 y mpk6. Las estrategias experimentales de cada fase se muestran en los 
Esquema 1 y 2. Los métodos experimentales se detallan más adelante. 
 
 
 
Esquema 1. Estrategia experimental de la primera fase del trabajo que se enfoca en estudiar la 
contribución de los esfingolípidos a la fluidez membranal en A. thaliana. 
 
26 
 
 
Esquema 2. Estrategia experimental de la segunda fase del trabajo para estudiar la contribución 
de los esfingolípidos a los cambios de fluidez en membrana plasmática en la respuesta a 
aclimatación a bajas temperaturas y la resistencia a congelamiento. 
 
5.1. Germinación de semillas de A. thaliana 
 
Se preparó el sustrato compuesto por: 2 partes de Mix 3 Agregate Plus (Sunshine, Sun Gro 
Horticulture; Canada Ltd.), 1 parte agrolita Dica Mex (Dicalite de México S.A. de C.V.; 
Tlalneplantla, Edo. de México) y 0.5 partes vermiculita Premium Grade (Sunshine, Sun Gro 
Horticulture; Canada Ltd.). El sustrato mezclado y humedecido se colocó en macetas de 100 ml de 
capacidad, previamente lavadas y enjuagadas con HClO4 (Cloralex®) al 30 %. Las semillas de A. 
thaliana Col-0 (WT) y de todas las mutantes usadas en este estudio, se espolvorearon con los 
dedos sobre la superficie de cada maceta, sembrando de 1 a 3 macetas por línea. Todas las 
macetas se rotularon con la línea, fecha, laboratorio y usuario. Una vez sembradas, las macetas se 
regaron con atomizador, se colocaron en una charola negra y se les puso un domo transparente 
para conservar la humedad. Se ubicaron en estantes a 22 °C con fotoperiodo de 8 h de luz y 16 h 
de oscuridad y a partir de entonces se regaron con atomizador cada tercer día o cuando fuera 
necesario. 
 
 
27 
5.2. Crecimiento de plantas adultas 
 
A las 3 semanas de crecimiento, las plántulas se transfirieron a macetas con sustrato recién 
preparado como se detalló anteriormente. Se colocaron de 1 a 3 plántulas por maceta, 
dependiendo del número de plántulas que germinaron. Para esto, con ayuda de una espátula y 
pinzas se tomó un cuadrante del área sembrada y con cuidado se separaron las plántulas 
cuidando no dañar sus raíces. Con la espátula se hizo una pequeña excavación en el sustrato y se 
enterró la raíz de la plántula dejando la parte aérea intacta. Nuevamente, las macetas se rotularon 
con la línea, fecha de siembra, laboratorio y usuario. Todas las macetas se colocaron en charolas 
negras, se cubrieron con un domo transparente y se ubicaron en el invernaderocon fotoperiodo de 
8 h de luz y 16 h de oscuridad a 22 °C aproximadamente. Se regaron con atomizador cada tercer 
día o cuando fuera necesario. 
Al convertirse en plantas adultas, como a las tres semanas de ser transplantadas, se les removió 
el domo transparente y se comenzó a usar regadera para su riego. Se regaron con solución 
nutritiva de Hoaghland una o dos veces a la semana. 
 
5.3. Silenciamiento de la subunidad LCB2b de la serina palmitoiltransferasa (SPT) en 
plantas adultas de A. thaliana Atlcb2b hp/Atlcb2a (hp +) 
 
La línea de A. thaliana Atlcb2b hp/Atlcb2a contiene la inserción de un transposón en el gen que 
codifica para la subunidad LCB2a de la enzima SPT y además, tiene un vector binario con la 
construcción de una horquilla de ARNi que en presencia del inductor (metoxifenazida), silencia el 
gene de la subunidad LCB2b de la SPT. Por lo tanto, al no tener proteínas LCB2a y al disminuir la 
cantidad de subunidades de LCB2b tras la adición del inductor, el heterodímero LCB1/LCB2 no se 
genera y consecuentemente la primera enzima de la biosíntesis de esfingolípidos (la SPT) deja de 
sintetizarse a medida que progresa el silenciamiento. En consecuencia, los niveles de 
esfingolípidos sintetizados de novo disminuyen gradualmente y la planta subsiste con los 
generados antes del silenciamiento, mismos que van experimentando un recambio natural 
(degradación). 
La metoxifenazida es el ingrediente activo del insecticida Intrepid 2F (Dow Agroscience de México 
S.A. de C.V.) que se administra a una concentración de 240 g i.a./L. Las condiciones para el 
silenciamiento de plantas adultas se determinaron asperjando soluciones del insecticida a las 
plantas o plántulas a concentraciones desde 1:5000 a 1:50 v/v. Las plántulas con un menor 
contenido de esfingolípidos complejos se identificaron por la presencia de clorosis generalizada, lo 
cual ocurrió aproximadamente a los 8 días de añadido el inductor del silenciamiento. Como control 
 
28 
se utilizaron plantas de la línea Atlcb2a-1 que permanecieron con hojas verdes después de la 
aplicación del inductor. 
 
5.4. Cosecha de las plántulas y plantas 
 
Con el fin de obtener fracciones microsomales de las líneas WT, GC-A, GC-B y GC-C, las 
plántulas se crecieron por 27 días hasta su cosecha. Para cada línea se tomaron cuantas plántulas 
se podía con pinzas, y levantándolas se cortaron con tijeras en la base de la parte aérea. Una vez 
cortadas, se procedió a enjuagar con agua la tierra remanente de la base de las hojas. 
Posteriormente, se secó el tejido dejándolo sobre papel absorbente. Las plántulas ya sin exceso 
de agua se colectaron con pinzas y se colocaron en una caja Petri en hielo. Todo el tejido obtenido 
se pesó y rotuló en papel aluminio, para ser congelado inmediatamente con N2 líquido y finalmente 
ser almacenado a -70 °C hasta su uso. 
Con respecto a las plantas adultas de A. thaliana Col-0 (WT), y de las líneas Atlcb2a-1 (lcb2a-1), 
Atlcb2b hp/Atlcb2a (hp ±) y sbh1-1, se cosecharon al tener el tamaño adecuado (aproximadamente 
a las 16 semanas de edad). En el caso de las plantas adultas de las líneas mutantes GC-A, GC-B 
y GC-C, se cosecharon hasta las 20 semanas de edad, ya que su crecimiento era más lento y su 
tamaño mucho menor al de las plantas adultas de otras líneas. 
Cada planta se cortó desde la raíz y con una brocha mediana de cerdas suaves se limpió el 
sustrato remanente. Después, se removieron las hojas muertas o deterioradas y las 
inflorescencias. A continuación, se cortaron las hojas y se colocaron en un vaso de precipitados en 
hielo. Al tener cerca de 25 g de peso en hojas de cada línea o 3 g de las líneas deficientes en 
glucosilceramidas, se pasaron a papel aluminio y se pesó el tejido. Inmediatamente se congeló 
cada paquete con N2 líquido y se almacenó a -70 °C hasta su uso. 
 
5.5. Preparación de fracciones microsomales 
 
Para preparar fracciones microsomales, el tejido congelado (aprox. 0.84 g) se pulverizó en un 
mortero hasta obtener un polvo fino, agregando N2 líquido periódicamente para evitar que se 
descongelara. El polvo resultante se transfirió a un vaso de precipitados de 10 mL en hielo. Se 
enjuagó el mortero con buffer de homogenización (4 mL de buffer por cada 0.84 g de hojas) y una 
vez acumulado todo el tejido pulverizado en el vaso, se homogeneizó en 3 periodos de 10 s con un 
homogenizador eléctrico. Todo el procedimiento se realizó a 4 °C. El homogeneizado resultante se 
filtró a través de 3 capas de gasa y se exprimió la gasa cuidadosamente enjuagando con buffer de 
homogenización. Se recibió el filtrado en otro vaso de precipitados de 10 mL y se colocó en tubos 
de centrífuga pequeños de policarbonato. Se centrifugó a 10 000 x g a 4 °C por 15 min en una 
 
29 
microultracentrífuga (TL-100, Beckman). Posteriormente, el sobrenadante se recuperó y se 
transfirió a otro tubo de centrífuga con las mismas características. Se centrifugó a 100 000 xg a 4 
°C por 120 min con la misma centrifuga y rotor anterior. El sobrenadante se desechó y el botón se 
resuspendió con pincel en 50 µL de amortiguador de ajuste de peso. Se enjuagó el pincel con 50 
µL del mismo amortiguador y se mezclaron todas las suspensiones para alicuotar. Se determinó la 
cantidad de proteína. 
 
5.6. Purificación de vesículas de membrana plasmática 
 
Se realizó por el método de partición de fases en polímeros acuosos según Carmona-Salazar et al. 
(2011). 
 
5.7. Determinación de proteína 
 
La concentración de proteína se determinó usando el método colorimétrico de Lowry modificado 
(Peterson, 1977). Se agregaron a tubos de ensayo 2 µL de la muestra proteica concentrada, 5 µL 
de la muestra diluida 1:10 y los mismos volúmenes de buffer en el que se resuspende la muestra. 
Paralelamente, se prepara una curva de calibración con albúmina sérica bovina (ABS) a una 
concentración de 1 mg/mL colocando 0, 10, 20, 30, 40 y 60 µL en tubos de ensayo. A todos los 
tubos de ensayo se les agregan 900 µL de H2O, 100 µL de solución de desoxicolato de sodio 0.15 
%, p/v, 1 mL de reactivo A (solución de carbonato-tartrato-cobre, NaOH 0.8 N, solución de dodecil 
sulfato de sodio 10 % p/v y H2O en partes iguales) y finalmente 500 µL del reactivo Folin-
Ciocalteau 1:5 v/v. Se agitó después de cada adición y se esperó 30 min a temperatura ambiente 
hasta desarrollarse la coloración azul. Se procedió a medir la absorbancia a 750 nm de cada tubo 
frente al blanco sin ASB. 
La concentración de proteína de la muestra se determinó restándole a su valor de absorbancia el 
obtenido para el buffer de resuspensión e interpolando el resultado en la curva estándar. 
 
5.8. Determinación de las condiciones para medir fluidez membranal por polarización de 
la fluorescencia usando DPH 
 
Debido a que se presentaron algunas inconsistencias e irreproducibilidad en las determinaciones 
iniciales, decidimos examinar el efecto del buffer en el que se resuspendieron las muestras 
membranales, así como del buffer en el que se midió la fluidez membranal. La composición de 
estos buffers se detalla en la Tabla 4. 
 
 
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Tabla 4. Composición de los buffers de resuspensión de las muestras membranales y de medición 
de la fluidez membranal 
 
Buffer de resuspensión 
para fracción microsomal 
(buffer de ajuste de peso) 
Buffer de resuspensión de 
vesículas de membrana 
plasmática (buffer de 
lavado) 
Buffer para la 
determinación de fluidez 
membranal 
620 mM sorbitol 
5 mM KH2PO4, pH 7.8 
0.1 mM EDTA 
 
 
 
 
350 mM sorbitol 
2 mM HEPES/MES, pH 7.6 
1 mM DTT 
Cocktail de inhibidores de 
proteasas 
 
 
20 mM HEPES /HCl, pH 7.0 
 
Como se puede observar, los buffers de resuspensión de las membranas tienen sorbitol que se 
requiere para darle estabilidad osmótica a las membranas, pero tiene alta viscosidad, por lo que la 
cantidad (que puede variar de preparación a preparación, y que está relacionada con la 
concentración