Derivatizacion-de-partculas-tipo-virus-con-m-Bromobimano

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
TÍTULO DEL TEMA ESCRITO 
TESIS: Derivatización de partículas tipo virus con m-Bromobimano 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
 
PRESENTA 
Anaid Herendira Viveros Belmonte 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2012 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: J. ELEAZAR MARTÍNEZ BARAJAS 
VOCAL: Profesor: JOSÉ PEDRAZA CHAVERRI 
SECRETARIO: Profesor: ISMAEL BUSTOS JAIMES 
1er. SUPLENTE: Profesor: LAURA CARMONA SALAZAR 
2° SUPLENTE: Profesor: SANDRA PAOLA SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO DE FISICOQUÍMICA E INGENIERÍA DE PROTEÍNAS. DEPARTAMENTO DE 
BIOQUÍMICA. FACULTAD DE MEDICINA, UNAM. 
 
ASESOR DEL TEMA: 
ISMAEL BUSTOS JAIMES 
 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
SANDRA PAOLA SÁNCHEZ RODRÍGUEZ 
 
SUSTENTANTE: 
ANAID HERENDIRA VIVEROS BELMONTE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTE PROYECTO CONTÓ CON EL APOYO DE CONACYT (99857) E ICYTDF (PIFUTP08-
104) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS: 
 
� A MIS PADRES, POR TODO EL AMOR, LA PACIENCIA Y EL ESFUERZO QUE 
HICIERON POR APOYARME A LO LARGO DE MI CARRERA. 
� A MI HERMANO, POR SU AMOR INCONDICIONAL. 
� A MI PRIMO EDUARDO, POR SU PACIENCIA Y ASESORÍAS BRINDADAS 
CUANDO MÁS PERDIDA ME SENTÍA. 
� A TODA MI FAMILIA, SIMPLEMENTE POR SU AMOR Y CARIÑO. 
� AL DR. ISMAEL BUSTOS JAIMES, POR DARME LA OPORTUNIDAD DE 
TRABAJAR EN ESTE PROYECTO Y POR BRINDARME EL APOYO Y LOS MEDIOS 
NECESARIOS PARA CONCLUIRLO. 
� A LA DRA. SANDRA P. SÁNCHEZ, POR AYUDARME Y ASESORARME A LO 
LARGO DEL PROYECTO, CON SU INFINITA PACIENCIA Y DEDICACIÓN. 
� A TODOS LOS COMPAÑEROS, DOCTORES Y PERSONAL DEL LABORATORIO DE 
FISICOQUÍMICA E INGENIERÍA DE PROTEÍNAS, POR SU APOYO (RENAN, 
HAVEN, SERGIO, HECTOR, DIANA, LAURITA, ISABEL, VALERIA, 
ALEJANDRO, JORGE, PATY, HUGO, ARELY, YARETH, ROGELIO, DR. 
ALEJANDRO FERNÁNDEZ, DR. ALEJANDRO SOSA, DRA. GEORGINA GARZA, 
DR. MARIO CALCAGNO Y DOÑA MAGO). 
� A MIS AMIGAS Y AMIGOS QUE ME ACOMPAÑARON Y AYUDARON A LO 
LARGO DE LA CARRERA (SOL, KARY´S, TANIA, KARLITA, BLANCA, LA 
CHINITA, ALE, HUGO, SUSY�, BENJA, LUIS, OSWALDO, DANNY, EL FRIJOL 
(CESAR), NARMY, LUPILLA, DAVID, TOÑO, OLGA, GRISEL, NORA, OMAR 
(ABUELO), JOSH (VOCHO), ANGEL (GATO), ZYANYA, GABY, ARTURO, 
LUISA (PRIMA) Y ERNEL (PRIMO)) HACIENDO DE LOS MOMENTOS DIFÍCILES 
ALGO GRATO QUE DISFRUTAR. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA: 
� DEDICO ESTE TRABAJO A TODOS AQUELLOS QUE CREYERON EN MÍ, PERO 
MÁS AUN, EN LOS QUE NO CREYERON, POR DARME LA FUERZA NECESARIA 
PARA SEGUIR ADELANTE CADA QUE PENSABA DESISTIR. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
LO QUE ERA, NO ES LO QUE SOY… Y LO QUE SOY NO ES AUN LO 
QUE PUEDO SER. JOHN KATZENBACH 
 
 
 
 
NO PUEDES ENSEÑAR AL HOMBRE NADA; SOLO PUEDES AYUDARLE 
A QUE LO ENCUENTRE DENTRO DE SÍ MISMO. SI CARECE DE 
INTELIGENCIA ENTONCES TODAS LAS EXHORTACIONES, TODAS LAS 
LECCIONES, TODO INTENTO DE MEJORAR SUS MEDIOS, TODO 
SACRIFICIO Y TODO IDEAL NO LE ARRANCARAN DE SU 
BESTIALIDAD… MEDICO DE CUERPOS Y ALMAS (TAYLOR CALDWELL) 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
1. Abreviaturas usadas…………………..………………………………..……..… 1 
 
 
2. Resumen……………………………………………………………………..…… 4 
 
 
3. Introducción……………………………………………….……………....……… 5 
 
 
4. Antecedentes...………………………...…………….………..……………...….. 7 
 
4.1 Virus y partículas tipo virus (VLPs)…………………………….............…. 7 
4.2 Usos y aplicaciones de virus y VLPs…………………………….........… 20 
4.3 Desarrollo de biosensores……………………………………………….... 26 
4.4 Virus icosaédricos no envueltos………….……………………..……...... 26 
4.5 Parvovirus humano B19 y sus VLPs…………………………………...... 31 
4.6 Monobromobimano (mBBr) y sus aplicaciones…………….…….…..… 38 
 
 
5 Objetivos..……………………………………………………………………….. 43 
 
5.1 General….…………………………………………………………...……… 43 
5.2 Particulares………………….……………………………………………... 43 
 
6 Metodología…..……………………………………………………………….… 44 
 
6.1 Preparación de la proteína VP2………………………………………….. 44 
6.2 Producción y purificación de las VLPs…………………………...…….... 45 
6.3 Replegamiento de las VLPs………….……………………………...….... 46 
6.4 Cuantificación de proteína (BCA) y determinación del número de tioles 
disponibles en ella (DTNB) para el marcaje…………………………..… 47 
6.5 Dispersión dinámica de luz (DDL)……………………………….…..…... 49 
6.6 Microscopía de transmisión electrónica (TEM)………………….……... 49 
6.7 Conjugación del mBBr con las VLPs………………………..…….…….. 50 
6.8 Cuantificación de proteína (BCA) y determinación de número de tioles 
(DTNB)……………………………………………………..………….…..... 50 
6.9 Dispersión dinámica de luz (DDL)…………………………………...…... 51 
6.10 Microscopía de fuerza atómica (MFA)……………………....…......… 51 
6.11 Espectroscopia de fluorescencia……………………………...…....… 51 
6.12 Electroforesis en condiciones desnaturalizantes……………….....… 52 
6.13 Gradiente de cloruro de cesio (CsCl)…………….……………..….… 52 
 
 
7. Resultados y análisis de resultados………………………………………..… 54 
 
7.1 Producción y purificación de las VLPs………………………….…….…. 54 
7.2 Replegamiento de las VLPs…………………………………….……....… 56 
7.3 Caracterización de las VLPs ensambladas……………………………....57 
7.4 Caracterización de las VLPs marcadas………………………………...... 66 
 
 
8. Conclusiones…………………………………………………………….…...… 78 
 
 
9. Perspectivas…………………………...……………………………………….. 79 
 
 
10. Bibliografía…………………...……………………………………………….… 80 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
1. ABREVIATURAS USADAS 
aa Aminoácidos 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
Arg Arginina: 
ARN Ácido ribonucleico 
ARNm Ácido ribonucleico mensajero 
B19 Parvovirus Humano B19 
BCA Ácido bicinconínico 
BNPs Bionanopartículas 
CCMV Virus de frijol moteado 
Ci Concentración inicial 
Cf Concentración final 
CPV Parvovirus Canino 
CsCl Cloruro de cesio 
Cys Cisteina 
Da Daltons 
DDL Dispersión dinámica de luz 
DTNB 5,5´- ditio – bis (ácido 2 nitrobenzoico) 
DTT DL – ditiotreitol 
E. coli Escherichia coli 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético 
 
2 
GSH Glutatión 
GuHCl Cloruro de Guanidinio 
ICNV Comité Internacional de Nomenclatura de Virus 
ICTV Comité Internacional de Taxonomía de Virus 
IPTG Isopropil β - D - 1 - tiogalacto – piranosido 
mBBr Monobromobimano 
MFA Microscopía de fuerza atómica 
NaCl Cloruro de sodio 
NaHPO4 Fosfato de sodio 
Na2HPO4Fosfato dibásico de sodio 
NHS N-hidroxisuccinimida 
NS1 Proteína no estructural 
ORF Marco de lectura abierto 
rpm Revoluciones por minuto 
SARS Síndrome respiratorio grave 
SDS Dodecil sulfato de sodio 
T Número de triangulación 
TEM Microscopía de transmisión electrónica 
TfR Receptor de transferrina 
TMD Enfermedad del virus de mosaico de tabaco 
TMV Virus de mosaico de tabaco 
 
3 
 
TNB Ácido tionitrobenzoico 
VIH Virus de inmunodeficiencia humana 
VLPs Partículas tipo virus 
VP1 Proteína viral 1 
VP2 Proteína viral 2 
VP2-6H Proteína viral 2 unida a una cola de histidinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
2. RESUMEN 
Los virus son parásitos intracelulares cuyo material genético se encuentra 
confinado dentro de una cubierta protectora de proteína que les permite 
desplazarse de una célula a otra. Son así un sistemamuy eficiente y específico de 
entrega de material genético. Una manera de aprovechar su potencial 
biotecnológico es mediante la producción de partículas tipo virus (VLPs). Las VLPs 
se producen mediante la expresión de las proteínas que forman la cápside en 
células generalmente distintas al hospedero natural del virus. Las proteínas 
recombinantes se auto-ensamblan para formar cápsides sin material genético y 
pueden ser directamente purificadas. Estas partículas tienen la ventaja de no ser 
infectivas ya que carecen de información genética y poseen las demás 
características del virus, como su morfología, sitios de reacción antígeno-
anticuerpo, etc. La derivatización con agentes fluorescentes de las partículas tipo 
virus o los viriones nativos ofrece grandes ventajas en el área de medicina, por 
ejemplo para trazar los procesos infectivos de los virus o el destino de fármacos 
incorporados en dichas partículas. 
En este trabajo hemos estudiado la derivatización de VLPs del parvovirus B19 
con monobromobimano (mBBr). Las VLPs se ensamblaron in vitro a partir de la 
proteína VP2 expresada en Escherichia coli. Aprovechamos los residuos de Cys 
presentes en la proteína VP2 para realizar la derivatización, de modo que las 
partículas adquirieron fluorescencia. Las partículas tipo virus se caracterizaron 
antes y después de la derivatización. Se encontró que las VLPs se marcaron 
eficientemente con mBBr y su señal fluorescente podría ser utilizada con fines 
biotecnológicos. 
 
 
 
 
 
5 
3. INTRODUCCIÓN 
Los virus son parásitos intracelulares envueltos en una coraza de proteína, y 
en algunos casos de una membrana, que les permite desplazarse de una célula a 
otra para completar su ciclo reproductivo. Esta coraza llamada "cápside" contiene 
y protege al material genético de los virus. Las cápsides generalmente contienen 
más de un tipo de cadena polipeptídica, a menudo dispuesta en varias capas. En 
muchos virus la cápside está recubierta, además, por una membrana lipídica que 
contiene proteínas. Un cromosoma vírico puede ser una cadena sencilla de RNA, 
una doble cadena de RNA, una cadena circular sencilla o una cadena sencilla y 
lineal de DNA (1). El tipo de ácido nucleico de un virus, la estructura de la 
envoltura, la manera que tiene de entrar en la célula huésped y su mecanismo de 
replicación, varían considerablemente de un tipo de virus a otro. 
Los virus pueden ser usados en biotecnología para el desarrollo de vacunas, 
entrega de fármacos, terapia génica, bio-imagenología, etc. Una manera de 
aprovechar a los virus es mediante la producción de partículas tipo virus (VLPs), 
usando tecnología de DNA recombinante. Experimentalmente las VLPs se forman 
mediante la expresión de las proteínas que forman la cápside en células 
generalmente distintas al hospedero natural del virus (sistemas heterólogos). Las 
proteínas recombinantes se auto-ensamblan para formar cápsides sin material 
genético y pueden ser purificadas directamente. Estas partículas tienen la ventaja 
de no ser infectivas ya que carecen de información genética. En otros casos las 
proteínas expresadas en sistemas heterólogos se agregan formando cuerpos de 
inclusión que pueden ser resuspendidos con agentes desnaturalizantes y las 
proteínas son replegadas en condiciones controladas que permiten obtener VLPs 
(2). 
Nuestro grupo ha logrado el ensamblado in vitro de las VLPs del Parvovirus 
B19 y en este trabajo estudiamos su derivatización con monobromobimano 
(mBBr), el cual al unirse a la proteína adquiere fluorescencia. Las VLPs 
modificadas pueden ser utilizadas como herramientas biotecnológicas. En 
 
6 
particular, el Parvovirus B19 tiene como hospedero natural al humano, por lo que 
tiene un enorme potencial médico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
4. ANTECEDENTES 
4.1 Virus y partículas tipo virus (VLPs ) 
Los virus son entidades biológicas muy pequeñas y no pueden ser cultivados 
fuera de su hospedero. Aunque las enfermedades virales no son nuevas, los virus 
se identificaron a finales del siglo XIX. En 1886, el químico Danés Adolf Mayer 
demostró que la enfermedad de mosaico del tabaco (TMD) se transmitía de una 
planta enferma a una planta sana (1, 4). 
Desde la antigüedad el término “virus” ha sido sinónimo de veneno, pero a 
finales del siglo XIX esto se hizo sinónimo para microbio (la palabra de Pasteur 
para un agente infeccioso). No adquirió su presente connotación sino hasta 1890, 
después de que muchas enfermedades infecciosas causadas por bacterias y 
hongos habían sido descubiertas. Gradualmente los adjetivos filtrable y 
ultramicroscópico fueron agregados y la palabra “virus” desarrolló su presente 
connotación. En 1892, en un intento por aislar la causa de la TMD, el bacteriólogo 
Ruso Dimitri Iwanowski obtuvo la primera evidencia de que muchos agentes 
infecciosos, después llamados virus, eran diferentes de bacterias patógenas. Filtró 
la savia de plantas enfermas a través de un filtro Chamberland que era designado 
para retener bacterias (usado para esterilización). Esperaba encontrar al microbio 
atrapado en el filtro; en cambio, encontró que el agente infeccioso había pasado a 
través de los diminutos poros del filtro. Cuando infectó plantas sanas con el fluido 
filtrado, estas contrajeron la TMD. Aunque Dimitri Iwanowski fue el primero en 
demostrar que el agente causante de la enfermedad del mosaico de tabaco 
pasaba a través de un filtro de esterilización, todas sus publicaciones revelaron 
que no captó el significado de su observación y que siguió convencido de que trató 
con una bacteria pequeña, en lugar de un nuevo tipo de agente infeccioso (1). 
Félix Hubert d´Herelle (1873-1949) nacido en Montreal, acuño el término 
“bacteriófago” para virus que atacaban bacterias. La primera enfermedad humana 
asociada con un agente filtrable fue la fiebre amarilla (1). 
 
8 
Por los 30´s del siglo XX, los científicos comenzaron a usar la palabra “virus”, 
que en latín significa veneno, para describir los fluidos contagiosos. Por estos 
años, el desarrollo de la ultracentrifugación hizo posible la separación de los virus 
de los componentes de la célula huésped, y a principios de los años 40´s del 
mismo siglo se generalizó la idea de que todos los virus contienen ácidos 
nucleicos (1). Fue hasta 1935, cuando Wendell Stanley, químico americano, aisló 
el virus del mosaico del tabaco (TMV) y encontró que podía cristalizarse, haciendo 
posible por primera vez realizar estudios químicos y estructurales en un virus 
purificado. Alrededor del mismo tiempo, la invención del microscopio electrónico 
hizo posible ver a los virus (2). 
Avances en técnicas de biología molecular en los 80´s y 90´s permitieron el 
reconocimiento de nuevos virus, incluyendo el virus de la inmunodeficiencia 
humana (VIH) y SARS-coronavirus asociado (2). 
A partir de la aparición de las técnicas de ADN recombinante se inició una 
revolución en los enfoques utilizados para estudiar prácticamente todos los 
fenómenos biológicos, y el estudio de las proteínas no fue la excepción. La 
posibilidad creciente de aislar, caracterizar y modificar genes, dio origen a 
herramientas cada vez más poderosas y sofisticadas para indagar la relación entre 
la secuencia, la estructura y la función de las proteínas. Así mismo, la ingeniería 
de proteínas se ha potenciado en gran medida para ser utilizada con fines 
tecnológicos. La ingeniería de proteínas es una herramienta de gran utilidad en la 
actualidad, entre los aspectos abarcados en los estudios básicos de las proteínas 
se encuentran: el plegamiento, la estructura y estabilidad conformacional, el 
rediseño de centros catalíticos y las interacciones entre proteínas y ligandos. En lo 
que se refiere al aspecto aplicado, la ingeniería de proteínas se utiliza 
ampliamente en el campo biotecnológico, lo cual ha contribuido al descubrimiento,desarrollo y comercialización de alrededor de 100 nuevos productos biológicos 
comerciales en las últimas 2 décadas tales como anticuerpos monoclonales, 
hormonas, interferones, factores de crecimiento, interleucinas, factores de 
 
9 
coagulación etc. Como se puede ver, la ingeniería de proteínas es de gran interés 
e importancia en el ámbito actual para el avance tecnológico (3). 
Los virus se distinguieron originalmente de otros agentes infecciosos porque 
son especialmente pequeños (filtrables) y porque son parásitos intracelulares 
obligados, que requieren absolutamente de células vivas para multiplicarse (2). 
La cuestión de si los virus son organismos vivos tiene una respuesta ambigua. 
Dependiendo de nuestro punto de vista, un virus puede ser considerado como una 
agregación excepcionalmente compleja, sin vida, de productos químicos, o como 
un microorganismo de vida excepcionalmente simple (2). 
Las características realmente distintivas de un virus son: 
o Entidades que contienen un solo tipo de ácido nucleico, ADN o ARN. 
o Contienen una capa proteínica (algunas veces encerrada por una 
envoltura de lípidos, proteínas y carbohidratos) que rodea al ácido 
nucleico. 
o Se multiplican dentro de células vivas, usando la maquinaria de la 
célula. 
o Causan la síntesis de estructuras especializadas que pueden transferir 
ácidos nucleicos virales a otras células. 
La gama de hospederos de un virus es el espectro de células que el virus 
puede infectar. Distintos virus infectan invertebrados, vertebrados, plantas, 
protistas, fungí y bacterias. Muchos virus son capaces de infectar tipos específicos 
de células de una sola especie de hospedero. La gama particular de hospederos 
de un virus está determinada por los requerimientos del virus, tanto para su unión 
específica en la célula hospedera como para suplir factores celulares requeridos 
para la multiplicación viral. Para que el virus infecte una célula, la superficie 
exterior de éste debe interactuar químicamente con sitios específicos del receptor 
en la superficie de la célula (2). 
 
10 
Los tamaños de los virus (Figura 4.1.1) son determinados con la ayuda de la 
microscopia electrónica. El tamaño de los virus varía considerablemente. Aunque 
muchos son mucho más pequeños que una bacteria, algunos de los virus más 
grandes están alrededor del mismo tamaño que una bacteria pequeña. El intervalo 
de tamaños para los virus se extiende de 20 a 1000 nm en longitud (2). 
Figura 4.1.1. Tamaños de virus. Los tamaños de distintos virus en 
comparación con un eritrocito y la bacteria E. coli (2). 
 
Un virus puede tener ADN o ARN como material genético. El ácido nucleico 
de un virus puede ser monocatenario o bicatenario. Hay virus con doble cadena de 
ADN, con una sola cadena de ADN, con doble cadena de ARN y con cadena 
sencilla de ARN, donde la cadena pude ser positiva (el ARNm) o negativa 
(complementaria al ARNm). Dependiendo del virus, el ácido nucleico puede estar 
en varios segmentos, puede ser circular o lineal (Figura 4.1.2). La cantidad total de 
 
11 
ácido nucleico varía de unos miles de nucleótidos (o pares) a no más de 250 000 
nucleótidos (4). 
 
Figura 4.1.2. Diversos tipos de genoma vírico. 
 
Generalmente, los virus que contienen ADN, replican su ADN en el núcleo de 
la célula y citoplasma mediante el uso de enzimas celulares. Posteriormente las 
proteínas virales sintetizadas en citoplasma migran dentro del núcleo y son unidas 
con el ADN recién sintetizado para formar viriones. Estos son transportados a lo 
largo del retículo endoplásmico a la membrana celular del hospedero para su 
liberación. 
La multiplicación de los virus de ARN es esencialmente la misma que la de los 
virus de ADN, excepto por la existencia de diferentes mecanismos de formación 
de ARNm que ocurren alrededor de diferentes grupos de virus de ARN (2) (Tabla 
4.1.1). 
 
12 
Tabla 4.1.1. Comparación de la biosíntesis de ADN y ARN en virus (2). 
Ácido 
nucleico viral 
Familia de 
virus 
Características especiales de biosíntesis 
ADN, hebra 
simple 
Parvoviridae Las enzimas celulares transcriben el ADN viral 
en el núcleo 
ADN, hebra 
doble 
Herpesviridae 
Papovaviridae 
Poxviridae 
Las enzimas celulares transcriben el ADN viral 
en el núcleo 
 
Las enzimas virales transcriben el ADN viral en 
viriones, en el citoplasma 
ADN, 
transcriptasa 
reversa 
Hepadnaviridae Las enzimas celulares transcriben el ADN viral 
en el núcleo; la transcriptasa reversa copia 
ARNm para hacer ADN viral 
ARN hebra 
positiva 
Picornaviridae 
Togaviridae 
ARN viral funciona como un modelo para 
síntesis de ARN polimerasa que copia hebras 
negativas de ARN para hacer ARNm en 
citoplasma 
ARN hebra 
negativa 
Rhabdoviridae Enzimas virales copian el ARN viral para hacer 
ARNm en citoplasma 
ARN, hebra 
doble 
Reoviridae Enzimas virales copian la hebra negativa del 
ARN para hacer ARNm en citoplasma 
ARN, 
transcriptasa 
reversa 
Retroviridae Enzimas virales copian el ARN viral para hacer 
ADN en el citoplasma; el ADN se mueve hacia 
el núcleo 
 
 
13 
El ácido nucleico de un virus está protegido por una capa de proteína llamada 
cápside. La estructura de la cápside está determinada por el ácido nucleico viral 
y representa la mayor parte de la masa del virus, sobre todo de los virus 
pequeños. Cada cápside contiene más de un tipo de cadena polipeptídica, a 
menudo dispuesta en varias capas y está compuesta de subunidades de proteína 
llamados capsómeros (en 1957 Francis Crick y James Watson señalaron que la 
cápside debe estar construida sobre la base de uno o unos pocos tipos de 
subunidades proteicas, dispuestas en forma simétrica o casi simétrica). En 
algunos virus, las proteínas que componen el capsómero son de un solo tipo; en 
otros virus, distintos tipos de proteína pueden estar presentes. El arreglo de los 
capsómeros es característico de un tipo particular de virus (2,4). 
Los virus pueden ser clasificados dentro de distintos tipos morfológicos en 
base a la arquitectura de la cápside (Figura 4.1.3): 
→ Virus no envueltos: Virus cuya cápside no está cubierta por una 
envoltura. La cápside de estos virus protege al ácido nucleico de las 
nucleasas presentes en fluidos biológicos y promueve la unión del virus 
a células susceptibles. Dentro de esta clasificación entran los Virus 
helicoidales: Estos virus se ensamblan en largas fibras, que pueden 
ser rígidas o flexibles. El ácido nucleico está dentro de la cápside 
cilíndrica vacía que posee una estructura helicoidal. Virus 
icosaédricos: Muchos virus de animales, plantas y bacterias son 
poliédricos. La cápside de muchos de estos virus tiene forma de un 
icosaedro (también son denominados virus esféricos), un poliedro 
regular con 20 caras triangulares y 12 vértices. Los capsómeros de cada 
cara forman un triángulo equilátero (2,4). 
→ Virus envueltos: En algunos virus, la cápside está cubierta por una 
envoltura, que usualmente consiste de una combinación de lípidos, 
proteínas y carbohidratos. Dependiendo de los virus, las envolturas 
pueden o no estar cubiertas por “picos”, que son complejos de proteínas 
y carbohidratos, los cuales son proyectados en la superficie de la 
 
14 
envoltura. Dichos “picos” son una característica tan confiable de algunos 
virus, que pueden ser utilizados como medios de identificación. Estos 
virus son aproximadamente esféricos. Cuando los virus helicoidales o 
poliédricos están envueltos, son llamados virus helicoidales envueltos o 
virus poliédricos envueltos, respectivamente. 
→ Virus complejos: Algunos virus, particularmente los bacteriófagos, 
tienen estructuras complicadas y son llamados virus complejos (2). 
 
 
Figura 4.1.3. Tipos de morfología viral. Arriba izquierda: virus 
helicoidal, arriba derecha: virus icosaédrico, abajo izquierda: virus 
helicoidalenvuelto, abajo izquierda: virus complejo (2). 
 
 
15 
Se necesita de una taxonomía viral para ayudar a entender y organizar 
organismos descubiertos recientemente. La vieja clasificación de los virus estaba 
basada en la sinto-patología, muchos para enfermedades que afectan el sistema 
respiratorio. Este sistema fue conveniente pero no aceptable científicamente, 
porque el mismo virus puede causar más de una enfermedad, dependiendo del 
tejido afectado. Después de los primeros esfuerzos tentativos con grupos 
particulares de virus, la nomenclatura viral quedó fuera en 1948, con la producción 
de un sistema de nomenclatura latinizado para todos los virus, por el virólogo de 
plantas F. O. Holmes. Fue solo en 1950, con la utilización de la microscopía 
electrónica, que se estableció la primera clasificación real de los virus (2). 
Esto estimuló a otros virólogos (en particular a C. H. Andrews de Londres y A. 
Lwoff de París), a direccionar el problema de la taxonomía viral en 1966, en 
Moscú, en el Congreso Internacional para la Microbiología, con la formación del 
Comité Internacional de Nomenclatura de Virus (ICNV por sus siglas en inglés) 
con el objetivo de desarrollar un sistema taxonómico y de nomenclatura, 
reconocido mundialmente para todos los virus, el nombre del ICNV fue cambiado 
en 1974 por el de Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV por sus 
siglas en inglés). Desde entonces, el ICTV es reconocido como el cuerpo oficial 
internacional que decide en toda la materia relacionada con taxonomía y 
nomenclatura de virus. Este ha ido agrupando a los virus dentro de familias 
basándose en: 
1. El tipo de ácido nucleico 
2. La estrategia de replicación 
3. La morfología 
La nomenclatura está asociada fuertemente con la clasificación, en el sentido 
que los nombres taxonómicos indican, hasta cierto punto, la naturaleza del taxa. El 
ICTV tiene reglas para la nomenclatura de virus y la ortografía de los nombres 
taxonómicos que son regularmente revisados y mejorados (Tabla 4.1.2). Los 
nombres internacionales de especie de virus terminan en “virus”, los nombres del 
género en “… virus”, los nombres de la subfamilia en “… virinae”, los nombres de 
 
16 
la familia en “… viridae” y los nombres de orden en “…virales”. En el uso de la 
taxonomía formal, los nombres del orden del virus, familia, subfamilia, género y 
especie están impresos en cursivas (o subrayados) y la primer letra es mayúscula. 
Para diferenciar los nombres de la especie de virus de nombres de virus, se 
decidió que su tipografía debía ser diferente, esto es, los nombres de especie 
debían ser escritos con cursiva y la primer letra del nombre escrita con letra 
mayúscula mientras que los nombres de virus no. Como ejemplo tenemos al Virus 
de la inmunodeficiencia humana VIH (nombre de virus) y al Virus de la 
inmunodeficiencia humana VHI-1 (donde el 1 es la especie) (2, 5). 
Tabla 4.1.2. Lista de criterios para demarcar diferente taxa de virus (5). 
I. Propiedades del virión 
A. Propiedades morfológicas de viriones 
1. Tamaño del virión 
2. Forma del virión 
3. Presencia o ausencia de una envoltura 
4. Estructura y simetría capsomérica 
B. Propiedades físicas de los viriones 
1. Masa molecular de los viriones 
2. Densidad de viriones 
3. Coeficiente de sedimentación 
4. Estabilidad al pH 
5. Estabilidad térmica 
6. Estabilidad por cationes (Mg++, Mn++) 
7. Estabilidad al solvente 
8. Estabilidad a detergentes 
9. Estabilidad a radiación 
C. Propiedades del genoma 
1. Tipo de ácido nucleico (DNA o RNA) 
2. Hebras (hebra simple o doble) 
3. Linear o circular 
4. Sentido (positivo, negativo o ambisentido) 
5. Número de segmentos 
 
17 
6. Tamaño de genoma o segmentos de genoma 
7. Presencia o ausencia y tipo de funda terminal 5’ 
8. Presencia o ausencia de polipéptido enlazado covalentemente al 5’ terminal 
9. Presencia o ausencia de la extensión poli (A) 3’ terminal (u otra específica) 
10. Comparaciones de secuencia de nucleótidos 
D. Propiedades de las proteínas 
1. Número de proteínas 
2. Tamaño de proteínas 
3. Actividades funcionales de las proteínas (especialmente la transcriptasa del virión, 
la transcriptasa reversa del virión, hemaglutinina del virión, neuroamidasa del virión, proteína de 
fusión del virión) 
E. Lípidos 
1. Presencia o ausencia de lípidos 
2. Naturaleza de los lípidos 
F. Carbohidratos 
1. Presencia o ausencia de carbohidratos 
2. Naturaleza de los carbohidratos 
II. Organización del genoma y replicación 
1. Organización del genoma 
2. Estrategia de replicación del ácido nucleico 
3. Características de transcripción 
4. Características de traducción y procesamiento post-traduccional 
5. Sitio de acumulación de proteínas del virión, sitio de ensamble, sitio de maduración y 
liberación 
6. Citopatología, formación de cuerpos de inclusión 
III. Propiedades antigénicas 
1. Relaciones serológicas 
2. Mapeo de epítopos 
IV. Propiedades biológicas 
1. Gama de hospedero, natural y experimental 
2. Patogenicidad, asociación con enfermedades 
3. Tropismos de tejido, patología, histopatología 
4. Modo de transmisión en la naturaleza 
5. Relaciones de vector 
6. Distribución geográfica 
 
18 
Muchos virólogos se opusieron a la introducción de especies en la 
clasificación, porque argumentaban que el único concepto legítimo de “especie”, 
era el de especie biológica, definida para reproducción sexual, genes comunes y 
aislamiento reproductivo. Otra razón para la renuencia a adoptar la categoría de 
especie en la clasificación de los virus era la ausencia de una definición 
satisfactoria de una “especie” de virus. En 1991, el ICTV, aprobó la siguiente 
definición: una especie de virus es un grupo de virus que muestra la misma 
información genética y nicho ecológico particular (gama de hospederos). Esta 
definición no está basada en similitudes fenotípicas alrededor de los miembros de 
la especie; también enfatiza la presente cohesión interna en los linajes biológicos 
que forman un nicho biótico común. Las especies virales son designadas por 
nombres comunes (5). 
Después que la categoría de especie fue aceptada como la menor clase 
taxonómica para ser usada en la taxonomía viral, el ICTV decidió en 1998 que los 
nombres existentes comunes en inglés debían hacerse los nombres de especie 
oficiales (5). 
Una manera de usar a los virus es mediante la producción de partículas tipo 
virus (VLPs). Existen 2 descripciones divergentes de las VLPs en la literatura. La 
primera es la descripción histórica o “clásica” en que una VLP es vista puramente 
como un ensamble de proteínas estructurales, organizadas dentro de sub-
estructuras (capsómeros) que forman una partícula (cápside). En esta descripción, 
una VLP es una replicación incompetente del ensamble macromolecular de 
proteína que puede ser creada del mínimo auto-ensamble de proteínas 
estructurales de fagos y virus. La otra descripción abarca ensambles de 
biomoléculas inspiradas en virus (por ejemplo: proteínas, lípidos y ácidos 
nucleicos) que técnicamente no pueden ser descritos como virus. Aunque 
frecuentemente es usado para describir la replicación de ensambles incompletos, 
el término está siendo usado cada vez más en partículas que tienen una 
replicación limitada y empacan in vivo genomas virales o factores de hospederos 
(6). En nuestro caso nos referimos a partículas formadas a partir de moléculas 
 
19 
presentes en viriones nativos que carecen de cromosomas. El hecho de carecer 
de material genético evita que las VLPs sean infecciosas. 
Experimentalmente las VLPs se obtienen mediante la expresión de las 
proteínas que forman la cápside en células generalmente distintas al hospedero 
natural del virus y, generalmente, se obtienen en forma soluble lo que permite que 
sean purificadas directamente. En otros casos las proteínas se agregan formando 
cuerpos de inclusión que pueden ser solubilizados conagentes desnaturalizantes 
para su posterior replegamiento en condiciones controladas, tales que permitan 
obtener VLPs. A pesar de la ruta específica de ensamble, el proceso es 
usualmente a través de estructuras multiméricas (capsómeros) que finalmente se 
ensamblan en estructuras altamente ordenadas que conforman la partícula (6). 
En el caso de los eucariontes, la ruta aceptada para el bio-procesamiento de 
las VLPs depende del ensamble in vivo y del método de purificación de las 
partículas ex vivo. En bacterias, la dificultad común es la obtención de monómeros 
solubles y completos, que estén libres de toxinas, proteínas de choque térmico y 
proteínas chaperonas. Se ha observado que generalmente la solubilidad de las 
proteínas virales es limitada y promueve la formación de cuerpos de inclusión (6). 
En estos casos se requiere además de pasos de solubilización de los cuerpos de 
inclusión seguidos de un procedimiento de reensamble (Figura 4.1.4). 
 
Figura 4.1.4. Diferentes opciones de bioprocesos para la manufactura de 
bioproductos de VLPs (6). 
 
20 
4.2 Usos y aplicaciones de virus y VLPs 
En los últimos años diversos materiales a escala nanométrica (5-100 nm) 
pueden ser o representar múltiples funcionalidades (blanco celular, entrega de 
fármacos y bio-imagen) como agentes útiles en medicina (7). 
La bionanotecnología se enfoca en investigar y desarrollar nuevos materiales 
a escala nanométrica a partir de bloques de construcción biológica para propósitos 
estratégicos. Los virus y las VLPs se han estudiado extensamente como 
materiales iniciadores para la síntesis de diversos nanomateriales. A estos 
también se les conoce como bionanopartículas (BNPs) y proveen un arreglo 
diverso de formas como bastones y esferas y una variedad de tamaños. Las 
propiedades únicas de las BNPs están caracterizadas por sus características 
estructurales altamente simétricas y sus propiedades químicas distribuidas 
igualmente en función de su alta simetría. Estas propiedades a su vez están 
dentro del control de la información genética susceptible a ser modificada para 
incorporar nuevas funcionalidades con propósitos biomédicos, como entrega de 
fármacos, terapia génica, imagenología médica y desarrollo de vacunas. Múltiples 
ligandos, péptidos y pequeños compuestos químicos pueden ser anclados en la 
superficie o en el interior de los virus y las VLPs (7). 
Las características distintivas de las BNPs que hacen atractivos a estos 
biomateriales son: 
• Arquitecturas bien organizadas con una amplia selección de tamaños en 
la escala nanométrica. 
• Partículas monodispersas en forma y tamaño uniforme. 
• Producción económica a gran escala. 
• Disponibilidad de secuencia del genoma, aunque las propiedades de 
composición y superficie pueden ser controladas a través de tecnología 
de ADN recombinante. 
• Las técnicas de modificación genética y química pueden ser usadas 
para modelar los andamiajes. 
 
21 
Las VLPs también ofrecen un alto grado de organización espacial con un auto-
ensamble característico, lo que es una ventaja para controlar la densidad y 
orientación de un grupo funcional. Muchas de estas VLPs tienen funcionalidades 
relevantes en medicina, como la inserción de péptidos heterólogos o 
bioconjugaciones quimioselectivas (7). 
Las BNPs, poseen grandes áreas de superficie que pueden ser explotadas 
para múltiples ligandos. El agrupamiento de los ligandos en la superficie de las 
BNPs permite múltiples interacciones de ligando-receptor, una estructura de multi-
valencia (Figura 4.2.1). Este enlazamiento colectivo entre múltiples ligandos y 
receptores frecuentemente permite incrementar la afinidad. Estos sistemas 
multivalentes pueden permitir mejorar un blanco celular y superar distintas 
limitaciones en sistemas terapéuticos monovalentes y basados en anticuerpos (7). 
 
Figura 4.2.1. Ilustración esquemática de interacciones ligando-receptor 
basadas en valencia (7). 
 
 
22 
El interior de las VLPs es hueco y en adición a la superficie exterior, también 
puede ser manipulado; entonces pueden encapsular otros elementos para entrega 
de fármacos, evitando la degradación del fármaco, reduciendo problemas de 
biocompatibilidad y toxicidad hasta que una señal o el bajo pH endosomal dentro 
de la célula libere al fármaco del acarreador. Se pueden insertar pequeños 
péptidos, pero la capacidad de inserción parece ser limitada, porque grandes 
insertos parecen afectar el ensamble de las proteínas de la cápside (7, 8). 
En células enfermas la terapia de blanco celular (utilizando múltiples ligandos) 
junto con la encapsulación de algún fármaco podría reducir efectos laterales 
potenciales e incrementar la eficacia terapéutica. Es posible tomar ventaja de la 
afinidad natural de las VLPs sobre su blanco natural, es decir las células que suele 
infectar. En otros casos, mediante modificaciones genéticas en las VLPs con 
fragmentos de pequeños péptidos, es posible redireccionar las partículas hacia 
diferentes receptores de superficie celular. Pequeños insertos de péptidos, 
derivados de ligandos truncados o identificados a través de bibliotecas, pueden 
ser genéticamente introducidos en la superficie de las VLPs, o porciones de 
anticuerpos pueden ser conjugados químicamente en las cápsides de proteína 
para conferir nuevas capacidades de blanco celular (7). 
En terapia génica, se pueden empacar fragmentos de ácidos nucleicos dentro 
de las VLPs que después serán entregados a sus células blanco. Esto es posible 
ya que las VLPs mimetizan las funciones del virus original, pero carecen de 
componentes estructurales del genoma viral, reduciendo los riesgos potenciales 
de seguridad (7). 
Sondas basadas en agentes fluorescentes son las más comúnmente usadas 
en imagen, generalmente BNPs marcadas. Tanto los virus como las VLPs, son 
particularmente atractivos para la imagen específica de tejidos, porque son 
biocompatibles y biodegradables; pueden ser modificados con fluoróforos 
orgánicos para imagen óptica (7). 
 
23 
Para imagen in vivo o in vitro (como una tomografía de difusión fluorescente), 
es importante tener altas concentraciones locales del agente fluorescente que no 
presenten apagamiento (quenching) para aumentar el contraste de la imagen. Ya 
que las VLPs pueden ser modificadas genética o químicamente de una manera 
quimioselectiva, grandes cantidades de moléculas fluorescentes pueden ser 
distribuidas con precisión en la superficie o en el interior de las VLPs. Las 
estructuras rígidas y altamente ordenadas de la cápside “fijan” la unión de los 
agentes de la imagen en posiciones designadas de la superficie; las moléculas 
fluorescentes no tienen movilidad para interaccionar o agregarse unas con otras, 
lo que frecuentemente provoca el apagamiento de la fluorescencia (7). 
Para minimizar el fondo y aumentar la habilidad de penetración profunda en el 
tejido, moléculas fluorescentes en el infrarrojo cercano (NIRF) son utilizados 
frecuentemente para imagen en vivo. La conjugación química se ha usado para 
producir nano-tubos y complejos de partículas virus-metal, que tienen potencial 
como sensores biológicos. Las BNPs fluorescentes pueden combinarse con 
ligandos blanco para desarrollar una nueva herramienta poderosa para imagen no 
invasiva de enfermedades (7). 
En la terapia “blanco” se requiere que el fármaco interactúe específicamente 
con el tejido enfermo, mientras evita a las células sanas. La imagen por “blanco” y 
moléculas terapéuticas hará el diagnostico más exacto y reducirá los efectos de 
apagado del blanco asociado con el fármaco. Ciertos tejidos enfermos expresan 
receptores diferentes de los correspondientes tejidos sanos y muchos receptores 
pueden ser “blanqueados” específicamente usando los ligandos apropiados para 
la entrega de fármacos o reactivos de imagen (7). 
Otras aplicaciones específicas de VLPs o virus fluorescentes pueden ser paraseguir su camino intracelular y/o para trazar el destino de las partículas virales, 
después de su administración en un organismo completo (8, 9). 
La exposición polivalente de las BNPs es altamente ventajosa en el desarrollo 
de vacunas. El tamaño pequeño de genomas virales, la facilidad con que pueden 
 
24 
ser manipulados y la simplicidad de los procesos de purificación hacen de estas 
VLPs una alternativa atractiva como sistemas transgénicos para la exposición de 
proteínas antigénicas (7). 
En medicina, las cápsides vacías pueden ser usadas directamente como 
vacunas para prevenir el cáncer. Por ejemplo: la exposición a las cápsides vacías 
del virus del papiloma humano producen anticuerpos, provocando una respuesta 
inmuno-efectiva en caso de una subsecuente exposición con el virus que causa 
cáncer cervical. También, las cápsides pueden ser usadas como acarreadores en 
entrega de fármacos por su habilidad para ser el blanco específico de células 
tumorales. Por ejemplo las cápsides de parvovirus canino consiguen entrar en 
células humanas al unirse específicamente al receptor de transferrina, que es 
producido en grandes cantidades por una variedad de células tumorales (7, 9, 10). 
En la ciencia de materiales, las VLPs, debido a su arquitectura monodispersa 
y altamente simétrica, son materiales versátiles que pueden ser usados como 
modelos de catálisis y síntesis de nanoestructuras. Los virus pueden ser 
considerados como nanopartículas orgánicas. Muchos virus son usados 
comúnmente como andamios para enlazar moléculas covalentemente en la 
superficie de la partícula para síntesis químicas (10, 11). 
La ventaja de usar virus en lugar de nanopartículas artificiales es el número 
definido y orientación accesible de grupos funcionales en su superficie, con la 
posibilidad de desarrollar diferentes funcionalidades químicas que presenten una 
precisión nanométrica. Por ejemplo se han empleado virus no envueltos de 
plantas y bacteriófagos para el desarrollo de complejos órgano-metálicos que 
actúan como mediadores de transferencia de electrones, nanopartículas de 
metales o redes moleculares conductivas en 3D para la "decoración" con 
carbohidratos (11, 12). 
La tendencia hacia la construcción de materiales híbridos 
orgánicos/inorgánicos creó una demanda de nuevos péptidos. Generalmente 
ciertos péptidos son utilizados o dirigidos para su enlace o interacción con 
 
25 
materiales inorgánicos como metales, semiconductores, polímeros y otros 
compuestos técnicamente relevantes (Figura 4.2.2) (11, 12). 
Otro ejemplo de los usos de los virus en la ciencia de materiales, ha sido su 
empleo como constituyentes de capa en polielectrolitos multicapa, fabricados por 
la tecnología capa-sobre-capa en sustratos lisos. La disposición de hojas de 
filamentos cargados, en competencia con polielectrolitos débiles en la capa 
superior permite formar una monocapa de líquido cristalino de virus. La densidad 
de esta película de virus flotante depende de la carga del virus, que puede ser 
ajustada por alteración del pH. Este concepto se ha aplicado para metalizar 
partículas de virus para construir materiales de electrodo, flexibles y finos para 
baterías de ion-litio (11, 12). 
 
Figura 4.2.2. Aplicaciones de partículas virales en nanotecnología (12). 
 
 
 
Oligonucleótidos
Péptidos
Nano‐oro, otros 
metales 
Proteínas 
blanco 
Polímeros de 
carbohidratos 
Fluoróforos 
QDs 
Pequeñas 
moléculas 
Anticuerpos
 
26 
4.3 Desarrollo de biosensores 
Como se mencionó anteriormente, los virus y las VLPs se pueden usar como 
biosensores. Los biosensores son sistemas que representan un mecanismo 
híbrido que transforma, por medio de mecanismos bioquímicos, información de 
interacciones químicas en señales analizables. Los biosensores están constituidos 
de un sistema receptor en el que un componente biológico interactúa 
específicamente con un analito específico y un transductor fisicoquímico acoplado 
a un detector. El interés en el diseño de biosensores ha sido particularmente 
impulsado por las necesidades de contar con técnicas analíticas rutinarias y 
rápidas para un gran número de muestras, las cuales requieren la robustez, 
sensibilidad y reproducibilidad. Los biosensores tienen gran utilidad en 
investigaciones analíticas, en diagnósticos clínicos, en el control ambiental, en la 
industria alimenticia y farmacéutica. La integración de un componente biológico y 
un componente transductor son aprovechados para el desarrollo de biosensores. 
Las enzimas, los anticuerpos, las superficies de las membranas, los ácidos 
nucleicos, las células y los tejidos lisos son los más usados como componentes 
biológicos, mientras que el componente transductor está formado por grupos 
químicos con propiedades espectroscópicas, fluorescentes, eléctricas, etc. Dentro 
de los detectores los más utilizados son los electrodos, los semiconductores, los 
componentes ópticos y las microbalanzas (3). 
El marcaje sitio-específico de proteínas como herramienta para la 
construcción de biosensores permite incorporar señales de tipo fluorescente. Dado 
que la detección de fluorescencia es una técnica analítica muy eficiente por su 
sensibilidad y relativa accesibilidad, el uso de proteínas como componente 
biológico en los biosensores es una prioridad en la biotecnología, ya que las 
proteínas le confieren una alta especificidad al biosensor (3). 
 
4.4 Virus icosaédricos no envueltos 
Los principios que establecen la arquitectura del virus resultan de la necesidad 
de proveer un contenedor de máximo tamaño derivado de la mínima cantidad de 
información genética. Para aproximadamente la mitad de las familias de virus, la 
 
27 
estrategia universal que envuelve el empaquetamiento de ácido nucleico viral 
emplea múltiples copias de uno o más tipos de subunidades proteínicas 
dispuestas alrededor del genoma. En muchos casos las subunidades están 
dispuestas con una simetría bien definida en forma esférica o icosaédrica. El 
ensamble de subunidades dentro de partículas de proteína debe de ser correcto, 
rápido y, en muchos casos, un proceso espontáneo en una escala de tiempo 
biológico que resulta en una estructura con un mínimo de energía libre bajo 
condiciones intracelulares (13). 
Los virus icosaédricos más simples son ensambles moleculares uniformes que 
cristalizan en forma muy similar a las proteínas. En consecuencia, se pueden 
aplicar las técnicas de cristalografía por rayos X para determinar la estructura de 
los virus (13). 
Los principios de arquitectura para la construcción de un “virus esférico” fueron 
descritos por vez primera por Crick y Watson en 1956. Ellos sugirieron que las 
subunidades idénticas probablemente estaban distribuidas con la simetría de un 
poliedro Platónico (solo hay 3 simetrías poliédricas en las que todos los elementos 
son equivalentes: el tetraedro, el octaedro y el icosaedro. Las cápsides con estas 
simetrías tendrían 12, 24 o 60 subunidades dispuestas en forma idéntica sobre la 
superficie de una esfera.) Por ejemplo, un icosaedro tiene 20 caras triangulares, 
cada una con simetría triple, con un total de 20 X 3 = 60 posiciones equivalentes. 
Las subunidades distribuidas con la simetría del icosaedro proveen el máximo 
tamaño de partícula para un tamaño dado de subunidad, en que todas las copias 
de la subunidad están en una posición idéntica. Las interacciones repetidas de 
superficies químicamente complementarias en las interfaces de la subunidad 
forman de manera natural una partícula simétrica (13). 
La más simple de las partículas esféricas, la cápside con T=1 (donde T se 
denomina número de triangulación), tiene solo una subunidad de proteína en cada 
una de las 60 posiciones relacionadas con la simetría icosaédrica (Figura 4.4.1). 
Mientras que una ventaja de la cápside con T=1 es su entorno equivalente de 
subunidad, su mayor limitación es el pequeño volumen departícula. Para crear 
 
28 
cápsides más grandes, las subunidades deben ser más grandes o tener más de 
ellas (4, 13). 
 
 
Figura 4.4.1. Cápside icosaédrica conteniendo 60 copias idénticas de 
subunidad de proteína (azul). Estas están relacionadas por elementos de 
simetría quíntuple (pentágonos amarillos en los vértices), triple (triángulos 
amarillos en caras) y doble (elipses amarillos en bordes) (5). 
 
Los virus no envueltos proveen un sistema modelo para estudios estructurales 
de alta resolución de las cápsides y sus componentes. El conocimiento detallado 
de la cápside viral es valioso para el diseño de estructuras basadas de 
componentes antivirales y para el entendimiento de adaptaciones mutacionales 
que han envuelto a los virus para evadir las defensas inmunológicas del 
hospedero (13). 
Se ha revelado que los virus icosaédricos, tanto de animales como de plantas, 
presentan un sorprendente pliegue común para las subunidades proteínicas 
estructurales, que sigue siendo encontrado en estructuras de nuevos virus: el 
barril β anti paralelo. Éste se ha encontrado principalmente en partículas 
icosaédricas y está formado por 8 hebras β anti paralelas, con una topología de 
rollo de jalea y si las hebras son etiquetadas A, B, C,… I a lo largo de la cadena 
polipeptídica, las hojas pueden ser identificadas por el arreglo de las hebras GDIB 
y CHEF (Figura 4.4.2). Por medio de estudios cristalográficos de virus 
icosaédricos se ha demostrado que hay un número limitado de pliegues utilizados 
 
29 
para formar cápsides virales. La posición del barril β en la cáscara de la cápside 
está en una variedad de orientaciones y las inserciones entre las hebras β tienen 
distintos tamaños, dando a cada virus una estructura definida, función e identidad 
antigénica. Aunque el ensamble del barril β forma la cápside, las inserciones 
forman la superficie viral, en que están localizados los sitios de unión a su receptor 
y las determinantes inmunológicas. La porción N-terminal de la proteína de la 
cápside está usualmente en el interior del caparazón y frecuentemente se 
encuentra asociado con el ácido nucleico. Esta parte de proteína de la cápside 
generalmente no tiene simetría icosaédrica y puede parecer desordenada. En 
contraste, el C-terminal está usualmente expuesto y ordenado en estructuras 
virales. Muchas subunidades tienen superficies interfaciales complementarias que, 
cuando interaccionan repetidamente, dan la simetría del icosaedro (5, 14). 
 
Figura 4.4.2. Representación esquemática de una subunidad de un bloque 
de construcción encontrado en diversos virus (5). 
Caspar y Klug en 1962, desarrollaron un método general para la construcción 
de cápsides icosaédricas que presentaran múltiplos de 60 unidades, al que 
denominaron "teoría de la cuasi-equivalencia". La teoría de la cuasi-equivalencia 
puede predecir, con principios geométricos, la organización de hexámeros y 
pentámeros en una cápside viral, el arreglo detallado de subunidades puede ser 
establecido solo empíricamente. El método enumera sistemáticamente todas las 
estructuras cuasi-equivalentes y es similar al que fue obtenido por Buckminster 
 
30 
Fuller para construir domos geodésicos. La teoría cuasi-equivalente de Caspar y 
Klug explicó la distribución de unidades morfológicas en todas las estructuras 
observadas hasta el momento, aunque los resultados de cristalografía de alta 
resolución han revelado algunas inconsistencias remarcables con los principios de 
la microscopia sobre los cuales la teoría está basada. La cuasi-equivalencia es 
mejor visualizada gráficamente. Las subunidades que forman estructuras cuasi-
equivalentes deben ser capaces de ensamblarse dentro de hexámeros (que son 
vistos conceptualmente como planos), y de pentámeros (que son convexos porque 
una subunidad del hexámero planar ha sido eliminada y mantienen contactos 
similares o cuasi-equivalentes). Caspar y Klug propusieron que, lógicamente, las 
interacciones atómicas de subunidades quíntuples y séxtuples podrían ser 
estrechamente similares, y que sólo el ángulo diedro entre las subunidades podría 
cambiar; argumentaron que esta diferencia podría ser acomodada por variaciones 
permitidas en ángulos de enlace no covalentes entre residuos, estabilizando así a 
los oligómeros. Esta predicción era correcta para algunas cápsides de virus, pero 
en muchos virus hay un cambio molecular explicito que cambia de estado 
oligomérico (5). 
Si las subunidades se ensamblaran como los hexámeros, el resultado podía 
ser una hoja de hexámeros y la cápside no se podría formar. Las reglas de la 
cuasi-equivalencia describieron un procedimiento sistemático para insertar 
pentámeros dentro de redes hexagonales de tal modo que formen una cápside 
con simetría icosaédrica exacta. El virus del moteado del frijol (CCMV, por sus 
siglas en inglés), fue la primera estructura determinada que se agregó de acuerdo 
con las predicciones de Caspar y Klug. Un número sustancial de estructuras 
complejas de virus han sido determinadas por microscopía electrónica y el 
enrejado de la superficie cumple con las predicciones de la cuasi-equivalencia (5). 
 
 
 
 
 
 
31 
4.5 Parvovirus Humano B19 y sus VLPs 
El Parvovirus B19 (B19) era hasta hace pocos años el único parvovirus 
patógeno para el hombre. Fue descubierto por casualidad en 1975, en Londres 
por Yvonne Cossart y colaboradores. Estos investigadores estaban evaluando 
diferentes ensayos para el virus de la Hepatitis B en muestras de sangre donada. 
El espécimen 19 del panel B dio un precipitado inesperado en una prueba de 
conteo de inmuno-electroforesis. La microscopía electrónica reveló partículas del 
tamaño y la forma que sugirieron que se trataba de un virus de la familia los 
Parvovirus. Después, estudios de biología molecular establecieron que las 
partículas eran virus que contenían una sola hebra de ADN y tenían otras 
características que los localizaban en la familia Parvoviridae. No se asoció con 
ninguna enfermedad, sino hasta 1981 cuando se demostró que era un agente 
causante de crisis aplásticas en pacientes que sufrían de anemia de células 
falciformes (15). 
El desarrollo de prueba de captura del anticuerpo IgM por Mary Anderson y 
colaboradores en 1982 hizo posible asociar al B19 con la hidropesía fetal, 
infección persistente con anemia crónica y la posibilidad de asociaciones entre 
B19 y un número de enfermedades crónicas, ya que éste infecta la médula ósea 
(16). 
La infección causa una condición de salpullido tipo sarampión en la infancia, 
eritema infeccioso, también conocido como "la quinta enfermedad" y artritis aguda 
o crónica en adultos. En personas con hemólisis, la infección provoca crisis 
aplásticas pasajeras, debido al cese de la producción de células rojas, que es 
causada por el tropismo de B19 en células progenitoras eritroides. En individuos 
inmuno-comprometidos, como pacientes con SIDA y pacientes bajo terapia 
inmunosupresora, la infección por B19 causa anemia crónica severa. La infección 
de B19 en mujeres embarazadas puede causar hidropesía fetal (falla congestiva 
del corazón) y aborto espontáneo debido a la inhabilidad del feto para soportar 
una respuesta inmune adecuada (17). El curso bifásico de la infección comienza 
con una inoculación intranasal viral acompañada por malestar, comezón, mialgia y 
 
32 
síntomas tipo pirexia. Aproximadamente 18 días después de la infección, la 
segunda fase de síntomas consiste de salpullido, comezón o artralgia (18). 
La familia Parvoviridae incluye virus pequeños, no envueltos, de hebra simple 
de ADN que infectan un amplio rango de animales. Existen 2 subfamilias 
reconocidas; la Densovirinae que infecta insectos, mientras que la Parvovirinae 
infecta vertebrados. Esta última subfamilia contiene 3 géneros. Miembros del 
género Dependovirus requieren ayuda de virus para su replicación; miembros del 
género Parvovirusreplican sin ayuda de otros virus mientras que el tercer género, 
Erythrovirus replican en células progenitoras eritroides. En el presente hay 2 
miembros de este último género: Parvovirus humano B19 y uno descrito 
recientemente Parvovirus de simio (SPV) (19). 
Los parvovirus son virus pequeños (18 – 26 nm), esféricos, no envueltos, el 
ADN consiste de alrededor de 5,600 bases y codifica para tres proteínas; la 
proteína no estructural (NS1) asociada con la replicación del DNA y la apoptosis, y 
2 proteínas estructurales: la VP1, asociada con la interacción del receptor celular 
(83,000 g/mol), y la VP2 (58,000 g/mol), asociada con el reconocimiento por el 
antígeno IgM. Cuando el DNA del B19 es extraído a baja fuerza iónica, el DNA 
predominante es de una sola hebra, indicando que el B19 empaca hebras con 
sentido positivo y negativo (en partículas separadas). El genoma del B19 tiene una 
horquilla terminal de 365 nucleótidos que puede verse usando microscopía 
electrónica. Las partículas tienen simetría icosaédrica de T = 1 (60 subunidades 
equivalentes estructuralmente). El peso molecular del virión y las partículas vacías 
es de 5.5 X 106 y 4.2 X 106 Da, respectivamente. Las partículas llenas tienen una 
densidad de aproximadamente 1.4 g/ml en cloruro de cesio (19, 20). 
La proteína no estructural denominada NS1 tiene pocas funciones 
demostradas directamente. Se cree que la NS1 del parvovirus es citotóxica en 
células de mamíferos. En estudios recientes se ha demostrado que mutaciones 
dentro del gen que codifica para la proteína NS1 de B19 reducen la citotoxicidad 
de esta proteína (19). 
 
33 
La iniciación de la replicación del parvovirus requiere interacciones con 
receptores celulares superficiales específicos. Brown y colaboradores han 
demostrado que el antígeno P de los grupos sanguíneos es el receptor para B19. 
Las proteínas de la cápside son codificadas por un marco de lectura abierto (ORF) 
(21), en el que existen 4 ARNm sobrepuestos (2 genes de 2 ARNm relacionados) 
que codifican las proteínas de la cápside viral del B19. Un gen codifica VP1 (781 
residuos de aminoácidos (aa)), la proteína estructural de menor porcentaje en la 
cápside (ensambla alrededor del 5% de la cápside viral). El otro gen codifica la 
VP2 (554 aa), la de mayor porcentaje en la cápside (ensambla alrededor del 95% 
de la cápside viral), que es traducida en el mismo ORF que la VP1. La estructura 
de la VP2 consiste de un barril β similar al encontrado en muchas otras proteínas 
de cápside que consiste en 2 hojas β en el arreglo estándar BIDG y CHEF. Esta 
estructura de barril β contiene sólo un tercio de los aminoácidos contenidos en 
cada polipéptido y están en su mayor parte bajo la superficie de la cápside, que 
está formada por grandes inserciones entre las hebras β. La cápside parece ser 
estabilizada por el entrelazamiento de moléculas VP2 vecinas (Figura 4.5.1). La 
VP1 tiene 226 aa extras y se denominan como la región-amino terminal única de 
VP1 y es conocida por estar en la superficie de partículas virales y los anticuerpos 
son dirigidos predominantemente sobre esta región de la cápside (17). 
 
34 
 
Figura 4.5.1. Estructura del Parvovirus B19. A: estructura de cada 
subunidad de la cápside; B: estructura de la cápside completa (28). 
 
Diversos grupos han expresado las proteínas virales VP de B19 (y en algunos 
casos las proteínas NS también) en diferentes sistemas celulares de cultivo como 
células de insectos usando baculovirus recombinante (22, 23), células 
transformadas CHO (inducibles con metotrexato) (24) y células transformadas 
COS-7 con vectores híbridos B19-SV40 (25). En cada caso, las proteínas de la 
cápside de B19 parecen ensamblarse en partículas que son morfológica y 
antigénicamente similares al Parvovirus B19 (26), con la excepción de que un 
número sorprendente de estas partículas auto-ensambladas expresadas en 
baculovirus parecen tener alguna densidad electrónica localizada acéntricamente 
dentro de la partícula. Mientras que las proteínas VP2 se ensamblan solas o con 
VP1, la VP1 sola no es capaz de auto-ensamblarse (22). En estudios adicionales 
se ha demostrado que los 226 aa de la región única de VP1 interfieren 
progresivamente con el ensamble de la partícula cuando más de 70 aa de esta 
región están presentes (27). 
A 
B 
 
35 
El B19 se ha utilizado para desarrollar nanopartículas tipo virus fluorescentes 
fusionando el gen de la proteína verde fluorescente y exponiendo una gran 
cantidad de esta proteína. Estas partículas podrían ayudar para elucidar el 
mecanismo de infección y patogénesis del virus. En adición, estas nanopartículas 
también podrían servir como un sistema modelo en el desarrollo de vehículos 
“blanco” designado para la entrega de biomoléculas (18). 
A partir de la estructura cristalográfica del parvovirus B19 (PDB 1S58 (28)) 
obtenida en base a la proteína VP2 se han identificado 2 residuos de Cys (64 y 75) 
(Figura 4.5.2) en la superficie de cada subunidad y 5 en total. 
 
Figura 4.5.2. Subunidad de la cápside del Parvovirus B19. En amarillo se 
señalan los átomos de azufre de los residuos de las cisteínas expuestas en 
la superficie de cada subunidad (PDB 1S58). 
 
Como se explicó anteriormente, las VLPs pueden ser modificadas 
químicamente en la superficie, en este caso, se pueden utilizar los residuos de 
cisteína de las VLPs del parvovirus B19 para poder modificarlos con un agente 
fluorescente (mBBr) y así poder utilizarlos como herramientas de bio-imagen o 
biosensores. Las VLPs usadas para propósitos de imagen no deben ser 
patógenas y no deben replicarse; si se combinan funciones de blanco, imagen y 
 
36 
entrega de fármacos, existirá un enorme potencial para incrementar la sensibilidad 
y especificidad de las terapias. Esto facilitará la detección y reducirá efectos 
adversos del tratamiento (29). 
Recientemente se ha utilizado al parvovirus canino (CPV) para dirigirlo a 
células tumorales, con fines de explorar su entrada a células vivas. El receptor 
natural para el CPV en células de caninos es el receptor de transferrina (TfR). 
Curiosamente la cápside de CPV también es afín por TfR sobreexpresados en una 
variedad de células tumorales. Se han modificado residuos de lisina en la 
superficie del CPV con moléculas fluorescentes y se ha observado que estas 
partículas son internalizadas en las células que expresan el TfR mientras que 
aquellas células sanas no lo internalizan (29). 
Los residuos que aparecen expuestos en la superficie del B19 pueden ser 
fácilmente titulados por medio de la reacción del 5,5'-ditio-bis (ácido 2-
nitrobenzoico) (DTNB), el cual reacciona con ellos para formar un enlace disulfuro 
entre la proteína y el residuo del ácido Tionitrobenzoico (TNB), liberando una 
molécula de TNB. La modificación es generalmente rápida y selectiva. La reacción 
es llevada a cabo a pH de 7-8 y la modificación es estable bajo condiciones 
oxidativas. El grupo TNB puede ser liberado de la proteína modificada por un 
tratamiento con reactivos que reducen enlaces S-S (mercaptoetanol o cianuro de 
potasio) (30). También es posible formar derivados de los grupos tioles mediante 
su reacción con haluros de moléculas marcadoras, como el 5-bromobimano 
(Figura 4.5.3). 
 
 
37 
 
Figura 4.5.3. Algunas reacciones de modificación química de proteínas. A) 
Oxidación de residuos de Cys por la reacción con 5,5'-ditiobis(ácido 2-
nitrobenzoico) (DTNB) [1] para producir un disulfuro mixto [2] y el ácido 5-
tio-2-nitrobenzoico [3], el cual puede ser seguido espectrofotométricamente 
por su color amarillo. B) Reacción de oxidación de Cys por el haluro 
monobromobimano (mBBr) [4] para producir un derivado fluorescente [5] 
(31, 35). 
 
Se han descrito nuevas estrategias para el uso de nanopartículas virales como 
una plataforma para la exposición multivalente de sondas fluorescentes para 
imagen de tejidos dentro de organismosvivos. El virus del mosaico del tabaco 
(CPMV) puede ser etiquetado con sondas fluorescentes (se utilizó N-
hidroxisuccinimida (NHS)), resultando en partículas brillantes con propiedades de 
dispersión in vivo que tienen una alta resolución en imagen intravital del endotelio 
vascular, en periodos de mínimo 72 horas. Se ha mostrado que las nanopartículas 
de CPMV pueden ser utilizadas para visualizar las vasculaturas y fluido sanguíneo 
en ratones vivos y embriones de pollo con una profundidad mayor a 500 µm. 
También con este virus se ha demostrado que la visualización intravital del 
fibrosarcoma humano provee un medio para identificar vasos sanguíneos 
arteriales y venosos y para monitorear la neovascularización del microambiente 
del tumor (32). 
 
 
 
 
 
 
38 
4.6 Monobromobimano (mBBr) y sus aplicaciones 
Los bimanos o 1,5-diazabiciclo [3,3,0]octadienonas son agentes de etiquetado 
fluorescente que adicionan idealmente pequeñas “etiquetas” fluorescentes en 
moléculas blanco, usualmente proteínas, aunque pueden ser ácidos nucleicos o 
polisacáridos. Estos compuestos fueron preparados por primera vez por Kosower 
(33). 
Los bromobimanos son derivados de una estructura básica (2 anillos de 5 
miembros fusionados) con el requisito de mínimo tamaño. Una “forma corta” de 
nomenclatura (R2, R1)B describe los sustituyentes en el anillo y es conveniente 
para descripción y discusión, mientras que el nombre sistemático de cada uno de 
ellos es apropiado como nombre formal (34). 
 Dos series de bimanos son conocidas, aquellas con los oxígenos carbonílicos 
en el mismo lado (sin) y aquellas con los oxígenos carbonílicos de lado opuesto 
(anti). La serie sin es generalmente fluorescente; mientas que la anti es 
fosforescente (figura 4.6.1) (35). 
 
Figura 4.6.1. Estructura de los tipos de bimanos conocidos. Izquierda: sin. 
Derecha: anti (35). 
Los bimanos neutros (aquellos que no poseen carga) son moderadamente 
solubles en medios polares orgánicos (acetonitrilo, diclorometano) y escasamente 
solubles en agua. La absorción máxima para los agentes y algunos de sus 
derivados está dada con la emisión máxima en la Tabla 4.6.1 (35). 
 
 
 
 
39 
Tabla 4.6.1. Absorbancia y fluorescencia de bromobimanos y materiales 
etiquetados (35). 
Bromobimanos y 
 materiales sB-etiquetadosa 
Absorbancia 
λm (εm) 
Fluorescencia 
λm (φF)c 
CH3CN Amortiguador b 
mBBr 381 (6000) 396 (5300)d (0)e 
bBBr 392 (6000) ------ (0) 
qBBr ------ 378 (5700)f (0) 
mB-globinag ------ 385 (∼4200) 484 (∼0.18-0.23) 
mB-SR(MPA)h ------ 392 484 (∼0.26-0.28) 
mB-SGi ------ 390 (∼5300) 482 (∼0.3) 
 
a sB-etiquetados es un término generalmente usado para cualquiera de los productos de syn-bimanos. 
b Amortiguador conteniendo 135 mM de NaCl, 10 mM de fosfatos, pH 7.4. 
c El rendimiento cuántico de fluorescencia (fotones absorbidos/fotones emitidos) se basó en la 
fluorescencia del sulfato de quinina como referencia (φF). 
d Una solución de mBBr fue diluida en acetonitrilo con el amortiguador descrito en la nota b. 
e El rendimiento cuántico de la fluorescencia de los bromobimanos fue menor a 0.001. 
f Disolver en amortiguador inmediatamente antes de las mediciones. 
g La globina etiquetada fue preparada de hemoglobina que reaccionó con bromobimano. Fue almacenada 
como un polvo y se disolvió en agua para las mediciones. 
h El extracto de ácido metafosfórico (MPA) de eritrocitos etiquetados, que contenían NPSH, 
principalmente GSH (glutatión). 
i GSH etiquetado preparado por reacción de GSH en amortiguador. 
 
Las soluciones stock de los bromobimanos son esencialmente no 
fluorescentes y son relativamente estables cuando se almacenan en la oscuridad. 
Generalmente son 3 bromobimanos los que tienen mayor aplicación en el marcaje 
fluorescente de sistemas biológicos (Figura 4.6.2). La forma corta de sus nombres 
aparece debajo de cada estructura: 
 
40 
 
Figura 4.6.2. Estructura de los tipos de bromobimanos más utilizados en el 
marcado fluorescente de sistemas biológicos. mBBr, monobromo bimano o 
5-bromo bimano; bBBr, bibromo bimano; qBBr, monobromo trimetilamonio 
bimano (35). 
 
Los bromobimanos mBBr y bBBr son neutros y penetran fácilmente en las 
células vivas; el qBBr está cargado positivamente y no penetra la célula viva. Los 
bromobimanos pueden ser usados a pH fisiológico, generando reacciones rápidas 
con tioles de moléculas pequeñas (marcado completo de tioles no proteínicos en 
un intervalo de segundos a minutos) y reacciones lentas con tioles de proteína 
(minutos a horas). Esto permite no sólo identificar la especie de tiol reactiva, sino 
también aprender como los grupos reactivos son accesibles en condiciones 
diversas, incluyendo las fisiológicas (35). 
El monobromobimano, mBBr, es el usado más frecuentemente en la serie, no 
sólo como un agente de marcado para tioles, sino también para estudios sobre el 
efecto de la alquilación de tioles reactivos en sistemas biológicos. El mBBr puede 
ser añadido a células intactas antes del tratamiento, evitando la pérdida oxidativa 
de tioles durante la preparación de la fracción a estudiar. En adición a la 
determinación de tioles totales, el marcado con mBBr hace posible la 
cuantificación de tioles en proteínas individuales (35). 
Los materiales etiquetados con bimanos son estables al aire, la luz, a 
procedimientos químicos y bioquímicos, y son resistentes a la irradiación (e.g. no 
pierden fluorescencia o lo hacen muy lentamente durante la observación en 
microscopía de fluorescencia); también exhiben buenas mediciones de 
fluorescencia y las pequeñas moléculas fluorescentes perturban mínimamente la 
 
41 
conformación macromolecular. Algunos usos y aplicaciones que pueden tener los 
materiales etiquetados con bimanos son los siguientes: 
 Las moléculas que no contienen tioles disponibles pueden ser 
modificadas con tioles libres que entonces pueden ser etiquetadas con 
mBBr y usadas como pruebas y sustratos fluorescentes. La pepstatina 
fue convertida en un SH-derivado (por acoplamiento con cisteamina) y 
luego tratada con mBBr; el mB-derivado usado como una prueba 
fluorescente para la localización subcelular de la catepsina D con 
selectividad para la conformación activa de la enzima. 
 Como sustrato para la glutatión (GSH) transferasa, el mBBr reacciona 
como mínimo 3 veces más rápido con GSH en presencia de la GSH 
transferasa. 
 Para inmovilización de células móviles, el mB-etiquetado de 
espermatozoides no tuvo efecto en la movilidad de estos; de cualquier 
modo, la excitación del esperma etiquetado por microscopía de 
fluorescencia resulto en la inmovilización instantánea del esperma. La 
inmovilización dependiente en la pieza central siendo irradiada sugirió 
un sitio de acción mitocondrial (35). 
 El mBBr ha siso usado como una prueba tiol-reactiva sitio-dirigida en 
estudios de espectroscopia de fluorescencia de rodopsina y lisozima 
T4. 
 Más recientemente los derivados de bimano han sido usados como 
pruebas en conjunción con espectrofluorometría de membrana fija 
(patch-clamp) para estudiar cambios conformacionales ligando-
dependientes en canales CNG (36). 
En este trabajo se propone el etiquetado de VLPs de B19, usando como 
agente fluoroforo al mBBr, el cual podría reaccionar con las cisteínas que se 
encuentran expuestas en la superficie de cada subunidad de la cápside de las 
 
42 
VLPs, así mismo para demostrar el número de estas presentes por unidad se 
pretende hacer una titulación con DTNB. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
43 
5. OBJETIVOS 
 
5.1 General: 
 Estudiar la modificación química de la superficie de partículas tipo virus 
derivadas del parvovirus B19 con monobromo bimano. 
 
 
5.2 Particulares: 
 Expresar en E. coli la proteína VP2-6H. 
 Purificar la proteína VP2-6H en condiciones desnaturalizantes.Ensamblar VLPs a partir de la proteína recombinante VP2-6H. 
 Modificar químicamente las VLPs ensambladas con monobromo bimano. 
 Caracterizar las partículas marcadas por métodos fisicoquímicos y 
espectroscópicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
44 
6. METODOLOGÍA 
 Reactivos 
 
Los reactivos incluyendo el marcador fluorescente mBBr, se compraron a 
Sigma Aldrich S.A. de C.V., México. 
 
6.1 Preparación de la proteína VP2 
El gen vp2 que codifica para la proteína VP2 del B19 se encuentra clonada en 
el vector pET-22b(+), al plásmido resultante se le denominó pETVP2. Esta 
construcción incluye una etiqueta de 6 histidinas para facilitar la purificación (37). 
La clonación del gen vp2 se hizo entre los sitios de restricción HindIII y NdeI 
(Figura 6.1.1). 
 
Figura 6.1.1. Vector de clonación pET-22b(+). 
 
 
 
45 
6.2 Producción y purificación de las VLPs 
En área estéril, un tubo con 10 mL de medio líquido LB (hidrolizado de caseína 
10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 9 g, Na2HPO4 1 g, agua c.b.p. 1 L), se inoculó 
con 100 µL de un cultivo de E. coli BL21(DH3) transformada con el plásmido 
pETVP2 más 10 µL de ampicilina 5 mg/mL. Se incubó a 37ºC toda la noche (las 
incubaciones se hicieron en la incubadora Max Q5000) con agitación constante de 
250 rpm. Pasado ese tiempo se vació el contenido del tubo en un matraz 
Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio líquido LB y se le adicionaron 100 µL 
de ampicilina 5 mg/mL. Se Incubó a 37ºC por 4 horas con agitación constante. 
Después de ese tiempo se vació el contenido del matraz en otro matraz 
Erlenmeyer de 2 L con 1 L de medio líquido LB y se le adicionó 1 mL de ampicilina 
5 mg/mL. Se incubó a 37ºC por 4 horas con agitación constante. Pasadas las 4 
horas el matraz se metió al cuarto frío por una hora, para disminuir la temperatura 
a 30ºC. Una vez que el matraz alcanzó los 30ºC se le adicionó IPTG (Isopropil β - 
D - 1 - tiogalacto - piranosido) como inductor a una concentración final de 0.25 mM 
y se incubó a esa temperatura por 36 horas con agitación constante de 250 rpm 
(incubadora orbital INO – 650M). Posteriormente las células se recuperaron por 
centrifugación de 20 min a 7500 rpm (centrifuga Sorvall RC-5B Refrigerated 
Superspeed, rotor Sorvall GSA). Esta proteína expresada en E. coli forma cuerpos 
de inclusión (37, 38). Las células se resuspendieron en 40 mL de amortiguador de 
lisis (NaH2PO4 50 mM, pH 6.3, NaCl 800 mM) y se sonicó (4ºC, 15 min, amplitud = 
31 y 5.5 pulsos por segundo). Las células lisadas se centrifugaron a 6000 rpm por 
15 minutos (centrifuga Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed, rotor Sorvall 
SS34) y se recuperó el pellet, donde se encuentran los cuerpos de inclusión. El 
pellet se lavó 3 veces con 25 mL del amortiguador de lavado (NaH2PO4 50 mM, 
NaCl 800 mM, urea 3 mM, Tritón X100 2%, DTT (DL-ditiotreitol) 3 mM, pH 6.3) y 
3 veces más con 25 mL del mismo amortiguador sin urea y sin tritón X100. 
Finalmente se lavaron 2 veces con 25 mL de agua desionizada. Entre cada lavado 
se sonicó 1 minuto y se centrifugó a 8000 rpm por 10 min (centrifuga Sorvall RC-
5B Refrigerated Superspeed, rotor Sorvall SS34). Una vez hechos los lavados se 
realizó la solubilización de los pellets resuspendiéndolos en 100 mL de 
 
46 
amortiguador de solubilización de proteína (NaH2PO4 50 mM, NaCl 800 mM, DTT 
3 mM, Cloruro de guanidinio 6 M, pH 6.3), sonicándolos por 1 min. Se incubaron 
toda la noche a 37ºC con agitación constante. Pasado ese tiempo se centrifugó a 
15,000 rpm por 20 min (centrifuga Sorvall RC-5B Refrigerated Superspeed, rotor 
Sorvall SS34) y se recuperó la fracción soluble. Se microfiltró la muestra con un 
filtro con tamaño de poro de 0.2 µm. 
Se realizó cromatografía de afinidad en condiciones desnaturalizantes 
utilizando una columna empacada con resina Protino Ni-TED (Macherey-Nagel) y 
preequilibrada con amortiguador de afinidad (NaH2PO4 50 mM, NaCl 800 mM, 
cloruro de guanidinio 6 M, pH 6.3) se realizaron varias corridas de 20 o 25 mL de 
proteína para no saturar la columna, se utilizó amortiguador de elución (NaH2PO4 
50 mM, NaCl 800 mM, cloruro de guanidinio 6 M, Imidazol 250 mM, pH 6.3) y se 
colectaron las fracciones, posteriormente se verificó la pureza de la proteína 
haciendo electroforesis en gel de acrilamida en condiciones desnaturalizantes 
(SDS-PAGE) y se juntaron las fracciones puras. 
 
6.3 Replegamiento de las VLPs 
Después de la purificación de la proteína, se continuó con el replegamiento y 
ensamble de las partículas virales, el cual se realizó en 2 condiciones. Se partió de 
la proteína soluble en GuHCl (cloruro de guanidinio) 6 M. Las diálisis se realizaron 
en amortiguador PBS (NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, NaH2PO4 10 mM, KH2PO4 2 
mM, pH 7.4) y en amortiguador PBS con 0.5 M de Arg. Se dejó que se llevara a 
cabo la diálisis por 36 horas a 4ºC con agitación constante, haciendo cambio de 
amortiguador cada 12 horas en cada condición. Para ello se usaron 1.2 mL de 
proteína soluble (0.7 mg/mL) en GuHCl 6 M por cada 50 mL de amortiguador (ya 
fuera PBS o PBS con 0.5 M de Arg). 
 
 
 
 
 
47 
6.4 Cuantificación de proteína (BCA) y determinación del número de 
tioles disponibles (DTNB) en ella para el marcaje 
Fundamento del BCA: El ácido bicinconínico (BCA) es altamente sensible y 
selectivo para medir proteína. Este ensayo combina la reducción de Cu2+ por 
proteína a Cu1+ en un medio alcalino, y el ión cuproso (Cu1+) es detectado por el 
BCA (Figura 6.4.1). 
Se ha descrito que la estructura macromolecular de la proteína, el número de 
enlaces peptídicos y la presencia de 3 aminoácidos (cisteina, triptofano y tirosina) 
son responsables de la formación de color en las muestras de proteína (39, 40). 
 
Figura 6.4.1. Esquema de la formación del complejo de color púrpura con 
BCA y el ión cuproso (39). 
La VP2 se cuantificó usando una curva patrón de albúmina (1 mg de albúmina 
en 1 mL de agua destilada), la cual se hizo de la siguiente manera: 
Se pesó 1 mg de albúmina (en la balanza analítica) y se disolvió en 1 mL de 
agua; de esta concentración de albúmina se tomaron diferentes volúmenes de 0 a 
100 µL (0, 20, 40, 60, 80 y 100), los cuales se colocaron en diferentes tubos 
Eppendorf y a cada uno de los tubos se les agregó el agua necesaria para llegar a 
un volumen final de 100 µL. A cada tubo se le adicionaron 5 µL de SDS al 10%. 
Aparte se preparó una mezcla de 9.8 mL de ácido bicinconínico y 0.2 mL de 
 
48 
sulfato de cobre al 4%. A cada tubo de la curva patrón se le adicionaron 900 µL de 
la mezcla anterior, se mezclaron bien y se incubaron a 37ºC por 30 min en una 
incubadora (MTC dry bath incubator) para tubos Eppendorf. Transcurrido el tiempo 
se midió la absorbancia a 562 nm (en el espectrofotometro Beckman DU 7500) y 
se trazó la curva patrón. 
Para determinar la cantidad de proteína en la muestra se siguió el 
procedimiento anterior usando 100 µL de muestra; el SDS se agregó para eliminar 
la turbidez de la proteína y así tener las mismas condiciones tanto en la curva 
patrón como en la muestra. 
Fundamento del método de cuantificación de tioles por DTNB: El DTNB 
reacciona con los sulfidrilos libres de la cadena de cisteína para formar un enlace 
S-S entre la proteína y un residuo del ácido tionitrobenzoico (TNB), liberando una 
molécula de TNB cuya coloración es medible (absortividad molar, ε = 14,150 M-1 
cm-1 a una λ de 412 nm) (30). 
Se preparó una solución stock saturada de DTNB (disolviendo 1.5 mg de este 
en 1 mL de Amortiguador Tris-HCl 20 mM, pH 8). Se mezcló perfectamente y 
después se centrifugó a 14,000 rpm (para tener las partículas insolubles en el 
fondo) a temperatura ambiente por 1 minuto (Centrifugue 5417R Eppendorf). 
En un tubo Eppendorf se colocaron 390 µL de muestra (VLPs) en 
amortiguador PBS, 10 µL SDS al 10% (0.2 % concentración final) y 100 µL de la 
solución stock de DTNB para tener un volumen final de 500