Delimitacion-de-especies-en-el-genero-dichromanthus-orchidaceae-spiranthinae

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
SISTEMÁTICA
DELIMITACIÓN DE ESPECIES EN EL GÉNERO DICHROMANTHUS
(ORCHIDACEAE, SPIRANTHINAE)
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
MIGUEL CASTAÑEDA-ZÁRATE
TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. GERARDO ADOLFO SALAZAR CHÁVEZ
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
COMITÉ TUTOR: DRA. TERESA MARGARITA TERRAZAS SALGADO
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
DR. JUAN FRANCISCO EFRAÍN DE LUNA GARCÍA
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
MÉXICO, D.F. ENERO, 2015
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
SISTEMÁTICA
DELIMITACIÓN DE ESPECIES EN EL GÉNERO DICHROMANTHUS
(ORCHIDACEAE, SPIRANTHINAE)
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
MIGUEL CASTAÑEDA-ZÁRATE
TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. GERARDO ADOLFO SALAZAR CHÁVEZ
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
COMITÉ TUTOR: DRA. TERESA MARGARITA TERRAZAS SALGADO
INSTITUTO DE BIOLOGÍA
DR. JUAN FRANCISCO EFRAÍN DE LUNA GARCÍA
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
MÉXICO, D.F. ENERO, 2015
AGRADECIMIENTOS
Al Posgrado en Ciencias Biológicas y al Instituto de Biología de la Universidad Nacional
Autónoma de México por la oportunidad de realizar los estudios de posgrado en sus
instalaciones y por los apoyos recibidos como parte del Programa de Apoyo a los Estudios
de Posgrado (PAEP).
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por haberme otorgado la beca necesaria para
la realización de los estudios de maestría. Esta beca se registró bajo el número de CVU:
412893.
A los miembros de mi Comité Tutor: Dr. Gerardo Adolfo Salazar Chávez (Instituto de
Biología, UNAM), Dra. Teresa Margarita Terrazas Salgado (Instituto de Biología, UNAM) y
al Dr. Juan Francisco Efraín De Luna García (Instituto de Ecología, A.C.), por las sugerencias
realizadas, a lo largo de la duración de la maestría, para la elaboración y mejora de esta
investigación.
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL
A los miembros del jurado:
Dr. Ángel Salvador Arias Montes (Instituto de Biología, UNAM), Dr. Braulio Edgar Herrera
Cabrera (Colegio de Postgraduados, Campus Puebla), Dra. Julieta Alejandra Rosell García
(Laboratorio Nacional de Ciencias de la Sostenibilidad, UNAM) y Dra. Patricia Dolores
Dávila Aranda (Facultad de Estudio Superiores Iztacala, UNAM), por su apoyo y disposición
para la revisión de este manuscrito, así como por sus comentarios, sugerencias y pláticas
que tuvieron como fin enriquecerlo.
Del Instituto de Biología-UNAM:
A la Dra. Teresa Margarita Terrazas Salgado por todos los consejos y el apoyo brindado
antes de ingresar al posgrado y durante el estudio del mismo.
A María del Rosario García Peña por su ayuda durante la solicitud de ejemplares a los
herbarios extranjeros y por responder a diferentes preguntas relacionadas con el manejo
de dichos ejemplares.
A Angélica Hernández Guerrero por ofrecerme y brindarme siempre su apoyo, sacarme de
apuros y compartir muchos momentos de alegría. Por todas esas pláticas y por esas
noches de películas y series entretenidas.
A mis compañeros del B-201: Ana Gabriela Martínez Becerril, Carolina Granados Mendoza,
Claudia Citlalli Gutiérrez Paredes, Claudia Lizbeth Montealegre Zúñiga, Coyolxauhqui
Figueroa Batalla, Gabriela Micaela Cruz Lustre, Héctor Miguel Huerta Espinoza y Jesús
Ricardo de Santiago Gómez, por sus recomendaciones, respuestas a múltiples dudas, por
los picnis y pláticas divertidas. Tambêm a Aline Do Vale (sensu Aline) pelas tardes de
chupões, o Leonardo Ramos Seixas Guimarães e o Sérgio Akira Adachi, colegas brasileiros
que chegaram para compartilhar seus conhecimentos e criar uma bonita amizade.
A Rosalinda Medina Lemos por su ayuda en la identificación de varios ejemplares de mis
colectadas efectuadas, como pasatiempo, durante los viajes realizados a la zona de
Tehuacán.
A Rocío Verónica González Vázquez por compartir sus conocimientos, inquietudes y por
ayudarme a resolver dudas durante el entretenido proceso de titulación, además por los
agradables momentos de café-chocolate y sobre todo por los frijoles.
A Rocío González Acosta, auxiliar del posgrado, por su amabilidad y enorme calidez. Por
ayudarme con la serie de trámites para diferentes actividades como parte del posgrado.
A Guadalupe Gómez Gen y Verónica González Reyes, secretarias del Departamento de
Botánica, por su amistad y disposición para ayudar.
A Claudia Lizeth Varela Vega por su amistad.
Del Instituto de Ecología-UNAM:
Al Dr. Juan Enrique Fornoni Agnelli por reclutarme desde Xalapa y sobre todo por su
amistad, consejos, consideraciones y por brindarme la oportunidad de colaborar con él.
Asimismo, a la Dra. Karina Boege Paré por permitirme colaborar durante la ejecución del
proyecto de plantas invasoras.
A Blanca Mejía Alva, Fernanda Baena Díaz, Lislie Solis Montero, Luz Palestina Llamas
Guzmán, Nora Villamil Buenrostro, Paula Sosenski Correa, Rubén Pérez Ishiwara, Sofía
Ochoa López, Verónica Cepeda Cornejo, Violeta Méndez Solís y Xóchitl Damián
Domínguez, por su amistad y por compartir momentos divertidos durante mi transitar por
el Laboratorio de Interacción Planta-Animal.
A Sergio Enrique Ramos Castro por ser una gran persona con la cual he pasado momentos
increíbles. Por ser mi orientador, consejero y por motivarme a alcanzar mis objetivos en
miras de ser un buen investigador. Además por los conocimientos transmitidos y por
llevarme de la mano al momento de incursionar en el uso del lenguaje R. En fin, por ser un
amigo-hermano-colaborador…un ser humano sin igual.
Del Herbario AMO:
A Elizabeth Santiago Ayala, Luis Martín Sánchez Saldaña y Rolando Jiménez Machorro por
su ayuda durante la consulta de material bibliográfico y ejemplares de herbario.
A todas las personas que me ayudaron a resolver varias dudas sobre Morfometría
Geométrica:
Dra. Amelia Chemisquy (Instituto de Botánica Darwinion, CONICET), Lic. Anibal Lezcano
(Unidades de Investigación de Biología y manejo de recursos acuáticos, CENPAT), Dr.
Fernando Gaspar Dellatorre (Unidades de Investigación de Biología y manejo de recursos
acuáticos, CENPAT), M. en C. Itzi Fragoso Martínez (Facultad de Ciencias, UNAM), Dr.
Mirsha Quinto-Sánchez (Unidades de Investigación de Biología y Manejo de Recursos
Acuáticos, CENPAT), Dr. Santiago Benitez-Vieyra (Instituto Multidisciplinario de Biología
Vegetal, CONICET), Dr. Santiago Andrés Catalano (Universidad Nacional de Tucumán,
CONICET), Dra. Zioneth Judith García Galeano (Universidade de São Paulo).
De Xalapa:
A Miriam Saray García Zamora y a Lorena Zamora Quiñones por su amistad, calidez y
consejos. También por recibirme en su casa durante mis visitas al INECOL.
Del Centro de Enseñanza de Lenguas Extranjeras-UNAM:
A Leidy Aleen Erazo Ñañez, César Eduardo Gómez Cañedo, María Angélica Ruíz Salazar,
Melisa Itzel Fabián Ríos y Karla Fernanda Aguirre Reyes, por su amistad y por compartir
momentos divertidos mayormente durante las clases de portugués.
Del Ballet Folklórico-UNAM:
Abimael Ávila Torres, Alejandra Fabiola Rodríguez Sáyago, Agueda Abigail Domínguez
Mateos, Ana Victoria Ramos Ruiseco, Alma Rosa Talavera Gómez, Bencar Valentín
Guerrero, Beatriz De Luna Lozano, Carolina Sánchez Ríos, David Ricardo Rangel Géniz,
Diana Laura Osnaya González, DianaPáramo Monjaras, Diana Yomalli Álvarez Esquivel,
Enrique Ávila Torres, Héctor Gabriel García Mendoza, Jorge Alberto Martínez Reyna, Karla
Guadalupe Márquez Gómez, Katia Xochipilzihuitl Garibay Zurita, Leonardo Zaid Martínez
Quintero, Laura Lizbeth Lucio Leandro, María de Guadalupe Sánchez Estrada, Mariana
Llamas Hernández, Mercedes Fragoso Martínez, Mónica Marina Gómez Melgarejo, Norma
Martínez Mendoza, Sixto Sergio Guadarrama Landero y Tiaret Espino Hernández, a todos
ellos por compartir conmigo su gusto, amor y pasión por el folklor mexicano.
A los amigos que hice durante las clases del posgrado:
Amaranta Ramírez Terrazo, Andrés Ramírez Ponce, Elkin Alexi Noguera Urbano, Geovanni
Rodríguez Mirón, Griselda García Rivera, Carolina Guadalupe Piña Páez, Laura Alexandra
Rengifo Correa, Leydis Murillo Ramos y Sara López Pérez.
A los amigos que por casualidades de la vida logré conocer y crear una bonita amistad:
Adriana Benítez Villaseñor, Ángel Gabriel Becerra Vázquez, Claudia Guillermina Moreno
Mejía, Cristóbal Sánchez Sánchez, Edgard Amacosta Velasco, Erika Rosalba Olmedo
Vicente, Eva María Piedra Malagón, Concepción Faviola Llamas Guzmán, Humberto Peraza
Villarreal, Ilse Alejandra Carmona Reyes, Julieta Álvarez Manjarrez, Nidia Vargas Martínez,
Silvia Guadalupe Zumaya Mendoza, Víctor José Trejo Meléndez y Yareli Joselin Cadena
Rodríguez.
En fin, a todas las personas y amistades que antes, durante y después de la maestría he
logrado conocer y han hecho amena mi estancia en el Distrito Federal.
DEDICATORIA
A mis padres Gerardo Castañeda Romero y Marilú Patricia Zárate Castillo, porque de ellos
siempre he recibido amor, comprensión y apoyo.
A mis hermanos Gerardo Ángel, Jairo y Marilú, por su amistad y confianza.
Aunque no existe una forma precisa de agradecerles una vida de lucha, sacrificio y
esfuerzos constantes, mi esfuerzo es inspirado en ustedes. Espero que este logro,
NUESTRO logro, los motive y continúen alcanzando sus sueños.
‘‘Only a thorough-going study of variation will lighten our darkness’’
Haldane, 1932.
“Phenotypic variation is the raw material for natural selection,
yet a century after Darwin, it is an almost unknown subject”
Leigh Van Valen, 1974.
"The fundamental observation of biology is morphology.
Morphological data form the basis of virtually all systematics descriptions”
MacLeod, 2002.
ÍNDICE
Resumen.......................................................................................................................................... 1
Abstract ........................................................................................................................................... 2
I. Introducción ................................................................................................................................. 3
II. Objetivos ..................................................................................................................................... 7
III. Antecedentes ............................................................................................................................. 8
3.1 Reseña histórica del género Dichromanthus Garay, 1982................................................ 8
3.2 Morfometría ................................................................................................................... 9
3.3 Morfometría tradicional..................................................................................................10
3.4 Morfometría geométrica ................................................................................................10
3.5 Estudios morfométricos en la familia Orchidaceae..........................................................12
IV. Metodología...............................................................................................................................15
4.1 Selección del material de estudio....................................................................................14
4.1.1 Ejemplares de herbario.....................................................................................14
4.1.2 Ejemplares frescos............................................................................................17
4.2 Recolección y preparación del material de estudio .........................................................18
4.3 Digitalización del material ...............................................................................................19
4.4 Registro de coordenadas.................................................................................................20
4.5 Morfometría geométrica ................................................................................................22
4.6 Morfometría tradicional..................................................................................................22
4.7 Análisis estadístico..........................................................................................................24
4.7.1 Morfometría geométrica ..................................................................................24
a) Análisis de Componentes Principales .........................................................24
b) Diferenciación de formas (Análisis de Variables Canónicas) .......................25
c) Análisis del tamaño ....................................................................................25
4.7.2 Morfometría tradicional ...................................................................................26
4.8 Reconstrucción filogenética.................................................................................27
a) Filogenia morfométrica ..............................................................................27
b) Filogenia molecular....................................................................................28
c) Filogenia combinada ................................................................................. 29
V. Resultados...................................................................................................................................31
5.1 Morfometría geométrica de los rasgos florales de ejemplares de herbario .....................31
a) Análisis de la forma ....................................................................................31
b) Análisis del tamaño....................................................................................38
5.2 Morfometría geométrica de los rasgos florales de ejemplares frescos ............................42
a) Análisis de la forma ....................................................................................42
b) Análisis del tamaño....................................................................................46
5.3 Morfometría tradicional de los rasgos florales de ejemplares de herbario ......................50
5.4 Morfometría tradicional de los rasgos florales de ejemplares frescos .............................53
5.5 Comparación de tratamientos.........................................................................................55
a) Ejemplares de herbario ..............................................................................56
b) Ejemplares frescos .....................................................................................58
c) Ejemplares frescos vs. Ejemplares de herbario ...........................................58
5.6 Variación de caracteres cualitativos ................................................................................60
5.7 Análisis filogenéticos.......................................................................................................64
5.8 Mapeo de caracteres sobre el árbol más parsimonioso...................................................65
VI. Discusión ....................................................................................................................................69
6.1 Morfometría geométrica: Variación en la forma y tamaño..............................................696.2 Morfometría tradicional..................................................................................................73
6.3 Cuantificación de la variación en la forma y tamaño .......................................................75
6.4 Variación en atributos cualitativos ..................................................................................77
6.5 La morfometría, una herramienta en taxonomía.............................................................79
6.6 Filogenia .........................................................................................................................81
VII. Conclusiones .............................................................................................................................83
VIII. Literatura Citada ......................................................................................................................84
IX. Anexo .........................................................................................................................................95
LISTA DE CUADROS
No. Cuadro Pág.
1 Relación de morfoespecies integradas de acuerdo a las propuestas de Salazar et al.
(2011) y Szlachetko et al. (2005) con número de muestras de ejemplares de herbario.
17
2 Especies, localidades y número de ejemplares frescos incluidos en el estudio. 18
3 Longitudes generadas sobre las configuraciones a partir de las marcas y semimarcas. 24
4 Número de acceso de las secuencias obtenidas de GenBank. 29
5 Eventos de inserción-deleción. 29
6 Eigenvalores de los primeros cinco componentes principales y la varianza explicada. 32
7 Parámetros de las tres variables canónicas generadas. 34
8 Matriz de clasificación correcta generada partir del análisis de variables canónicas. 35
9 Eigenvalores de los primeros cinco componentes principales y la varianza explicada. 45
10 Parámetros de las tres variables canónicas generadas. 46
11 Matriz de clasificación correcta generada partir del análisis de variables canónicas. 46
12 Análisis discriminante entre los ejemplares de las morfoespecies consideradas con base
en caracteres morfométricos.
51
13 Matriz de clasificación correcta generada a partir del análisis clasificatorio
discriminante para los ocho taxa considerados.
53
14 Distancias de Mahalanobis entre los centroides que mostraron diferencias
estadísticamente significativas.
53
15 Análisis discriminante entre los ejemplares de los taxa considerados con base en
caracteres morfométricos.
54
16 Matriz de clasificación correcta generada a partir del análisis clasificatorio
discriminante.
55
17 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el análisis
canónico discriminante (CDA) en ejemplares de herbario.
57
18 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el CDA
sobre los grupos definidos a partir de ejemplares de herbario.
57
19 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el análisis
canónico discriminante en ejemplares frescos.
58
20 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el CDA
para Dichromanthus aurantiacus.
59
21 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el CDA
para Dichromanthus cinnabarinus.
59
22 Diferencias significativas para siete caracteres cuantitativos identificados en el CDA
para Dichromanthus michuacanus
60
23 Resumen de los estadísticos descriptivos para los caracteres morfológicos cuantitativos
de Dichromanthus aurantiacus y D. cinnabarinus y D. michuacanus
61
24 Comparación de características entre las especies de Dichromanthus a partir de
ejemplares de herbario.
62
25 Comparación de características entre las poblaciones de Dichromanthus estudiadas. 63
26 Características de las filogenias generadas con las diferentes fuentes de datos. 67
LISTA DE FIGURAS
No. Figura Pág.
1 Inflorescencias de las especies de Dichromanthus y su género hermano Deiregyne. 6
2 Bráctea floral y flor de Dichromanthus aurantiacus disectadas, ejemplificando los
elementos analizados.
19
3 Ubicación de las marcas y semimarcas registradas para recuperar la forma en las
estructuras consideradas.
23
4 Distancias generadas a partir de las marcas y semimarcas registradas. 24
5 Proyección de los ejemplares en el plano de los dos primeros componentes principales. 33
6 Proyección en el plano definido por las variables canónicas 1 y 2 de los ejemplares de
herbarioanalizados.
36
7 Cambios en la forma representados por la primera y segunda variable canónica con
respecto a la forma consenso.
37
8 Forma promedio de las estructuras de las especies que mostraron diferencias. 38
9 Gráfica de cajas y alambres en donde se muestra la variabilidad existente en el tamaño
del centroide de las cinco estructuras de las morfoespecies evaluadas.
41
10 Proyección de los ejemplares de las poblaciones de Dichromanthus en el plano de los
dos primeros componentes principales.
44
11 Proyección en el plano definido por las variables canónicas 1 y 2 de los ejemplares
frescos analizados.
47
12 Cambios en la forma representados por la primera y segunda variable canónica con
respecto a la forma consenso.
48
13 Gráfica de cajas y alambres en donde se muestra la variabilidad existente en el tamaño
del centroide de las cinco estructuras en las morfoespecies evaluadas.
49
14 Análisis Canónico Discriminante de las ocho morfoespecies incluidas en el análisis
morfométrico.
52
15 Análisis Canónico Discriminante de las cuatro poblaciones de Dichromanthus incluidas
en el análisis morfométrico.
55
16 Hipótesis filogenéticas generadas a partir del análisis de la forma y el tamaño. 64
17 Árbol más parsimonioso derivado del análisis de las regiones ITS y trnL-trnF. 65
18 Árbol más parsimonioso derivado del análisis combinado de datos morfométricos,
morfológicos y moleculares.
65
19 Optimización de la configuración de las estructuras sobre el árbol del análisis
combinado.
68
1
RESUMEN
El género Dichromanthus, subtribu Spiranthinae (Orchidaceae) está ampliamente
distribuido y presenta una gran variación morfológica. Esto ha originado problemas en el
reconocimiento y delimitación de sus especies. En el presente trabajo se evaluaron y
compararon diversas características morfológicas de la bráctea floral y cinco estructuras
florales (ovario, sépalo dorsal, sépalo lateral, pétalo y labelo) en ejemplares de herbario y
ejemplares frescos usando morfometría tradicional y geométrica para identificar las
especies que integran el género. El análisis con morfometría tradicional y geométrica
permitió diferenciar tres especies: D. aurantiacus, D. cinnabarinus y D. michuacanus. El
análisis de la forma de las cinco estructuras reveló diferencias estadísticamente
significativas entre las especies. El análisis del tamaño geométrico identificó diferencias
significativas pero sólo entre pares de especies. Mediante morfometría tradicional se
encontraron siete atributos que expresan diferencias significativas principalmente para la
bráctea floral y el sépalo lateral. Una vez seleccionados los caracteres útiles para
identificar las especies, se analizaron por separado y en conjunto con secuencias de ADN
para postular hipótesis filogenéticas a través de análisis de máxima parsimonia. El análisis
combinado arrojó un solo árbol (L = 108.482; IC = 0.97; IR = 0.80), en el que D.
cinnabarinus, especie tipo, divergió primero.
Palabras clave: Dichromanthus, filogenia, flores, morfometría geométrica, morfometría
tradicional, Orchidaceae, sistemática.
2
ABSTRACT
The genus Dichromanthus, subtribe Spiranthinae (Orchidaceae) is widespread and
exhibits a remarkable morphological variation. This fact has made difficult the recognition
of the species and its delimitation. In this work, a set of morphological traits such as the
floral bract, ovary, dorsal sepal, lateral sepal, petal and lip from herbarium and fresh
material were evaluated and compared using traditionaland geometric morphometrics in
order to delimity the species belonging to genus Dichromanthus. Using both techniques,
the analyses identified three species: D. aurantiacus, D. cinnabarinus and D. michuacanus.
In addition, shape analysis using geometric morphometrics showed statistical differences
among the species. Centroid size analyses showed statistical differences, but only among
pairs of species. In addition, by means of traditional morphometrics, seven characteristics
related to floral bract and lateral sepal were found to be statistically different. After the
useful characters for identifying the species were selected, these were individually
analyzed and in combination with DNA sequences to postulate phylogenetic hypothesis by
maximum parsimony. The combined phylogenetic analysis resulted in only one most
parsimonious tree (L= 108.482; IC= 0.97; IR= 0.80), in which D. cinnabarinus first diverged.
Key words: Dichromanthus, floral traits, geometric morphometrics Orchidaceae,
phylogeny, systematics, traditional morphometrics.
3
I. INTRODUCCIÓN
Incluida en la familia Orchidaceae, la subtribu Spiranthinae (subfamilia Orchidoideae) tiene
aproximadamente 40 géneros que se distribuyen exclusivamente en los Neotrópicos, excepto por el
género Spiranthes, el cual es cosmopolita (Salazar, 2003). Los miembros de Spiranthinae son
generalmente terrestres o litofíticos, pero algunos crecen como epífitos. La subtribu difiere de otras
fundamentalmente por presentar plantas que poseen raíces fasciculadas, flores resupinadas y labelo
adherente a los lados de la columna, con glándulas nectaríferas cerca de la base (Salazar, 2003).
A nivel genérico, las orquídeas de ésta y otras subtribus han sido delimitadas principalmente a
partir de caracteres florales y particularmente con base en el rostelo, que es la parte modificada no
receptiva del ápice del carpelo medio, una porción de la cual se desarrolla el viscidio (Dressler, 1993).
Desafortunadamente, el uso de esta estructura que aporta información limitada para clasificar más de
400 especies que conforman esta subtribu (Salazar, 2003), ha originado una serie de propuestas que
difieren notablemente entre sí (Balogh, 1982; McVaugh, 1985, Rutkowski et al., 2008; Szlachetko,
1995; Szlachetko et al., 2005).
Dentro del conjunto de géneros que conforman la subtribu Spiranthinae, el género
Dichromanthus que se distribuye en el sur de los Estados Unidos, México, Guatemala, El Salvador y
Honduras, presenta plantas terrestres que se caracterizan por sus inflorescencias en racimo,
generalmente glabras en la parte inferior y pubescentes en la parte superior, cuyas flores se
encuentran parcialmente protegidas por brácteas florales prominentes densamente glandular-
pubescentes (Salazar, 2003).
Hasta hace poco, Dichromanthus representaba uno de los géneros de Spiranthinae no bien
definido en su taxonomía y por ello su delimitación presentó dificultades y propició el surgimiento de
diferentes propuestas taxonómicas y nombres aplicados a sus especies. Algunas de estas propuestas
las incluían en géneros como Gyrostachys, Schiedeella, Spiranthes y Stenorrhynchos entre otros. Sin
embargo, Salazar y colaboradores (2011), desarrollaron un estudio para probar la monofilia de
Dichromanthus en sentido amplio y Stenorrhynchos en sentido estricto, a fin de entender mejor las
relaciones entre ellos. En este estudio se incluyeron 40 especies de la subtribu Spiranthinae, entre
ellas las cuatro del género Dichromanthus reconocidas por dichos autores. A partir de las similitudes
vegetativas, reproductivas y genéticas ellos concluyeron que el género es monofilético y ocupa una
4
posición dentro del clado Spiranthes y que tiene a Deiregyne como grupo hermano. Lo anterior
contrasta con las propuestas previas que consideraban a Dichromanthus como monotípico
(Szlachetko, 2005; Rutkowski et al., 2008). También a partir de este trabajo, se encontró que la
delimitación tradicional de Stenorrhynchos resulta ser polifilética y que el género presenta una
posición basal, mientras que Dichromanthus ocupa una posición derivada.
Dichromanthus s.l. se caracteriza también por presentar una posible sinapomorfía morfológica
consistente en un nectario formado por un canal estrecho en la base del labelo, con una glándula
nectarífera intramarginal irregularmente engrosada localizada a cada lado (Salazar et al., 2003, 2011).
Asimismo, las especies que lo integran tienen flores tubulares, horizontales o ligeramente
descendentes, con los pétalos adherentes a los tres sépalos que además tienen contacto con el labelo
en su base. Las flores son de color blanco a amarillo limón con venas verde oscuro, rojo con
anaranjado y anaranjado-amarillo (Salazar, 2003).
En contraste con el límite genérico así establecido, no son claros los límites entre las especies
que lo constituyen. En la actualidad se cuenta con dos propuestas contrastantes de Dichromanthus.
La primera es apoyada por Szlachetko (1994), Szlachetko et al. (2005) y Rutkowski et al. (2008), en la
cual se mantiene al género como monoespecífico e incluye a las demás especies dentro de
Stenorrhynchos. La segunda fue hecha por Salazar (2003), Salazar & García-Mendoza (2009) y Salazar
et al. (2002), y adopta un concepto más amplio. Los simpatizantes de la primera propuesta, a partir de
las diferencias en las longitudes de las estructuras florales, consideran a “Stenorrhynchos” aurantiacus
(Lex.) Lindl. y a “S.” pubens (Rich. & Gal.) Schltr. dentro de lo que Salazar et al. (2011) consideran
como Dichromanthus aurantiacus (Lex.) Salazar & Soto Arenas. Por otra parte, en la primera
propuesta se aceptan y distinguen a “Stenorrhynchos” michuacanum (Lex.) Lindl., “S.” vexillaris
(Szlach.) Szlach., Rutk. & Mytnik y “S.” xoxonitla S. Rosillo de V. ex. Szlach., Rutk. & Mytnik, basándose
en las diferencias en observadas en las longitudes del hipoquilo y epiquilo que son dos porciones en
las que se puede dividir el labelo y en la pubescencia de las brácteas florales, principalmente. En
cambio otros, incluyen estos tres taxa como Dichromanthus michuacanus (Lex.) Salazar & Soto Arenas
(Figueroa et al., 2012; Salazar, 2003; Salazar et al., 2003, 2011). El hallazgo reciente de D. yucundaa
Salazar & García-Mend. (Salazar & García-Mendoza, 2009), agrega un nuevo taxon como parte del
género (Figura 1). En ambas clasificaciones se respeta la especie tipo Dichromanthus cinnabarinus,
pero Salazar et al. (2011) además distinguen las dos subespecies que Soto (2002) reconoció a partir de
5
las diferencias en el tamaño de las plantas, inflorescencias y flores. Estas subespecies son D.
cinnabarinus (Lex.) Garay subsp. cinnabarinus y D. cinnabarinus (Lex.) Garay subsp. galeottianum
(Schltr.) Soto Arenas & Salazar.
Las clasificaciones antes mencionadas, indican discrepancias que lejos de facilitar la
identificación de las especies complican el reconocimiento de las mismas. Si bien es cierto que las
descripciones originales de estos taxa se basaron en una evaluación visual, también es cierto que en
ningún caso se pusieron a prueba estadísticamente dichas diferencias y similitudes morfológicas, por
lo que los límites propuestos entre cada especie no permiten su clara identificación.
La morfometría y los métodos estadísticos multivariados, de acuerdo a Pinheiro & de Barros
(2007) , han sido aplicados previamente dentro de la familia Orchidaceae, para delimitar especies,
reconocer el origen híbrido de algunos taxa y han permitido evaluar la variabilidad morfológica en
poblaciones o combinar estos diferentes objetivos. Los métodos multivariados con frecuencia hacen
posible el reconocimiento de importantes discontinuidades morfológicas y mejoran la selección de
caracteres diagnósticos que son de mucha utilidad en taxonomía para la delimitación de los taxa y el
entendimiento de sus relaciones filogenéticas (Chiron et al., 2010).
Este estudio investiga las diferencias entre las especies del género Dichromanthusmediante
morfometría tradicional o clásica, conocida también como morfometría de distancias euclidianas y
morfometría geométrica, así como mediante análisis multivariados aplicados a las estructuras
florales. Se consideró la evaluación de caracteres florales debido a que en las claves de identificación,
son las flores los elementos principalmente empleados para distinguir los taxa. Además, existen
evidencias de que las características florales son menos variables que las vegetativas (p. ej.: Rosas-
Guerrero et al., 2010; Pélabon et al., 2011, Pélabon et al., 2013). A partir de esto, se espera poder
comprender mejor la identidad taxonómica de las especies y así contribuir a aclarar el número de
especies que integran al género Dichromanthus.
6
Figura 1. Inflorescencias de las especies de Dichromanthus y su género hermano Deiregyne. A)
Dichromanthus aurantiacus (Castañeda-Zárate & Ramos-Castro 561). B) Dichromanthus cinnabarinus
(Castañeda-Zárate 722). C) Dichromanthus michuacanus (Castañeda-Zárate & Ramos-Castro 705). D)
Dichromanthus yucundaa (García-Mendoza & Franco 8744). E) Deiregyne eriophora (Salazar et al.
8183). F) Flor tubular de Dichromanthus cinnabarinus (Castañeda-Zárate 722). G) Flor disectada de
Dichromanthus cinnabarinus en donde se aprecian: 1) bráctea floral, 2) sépalo dorsal, 3) sépalos
laterales, 4) pétalos y 5) labelo (Castañeda-Zárate 722). Escalas, 2 cm (A-C); 1 cm (D, E, G); 5 mm (F).
Fotografías D y E de G. Salazar.
7
II. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
• Delimitar las especies del género Dichromanthus, utilizando métodos cuantitativos y
repetibles, a partir del uso de morfometría tradicional y geométrica.
OBJETIVOS PARTICULARES
• Describir la variación morfológica floral de las especies del género Dichromanthus, usando
caracteres cuantitativos mediante morfometría tradicional y geométrica.
• Identificar caracteres cuantitativos (métricos) que puedan ser utilizados para diferenciar las
especies del género Dichromanthus, mediante análisis multivariados.
• Explorar el potencial de los caracteres morfométricos para la reconstrucción filogenética en el
género Dichromanthus, mediante su inclusión en análisis cladísticos.
8
III. ANTECEDENTES
3.1 Reseña histórica del género Dichromanthus Garay, 1982
Juan Martínez de Lexarza, en su Orchidianum Opusculum (1824) dentro de la obra “Novorum
Vegetabilium Descriptiones” realizada en colaboración con Pablo de La Llave, describió 50 especies de
orquídeas, la mayoría procedentes de los alrededores de Morelia, Michoacán (antes Valladolid). El
material tipo que respaldaba estas descripciones está perdido, por lo que la identificación de dichas
especies, así como su situación nomenclatural han sido problemáticas. A pesar de lo anterior, el
estatus de gran parte de estos taxa ha sido aclarado e incluso en varios casos se han designado
neotipos (López-Ferrari & Espejo, 2000).
Entre las especies descritas en esta obra figuran Neottia aurantiaca Lex., N. cinnabarina Lex. y
N. michuacana Lex., las cuales fueron transferidas a géneros como Gyrostachys, Schiedeella,
Spiranthes y finalmente mantenidas en Stenorrhynchos. De las especies antes mencionadas resulta
relevante N. cinnabarina, ya que Garay (1982) realizó la revisión de la subtribu Spiranthinae e
identificó en esta especie ciertas características que fueron clave para proponer un género diferente a
Stenorrhynchos.
Textualmente Garay (1982) indicó: “Stenorrhynchos cinnabarinus, planta mexicana común, es
otro caso de observaciones erróneas. El género Stenorrhynchos siempre se ha caracterizado por su
rostelo rígido terminado en punta. Sin embargo, S. cinnabarinus presenta un remanente rostelar
suave, flexible, linear-oblongo y truncado. Este carácter particular, junto con otros criterios asociados,
indican que S. cinnabarinus es completamente distinto de Stenorrhynchos”. Por lo anterior, Garay
creó el género Dichromanthus, que de acuerdo a su etimología significa “flores con dos colores” (di=
dos, chroma= color y anthos= flor), debido a que éstas presentan coloraciones rojas y amarillas.
Existe otro nombre publicado aplicable a este género, Cutsis, que se deriva de la palabra
vernácula “Cutsis” y que fue propuesto paralelamente a Dichromanthus, por Balogh, Greenwood y
González (Balogh & Greenwood, 1982). Sin embargo, el nombre dado por Garay tiene prioridad, ya
que fue publicado un mes antes. Las características distintivas más notables del género son sus
grandes hojas acintadas presentes durante la floración, el racimo denso con flores de dos distintos
tonos, anaranjado y amarillo, la antera sagitada, el largo remanente del rostelo, obtuso en la punta
9
con una cavidad o bolsa y un polinario linear-oblongo, con un viscidio originado en una bolsa en el
ápice del rostelo (Burns-Balogh, 1986).
La validez y los límites genéricos y específicos de los “cutsis” han sido debatidos por diversos
autores durante cerca de 200 años. En la actualidad permanece cierta confusión y por ello se ha
propuesto la existencia de especies distintas de Dichromanthus. Por lo anterior, se ha recomendado
realizar trabajos para esclarecer el estatus taxonómico de las especies propuestas, las cuales muchas
veces presentan diferencias que no son constantes (Szlachetko et al., 2005). De manera general, las
descripciones de especies se realizan a partir de características morfológicas únicamente, lo cual no
representa inconveniente alguno cuando las entidades poseen características cualitativas que
permiten establecer claramente su distinción. Sin embargo, muchos de estos trabajos taxonómicos y
comparaciones entre especies están basados en la evaluación visual subjetiva de similitudes y
diferencias entre los taxa (Mutanen & Pretorius, 2007).
Si bien, en el caso de Dichromanthus existe variación en las estructuras florales y vegetativas
entre las especies propuestas, quienes las han identificado no han empleado métodos objetivos que
permitan reconocerlas de manera eficiente. Por fortuna existen métodos numéricos que resultan ser
una herramienta útil en los estudios de taxonomía, principalmente para evaluar la variación
morfológica (Volkova & Shipunov, 2007; De Luna & Gómez-Velasco, 2008; Kaplan & Marhold, 2012;
Slovák, 2012). La ventaja de estos métodos es la forma objetiva de tratar los datos, sobre todo sí
muchas variables están involucradas (Manly, 1994).
3.2 Morfometría
Tanto la clasificación taxonómica de los organismos como la comprensión de la diversidad
biológica estuvieron basadas históricamente en la descripción de la morfología (Jensen, 2003). Sin
embargo, a principios del siglo XX, la biología experimentó una transición desde un campo
meramente descriptivo, en el que se consideraban principalmente caracteres cualitativos, hacia otro
más cuantitativo. Igualmente el análisis de las formas biológicas sufrió una tendencia hacia la
cuantificación en que su descripción se basa en variables definidas matemáticamente. A partir de
entonces, los estudios morfológicos incluyeron datos cuantitativos para una o más variables medibles,
que eran comparados entre grupos, pero el posterior desarrollo de métodos estadísticos aumentó la
10
eficacia de los métodos cuantitativos. A mediados del siglo XX la descripción cuantitativa de las
formas se combinó con los análisis estadísticos que describían patrones de variación de la forma,
entre y dentro de los grupos, con lo cual nació un nuevo campo en la morfometría (Adams et al.,
2004). La cual puede definirse como el estudio cuantitativo de los patrones de covarianza de las
formas biológicas con respecto a las forma. Ha sido usada ampliamente en diversas disciplinas
(Bookstein, 1991), como la sistemática. El campo se ha desarrollado rápidamente en los últimos
veinte años, hasta el punto en que ahora se hace la distinción entre la morfometría tradicional y la
geométrica.
3.3 Morfometría tradicional
A partir de su surgimiento, las técnicas de morfometría tradicional, basadas en la aplicación demétodos estadísticos multivariados sobre un conjunto de variables lineales (Rohlf & Marcus, 1993),
han sido empleadas en gran número de trabajos biométricos con la finalidad de entender la
taxonomía e historia de vida en plantas (p. ej.: Kazandjian, 2011; Ruíz et al., 2010; Sosa et al., 2012) y
animales (p. ej.: Marugán-Lobón et al., 2011; Pérez, 2003).
El observar formas y registrar mediciones fue un esfuerzo para entender cómo las formas
biológicas varían de una a otra, para establecer la correspondencia entre la forma y su función, así
como para cuantificar la descripción de las características usadas en la identificación de las especies
(Richtsmeier et al., 2002). En este sentido, la morfometría tradicional mide tamaño y forma que son
combinados en un número y cada longitud es la magnitud de una dimensión, una medida de tamaño.
Aunque los datos incluyen información acerca de la forma, ésta está contenida en las longitudes, por
lo que es difícil separar información sobre la forma a partir del tamaño (Zelditch et al., 2004).
3.4 Morfometría geométrica
Definida como la fusión de la geometría y la biología (Bookstein, 1982), la morfometría
geométrica se ocupa del estudio de la forma y el tamaño algebraicamente separados en dos juegos de
variables numéricas. Su mayor diferencia respecto de los métodos clásicos es la capacidad de analizar
la forma de un objeto directamente, como un todo cohesivo, y no como una serie de mediciones
11
fragmentadas (Zelditch et al., 2004). La forma es concebida como los atributos de una configuración
de coordenadas que resultan invariantes con respecto a los efectos de traslación, rotación y escala
geométrica (Rohlf, 2000). Así, las variables morfométricas permiten la reconstrucción completa de la
forma por separado de las variables que describen el tamaño (Zelditch et al., 2004).
La morfometría geométrica capta la mayor cantidad posible de información biológica en un
menor número de variables tomadas sobre la estructura anatómica que se va a estudiar, lo cual
resulta en un mayor poder estadístico para evaluar visual y analíticamente las diferencias de
conformación de las estructuras biológicas (Rohlf & Marcus, 1993). La vía para capturar el tamaño y la
forma de los objetos se logra mediante el uso de puntos morfométricos o landmarks (Webster &
Sheets, 2010).
De acuerdo a Lawing & Polly (2009), en muchas investigaciones biológicas las preguntas a
responder conciernen a la forma. Tales preguntas son dirigidas y respondidas con ayuda de pruebas
estadísticas, las cuales a menudo requieren una representación cuantitativa del fenotipo que captura
los atributos funcionales, genéticos o del desarrollo y que son biológicamente importantes para la
hipótesis que se va a probar. Hay muchas aplicaciones taxonómicas de los métodos de morfometría
geométrica, como son la identificación de especies crípticas y la asignación de individuos de identidad
desconocida a su grupo o especie más probable. Sin embargo, la mayoría de ellos hasta el día de hoy
han sido empleados con propósitos zoológicos o paleontológicos, mayormente enfocados a insectos
(p. ej.: Gumiel et al., 2003; Matias et al., 2001; Páez-Colasante & Aldana, 2008; Soto-Vivas et al., 2011;
Villegas et al., 2002), peces (p. ej.: Pardo et al., 2005; Whitenack & Gottfried, 2010) y mamíferos (p.
ej.: Evin et al., 2008; Pérez, 2003). Por lo cual, hay muchos grupos que seguramente requieren
tratamientos taxonómicos que utilicen la morfometría geométrica (Shipunov & Bateman, 2005), como
en el caso de las plantas.
Aunque existen trabajos en donde se ha evaluado la forma de las semillas (Burger et al., 2011),
flores (Savriama et al., 2012; Strelin et al., 2013; van der Niet, 2010) y hojas (p. ej.: Albarrán-Lara et
al., 2010; Jensen, 1990; Jensen et al., 1993; Peñaloza-Ramírez et al., 2010; Souza et al., 2012; Viscosi &
Cardini, 2011), se considera que la morfometría geométrica es un método prometedor debido a que
muchas características botánicas de importancia taxonómica se ajustan y podrían ser resueltas con
alguno de sus métodos. Sin embargo, aún son escasos los estudios realizados bajo este enfoque.
12
3.5 Estudios morfométricos en la familia Orchidaceae
Dada la gran diversidad de formas, así como las diferentes interacciones que presentan los
integrantes de la familia Orchidaceae, la morfometría ha sido un importante auxiliar para explorar,
comprender el desarrollo, diferenciación poblacional y sistemática del grupo. De hecho, existen varios
trabajos en que se han empleado de manera conjunta la morfometría y los análisis multivariados para
responder preguntas que consideran forma y tamaño, y que tienen implicaciones ecológicas y
taxonómicas, principalmente.
En cuanto a morfometría tradicional se refiere, Peakall et al. (1997) realizaron un análisis
morfométrico y genético a poblaciones de Chiloglottis trapeziformis, C. valida y al supuesto híbrido
entre ambas (Chiloglottis × pescottiana). Basándose en siete características vegetativas y florales
lograron confirmar el origen híbrido pues los análisis multivariados permitieron distinguir los tres
taxa, resultado que coincidió con el estudio genético desarrollado posteriormente.
También han sido identificadas especies nuevas a partir del análisis morfométrico de
estructuras vegetativas y florales. Tal es el caso de Palestina & Sosa (2002), quienes al estudiar la
variación morfológica de Bletia purpurea a lo largo de su distribución geográfica, lograron identificar
una nueva especie, Bletia riparia, mediante análisis univariados y multivariados de caracteres
cuantitativos y cualitativos.
Con el fin de identificar los caracteres que permitieran distinguir diferentes grupos y poder así
examinar su circunscripción, Goldman et al. (2004), llevaron a cabo un análisis morfométrico de dos
diferentes subconjuntos de Calopogon, uno que consideró todas las especies reconocidas como parte
del género y otro únicamente con C. tuberosus. Este estudio se basó en el análisis multivariado de
cuarenta variables florales y vegetativas en plantas vivas. Se encontró que C. barbatus, C. multiflorus,
C. oklahomensis y C. pallidus deben mantenerse como especies independientes, pero que en el caso
de C. tuberosus, el reconocimiento de las variedades latifolius y tuberosus no presenta ningún
fundamento, pues la variación observada se explica por la amplia distribución que presenta la
especie.
Ponsie et al. (2009) estudiaron el complejo Bonatea speciosa con la finalidad de determinar si
B. antennifera, B. boltonii y B. speciosa contaban con los caracteres diagnósticos para sugerirlas como
especies diferentes o si debían ser consideradas variantes de B. speciosa. La variación morfológica en
13
los catorce caracteres medidos fue explorada con ayuda de análisis de componentes principales y
análisis de conglomerados, para así identificar caracteres que pudieran ser utilizados para distinguir
entre especies. Esto permitió reconocer tres especies distintas en lugar de una sola entidad.
Con el objetivo de investigar la variación morfológica en flores de Laelia anceps susbp.
dawsonii f. chilapensis, Salazar-Rojas et al. (2010), realizaron un estudio comparativo del labelo de
ejemplares cultivados en jardines caseros en Chilapa, Guerrero. El estudio de esta estructura se
fundamentó en que las estructuras reproductivas son menos susceptibles a la variación por efectos
ambientales. Se concluyó que el uso de características morfométricas del labelo es útil pues permitió
reconocer cuatro morfotipos mediante el uso de análisis multivariados.
Shipunov & Bateman (2005), al emplear técnicas morfométicas para evaluar la diversidad en la
forma del labelo en flores de Dactylorhiza, encontraron concordancia significativa entre los resultados
de morfometría geométrica y morfometría tradicional, así como con la distribución de ciertos
marcadores moleculares de ADN nucleares. La forma del labelo de ciertos ejemplares de Rusia
Central, queocupan una posición intermedia entre D. maculata y D. fuchsii, apoyó el origen híbrido
de las Dactylorhiza tetraploides del noroeste de Eurasia.
Chemisquy et al. (2009), consideraron la utilidad de los caracteres presentes en las semillas de
orquídeas para clasificar y proponer filogenias a nivel supragenérico, estudiaron la morfología de las
semillas de varias especies de la tribu Chloraeeae mediante técnicas de morfometría tradicional y con
herramientas de morfometría geométrica. Lo anterior permitió encontrar que sólo ciertos grupos
eran discriminados mediante el uso de la forma; sin embargo, el tamaño de la semilla, expresada
como tamaño del centroide resultó ser un carácter variable e informativo a nivel filogenético.
Para reconocer la variación en el tamaño y la forma de las especies que constituyen el género
Mokara, el cual posee una notoria importancia económica, Dalayap et al. (2011) evaluaron las
características cuantitativas y cualitativas de las estructuras florales en plantas vivas. Así describieron
la variación de las estructuras y reconocieron cuatro variedades a partir de análisis de Fourier.
Un estudio de índole ecológico con Geoblasta pennicillata, orquídea sudamericana polinizada
por pseudocopulación por machos de la avispa Campsomeris bistrimacula, tuvo por objetivo
establecer si el labelo es objeto de selección natural mediado por la preferencia del polinizador
(Benitez-Vieyra, 2009). Se encontró que las plantas que mostraban labelos más similares a la hembra
14
del polinizador no resultaron favorecidas, sino que la imitación exacta no es necesaria para atraer al
polinizador.
Un estudio reciente en el que se emplearon técnicas de morfometría tradicional y geométrica,
tuvo por objetivo evaluar si las diferencias interespecíficas en la forma del labelo de cuatro especies
de Cryptostylis influencian el éxito en el proceso de polinización. Este género es polinizado por los
machos de la avispa Lissopimpla excelsa, quienes resultan atraídos por la esencia y color del labelo
que se asemejan a los de las hembras. Por ello, se realizó un Análisis Elíptico de Fourier para comparar
las formas de las flores y los polinizadores. Se halló que las flores de todas las especies son más
grandes que el polinizador. Esto sugiere que actúa como un super-estímulo que permite a los
polinizadores detectarlas de manera más eficiente (Gaskett, 2012).
Al tener este panorama, en el presente trabajo se pretendió analizar la variación existente en
la bráctea floral y las estructuras florales de los integrantes del género Dichromanthus. Estos
elementos fueron seleccionados, ya que son los primeramente referidos en las clasificaciones
existentes y permiten la identificación de las especies. Además porque existe una discrepancia en el
número de especies reconocidas por diferentes autores y porque no se cuenta con estudios
morfométricos que documenten y analicen objetivamente esta variación. Por lo tanto, se propuso
estudiar las estructuras florales de ejemplares de herbario que incluyen toda la distribución conocida
del género y de estructuras florales en plantas vivas provenientes de poblaciones del centro del país
(D.F., Estado de México e Hidalgo), basándose en técnicas de morfometría tradicional y geométrica.
Se esperaba que a partir del uso de técnicas morfométricas y análisis multivariados se pudiera
confirmar la delimitación de las especies de Dichromanthus.
15
IV. METODOLOGÍA
4.1 Selección del material de estudio
4.1.1 Ejemplares de herbario
Se revisó el material depositado en herbarios de instituciones nacionales: Herbario AMO
(AMO), Instituto Politécnico Nacional (ENCB), Universidad Nacional Autónoma de México (FCME, IZTA
y MEXU). También se consultó el material resguardado en colecciones extranjeras: Royal Botanic
Gardens (K), Marie Selby Botanical Gardens (SEL), Field Museum of Natural History (F), Harvard
University (AMES y GH), New York Botanical Garden (NY), Missouri Botanical Garden (MO) y
Smithsonian Institution (US) (Thiers, 2014).
La identificación de cada ejemplar fue revisada e inicialmente se formaron conjuntos a partir
de la evaluación visual de las diferencias fenotípicas presentes en los ejemplares. Estos conjuntos se
denominaron morfoespecies y para fines prácticos se consideraron como conjuntos de ejemplares
concaracterísticas morfológicas similares que permiten su asignación a una especie en particular. El
reconocimiento de morfoespecies atendió a las dos propuestas actuales de clasificación. En la
primera, el género Dichromanthus está integrado por cinco taxa: D. aurantiacus, D. cinnabarinus
subsp. cinnabarinus, D. cinnabarinus subsp. galeottianum, D. michuacanus y D. yucundaa (Salazar &
García-Mendoza, 2009; Salazar et al., 2011; Soto, 2002); mientras que en la segunda se reconocen seis
taxa Stenorrhynchos aurantiacus y S. pubens, D. cinnabarinus, S. michuacanum, S. vexillaris y S.
xoxonitla (Szlachetko et al., 2005).
Los criterios para separar cada una de las morfoespecies fueron los siguientes: D. aurantiacus
se diferencia de S. pubens por poseer brácteas florales más grandes que las flores.Estas brácteas
florales son acuminadas y presentan pubescencia en la parte basal. En esta misma especie,
Dichromanthus aurantiacus, los segmentos del perianto son tres veces más largos que el ovario y los
sépalos son cinco veces más largos que anchos y tienen ápices acuminados. Por otra parte, S. pubens
presenta brácteas florales de tamaño similar al de las flores. Sus brácteas son agudas y pubescentes a
lo largo de toda la lámina. Los segmentos del perianto son alrededor de dos veces más largos que el
ovario y los sépalos son cuatro veces más largos que anchos y presentan ápices obtusos a subobtusos
(Szlachetko et al., 2005).
16
Dentro de D. cinnabarinus, la subespecie cinnabarinus puede ser reconocida por poseer
plantas de hasta 1.20 m de alto y por presentar inflorescencias cilíndricas o cónicas. En contraste, la
subespecie galeottianum presenta plantas de menor tamaño y sus inflorescencias son mayormente
turbinadas, con sus flores orientadas principalmente hacia una sola dirección (Soto, 2002).
Dentro del grupo D. michuacanus, la especie reconocida como tal se distingue por poseer un
labelo cuya lámina entera es más ancha hacia la base y gradualmente se atenua en el ápice. Además
sus brácteas florales son pubescentes especialmente en la base y son largamente acuminadas. En S.
vexillaris el labelo presenta un escotamiento distintivo cerca de la mitad de la lámina, lo que permite
distinguir que el hipoquilo y epiquilo son similares en largo y ancho. Al igual que en D. michuacanus,
sus brácteas florales son pubescentes y largamente acuminadas. Por último, S. xoxonitla se
caracteriza por tener labelo entero y las brácteas florales glabras (Szlachetko et al., 2005).
Dichromanthus yucundaa es similar a D. cinnabarinus pero se distingue de ésta porque la
primera presenta plantas de 20-30 cm de alto, con inflorescencias glabras y brácteas florales de color
rojo, glabras y con su superficie abaxial glauca (Salazar & García-Mendoza, 2009).
Una vez construidos los grupos de especies, con poco más de ochocientos ejemplares de
herbario montados, se seleccionaron aquellos que presentaron inflorescencias con las flores de la
porción media en antesis. Lo anterior debido a que en el estudio se planteó analizar características
florales que únicamente pueden ser evaluadas en flores abiertas. Se acotó que, en todos los
ejemplares a muestrear, las flores de la parte media de la inflorescencia serían las consideradas en el
análisis morfométrico. Tras descartar los ejemplares que no presentaron flores en antesis en la parte
media o que ya presentaban frutos, se procedió a la revisión meticulosa de cada uno a fin de conocer
si las flores estaban completas y si éstas podían ser colectadas sin dañar el resto del ejemplar. Esto es
relevante porque generalmente en el proceso de montaje las plantas se fijan a la cartulinacon ayuda
de costuras o pegamento, lo cual muchas veces impide la toma de muestras de ejemplares con
características deseables, es decir, con flores sin daño.
El único ejemplar existente de D. yucundaa fue descartado porque presentaba frutos en
maduración y los segmentos del perianto considerados en el análisis morfométrico no podían ser
analizados debido al cambio en la forma. Este cambio en la forma no es comparable con el resto de
las flores.
17
La especie Deiregyne eriophora (Robins. & Greenm.) Garay fue incluida en este estudio como
grupo de comparación, ya que el género Deiregyne es reconocido como género hermano de
Dichromanthus (Salazar, 2003; Salazar et al., 2011). Deiregyne eriophora se distribuye en gran parte
de la región geográfica donde se presenta el género Dichromanthus y es un elemento característico
de sitios montañosos estacionalmente secos (Salazar, 2003).
Después de haber seleccionado los ejemplares de herbario útiles para el estudio, se observó
que éstos cubren el área de distribución hasta hoy conocida del género, excepto los Estados Unidos.
Por lo que se tuvieron muestras de México, Guatemala, El Salvador, Honduras y Nicaragua. Una lista
de los ejemplares incluidos en el estudio se presenta en el Anexo I. El número de muestras no fue
homogéneo debido a las observaciones anteriormente mencionadas (Cuadro 1).
Cuadro 1. Relación de morfoespecies integradas de acuerdo a las propuestas de Salazar et al. (2011) y
Szlachetko et al. (2005) con número de muestras de ejemplares de herbario.
Salazar et al. (2011)* Muestras Szlachetko et al. (2005) Muestras
Dichromanthus aurantiacus 109 Stenorrhynchos aurantiacus 61Stenorrhynchos pubens 48
Dichromanthus cinnabarinus
subsp. cinnabarinus 144 Dichromanthus cinnabarinus 169Dichromanthus cinnabarinus
subsp. galeottianum 25
Dichromanthus michuacanus 51
Stenorrhynchos michuacanum 35
Stenorrhynchos vexillaris 14
Stenorrhynchos xoxonitla 2
Dichromanthus yucundaa 0 - -
Deiregyne eriophora 15 Oestlundorchis eriophora 15
Total 344 Total 344
* Incluida D. cinnabarinus subsp. galeottianum propuesta por Soto (2002).
4.1.2 Ejemplares frescos
De manera adicional, se colectaron 126 flores de ejemplares de campo, de D. aurantiacus (51),
D. cinnabarinus (33) y D. michuacanus (42). Éstas se analizaron morfométricamente para tener un
referente sobre la variación dentro de las poblaciones. Las poblaciones contempladas en el estudio se
localizan en el Distrito Federal, Estado de México e Hidalgo (Cuadro 2).
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Cuadro 2. Especies, localidades y número de ejemplares frescos incluidos en el estudio.
Sitio Localización Dichromanthusaurantiacus
Dichromanthus
cinnabarinus
Dichromanthus
michuacanus
REPSA* Coyoacán,
Distrito Federal. 35 33 -
Rancho Santa Elena Huasca de Ocampo,
Hidalgo. 16 - -
Santa Inés Texcoco,
Estado de México. - - 42
*REPSA: Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel.
Los números indican el tamaño de muestra obtenido en cada población.
Los ejemplares de Dichromanthus aurantiacus y Dichromanthus cinnabarinus recolectados en
la REPSA se refirieron como D. aurantiacus-DF y D. cinnabarinus-DF respectivamente. Las muestras
recolectadas en el Rancho Santa Elena, se abreviaron como D. aurantiacus-HGO, mientras que las
muestreadas en la localidad de Santa Inés como D.michuacanus-EDOMEX.
4.2 Caracteres cualitativos
A fin de tener un referente sobre la variación de los caracteres cualitativos tanto de las
estructuras reproductivas como vegetativas, se obtuvo información existente en la literatura y se
realizaron observaciones de los ejemplares de herbario y frescos. La identificación y reconocimiento
de esta variación fue útil porque agrega información necesaria para la adecuada delimitación de las
especies que integran al género. Además de los caracteres cualitativos, se conoció a partir de la
información de las etiquetas que acompañan a cada ejemplar, la distribución geográfica de cada
especie y aspectos sobre su hábitat, así como de su fenología.
4.2 Recolección y preparación del material de estudio
De cada ejemplar de herbario seleccionado se tomó una flor en antesis, del tercio medio de la
inflorescencia, con la ayuda de pinzas y navajas, con la intención de evitar el maltrato del resto de
flores. Se hizo una pequeña escisión en la base del ovario donde éste tiene contacto con el escapo
floral y así se separó la flor. Las flores fueron hervidas a fin de posibilitar su disección. Una vez que
fueron rehidratadas, se mantuvieron en alcohol al 50% y 3% de glicerina con el fín de suavizar los
19
tejidos. En el caso de los ejemplares frescos la recolección de las muestras fue más sencilla. Las flores
seleccionadasfueron tomados con ayuda de pinzas y navaja. Las flores, después de ser separadas del
escapo floral, se colocaron en alcohol al 50%.
Las flores y brácteas florales tanto rehidratadas como frescas fueron disectadas bajo un
microscopio estereoscópico y posteriormente fueron montadas en tiras de cartulina libre de ácido
con cinta invisible. El montaje facilitó su manejo al momento de tomar las fotografías que son la base
para proceder al análisis de la forma mediante morfometría geométrica.
Las ocho estructuras consideradas se ilustran en la Figura 2. De éstas, siete son componentes
de la flor (sépalo dorsal, sépalo lateral izquierdo, sépalo lateral derecho, pétalo izquierdo, pétalo
derecho, labelo y ovario) y la octava corresponde a la bráctea floral. Como los pétalos y sépalos
laterales izquierdos y derechos son homólogos, se optó por emplear únicamente los izquierdos. A
partir de este punto se hizo referencia a dichas estructuras como pétalo y sépalo lateral,
respectivamente.
Figura 2. Bráctea floral y flor de Dichromanthus aurantiacus disectadas, ejemplificando los elementos
analizados. A) Bráctea floral. B) Ovario. C) Sépalo dorsal. D) Sépalos laterales. E) Pétalos. F) Labelo.
Barra= 1 cm.
20
4.3 Digitalización del material
Las partes florales montadas fueron digitalizadas, de manera separada, con el uso de una
cámara digital Canon EOS DSLR. Todas las estructuras fueron fotografiadas con la cámara adaptada al
tubo C de un microscopio estereoscópico Carl Zeiss SV 11. La bráctea floral fus digitalizada con la
cámara montada en un soporte vertical del Foto-estudio Bencher. Para tener una referencia de
tamaño se usó una regla milimétrica. Una vez capturadas las imágenes de cada estructura se procedió
a registrar las coordenadas.
4.4 Registro de coordenadas
Tanto en la bráctea floral como en el sépalo dorsal, sépalo lateral, pétalo y el labelo se pueden
reconocer únicamente tres marcas o landmarks, dos en la base y una en la parte apical de cada
estructura; el resto consiste de un contorno curvilíneo.
A fin de recuperar la forma de cada estructura se localizaron semimarcas o semilandmarks,
porque permiten recuperar información acerca de las características homólogas del contorno, que no
son obtenidas con el uso exclusivo de landmarks (Zelditch et al., 2004). Las semimarcas se
identificaron en el contorno de cada estructura con ayuda de una plantilla conformada por dos peines
mediante el programa MakeFan versión 6, 6th Beta (Sheets, 2004). Cada peine constó de 14 líneas,
excepto en el labelo en donde se consideraron 20, con lo que se obtuvo una configuración de 27
puntos (24 semimarcas y tres marcas) y 39 puntos (36 semimarcas y tres marcas) respectivamente
(Figura 3). Para el ovario se registraron dos landmarks, uno en la base y uno en el ápice, pues como
parte del proceso de herborización, durante el prensado, se comprime esta estructura que presenta
volumen y se deforma. Por ello, únicamente se empleó en el análisis de morfometría tradicional.
Es relevante mencionar que Szlachetko (1994) y Szlachetko et al. (2005) delimitan las especies
del grupo D. michuacanus (S. michuacanum, S. vexillaris y S. xoxonitla) a partir de las diferencias en el
largo y ancho de dos porciones que ellos reconocen en el labelo, es decir, hipoquilo y epiquilo. Sin
embargo,el reconocimiento de estas dos porciones en muchos de los ejemplares identificados como
parte del grupo D. michuacanus y el resto de las especies fue difícil de ubicar o prácticamente
imposible, debido a que la lámina no siempre presenta lobulaciones evidentes que permitan delimitar
21
ambas partes. Como se busca que el método sea objetivo y en morfometría geométrica se requiere
reconocer el mismo número de marcas en cada forma a analizar (Zelditch et al., 2004), se optó por no
considerarlas y se analizó la forma del labelo como un todo con ayuda de semimarcas.
Las coordenadas “x, y” de las marcas y semimarcas se digitalizaron con el programa tpsDig
versión 2.17 (Rohlf, 2013), tras la generación de un archivo con formato .tps, conformado por las
imágenes de cada estructura, con el programa tps Utility versión 1.52 (Rohlf, 2012). La matriz con las
coordenadas “x, y” se empleó para los análisis de morfometría geométrica y morfometría tradicional.
4.5 Morfometría geométrica
Las coordenadas de las diferentes estructuras fueron ajustadas por medio de la superposición
Procrustes (Bookstein, 1991) a través del criterio de los cuadrados mínimos también llamado análisis
Generalizado de Procrustes (Rohlf & Slice, 1990), con el programa CoordGen6 (Sheets, 2005a). Tras
minimizar la rotación, traslación y escalamiento de las configuraciones, los contornos se alinearon en
el programa SemiLand6 (Sheets, 2002).
Debido a que la simetría es una característica importante en las estructuras florales (Savriama
et al., 2012), ésta fue evaluada con ayuda del programa BigFix6 (Sheets, 2001). Las estructuras que
presentaron simetría bilateral fueron la bráctea floral, el sépalo dorsal y el labelo, por ello una sola
mitad fue empleada con la intención de reducir el número de variables y con ello los grados de
libertad, es decir, para evitar incluir información redundante (Cardini & O'Higgins, 2004).
4.6 Morfometría tradicional
Después de revisar las descripciones y/o diagnosis proporcionadas por Soto (2002), Szlachetko
(1994), Szlachetko et al. (2005) y Rutkowski et al. (2008) y establecer los caracteres que según esos
autores permiten identificar cada taxón, se decidió realizar un análisis morfométrico tradicional
basado en las longitudes obtenidas de dichos caracteres.
A partir de la configuración obtenida para los análisis de morfometría geométrica en las
distintas estructuras, se procedió a recuperar las longitudes entre marcas con ayuda del programa
TMorphGen6-Traditional Morphometrics Variables Generation Utility (Sheets, 2000). Se empleó este
22
programa porque permite generar distancias (longitudes) a partir de datos morfométricos basados en
coordenadas (landmarks). Para esto, se empleó el archivo con las coordenadas sujetas previamente a
superposición Procrustes y se generaron las longitudes. En todos los casos se consideraron las
estructuras completas y no una sola mitad de éstas como en el protocolo de morfometría geométrica.
En el Cuadro 3 se especifican las medidas consideradas para cada estructura y las marcas empleadas
para recuperar las longitudes.
En el caso de la bráctea floral, labelo, pétalo, sépalo dorsal y sépalo lateral se recuperaron
cinco longitudes, pero dos de éstas resultan redundantes pues se originan a cada lado de la base hacia
el ápice de dichas estructuras (Figura 4). Para eliminar esta redundancia, se optó por promediar el
valor de ambas longitudes y así se obtuvo un único valor correspondiente al largo, con lo que el
número de medidas para las estructuras arriba mencionadas fue cuatro.
Por último, para el ovario se recuperó una distancia, considerada desde la base hasta el ápice
del mismo (Figura 4F).
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Figura 3. Ubicación de las marcas y semimarcas registradas para recuperar la forma en las estructuras
consideradas. A, B) Bráctea floral. C, D) Sépalo dorsal. E, F) Pétalo. G, H) Sépalo lateral. I, J) Labelo. K,
L) Ovario. Los círculos de color rojo y azul representan las marcas y los círculos negros las semimarcas.
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Cuadro 3. Longitudes generadas sobre las configuraciones a partir de las marcas y semimarcas.
Estructura Distancia (Longitud) Marcas de apoyo
Bráctea floral Largo 1-15 y 15-29
Ancho base 1-29
Ancho tercio basal 4-26
Ancho tercio apical 10-20
Labelo Largo 1-20 y 20-39
Ancho base 1-39
Ancho tercio basal 6-34
Ancho tercio apical 16-24
Pétalo Largo 1-15 y 15-29
Ancho base 1-29
Ancho tercio basal 4-26
Ancho tercio apical 10-20
Sépalo dorsal Largo 1-15 y 15-29
Ancho base 1-29
Ancho tercio basal 4-26
Ancho tercio apical 10-20
Sépalo lateral Largo 1-15 y 15-29
Ancho base 1-29
Ancho tercio basal 4-26
Ancho tercio apical 10-20
Ovario Largo 1-2
Figura 4. Distancias generadas a partir de las marcas y semimarcas registradas. A) Bráctea floral. B)
Sépalo dorsal. C) Pétalo. D) Sépalo lateral. E) Labelo. F) Ovario. Los círculos de color rojo y azul
representan las marcas y los círculos negros las semimarcas.
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4.7 Análisis Estadístico
4.7.1 Morfometría geométrica
a) Análisis de Componentes Principales
La matriz de coordenadas superimpuestas y alineadas fue empleada en el programa PCAGen6
(Sheets, 2005c), para generar las deformaciones parciales (Partial Warps) y llevar a cabo un Análisis
de Componentes Principales (PCA). Este análisis permitió identificar el número de componentes que
contienen la mayor cantidad de información en cuanto a la variación de las estructuras. El PCA es una
de las técnicas multivariadas más sencillas, cuyo objetivo es sintetizar la información al reducir la
dimensionalidad de las variables, de modo que se pierda la menor cantidad de información posible y
pueda describirse adecuadamente la variación de los datos (Manly, 2005). Los scores se usaron para
graficar y etiquetar los ejemplares de cada especie de acuerdo a la propuesta de Szlachetko et al.,
2005. Se empleó el programa R (R Core Team, 2013).
b) Diferenciación de formas (Análisis de Variables Canónicas)
Se realizó un Análisis de Variables Canónicas (CVA) con CVAGen6 (Sheets, 2005b). El CVA
determina si los grupos definidos a priori pueden ser distinguidos estadísticamente basados en datos
multivariados. El CVA permitió realizar una prueba de Lambda de Wilk basado en un análisis de
varianza multivariado (MANOVA) para saber si existe igualdad o diferencia en la forma promedio de
las estructuras florales entre los taxa. El estadístico Lambda de Wilks es usado para determinar qué
tan diferentes estadísticamente son unas de otras las variables canónicas. Hallar que una o más
variables canónicas son significativamente distintas indica que por lo menos alguno de los grupos
puede ser distinguido por dichas variables (Webster & Sheets, 2010). De igual manera, los scores
fueron empleados para graficar cada ejemplar considerado en el estudio. Lo anterior fue realizado en
el programa R (R Core Team, 2013).
En morfometría tradicional cada variable de la función canónica puede descomponerse en
cargas canónicas y éstas no pueden interpretarse como cambios en la forma. En cambio, en
morfometría geométrica la configuración de las marcas no puede descomponerse, ya que por
definición la forma es una característica de todas las variables de deformación relativa. Los cambios
26
en la forma son interpretados a través de rejillas de deformación (Zelditch et al., 2004; Toro et al.,
2010). Las rejillas de deformación, conocidas también como placas finas de deformación, permitieron
visualizar los cambios en la forma y fueron generadas en CVAGen6 (Sheets, 2005b). La forma
promedio para cada estructura fue recuperada y el nombre aplicado a dichos contornos fue asignado
con ayuda de la clasificación, para tipos de forma de estructuras planas, propuesta por Moreno
(1984).
c) Análisis del tamaño
El estimador de tamaño corresponde al tamaño del centroide (CS). El tamaño del centroide es
definido como la raíz cuadrada de la suma de las distancias al cuadrado, de un conjunto de landmarks
al centroide que ellos definen (Zelditch et al.,2004). El tamaño del centroide es utilizado en
morfometría geométrica porque condensa toda la información del tamaño y en ausencia de
alometría, no se correlaciona con ninguna variable de forma (Bookstein, 1986), cuando los landmarks
están distribuidos alrededor de su media independiente y presentan pequeñas e iguales varianzas en
cada punto y en cada dirección.
Para analizar el tamaño de las estructuras florales se compararon los valores del tamaño del
centroide entre los diferentes taxa mediante un análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey. El
análisis de varianza es una técnica que se usa para probar hipótesis acerca de las medias de diferentes
tratamientos que se ensayan (Daniel, 1984).
De acuerdo a Montgomery (2003), la prueba de Tukey es la prueba más aplicada y preferida
por los estadísticos, pues controla de mejor manera los dos errores ampliamente conocidos en la
estadística (a y ). Esta prueba permite hacer todas las posibles comparaciones de tratamientos de
dos en dos.
Los valores del tamaño del centroide se emplearon como variables dependientes y los grupos
a priori como variables independientes. Los análisis se llevaron a cabo para cada conjunto de datos, es
decir, se analizaron los ejemplares de herbario y los frescos por separado y también de manera
conjunta. Estos análisis se llevaron a cabo con el programa R (R Core Team, 2013).
27
4.7.2 Morfometría tradicional
De acuerdo al Cuadro 3, el número de variables correspondientes a las longitudes obtenidas
para cada estructura varió. Las 21 variables cuantitativas fueron empleadas para realizar un Análisis
Canónico Discriminante (CDA), el cual fue seguido de un análisis discriminante clasificatorio con el
propósito de corroborar que los individuos estaban correctamente asignados a las especies
identificadas por el CDA (Marhold, 2011). El CDA permitió identificar el subconjunto de caracteres que
separó a las especies (Manly, 1994). Los caracteres que presentaron los valores de carga más alta en
las tres primeras funciones canónicas se les aplicó un ANOVA, seguido de un análisis de comparación
de medias de Tukey para detectar las diferencias significativas entre los taxa. Los análisis se llevaron a
cabo con el programa R (R Core Team, 2013).
4.8 Reconstrucción filogenética
Tras realizar los análisis morfométricos de las estructuras florales de las siete morfoespecies
identificadas, fue posible identificar únicamente tres especies como parte del género Dichromanthus.
Con la finalidad de inferir las relaciones filogenéticas entre estas especies, se construyeron matrices
de cuatro terminales, incluido el grupo externo, con información obtenida de diferentes fuentes. Los
datos morfométricos de tamaño (tamaño del centroide) y forma (Coordenadas Procrustes), así como
los moleculares fueron analizados por separado. Posteriormente, los diferentes conjuntos fueron
reunidos en una matriz para efectuar un análisis combinado.
En todos los casos, la generación de la hipótesis filogenética bajo el método de Máxima
Parsimonia se realizó con el programa TNT (Goloboff et al., 2003, 2008). Se empleó el algoritmo de
enumeración implícita para la búsqueda de las hipótesis más parsimoniosas. Para calcular la
confiabilidad estadística de las ramas de los árboles, se aplicaron técnicas de remuestreo por
bootstrapping (Felsenstein, 1985) y jackknifing (Farris et al., 1996). Se generaron 1000 réplicas y
búsquedas para cada técnica, también por enumeración implícita. En el caso del jackknifing se empleó
un porcentaje de deleción de 40%.
Los cambios en los atributos de la forma de todas las estructuras, fueron optimizados tras
realizar el análisis combinado que incluyó los datos morfométricos, morfológicos y moleculares. El
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método para la optimización de ladmarks bidimensionales o tridimensionales se llevó a cabo
directamente sobre el árbol y se basó en el uso de gradillas y su subsecuente refinamiento iterativo
de los puntos iniciales estimados (Goloboff & Catalano, 2011). A continuación se especifica el
conjunto de datos empleados para cada una de las filogenias generadas.
a) Filogenia morfométrica
Se realizaron análisis por separado para evaluar los datos correspondientes a la forma y el
tamaño. En el primer caso, se emplearon las coordenadas Procrustes y para el segundo el tamaño del
centroide y la longitud del ovario. Debido a que el tamaño del centroide resume el tamaño de las
estructuras, se optó por emplear éste y no las longitudes que resultaron útiles en la separación de los
taxa. Se consideraron como valores del tamaño del centroide y longitud del ovario, a los valores
comprendidos en un intervalo entre la media menos la desviación estándar y la media más la
desviación estándar ( ± σ).
De acuerdo a Catalano et al. (2010), las variables de forma (landmarks alineados) fueron
analizadas de manera individual con ayuda del script LandschW.run (Catalano, 2012), con el fin de
conocer su utilidad para generar hipótesis filogenéticas. El método para usar los landmarks en el
análisis filogenético se basa en encontrar, para cada landmark, la posición que minimiza la distancia
entre el ancestro/descendiente de los puntos a lo largo del árbol (Catalano et al., 2010; Catalano &
Goloboff, 2012). También se analizó la matriz combinada con las configuraciones de la bráctea floral,
sépalo dorsal, pétalo, labelo, y sépalo lateral.
b) Filogenia molecular
Se incluyeron datos moleculares correspondientes a dos marcadores de ADN altamente
variables: la región de los espaciadores internos transcritos del ADN ribosomal nuclear (nrITS) y la
región del plástido trnL-trnF, el cual incluye el intron de trnL, el espaciador intergenérico entre trnL y
trnF y porciones cortas de los exones de las series trnL y trnF. Estas dos regiones han sido usadas de
manera previa, ya sea solas o en combinación con otra u otras regiones del ADN para la
reconstrucción filogenética de Spiranthinae (Salazar et al., 2003; Figueroa et al., 2008; Salazar et al.,
2011).
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Las secuencias fueron obtenidas de GenBank y corresponden a las generadas previamente por
Salazar et al. (2011). Para estos análisis también se incluyó a Deiregyne eriophora, como grupo de
comparación, para arraizar el cladograma (Cuadro 4).
Cuadro 4. Número de acceso de las secuencias obtenidas de GenBank.
Especies nrITS trnL-trnF
Dichromanthus aurantiacus FN996957 FN996971
Dichromanthus cinnabarinus FN996952 FN996964
Dichromanthus michuacanus FN996955 FN996969
Deiregyne eriophora FN641873 FN641885
El alineamiento de las secuencias se llevó a cabo a través de MAFFT Aligment versión 7 (Katoh
& Standley, 2013) y posteriormente ésta se corroboró manualmente con ayuda del programa PhyDe
v0.9971 (Phylogenetic Data Editor, Müller, 2010). Una vez editadas las secuencias de ambos
marcadores fueron concatenadas en PhyDe.
Para maximizar la señal filogenética, las inserciones/deleciones en las matrices de nrITS y trnL-
trnF fueron codificadas mediante el método de codificación simple de Simmons & Ochoterena (2000),
con ayuda del programa SeqState v1.4.1 (Müller, 2005). Las inserciones/deleciones comúnmente
abreviadas como ”indel”, son un tipo de variación genética en la que una secuencia de nucleótidos
específica está presente (inserción) o ausente (deleción), y son el resultado de errores en la
replicación de la información genética (Vandamme, 2009). Se presentaron diez eventos de inserción-
deleción y de éstos nueve resultaron ser autapomórficos y solo uno fue sinapomórfico (Cuadro 5).
Cuadro 5. Eventos de inserción-deleción.
Número de
indel Marcador Posición Carácter
1 nITS 12 Autapomorfía
2 199 Autapomorfía
3 trnL-trnF 762-770 Autapomorfía
4 763-770 Autapomorfía
5 765-770 Autapomorfía
6 771-776 Autapomorfía
7 993-999 Sinapomorfía
8 1110-1116 Autapomorfía
9 1350-1356 Autapomorfía
10 1490-1501 Autapomorfía
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c) Filogenia combinada
Los diferentes conjuntos de datos, morfométricos y moleculares, se conjuntaron para llevar a
cabo un