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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Detección de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia en agua desde un área urbana hasta un sistema de reutilización en el Valle del Mezquital, Hidalgo, México. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N T A : MARÍA TERESA CASTAÑÓN MARTÍNEZ DIRECTOR DE TESIS: BIÓL. MARCO ANTONIO TAPIA PALACIOS 2015 Lourdes Texto escrito a máquina Ciudad Universitaria, D. F. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ii Hoja de datos del jurado 1. Datos del alumno Castañón Martínez María Teresa 044 55 12438918 Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Ciencias Biología 307071950 2. Datos del Tutor Biól. Marco Antonio Tapia Palacios Facultad de Ciencias, UNAM 3. Datos de sinodal 1 Dra. Marisa Mazari Hiriart 4. Datos de sinodal 2 Dra. Ana Cecilia Espinosa García 5. Datos de sinodal 3 Dr. José Pablo Maravilla Campillo 6. Datos de sinodal 4 Dra. Alma Concepción Chávez Mejía 7. Datos del trabajo escrito Detección de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia en agua desde un área urbana hasta un sistema de reutilización en el Valle del Mezquital, Hidalgo, México. 57 páginas 2015 iii ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 1 1.1. Agua: líquido vital .................................................................................................... 1 1.2. Agua residual ........................................................................................................... 3 1.3. Recarga artificial de acuíferos con agua residual .................................................... 5 1.4. Protistas patógenos en agua.................................................................................... 5 1.5. Especies de estudio .................................................................................................. 7 1.5.1. Cryptosporidium parvum .................................................................................. 8 1.5.2. Giardia lamblia ............................................................................................... 11 2. ANTECEDENTES............................................................................................................. 14 3. JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 16 4. OBJETIVOS .................................................................................................................... 17 4.1. Objetivo general..................................................................................................... 17 4.2. Objetivos particulares ............................................................................................ 17 5. SITIO DE ESTUDIO ......................................................................................................... 17 6. MÉTODOS ..................................................................................................................... 21 6.1. Métodos de campo ................................................................................................ 21 6.2. Métodos de laboratorio ......................................................................................... 22 6.2.1. Concentración de la muestra ......................................................................... 22 6.3. Análisis de datos .................................................................................................... 24 7. RESULTADOS ................................................................................................................. 25 7.1. Detección de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia ..................................... 25 7.2. Concentración de (oo)quistes en agua residual y subterránea ............................. 28 7.2.1. Variación en la concentración de (oo)quistes por sitio .................................. 28 7.2.2. Variación en la concentración de (oo)quistes por temporada....................... 29 7.3. Factores condicionales sobre la concentración de (oo)quistes ............................. 31 8. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 36 9. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 41 REFERENCIAS ........................................................................................................................ 43 iv RESUMEN La transmisión ambiental de protistas patógenos representa uno de los problemas de salud pública en el mundo. La mayoría de estos patógenos causan principalmente gastroenteritis y el 50% de estos casos están asociados al consumo de agua contaminada por heces tanto humanas como de animales. En el estado de Hidalgo, las enfermedades infecciosas intestinales son la tercera causa de morbilidad entre los habitantes. Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia son protistas patógenos de interés que se transmiten por agua, debido a las características de sus ciclos de vida y las enfermedades que provoca en el mundo. El Valle del Mezquital es la zona con mayor extensión territorial en el mundo regada con agua residual, aproximadamente la mitad de ésta se infiltra a los acuíferos (70 Mm3/año en retornos de riego y 80Mm3/año por infiltración de canales) de donde posteriormente se extrae agua para consumo humano. El presente estudio tuvo como objetivo analizar los cambios en las densidades de ooquistes de C. parvum y quistes de G. lamblia en agua desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo, evaluando el sistema de reúso y las fuentes de abastecimiento para la población, así como el riesgo potencial para la salud que implica su detección. Para ello, muestras de agua residual (1 L) y subterránea (10 L) fueron colectadas durante tres temporadas (cálida-seca, fría-seca y lluvias) y analizadas por medio de la técnica de inmunoflorescencia indirecta y tinción de anticuerpos monoclonales. Los resultados arrojaron la presencia de (oo)quistes en ambos tipos de agua y en las distintas temporadas, siendo las muestras positivas a C. parvum más frecuentes con respecto a las de G. lamblia tanto en agua residual (1% más) como subterránea (6% más) y mostrando que, durante la temporada cálida-seca se presenta la mayor concentración de patógenos en agua aunque solo para C. parvum la diferencia en la densidad de ooquistes entre temporadas fue significativa. El canal Salto Tlamaco (STLA) y Licuadora (LICU) son dos sitios que resaltan por la alta concentración de patógenos que presentan en el agua que transportan. Cada sitio analizado en el que se detectaron (oo)quistes, rebasó con sus cargas parasitarias las dosis infecciosas reportadas (30 a 132 ooquistes de C. parvum y 25 a 100 quistes de G. lamblia), loque se traduce en un riesgo potencial a la salud para la población que se encuentra expuesta a este líquido. v Se realizó la comparación total de (oo)quistes por temporada y se encontraron diferencias significativas entre las concentraciones de ooquistes de C. parvum, siendo los conteos en la época de lluvias menores que para la temporada cálida-seca. Las densidades de quistes de G. lamblia detectadas durante el muestreo se mantuvieron constantes sin seguir un patrón estacional específico. Las interacciones (sitio de muestreo/temporada, tipo de agua/temporada) presentadas en forma gráfica, y apoyadas en un diagrama del flujo de agua en la zona, confirman que el comportamiento de la densidad de los microorganismos cuantificados dependerá del sitio y la temporada en la que se encuentren. Además de que los efectos estacionales son perceptibles principalmente para corrientes de agua superficiales. Este estudio aporta información actualizada que puede ser utilizada por las autoridades sanitarias a fin de enfocar acciones y programas de monitoreo microbiológico en la zona. Un monitoreo constante, junto con la realización de estudios complementarios de viabilidad de protistas patógenos es necesario como medida de prevención de brotes y episodios frecuentes de infecciones que sean producidas por C. parvum y G. lamblia debido al uso de agua residual cruda y parcialmente tratada. 1 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Agua: líquido vital El agua es un recurso imprescindible para la existencia de todos los seres vivos y el desarrollo de la humanidad (DE, 2012; IV-EUA, 2012). En muchas regiones del mundo, la carencia y contaminación de ésta se ha convertido en un problema que afecta la salud e integridad de los ecosistemas, así como la estabilidad social y política (Carabias y Landa, 2005). El agua disponible en la Tierra se encuentra principalmente formando parte de los océanos; del total de la masa de agua sólo el 2.8% (36 millones de km3) es agua dulce y de ésta cerca del 75% forma hielo de los casquetes polares de las zonas ártica y antártica. Del agua que fluye en los continentes, cerca del 0.63% (8 millones de km3) se encuentran en lagos, ríos y lagunas, y sólo el 0.2% forma parte de la atmósfera (Huarte, 2006). A pesar de que el agua se precipita, escurre y almacena de forma natural, ésta se distribuye de manera desigual en las distintas regiones del planeta y según la época del año (Carabias y Landa, 2005; CONAGUA, 2005); así, este recurso se vuelve cada vez más escaso debido al rápido aumento de su consumo, derivado del crecimiento demográfico, la urbanización, la industrialización y la expansión de la agricultura, haciendo más lenta su renovación y modificando su ciclo natural (CONAGUA, 2005; Mazari-Hiriart et al., 2005; Avellaneda et al., 2011; González y Chiroles, 2011), convirtiendo a este recurso en el que mayor presión antropogénica recibe (González y Chiroles, 2011; IV-EUA, 2012). Sin embargo, el correcto funcionamiento de los cuerpos de agua no depende sólo de la cantidad de líquido que poseen, sino también de su calidad (Meybeck y Helmer, 1996; Schuartz et al., 2005; Tapia-Palacios, 2012). Actualmente, el acceso a un agua de calidad es mucho más difícil, debido sobre todo a la falta de gestión y a la ausencia de políticas específicas que se apliquen con el fin de conservar y utilizar de manera racional este valioso recurso (Avellaneda et al., 2011). Si bien el agua se considera una fuente de vida, es importante destacar que también actúa como vía de transmisión de muchas enfermedades (Carabias y Landa, 2005; Solarte et al., 2 2006; Avellaneda et al., 2011) ya que su uso con una calidad inadecuada (agua no tratada o tratada inadecuadamente) son la principal fuente de propagación de microorganismos patógenos (Carabias y Landa, 2005). Tomando en cuenta que, en todo el mundo, alrededor de 780 millones de personas carecen de acceso a fuentes de agua de calidad y unos 2 500 millones aún no tienen acceso a instalaciones básicas de saneamiento (DGE, 2012; OMS, 2014); se estima que el agua contaminada causa aproximadamente 80% de las enfermedades gastrointestinales en los países en desarrollo (WWAP, 2003), y son causa de muerte de 2.5 millones de personas al año (WHO, 2011; WHO, 2013). A pesar de que todos tenemos el riesgo de contraer enfermedades trasmitidas a través del agua, son los niños menores de cinco años, adultos mayores de 70 y personas inmunocomprometidas, las poblaciones más susceptibles (Hurst y Murphy, 1996; Mazari- Hiriart, 2000; Reynolds, 2001; Carabias y Landa, 2005; Solarte et al., 2006). Ésta transmisión suele ocurrir por medio del contacto directo e indirecto, o por la ingesta de agua contaminada con bacterias patógenas, virus, protozoarios y helmintos provenientes de los desechos fecales de humanos y animales que reciben las distintas fuentes de abastecimiento y los alimentos que son regados con estas (WHO, 2003; Carabias y Landa, 2005; WHO, 2006). En México, el Registro Público de Derechos de Agua (REPDA) agrupa los distintos usos del agua en cinco categorías: la agrícola, el abastecimiento público, la industria autoabastecida, la generación de energía eléctrica (termoeléctricas) y la hidroeléctrica (CONAGUA, 2011a). De acuerdo con estadísticas generadas hasta diciembre del 2011, el mayor volumen concesionado para uso del agua corresponde al sector agrícola con un 76.7% del total (Figura 1), convirtiendo a México en uno de los países con mayor infraestructura de riego en el mundo (CONAGUA, 2012a; CONAGUA, 2012b). 3 Figura 1. Volumen concesionado para usos consuntivos del agua en México (Modificado de CONAGUA, 2011a). La contaminación del agua en los distintos usos disminuye su aprovechamiento para diversas actividades, por lo que es indispensable su tratamiento para el reúso (León, 1995; Schuartz et al., 2005; Avellaneda et al., 2011). 1.2. Agua residual De acuerdo con la Ley de Aguas Nacionales (DOF, 2013), se considera agua residual a aquella cuya composición variada proviene de las descargas de usos público urbano, doméstico, industrial, comercial, de servicios, agrícola, pecuario y en general, de cualquier uso, así como la mezcla de ellas. Para 2012, en México se descargaron aproximadamente 230 m3/s de agua residual, siendo el estado de México (24 m3/s), Distrito Federal (22 m3/s) y Veracruz (16 m3/s) los que generaron las mayores descargas de agua municipal (SEMARNAT, 2014). El reúso de agua residual conlleva aspectos sociales, económicos, políticos y ambientales (Cifuentes et al., 2000). El uso de éstas para el riego de cultivos agrícolas cada vez es más común (Carabias y Landa, 2005; González y Chiroles, 2011); tan solo para el 2010, en México se destinaron 2 766 Hm3 (87.65 m3/s) de agua residual a esta actividad, es decir, el 5.1% 4% 14.3% 76.7% Energía elécrica excluyendo hidroelectricidad Industria autoabastecida Abastecimiento público Agrícola 4 54.76% del total de agua residual producida en un año (CONAGUA, 2011b; CONAGUA, 2012b). En el agua residual se encuentran nutrientes como el nitrógeno, fósforo y carbono que son utilizados por las plantas, causando un incremento en la producción de los cultivos y disminuyendo el uso de fertilizantes químicos, por ello, el reúso de éstas conlleva en muchos casos un efecto social, mejorando cosechas y creando empleos en las zonas rurales (Cifuentes et al., 2000; Salgot de Marcay, 2005). Diversos estudios han demostrado que con este tipo de agua se puede llegar a aumentar la producción agrícola entre 10 y 30% (Salgot de Marcay, 2005). Aunque el riego puede aportar beneficios y ser una alternativa adecuada de reutilización, cuando el agua residual es utilizada en aplicaciones donde existe la posibilidad de contacto con las personas, se presenta un riesgo para la salud y el deterioro de los ecosistemasasociado con la exposición de agentes microbiológicos patógenos, principalmente bacterias, virus, helmintos y protozoarios (Cifuentes et al., 2000; Abreu, 2002; Carabias y Landa, 2005; Salgot de Marcay, 2005; González y Chiroles, 2011). En muchos países, gran parte del agua residual es vertida sin un tratamiento previo en los cuerpos de agua, convirtiéndose en un peligro para la salud humana y el resto de seres vivos que estén en contacto con ella (León, 1995; Mazari-Hiriart, 2000; Schuartz et al., 2005; Avellaneda et al., 2011). González y Chiroles (2011) enumeran las vías de transmisión y exposición a patógenos con el uso de agua residual para la agricultura: a. Por contacto con agua residual (o cosechas contaminadas) antes, durante o después del riego. b. Por inhalación de aerosoles. c. Consumo de productos contaminados regados con agua residual. d. Consumo de agua contaminada de manera accidental (acuíferos o aguas superficiales). 5 e. Consumo de animales o productos animales que han sido expuestos a agua residual. 1.3. Recarga artificial de acuíferos con agua residual Un acuífero es definido como una unidad geológica saturada y permeable que puede transmitir cantidades significativas de agua bajo gradientes hidráulicos ordinarios, por lo que ésta circula o se almacena en el subsuelo y puede ser extraída para su explotación, uso o aprovechamiento (Freeze y Cherry, 1979; DOF, 2013). En general, la calidad de su agua es mejor que la del agua superficial (Carabias y Landa, 2005). La infiltración de agua a un acuífero es un proceso natural que ocurre a través del suelo; el agua puede provenir de una lluvia, riego o de una corriente de agua superficial (Esteller, 2005). Cuando esto sucede con agua residual sin tratamiento, se habla ya de una posible fuente de contaminación al acuífero (Carabias y Landa, 2005) y generalmente ocurre en zonas donde se emplean láminas de riego muy altas que junto a los aportes laterales del flujo subterráneo natural y el agua de lluvia, causan la recarga artificial de estos acuíferos (Silva-Castro, 2008; Navarro et al., 2011), propiciando el reúso de agua residual para consumo humano (Foster, 2001). 1.4. Protistas patógenos en agua Los protistas son organismos eucariontes, predominantemente unicelulares, sin pared celular, heterótrofos y móviles; ellos se encuentran en ambientes húmedos como el mar, ríos, lagos e incluso en la tierra húmeda (García, 2005). La mayoría son de vida libre, pero un gran número se consideran comensales y unos más se reconocen como parásitos (García, 2005; Solarte et al., 2006). Como se mencionó anteriormente, en el agua se pueden transmitir múltiples microorganismos patógenos (Tabla 1) de los cuales los protistas son capaces de sobrevivir fuera de su hospedero y son resistentes a la mayoría de los desinfectantes químicos que se utilizan como medidas preventivas (APHA, 2005; Carabias y Landa, 2005). La presencia de estos microorganismos en los cuerpos acuáticos puede ser relevante en la salud pública de una población (Gerba, 2009a; SSH, 2014). 6 Tabla 1. Patógenos entéricos comunes en agua y sus tiempos de incubación (Gerba, 2009b). Agente Periodo de incubación (días) Forma de transmisión Duración de la enfermedad (días) Virus Adenovirus Hepatitis A Rotavirus Bacterias 8-10 30-60 1-3 Fecal-oral-respiratorio Hepatitis Contacto directo o indirecto 8 14-28 4-6 Campylobacter jejuni 3-5 Ingestión de comida, contacto directo 2-10 Salmonella 1-3 Ingestión de comida contaminada, contacto directo o indirecto 2-7 Shigella 1-3 Ingestión de agua o comida contaminada, contacto directo o indirecto 2-7 Protistas Cryptosporidium parvum 2-14 Ingestión de agua o comida contaminada, contacto directo o indirecto 12-15 Giardia lamblia 7-14 Ingestión de agua o comida contaminada, contacto directo o indirecto 14-42 Entre los protistas que han sido asociados con infecciones transmitidas por el agua se encuentran los géneros Giardia, Cryptosporidium, Toxoplasma, Cyclospora, Entamoeba, Acanthamoeba, y los microsporidios, Enterocytozoon y Encephalitozoon (APHA, 2005). Todos estos organismos producen quistes, ooquistes o esporas resistentes a distintas condiciones ambientales y que se propagan por medio de las heces de los individuos infectados, excepto por los organismos del género Acanthamoeba que son de vida libre (APHA, 2005; Hunter y Thompson, 2005). Los (oo)quistes (abreviación para ooquiste y quiste) son las formas infectantes de los protistas patógenos y constituyen un estadio del ciclo de vida de varios protistas que les permite sobrevivir en los ambientes acuáticos, resistir los procesos de tratamiento en redes de distribución de agua y de desecho doméstico, les confiere resistencia a la desecación, a altas temperaturas, a la falta de nutrientes y oxígeno. Estas estructuras los habilita para pasar de un huésped a otro; y el agua se encarga de dispersarlos a nuevos 7 ambientes (Bitton, 1994; Betancourt y Rose, 2004; Carabias y Landa, 2005; Solarte et al., 2006; Gállego, 2007). La transmisión ambiental de protistas patógenos es un problema de salud pública en el mundo (Valverde et al., 2005; Betancourt y Querales, 2008; Gerba, 2009b). La mayoría de estos patógenos causan principalmente gastroenteritis y el 50% de estos casos se deben al consumo de agua contaminada por heces tanto humanas como de animales, y se atribuyen a microorganismos específicos o toxinas generadas por ellos (Solarte, 2006); tan solo en el 2012, el Perfil Epidemiológico de las Enfermedades Infecciosas Intestinales reportó en México una demanda del 20% en consultas de servicios de salud por éstos padecimientos (DGE, 2012). Y en específico, en el estado de Hidalgo, la tercer causa de enfermedades entre la población lo ocupan las enfermedades infecciosas intestinales con 105 541 casos reportados para 2013 (SSH, 2014). 1.5. Especies de estudio Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia son los protistas patógenos que se transmiten por agua de mayor interés, debido a las características específicas de sus ciclos de vida (Solarte et al., 2006; Karanis, 2011) y los problemas de salud pública que ocasionan en el mundo (Betancourt y Querales, 2008). De 199 brotes de enfermedades causadas por la transmisión de protistas patógenos que se registraron a nivel mundial entre 2004 y 2010, Cryptosporidium spp. fue el agente etiológico en 60.3% de los casos mientras que G. lamblia lo fue en un 35.2% (Baldursson y Karanis, 2011). Sus (oo)quistes resistentes a desinfectantes y distintas condiciones ambientales, la transmisión persona-persona, a través del agua o alimentos y la capacidad de causar auto-infección, les confieren un potencial epidemiológico alto (Solarte et al., 2006; Gerba, 2009b). Ambas especies colonizan el intestino de diversos mamíferos (Olson, 2002; Fayer, 2004; Appelbee et al., 2005), siendo causantes de enfermedades zoonóticas, es decir, que se pueden transmitir de forma directa o indirecta entre animales y seres humanos (Appelbee et al., 2005; Cháidez et al., 2005). 8 En 2004, la cryptosporidiosis y giardiasis fueron incluidas por la OMS en la iniciativa de “enfermedades descuidadas” buscando un enfoque integral para erradicarlas. Todas las enfermedades incluidas en esta iniciativa se asocian con la pobreza, por lo que no han despertado el interés comercial de las empresas de salud ni los laboratorios farmacéuticos (Savioli et al., 2006; Karanis, 2011). 1.5.1. Cryptosporidium parvum En 1907, Edward Tyzzer describió el género Cryptosporidium cuando observó el desarrollo de estos organismos en el intestino delgado de sus ratones de laboratorio (Marshall et al., 1997; Rojas, 2011), Fue hasta 1976 cuando se identificó ya como un patógeno en humanos, una vez que se describió en heces de pacientesinmunocomprometidos (Gerba, 2009b). Cryptosporidium parvum es un protista miembro del phyllum Apicomplexa (Fayer et al., 2000) y se considera la especie con mayor potencial zoonótico del género (Xiao y Feng, 2008). Estos microorganismos sobresalen como esferas diminutas en las células enteroepiteliales, sus ooquistes miden 4-6 µm de diámetro aproximadamente y están provistos de una gruesa pared que encierra a cuatro esporozoitos curvados en forma de cuña (Gállego, 2007). Una vez liberados los ooquistes en el ambiente, el parásito puede causar cryptosporidiosis, una infección entérica tanto en seres humanos como en animales; su transmisión ocurre cuando los ooquistes son ingeridos a través de los alimentos, el agua, o por contacto directo con personas, animales o superficies contaminadas (Fayer et al., 2000; Gerba, 2009b; Yoder et al., 2012; Uribarren, 2014a). La prevalencia de esta enfermedad, en países en desarrollo, oscila de 0.1 a 31.5% (Uribarren, 2014a), en México es difícil conocer el impacto real de C. parvum, ya que el Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) agrupa los casos de cryptosporidiosis en un rubro catalogado como “otras infecciones intestinales debidas a protozoarios”; que a su vez se ubica, junto con otras 12 patologías, en la clasificación de enfermedades infecciosas intestinales (Del 9 Coco et al., 2009; DGE, 2012; DIE, 2014). El amplio intervalo de seroprevalencia indica que numerosas personas se han infectado en algún momento de sus vidas, debido a que este parasitismo es frecuente entre todos los grupos de edad, tanto en individuos inmunodeprimidos (>24%) como inmunocompetentes (6%) (Gállego, 2007; Rojas, 2011). Sin embargo, es bien conocido que la mayor prevalencia (5-30%) se presenta en niños de 1 a 5 años (Gállego, 2007; Rojas, 2011). Una vez que el hospedero ingiere los ooquistes de C. parvum, ocurre la liberación de los esporozoitos que parasitan las células epiteliales del tracto gastrointestinal. En estas células, los parásitos se multiplican de manera asexual (esquizogonia o merogonia) y luego ocurre una multiplicación sexual (gametogonia), produciendo microgametocitos y macrogametocitos. Tras la fertilización de estos últimos, se forma un cigoto que se diferencia en un nuevo ooquiste, que es expulsado y puede esporular en el intestino del huésped; así, se producen dos tipos diferentes de ooquistes: los de pared gruesa, que comúnmente son excretados por el anfitrión, y los de pared delgada, que promueven la autoinfección manteniendo al parásito en el huésped (Putignani y Menichella, 2010) (Figura 2). 10 Figura 2. Ciclo de vida de C. parvum (Modificado de CDC, 2015). JI~<Ir .... <d - Auto info«ión kl~<Ir _ .. ~ 11 Estos ooquistes son fundamentales para la dispersión, infectividad y sobrevivencia del parásito (Fayer et al., 2000; Solarte et al., 2006) ya que sus bajas dosis infecciosas de 30 a 132 ooquistes (DI50) aumentan la probabilidad de infección (DuPont et al., 1995; Okhuysen et al., 1999; Smith et al., 2007; Gómez-Marín, 2010; Putignani y Menichella, 2010). La carga parasitaria excretada en heces alcanza niveles de 108-1010 ooquistes por día, mientras que los descargas de agua pueden contener de 0.06 a 19.4 ooquistes por litro (Kemp et al., 1995; Gerba, 2009b; Putignani y Menichella, 2010). Los ooquistes pueden sobrevivir de 3-11 días en agua con niveles de cloro de 1-3 mg/L (Yoder et al., 2012) que son las cantidades empleadas generalmente para desinfectar el agua, también permanecen viables por dos meses a una temperatura de -5°C (Fayer y Nerad, 1996) y por más de 6 meses si se mantienen a temperatura ambiente (20°C ) (Robertson, 1995). 1.5.2. Giardia lamblia En 1681, Antony Van Leeuwenhoek describió por primera vez a parásitos similares a Giardia lamblia en sus propias heces. Fue hasta 1859, cuando el médico checo Vilem Lambl redescubrió a Giardia y describió algunos de los detalles morfológicos de los trofozoítos en su entorno intestinal, que fue nombrado posteriormente lamblia (Marshall et al., 1997). Giardia lamblia es un protista binucleado y flagelado que habita el intestino delgado de humanos y otros mamíferos y es el agente responsable de la giardiasis, una patología de difusión mundial y la protozoosis entérica más frecuente en el mundo (EPA, 2000). Ésta se presenta con manifestaciones clínicas que varían desde la infección asintomática a la enfermedad aguda o crónica asociada con diarrea acuosa o pastosa, dolor epigástrico, náusea, vómito y pérdida de peso (Thompson, 2000; Gállego, 2007; Thompson, 2008; Gómez-Marín, 2010). Se estima que cada año se reportan 500 000 casos nuevos en países de Asia, África y Latinoamérica, es decir, alrededor de 200 millones de personas se ven afectadas por este parasito al año en estas regiones (WHO, 1996). La tasa de prevalencia de giardiasis varía 12 dependiendo de la localización geográfica, la edad de los individuos y las condiciones sanitarias existentes en una comunidad (Cedillo-Rivera, 1989; EPA, 2000). En México se ha reportado una prevalencia del 7.4 al 68.5%, encontrando la incidencia más alta entre lactantes, preescolares y escolares (Solarte et al., 2006; Uribarren, 2014b). En 2009, Cedillo-Rivera y colaboradores determinaron que la seroprevalencia de G. lamblia en el país es de 55.3%. El ciclo de vida de G. lamblia (Figura 3) posee dos estadios: el trofozoito y un quiste (Marshall et al., 1997). El primero son las formas asexuales y activas del parásito, tiene un tamaño aproximado entre 10-20 µm con un aspecto de media pera, cuya cara plana presenta un disco ventral al mismo nivel que sus dos núcleos y el canal del que nacen tres de sus cuatro pares de flagelos (Gállego, 2007); mientras que el segundo, la forma de resistencia e infectiva, es un quiste ovalado entre 8-12 µm bordeado por una capa filamentosa externa y una capa membranosa interna (Uribarren, 2014b). Estos estadios le permiten adaptarse mejor a los cambios que confronta durante su ciclo de vida ya sea para sobrevivir dentro del huésped o fuera del mismo; así, el enquistamiento es esencial ya que los trofozoitos son sumamente sensibles a las variaciones de temperatura, humedad y a la presencia de agentes químicos (Luján, 1997; Adam, 2001). 13 Figura 3. Ciclo de vida de G. lamblia (elaborado por E. Hjort, 2012) Giardia lamblia produce los quistes que son evacuados en las heces e inician la infección si son ingeridos por otro hospedero. La transmisión de éstos puede darse por vía fecal-oral o a través de agua y alimentos contaminados (Hunter y Thompson, 2005; Thompson, 2008; Gerba, 2009b; Uribarren, 2014b). La exposición de los quistes primero a un medio ácido en el estómago y luego a sales biliares en el intestino delgado proximal, estimula la liberación de trofozoitos; éstos se acoplan y viven en las primeras regiones del intestino delgado (duodeno y yeyuno) en donde se encuentran fijados a las células enteroepiteliales de su pared gracias a una actividad succionante, enseguida inician su multiplicación por fisión binaria asexuada. A medida que los trofozoitos descienden por el intestino del hospedador, y encuentran un ambiente pobre en colesterol, se induce su diferenciación a quiste, los cuales son nuevamente eliminados con las heces (Adam, 2001; Thompson, 2008; Gerba, 2009b; Uribarren, 2014b). 14 Es importante mencionar que el número aproximado de quistes que se excretan en las heces es de 900 millones al día; si bien la eliminación de quistes no es constante, éstos pueden permanecer viables hasta por dos meses suspendidos en agua a 4°C, aproximadamente cuatro días a una temperatura de 37 °C y es probable que sobrevivan por un par de semanas en los alimentos refrigerados, además son resistentes a desinfectantes como el cloro (Bingham et al., 1979; Cedillo-Rivera, 1989; Robertson,1995; Gerba, 2009b). Éstas características, aunadas a las bajas dosis infecciosas (25 a 100 quistes) que posee (Rendtorff, 1954; Rendtorff, 1979), aumentan su sobrevivencia en el ambiente y facilitan la transmisión de G. lamblia (Cedillo-Rivera, 1989; Gerba, 2009b). 2. ANTECEDENTES Uno de los mayores sistemas de reutilización de agua residual en el mundo se encuentra ubicado en el centro de México, en el Valle del Mezquital (Cifuentes et al., 2000; Jiménez y Chávez, 2004). Las limitaciones financieras, el crecimiento demográfico y la escasez de agua en la zona, fueron las principales razones para iniciar un programa de reutilización de agua residual y adoptar una tecnología de tratamiento de agua diferente a la de los sistemas convencionales. Numerosos trabajos se han llevado a cabo en la Cuenca de México y en la región del Mezquital analizando el manejo y uso de agua residual, así como la contaminación de agua subterránea en la zona. Uno de los trabajos pioneros en el análisis de protistas patógenos en la zona de los distritos de riego 03 y 100 del Valle del Mezquital fue llevado a cabo por Cifuentes et al. (1994), en donde se evaluó la prevalencia de enfermedades diarreicas e infecciones intestinales con la aplicación de cuestionarios y exámenes parasitológicos a las familias expuestas, éstos fueron clasificados de acuerdo al tipo de agua que empleaban en sus labores agrícolas. En 1995, Capella reportó las características que presenta el agua residual proveniente de la Ciudad de México en diez sitios a lo largo del sistema durante la época de lluvias y secas; contrario a lo que esperaba, no hubo diferencias en los parámetros evaluados de 15 calidad de agua para ambas épocas del año. Además, observó que a lo largo del recorrido se presenta un fenómeno de autopurificación por la depuración que ocurre en el transporte del agua a través del canal superficial. Lo que no ocurrió con un indicador de contaminación microbiológica como las coliformes fecales, mismos que se mantuvieron presentes hasta el final del sistema. Cifuentes y colaboradores (2000) realizaron un estudio en el Valle del Mezquital en el que se evaluó el riesgo de infección con G. lamblia debido al uso de agua residual cruda y agua residual tratada para riego. En este trabajo no se detectó mayor riesgo de infección por G. lamblia en las personas que utilizan agua residual cruda. A pesar de que el agua residual tratada (por retención hidráulica) tuvo una mejora parcial en su calidad, no se redujo el riesgo a la salud pues la prevalencia de infección fue mayor comparada con los grupos que utilizan agua residual cruda. Por otra parte, considerando la infiltración de agua que ocurre a partir de la irrigación en la zona, Page y colaboradores (2010) evaluaron de manera cuantitativa los riesgos microbiológicos en el acuífero del Valle de Tula; encontrando que rotavirus y Cryptosporidium fueron los patógenos con el mayor riesgo de contaminación del acuífero debido a la falta de un pre-tratamiento del agua residual recargada y el poco tiempo de residencia de ésta en el acuífero (20 días aproximadamente). De igual manera, Navarro et al. (2011) cuantificó un mayor riesgo de infección con G. lamblia en el análisis que realizaron en pozos y fuentes del Valle del Mezquital. En este trabajo evaluaron la exposición de diversos patógenos en las personas que utilizan estos lugares como principal fuente de abastecimiento, los resultados coincidieron con la prevalencia reportada por Cifuentes et al. (2000). Espinosa (2009) evaluó la calidad biológica en fuentes de suministro a la población del Valle del Mezquital, uno de los organismos seleccionados fue Giardia spp., que se detectó en todas las norias y uno de los manantiales analizados. 16 3. JUSTIFICACIÓN Las enfermedades infecciosas intestinales continúan siendo una de las principales causas de morbilidad en el estado de Hidalgo (SSH, 2014). El Valle de Tula, en el estado de Hidalgo, ha recibido agua residual no tratada de la Ciudad de México por más de 100 años (Navarro et al., 2011). Ésta agua es utilizada para el riego del 60% de los cultivos agrícolas (Palacio-Prieto, 1994), de la cual, la mitad se infiltra a los acuíferos (Jiménez et al., 2000) de donde posteriormente se extrae el agua para consumo humano (Espinosa, 2009; Chávez et al., 2011). Lesser-Carrillo y colaboradores (2011) calcularon para un área de balance en el Valle de Mezquital una infiltración por lluvia de 15.8 Mm3/año, retornos de riego de 69 Mm3/año y una infiltración por canales de 80.2 Mm3/año. Mucho se ha debatido acerca del impacto potencial de contaminación en el acuífero proveniente de esta recarga de agua residual; por consiguiente, es necesario caracterizar el agua a partir de la presencia de C. parvum y G. lamblia desde la Ciudad de México hasta la zona de reutilización del agua y las fuentes de abastecimiento para evaluar el riesgo potencial a la salud que esto representa (Salgot de Marcay, 2005; Espinosa, 2009). De manera simultánea, C. parvum y G. lamblia no han sido registrados en trabajos en la zona del Mezquital. Considerando la capacidad de sobrevivencia en el ambiente y el corto tiempo en el que éstos parásitos transmiten enfermedades, así como sus bajas dosis infecciosas, el conocer el aporte diferencial de ambas especies provenientes del sistema urbano apoya los estudios sobre presencia de protistas patógenos en agua que son fundamentales para conocer la epidemiología de algunas enfermedades que se transmiten por este medio y que afectan a distintas poblaciones en el mundo (Jiménez et al., 2002; Carmena et al., 2007; Betancourt y Querales, 2008; Espinosa, 2009), además de obtener datos útiles en temas de salud pública con el objetivo de mejorar las estrategias de gestión y manejo de los recursos hídricos. 17 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo general Determinar los cambios en las densidades de ooquistes de Cryptosporidium parvum y quistes de Giardia lamblia en agua a lo largo de la trayectoria desde la Ciudad de México al Valle del Mezquital, Hidalgo. 4.2. Objetivos particulares Detección de ooquistes de Cryptosporidium parvum y quistes de Giardia lamblia en agua residual y subterránea a partir de la técnica de microscopia de inmunoflorescencia utilizando anticuerpos monoclonales. Evaluar los cambios en la densidad de (oo)quistes en la trayectoria del sistema urbano al sistema agrícola, así como sus variaciones temporales. Comparar los cambios en la densidad de (oo)quistes entre los distintos tipos de agua. 5. SITIO DE ESTUDIO El Valle del Mezquital, también llamado Valle de Tula (Figura 4), se localiza en la parte suroccidental del estado de Hidalgo, a 80 km al norte de la Ciudad de México (Jiménez et al., 2005; Jiménez y Chávez, 2004). Geográficamente se encuentra entre los paralelos 19°30’ y 20°22’ de latitud norte y entre los meridianos 98°56’ y 99°37’ de longitud oeste (Lesser-Carrillo et al., 2011). 18 Figura 4. Zona de estudio y ubicación de los sitios de muestreo desde la Ciudad de México al Valle del Mezquital, Hidalgo. Presa Endhó Valle del Mezquital Hidalgo Distrito Federal Estado de México Río El Salto Presa Requena Río Tula HA HB PB LICU STLA CCOL NOR PZ POZO LAV ES EE AUTOR María Teresa Castañón Martínez Laboratorio Nacional de Ciencias de la Sostenibilidad FUENTE Datum............. NAD27 Elipsoide......... GRS 1980 Zona UTM........ número 14 Polígono de cuerpos de agua. Red hidrográfica escala 1: 50 000 edición: 2.0. INEGI, 2010. Polígono de estados. División Política Estatal 2012 edición 5. INEGI, 2014. Polígono de cuerpos de agua. CONAGUA-SIGA, 1995. Polígono de distritos de riego. Distritos de Riego de la República Mexicana, CONAGUA-SIGA, 1995. Ríos. Ríos principales, CONAGUA-SIGA, 1999. 19En esta zona se encuentran los distritos de riego más importantes del país (Cifuentes et al., 1994) y destaca por ser el área con mayor extensión territorial en el mundo regada con agua residual (Mara y Cairncros, 1989; Cifuentes et al., 1994; Gutiérrez-Ángeles y Silva de la Rosa, 1998; Jiménez y Chávez, 2004; Siemens et al., 2008; Cortés-Ortiz, 2011). La zona de riego abarca aproximadamente 90 000 ha y comprende los Distritos de Riego 03 (Tula), 100 (Alfajayucan) y 25 (Ixmiquilpan) (Jiménez et al., 2005; Navarro et al., 2011). La superficie irrigada ha aumentado de manera continua desde finales del siglo pasado, cuando los distritos de riego iniciaron su operación (Figura 5) (Palacio-Prieto, 1994) y continúa su expansión. Figura 5. Crecimiento del área bajo riego en los distritos 03 y 100 (Palacio-Prieto, 1994). El clima de la región es templado sub-árido con temperatura media anual de 17°C, una precipitación de 550 mm y evapotranspiración de 1750 mm; por estas condiciones climatológicas, el Valle de Tula carece de agua para la agricultura (Jiménez et al., 2005; Chávez et al., 2011). A finales del siglo XVIII las aguas de la Ciudad de México empezaron a ser enviadas a esta zona con el doble propósito de desalojar el agua residual y los excedentes de agua de lluvia para evitar inundaciones (Jiménez et al., 2005). Aunque existen reportes de riegos localizados desde 1896 a partir del río Salado en Tlaxcoapan, Tlalhuelilpan y Mixquiahuala (Jiménez et al., 2005; Navarro et al., 2011), de 20 manera oficial el agua en el Valle de Tula comenzó a ser aprovechada para el riego en 1912 (Cruz-Campa, 1965). Actualmente, la industria y la agricultura son las principales actividades económicas en la región; el cultivo de maíz y alfalfa se ven representados de 60 a 80%, dependiendo del ciclo agrícola. En segundo término se cultiva avena, cebada, frijol, y en menor proporción trigo y hortalizas como chile, calabacita y betabel (Jiménez et al., 2005; Pérez et al., 2009). Debido a la asombrosa mejora en la economía de la región por el uso de agua negra, a partir de 1920, se decidió crear nueva infraestructura que regulara su flujo y distribución para la agricultura (Jiménez et al., 2005); así, la Ciudad de México drena su agua residual hacia el Valle del Mezquital a través de los llamados Gran Canal de Desagüe, Interceptor Poniente y Emisor Central (Lesser-Carrillo et al., 2011). El agua residual para el riego se distribuye a través de un sistema complejo de canales y presas en donde aproximadamente 204 km (81% de los canales principales y 52% de los canales laterales) no poseen un revestimiento (CONAGUA, 1998; Silva-Castro, 2008), esto ocasiona una recarga incidental en el acuífero local que ha sido estimada en 25 m3/s, es decir, más de 13 veces su recarga natural (Foster et al., 1994; Jiménez et al., 2000). Jiménez y colaboradores (1997) reportaron que el nivel piezométrico del agua del subsuelo se ha elevado tanto que en sitios donde antes se encontraba a 50 m de profundidad, hoy aflora agua en nuevos puntos como manantiales con flujos de 40 hasta 600 L/s. Estudios geohidrológicos en el acuífero, impacto de metales en sedimentos, contaminación en agua subterránea por infiltración de aguas negras y contaminación de agua superficial, suelos, sedimentos y vegetales irrigados con agua residual son algunos ejemplos de las numerosas investigaciones que se han llevado a cabo en la zona del Mezquital (Cifuentes et al., 2000; Jiménez y Chávez, 2004; Jiménez et al., 2005; Chávez et al., 2011; Lesser-Carrillo et al., 2011). 21 6. MÉTODOS 6.1. Métodos de campo Se realizó un muestreo en 14 sitios (Tabla 2), desde un sistema de abastecimiento urbano en el Distrito Federal hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo durante tres temporadas: cálida-seca (mayo de 2011), fría-seca (diciembre de 2011) y lluvias (junio 2012). Las temporadas fueron asignadas de acuerdo a los datos anuales de temperatura y precipitación reportados por el Sistema Meteorológico Nacional (SMN, 2012), incluyendo sistemas de agua residual y de agua subterránea. Los sitios muestreados comprenden dos hospitales de especialidad ubicados al sur de la Ciudad de México, los cuales fueron punto de partida para evaluar el agua subterránea de la red con la que se abastecen, seguido de la planta de bombeo Churubusco Lago localizada en el oriente de la ciudad, que se encarga de bombear aproximadamente 26 m3/s de agua residual hacia el río de la Compañía que más adelante se incorpora al Gran Canal de Desagüe. Posteriormente se analizaron distintos puntos en el Valle del Mezquital que incluyen un vertedero, un canal y una presa con agua residual, además de agua subterránea obtenida de distintas fuentes como un manantial, pozo, noria y piezómetro de la zona. Tabla 2. Sitios de muestreo en el trayecto de la Ciudad de México al Valle del Mezquital, Hidalgo. Sitio de muestreo Clave Tipo de agua Volumen colectado Hospital A entrada HA ENT Subterránea 10 L Hospital A salida HA SAL Residual 1 L Hospital B entrada HB ENT Subterránea 10 L Hospital B salida HB SAL Residual 1 L Planta de bombeo PB Residual 1 L Licuadora LICU Residual 1 L El Salto-Tlamaco STLA Residual 1 L 22 Cerro Colorado CCOL Subterránea 10 L Presa Endhó entrada EE Residual 1 L Presa Endhó salida ES Residual 1 L La Virgen LAV Subterránea 10 L Pozo Tlahuelilpan POZO Subterránea 10 L La Noria (Rancho las Palmas) NOR Subterránea 10 L Piezómetro PZ Subterránea 10 L Para los sitios con agua residual se tomaron muestras de un litro por triplicado en frascos de polipropileno (Nalgene, Massachusetts) previamente esterilizados por autoclave 120°C/15-20 min (APHA, 2005). En los sitios donde se extrae agua subterránea se colectaron 10 L en bidones de polipropileno (Nalgene, Massachusetts), previamente esterilizados (120°C/15-20 min), las muestras fueron transportadas al laboratorio a 4°C para su posterior concentración. 6.2. Métodos de laboratorio 6.2.1. Concentración de la muestra 6.2.1.1 Ultrafiltración Las muestras de 10 L fueron concentradas por medio de la técnica de ultrafiltración (Hill et al., 2005) modificada por Polaczyk y colaboradores (2008). Para ello se utilizaron filtros de polisulfona F80A (Fresenius, Medical Care, Lexington, MA) en un sistema de filtración de flujo continuo de 1700 mL/min que se logró con una bomba peristáltica (Masterflex, Cole- Parmer Instrument Company, Illinois). Previamente, los filtros fueron bloqueados promoviendo cargas electronegativas en las fibras de polisulfona por medio de la recirculación de una solución de polifosfato de sodio (1g de NaPP/L) por 30 minutos para evitar la adsorción de microorganismos en las fibras de polisulfona. Posteriormente a cada muestra se le agregó directamente 1 g de NaPP por cada litro de agua como disgregante. Cada muestra se concentró a un volumen de 100 mL aproximadamente. 23 6.2.1.2 Centrifugación Quince mililitros de los concentrados obtenidos mediante la ultrafiltración se centrifugaron a 3,000 rpm por 15 minutos. El pellet obtenido se resuspendió en 3 mL de PBS (solución buffer de fosfato) estéril al 1% y se separó en tres partes iguales (≈1 mL) para el procedimiento posterior. En el caso del agua residual las muestras fueron concentradas solo por centrifugación como se describió anteriormente. 6.2.1.3 Detección y cuantificación de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia por inmunofluorescencia La detección de ooquistes de Cryptosporidium parvum y quistes de Giardia lamblia se realizó por el método de inmunoflorescencia indirecta en fase líquida de acuerdo con la técnica modificada por Rangel-Martínez (2010) y Tapia-Palacios (2012). 1 ml de la muestra concentrada o directa y el control positivo (Merifluor Cryptosporidum/Giardia.Meridiam Bioscience, Inc.) fueron centrifugados durante 5 minutos a 5000 rpm para a continuación bloquear el concentrado con 500 µL de albúmina sérica bovina (BSA) (Amresco) al 1% en PBS. Después de una incubación a temperatura ambiente por hora y media se procedió a colocar 5 µL del primer par de anticuerpos (mouse monoclonal IgG Anti-Cryptosporidium parvum 7 631; mouse monoclonal IgG3 Anti-Giardia lamblia BDI27. Santa Cruz Biotecnology), para dejar incubando a 4°C durante toda la noche. Al día siguiente, a las muestras se les colocó 2.5 µL del segundo anticuerpo (anticuerpo conjugado con fluorosceína, AffiniPuse Rabbit Anti-mouse IgG, Jacobson Inmuno Research) que posteriormente se incubó a 37°C por hora y media en obscuridad. Una vez pasado este tiempo, se colocaron 5 µl de ioduro de propidio (Santa Cruz Biotecnology) y se incubó nuevamente a 37°C por 30 minutos. El montaje de las muestras se realizó (protegido de la luz) en un portaobjetos, colocando 15 µL de la muestra en cada 'pozo' previamente etiquetado sobre el cristal para facilitar su observación. Esto se dejó secar a temperatura ambiente y se agregó una gota de medio de montaje (40% Tris Buffer Saline/ 60% Glicerol) a cada 'pozo'. 24 6.2.1.4 Conteos de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia Se observaron y cuantificaron las formas esféricas de los ooquistes de C. parvum (4-6 µm) y los quistes ovalados de G. lamblia (8-12 µm), ambos con una coloración verde manzana, en un microscopio de fluorescencia Axiostar Plus (Carl Zeiss, Gottingen, Germany). Se revisó por completo cada placa siguiendo el barrido propuesto (Figura 6) en el trabajo de Tapia- Palacios (2012). Con un aumento de 20X y 40X se examinaron las muestras. Figura 6. Esquema del barrido total de los 'pozos' de una muestra (Tapia-Palacios, 2012). 6.3. Análisis de datos Utilizando el programa Microsoft Office Excel 2007 se integró una base de datos con el resultado de los conteos y se examinaron las principales características de los mismos. Por medio del paquete estadístico Statgraphics XVII-X64 se realizaron gráficos de caja y bigotes, así como pruebas de Kruskal-Wallis para comparar la concentración de (oo)quistes de las muestras entre sitios y temporadas. Dada la variación en los conteos de microorganismos, estos datos fueron transformados a logaritmo base 10. De manera complementaria, para el análisis estadístico, se utilizaron gráficos de interacciones con el propósito de conocer si la combinación de factores como la temporalidad, el tipo de agua y el sitio de muestreo poseen alguna influencia en la concentración de los microorganismos. Para probar formalmente la significancia de las diferencias por y entre factores se recurrió a un ANOVA Multifactorial (Netter et al., 2005); el programa R fue utilizado para estos análisis que se elaboraron bajo la supervisión 25 del Dr. Carlos Díaz Ávalos del Instituto de Investigaciones en Matemáticas Aplicadas y en Sistemas (IIMAS) de la UNAM. 7. RESULTADOS 7.1. Detección de Cryptosporidium parvum y Giardia lamblia Se procesaron un total de 114 muestras, de las cuales 63 (55%) fueron de agua residual y 51 (45%) de agua subterránea. Se observaron los ooquistes de C. parvum y quistes de G. lamblia a través de la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Los (oo)quistes presentan una característica coloración verde manzana, en tanto el fondo se observa de un contrastante color rojo (Figura 7) debido al ioduro de propidio, el cual se intercala con el material genético y hace que el detritus orgánico fluoresca. En ambos tipos de agua y en las distintas temporadas se detectó la presencia de protistas parásitos. Del total de las muestras procesadas para agua residual, 55 que representan el 87% presentó alguna de las dos especies. El 44% de ellas fueron positivas para C. parvum y el 43% de las muestras fueron positivas para G. lamblia. Para agua subterránea la prevalencia fue del 14%. El 10% (5) de las muestras fueron positivas para C. parvum y el 4% (2) para G. lamblia. El número de muestras positivas para C. parvum fue mayor con respecto a las de G. lamblia tanto en agua residual como subterránea. En general, la temporada cálida-seca presentó una prevalencia mayor de muestras positivas (13) en los triplicados en relación a las otras temporadas (Tabla 3). Más adelante se mostrará un análisis por temporada para cada especie de estudio. 26 Figura 7. a) Quiste ovalado de G. lamblia (8-12µm) con 200 aumentos. b) Quistes de G. lamblia a 400 aumentos en muestras de agua subterránea. c) Quistes de G. lamblia y ooquiste redondo de C. parvum (4-6 µm) en una muestra de agua residual. d) Control positivo con 400 aumentos. a b. 40x c. 40x d. 40x a. 20x 10 µm 27 Tabla 3. Presencia-ausencia de (oo)quistes en las temporadas de muestreo. (+): presencia de (oo)quistes, (-): ausencia de (oo)quistes, (sm): sin muestra. Temporada cálida-seca (2011) Temporada fría-seca (2011) Temporada de lluvias (2012) Sitio Clave Cryptosporidium parvum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Giardia lamblia Hospital A entrada HA ENT - - - - - - Hospital A salida HA SAL + + + + - + Hospital B entrada HB ENT - - - - - - Hospital B salida HB SAL + + - + - - Planta de Bombeo PB + + + - + + Licuadora LICU + + + + + + El Salto Tlamaco STLA + + + + - - Presa Endhó entrada EE + - - - + + Presa Endhó salida ES + + - - - - Cerro Colorado CCOL - - - - - - La Virgen LAV Sm sm - - - - Pozo Tlahuelilpan POZO Sm sm - - + - La Noria NOR Sm sm + + + - Piezómetro PZ Sm Sm - - - - 28 7.2. Concentración de (oo)quistes en agua residual y subterránea 7.2.1. Variación en la concentración de (oo)quistes por sitio Como se mencionó anteriormente, los protistas parásitos fueron detectados en ambos tipos de agua. Las figuras 8 y 9, muestran las concentraciones de (oo)quistes para cada uno de los sitios. Para agua residual, la mayor concentración de ooquistes de C. parvum se detectó en STLA, superando las cuatro unidades logarítmicas (Figura 8); con 1.6x104 ooquistes/L en la temporada cálida-seca y 1.5x104 ooquistes/L en la fría-seca. En la temporada de lluvias, el sitio con la mayor carga parasitaria (LICU) presentó 5x103 ooquistes/L. En al menos una temporada, todos los sitios muestreados de agua residual presentaron ooquistes. HA ENT, HB ENT, CCOL, LAV y PZ fueron los sitios con agua subterránea en los que no se detectaron ooquistes durante el periodo estudiado, mientras que en POZO y NOR se pudieron cuantificar cargas parasitarias de hasta 500 ooquistes/L. Figura 8. Variación espacial del número de ooquistes de C. parvum en los sitios de muestreo desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo. 29 Al igual que C. parvum, todos los sitios de agua residual muestreados en este estudio presentaron quistes de G. lamblia en al menos una temporada (Figura 9). Las concentraciones de quistes en este tipo de agua alcanzaron las tres unidades logarítmicas. La mayor densidad de microorganismos varío entre temporadas: 7x103 quistes/L en la temporada cálida-seca (HA SAL), 8x103 quistes/L en la fría-seca (STLA) y 5x103 en lluvias (LICU). De los siete sitios muestreados para agua subterránea, solo en NOR fueron detectadas cargas parasitarias de 500 quistes/L. Figura 9. Variación espacial del número de quistes de G. lamblia en los sitios de muestreo desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo. La comparación de muestras con la prueba de Kruskal-Wallis, tanto para C. parvum (P= 1.61x10-9) como para G. lamblia (P= 7.03x10-10), indicó que la diferencia en la concentración de (oo)quistes entre sitios es estadísticamente significativa (P <0.05). 7.2.2. Variación en la concentraciónde (oo)quistes por temporada 30 Para identificar si existe un patrón estacional con los datos obtenidos en este estudio, en las figuras 10 y 11 se muestran gráficos de caja y bigotes para la concentración total de (oo)quistes por temporada. De acuerdo con la prueba de Kruskal-Wallis para las concentraciones de ooquistes de C. parvum, se encontró que existe una diferencia estadísticamente significativa (P= 0.022) entre el comportamiento de los datos por temporada. Se puede observar (Figura 10) que la concentración de ooquistes en la temporada de lluvias es menor que en la época cálida- seca y fría-seca. Figura 10. Variación temporal de la concentración de ooquistes de C. parvum en los sitios de muestreo desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo. En cuanto a la comparación entre temporadas para las concentraciones de quistes de G. lamblia, la prueba de Kruskal-Wallis no presentó diferencias significativas (P= 0.463), es decir, los datos obtenidos en este estudio se comportaron de manera similar sin seguir un patrón estacional específico (Figura 11). 31 Figura 11. Variación temporal de la concentración de quistes de G. lamblia en los sitios de muestreo desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo. 7.3. Factores condicionales sobre la concentración de (oo)quistes Para comprobar la influencia de factores sobre la concentración de microorganismos en las muestras, los resultados obtenidos en el ANOVA multifactorial indicaron que los conteos de ooquistes de C. parvum mostraron diferencias significativas en relación con el tipo de agua y la temporada (P < 0.008), mientras que las concentraciones de quistes de G. lamblia solo mostraron diferencias significativas por tipo de agua (P < 0.01). Es decir, éstos factores son los que tuvieron mayor influencia sobre el número de (oo)quistes encontrado. Las figuras 13 y 14 también fueron trabajadas en escala logarítmica para poder apreciar mejor los detalles gráficos. En éstas se muestra cómo la combinación de factores tiene un efecto sobre la concentración media de los (oo)quistes, es decir, que el comportamiento de la densidad de microorganismos cuantificados dependerá del sitio y la temporada en la que se encuentre, sugiriendo una interacción. De manera física y en términos de flujo, con apoyo del diagrama generado por Siebe (en proceso) y Fonseca y colaboradores (2015) 32 (Figura 12), las interacciones encontradas en este estudio pueden ser explicadas en los sitios cuyas aguas muestran conexión en el sistema. Con C. parvum, se observaron diferencias en el comportamiento de ooquistes en LICU, STLA y POZO; para el caso de la concentración de quistes de G. lamblia, HB SAL, PB, LICU y STLA fueron los sitios que presentaron interacciones. Cabe mencionar que los sitios en donde se detectaron interacciones pero cuyos flujos de agua no tenían una relación directa, no fueron tomados en cuenta. Figura 12. Esquema del flujo de agua en los sitios de muestreo desde la Ciudad de México hasta el Valle del Mezquital, Hidalgo (Modificado de Siebe (en proceso) y Fonseca et al., 2015). PB LICU POZO HB STLA 33 Figura 13. Gráfica de interacción entre el sitio de muestreo y la temporada para el logaritmo de la concentración media de ooquistes de C. parvum en las muestras de agua. Figura 14. Gráfica de interacción entre el sitio de muestreo y la temporada para el logaritmo de la concentración media de quistes de G. lamblia en las muestras de agua. . 34 El agua residual y subterránea representan categorías independientes. El análisis de interacción entre el tipo de agua y la temporalidad mostró diferencias significativas en ambas especies (Figuras 15 y 16). En el agua subterránea, las concentraciones de (oo)quistes fueron similares para las tres temporadas apenas rebasando un logaritmo de la concentración media en las muestras; para el caso del agua residual, los conteos se invirtieron e incrementaron, alcanzando mayores concentraciones en la temporada cálida- seca. Éstas graficas complementan la perspectiva de temporalidad mencionada anteriormente en donde la mayor prevalencia de parásitos protozoarios se encontró en el mes de mayo, aunque solo para C. parvum la diferencia de concentración de ooquistes entre temporadas fueron significativas. 35 Figura 15. Gráfica de interacción entre el tipo de agua y la temporada para el logaritmo de la concentración media de ooquistes de C. parvum en las muestras. Figura 16. Gráfica de interacción entre el tipo de agua y la temporada para el logaritmo de la concentración media de quistes de G. lamblia en las muestras. 36 8. DISCUSIÓN Las prevalencias de (oo)quistes que se obtuvieron en este trabajo (44% para C. parvum y 43% para G. lamblia) son similares a las reportadas por Cháidez y colaboradores (2005) y Soto y colaboradores (2004), para un sistema de riego en Sinaloa con condiciones similares a las del Valle del Mezquital. Trabajos previos han mencionado que la alta prevalencia de estas especies se ve reflejada en el carácter endémico que presentan las infecciones por Cryptosporidium spp. y G. lamblia (Sánchez-Vega et al., 2006; Cedillo- Rivera et al., 2009; Gerba y Choi, 2009), tanto en zonas rurales como urbanas de México. De acuerdo con nuestros análisis en agua subterránea, el 10% de las muestras fueron positivas a C. parvum y el 4% a G. lamblia. En Chihuahua, Olivas y colaboradores (2013) evaluaron de manera simultánea la presencia de éstos patógenos en agua proveniente de pozos encontrando que el 50% y 44% de las muestras fueron positivas para C. parvum y G. lamblia, respectivamente. De igual manera González (2005), Smith y colaboradores (2006) y Reyes-Almodovar (2009) han detectado estos microorganismos en fuentes de abastecimiento. Los conteos más altos de (oo)quistes de C. parvum y G. lamblia se observaron en el sitio STLA, debido a que éste se caracteriza por ser uno de los principales canales de riego y concentración de agua residual que proviene de las descargas de la Zona Metropolitana de la Ciudad de México (ZMCM). El aumento en las concentraciones de quistes y ooquistes en el agua se puede asociar a lugares en donde se descarga agua residual (LeChevallier et al., 1991; Ong et al., 1996; EPA, 2000; Wilkes et al., 2009), así como a la presencia de ganado y otros mamíferos en la zona que contribuyen o incrementan la aportación de estos parásitos (Bodley-Tickell et al., 2002; Solarte et al., 2006; Ruecker et al., 2007, Castro-Hermida et al., 2009). En diversos trabajos (Kemp et al., 1995; Ong et al., 1996; Bodley-Tickell et al., 2002) se detectó que los mayores niveles de concentración de (oo)quistes se obtuvieron en muestras de agua que fueron colectadas después de ranchos y zonas de pastoreo, sugiriendo que la escorrentía en estas áreas contaminaba las aguas superficiales, lo que apoya nuestros resultados pues la zona aledaña al sitio STLA es 37 utilizada como campo de pastoreo, incluso es posible observar cómo el ganado se encuentra en contacto directo con agua proveniente del canal. La presencia de (oo)quistes en el agua subterránea analizada en este trabajo sugiere la contaminación potencial del acuífero. Los pozos y las norias cuentan con infraestructura apropiada como fuentes de suministro de agua. Se diferencian por las profundidades que alcanzan, los pozos entre 50-450 m y las norias entre 3-40 m, considerándose sistemas más superficiales (Gutiérrez y Silva de la Rosa, 1998; Espinosa, 2009). Por sus características de construcción y mantenimiento, los pozos en el Valle del Mezquital presentan un riesgo de contaminación bajo (Espinosa, 2009). Sin embargo, en el sitio POZO se detectaron hasta 500 ooquistes/L de C. parvum en una de las temporadas, esto puede debersea que éste pozo en particular tiene poca profundidad (8 m) pues se ubica en la zona urbana de Tlahuelilpan y es abastecido directamente del acuífero más superficial el cual posee mayor probabilidad de presentar microorganismos patógenos. Del Arenal (1985) y Lesser y colaboradores (2011) además de identificar distintos horizontes acuíferos, observaron que la recarga de agua se lleva a cabo mediante el flujo procedente del sur y la infiltración en la zona del Mezquital a partir de retornos de riego y pérdidas de canales. De esta forma, las características del patógeno, como la forma, el tamaño microscópico de los ooquistes y su baja gravedad específica, facilitan su diseminación en agua (Gajadhar y Allen, 2004; Cox et al., 2005; Wilkes et al., 2009; Olivas et al., 2013) y posterior infiltración. La detección de C. parvum y G. lamblia en una fuente de abastecimiento como la Noria (NOR) puede ser explicada por la mayor vulnerabilidad que posee al ubicarse dentro de una zona de riego con agua residual. Por lo tanto, al ser un cuerpo de agua más superficial y poseer menos protección, se encuentra expuesto a los contaminantes presentes en ésta agua (residual). A partir de un estudio en el que se incluye una inspección sanitaria, muestreo con identificación y cuantificación de organismos y finalmente el establecimiento de riesgo sanitario, Espinosa (2009) señala que las norias en el Valle de Tula presentan valores de riesgo de contaminación de intermedios a altos. 38 Por otra parte, Landa-Cansigno (2009) evaluó la adsorción de G. lamblia en suelos de tipo Feozem en el Rancho ‘Las Palmas’ (área en donde se localiza nuestro sitio de muestreo ‘NOR’) encontrando que este tipo de suelo, con altas proporciones de arcilla y materia orgánica, mostró una menor retención del parásito por lo que se aumenta el riesgo de la migración de microorganismos al acuífero. La densidad de (oo)quistes detectados en el agua de ambos sistemas de abastecimiento (POZO y NOR) rebasaron las dosis infecciosas reportadas para C. parvum y G. lamblia (30 a 132 ooquistes/L y 25 a 100 quistes/L, respectivamente), cabe mencionar que ninguno de éstos sitios recibe cloración por lo que el uso de ésta agua representa un riesgo potencial de infección para la población que se encuentra expuesta (Gerba y Choi, 2009; Balderrama-Carmona et al., 2012; SSH, 2014). La variación de la concentración de (oo)quistes entre los sitios muestreados resultó ser estadísticamente significativa (P <0.05) para ambas especies de protistas patógenos, esto puede ser explicado por la heterogeneidad espacial del sistema (Wilkes et al., 2009) pues no existe una única fuente de aportes a lo largo de la trayectoria desde la Ciudad de México al Valle del Mezquital. Por lo mismo, el origen de cada especie es una característica biológica que también puede influir en la diferencia de concentración de (oo)quistes entre cada sitio (Cox et al., 2005; Wilkes et al., 2009); Madore y colaboradores (1987) y Ongerth y Stibbs (1987), por ejemplo, realizaron estudios en aguas superficiales de Washington, California y Arizona, donde reportaron que en sitios donde predomina la escorrentía de las industrias y ciertas zonas de pastoreo, la densidad de ooquistes de Cryptosporidium spp. es entre 1.5 y 1.9 veces mayor que en aguas donde solo se vierte agua residual doméstica. Para el caso de G. lamblia, se ha observado que la prevalencia de este organismo es mayor en zonas urbanas que en las poblaciones rurales (Fraser, 1994). En este estudio, se analizó el comportamiento de las concentraciones de (oo)quistes por temporada. La diferencia significativa entre la densidad de ooquistes de C. parvum encontrada mediante una prueba de Kruskal-Wallis, indica que existe un patrón de 39 temporalidad en la detección de este organismo durante el periodo estudiado. Así que para este conjunto de datos, la mayor concentración de ooquistes en la temporada cálida- seca puede ser explicada por el efecto de concentración por evaporación en esta época (LeChevallier et al., 2000; Castro-Hermida et al., 2009); mientras que la disminución significativa de ooquistes para la temporada de lluvias pudo deberse a un efecto de dilución suscitado por los eventos de precipitación que estuvieron marcados en la ZMCM (Wilkes et al., 2009; SMN, 2012). El comportamiento en la densidad de ooquistes de C. parvum reportado para la temporada cálida-seca coincide con patrones estacionales observados en otros trabajos (LeChevallier et al., 2000; Rangel et al., 2015) donde las altas concentraciones se presentan de marzo a mayo y las más bajas durante los meses de verano (junio-julio). En ese periodo de alta prevalencia, también se ha comprobado que aumenta la dispersión por aire de (oo)quistes a partir de los suelos regados con agua residual (Doyle et al., 2012; Balderrama-Carmona et al., 2014). De manera contraria a C. parvum, las concentraciones de G. lamblia obtenidas en este estudio no presentaron diferencias significativas entre temporadas por lo que sin importar la época, los datos tienden a comportarse de la misma manera. Al tratarse de un sistema que continuamente se encuentra recibiendo descargas, esto podría ser explicado por la adhesión de quistes a las superficies sólidas ya que la hidrofobicidad y cargas superficiales de G. lamblia (Dai et al., 2004) permitirían que este protista sea transportado fácilmente junto a los sólidos totales disueltos (STD) presentes en el agua (Rangel-Martínez et al., 2015) que generalmente se encuentran por encima del límite máximo permisible (Lesser- Carrillo et al., 2011). Resultados similares obtuvo Ongerth (1989) en un estudio realizado en aguas superficiales del Pacifico Noreste, donde observó que los quistes de G. lamblia se mantenían a una concentración constante a pesar de la variación estacional; el autor menciona que la persistencia de quistes en el agua podría depender de las poblaciones animales en la zona y de la ubicación de sus puntos de muestreo. Otros autores, a diferencia de los resultados 40 obtenidos en este trabajo, sí han identificado patrones estacionales en la detección de este parásito para distintas fuentes de agua, observando altas concentraciones en primavera y verano (LeChevallier et al., 2000; Amahmid et al., 2002; Castro-Hermida et al., 2009; Chávez et al., 2011) y otoño (Wilkes et al., 2009). Los datos obtenidos en este estudio complementan la perspectiva de temporalidad para diferentes microorganismos patógenos. Pues, en general, los mayores conteos de bacterias indicadoras son reportados para la temporada cálida-seca (Noguez, 2012; Tapia- Palacios, 2012) mientras que la prevalencia en virus ocurre durante la temporada fría-seca (Fonseca, 2010). Con la finalidad de incrementar el conocimiento acerca de la distribución de los parásitos protozoarios, así como los patrones de concentración de (oo)quistes de acuerdo a la temporalidad, LeChevallier y colaboradores (2000) sugieren monitoreos a largo plazo. Las interacciones identificadas en este estudio muestran de manera específica en qué lugar las concentraciones de (oo)quistes se ven influenciadas por la combinación entre el sitio y una temporalidad determinada. Los flujos de agua en el sistema también proporcionan parte de esta información. Dependiendo la temporada en que se encuentran, el logaritmo en la concentración media de (oo)quistes varió en LICU, STLA y POZO (para C. parvum) y HB SAL, PB, LICU y STLA (para G. lamblia). Los cambios más notables en las interacciones detectadas ocurrieron en LICU y STLA para ambas especies de patógenos, esto puede deberse a que éstos lugares no solo reciben descargas provenientes de la ZMCM sino que en ellos se mezclan aportes de varios canales y de las actividades económicas de la zona como clínicas, áreas comerciales, institucionales, y recreativas(Cortés-Ortiz, 2011), desechos agroquímicos, residuos generados por el ganado, productos veterinarios e incluso hidrocarburos de la refinería de Tula, por lo que la temporalidad juega un papel determinante en los periodos en que se llevan a cabo estas actividades. 41 Al considerar la interacción que se presentó entre los tipos de agua (subterránea y residual) y la temporalidad para ambos organismos, se puede sugerir que los efectos estacionales son perceptibles principalmente para corrientes de agua que circulan a nivel superficial (Jiménez et al., 2005). Olivas y colaboradores (2013) señalan que los sitios con agua subterránea que abastecen a la población poseen menor probabilidad de contaminarse que cuando se trata de cuerpos superficiales como canales o presas, los cuales distribuyen la mayor cantidad de agua en nuestra zona de estudio. Esto debido a la mayor vulnerabilidad que posee el agua superficial a la contaminación directa por las descargas de agua residual y la escorrentía (EPA, 2000; EPA, 2001). Actualmente, México no cuenta con alguna norma que exija la evaluación microbiológica del agua en relación al riesgo para la salud que representan los protistas patógenos (Balderrama-Carmona et al., 2012), lo que pone una barrera al conocimiento de la verdadera exposición de las poblaciones a estos microorganismos. Como consecuencia, no se obtienen suficientes elementos para implementar acciones dirigidas al control de los mismos (Rangel et al., 2015). 9. CONCLUSIONES Los análisis en la detección de (oo)quistes mostraron la presencia de éstos en agua residual y subterránea. El canal Salto Tlamaco (STLA) y Licuadora (LICU) son sitios prioritarios por la alta concentración de patógenos que presentan en el agua que es transportada a lo largo del sistema. Además de que en ambos sitios, la diferencia en sus concentraciones se vio condicionada a la temporada y al flujo de agua en la zona. Cada sitio analizado que presentó (oo)quistes, rebasó con sus cargas parasitarias las dosis infecciosas medias (DI50) reportadas, traduciéndose en un riesgo potencial a la salud para la población que se encuentra expuesta a este líquido. A pesar de que el agua subterránea en POZO y NOR no es utilizada para consumo humano, nadie regula el uso que se le da en 42 estos sitios. Es recomendable hacer una evaluación de exposición de la población así como de las vías de transmisión. La estacionalidad y el tipo de agua, así como el flujo de este líquido en el sistema son factores de importancia ya que afectan directamente la densidad de C. parvum y G. lamblia en agua. Las concentraciones de C. parvum en el sistema mostraron un patrón de temporalidad en el que la mayor densidad se presentó en la temporada cálida-seca, aumentando la probabilidad de estar en contacto con este protozoario. Las concentraciones de G. lamblia en cada temporada se mantuvieron constantes, sin mostrar algún patrón estacional. Este trabajo nos ayuda a comprender la importancia del tratamiento de agua, a niveles en los cuales ésta sea segura en términos de las cargas parasitarias presentes, con el fin de minimizar el riesgo de infección por el uso de agua residual cruda y parcialmente tratada en la zona. De esta forma, el volumen y la frecuencia de aplicación de estas aguas deben ser mejor regulados a fin de evitar un problema de salud en la población. Además, los análisis presentados en este estudio aportan información actualizada que puede ser utilizada por las autoridades sanitarias a fin de enfocar acciones y programas de monitoreo microbiológico. Un monitoreo constante, el establecimiento de puntos control, así como la realización de estudios complementarios de viabilidad de los protistas patógenos son necesarios para la prevención de brotes y episodios frecuentes de infecciones que sean producidas por C. parvum y G. lamblia. 43 REFERENCIAS IV-EUA, Encuentro Universitario del Agua. 2012. El agua. <http://www.agua.unam.mx/ivagua/index.html> Consultado el 30 de octubre de 2012. Abreu, N., M. Delgado, A. Ortega, A. del Castillo, E. Aguiar y B. Valladares. 2002. Presencia de Giardia lamblia y Cryptosporidium spp. en aguas residuales depuradas reutilizadas para riego agrícola en la isla de Tenerife, España. Efectos del transporte a larga distancia sobre la calidad del agua reutilizada. Revista Salud Ambiental 2(1): 2-7. 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