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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE GEOLOGÍA
Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas
aisladas del agua y de la piel del ajolote (Ambystoma mexicanum) en la
zona lacustre de Xochimilco, México.
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL)
PRESENTA:
ANA PATRICIA GARCÍA GARCÍA
TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. IRMA AURORA ROSAS PÉREZ
CENTRO DE CIENCIAS DE LA ATMÓSFERA
COMITÉ TUTOR: DR. RICARDO OROPEZA NAVARRO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
DRA. GRACIELA CASTRO ESCARPULLI
INSTITUTO NACIONAL POLITÉCNICO
MÉXICO, D.F. FEBRERO, 2013

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Agradecimientos.
Al Posgrado en Ciencias Biológicas, de la Universidad Nacional Autónoma de México –
UNAM, agradezco la oportunidad que se me brindó para desarrollar el presente trabajo
y así fortalecer mi formación profesional dentro de las ciencias.
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología – CONACYT, por el apoyo
económico que se me otorgó, a través de la beca comprendida durante 2 años.
A la Dra. Graciela Castro – Escarpulli, agradezco me haya compartido su conocimiento y
experiencia que tiene sobre las Aeromonas, y el apoyo incondicional que siempre me
brindó como parte de mi Comité Tutor, así como la oportunidad de desarrollar parte de
mi trabajo experimental en el Laboratorio de Bacteriología Médica, en la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional.
Al Dr. Ricardo Oropeza Navarro, agradezco el apoyo que me brindó durante el
desarrollo de mi proyecto de posgrado, al formar parte de mi Comité Tutor.
A la Dra. Irma A. Rosas Pérez, agradezco la dirección de esta tesis, además de haberme
compartido su admiración para trabajar con bacterias ambientales, y los grandes
momentos de reflexión sobre el desarrollo de mi trabajo de posgrado, así como la
oportunidad que me brindó para desarrollarlo en el Laboratorio de Aerobiología,
ubicado en el Centro de Ciencias de la Atmósfera.
Agradecimientos personales.
A las M. en C. Leticia Martínez y M. en C. Eva Salinas Cortés, del Laboratorio de
Aerobiología, ubicado en el Centro de Ciencias de la Atmósfera, agradezco su apoyo en
el desarrollo de este trabajo.
A la Dra. Guadalupe Aguilera Arreola, a la Dra. Cecilia Hernández Cortez y en general al
equipo de trabajo del Laboratorio de Bacteriología Médica, en la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional, agradezco la oportunidad de
compartirme su experiencia en el desarrollo de algunas técnicas que me fueron útil en
el desarrollo de mi tesis.

Dedicatoria
Al sol que me alumbra todas las mañanas,
entre sonrisas y preguntas interminables
mi hijo Rayenari
Al lucero que siempre me acompaña
en mis mejores desvelos por la vida
mi esposo Carlos
A mis grandes robles
en los que siempre me he apoyado
mis padres (Lidia y Donato)
A mis hermanos con los que he compartido grandes momentos de mi vida
A mis profesores que me compartieron su asombro y respeto por la ciencia.
Con gran emoción dedico este trabajo, como reflejo de mi compromiso en mi
formación para desempeñarme de forma profesional y responsable ante la humanidad.

Índice

Página
Índice………………………………………………………………………………………….. I
Índice de tablas….………………………………………………………………………….. IV
Índice de figuras…………………………………………………………………………….. VI
Resumen……………………………………………………………………………………… VIII
Abstract………………………………………………………………………………………. X
I. Introducción………………………………………………………………………………..
1. Bacterias patógenas primarias transmitidas por el agua……………………
2. Bacterias patógenas oportunistas transmitidas por el agua………………...
3. Microbiota del intestino de animales acuáticos……………………………….
4. Microbiota en piel de anfibios………………………………………………….
5. Factores de virulencia en bacterias patógenas oportunistas……………….
6. El ajolote en la zona lacustre de Xochimilco………………………………….
7. Justificación……………………………………………………………………..
8. Hipótesis…………………………………………………………………………
II. Objetivos………………………………………………………………………………….
1
2
4
5
5
6
7
8
8
9
III. Antecedentes…………………………………………………………………………….
1. Generalidades de Aeromonas…………………………………………………
2. Aeromonas como patógeno de organismos acuáticos……………………..
3. Aeromonas como patógenas en humanos……………………………………
4. Aeromonas como patógeno emergente……………………………………….
5. Genes de virulencia en Aeromonas……………………………………………
11
12
15
15
16
17
IV. Métodos………………………………………………………………………………….
1. Zona de estudio………………………………………………………………….
2. Cepas de referencia…………………………………………………………….
3. Muestreo en piel del ajolote…………………………………………………….
4. Muestreo en agua del refugio del ajolote …………………………………….
5. Aislamiento de Aeromonas spp., de la piel y del agua en la zona lacustre
de Xochimilco…………………………………………………………………….
6. Caracterización fenotípica de aislados presuntivos de Aeromonas spp….
7. Detección de genes putativos de virulencia………………………………......
8. Identificación…………………………………………………………………….
8.1 Extracción de DNA………………………………………………………..
8.2 RFLP del gen 16S rRNA.…………………………………………………
22
23
25
25
26

26
27
30
33
33
34
II

8.3 Secuenciación del gen 16S rRNA………………………………............
9. Formación de biopelícula……………………………………………………….
10. Perfil de sensibilidad a los antimicrobiano…………………………………….
37
37
38
V. Resultados……………………………………………………………………………..
1. Cuantificación de grupos bacterianos en la piel del ajolote y el agua……….
2. Caracterización bioquímica de Aeromonas…………….……………………….
3. Confirmación del género Aeromonas…………………………………………….
4. Presencia de genes que codifican para factores putativos de virulencia e
identificación genotípica de las especiesde Aeromonas………………………
5. Combinación de factores putativos de virulencia y formación de biopelícula..
6. Perfil antimicrobiano…………………………………………………………………
39
40
41
42

43
46
53
VI. Discusión………………………………………………………………………………. 54
VII. Conclusiones…………………………………………………………………………… 63
VIII. Bibliografía…………………………………………………………………………… 66
XII. ANEXOS………………………………………………………………………………… 77

III

Índice de tablas

No. Titulo Página
1 Lista de candidatos microbianos para ser considerados patógenos
emergentes identificados por la USEPA.
4
2 Patrón bioquímico de distintas especies de Aeromonas aisladas de
muestras clínicas.
12
3 Abundancia relativa de las especies de Aeromonas en distintos
ambientes.
13
4 Concentración de Aeromonas spp., en distintos ambientes
acuáticos.
14
5 Especies de Aeromonas con asociaciones clínicas. 16
6 Secuencias de los oligonucleótidos de cada uno de los 5 genes
putativos de virulencia.
30
7 Condiciones de reacción de la PCR múltiple. 31
8 Mezcla de reacción estandarizada para la PCR múltiple. 32
9 Secuencias de los iniciadores de los genes universales para
amplificar el gen 16S rRNA.
34
10 Condiciones de reacción para amplificar el gen 16S rRNA. 34
11 Mezcla de reacción para amplificar el gen 16S rRNA. 35
12 Cuantificación promedio de bacterias en el agua de tres sitios en la
zona lacustre de Xochimilco.
40
13 Aeromonas aisladas de la piel del ajolote y del agua de la zona
lacustre de Xochimilco.
42
14 Presencia de más de un gen putativo de virulencia en Aeromonas
spp., aisladas de la piel del ajolote y del agua de la zona lacustre de
Xochimilco.
44
15 Distribución de factores putativos de virulencia en las distintas
especies de Aeromonas inluyendo su patrón de resistencia y los
valores de formación de biopelícula.
48
16 Capacidad para formar biopelícula (DO570) en Aeromonas con 3
genes de virulencia.
53

Índice de figuras

No. Título Página
1 Modelo hipotético de infección de Aeromonas en una herida. 17
2 Monómero de proaerolisina. 18
3 Poro transmembranal que forma un heptámero de aerolisina. 19
4 Representación esquemática de la secreción intestinal regulada por
GC-C (guanilil ciclasa).
20
5 Adherencia de A. caviae Sch3 silvestre (A) y mutante, sin flagelo
lateral (B) en células Caco-2 (cultivo en monocapa).
21
6 Localización de los sitios donde se cuantificaron coliformes fecales
en el agua de los canales.
24
7 Muestreo en piel del ajolote (Ambystoma mexicanum) en el refugio
Teshuilo, en la zona lacustre de Xochimilco.
25
8 Canal donde se ubica el refugio Teshuilo, en la zona lacustre de
Xochimilco.
26
9 Protocolo ampliado de restricción enzimática del gen 16S rRNA para
la identificación de las especies de Aeromonas.
36
10 Comparación de las concentraciones de bacterias obtenidas en
diferentes medios de cultivo.
40
11 Abundancia relativa de colonias bacterianas, aisladas de la piel del
ajolote y del agua en la zona lacustre de Xochimilco.
41
12 PCR múltiple para 5 genes putativos de virulencia. 43
13 RFLP de 13 Aeromonas aisladas del agua del refugio Teshuilo, en la
zona lacustre de Xochimilco.
45
14 Especies de Aeromonas que presentaron más de un gen putativo de
virulencia, identificadas por RFLPs, aisladas de la piel del anfibio y
del agua.
46
15 Distribución del número de genes putativos de virulencia entre las
especies de Aeromonas aisladas de la piel de ajolote y del agua de la
zona lacustre.
47
16 Comparación de valores de biopelícula en distintas especies de
Aeromonas aisladas de la piel del ajolote y del agua de la zona
lacustre de Xochimilco.
50
17 Comparación de valores de biopelícula en Aeromonas aisladas a
partir de la piel del ajolote (1) y del agua (2) de la zona lacustre de
Xochimilco.
51
18 Comparación de valores de biopelícula de acuerdo con el número de
genes putativo de virulencia, en las 53 Aeromonas aisladas.
52
19 Comparación de valores de biopelícula y presencia del flagelo lateral
(lafA), en las 53 Aeromonas spp. aisladas.
52

VII

Resumen

VIII

Las especies del género Aeromonas son bacterias Gram negativas de vida libre,
consideradas patógenas oportunistas transmitidas por el agua o por alimento
contaminado. Se ha reportado que pueden presentarse como agentes etiológicos tanto de
infecciones en humanos como en organismos acuáticos, a pesar de que el mecanismo
de patogenicidad no se conoce del todo. En el presente estudio se detectó la presencia de
factores puativos de virulencia en las especies de Aeromonas aisladas del agua y de la
piel del ajolote (Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, para conocer
el potencial patogénico de estas bacterias en el sitio. Se aislaron 94 Aeromonas spp., 45
de la piel del ajolote (Ambystoma mexicanum) y 49 del agua de su refugio, ubicado en el
sistema de canales en Xochimilco, sitio donde se reciben desechos humanos y animales.
Mediante PCR se detectó en los aislados de Aeromonas spp, la presencia de cinco genes
putativos de virulencia, gcat (glicerofosfolípido colesterol aciltransferasa), aer/ hem
(aerolisina/ hemolisina), alt, ast (enterotoxinas citotónicas) y lafA (flagelo lateral). El 56%
de los aislados (53/ 94) presentaron por lo menos dos genes putativos de virulencia, 17 de
la piel del anfibio y 36 del agua, estos se identificaron a nivel de especie por RFLPs
(Restriction Fragment Length Polymorphism) y se evaluó su capacidad para formar
biopelícula, mediante la técnica de tinción con cristal violeta, así como su resistencia a
distintos antibióticos por el sistema automatizado, VITEK. Los aislados del ajolote
presentaron con mayor frecuencia el gen gcat > aer/hem > lafA, alt > ast y solo uno
presentó los cinco genes putativos de virulencia, mientras que en los aislados del agua
presentaron gcat > aer/hem > alt, ast > lafA, y seis presentaron todos los genes. El 8% (4/
53) de los aislados con más de dos genes de virulencia formaron un poco más biopelícula
que el control positivo (A. caviae Sch3), pero no llega a ser el doble, y la mayoría fueron
aislados del agua. Algunos de los aislados presentaron resistencia a imipenem, 15%
(8/53), y de ellos cinco fueron identificados como A. veronii. Seis especies fueron
encontradas en la piel del ajolote, donde la más frecuente fue A. veronii, mientras que en
el agua se identificaron ocho especies, de las cuales A. salmonicida fue la más común,
especie en la que se detectó la mayoría de los genes putativos de virulencia. Estos
resultados sugieren que tanto la piel del ajolote como el agua son importantes reservorios
de Aeromonas spp. Se requieren más estudios para determinar el riesgo potencial para la
salud humana y de los animales que implica la presencia de altas concentraciones de
esta bacteria de vida libre, en el agua y los productos alimenticios de la zona de estudio.

Abstract

Aeromonas spp. are includes gram negative opportunistic waterborne and
foodborne pathogens, known as important causes of aquatic organisms and human
infection. However the pathogenic mechanism is not yet clear. In this study 94 Aeromonas
ssp were isolated from both 45 ajolote skin (Ambystoma mexicanum) and 49 their refuge
water canal in an urban lake that receive human and animal waste, located in Xochimilco
County. Five putative virulence genes were tested, gcat (glycerophospholipid cholesterol
acyltransferase), aer/ hem (aerolysin/ hemolysin), alt, ast (cytotonic enterotoxins) and lafA(lateral flagella), all of them were detected by PCR. 56% (53/94) of the total isolates
presented at least two virulence genes, 17 were isolated from ajolote skin and 36 from
water canal. Those positive were identified the species level by RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) and we assessed their capacity to build biofilms, by
crystal violet, and antibiotic resistance, by VITEK. The ajolote skin isolates harbored gcat >
aer/hem > lafA, alt > ast and only one was positive for five of the tested genes, and those
from water gcat > aer/hem > alt, ast > lafA, and 17% (6/36) were positive to all of them.
Eight percent (4/53) were able to form biofilm higher than the positive control (A. caviae
Sch3), mainly those from water samples. It was possible to observe some isolates
resistant to imipenem, a 15% (8/53), five A. veronii isolates were resistant to imipenem.
Six Aeromonas species were identified from ajolote skin and the most common species
were A. veronii, and eight were identified from water canal and A. salmonicida was the
most common. The virulence genes tested were detected among the eight species
identified in this study, but in A. salmonicida was detected most of them. These results
suggest that both water and ajolote skin could be an important reservoir of potential
pathogenic Aeromonas spp. Further studies are need perform in order to determine the
potential human and animal health risk associated to these free living bacteria.

I. Introducción

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

Las enfermedades infecciosas transmitidas por el agua han ocupado la atención de
microbiólogos y epidemiólogos de diferentes partes del mundo, desde hace varias
décadas, principalmente las infecciones asociadas a la contaminación fecal de origen
tanto humano como animal (Cabral, 2010; Santiago – Rodriguez et al., 2012). Este
problema es crítico para los cuerpos de agua dulce de regiones tropicales, principalmente
para aquellas que cuentan con una deficiente vigilancia e infraestructura sanitaria, y con
grandes núcleos poblacionales que demandan agua potable, así como para la agricultura
(Hazen y Toranzos, 1990; Nagvenkar y Ramaiah 2009).

En la actualidad existen evidencias epidemiológicas que señalan a la contaminación del
agua, por materia fecal, como un problema importante de salud pública que no se ha
controlado eficientemente, y al que se van sumando las enfermedades emergentes por
patógenos oportunistas (USEPA, 2002,2005).

Otro problema asociado a la descarga de aguas negras a los cuerpos de agua es el
incremento de nutrientes, y materia orgánica, que afectan al estado trófico o saprobio del
sitio, lo que repercute entre otras cosas en la densidad de las bacterias autóctonas, ya
que puede incrementar las poblaciones bacterianas con potencial patógeno como es el
caso del género Aeromonas, considerado un patógeno oportunista tanto para el hombre
como para los organismos que allí se desarrollan (Shotts et al., 1972; Berngozzi, et al.,
1995; Nagvenkar y Ramaiah, 2009; Health Canada, 2006).

1. Bacterias patógenas primarias transmitidas por el agua

Las heces humanas y de animales transmiten agentes primarios de diversas
enfermedades, en las infecciones zoonóticas las bacterias patógenas llegan al hombre a
través de los animales o sus productos alimenticios. Las heces de ganado vacuno,
porcino, avícola, animales silvestres y mascotas se consideran vectores de
microorganismos patógenos entre los que se encuentran Escherichia coli O157:H7,
Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Arcobacter spp., Giardia duodenalis, y
Cryptosporidium parvum. Los reptiles también pueden ser vectores de agentes como
Salmonella. Además se ha reportado que la orina de varios animales es vector de
Leptospira, causante de una enfermedad endémica de los trópicos (Lee et al., 2011).

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

Las bacterias son microorganismos muy diversos y esenciales para el funcionamiento de
los sistemas acuáticos, sin embargo al ser contaminados por desechos humanos y
animales pueden favorecer el desarrollo de bacterias alóctonas, lo que representa un
riesgo para la salud, puesto que la mayoría de las bacterias involucradas en infecciones
gastrointestinales son de éste tipo (Anexo 1), razón por la cual es necesario distinguirlas
de las bacterias autóctonas. Estas bacterias prefieren temperaturas similares a la del
intestino de animales de sangre caliente y pasan solo un tiempo corto de su ciclo de vida
en los cuerpos de agua, sitios donde llegan por descargas de aguas negras, por la lluvia o
por escorrentía, y una vez fuera del intestino mueren rápidamente, razón por la cual la
cuantificación de las coliformes fecales y los enterococos fecales ha permitido determinar
el grado de contaminación fecal de estos sitios (Santiago – Rodriguez et al., 2012).

Está bien documentado el hecho de que la ingestión de Escherichia coli, Vibrio cholerae,
Salmonella spp., y Shigella spp., producen infecciones gastrointestinales. En años
recientes se ha reportado la incidencia de otros patógenos oportunistas intestinales como,
Yersinia enterocolitica, Aeromonas spp., Mycobacterium avium intracelular, Helicobacter
pylori y Campylobacter jejuni. Muchos de estos microorganismos habitan en el hombre o
algunos animales y pueden ser transmitidos a través de sus desechos (Von Reyn et al.,
1994; Hulten et al., 1996; Leclerc et al., 2002, Santiago – Rodriguez et al., 2012,).

La contaminación fecal es más común en las aguas superficiales como lagos, ríos, y
arroyos que en las aguas subterráneas. Diversos patógenos son excretados en las heces
de humanos o animales infectados y de aquellos portadores sanos, los cuales son
capaces de producir una infección a otros hospederos, a través del agua en sus diferentes
usos. Estos microorganismos llegan a los sistemas de agua dulce por la descarga de
efluentes de plantas de tratamiento de mala calidad, directa de desechos fecales
provenientes de los asentamientos humanos irregulares, o a través de las escorrentías.

Existen bacterias patógenas tanto entéricas como autóctonas de ecosistemas acuáticos,
los cuales son muy resistentes a las condiciones ambientales y a los desinfectantes
(Johnson y Chess, 2003).

Los brotes de origen bacteriano particularmente la fiebre tifoidea, en países en vías de
desarrollo ha disminuido considerablemente desde los 90s. A la fecha algunos patógenos
3

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

de origen fecal prevalecen en la población (Shigella sonnei) así como nuevos patógenos
(Campylobacter jejuni o E. coli O157:H7). La característica común de estas bacterias es
que a pesar de su bajo inóculo (de unas cuantas a cientos de células), puede
desencadenar una infección.

2. Bacterias patógenas oportunistas transmitidas por el agua

Las bacterias patógenas oportunistas transmitidas por el agua en general son bacterias
autóctonas importantes para los sistemas acuáticos y sus hospederos son organismos
con alteraciones inmunológicas. Algunos nuevos patógenos (Tabla 1) incluyendo a las
bacterias ambientales son capaces de sobrevivir y proliferar en sistemas de distribución
de aguas. Otros tienen un hospedero especifico y la población en general no está en
riesgo por su ingesta como es el caso de P. aeruginosa.La importancia de las especies de Aeromonas presentes en el agua potable y su relación
con gastroenteritis aguda permanece en discusión, sin embargo existen evidencias de su
papel como patógeno en personas inmunodeficientes así como de animales acuáticos
(Cabral, 2010). Una vez que las bacterias patógenas se encuentran en el cuerpo de agua,
estas pueden afectar tanto a los organismos acuáticos como al hombre a través del
consumo del agua o de organismos como los peces, moluscos y crustáceos
contaminados (Novotny, 2005).

Más estudios son necesarios para entender realmente el papel de estas bacterias
patógenas oportunistas y darle dimensiones a la incidencia de enfermedades a las cuales
se les asocia, así como determinar aspectos de su ecología.

Tabla 1. Lista de candidatos microbianos para ser considerados patógenos
emergentes identificados por la USEPA (USEPA, 2005).
Microorganismo
Adenoviruses
Aeromonas hydrophila
Caliciviruses
Coxsackieviruses
Microsporidia (Enterocitozoon)
Helicobacter pylori
Echoviruses
Mycobacterium avium intracelular (MAC)
Cianobacteria (CyC-blue-green algae)
4

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

3. Microbiota del intestino de animales acuáticos

Es importante conocer qué tipo de microorganismos alberga el intestino de los
organismos poiquilotermos, como los anfibios, debido a que éste puede resultar un
reservorio de bacterias patógenas oportunistas (Novotny, 2005). El hábito alimenticio de
estos organismos es importante, porque puede poner en contacto a ciertas bacterias con
animales o el hombre que de forma directa sería muy difícil, como es el caso de los peces
que remueven el sedimento al alimentarse.

Por ejemplo Aeromonas forman parte de la microbiota del intestino de peces, anfibios y
reptiles; en los peces sanos de agua dulce predominan géneros como Aeromonas,
Acinetobacter, Bacillus, Flavobacterium, Pseudomonas y algunos géneros representativos
de la familia Enterobacteriaceae, además de bacterias anaerobias obligadas del género
Bacteroides y Clostridium (Buller, 2004; Denev et al., 2009). Aeromonas en el humano no
se encuentra como parte de la microbiota (Lamp, 2010), solo se aísla cuando llega a ser
infectado por consumir agua o alimentos contaminados, por tanto no existe una
asociación entre las coliformes fecales y este género (Araujo et al., 2004; Hirotami et al.,
1999; Di Bari et al., 2007).

4. Microbiota en piel de anfibios

Poco se ha estudiado sobre la microbiota que habita en la piel de anfibios y su relación
con los ambientes acuáticos donde se desarrollan, sin embargo hay pocas evidencias
sobre las relaciones entre las bacterias y estos organismos acuáticos, lo que podría ser
desde interacciones mutualistas hasta de patogenicidad. (McFall et al., 2005)

Son escasos los trabajos que reportan bacterias asociadas a la piel de salamandras y
ranas sanas (Anexo 2). Culp y colaboradores (2007) identificaron fenotípicamente, a
bacterias patógenas oportunistas como Aeromonas hydrophila, Pseudomonas
fluorescens, P. luteola, P. oryzihabitans, Raoultella terrígena, Bacillus cereus,
Staphylococcus epidermidis, Flavobacterium sp., Microbacterium sp. y Corynebacterium
sp., además del patógeno de plantas Agrobacterium radiobacter. Por otro lado Lauer
(2007 y 2008), McKenzie (2012) y colaboradores identificaron genotípicamente, a
bacterias patógenas oportunistas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae,
5

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

Pasteurellaceae, Caulobacteraceae, Clostridiaceae; bacterias del género Pseudomonas,
Stenotrophomonas, Sphingomonas, Bacillus, Paenibacillus, Chryseobacterium,
Flavobacterium, Streptomyces, además de bacterias que habitan el suelo, como
Lysobacter gummosus, Duganella zoogloeoides, Variovorax sp., Ideonella sp., Curvibacter
sp., Pedobacter sp., Agromyces sp. y Acidobacteria; así como bacterias exclusivas de la
piel de la salamandra, como Janthinobacterium lividum.

Lauer y colaboradores (2008) proponen a Janthinobacterium lividum, Bacillus cereus y
Flavobacterium sp., como bacterias que interaccionan con la salamandra de forma
positiva (mutualista), por su actividad antifúngica, lo que podría ser parte de una
respuesta inmune-innata del anfibio (Banning et al., 2008; Boman, 2000).

Dentro de los patógenos que han afectado en mayor medida las poblaciones de anfibios,
se han identificado al hongo Batrachochytrium dendrobatidis, causante de quitridiomicosis
(Rachowics et al., 2006; Stuart et al., 2004; Berger et al., 1998), al virus ATV (Ambystoma
tigrinum Virus) y Ranavirus causantes de infecciones en piel (Chinchar, 2002;
Cunningham et al., 1996) y a las bacterias patógenas oportunistas como A. hydrophila,
Listeria innocua, Staphylococcus epidermis, S. aureus, Enterococcus faecalis y E. coli
quienes pueden potenciar enfermedades en anfibios (Schadich y Cole, 2009; Fernandez
et al., 2009; Bhowmik et al., 2009; Cotter et al., 2008; Picco y Collins, 2008; Forzan et al.,
2008; Parris y Beaudoinm, 2004; Pasmans et al., 2004; Rollins-Smith et al., 2002).

5. Factores de virulencia en bacterias patógenas oportunistas

El ambiente es reconocido como un importante reservorio de bacterias y fuente de
patógenos humanos y otros organismos. La versatilidad metabólica de ciertas bacterias
durante su ciclo de vida les permite vivir fuera y dentro de organismos homeotermos o
poiquilotermos exitosamente. Los genes de virulencia que han sido identificados en las
bacterias patógenas primarias y oportunistas, además se han encontrado en bacterias
que habitan ambientes marinos y lagos hipersalinos (8 – 12%), a diferencia de las
bacterias de agua dulce donde solo del 2-3% de ellas se han identificado estos genes
(Olof et al., 2009).

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

Se ha observado que en algunas circunstancias los factores de virulencia tienen una
función diferente en el ambiente que en el hospedero, lo que puede estar relacionado con
la manera en la que los microorganismos se encuentran en el ambiente, para que
presenten diferentes habilidades como formar biopelículas, obtener Fe2+ no disponible, o
producir enzimas proteolíticas lo que puede contribuir a su potencial virulento (Martinez y
Casadevall, 2006)

La secuenciación del genoma de diversas bacterias comensales humanas y de diferentes
organismos incluyendo las plantas, así como de las ambientales (agua, aire y suelo), ha
permitido obtener información sobre la evolución y adaptación de estas bacterias hasta
llegar a convertirse en patógenas oportunistas en hospederos, generalmente
inmunodeficientes (Aujolaut et al., 2011; Tounsi et al., 2006; Theron y Cloete, 2002).

Se cuenta con información sobre el gran tamaño del genoma de ciertas bacterias
comensales o ambientales que ocupan diversos hábitats y nichos, considerando que esta
amplia maquinaria genética les permite actuar como patógenos oportunistas exitosos
como Pseudomonas, Aeromonas y Ochrobactrum (Reith et al., 2008). Al respecto se ha
observado en el genoma de diversas bacterias, genes que codifican para factores
potenciales de virulencia que les permiten adherirse, invadir, formar cápsulas, producir
toxinas, así como proteínas de superficie, producir efecto de quórum-sensing y formación
de biopelícula, entre otros (Khajanchi et al., 2010, Ottaviani et al., 2011).

La biopelícula está constituida por una matriz orgánica de polímeros producida por unoo
un conjunto de microorganismos, lo que favorece la adherencia a distintas superficies. El
papel que juega la formación de biopelícula en los procesos infecciosos está siendo
ampliamente investigado, ya que se le ha relacionado con la persistencia de los
microorganismos en infecciones, lo que sugiere que la biopelícula lo protege de los
mecanismos de defensa del hospedero (Weihua et al., 2011; Kirov et al., 2004).

6. El ajolote en la zona lacustre de Xochimilco

La zona lacustre de Xochimilco se decretó Patrimonio de la humanidad por la UNESCO,
por ser el único lugar de la Cuenca de México que sigue manteniendo parte de las
chinampas, y con ello organismos que crecen, se desarrollan y participan en el flujo de
7

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energía del sitio, resultando en un ecosistema único en el mundo. Desafortunadamente su
cercanía a las zonas urbanas lo ha afectado y actualmente está considerado como un
humedal urbano altamente contaminado (Losada et al., 1998).

A pesar de su grado de contaminación, aun se encuentran poblaciones de especies
endémicas como el axolotl (Ambystoma mexicanum, Anexo 3), anfibio de hábitos
exclusivamente acuáticos y por tanto altamente sensible a los cambios en la calidad del
agua; considerado en peligro de extinción de acuerdo a la norma mexicana (NOM-059-
ECOL-2001). Hasta este momento, no se ha reportado ningún estudio sobre la microbiota
normal de ajolotes sanos. Frías-Álvarez y colaboradores (2008) detectaron la presencia
del hongo B. dendrobatidis en la piel de 98% de ajolotes en cautiverio, en México, sin
embargo, se desconoce la presencia de algún otro patógeno potencial, como A.
hydrophila.

7. Justificación

Las Aeromonas son bacterias consideradas patógenos oportunistas emergentes tanto en
humanos como en organismos acuáticos, son ubicuas y endémicas de ecosistemas
acuáticos. En la zona lacustre de Xochimilco, enriquecida con materia orgánica, es
importante conocer la distribución de especies de Aeromonas y sus factores putativos de
virulencia, que pudieran poner en riesgo a los organismos acuáticos que allí habitan,
como el ajolote (Ambystoma mexicanum), anfibio endémico y en peligro de extinción, y a
los humanos, al consumir vegetales crudos que se cultivan en la zona y se riegan con el
agua de los canales.

8. Hipótesis

Si las especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote cuentan con
atributos patogénicos como la presencia de genes putativos de virulencia (gcat, alt, ast,
aer/hem y lafA), la capacidad para formar biopelículas y la resistencia a antibióticos,
entonces se podrá establecer el riesgo potencial que representan estas bacterias tanto
para los organismos acuáticos que allí se desarrollan, como para la calidad del agua,
especialmente si se usa para el riego de vegetales comestibles crudos.

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II. Objetivos

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Objetivo general

 Evaluar la distribución de especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del
ajolote y la presencia de los genes putativos de virulencia asociados a ellas tales
como: lafA, gcat, alt, ast, hem, aunado a la capacidad para la formación de
biopelícula y resistencia a antibióticos, para conocer el potencial patogénico de
estas bacterias.

Objetivos específicos

 Aislar a las Aeromonas de las muestras de agua de la zona lacustre de Xochimilco
y de la piel del ajolote, mediante medios de cultivo diferenciales.

 Caracterizar fenotípicamente los aislados de Aeromonas asociados a la piel del
ajolote y del agua de la zona lacustre de Xochimilco, mediante pruebas
bioquímicas.

 Detectar la presencia de cinco genes putativos de virulencia (gcat, lafA, aer/hem,
ast y act), mediante PCR.

 Determinar a nivel de especie, los aislados de Aeromonas asociados a la piel del
ajolote y del agua de la zona lacustre de Xochimilco, mediante RFLPs y
secuenciación del gen 16S rRNA.

 Evaluar la resistencia a diferentes antibióticos y formación presuntiva de
biopelícula en las especies de Aeromonas.

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III. Antecedentes

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1. Generalidades de Aeromonas
Patrón bioquímico
El género Aeromonas se caracteriza por agrupar bacterias con morfología de bacilos
cortos (0.3 x 3.5 m), anaerobios facultativos, Gram negativos, con presencia de catalasa
y oxidasa, se desarrollan a temperatura óptima de 22 – 28 0C y la mayoría de las especies
son móviles por presentar un flagelo polar, excepto A. salmonicida y A. media. Su
principal fuente de carbono y energía es la glucosa y tienen la capacidad de reducir nitrato
a nitrito, con patrón bioquímico variable (tabla 2). Pueden crecer a 3% de NaCl, pero no
en 6%, característica que permite diferenciarlos del género Vibrio, además de presentar
resistencia al vibriostático O/129 (2,4 diamino – 6 – 7 -diisopiopilteridina) a 10 y 150 g
(Castro-Escarpulli et al., 2002).

Tabla 2. Patrón bioquímico de distintas especies de Aeromonas aisladas de
muestras clínicas, de acuerdo a la revisión de Janda y Abbot (2010).
Porcentajes de Aeromonas que presentaron la característica bioquímica.

Especies

Comunes G
lu
co
sa
fe
rm
.
G
lu
co
sa
o
x.

S
or
bi
to
l
Á
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O
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iti
na
d
C

E
la
st
in
a
Á
c.
u
ro
cá
ni
co

A. hydrophila 95 95 0 71 98 99 76 58 7 27 97 98 100 0 74 26
A. veronii bv.
Sobria
94 89 0 0 99 7 0 91 0 22 100 98 100 0 0 1
A. caviae 0 0 0 95 100 97 2 100 1 79 100 0 94 0 0 96
Poco frecuentes
A. veronii bv.
Veronii
83 92 0 0 100 92 - 8 0 83 100 100 0 100 0 0
A. jandaei 88 100 0 7 100 0 - 0 0 18 0 100 100 0 0 7
A. trota 6 71 0 94 71 12 - 0 0 12 24 100 100 0 0 69
A. schubertii 17 0 0 67 0 0 - 0 0 25 0 83 92 0 0 0
A. popoffii 100 100 0 86 100 0 - 57 0 0 0 0 100 0 0 71
Raras
A. bestiarum 63 75 0 0 100 94 - 100 69 13 100 50 88 0 13 94
A. salmonicida 64 71 79 0 95 93 - 93 0 86 100 50 71 0 43 100
A. media 0 0 0 38 100 88 80 100 0 94 100 0 94 0 0 100
A. eucrenophila 0 73 0 0 100 82 - 82 20 55 64 0 82 0 0 9

En la tabla se presenta el porcentaje del patrón bioquímico para cada especie, como se
puede apreciar existe variabilidad fenotípica interespecífica, por lo que no se puede hablar
de un solo patrón para cada especie, por ello se han propuesto métodos genotípicos para
una correcta identificación.
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Taxonomía

En el manual Bergey’s (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) se reconocen 24
especies de Aeromonas, de las cuales 18 tienen mayorreferencia (A. hydrophila, A.
salmonicida, A. sobria, A. media, A. caviae, A. veronii, A. eucrenophila, A. trota,
A.schubertii, A. jandaei, A. encheleia, A. bestiarum, A. popoffii, A. simiae, A. molluscorum,
A. bivalvium, A. aquariorum y A. tecta), 5 están en discusión sobre su sinonimia (A.
allosaccharophila, A. culicicola A. enteropelogenes, A. ichthiosimia y A. punctata) y una no
se reconoce como especie (A. sharmana).

Las Aeromonas pueden agruparse en: 1) las mesofílicas, representadas por A. hydrophila,
caracterizadas por ser móviles y tener un crecimiento óptimo de 35 a 37 0C, aisladas a
partir de muestras clínicas; y 2) las psicrofílicas, representadas por A. salmonicida,
caracterizadas por no ser móviles y tener un crecimiento óptimo de 22 a 23 0C, aisladas a
partir de animales acuáticos. Sin embargo, se han descrito distintas especies relacionadas
con otros orígenes de la muestra (tabla 3).

Tabla 3. Abundancia relativa de las especies de Aeromonas en distintos ambientes
(modificado de Janda y Abott, 2010).
Vertebrados Invertebrados Agua Especies
Primates Otros Moluscos Artrópodos otros dulce Salada potable
A. aquariorum ND ± ND ND ND ± ND ND
A. bestiarum + ± ± ND ND ++ ND ND
A. bivalvium ND ND ± ND ND ND ND ND
A. caviae +++ +++ ++ ++ ND ++ +++ +++
A. encheleia ND ++ ± ND ND + ND ND
A. eucrenophila ± + ND ND ND + ND ND
A. hydrophila +++ +++ ± ± ND +++ ++ ++
A. jandaei + ++ ± ND + ± ND ND
A. media + ND ND ND ND + ND ND
A. molluscorum ND ND ± ND ND ND ND ND
A. popoffii ± ND ND ND ND + ND ND
A. salmonicida + +++ ND ND ND ++ ND ND
A. schubertii + ± ND ND ND ND ND ±
A. simiae ± ND ND ND ND ND ND ND
A. sobria ND ++ ND ND ND ± ND ND
A. tecta ± ± ND ND ND ND ND ND
A. trota + ND ND ND ND ND ND ±
A. veronii +++ ++ ND ± ++ ± ++ ++
ND. No detectado ++. Reportes comunes
±. Reportes raros +++. Especies predominantes en las muestras
+. Reportes no comunes
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Ecología

Aeromonas spp. se consideran bacterias comunes en ambientes acuáticos como lagos,
ríos, agua salina, incluso en agua potable, dado que pueden reproducirse y colonizar
dichos ambientes, siempre y cuando tengan nutrientes suficientes. A partir de los reportes
donde se asocian a estas bacterias con distintas infecciones causadas por ingesta de
alimentos o bebidas contaminadas, o por contacto con aguas “contaminadas”, se ha
determinado su abundancia en distintos cuerpos de agua (tabla 4).

Tabla 4. Concentración de Aeromonas spp. en distintos ambientes acuáticos.
Ambiente Aeromonas
UFC/mL
Referencia País
Aguas residuales domésticas > 108 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Aguas residuales crudas 106 – 108 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Aguas residuales tratadas 103 – 105 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Aguas residuales tratadas 101 – 102 Havelaar, Versteegh y During, 1990 Netherlands
Aguas residuales 102 – 107 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Ríos con descarga de aguas residuales 101 – 104 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Ríos y lagos sin descarga de aguas residuales 100 – 102 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Agua salina 10-2 – 102 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Agua potable, post tratamiento 10-2 – 101 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Agua potable, post tratamiento 101 Stelzer, 1992 Alemania
Agua potable, post tratamiento 10-1 Knochel y Jeppesen, 1990 Dinamarca
Agua potable en el sistema de distribución 10-2 – 103 Holmes, Niccolls y Sartory, 1996 Inglaterra
Agua subterránea < 1 Havelaar, Versteegh y During, 1990 Netherlands
UFC/mL, unidades formadoras de colonias por mililitro.

Asimismo se sabe que el incremento de nutrientes y materia orgánica en el agua favorece
el desarrollo de las poblaciones de Aeromonas entre otras bacterias, por lo que se le ha
propuesto como un indicador del estado trófico o saprobio (Reali et al., 1994; Gugliandolo
et al., 2009), o como indicadoras del mal funcionamiento del sistema de tratamiento y
potabilización del agua, dado que en agua potable se han reportado <1 UFC/mL, mientras
que en descargas de aguas domésticas donde hay una mayor cantidad de materia
orgánica, aumentan las concentraciones alrededor de 108 UFC/mL (Figueras y Borrego,
2010; Chauret et al., 2001). Esto sugiere que este crecimiento bacteriano podría ser un
efecto indirecto de contaminación por aguas negras o de escorrentía de suelos agrícolas
o de bosques.

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2. Aeromonas como patógeno de organismos acuáticos

Si las Aeromonas spp. están generalmente presentes en ambientes acuáticos, es fácil
pensar que puede establecerse una relación mutualista con los organismos que allí se
desarrollan, sin embargo existen reportes de infecciones epidérmicas, tales como la
furunculosis, septicemias con hemorragias que se desarrolla en los poros de la epidermis
de peces como el salmón, donde se ha descrito como agente etiológico a A. salmonicida.
Hay otras septicemias hemorrágicas y úlceras que se desarrollan en peces como la carpa,
la tilapia, la trucha, el pez gato, el bacalao y el salmón, donde el agente etiológico es
A. hydrophila y A. veronii. Así como la aeromoniasis, infección desarrollada en pez gato y
anguilas, donde el agente etiológico es A. jandaei (Austin et al., 1998; Castro-Escarpulli et
al., 2002; Reith et al., 2008).

La literatura en su mayoría está relacionada con productos acuícolas aunque también hay
reportes de infecciones causadas por A. hydrophila y A. veronii, en vertebrados de sangre
fría y caliente como: estomatitis ulcerativa en serpientes y lagartijas; septicemias
hemorrágicas en ranas, anfibios y perros; artritis séptica en terneros y vasculitis en toros
(Schadich y Cole, 2009; Bhowmik et al., 2009; Rollins-Smith et al., 2002).

3. Aeromonas patógenas en humanos

De la microbiota normal descrita para la piel, mucosas e intestino del cuerpo humano, no
se ha reportado a ninguna especies de Aeromonas, por el contrario, de las 18 especies de
Aeromonas, 11 se han aislado a partir de muestras clínicas (tabla 5), las cuales son
capaces de colonizar, invadir y dañar el cuerpo humano hasta desarrollar una infección.

Dentro de las infecciones comunes en humanos destacan las intestinales, donde las
manifestaciones clínicas varían desde una diarrea leve, hasta una gastroenteritis aguda
con diarrea, fiebre, dolores abdominales y cólicos con vómitos, síntomas similares a los
de otros enteropatógenos bacterianos Gram negativos. Las especies relacionadas con
este tipo de infecciones son Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii y Aeromonas
caviae, generalmente asociadas a infecciones transmitidas por consumo de alimentos y
bebidas contaminadas, donde se ha demostrado que una concentración >109 UFC es
capaz de ocasionar gastroenteritis (Castro-Escarpulli et al., 2002; Leclerc et al., 2002,
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Cabral, 2010). En México se han reportado una frecuencia de aislamiento del 7.7% en
casos de diarrea aguda en niños menores de 2 años y en un 7% en adultos (Rebollo y
Escamilla, 1984) y en otro estudio se reporta 5.7% en la frecuencia de aislamiento de
Aeromonas, asociada a diarrea de larga evolución en niños de 5 años (Martínez, 1996)

Por otro lado, las infecciones extraintestinales como septicemiastambién han llamado la
atención dado que en combinación con otras enfermedades como la diabetes,
pancreatitis, anemia, entre otros, se han reportado una mortandad del 25 al 50% de los
pacientes infectados. Las septicemias se consideran complicaciones de heridas o
bacteremias causadas por A. hydrophila, A. veronii, A. caviae, A. jandaei y A. schubertii
en pacientes inmunodeficientes.

Además hay otras infecciones asociadas a morbilidad donde han sido relacionadas
distintas especies, como Aeromonas media, Aeromonas trota, Aeromonas poppofii,
Aeromonas tecta y Aeromonas bestiarum.

Tabla 5. Especies de Aeromonas con asociaciones clínicas (Modificado de Janda y
Abbot, 2010).
Determinación de especieEspecie
genética bioquímica
Otro nombre
A. bestiarum + +
A. caviae + + A. punctata
A. hydrophila + +
A. jandaei + +
A. media + +
A. popoffii + -
A. salmonicida + +
A. schubertii + +
A. tecta + +
A. trota + + A. enteropelogenes
A. veronii + + A. ichthiosmia

4. Aeromonas como patógeno emergente

Un patógeno emergente es aquel que en poco tiempo llega a ser prevalente en cierta
población, en este caso, distintas especies de Aeromonas, fueron asociadas con
infecciones gastrointestinales en el humano, además de su asociación a infecciones
epidérmicas en peces, donde A. hydrophila ha centrado la atención dado que estuvo
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involucrada en grandes pérdidas económicas por la mortandad de carpas en EUA en el
2001, de peces oro (goldfish) en Indonesia en el 2002 y de peces gato en EUA en el
2007. Por ello instituciones como la EPA (Environmental Protection Agency por sus siglas
del inglés) ingresaron a A. hydrophila dentro de la lista de contaminantes potenciales y la
OMS (Organización Mundial de la Salud) han catalogado a las Aeromonas spp., dentro de
los primeros cinco patógenos emergentes (WHO, 2006), razón por la cual es prioritario su
estudio (Ecker et al., 2005; Palu et al., 2006; Edberg et al., 2007).

5. Genes putativos de virulencia en Aeromonas spp.

La virulencia de una bacteria patógena, está determinada por su capacidad para colonizar
e invadir a su hospedero; y para controlar dicho patógeno, es necesario determinar los
factores que le permiten dichas capacidades. En Aeromonas spp., se han descrito
factores putativos de virulencia que le permiten desarrollar una infección (Fig. 1), tales
como la cápsula, capa S, lipopolisacáridos, pilus, flagelo (lafA), y OMP’s, sideróforos;
además de la producción de toxinas como aerolisinas/ hemolisinas (aer/ hem),
enterotoxinas citotónicas (alt/ ast), proteasas (aspA), lipasas (gcat), de las cuales se ha
demostrado su patogenicidad en modelos animales (Aguilera-Arreola et al., 2005; Cascón
et al., 2000; Schiavano et al., 1998; Merino et al., 1995; Garduño et al., 1992; Ho et al.,
1992; Kay y Trust, 1991)

Figura 1. Modelo hipotético de infección de Aeromonas en una herida, donde se
observan los diferentes pasos para que la bacteria pueda causar una infección.
Modificado de Janda y Abott, 2010.
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El glicerofosfolípido colesterol acil transferasa (gcat), es una de las cuatro lipasas que
se han descrito para el género Aeromonas, la cual se ha asociado al desarrollo de
infecciones en peces y se ha propuesto como factor que favorece la invasión de la
bacteria en el hospedero, aunque no se ha determinado el papel en humanos (Lee y Ellis,
1990). Chacón y colaboradores (2002) han reportado al gen gcat, como exclusivo del
género y presente en todas las especies de Aeromonas, por lo que han propuesto la
detección de este gen, como método básico para distinguirlas de otros géneros
relacionados, como Vibrio, quien tiene patrones bioquímicos similares al que presentan
algunas especies de Aeromonas.

La aerolisina/ hemolisina (aer/hem) es una toxina formadora de poro (Fig. 2 y 3), similar
a la -toxina de Staphylococcus aureus o Clostridium septicum, relacionada con la
citolisina dependiente de colesterol (CDCs) producida por algunas especies de Bacillus,
Streptococcus, Listeria y Arcanobacterium (Szczesny et al., 2011; Menestrina et al., 2003;
Buckley, 1992). La aerolisina fue originalmente detectada como un factor importante en el
desarrollo de la patogénesis en A. hydrophila, asociada a diarreas y a infecciones internas
en humanos (Fivaz et al., 2002; Parker et al. 1994). Recientemente se han reportado
dicha toxina en otras especies como A. salmonicida, A. caviae, A. veronii y A. trota
(Aguilera-Arreola et al., 2005; Nagar et al., 2011; Nawaz et al., 2010).

Figura 2. Monómero de proaerolisina. El dominio 1 es transmembranal y el dominio
2 forma parte interna del poro. Este monómero al asociarse a su receptor de
membrana, se acopla para asociarse con otras 6 aerolisinas y formar el poro de 7.
Tomado de Parker et al., 1994.
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Figura 3. Poro transmembranal que forma un heptámero de aerolisina. La imagen A
es una microfotografía del poro, la imagen B es un modelo tridimensional y las
imágenes C y D, muestran el modelo molecular donde cada monómero de aerolisina
se ejemplifica con un color diferente. Modificado de Tsitrin et al., 2002.

Las enterotoxinas citotónicas termolábil (alt) y termoestable (ast) son toxinas
similares a la toxina del cólera, producida por Vibrio cholerae, quien interactúa con la
proteína reguladora adenilato ciclasa GTP dependiente, y con la enterotoxina de E. coli
quien interactúa con la guanilil ciclasa C (Fig. 4); en ambos casos se tiene un aumento de
AMP o GMP cíclico respectivamente, produciendo hipersecreción de electrolitos y agua,
resultando en un cuadro de diarrea (Weiglmeier et al., 2010). Inicialmente alt y ast fueron
identificadas en A. hydrophila, asociadas al desarrollo de diarreas; sin embargo se han
reportado en otras especies como A. salmonicida, A. caviae, A. veronii, A. media y A. trota
(Ottaviani et al. 2011; Aguilera-Arreola et al., 2007; Albert et al., 2000).

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Figura 4. Representación esquemática de la interacción de las enterotoxinas con el
receptor intestinal GC-C (guanilil ciclasa C). La asociación de la enterotoxina con
GC-C induce el aumento de cGMP (guanilil monofosfato cíclico), el cual inhibe a la
fosfodiesterasa PDE3; lo que tiene como consecuencia el aumento de cAMP
(adenin monofosfato cíclico), y aumento de PKA (proteína cinasa dependiente).
PKA inhibe el intercambio de Na+/H+ por la bomba NHE3, lo que altera la
concentración de electrolitos dentro y fuera de la célula del intestino. Además
cGMP activa a PKGII (proteína cinasa II dependiente de cGMP), la cual activa al
regulador transmembranal CFTR, lo que favorece la secreción de Cl- y HCO3
-. La
alteración de electrolitos dentro de la célula favorece la secreción de agua, dando
como resultado diarrea. Tomado de Weiglmeier, 2010.

El flagelo lateral (lafA) permite que la bacteria tenga un movimiento tipo swarming, lo
que facilita su desplazamiento en un medio sólido y la colonización hacia algún
hospedero; por ello se ha propuesto un factor putativo de virulencia en A. hydrophila AH3
y A. caviae Sch3, donde se demostró su asociación con la formación de biopelícula y
adherencia a célulasepiteliales, como se muestra en la figura 5 (Kirov et al., 2004; Canals
et al., 2006; Santos et al., 2011), aunque en el caso de A. hydrophila AH3, Canals y
colaboradores observaron que el flagelo polar que tiene esta especie para su
desplazamiento en su ambiente acuático, también contribuye a la formación de
biopelícula.

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Figura 5. Adherencia de A. caviae Sch3 silvestre (A) y deletada en el flagelo lateral
(B) en células Caco-2 (cultivo en monocapa). Barra, 10 m. Tomado de Kirov, 2004.

La biopelícula es el término que se utiliza para describir el crecimiento de una colonia
bacteriana en una superficie biótica o abiótica, donde coexisten microorganismos de una
o más especies, por ello se considera a esta estructura como una comunidad microbiana
donde se favorece la disponibilidad de nutrientes que llegan a dicha superficie. Esto
representa un medio de autodefensa para las bacterias que lo conforman, ya que resisten
fuerzas físicas (al no ser arrastradas por el flujo acuoso), químicas (al impedir la entrada
de antibióticos o agentes tóxicos), y biológicos (al no ser fagocitadas por células del
sistema inmune de los hospederos), razón por la cual resulta de gran importancia conocer
los factores que inducen la formación de biopelículas (Costerton et al., 1995).

Dentro de las estructuras que favorecen la adherencia de las bacterias, factor implicado
en la formación de una biopelícula, están los flagelos, pilis y adhesinas. Además de
dichas estructuras se ha propuesto la señalización intraespecífica por la producción de
homoserina lactona, molécula que desencadena el proceso conocido como quórum
sensing, donde hay una actividad coordinada para que otras bacterias se adhieran a dicha
superficie; y señalización interespecífica en el caso del desarrollo de una biopelícula con
dos o más especies. Finalmente la maduración de la biopelícula se asocia a una
diferenciación fenotípica con el estado planctónico, lo que resulta en una especialización
celular (Gilbert y Lappin – Scott, 2000; Dutta et al., 2012).

En un ambiente acuático, resulta interesante la interacción entre bacterias capaces de
desarrollar biopelícula sobre otro organismo (hospedero), relación epibiótica descrita por
Wahl (1989) en ambientes marinos, dado que puede existir una compleja comunicación
química entren micro y macroorganismos, dentro de múltiples interacciones positivas
(mutualismo) o negativas (patogenicidad), dependiendo del equilibrio huésped –
hospedero.
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Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

IV. Métodos

Detección de factores putativos de virulencia en especies de Aeromonas aisladas del agua y de la piel del ajolote
(Ambystoma mexicanum) en la zona lacustre de Xochimilco, México.

1. Zona de estudio

Por la gran complejidad que implica muestrear a los ajolote, se decidió trabajar con
organismos juveniles y adultos reclutados en canales de refugio Teshuilo (canal con 1.2 m
de profundidad) de la zona lacustre de Xochimilco, quienes fueron inicialmente criados en
la “Estación biológica para el estudio y preservación de Ambystoma mexicanum”, a cargo
de la asociación UMBRAL y monitoreados por el grupo de trabajo de Restauración
Ecológica del Instituto de Ecología-UNAM a cargo del Dr. Zambrano.

Para conocer la distribución de bacterias coliformes fecales en el agua de los canales, se
analizaron cuatro sitios de un transecto, desde la zona urbana hasta el refugio de los
ajolotes (Fig. 6):

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Figura 6. Localización de los sitios donde se cuantificaron coliformes fecales en el
agua de los canales. San Lorenzo (SL), canal dentro de zona urbana, poco profundo
(0.5 m) y con desagües de aguas negras directos de las casas. La santísima(S),
canal dentro de la zona urbana, con mayor profundidad (1.2 m). Apatlaco (A), canal
que conecta hacia el sitio ecológico, amplio y con más profundidad (2.2 m). Refugio
Teshuilo (T), canal donde se encuentran los ajolotes, profundidad (1.2 m).

D. F.
Zona lacustre
México
San Lorenzo

La Santísima

Apatlaco

Refugio Teshuilo
24

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2. Cepas de referencia

La cepa de referencia que se usó para la caracterización fenotípica y genotípica fue A.
hydrophila ATCC 7966, originalmente aislada de una lata de leche con olor a pescado.
Las cepa de referencia que se usó para determinar la formación de biopelícula fue A.
caviae Sch3. Ambas cepas fueron donadas por la Dra. Castro – Escarpulli de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas-IPN (México).

3. Muestreo en piel del ajolote

El estudio se realizó a partir de la muestra de 17 ajolotes ubicados en el canal del refugio
Teshuilo, los cuales fueron capturados de Abril a Julio del 2010, con redes, con la menor
manipulación posible, para realizarles cinco lavados superficiales en dorso y branquias,
con una pizeta con agua estéril (Fig. 7). En seguida se tomó una muestra con hisopos
estériles, 9 cm2 aprox. en piel de la parte dorsal y en branquias, en condiciones asépticas.
Los hisopos se llevaron de derecha a izquierda, iniciando en la parte superior hasta la
parte inferior, para obtener un barrido lo más uniformemente posible en el área designada
de acuerdo al protocolo descrito por Lauer y colaboradores (2007). Después del barrido
los hisopos se colocaron en tubos de 10 mL conteniendo un medio de transporte Cary –
Blair estéril (Difco).

Figura 7. Muestreo en piel del ajolote (Ambystoma mexicanum) en el refugio
Teshuilo, en la zona lacustre de Xochimilco.

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4. Muestreo en agua del refugio del ajolote

Las muestras de agua de los cuatro puntos (Refugio Teshuilo, San Lorenzo, La Santísima
y Apatlaco) se realizaron a 50 cm de la superficie, se tomaron 250 mL de agua en frascos
de vidrio estériles, del mismo sitio donde se colectaron los ajolotes. En total se obtuvieron
10 muestras de agua del refugio Teshuilo para el aislamiento de Aeromonas, mientras
que en los otros canales (San Lorenzo, La Santísima y Apatlaco) sólo 2 muestras de agua
para el análisis de bacterias coliformes (Fig. 8).

Figura 8. Canal donde se ubica el refugio Teshuilo, en la zona lacustre de
Xochimilco. Fotografías tomadas para ilustrar este trabajo.

5. Aislamiento de Aeromonas spp., de la piel y del agua en la zona lacustre de
Xochimilco

Las muestras directas de la piel de los ajolote y del agua, se diluyeron hasta 10-3 para
obtener una cuantificación de bacterias mesófilas aerobias, bacterias metilotrofas,
bacterias oligotrofas y Aeromonas spp., mediante el método de cuantificación en placa
(American Public Health Association, 1985). Se sembraron por espatulado en agar soya y
tripticaseína (TSA) como medio de cultivo general y en agar cromogénica (CromoCen)
como medio diferencial para Aeromonas spp. Además las muestras de la piel delanfibio
se sembraron en agar con sales y minerales de amonio (AMS-Ammonium Mineral Salts)
como medio de cultivo para bacterias metilotrofas y en gelosa mínima en nutrientes (R2A)
como medio de cultivo para bacterias oligotrofas. Para el aislamiento de colonias puras,
se realizaron resiembras en estría cruzada, a partir del medio de cultivo CromoCen y R2A,
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se mantuvieron a mediano plazo, en tubos con TSA, y a largo plazo en congelación a -70
0C en caldo LB (Luria Berttani) con 20% de glicerol. Para determinar la concentración de
bacterias coliformes totales y fecales en las muestras de agua, se realizaron diluciones
hasta 10-5 y se siguió la técnica de tubos múltiples de fermentación. Se sembró 1 mL de la
muestra en tubos múltiples de fermentación con campanas de Durham y caldo lactosado;
después de una incubación a 37oC/ 24 h, los tubos con gas en las campanas de Durham
(considerados positivos a la prueba) se inocularon 100 L a tubos con caldo verde
brillante; y después de una incubación a 37oC/ 24 h, se tomaron 100 L de cada tubo
positivo y se inocularon en tubos de fermentación con caldo EC, los cuales se incubaron a
45oC/ 24 a 48 h, para comparar las tablas del número más probable.

6. Caracterización fenotípica de aislados presuntivos de Aeromonas spp.

Se realizó una caracterización fenotípica de cada aislado, iniciando con el registro del
color de la colonia, importante sobre todo para los aislamientos del medio de cultivo
cromogénico, ya que se puede tener el crecimiento de enterobacterias (color violeta) y
Pseudomonas (salmón), además de Aeromonas spp. (verde-morado); con dicha
información se realizaron aislamientos dirigidos sobre todo para colonias verde-morado,
aunque también se realizaron aislamientos de colonias color salmón por ser las más
abundantes.

Pruebas bioquímicas

Para corroborar que las bacterias fueran Gram negativas, se colocó una gota de hidróxido
de potasio (KOH) al 3% en un cubreobjetos y se disolvió una asada de la bacteria para
observar su reacción, si la solución forma hilo viscoso, es indicativo de ser una bacteria
Gram negativa, por el contrario si la reacción es negativa, es indicativo de ser una
bacteria Gram positiva, ya que hay resistencia de las paredes de la bacteria a la acción
del hidróxido, por lo que resisten la solubilización (Pérez et al., 1987). Dicha prueba es
relevante sobre todo para los aislados del medio de cultivo R2A, ya que también pueden
crecer bacterias Gram positivas.

Se determinó la presencia de catalasa y citocromo oxidasa, ya que las especies de
Aeromonas tienen ambas enzimas. La catalasa es una enzima que cataliza la ruptura del
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peróxido de hidrógeno en oxígeno y una molécula de agua; la prueba para determinar el
contenido de catalasas consiste en suspender una asada de cada aislado en peróxido de
hidrógeno al 3% y observar la producción de burbujas si es que se trata de una bacteria
catalasa positiva. La citocromo oxidasa es una enzima involucrada en procesos de óxido-
reducción durante la transferencia de electrones; para determinar el contenido de oxidasa
se utiliza diclorhidrato de tetrametil p – fenil – diamina al 1%, impregnada en papel filtro y
se expuso una asada de la bacteria por espatulado para observar el viraje de color (azul si
es oxidasa positiva e incoloro si es oxidasa negativa).

Para descartar los aislados de otras bacterias oxidasa positivas como Pseudomonas spp.,
o Shewanella spp. se utilizó el medio TSI (Agar de hierro y triple azúcar, por sus siglas en
inglés) como medio diferencial. Se prepararon tubos inclinados con el medio TSI (color
anaranjado), se inoculó cada aislado y se incubaron a 30 0C/ 24 h. Si se observa un viraje
de color a amarillo es indicativo de utilización de glucosa, sacarosa o lactosa. Para ésta
prueba Pseudomonas spp. es negativa, por lo que nos permitió descartar a éste tipo de
bacterias. Shewanella spp. es positiva igual que Aeromonas spp., sin embargo en el
medio TSI se puede evaluar la capacidad de las bacterias como Shewanella spp., para
reducir el sulfuro de hidrógeno, quien reacciona con el sulfato ferroso del medio de cultivo
y produce sulfuro de hierro, observándose en el medio precipitaciones de color negro, lo
que nos permitió descartar a este tipo de bacterias (Pérez et al., 1987).

Se sabe que las especies de Aeromonas utilizan a la glucosa como principal recurso de
carbono y energía, por lo que se utilizó el medio O/F (oxidación – fermentación) de Hugh y
Leifson adicionado con dextrosa. En dicha prueba se preparó el medio de cultivo en tubos
por duplicado para cada aislado, ya que de acuerdo al protocolo Mac Faddin (2003), se
puede analizar la utilización de glucosa por oxidación o fermentación. Para ello en uno de
los duplicados se agregó aceite mineral, para generar un ambiente anaerobio y así
evaluar la utilización de glucosa por fermentación y/ o oxidación. El medio es inicialmente
verde, se inocula y se incuba a 300C/ 24 h, y se analiza el viraje de color a amarillo en
ambos tubos (con y sin aceite mineral) si es que las bacterias utilizan glucosa por
fermentación, como es el caso del género Aeromonas.

También se sabe que las especies de Aeromonas producen triptofanasas, enzimas que
catalizan la oxidación del triptófano y producen indol; por lo que se determinó la
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producción de indol y movilidad utilizando el medio SIM, que es un medio semisólido
donde se puede observar por turbiedad la movilidad de bacterias y utilizando el reactivo
de Kovacs se puede determinar la producción de indol al virar de color dicho reactivo, de
amarillo inicial a rojo en caso de reacción positiva. Además de confirmar la no producción
de sulfuro de hierro, como en el medio TSI, por precipitaciones de color negro que solo se
presenta en productores de sulfuro de hidrógeno, como Shewanella spp.

Sistema automatizado, Vitek

En algunos casos se incluyó la identificación por el sistema automatizado VITEK
(Biomeriéux), como una prueba presuntiva para identificar bacterias pertenecientes al
género Aeromonas. Se siguió el protocolo establecido para el sistema donde se diluye
una asada de cultivo fresco de la bacteria en solución salina (0.45 %), se ajusta la
densidad bacteriana a 0.5 McFarland (1.5 x108 UFC/mL) y en vacío se llenan las tarjetas
de identificación GNI, para la identificación de bacterias Gram negativas. Se incubó 18 h a
37 0C, obteniendo resultados de acuerdo a las 35 bioquímicas de la tarjeta y de su
comparación automática en la biblioteca interna del sistema.

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7. Detección de genes putativos de virulencia

Mediante PCR múltiple (Polymerase Change Reaction multiplex), se analizó la presencia
de 5 factores putativos de virulencia (Tabla 6) relacionados con adherencia y producción
de toxinas (gcat – glicerofosfolípido colesterol acil transferasa, alt – enterotoxina
citotónica, aer/hem – aerolisina/hemolisina, ast – proteasa y lafA – flagelo) utilizando los
oligonucleótidos correspondientes para cada gen (Aguilera-Arreola et al., 2011).

Tabla 6. Secuencias de los oligonucleótidosde cada uno de los 5 genes putativos
de virulencia.
Gen Secuencia de iniciadores
(5’ – 3’)

Tamaño del
amplificado
(pb)
Cepa para
diseño de
primers
gcat* gcat-F: 5´CTCCTGGAATCCCAAGTATCAG-3´
gcat-R: 5´GGCAGGTTGAACAGCAGTATCT-3´
237 varios
alt** alt-F: 5´AAAGCGTCTGACAGCGAAGT-3´
alt-R: 5´AGCGCATAGGCGTTCTCTT-3´
320 A. hydrophila
SSU
aer/hem*** aer-F: 5´CCTATGGCCTGAGCGAGAAG-3´
aer-R: 5´CCAGTTCCAGTCCCACCACT-3´
431 A. hydrophila
A. salmonicida
A. sobria
A. caviae
A. trota
ast** ast-F: 5´ATCGTCAGCGACAGCTTCTT-3`
ast-R: 5´CTCATCCCTTGGCTTGTTGT-3
504 A. hydrophila
SSU
lafA** lafA-F: 5´CAAACTT(T/C)GC(C/T)TC(T/C)(C/A)TGACC-3´
lafA-R: 5´TCTTGGTCAT(G/A)TTGGTGCT(C/T)-3´
743 A. caviae Sch3
*Chacón et al., 2002. ** Aguilera-Arreola et al., 2011. ***Soler et al., 2002.

Los oligonucleótidos se hidrataron a una concentración stock 1mM, realizando los
cálculos necesarios para cada uno de acuerdo a la siguiente fórmula (Sambrook y
Russell, 2001) y haciendo diluciones necesarias para obtener una concentración de 5M
para cada oligonucleótido para PCR múltiple.

V= Absorbancia a 260nm X 1000
Coeficiente de extinción (concentración stock)

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Las condiciones y mezcla de reacción de la PCR múltiple (Tabla 7) se realizó con base a
las publicaciones de Chacón y col. (2002), Aguilera – Arreola y col. (2011).

Tabla 7. Condiciones de reacción de la PCR múltiple.
gcat, aer/hem, lafA
Etapa Temperatura
(oC)
Tiempo
(min.)
Ciclos
Desnaturalización inicial 95 5
Desnaturalización 94 1
Alineamiento 56 1
Extensión 72 1
20
alt, ast
Etapa Temperatura
(oC)
Tiempo
(min.)
Ciclos
Desnaturalización 94 1
Alineamiento 54 1
Extensión 72 1
Extensión final 72 10
15

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La mezcla de reacción (Tabla 8) se ajustó a la estandarización descrita por Aguilera –
Arreola y col. (2011), modificando el volumen de DNA y ajustando el volumen de agua
ultrapura para obtener un volumen final de 50 L en cada mezcla de reacción.

Tabla 8. Mezcla de reacción estandarizada para la PCR múltiple.
Reactivo Concentración
inicial
Volumen por tubo
de reacción (L)
Concentración
final
Agua ultrapura 16.7
Regulador PCR 10X 5 1X
dNTP’s 2 mM 7.5 300 M
MgCl2 50 mM 1.8 1.8 mM
gcat F
gcat R
5 M
2.5
2.5
0.25 M
alt F
alt R
5 M
1.5
1.5
0.15 M
aer/hem F
aer/hem F
5 M
1.5
1.5
0.15 M
ast F
ast F
5 M
1.0
1.0
0.10 M
lafA F
lafA F
5 M
1.5
1.5
0.15 M
Taq polimerasa 5 U 0.5 2.5 U/L
DNA 2.5

Los amplificados se comprobaron por electroforesis de agarosa al 1.5%, tiñendo las
secuencias con bromuro de etidio (10 mg/mL), observando a través de un transiluminador
UV y archivando los resultados a través de una fotografía del gel.

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8. Identificación

8.1 Extracción de DNA

Se utilizó el kit de extracción de DNA QIAamp DNA Mini kit (QIAgen) y se siguió el
protocolo del fabricante correspondiente para la extracción de DNA a partir de una
bacteriano de toda la noche, descrito a continuación:
1. Pipetear 1.0 - 1.5 mL de cultivo de toda la noche, de cada aislado, en tubos
eppendorf de 1.5 mL.
2. Centrifugar a 6000 x g /5 min para precipitar las células en un botón, desechar el
sobrenadante.
3. Adicionar 20 L de proteinasa K, resuspender botón en vortex e incubar a 56oC /2
h (agitar en vortex cada hora).
4. Centrifugar para remover gotas, pulsos de 6000 x g.
5. Adicionar 200 L de regulador AL, mezclar en vortex 15 seg. e incubar a 70oC /10
min.
6. Adicionar 200 L de etanol (96 – 100%), mezclar en vortex 15 seg. y centrifugar un
pulso de 6000 x g, para remover gotas.
7. Aplicar la mezcla anterior a la columna con tubo colector 2 mL, sin tocar los
bordes. Cerrar la tapa y centrifugar a 6000 x g /1 min, para obtener el DNA más
impurezas en la matriz de la columna; desechar el filtrado con restos proteínicos y
cambiar el tubo colector por uno limpio.
8. Adicionar 500 L de regulador AW1 sin tocar los bordes, para eluir impurezas
asociadas al DNA. Centrifugar 6000 x g /1 min, desechar el filtrado y cambiar el tubo
colector por uno limpio.
9. Adicionar 500 L de regulador AW2 sin tocar los bordes. Centrifugar 20,000 x g /3
min, desechar el filtrado
10. Se recomienda cambiar el tubo colector por uno limpio y centrifugar a máxima
velocidad /1min para eliminar excesos del regulador.
11. Cambiar la columna, a un tubo limpio de 1.5 mL, y adicionar 50 – 70 L de agua
ultrapura.
12. Incubar a temperatura ambiente / 5 min, y centrifugar 6000 x g / 1 min.
13. Repetir el paso 11 y 12, para obtener DNA en volumen final de 100 – 140 L.
33

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14. Se observó la integridad del DNA mediante electroforesis en 1% de agarosa, el
cual se reveló con bromuro de etidio (10 mg/mL) y se observó a través de un
transiluminador UV.

8.2 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) del gen 16S rRNA

La identificación genética se realizó con base al protocolo del análisis de los patrones de
RFLP del gen 16S rRNA propuesto por Figueras y colaboradores (2000).

La amplificación del gen 16S rRNA se realizó en un termociclador con un volumen de
mezcla de reacción final de 50 μL utilizando los iniciadores universales que se muestran
en la tabla 9 (Borrel et al., 1997; Figueras et al., 2000; Castro-Escarpulli, 2002).

Tabla 9. Secuencias de los iniciadores de los genes universales para amplificar el
gen 16S rRNA.
Gen Secuencia de iniciadores
(5’ – 3’)
Tamaño del
amplificado
(pb)

16S

16S- S : 5´GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3´
16S-Anti S: 5´AGA GTT TGA TCA TGG CTC A -3´

1502

Tabla 10. Condiciones de reacción para amplificar el gen 16S rRNA.
16S
Etapa Temperatura
(oC)
Tiempo
(seg.)
Ciclos
Desnaturalización inicial 94 60 1
Desnaturalización 94 60
Alineamiento 56 30
Extensión 72 90
30
Extensión final 72 300 1
4 ∞

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Tabla 11. Mezcla de reacción para amplificar el gen 16S rRNA.
Reactivo Concentració
n inicial
Volumen por tubo
de reacción (L)
Concentración
final
Agua ultrapura 31.8
Regulador PCR 10X 5 1X
dNTP’s 2 mM 5 200 M
MgCl2 50 mM 1.5 1.5 mM
16S F
16S R
10 M 2
2
0.4 M
Taq polimerasa 5 U 0.2 1 U/L
DNA 2.5

Los amplificados se visualizaron por electroforesis de agarosa al 1.5%, tiñendo el gel con
bromuro de etidio (10 mg/mL), y observando a través de un transiluminador UV los
amplificados esperados. Los resultados se archivaron a través de una fotografía del gel.

Teniendo el amplificado, se utilizó el kit QIAquick Spin PCR purification (QIAgen) para
quitar impurezas de la mezcla de reacción del PCR (exceso de oligonucleótidos, regulador
de PCR, dNTPs), siguiendo el protocolo del fabricante, descrito a continuación:

1. Adicionar