Deteccion-de-resistencia-en-Mycobacterium-tuberculosis-a-isoniacida-mediante-la-amplificacion-de-los-genes-inhA-y-ahpC-empleando-la-reaccion-de-PCR-en-punto-final

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 Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán 
 
 
“Determinación de la resistencia en Mycobacterium tuberculosis 
a isoniácida mediante la amplificación de los genes inhA y ahpC 
empleando la reacción de PCR en punto final” 
 
T E S I S 
 
Que para obtener el título de: 
 
 Químico Farmacéutico Biólogo 
 
Presenta: 
 
José Pablo García Ruiz 
 
Asesores: 
M en C. Maribel González Villa 
 QFB. Iliana Alejandra Cortez Ortiz 
 Dra. Susana Elisa Mendoza Elvira 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MEX. 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
ii 
 
 
 
 
 
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Este proyecto fue realizado en las instalaciones del laboratorio de 
Diagnostico y Tipificación Molecular del Instituto de Diagnostico y 
Referencia Epidemiológicos (InDRE). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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DEDICATORIA 
 
 
A mi madre que siempre me ha brindado su apoyo y dado el ánimo 
para conseguir mis metas en la vida, te quiero con todo mi corazón. 
Gracias Mamá 
 
A los otros dos químicos de la familia, mis hermanos, Emilio y Guido 
por su apoyo incondicional durante mi formación académica, por todos 
sus consejos y buena compañía siempre. 
 
Para mis amigos por todos esos momentos de alegría, por compartir 
tantas aventuras, experiencias, risas y tanta buena broma. 
 
 
 
 
 
 
 
Nunca es Suficiente. . . 
 
v 
 
AGRADECIMIENTOS 
Quiero agradecer a todo el personal del Laboratorio de Diagnostico y Tipificación 
Molecular del InDRE y en especial a la QFB. Iliana Alejandra Cortez Ortiz por 
darme la oportunidad de formar parte de su equipo de trabajo permitiéndome 
desarrollar este proyecto. 
A la M en C. Maribel González Villa, por su ayuda y asesoramiento en la 
realización de este trabajo. Gracias Du! 
A Elizabeth Andrade Montiel y Carina Berenice Brito Loran por todo el apoyo, 
consejos y enseñanzas que me proporcionaron durante mi estancia en el 
laboratorio, pero sobre todo por la amistad sincera que me han brindado. 
Muchas gracias. 
A la Universidad Nacional Autónoma de México y a sus profesores que 
participaron en mi desarrollo profesional durante mi carrera, sin su ayuda y 
conocimientos no estaría en donde me encuentro ahora. 
 
Y a todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron 
en la realización de esta investigación, hago extensivo mi más sincero 
agradecimiento 
 
 
 
vi 
 
 
 
i 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
ABREVIATURAS ..................................................................................................... iii 
ÍNDICE DE TABLAS................................................................................................. iv 
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................... iv 
RESUMEN ............................................................................................................... vi 
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 1 
1.1 Antecedentes y epidemiología de la tuberculosis ..................................................... 1 
1.2 Reemergencia y persistencia de la tuberculosis ....................................................... 1 
1.3 Transmisión y patogenia de la tuberculosis ............................................................. 2 
1.4 Mycobacterium tuberculosis ..................................................................................... 4 
1.4.1 Generalidades del género Mycobacterium ......................................................... 4 
1.4.2 El Complejo Mycobacterium tuberculosis ........................................................... 5 
1.4.3 Genoma de Mycobacterium tuberculosis ........................................................... 6 
1.5 Farmacorresistencia ................................................................................................. 7 
1.6 Diagnóstico .............................................................................................................. 8 
1.6.1 Diagnóstico de tuberculosis latente .................................................................... 8 
1.6.2 Diagnóstico de tuberculosis activa ..................................................................... 9 
1.6.3 Diagnóstico molecular del Complejo M. tuberculosis........................................ 11 
1.7 Técnicas de determinación de susceptibilidad a fármacos ..................................... 12 
1.7.1 Ensayos fenotípicos ......................................................................................... 13 
1.7.2 Ensayos genotípicos ....................................................................................... 13 
1.7.2.1 Secuenciación............................................................................................... 14 
1.8 Tratamiento ............................................................................................................ 15 
1.9 Prevención ............................................................................................................. 17 
1.9.1 Vacuna BCG .................................................................................................... 17 
 
ii 
 
1.10 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................. 18 
1.11 HIPÓTESIS ......................................................................................................... 18 
2. OBJETIVO GENERAL ......................................................................................... 19 
2.1 Objetivos particulares ............................................................................................. 19 
3. DISEÑO EXPERIMENTAL.................................................................................... 20 
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 21 
4.1 Material biológico ................................................................................................... 21 
4.2 Obtención de DNA de las cepas de estudio ........................................................... 22 
4.3 Amplificación de los genes implicados a resistencia ............................................... 22 
4.3.1 Amplificación del gen inhA ............................................................................... 22 
4.3.2 Amplificación del gen ahpC .............................................................................. 22 
4.4 Condiciones del termociclador PCR punto final ...................................................... 23 
4.5 Visualización de los amplicones ............................................................................. 24 
4.6 Cuantificación de los amplicones............................................................................ 24 
4.7 Secuenciación ........................................................................................................ 25 
4.8 Análisis de secuencias ........................................................................................... 25 
5. RESULTADOS ....................................................................................................25 
5.1 Detección de los genes ahpC y inhA en las cepas de estudio ................................ 25 
5.2 Cuantificación de los amplicones por electroforesis en DNA chip ........................... 27 
5.3 Mutaciones detectadas relacionadas con la resistencia a la INH ............................ 30 
6. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 32 
7. CONCLUSIONES ................................................................................................ 35 
ANEXO I ................................................................................................................. 36 
ANEXO II ................................................................................................................ 39 
ANEXO III ............................................................................................................... 41 
8. REFERENCIAS ................................................................................................... 44 
 
iii 
 
ABREVIATURAS 
 
Abreviatura Significado Traducción 
°C Grados centígrados 
ahpC Gen de la alquil-hidroperóxido reductasa 
BCG Bacilo de Calmette-Guérin 
BAAR Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes 
CMI Concentración Mínima Inhibitoria 
DNA Ácido desoxirribonucléico 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético 
g Gramo 
InDRE Instituto de Diagnóstico y Referencia 
Epidemiológicos 
 
IS Insertion sequence Secuencia de inserción 
INH Isoniácida 
inhA Gen de la acil-enoil-reductasa 
katG Gen de la catalasa-peroxidasa 
L Litro 
µL Microlitro 
M Molar 
mMol Milimolar 
MPM Marcador de Pesos Moleculares 
mg Miligramo 
NCBI National Center for Biotechnology 
Information 
Centro Nacional para la 
Información Biotecnológica 
NOM Norma Oficial Mexicana 
 
 
MPM VIII Marcador de Pesos Moleculares 
PCR Polimerase Chain Reaction Reacción en Cadena de la 
Polimerasa 
PPD Purified Protein Derivative Derivado proteínico 
purificado 
RIF Rifampicina 
SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida 
TAES 
 
Tratamiento Acortado Estrictamente 
Supervisado 
 
TB Tuberculosis 
TBE Tris-Boratos-EDTA 
TB-MD Tuberculosis-Multi-Drug-Resistance Tuberculosis multifármaco 
resistente 
U Unidades 
UFC Unidades Formadoras de Colonias 
VIH Virus de la Inmunodeficiencia Humana 
WHO World Healt Organization Organización Mundial de la 
Salud 
WT Wild Type Tipo silvestre 
 
iv 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Fármacos antituberculosos de primera línea ........................................... 15 
Tabla 2. Tratamiento primario acortado................................................................. 16 
Tabla 3. Descripción de las cepas empleadas ...................................................... 21 
Tabla 4. Iniciadores para la amplificación y secuenciación de nucleótidos ........... 23 
Tabla 5. Concentraciones y tamaños de las 12 cepas amplificadas para los genes 
ahpC e inhA, obtenidas por DNA chip ................................................................... 29 
Tabla 6. Mutaciones detectadas en las secuencias nucleotidicas de los genes 
ahpC e inhA ........................................................................................................... 31 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Patofisiología de la tuberculosis ............................................................... 3 
Figura 2. Mecanismo de resistencia natural.. .......................................................... 8 
Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico de tuberculosis.. ...................................... 10 
Figura 4. Estrategia genotípica para detección de resistencia a los antibióticos en 
M. tuberculosis.. .................................................................................................... 14 
Figura 5. Procedimiento general del tratamiento de las 12 cepas de 
M. tuberculosis analizadas para la amplificación de los genes inhA y ahpC por 
PCR punto final. .................................................................................................... 20 
Figura 6. Programa empleado en el termociclador PCR punto final. ..................... 24 
 
v 
 
Figura 7. Visualización de los productos de PCR para el gen ahpC. .................... 26 
Figura 8. Visualización de los productos de PCR para el gen inhA. ..................... 27 
Figura 9. Corrimiento electroforético obtenido del DNA chip. ................................ 28 
Figura 10. Mutaciones encontradas en los genes inhA y ahpC. ............................ 30 
 
 
vi 
 
RESUMEN 
La isoniácida (INH) es el principal fármaco de primera línea para el tratamiento de 
la tuberculosis. Existen mutaciones en diferentes regiones génicas de 
M. tuberculosis que están implicadas en la aparición de resistencia a INH; el gen 
katG, codifica para la enzima catalasa-peroxidasa es el gen más comúnmente 
afectado, ya que es el responsable de la activación del fármaco sin embargo 
existen otros genes implicados con la resistencia a INH. Las mutaciones en la 
región promotora del gen inhA el cual codifica para la proteína acil-enoil-reductasa, 
implicada en la biosíntesis de ácidos micólicos (blanco de la INH), así como 
mutaciones en el promotor del gen que codifica para la enzima 
alquil-hidroperóxido-reductasa, ahpC, implicado en la respuesta celular al estrés 
oxidativo. 
 
En el trabajo, se investigaron las mutaciones presentes en las regiones 
amplificadas y secuenciadas de los genes ahpC e inhA, relacionados con la 
resistencia a INH en cepas de M. tuberculosis. A partir de una colección de cepas 
de M. tuberculosis, se seleccionaron 12 cepas por contar con las siguientes 
características: fenotípicamente resistentes a INH, siendo determinadas mediante 
el método de las proporciones y con ausencia de mutaciones en el gen katG 
implicadas con la resistencia a INH esto mediante el análisis de una curva de 
disociación por PCR en tiempo real, esto realizado en estudios previos. 
 
Se determinó la presencia de mutaciones en la región reguladora del gen inhA 
resultando en una sobreexpresión, el cual sobrepasa el efecto farmacológico de la 
INH. Se encontraron mutaciones en el promotor del gen ahpC del cual se tiene la 
teoría de que incrementan los niveles de la proteína alquil-hidroperóxido-reductasa 
relacionada con el estrés oxídativo derivado de la activación y metabolismo de la 
INH.
 
1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1 Antecedentes y epidemiología de la tuberculosis 
 
La tuberculosis o TB es una enfermedad infecciosa que ha afectado a la 
humanidad desde la antigüedad, existen evidencias en el hombre principalmente 
en fragmentos de vértebras, que muestra la giba típica de la tuberculosis (Mal de 
Pott). Los ejemplos más antiguos de la tuberculosis espinal se remontan alrededor 
de 8000 a. C. (Ayvazian, 1993). La tuberculosis fue definida como entidad clínica 
con el término de “tuberculosis” en 1830 y el bacilo M. tuberculosis agente causal 
de la enfermedad, fue identificado por Robert Koch en 1882 (Murray, 2004). 
Durante el siglo XIX, se produjo en Europa un declive “natural” de la infección, 
debido a la mejora de las condiciones socio-económicas, con una disminución de 
casos de un 5 a 10 % anual y a partir del descubrimiento de la estreptomicina en 
1946, éste declive se hizo más patente, con disminución de un 12 a 20 % anual 
(Ayvazian, 1993). 
Sin embargo no se puede hablar de la tuberculosis como una patología del pasado 
puesto que sigue siendo la enfermedad infecciosa con mayor prevalencia en el 
mundo, en el año 2008, se estimaba que había una incidencia de 9.9 millones de 
nuevos caso de TB, 13.3 millones de casos prevalentes, de 1.1 a 1.7 millones de 
muertes por tuberculosis entre las personas VIH-negativas y una adicional de 0.45 
a 0.62 millones de muertes por tuberculosis entre personasVIH-positivas 
(WHO, 2009). 
 
1.2 Reemergencia y persistencia de la tuberculosis 
 
La persistencia de la TB se debe a diversos factores entre los cuales destacan los 
problemas socioeconómicos, la falta y descuido de programas de control y falla en 
el seguimiento del tratamiento. Desde el año 1985 se presentó un rebrote de 
casos, coincidiendo con la epidemia de SIDA una de principales causas que han 
 
2 
 
dado lugar a la reemergencia de la tuberculosis (Aliyu y Salihu, 2003), además de 
la aparición de cepas de TB multirresistente (MDR) en muchas zonas geográficas 
(Iseman, 1999). Otro factor importante es la baja y variable eficiencia de la actual 
vacuna contra la tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin (BCG), debido a que 
se encuentra contraindicado para las personas VIH-positivas y sobre todo a su 
baja capacidad para estimular el amplio espectro de células necesaria para inducir 
una respuesta inmune efectiva, (Batoni et al., 2000; Hesseling et al., 2003). 
 
1.3 Transmisión y patogenia de la tuberculosis 
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa aguda o crónica, causada por un 
grupo de bacterias pertenecientes al Complejo M. tuberculosis principalmente por 
M. tuberculosis y M. bovis. La enfermedad se adquiere principalmente por vía 
aérea, las partículas expulsadas en forma de aerosoles que contienen bacilos, son 
suficientemente pequeñas para eludir la 1ª barrera defensiva (aparato mucociliar) 
para alcanzar los alveolos pulmonares, donde comienza la multiplicación de los 
bacilos al inhalar estas partículas provenientes de un enfermo, al toser, hablar o 
estornudar, se estima que es suficiente entre 1 y 10 bacilos para producir la 
infección (Bloom y Murray, 1992). 
Los bacilos que logran evadir el aparato mucociliar y llegar a los alveolos son 
rápidamente rodeados y fagocitados por los macrófagos alveolares, la siguiente 
línea de defensa del hospedero proporcionando una oportunidad para que el 
cuerpo elimine el bacilo invasor y evitar así la infección (Crevel et al., 2002). 
Después de la fagocitosis por los macrófagos comienza una serie de reacciones y 
eventos que derivan, ya sea en el éxito en el control de la infección seguido de 
una TB latente o a la progresión de una TB activa (Frieden et al., 2003). El 
resultado es esencialmente determinado por la calidad del sistema inmune del 
hospedero y el equilibrio que se produce contra el bacilo invasor 
(Crevel et al., 2002). 
 
 
3 
 
En muchos casos los macrófagos, monocitos reclutados y las células dendríticas 
son incapaces de contener la infección, el bacilo sobrevive y se multiplica de 
manera intracelular, otorgándole ventajas importantes al bacilo, debido a que 
queda protegido de los mecanismos efectores de la respuesta inmune del 
hospedero, como la lisis por el complemento; además, las características 
estructurales de su envoltura le proporcionan resistencia a los agentes 
microbicidas y a la destrucción por el calor (Wolinsky et al,. 1990; Frieden et al., 
2003; American Thoracic Society and Centers for Disease Control and Prevention, 
2000). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Patofisiología de la tuberculosis: inhalación de bacilos (A), contención en un 
granuloma (B), y rompimiento del granuloma en individuos no inmunocompetentes (C). Tomado y 
adaptado de American Thoracic Society and Centers for Disease Control and Prevention, 2000. 
 
 
4 
 
El siguiente sistema de defensa es la formación de granulomas, lesiones de tipo 
nodular compuestas por agregados celulares de defensa que rodean el sitio de la 
infección caracterizada por poseer un ambiente hipóxico, situación responsable de 
mantener bajos los niveles de replicación bacteriana (Frieden et al., 2003; Nicod, 
2007). En el interior del granuloma pueden formarse lesiones necróticas 
(caseificación) que permiten la presencia de bacilos en el espacio extracelular, 
favoreciéndose la existencia de microambientes con áreas anaeróbicas. De este 
modo, la adaptación a los bajos niveles de oxígeno es un factor importante que 
incrementa la capacidad de M .tuberculosis para persistir en el hospedero. Sin 
embargo, el desarrollo de la necrosis no conduce necesariamente a la 
diseminación y puede proveer un ambiente que prevenga la transmisión y 
dispersión de la TB (Raupach y Kaufman 2001). En la mayoría de los casos los 
granulomas logran contener la infección y diseminación del bacilo, este se puede 
encontrar ya sea en un periodo de latencia no replicativo o replicando activamente 
pero siendo a su vez eliminado por el sistema inmune de la persona infectada, o 
podría estar alternando ciclos de replicación intermitentes (Flynn y Chan, 2001). 
En las personas inmunosuprimidas, la formación de granulomas, no se realiza 
correctamente y no es del todo funcional en la contención de los bacilos. La 
necrosis del tejido se somete a licuefacción, y la pared fibrosa pierde integridad. El 
material necrótico semilíquido puede ser drenado a vasos sanguíneos y linfáticos 
dando lugar a la aparición de una tuberculosis extrapulmonar, pudiendo afectar a 
cualquier órgano del cuerpo y la formación de nuevos granulomas caseosos. Los 
síntomas y el grado de severidad de la enfermedad dependerán del órgano 
comprometido en la infección (Dheda, 2005). 
1.4 Mycobacterium tuberculosis 
1.4.1 Generalidades del género Mycobacterium 
 
El género Mycobacterium pertenece a la familia Mycobacteriaceae, está 
conformado por bacilos largos y curvos de 0.2 a 0.6 µm de ancho y de 3 a 5 µm de 
longitud, son inmóviles, no esporulados, resistentes a la decoloración con 
 
5 
 
ácido-alcohol una vez que son teñidos, debido a su alto contenido en lípidos 
(20-60%). La mayoría de ellos son aerobios y de crecimiento lento. 
Presentan ácidos micólicos de 60-90 átomos de carbono y tienen parad celular 
tipo IV (arabinosa, galactosa y ácido meso-diaminopimélico). Su contenido en 
guanina y citocina (G+C), en el DNA se encuentra entre 62 y 70 mol % (Wayne y 
Kubica 1986). 
Los bacilos se clasifican de acuerdo a su velocidad de crecimiento, rápido o lento, 
según sea superior o inferior a una semana; producción de pigmento en presencia 
o ausencia de luz (fotocromógeno, escotocromógeno y no cromógeno) y 
características coloniales (Runyon et al., 1974). 
Actualmente existen más de 120 especies aceptadas dentro del género 
Mycobacterium, de hecho el número de micobacterías consideradas como 
patógenas para el ser humano asciende a más de 60 especies lo cual representa 
un reto para el diagnóstico clínico (Heifets y Desmond, 2005). 
 
1.4.2 El Complejo Mycobacterium tuberculosis 
 
La taxonomía del genero Mycobacterium ha estado ligada con otras especies de 
bacterias como Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus, por su gran similitud 
bioquímica y antigénica entre estos géneros, ensayos de taxonomía numérica y 
quimiotaxonomia han permitido la diferenciación entre éstas, a pesar de dichos 
ensayos se ha optado por agrupar especies en complejos por cuestiones 
prácticas, basándose en parámetros fenotípicos y epidemiológicos. De tal forma 
que M. tuberculosis pertenece al complejo que lleva el mismo nombre, el cual 
comprende a cinco especies: M. tuberculosis, M. bovis, M. canettii, M. microti, 
M. africanum (Sreevatsan et al., 1997; Rastogi et al., 2001). 
 
 
 
6 
 
1.4.3 Genoma de Mycobacterium tuberculosis 
 
La cepa M. tuberculosis H37Rv fue aislada por primera vez en 1905, la cepa se ha 
mantenido patógena durante todo este tiempo y es ampliamente utilizada en la 
investigación de la tuberculosis. La secuencia completa de su genoma fue 
publicada en 1998 (Cole et al., 1998). En la secuencia original de la cepa H37Rv 
fueron identificados 3, 974 genes con 4, 411, 529 pares de bases de los cuales 
3, 924 genes codifican para diferentes proteínas y 50 para RNA estables(Cole et al., 1998). 
El genoma de M. tuberculosis difiere respecto al resto de bacterias por poseer dos 
nuevas familias de proteínas ricas en glicina, cuya estructura repetitiva 
proporciona una fuente importante de variabilidad antigénica; se calcula que un 
10% de la capacidad codificante de M. tuberculosis va destinado a esta familia 
multigénica, es un genoma rico en DNA repetitivo en forma de secuencias de 
inserción de las cuales posee cuatro diferentes elementos de inserción (IS). La 
IS6110, de la que se han hallado de 16 a 25 copias, IS1081 con 6 copias, IS1547 
con 2 copias. Tras la reanotación del genoma un 52 % de las proteínas predichas 
tienen una función asociada y solo un 10 % no presentan similitud con otras 
proteínas y podrían ser exclusivas de M. tuberculosis (Camus et al., 2002). 
Del genoma se deduce que M. tuberculosis tiene la capacidad de sintetizar todos 
los aminoácidos, vitaminas y cofactores esenciales, así como el potencial 
metabólico de adaptarse a ambientes aeróbicos, microaerofilicos y anaeróbicos 
(Brondin et al., 2005). 
Los 3, 924 genes identificados suponen un 91% de la capacidad codificante del 
genoma. Haciendo uso de la información disponible en bases de datos, y 
realizando comparaciones de secuencias, se ha imputado una función precisa a 
un 40 % de los genes predichos, y para otro 44 % se ha encontrado secuencias 
similares o información relacionada. El 16 % restante alberga genes de función 
desconocida (Cole et al., 1998). 
 
7 
 
1.5 Farmacorresistencia 
 
Las micobacterias presentan una resistencia natural a los antibióticos por la 
compleja pared celular que poseen, altamente hidrófoba y de muy baja 
permeabilidad, lo que dificulta la entrada de una cantidad importante de fármacos, 
por ello es necesario emplear fármacos con actividad antituberculosa especifica 
(De Rossi et al., 2006). 
La resistencia a los diferentes antibióticos principalmente a isoniácida (INH) y 
rifampicina (RIF), en gran parte es atribuida a las mutaciones genéticas. El bacilo 
tuberculoso tiene tasas espontáneas y predecibles de mutaciones cromosómicas 
que le confieren resistencia a los agentes antimicrobianos. El surgimiento de la 
resistencia a los antibióticos se produce debido a mutaciones al azar preexistentes 
en las poblaciones de bacilos como se resume en la figura 2. Cuando se 
administra una monoterapia en el tratamiento de la TB, la mayoría de los bacilos 
sensibles son inhibidos o eliminados, pero se favorece la selección de mutantes 
resistentes al fármaco administrado, además debido a la población elevada y la 
continua multiplicación de los bacilos mutantes resistentes se tornan en mayoría 
(Caminero 2001; Parsons et al., 2004). 
La resistencia se clasifica como adquirida cuando los bacilos mutantes resistentes 
a los antibióticos son seleccionados como resultado de un tratamiento ineficaz, 
o como la resistencia primaria cuando un paciente está infectado con una cepa 
resistente. Las mutaciones en el genoma de M. tuberculosis que pueden conferir 
resistencia a los medicamentos anti-TB se producen de forma espontánea con una 
frecuencia estimada de 3.5 × 106 para INH y 3.1 × 108 para RIF. Debido a que los 
loci cromosómicos responsables de la resistencia a varios de los fármacos no 
están vinculados, el riesgo de una doble espontánea mutación es extremadamente 
bajo, de 9 ×10-14 para INH y RIF (Dooley y Simone, 1994). 
 
 
 
 
8 
 
Pocas bacterias naturalmente Resistencia adquirida Resistencia primaria 
resistentes (mutaciones) Sobrecrecimiento de MO resistentes Transmisión a diferente 
 INH = 3.5 x 10
-6 
(mutantes) en el mismo hospedero hospedero 
 RIF = 3.1 x 10
-8 
 
 
 Selección 
 
Figura 2. Mecanismo de resistencia natural. La resistencia adquirida se desarrolla debido a la 
selección natural, que está en función de un tratamiento ineficaz o incumplimiento 
(Johnson et al., 2004). 
 
 
La tuberculosis multirresistente (TB-MDR) se define como resistencia al menos a 
INH y RIF, se produce principalmente en circunstancias en las que se continúa 
administrando un tratamiento fallido y la resistencia del bacilo es sostenida. El 
mecanismo de resistencia a la rifampicina implica mutaciones en una región bien 
caracterizada en el gen rpoB que codifica la subunidad β de la RNA polimerasa 
(Telenti et al., 1993), por lo cual, la investigación de resistencia a la rifampicina es 
relativamente sencilla. Por el contrario, la resistencia a la INH se asocia con una 
variedad de mutaciones que afectan a uno o más genes, como los que codifican 
para la enzima catalasa-peroxidasa cuyo gen es katG (Zhang et al., 1992), la 
proteína acil-enoil-reductasa codificada por el gen inhA, involucrada en la 
biosíntesis de ácidos micólicos y el gen ahpC recientemente descrito que codifica 
para una alquil-hidroperóxido reductasa, implicada en la respuesta celular al estrés 
oxidativo (Banerjee et al., 1994). 
1.6 Diagnóstico 
1.6.1 Diagnóstico de tuberculosis latente 
 
Las personas con tuberculosis latente no presentan signos ni síntomas de la 
enfermedad y no son fuente de infección (Amberson, 1938). La prueba cutánea 
de la tuberculina se realiza por inyección intradérmica con 0.1 mL de un derivado 
proteico purificado (PPD) que contiene 5 unidades de tuberculina. Después de 48 
a 72 horas, el sitio de aplicación es examinado midiendo el diámetro de la 
 
9 
 
induración, el enrojecimiento es irrelevante. Aunque la prueba es de utilidad 
debido a que la PPD provoca una reacción de hipersensibilidad cutánea en 
personas previamente infectadas con micobacterias, la prueba tiene limitantes 
como son baja sensibilidad y especificidad; en algunos casos se pueden presentar 
falsos negativos en pacientes inmunocomprometidos o desnutridos y que estos 
pacientes no logran montar una respuesta inmune adecuada al igual que la 
posibilidad de resultados falsos positivos debido a que los pacientes pueden 
presentar una infección causada por micobacterias diferentes a M. tuberculosis o 
que han recibido la vacuna BCG (Anderson et al., 2006). La prueba cutánea de la 
tuberculina es la única prueba disponible para detectar la tuberculosis latente. 
 
1.6.2 Diagnóstico de tuberculosis activa 
Aquellas personas con tuberculosis activa son consideradas infecciosas capaces 
de diseminar bacilos tuberculosos a individuos sanos; cuando se sospecha de 
esto se debe seguir un algoritmo de diagnóstico como se muestra en la figura 3, 
los principales obstáculos para el control de la TB activa es la detección de nuevos 
casos de manera oportuna para lograr administrar un tratamiento rápido, 
atribuyéndose principalmente a la condición socioeconómica de las personas que 
viven en países en vías de desarrollo, otro factor influyente es el difícil o nulo 
acceso de las comunidades a programas de salud adecuados como también la 
falta de técnicas de diagnóstico rápidas, sensibles y precisas (Casal,1992). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
10 
 
 
Persona sospechosa de TB pulmonar 
 
 
Búsqueda de BAAR 
en 3 muestras de expectoración 
para examen microscópico 
 
+++ + -- -- + -- -- 
++ -- 
 
Rx Tórax Tratamiento 
Decisión antibiótico 
 medica 
 
 ¿Tuberculosis? ¿Mejoría? 
 
 Búsqueda en bacilos tuberculosos 
 en 3 muestras de expectoración 
 +++ 
 ++ -- -- 
 + -- -- 
 
 Tratar el caso para TB ¿Tuberculosis? 
 
Búsqueda de 
 otro diagnóstico 
Figura 3. Algoritmo para el diagnóstico de tuberculosis. Adaptado del Boletín de Práctica 
Médica Efectiva, Instituto Nacional de Salud Pública-SSA,2006). 
 
El hallazgo de BAAR (bacilos ácido-alcohol resistentes) positivo en frotis teñido 
empleando la tinción de Ziehl-Neelsen y examinado al microscopio es la primera 
evidencia de la presencia de micobacterias en una muestra clínica. Es el 
 
11 
 
procedimiento más fácil y rápido que se puede efectuar, y aporta un diagnóstico 
preeliminar de la enfermedad. Para la correcta realización e interpretación de los 
resultados de un examen microscópico directo deben tenerse en cuenta los 
siguientes hechos: a) la ácido-alcohol resistencia es una propiedad común a todas 
las especies del género Mycobacterium y no sólo de M. tuberculosis, b) la no 
observación de BAAR en una muestra clínica no descarta el diagnóstico de TB, ya 
que es una técnica de sensibilidad limitada. Se estima que la concentración más 
baja de microorganismos que se puede detectar mediante examen microscópico 
es de 104 / mL de muestra (Heifets y Desmond, 2005). 
Todas las muestras clínicas sospechosas de contener micobacterias se deben 
sembrar en medios de cultivo adecuados por las siguientes razones: 
1. Los cultivos son mucho más sensibles que los exámenes microscópicos, al 
punto que pueden detectar una cantidad tan pequeña como 10 bacterias 
por mL de muestra clínica digerida y concentrada; 
2. El aislamiento en cultivo puro es necesario para poder identificar la especie 
de las cepas aisladas, por lo cual se considera como el estándar de oro. 
3. Si la baciloscopia es un índice de la eficacia del tratamiento, el cultivo 
permite asegurar la negativización y curación del paciente. Presenta el 
inconveniente de ser un diagnóstico lento debido a la espera del desarrollo 
de colonias en los medios de cultivo, siendo de en 4 a 6 semanas 
(Casal, 1991). 
1.6.3 Diagnóstico molecular del Complejo M. tuberculosis 
Uno de los actuales recursos para el diagnóstico de tuberculosis es la reacción en 
cadena de la polimerasa, PCR, por sus siglas en inglés. Es una técnica 
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de 
copias de un fragmento de DNA especifico, partiendo de un mínimo, basándose 
en la propiedad de la DNA polimerasa para replicar hebras de DNA; para esto se 
requieren ciclos de altas y bajas temperaturas de manera alternadas para 
desnaturalizar o separar las hebras de DNA y a partir de ellas sintetizar la 
secuencia complementaria del DNA de interés y así obtener amplicones o 
 
12 
 
productos de amplificación de un determinado tamaño molecular 
(Bartlett y Stirling, 2003). 
La PCR es una prueba rápida con buena sensibilidad y especificidad para la 
identificación de patógenos ya que en condiciones óptimas puede detectar de 1-10 
microorganismos en un tiempo mucho menor al cultivo (3-5 días). Así mismo 
gracias a los métodos de extracción disponibles es posible la obtención del DNA 
del microorganismo de interés a partir de cualquier muestra biológica 
(Barrón et al., 2006). Un gran número de ensayos de amplificación de ácidos 
nucleicos para el diagnóstico de la tuberculosis utilizan la secuencia de inserción 
IS6110 (Thierry et al., 1990) como DNA blanco, específico del Complejo 
Mycobacterium tuberculosis. La secuencia IS6110, es un elemento génico de 
inserción que representa secuencias de DNA dispersas en los genomas 
bacterianos con actividad de transposición. La secuencia IS6110 sólo es 
detectable en genomas bacterianos del Complejo Mycobacterium tuberculosis y 
tiene la estabilidad necesaria para ser empleada en el diagnostico 
(Fomukong et al., 1994). Los resultados falsos positivos y los informes de 
reactividad cruzada con otras especies de micobacterias se atribuyen a la 
contaminación en laboratorio con cepas de otras micobacterias o a la 
contaminación debida a pacientes con tuberculosis no diagnosticada o residual 
(Clarridge et al., 1993). Esta técnica tiene como limitante el hecho de que no es 
posible diferenciar entre TB activa o latente, ya que únicamente se esta 
evidenciando la presencia de material genético de la micobacteria, no así de su 
viabilidad. 
1.7 Técnicas de determinación de susceptibilidad a fármacos 
La infección con cepas resistentes y multirresistentes de M. tuberculosis, debido a 
la fácil transmisión del bacilo y el impacto social que representa, conlleva costos 
elevados en cuanto a la aplicación de nuevos esquemas terapéuticos. Por ello, es 
de gran interés e importancia la detección rápida de estos casos para interrumpir 
de manera oportuna la transmisión de los bacilos (Espinal, 2003). Los métodos de 
 
13 
 
susceptibilidad a los antibióticos pueden ser de dos tipos: ensayos fenotípicos, 
cuando se analiza el crecimiento de la bacteria en presencia de antibióticos o 
genotípicos mediante la amplificación y detección de mutaciones en genes 
asociados a la resistencia. Siendo de gran valor en el monitoreo de la resistencia y 
en la aplicación de un adecuado esquema terapéutico que en pacientes infectados 
con cepas de TB-MDR (Brodie y Schluger, 2005). 
1.7.1 Ensayos fenotípicos 
La mayoría de estos métodos fenotípicos anteriormente requerían del crecimiento 
de M. tuberculosis en medio de cultivo para lograr resultados, el principal 
inconveniente era el tiempo prolongado de crecimiento de la bacteria, por lo que 
actualmente se han desarrollado nuevos métodos que ofrecen resultados más 
rápidos, algunos ensayos de este tipo emplean indicadores redox, multiplicación 
de bacteriófagos, detección del consumo de oxígeno, producción de dióxido de 
carbono, este conjunto de técnicas requieren de 7 a 15 días, para proporcionar un 
resultado (Heifets y Desmond, 2005; Palomino, 2006). 
1.7.2 Ensayos genotípicos 
 
Estos ensayos se basan en la detección de mutaciones asociadas con la 
resistencia a fármacos, hay diversos métodos basados en la amplificación de 
marcadores génicos que han sido relacionados con la resistencia hacia los 
fármacos de primera línea mediante la técnica de PCR y su posterior análisis por 
diferentes métodos como se ilustra en la figura 4; permitiendo primero identificar al 
patógeno como M. tuberculosis y de manera simultánea mutaciones asociadas 
con resistencia (Forbes et al., 2005). 
 
 
 
 
14 
 
1.7.2.1 Secuenciación 
 
La secuenciación se ha convertido en el “estándar de oro” para identificación de 
especies de micobacterias y determinación de resistencia genotipica. El método 
consiste en la amplificación por PCR del DNA de la micobacteria con iniciadores 
específicos de la región de interés donde se tiene conocimiento de posibles 
mutaciones en la secuencia de los amplicones obtenidos. El microorganismo y las 
mutaciones se identifican haciendo comparaciones con secuencias de referencia y 
con las secuencias de cepas silvestres susceptibles a los fármacos en estudio 
(Forbes et al., 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estrategia genotípica para detección de resistencia a los antibióticos en 
M. tuberculosis. El primer paso consiste en amplificar por PCR, el fragmento de DNA del gen 
donde se localizan mutaciones asociadas a resistencias a antibióticos. El análisis post-
amplificación consiste en la detección de alteraciones en los sitios de corte por enzimas de 
restricción (RFLP) o alteraciones conformacionales de la molécula de DNA. La secuenciación es 
importante para confirmar e identificar la alteración de la secuencia de DNA (Arraiz et al., 2005). 
 
 
15 
 
1.8 Tratamiento 
 
El principal objetivo del tratamiento es curar al enfermo e interrumpir la cadena de 
transmisión, en el caso del tratamiento de la tuberculosis debe considerarse la 
asociación de dos o más fármacos antituberculosos y mantener el tratamiento por 
un mínimo de seis meses, al igual que la supervisión del tratamiento. El 
tratamiento primario acortado para la TB es administrado en aquellos individuos 
que nohan recibido tratamiento alguno, se incluyen los siguientes fármacos: 
Isoniácida (H), Rifampicina (R), Pirazinamida (Z) y Etambutol (E) según la Norma 
Oficial Mexicana, NOM-006-SSA2-1993, como se muestra en la tabla 1. Debido a 
que el comportamiento biológico de M. tuberculosis da lugar a poblaciones 
bacterianas heterogéneas y mutantes, para el tratamiento de la enfermedad se 
debe utilizar una terapia combinada, nunca monoterapia, para evitar la selección 
de mutantes resistentes. Además el tratamiento debe ser lo suficientemente 
prolongado para permitir eliminar todas las poblaciones bacilares 
(Iribarren et al., 1993). 
Tabla 1. Fármacos antituberculosos de primera línea 
 
Fármacos Presentación Dosis diaria Dosis 
intermitentes 
Reacciones 
adversas 
Niños 
mg/Kg 
peso 
Adultos 
mg/Kg 
peso 
Dosis 
máxima/día 
Niños 
mg/kg 
Adultos 
dosis 
total 
máxima 
Isoniácida 
(H) 
Comprimido 
100 mg 
 
5-10 
 
5-10 
 
300 mg 
 
15-20 
600-
800 mg 
Neuropatía 
periférica 
Hepatitis 
 
Rifampicina 
(R) 
Capsulas 
300 mg 
Jarabe 
100 mg x 5 
mL 
 
 
15 
 
 
10 
 
 
600 mg 
 
 
15-20 
 
 
600 mg 
Hepatitis 
hipersensibilidad 
Interacciones 
medicamentosas 
Pirazinamida 
(Z) 
Comprimido 
500 mg 
25-30 20-30 1.5-5 g 50 2.5 g Gota 
Hepatitis 
 
Estreptomicina 
(S) 
 
Frasco 
ámpula 1 g 
20-30 15 1 g 18 1 g Vértigo 
Hipoacusia 
Dermatosis 
 
Etambutol 
(E) 
Comprimido 
400 mg 
20-30 15-25 1200 mg 50 2400 
mg 
Alteración de la 
visión 
Tomado y adaptado de la Norma Oficial Mexicana NOM-006-SSA2-1993 para la Prevención y 
Control de la Tuberculosis en la Atención Primaria a la Salud. 
 
16 
 
El tratamiento de la tuberculosis se divide en dos fases: una intensiva y una de 
sostén; durante los primeros dos meses de la fase intensiva se administran de 
manera conjunta H, R, Z, E según la NOM-006-SSA2-1993 como se muestra en la 
tabla 2. La finalidad de esta terapia múltiple es prevenir la aparición de 
resistencias eliminando los bacilos que están replicando activamente (isoniácida), 
así como los que se encuentran en lesiones cerradas en condiciones acidas 
(pirazinamida), y la eliminación de los bacilos persistentes para evitar recurrencias 
(rifampicina) (Onyebujoh et al., 2005). En la fase de sostén se administran 
rifampicina e isoniácida para eliminar a los bacilos resistentes a rifampicina, la fase 
dura de 4 a 7 meses dependiendo del éxito de la fase inicial, el cual se verifica 
mediante cultivos después de los primero dos meses de tratamiento 
(Onyebujoh et al., 2005). 
Tabla 2. Tratamiento primario acortado 
 
Fase intensiva Diario, de lunes a sábado, hasta completar 60 dosis. 
Administración en una toma 
Fármacos 
Rifampicina (R) 
Isoniácida (H) 
Pirazinamida (Z) 
Etambutol (E) 
 
Dosis 
600 mg 
300 mg 
1500 mg a 2000 mg 
1200 mg 
 
Fase de sostén 
Intermitente. 3 veces por semana, lunes, miércoles y viernes, hasta 
completar 45 dosis 
Administración en una toma 
Fármacos 
Isoniácida (H) 
Rifampicina (R) 
Dosis 
800 mg 
600 mg 
Tomado y adaptado de la Norma Oficial Mexicana NOM-006-SSA2-1993 para la Prevención y 
Control de la Tuberculosis en la Atención Primaria a la Salud. 
 
 
17 
 
La reducción del número de bacilos emitidos por el enfermo orienta sobre la 
eficacia del tratamiento siempre que se acompañe de una mejoría de sus 
síntomas clínicos. Cuando los pacientes infectados con bacilos son tratados con 
regímenes de primera elección suelen negativizar sus esputos a partir de las 2-3 
semanas de tratamiento (Jenkins et al., 1991). No obstante, en algunos pacientes 
se negativizan antes los cultivos que las baciloscopias, esto es debido a que los 
bacilos que se siguen eliminando están lo suficientemente dañados por el 
tratamiento por lo que no son capaces de desarrollarse en los cultivos. Dando 
lugar a los llamados “falsos positivos” de la baciloscopia (examen microscópico 
positivo con cultivo negativo o “bacilos no viables”). A pesar de la “positividad” de 
la baciloscopia, estos pacientes no suelen tener capacidad contagiante 
(Jenkins et al., 1991). 
1.9 Prevención 
1.9.1 Vacuna BCG 
 
El BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) es una cepa de M. bovis que se ha 
modificado para producir respuesta inmune frente a la tuberculosis sin causar la 
enfermedad y es la única vacuna con la que se cuenta como profilaxis 
actualmente. A partir de esta cepa se prepara la vacuna BCG que es, por tanto, 
una vacuna de bacterias vivas atenuadas. Una vacuna fresca contiene 
aproximadamente 108 bacilos / mg de BCG, aunque sólo proporcionará entre 
5 X 106 a 45 X 106 UFC, y además la proporción de bacilos BCG viables puede 
reducirse a la mitad después de la liofilización. Lamentablemente la vacuna BCG 
no es suficiente para controlar la propagación mundial de la enfermedad, sobre 
todo porque está contraindicada para las personas VIH-positivas, además de 
presentar una eficacia variable, sobre todo por su baja capacidad para estimular el 
amplio espectro de células necesarias para inducir una respuesta inmune efectiva 
(Batoni et al., 2000; Hesseling et al., 2003). 
 
 
 
18 
 
 1.10 JUSTIFICACIÓN 
 
La tuberculosis continua siendo una enfermedad que afecta a gran parte de la 
población, su prevalencia se debe principalmente a la coinfección con el VIH y la 
aparición de cepas resistentes, esto conlleva costos elevados en cuanto a la 
aplicación de nuevos esquemas terapéuticos. Los métodos convencionales para 
determinar la resistencia requieren de un tiempo muy extenso (4 a 6 semanas) 
favoreciendo un periodo de transmisión prolongado de estas cepas. Por lo cual es 
necesario implementar un método para una rápida detección que permitan crear 
un esquema terapéutico adecuado para limitar de manera oportuna la transmisión 
de los bacilos resistentes enfocándose a el porcentaje de cepas resistentes a INH 
que no son mutantes en katG puesto que estas representan un porcentaje 
considerable de aislamientos en pacientes infectados con cepas de 
M. tuberculosis resistente. 
 
1.11 HIPÓTESIS 
 
Si las cepas de M. tuberculosis resistentes a isoniácida no presentan mutaciones 
en el gen katG que codifica para la enzima catalasa peroxidasa responsable de la 
activación de dicho fármaco, entonces la resistencia puede estar dada por otro 
mecanismo relacionado con mutaciones en otros genes, como lo son inhA el cual 
codifica para la proteína enoil acil-reductasa, blanco de la isoniácida activada y 
relacionado con la síntesis de la pared bacteriana y ahpC que codifica para la 
proteína alquil hidroperóxido-reductasa relacionada en la respuesta celular al 
estrés oxidativo. 
 
 
 
 
19 
 
2. OBJETIVO GENERAL 
 
Determinar la resistencia de Mycobacterium tuberculosis a isoniácida en cepas 
aisladas de pacientes mexicanos, mediante la amplificación de genes inhA y ahpC 
empleando la técnica de PCR en punto final y la detección de mutaciones en los 
mismos. 
2.1 Objetivos particulares 
 
 Detectar el gen inhA a partir de cepas de M. tuberculosis mediante la 
técnica de PCR punto final. 
 Detectar el gen ahpC a partir de cepas de M. tuberculosis mediante la 
técnica de PCR punto final. 
 Obtener y analizar las secuencias de los genes amplificados para la 
detección de posibles mutaciones relacionadas con la resistencia a la INH. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 3. DISEÑO EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Procedimiento general del tratamiento de las 12 cepas de M. tuberculosis 
analizadas para la amplificación de los genes inhA y ahpC por PCR punto final, su posterior 
secuenciación y determinación de mutaciones que confieren resistencia a INH. 
 
Se partió de 12 cepas de 
M. tuberculosis con resistencia 
probada fenotípicamente a INH 
pero sin mutaciones en elgen 
katG 
Realizar la obtención del DNA de estas 
cepas por el método de shock térmico 
empleando CHELEX 100® y calentando 
las cepas a 95°C por una hora. 
Amplificar el gen inhA 
mediante PCR punto final 
empleando los iniciadores 
TB92 y TB93. 
Amplificar el gen ahpC 
mediante PCR punto final 
empleando los iniciadores 
TB90 y TB91. 
 
Visualizar los productos de 
PCR obtenidos mediante 
electroforesis en gel de 
agarosa al 2.5% 
Cuantificar los productos de PCR 
mediante DNAChip para cada gen 
en las 12 cepas a probar. 
Secuenciar los amplicones de las 
12 cepas para los genes inhA y 
ahpC mediante secuenciación 
capilar. 
Identificar si existen mutaciones en las 
secuencias de las cepas en estudio, 
alineándolas con la secuencia de 
referencia de M. tuberculosis H37Rv para 
cada uno de los dos genes empleando el 
programa bioinformatico Clustal X v1.83 
 
21 
 
 4. MATERIALES Y MÉTODOS 
4.1 Material biológico 
 
Cepas de referencia. La cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv se empleó 
como control positivo de amplificación, y como control negativo de resistencia a 
isoniácida. 
Se partió de un total de 12 cepas de M. tuberculosis aisladas de pacientes 
mexicanos con diagnóstico de tuberculosis, seleccionadas por poseer las 
siguientes características, como se resume en la tabla 3. Las cepas fueron 
previamente probadas para determinar su sensibilidad y resistencia a isoniácida 
empleando el método de las proporciones (datos no mostrados), al igual que por 
un método genotípico mediante en análisis por curva de disociación para el 
análisis del gen katG involucrado en la resistencia a isoniácida. 
Tabla 3. Descripción de las cepas empleadas 
No de 
registro 
interno 
 
Cepa 
identificada 
 
Isoniácida 
 
Resultado de curvas de 
disociación para el gen katG 
16 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
17 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
24 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
26 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
64 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
68 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
69 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
70 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
71 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
89 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
91 M. tuberculosis Resistente No presenta mutación 
* Como cepa de referencia M. tuberculosis H37Rv. 
 
22 
 
4.2 Obtención de DNA de las cepas de estudio 
 
La obtención del DNA de los aislamientos bacterianos se efectúo mediante shock 
térmico, colocando en un tubo de 2 mL con rosca, 1 mL de Chelex 100® y dos 
azadas bacterianas provenientes de los cultivos puros de las cepas de estudio, 
calentando el tubo contenedor en un termoblock lleno con glicerol a una 
temperatura de 95 °C durante una hora. Posteriormente los tubos se almacenaron 
a -20 ºC hasta su uso. 
4.3 Amplificación de los genes implicados a resistencia 
 
Se utilizó la técnica de PCR en punto final para amplificar los genes inhA y ahpC 
implicados con la resistencia a isoniácida como se expone a continuación. 
4.3.1 Amplificación del gen inhA 
 
Para amplificar una región de 250 pb del gen inhA, se preparó una mezcla de 
reacción con los siguientes componentes para obtener 50 µL como volumen final: 
5 µL de regulador PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 1.7 µL de 
MgCl2 50 mM, 5 µL de los dNTP’s 10 mM, 4 µL de cada uno de los iniciadores con 
concentración a 10 pmol, TB92 y TB93 (ver tabla 4) 1.5 U de enzima Taq 
polimerasa, 31 µL de agua grado PCR y finalmente se agregaron 3 µl de DNA 
extraído. 
4.3.2 Amplificación del gen ahpC 
Para amplificar una región de 242 pb del gen ahpC, se efectuó una mezcla de 
reacción con los siguientes componentes para obtener 50 µL como volumen final: 
5 µL de regulador PCR 10X (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl), 1.7 µL de 
MgCl2 50 mM, 5 µL de los dNTP’s 10 mM, 2 µL de cada uno de los iniciadores con 
concentración a 10 pmol, TB90 y TB91, (ver tabla 4) 1.5 U de enzima Taq 
polimerasa, 33 µL de agua grado PCR. Se adicionaron al final 3 µL del DNA en 
estudio. 
 
23 
 
La preparación de las mezclas de reacción para ambos genes se realizó 
manteniendo los reactivos en bloques de enfriamiento hasta su ingreso al 
termociclador. 
Tabla 4. Iniciadores para la amplificación y secuenciación de nucleótidos 
 
Gen 
No de 
Acceso 
 
Iniciador 
 
Secuencia 
5’ – 3’ 
 
Posición
* 
 
Tm 
(C°) 
 
Referencia 
 
inhA 
(U66801) 
 
F TB92 
R TB93 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGA 
 
ATCCCCCGGTTTCCTCCGGT 
 
 
56 
303 
 
60 
60 
 
Telenti et 
al., 1997 
 
ahpC 
(U16243) 
 
F TB90 
R TB91 
 
ACCACTGCTTTGCCGCCACC 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTG 
 
 
819 
583 
 
60 
60 
 
Telenti et 
al., 1997 
*La posición de los iniciadores corresponde a la secuencia del banco de genes con el número de 
acceso indicado. 
Tm: Temperatura de alineamiento de los iniciadores 
 
 
4.4 Condiciones del termociclador PCR punto final 
 
Se empleó un termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) 
con el siguiente programa de amplificación: desnaturalización del DNA durante 
2 min a 94 °C, 30 ciclos de desnaturalización por 3 seg a 94 °C, alineamiento por 
3 seg a 60 °C, elongación durante 10 seg a 72 °C y una extensión final de 7 min a 
72 °C, (ver figura 5). Se utilizó el mismo programa de amplificación para ambos 
genes de estudio. 
 
 
 
 
24 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Programa empleado en el termociclador PCR punto final. 
 
4.5 Visualización de los amplicones 
La visualización de los amplicones obtenidos para cada gen (ahpC e inhA) se hizo 
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2.5 %, empleando como agente 
intercalante de ácidos nucleicos 1 µL de Gelstar® (Cambrex Bio Science) y 
regulador TBE 0.25X. El corrimiento electroforético se llevó a cabo a 180 V 
durante 24 min. 
Concluido el tiempo de corrimiento electroforético, la visualización y digitalización 
de las imágenes se llevó a cabo empleando el fotodocumentador (Bio-Rad); el 
tamaño molecular de las bandas fue determinado con base en el marcador de 
peso moleculares MPMVIII (Roche). 
4.6 Cuantificación de los amplicones 
 
La cuantificación de los productos de PCR se realizó en el equipo Bioanalyzer 
2100 (Agilent Technologies) basado en el tecnología de microfluidos, la cual 
permite el manejo, mezclado, dilución, electroforesis y separación cromatografica 
de la muestra, la tinción y detección en un solo sistema integrado, estandarizado y 
automatizado. Los resultados se visualizaron como una imagen virtual de un gel 
de electroforesis o como un electroferograma, donde el “software” del equipo 
calcula la concentración del DNA. En el trabajo se empleó equipo Agilent 
 
25 
 
Bioanalyzer 2100 DNA1000 Chip Kit de acuerdo con las especificaciones del 
fabricante. 
4.7 Secuenciación 
La secuenciación fue realizada por el personal de el Laboratorio de Genoma de 
Patógenos-InDRE usando el kit “ABI PRISM big dye terminator cycle sequencing 
ready reaction” (Applied Biosystem) y el secuenciador ABI PRISM 3130 Genetic 
Analyser (Applied Biosystems). 
 
4.8 Análisis de secuencias 
Para la edición y obtención de la secuencia consenso fue empleado el programa 
Chromas V 1.43. Una vez obtenida ésta se requirió del programa Clustal X v1.83, 
para el alineamiento y comparación de las secuencias de los genes inhA y ahpC, 
en búsqueda de posibles mutaciones en contraste con su respectivo gen de 
referencia de la cepa sensible M. tuberculosis H37Rv, obtenidos de la base de 
datos del banco de genes del Centro Nacional para la Información Biotecnológica 
(por sus siglas en ingles NCBI) disponibles en internet. 
 5. RESULTADOS 
5.1 Detección de los genes ahpC y inhA en las cepas de estudio 
 
 
Se obtuvo el producto de amplificación de aproximadamente240 y 250 pb para 
cada uno de los genes, ahpC e inhA, respectivamente. En las figuras 6 y 7, se 
muestran los productos obtenidos, visualizados en un gel de agarosa. 
 
 
 
 
26 
 
 
 
 
 
 
242pb 
 
 
 
 
 
 
 
 
242pb 
 
 
 
 
 
Figura 7. Visualización de los productos de PCR para el gen ahpC; Carriles 1 y 9 marcador de 
pesos moleculares MPMVIII, carril 2 control positivo cepa H37Rv donde se aprecia el amplicón de 
aproximadamente 242 pb, carril 3 blanco de reacción, carriles del 4 al 14 muestras. Las flechas 
indican el tamaño de las bandas. 
 
 
 
 
27 
 
 
 
 
250pb 
 
 
 
 
 
 
 
250pb 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Visualización de los productos de PCR para el gen inhA; Carriles 1 y 10 marcador 
de pesos moleculares MPM VIII, carril 2 control positivo cepa H37Rv donde se aprecia el amplicón 
de aproximadamente 250 pb, carril 3 blanco de reacción, Carriles del 4 al 15 muestras. Las flechas 
indican el tamaño de las bandas. 
 
5.2 Cuantificación de los amplicones por electroforesis en DNA chip 
Para que las muestras amplificadas puedan ser secuenciadas es necesario 
cuantificar los amplicones, determinar la integridad del mismo y conocer si se 
encuentra libre de productos inespecíficos, ya que la presencia de éstos puede 
 
28 
 
interferir en la obtención de una adecuada secuencia. La figura 8 muestras los 
corrimientos electroforéticos obtenidos con el equipo Agilent 2100 Bioanalyzer 
(Agilent Technologies), donde se observa la presencia de una única banda en los 
amplicones obtenidos para cada una de las cepas de estudio en ambos genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Corrimiento electroforético obtenido del DNA chip. Se muestran los amplicones 
obtenidos para el gen ahpC (arriba) y para el gen inhA (abajo) de cada una de la muestras de 
estudio. En rosa, marcador de alto peso molecular (1500 pb); en verde, marcador de bajo peso 
molecular (15 pb). A la izquierda marcador de peso molecular para el estuche comercial DNA 1000 
(Agilent Technologies). 
 
 
29 
 
La tabla 5 muestran las concentraciones obtenidas para cada uno de los 
amplicones a secuenciar. 
Tabla 5. Concentraciones y tamaños de las 12 cepas amplificadas para los genes 
ahpC e inhA, obtenidas por DNA chip 
 
 
 
 Muestras 
Gen inhA 
Tamaño 
(pb) 
Concentración 
(ng/µL) 
Muestras 
Gen ahpC 
Tamaño 
(pb) 
Concentración 
(ng/µL) 
Identificación 
Marcador 
de bajo 
peso 
 
15 
 
4.20 
Marcador 
de bajo 
peso 
 
15 
 
4.20 
 
A16 250 21.33 C16 241 22.20 
A17 250 17.62 C17 243 25.52 
A24 250 15.14 C24 244 28.04 
A26 251 19.25 C26 241 20.53 
A47 251 13.03 C47 240 27.05 
A64 252 9.35 C64 243 19.64 
A68 252 10.60 C68 243 26.08 
A69 252 11.62 C69 243 17.74 
A70 251 7.62 C70 242 26.53 
A71 251 8.61 C71 244 23.80 
A89 250 37.04 C89 243 14.82 
A91 250 45.59 C91 243 43.96 
Marcador 
de alto 
peso 
1500 2.10 
Marcador 
de alto 
peso 
1500 2.10 
 
 
30 
 
5.3 Mutaciones detectadas relacionadas con la resistencia a la INH 
 
Se detectaron mutaciones en 2/12 cepas analizadas de M. tuberculosis con 
cambios de bases en diferentes posiciones de la región del promotor en el gen 
ahpC, mientras que para el gen inhA se encontraron 4/12 cepas con mutaciones 
en la región reguladora (figura 9). Las mutaciones encontradas así como la 
posición en la cual se presenta el cambio nucleotídico (tabla 6) está determinada 
tomando como secuencia referencia a los genes inhA U66801 y ahpC U16243 
(número de acceso del GenBank) de la cepa M. tuberculosis H37Rv. 
Figura 10. Mutaciones encontradas en los genes inhA y ahpC, en las cepas de 
M. tuberculosis analizadas. Los recuadros muestra la posición de éstas comparándolas con la cepa 
de referencia M. tuberculosis H37Rv para cada gen. 
 
31 
 
Tabla 6. Mutaciones detectadas en las secuencias nucleotidicas de los genes ahpC 
e inhA 
 
Muestra 
Patrón de 
resistencia 
fenotípica 
 
Cambios en ahpC 
 
Cambios en inhA 
16 INHR WT WT 
17 INHR WT WT 
24 INHR WT WT 
26 INHR WT WT 
47 INHR WT WT 
64 INHR WT C209T 
68 INHR WT C209T 
69 INHR G715A WT 
70 INHR WT C209T 
71 INHR C635T T216A 
89 INHR WT WT 
91 INHR WT WT 
Números= indican la posición en el cambio de base 
INH
R
= Isoniácida resistente 
WT= Tipo silvestre 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
6. DISCUSIÓN 
 
La tuberculosis continua siendo un grave problema de salud pública no solo en 
países subdesarrollados, si no a nivel mundial, es la enfermedad infecciosa que 
más muertes causa anualmente, desde el descubrimiento de los fármacos 
antituberculosos se ha producido una notable disminución y mejora en la 
morbilidad de personas infectadas con el bacilo tuberculoso, sin embargo la 
aparición y posterior diseminación de cepas resistentes y multirresistentes 
comprometen los logros alcanzados en el control de esta enfermedad 
(Aziz y Wright, 2005). 
 
La problemática en curso de la tuberculosis se ha debido a la negligencia en el 
control de esta enfermedad por los gobiernos por la falta de acceso e 
infraestructura clínica, la mala gestión de los programas de control de la 
tuberculosis, falta de continuidad del paciente con su tratamiento, la pobreza, 
crecimiento de la población, la migración, y un aumento significativo 
en el número de casos de tuberculosis en personas infectadas por el VIH (WHO, 
2003; Blumberg et al., 2003), al igual que la aparición y diseminación de cepas 
resistentes y multiresistentes (Aziz y Wright, 2005). 
 
Se calcula que cerca de 50 millones de personas están infectadas con cepas 
MDR, problema que emergió principalmente por el abandono del tratamiento. Esta 
problemática ha generado una necesidad de nuevos ensayos para la vigilancia de 
la resistencia y aplicación de tratamientos ideales (WHO, 2004; Kim, 2005). 
 
Diversos estudios genotípicos han demostrado que la presencia de mutaciones en 
el gen katG son las más frecuentes en cepas INH resistentes. Sin embargo, la 
existencia de otros genes implicados en la resistencia como lo son ahpC que 
codifica la alquil hidroperóxido-reductasa involucrada en el estrés oxidativo de la 
micobacteria (Wada et al., 2004; Caws y Drobniewski, 2001) e inhA que codifica la 
síntesis de la enoil acil reductasa proteína implicada en la producción de los 
 
33 
 
ácidos grasos de la micobacteria (diana de la isoniácida activada) (Quirós et al., 
2001; Caws y Drobniewski, 2001), son una fracción importante de aislamientos 
clínicos resistentes a INH. 
 
El principal objetivo del trabajo fue determinar la presencia de mutaciones en los 
genes inhA y ahpC que confirieren resistencia a la isoniácida en cepas de 
M. tuberculosis aisladas de pacientes mexicanos, debido a que en estudios 
previos se determinó fenotípicamente su resistencia a dicho fármaco por el 
método de las proporciones (datos no mostrados) no así su relación con la 
presencia de mutaciones en el gen katG determinado por el grupo de trabajo 
(Rivera y Pérez, 2011). 
Como resultado de los análisis en las secuencias nucleotidicas se encontraron 
mutaciones en 4/12 cepas analizadas para el gen inhA (cepas A64, A68, A70, 
A71), 3 /4 cepas presentaron un cambio de base C209T (cepas A64, A68, A70) y 
en la cepa A71 un cambio de base en la posición T216A. El efecto de estas 
mutaciones en la región reguladora del gen inhA, inducen la sobreexpresión de 
dicho gen y por lo tanto de los niveles elevados de la enzima acil-enoil-reductasa 
en cantidades que superan el poder inhibitorio de la INH. Las mutaciones de inhA 
están asociadas a aproximadamente al 25% de los casos de resistencia a INH, 
generalmente con bajos niveles de resistencia (CIM ≥1 mg/mL) (Vilcheze et al., 
2000; Wade et al., 2004; Zhang et al., 2005; Leung et al., 2006). 
Además de la acción de la INH en inhA, más recientemente se han descritounas 
mutaciones en cepas isoniácida resistentes en la región reguladora del gen ahpC. 
Al analizar y comparar las secuencias para este gen, obtenidas a partir de las 
cepas probadas en el estudio, se encontraron que solo 2/12 cepas cambios de 
base en la posición G715A en la cepa 69, y un cambio de C635T en la muestra 
71. 
Anteriormente se ha reportado el cambio de base CT en la región del promotor 
en la misma posición del gen ahpC como lo detectamos en la cepa C71, lo cual 
deriva en un incremento de la enzima alquil-hidroperóxido reductasa codificada 
 
34 
 
por ahpC, que como se mencionó está relacionada en el estrés oxidativo de la 
bacteria, por lo que se ha propuesto la teoría de que en el proceso de activación y 
metabolismo de la INH implica la producción de intermediarios reactivos de 
oxígeno que poseen efectos nocivos sobre los bacilos tuberculosos 
(Kelley et al., 1997 ) propiciando la activación de un mecanismo de defensa 
específica para desintoxicar de estos intermediarios y eliminar los productos 
tóxicos para el bacilo tuberculoso (Sherman et al., 1996; Wada et al., 2004; Caws 
y Drobniewski, 2001); es posible que el gen ahpC pueda contrarrestar estos 
efectos mediante la reducción de dichos intermediarios transformando los 
peróxidos orgánicos en sus correspondientes alcoholes de manera significativa 
desintoxicando al bacilo de estos productos derivados de la INH activada 
(Master, 2002). En este modelo, los bacilos con ahpC aumentado no pueden estar 
en desventaja cuando son expuestos a la INH, (Wilson y Collins 1996; Kelley et 
al., 1997) Manifestando que el aumento en el nivel de ahpC es un factor crítico 
que contribuye a la diferencia en la susceptibilidad de las micobacterias a INH. 
El otro cambio nucleotídico detectado fue el cambio de G715A en la cepa 69, 
mutación que no ha sido reportada con anterioridad por lo que no se tienen datos 
para relacionarla con algún mecanismo de resistencia para la INH, por lo que la 
hipótesis planteada en el estudio se acepta con algunas reservas dado que un 
punto importante es el número tan reducido de muestras, puesto que sería 
recomendable una población mayor para obtener resultados mas significativos y 
poder analizar la frecuencia de estas mutaciones. 
Finalmente, se obtuvo un grupo de cepas INH resistentes fenotípicamente, pero 
sin algún genotipo relacionado con resistencia en los genes katG, inhA y ahpC lo 
cual puede ser explicado por la participación de algún otro mecanismo de 
resistencia presente en las micobacteria no considerado en el estudio. 
 
 
 
 
35 
 
7. CONCLUSIONES 
 
-Fueron detectados los genes inhA y ahpC por PCR en punto final en todas las 
cepas de M. tuberculosis probadas. 
 
-Se determino en 4/12 cepas la presencia de mutaciones en el gen inhA 
relacionadas con la resistencia hacia INH. 
 
-Para le gen ahpC se detectaron en 2/12 cepas la presencia de mutaciones, el 
cambio nucleotidico de C635T es responsable de conferir resistencia a INH en las 
cepas analizadas, sin embargo el otro cambio de bases G715A a la fecha, no ha 
sido descrito como un factor relacionado con la resistencia a este fármaco. 
 
-Se requiere del planteamiento de nuevos estudios para establecer si el cambio 
G715A participa en la resistencia a INH, así como es necesario el estudio de otros 
marcadores génicos que expliquen la resistencia en aquellas cepas INH 
resistentes fenotípicamente y sin mutaciones en los genes de este estudio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
 ANEXO I 
 
Preparación de gel colorante para DNAchip (Kit Agilent DNA 1000) 
1. Dejar que el concentrado del tinte de DNA (azul) y el gel matriz para DNA 
(rojo) alcancen la temperatura ambiente durante 30 minutos. 
2. Mezclar con vortex el tubo azul durante 10 segundos y centrifugar, después 
pipetear 25 µL del tinte azul a la matriz roja, almacenar a 4 °C. 
3. Agitar el tubo durante 10 segundos con vortex, observar que los dos 
componentes estén totalmente mezclados. 
4. Transferir la mezcla del gel en la parte superior del tubo-columna. 
5. Centrifugar a 6000 rpm, el tubo-columna durante 15 minutos a temperatura 
ambiente. 
6. Desechar la columna y almacenar la mezcla a 4 °C hasta su uso. 
 
Preparación y llenado de DNAchip 
 
Para la preparación del chip se realizan los siguientes pasos: 
 Se coloca el DNA chip en la estación de purgado de chips durante 10 
segundos. 
 Colocar 9 µL del gel colorante (Kit Agilent DNA 1000) en el pozo marcado 
según se muestra en la figura. 
 
 
 
 
 Se coloca el DNA chip en la estación de purgado de chips durante 60 
segundos y se adicionan 9 µL más del gel colorante en los pozos marcados 
según se muestra en la figura 
 
37 
 
 
 
 
 
 Posteriormente son colocados 5 µL del marcador de DNA con tapa verde 
(Kit Agilent DNA 1000) en todos los pozos para muestras incluyendo el 
pozo para el marcador de pesos moleculares señalado con una escalera 
, según la figura 
 
 
 
 
 Adicionar 1 µL del marcador de pesos moleculares con tapa amarilla 
(Kit Agilent DNA 1000) en el pozo señalado con una escalera 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
38 
 
 Por último se agrega 1 µL por muestra en cada uno de los doce pozos 
 
 
 
 
 
 
Después de la preparación del DNA chip, se mezcla con vortex a 2400 rpm 
durante un minuto, y se ingresa el chip a la unidad de análisis Agilent bioanalyzer 
2100 (Agilent technologies) el análisis se lleva a cabo empleando el “software 
2100 expert”. 
 
39 
 
 ANEXO II 
 
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES 
 Solución reguladora TBE 10X 
 
100 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA 
Tris-Base………….………………………………………………………………...108.0 g 
Ácido Bórico………………………………………………..………………….….0.3722 g 
EDTA……………………………………………………………………………..…….6.8 g 
Disolver en agua bidestilada, ajustar a pH 8.0 y aforar a 1 litro. 
 
 Solución reguladora TBE 0.25X 
 
Medir 25 mL de TBE 10X y agregar 975 mL de agua bidestilada. (Ajustar 
cantidades según el volumen a preparar). 
 
 Solución reguladora TE 10X 
Tris Base/HCl pH 8.0……………………………………………………………..100 mM 
EDTA……………………………………………………...…………………..….....10 mM 
Disolver en agua bidestilada. 
 
 Colorante de carga para electroforesis 
Sacarosa.…………………………….………...…………………………………..…40 % 
Azul de bromofenól……………………………………………………..………….0.25 % 
Alternativamente se puede emplear Glicerol al 35 % en lugar de sacarosa al 40 %. 
 
 MPM VIII (Roche) 
TE 10X…………………………………………..……………......................….…50 mL 
Colorante de carga para electroforesis…………………….……….………..….40 mL 
MPM VIII ………………………………………………………...…..……………..10 mL 
 
40 
 
 
 Preparación de gel de agarosa al 2.5% para electroforesis 
1. En un matraz Erlenmeyer medir un volumen de 30 mL de solución TBE 0.25X 
2. Pesar 0.75 g de agarosa 
3. Disolver la agarosa en el matraz con la solución TBE 0.25X (poner a ebullición). 
4. Agregar 0.5 µL del agente intercalante de bases. 
5. Vertir el gel en la charola para electroforesis evitando hacer burbujas y se 
coloca el peine para formar los pocillos donde se colocan las muestras. 
6. Dejar solidificar a temperatura ambiente. 
7. Retirar el peine del gel y colocar el gel en la cámara para electroforesis llena 
con la solución TBE 0.25X, el gel debe quedar ligeramente sumergido en la 
solución. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
41 
 
 ANEXO III 
 
 Secuencias obtenidas 
Secuencias de la región amplificada del gen inhA de M. tuberculosis por PCR de 
las 12 muestras analizadas, obtenidas por el método de secuenciación capilar. 
Muestra Secuencia 5’ – 3’ 
 
 
A16 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A17 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGCTCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A24 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A26 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A47 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A64 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A68 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A69 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A70 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGATGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
A71 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGATGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A89 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
 
A91 
 
CCTCGCTGCCCAGAAAGGGATCCGTCATGGTCGAAGTGTGCTGAGTCACACCGACAAA 
CGTCACGAGCGTAACCCCAGTGCGAAAGTTCCCGCCGGAAATCGCAGCCACGTTACGC 
TCGTGGACATACCGATTTCGGCCCGGCCGCGGCGAGACGATAGGTTGTCGGGGTGACT 
GCCACAGCCACTGAAGGGGCCAAACCCCCATTCGTATCCCGTTCAGTCCTGGTTACCGG 
AGGAAACCGGGGGAT 
 
 
43 
 
 
Secuencias de la región amplificada del gen ahpC de M. tuberculosis por PCR de 
las 12 cepas analizadas, obtenidas por el método de secuenciación capilar. 
Muestra Secuencia 5’- 3’ 
 
 
C16 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C17 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C24 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C26 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C47 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C64 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C68 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C69 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAAGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C70 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C71 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGTAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
44 
 
 
 
 
C89 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
GACTCTCCTCATCATCAAAGCGGACAATGCATTTGGTTGCGACATTCCATCGTGCCGTGA 
AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
TGCTAGCCGGCCGTGGCCGGGCTTCGCGCGTTCGCCGCGGTGGCGGCAAAGCAGTGGT 
 
 
 
C91 
 
CCGATGAGAGCGGTGAGCTGGTAGGCGGGGAATTGATCGCCAATGGTTAGCAGTGGCAT 
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AGTCGCTGTCAGGCAAAGGTGATATATCACACCATATTTATCGGCATCGCCGCCAAGAGG 
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