Determinacion-de-los-cambios-que-ocurren-en-las-comunidades-bacterianas-durante-la-congelacion-de-carne-fresca

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
“DETERMINACIÓN DE LOS CAMBIOS QUE OCURREN EN LAS 
COMUNIDADES BACTERIANAS DURANTE LA CONGELACIÓN DE 
CARNE FRESCA” 
 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
ANDREA ESQUIVEL CHÁVEZ 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2011 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: QFB. ADRIANA MEJIA CHAVEZ 
VOCAL: Profesor: DRA. MARIA DEL CARMEN WACHER RODARTE 
SECRETARIO: Profesor: MC. BEATRIZ SERRANO LOPEZ 
1er. SUPLENTE: Profesor: QFB. NORMA CASTELLANOS CHAVEZ 
2° SUPLENTE: Profesor: DRA. GLORIA DIAZ RUIZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 324, EDIFICIO E, 
DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA, FACULTAD DE QUÍMICA, CIUDAD 
UNIVERSITARIA 
 
 
 
 
 
 ASESOR: DRA. M. CARMEN WACHER R. SUPERVISOR TÉCNICO: DRA. GLORIA DIAZ RUIZ 
 
 
 
 
SUSTENTANTE: ANDREA ESQUIVEL CHAVEZ 
Reconocimientos 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el laboratorio 324 del departamento de Alimentos y 
Biotecnología en el Conjunto E de la Facultad de Química de la UNAM, bajo la 
supervisión de la Dra. María del Carmen Wacher Rodarte y la asesoría de la Dra. 
Gloria Díaz Ruíz. 
 
 
Para la realización de este trabajo se contó con el apoyo económico del 
Subprograma 127. Formación de investigadores de la Facultad de Química, UNAM. 
 
 
A la Facultad de Química y al Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. 
 
 
A los profesores que participaron en mi formación académica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
 
 
A la Dra. María del Carmen Wacher Rodarte por haberme dado la oportunidad de 
formar parte de su equipo de trabajo, por brindarme su confianza y por ser una guía 
en mi formación profesional. 
 
A la Dra. Gloria Díaz Ruíz por brindarme siempre un minuto de su tiempo y 
enseñarme las técnicas base de mi proyecto de investigación. 
 
A los miembros del jurado por su revisión crítica y comentarios a esta tesis. 
 
A Tere por que siempre tenia listos los reactivos necesarios para la realización de 
mis experimentos. 
 
Al Dr. Antonio Peña Díaz por su apoyo y preocupación sobre mis avances en la 
tesis. 
 
A mis padres darme la vida, educarme, quererme, apoyarme, tolerarme, regañarme 
y estar siempre conmigo y para mí. 
 
A mi hermano por ayudarme, quererme y abrirme de nuevo su corazón. 
 
A Emmanuel por todo su apoyo, paciencia, cariño, confianza, comprensión, 
elocuencia, elegancia y por compartir su vida conmigo aquí y en el extranjero. 
 
A la familia Villanueva: Martha, Herlinda y Tatiana por todas sus atenciones, cariño 
y apoyo. 
 
A Marisol por sus bromas, consejos, regaños, compañía y confianza. Por hacer mis 
días en el laboratorio más alegres, pero sobretodo por su amistad. Aunque llegaste 
casi al final para mi eres la primera. 
 
A Caro por sus comentarios, apoyo, detalles, cariño, bromas, amistad y peleas con 
Marisol. 
 
A Gris por ayudarme en el laboratorio cuando lo necesitaba. 
 
A todo el laboratorio 324: Adriana, Girasol, Biani, Paco, Betty, David, Ana, Zayas, 
Ricardo, Anita, Karina, Carlos, Israel, Sandra, Lila, Arely y Sara por el caos al 
trabajar juntos, las comidas, los seminarios y su apoyo para organizar intercambios 
de último momento. 
 
A Meloni, Rócio, Ayleen, Chinis, por su cariño y amistad que hasta el momento ha 
perdurado, aunque en ocasiones se desaparecen por largos periodos o se van a 
vivir a otro estado y ni siquiera invitan. Las quiero Tontis. 
 
A Poncho y Ana Laura por su amistad, terapias y noches de sushi en su consultorio. 
 
A Roger por acompañarme en mis noches de desvelo y esperarme en la puerta 
hasta que llego a casa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
INDICE GENERAL 
 
 Página 
Índice de Tablas 4 
Índice de Figuras 6 
Resumen 7 
Introducción 9 
Antecedentes 11 
3.1 La carne de res 11 
3.2 El tejido muscular como medio de crecimiento para los 
 microorganismos y sus características de descomposición 12 
3.3 Origen de la microbiota de la carne de res 13 
3.4 Aspectos generales sobre la microbiología de la carne de 
mamífero 14 
3.5 La congelación como método de conservación de la 
carne de res 19 
3.6 Evolución microbiana durante el almacenamiento a 
 bajas temperaturas 24 
3.7 Identificación de microorganismos mediante el uso del 
 gen rRNA 16S 25 
3.8 Inhibidores de la PCR presentes en alimentos 26 
Justificación 29 
 
 
2 
Hipótesis 30 
Objetivos 31 
Estrategia experimental 32 
Materiales y métodos 33 
8.1 Material 33 
8.2 Muestreo de carne 33 
8.3 Efecto de la congelación en el desarrollo de 
 microorganismos de descomposición 34 
8.4 Identificación de cepas puras mediante la comparación 
 de secuencias del gen rRNA 16S 36 
8.4.1 Extracción de DNA 36 
a) Activación de cepas puras 36 
b) Extracción de DNA 36 
8.4.2 Amplificación por PCR de la región V1 del gen 
 rRNA 16s de cepas puras 38 
8.4.3 Purificación de productos de PCR 40 
 
8.5 Extracción de DNA de carne 41 
8.6 Amplificación por PCR de la región V3 del gen rRNA 
 16S de DNA de carne, para su separación por DGGE 44 
 
Resultadosy Discusión 47 
9.1 Análisis microbiológico de la carne congelada 47 
9.1.1 Cuentas Microbianas 47 
 
 
3 
9.1.2 Análisis morfológico de las colonias presentes en las 
placas de filete de res y sirloin de res para 
 mesófilos aerobios y psicrótrofos aerobios 50 
9.1.3 Identificación de microorganismos mediante 
 amplificación de la región V1 del gen rRNA 16S 53 
a) Selección de cepas 53 
b) Extracción de DNA 56 
c) Amplificación por PCR 57 
d) Purificación de los productos de PCR 57 
e) Secuenciación y comparación de secuencias 58 
9.2 Extracción de DNA de la carne 62 
9.3 Amplificación por PCR de la región V3 del gen rRNA 
 16S de DNA de carne 67 
Conclusiones 71 
Perspectivas 72 
Bibliografía 73 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4 
INDICE DE TABLAS 
 
Tabla Página 
 
Tabla 1. Composición aproximada del músculo de mamífero 
 adulto después del rigor mortis. 11 
 
Tabla 2. Poblaciones bacterianas en canales bovinas en algunos 
 países (Log UFC/cm2). 14 
 
Tabla 3. Géneros de bacterias comúnmente encontrados en 
 la carne de mamíferos y aves. 15 
 
Tabla 4. Principales factores implicados en la ecología 
 microbiana de la carne y productos cárnicos. 18 
 
Tabla 5. Tiempo de congelación de los cortes de carne de 
 res almacenados en condiciones aerobias a una 
 temperatura de – 20 ° C. 34 
 
Tabla 6. Medios de cultivo y condiciones usadas para la 
 cuantificación de los grupos microbianos. 35 
 
Tabla 7. Cebadores para PCR utilizados para la 
 amplificación de la región V1 del gen rRNA 
 ribosomal 16S. 38 
 
Tabla 8. Protocolo de PCR para la amplificación de la región 
 V1 del gen rRNA 16S de cepas puras. 39 
 
Tabla 9. Condiciones de la reacción de PCR para amplificar 
 la región V1 del gen rRNA 16S. 40 
 
Tabla 10. Diferencias entre los métodos empleados para la 
 extracción de DNA. 42 
 
Tabla 11. Cebadores para PCR utilizados para la 
 amplificación de la región V3 del gen rRNA 16S. 45 
 
Tabla 12. Protocolo de PCR para la amplificación de la 
 región V3 del gen rRNA 16S de cepas puras y de 
 muestras de carne. 45 
 
Tabla 13. Condiciones de la reacción de PCR para 
 amplificar la región V3 del gen rRNA 16S. 46 
 
 
 
5 
Tabla 14. Concentración de microorganismos mesófilos 
 aerobios y psicrótrofos durante diferentes tiempos 
 de almacenamiento en congelación (-20° C) de 
 sirloin y filete de res. 48 
 
Tabla 15. Características morfológicas de mesófilos 
 aerobios presentes en los cortes de carne 
 analizados a los diferentes tiempos de muestreo. 50 
 
Tabla 16. Características morfológicas de psicrótrofos 
 aerobios presentes en los cortes de carne 
 analizados a los diferentes tiempos de muestreo. 52 
 
Tabla 17. Características morfológicas de las cepas aisladas 
 provenientes de filete y sirloin de res. 54 
 
Tabla 18. Características de las colonias aisladas 
 provenientes de la carne de res almacenada en 
 congelación a diferentes tiempos. 55 
 
Tabla 19. Identificación de las cepas aisladas de la carne de 
 res después de la amplificación de la región V1 del 
 gen rRNA 16S. 59 
 
Tabla 20. Cuantificación de DNA de filete de res con los 
 métodos: original, A, B y C. Método 
 espectrofotométrico. 64 
 
Tabla 21. Medición espectrofotométrica del DNA extraído 
 mediante el método C para determinar cantidad y 
 pureza del DNA en muestras de carne tanto fresca 
 como congelada. 66 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6 
INDICE DE FIGURAS 
 
Figura Página 
 
Figura. 1 Esquema de trabajo. 32 
 
Figura 2. Concentración del DNA extraído mediante la 
 medición espectrofotométrica a 260 nm, 
 considerando una celda de 2mm. 43 
 
Figura 3. Pureza del DNA extraído mediante la relación 
 entre las mediciones espectrofotométricas a 260 
 nm y 280 nm. 44 
 
Figura 4. Extracción del DNA de cepas puras. Mediante Kit 
 de Promega (Wizard Genomic DNA Purification). 56 
 
Figura 5. Productos de PCR de la región V1 del gen rRNA 
 16S para cepas puras provenientes de la carne en 
 almacenamiento en congelación. 57 
 
Figura 6. Productos purificados de la amplificación de la 
 región V1 del gen rRNA 16S para cepas puras 
 provenientes de la carne en almacenamiento en 
 congelación. 58 
 
Figura 7. Extracción de DNA de filete de res mediante todos 
 los métodos probados. 63 
 
Figura 8. Extracción de DNA mediante el método C. 65 
 
Figura 9. Efecto del MgCl2 en la amplificación de la región 
 V3 del gen rRNA 16S. Primers Agc338F y B518F. 
 5 ng/ µL de Templado. 68 
 
 
Figura 10. Efecto del MgCl2 en la amplificación de la región 
 V3 del gen rRNA 16S. Primers Agc338F y B518F. 
 9 ng/ µL de Templado. 69 
 
 
 
 
7 
 
Resumen 
 
 
 El tejido muscular fresco es un ambiente muy favorable para el desarrollo 
microbiano y consecuentemente se altera rápidamente (Nychas et al., 2008). La 
congelación es unatecnología antigua para conservar los alimentos, retarda las 
actividades de los microorganismos de descomposición en y de los alimentos, 
además se emplea para conservar algunos microorganismos por largos periodos de 
tiempo. 
 
 Tradicionalmente los microorganismos se han caracterizado según sus rasgos 
fenotípicos, características observables y componentes celulares. Actualmente, 
existen diferentes métodos basados en técnicas moleculares para la identificación y 
la tipificación de los microorganismos (Ercolini, 2004; Farnleitner et al., 2004). 
 
 El objetivo de este trabajo fue determinar la variabilidad de la microbiota 
bacteriana de muestras de carne de res fresca durante su almacenamiento en 
congelación. Para ello se analizaron dos cortes de carne de res (filete y sirloin). Se 
realizaron las cuentas microbianas de mesófilos y psicrótrofos aerobios durante el 
almacenamiento de la carne en congelación. A partir de estas cuentas se 
seleccionaron cepas morfológicamente diferentes, las cuales fueron identificadas 
mediante la secuenciación de la región V1 del gen ribosomal (rRNA) 16S. La 
especie microbiana predominante fue: Kocuria rhizophila. 
 
 Además se llevó a cabo la extracción de DNA directamente de las muestras de 
carne de res analizadas, a la cual se le realizó la reacción de cadena de la 
polimerasa (PCR) para amplificar la región V3 del gen rRNA 16S y posteriormente 
someterse a la técnica de PCR-DGGE para conocer así la variabilidad bacteriana 
presente en la carne de res analizada. Pero la presencia de inhibidores (glucógeno, 
lípidos, compuestos fenólicos, detergentes) en el DNA extraído directamente de la 
carne impidieron la PCR. Por lo que se propusieron alternativas para contrarrestar 
 
 
8 
la acción de estos inhibidores, como el uso de kits de purificación de DNA o la 
albúmina sérica bovina (BSA). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
Introducción 
 
 
 La carne fresca es un alimento muy perecedero, por lo que es necesario emplear 
métodos de conservación efectivos. Para esto es necesario primero estudiar con 
mayor profundidad cuáles son los efectos de los métodos usados tradicionalmente, 
como la congelación. Posteriormente proponer nuevas estrategias de conservación. 
 
 La congelación es una tecnología antigua empleada para conservar los 
alimentos. Esta puede llegar a matar a los microorganismos por efectos físicos y 
químicos y posiblemente a través de cambios genéticos inducidos (Archer, 2004). 
Estudios anteriores en los cambios de la diversidad bacteriana y la flora normal de 
la carne durante el almacenamiento a bajas temperaturas indican la presencia de 
ocho géneros de bacterias predominantes: Arthrobacter sp., Enterococcus sp., 
Staphylococcus sp., Moraxella sp., Pseudomonas sp., Lactobacillus sp., Aeromonas 
sp., Acinetobacter sp. y Brochothrix thermosphacta (que es una especie 
característica de la carne) (Li et al., 2006). Aunque generalmente estas bacterias 
sólo constituyen una pequeña proporción de la flora inicial, los tipos de bacterias 
que finalmente predominan en el almacenamiento son miembros de estos géneros. 
Siendo característicos del tejido muscular y de la piel, así como del ambiente de 
almacenamiento (Doyle et al., 2001). 
 
 Debido a que existen diferentes fuentes de contaminación, los tipos de 
microorganismos que suelen encontrarse en la carne son muchos y muy variados, 
por lo que es necesario indicar algunos factores que determinan la microbiología de la 
carne. Estos factores pueden ser clasificados en cuatro grupos: i) intrínsecos, ii) 
extrínsecos, iii) métodos de procesamiento y conservación e iv) implícitos (Huis in’t 
Veld, 2006). 
 
 La descomposición de la carne es un proceso complejo, debido a la diversidad 
de su microbiota, y es el resultado de interacciones entre los microorganismos y de 
estos con el sustrato, así como con las condiciones de almacenamiento. Es 
 
 
10 
importante entonces considerar no solamente los microorganismos de 
descomposición, sino su microbiota natural. La investigación es necesaria para 
entender mejor las interacciones físicas y químicas entre la matriz del alimento y los 
microorganismos durante la congelación y su almacenamiento a bajas 
temperaturas. El uso de una estrategia ecológica permitirá entender la presencia y 
el crecimiento de los microorganismos en la carne ya que los conceptos ecológicos 
constituyen las bases tanto para el control de microorganismos indeseables como 
para el uso racional de microorganismos en la producción de alimentos. 
 
 En los últimos años el conocimiento de la diversidad microbiana en comunidades 
complejas se ha incrementado debido al uso de métodos moleculares que no 
requieren el cultivo de microorganismos y al de herramientas usadas en estudios 
filogenéticos para identificarlos. Las relaciones evolutivas entre los organismos (que 
por lo general no es posible obtener mediante el análisis de las características 
fenotípicas) constituyen una base más natural para clasificarlos. Estas relaciones 
pueden ser inferidas mediante la comparación de secuencias de genes individuales. 
Se han utilizado proteínas como las ATPasas y RecA (proteína requerida para la 
recombinación genética), pero los genes que codifican para el RNA ribosomal son 
los más utilizados. Esto se debe a que estas moléculas son funcionalmente 
constantes, se encuentran distribuidas universalmente y sus secuencias son 
moderadamente conservadas en la mayoría de los microorganismos. En el caso de 
los procariotes, el rRNA 16S (que contiene aproximadamente 1,500 nucleótidos) es 
el más utilizado (Díaz & Wacher, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
Antecedentes 
 
 
3.1 La carne de res 
 
 La carne de res es un alimento importante en la dieta de los seres humanos. Es 
consumida en todo el mundo por su aroma, sabor y textura. Desde el punto de vista 
nutricional, destaca por su alto contenido en proteínas de gran valor biológico, 
lípidos, hierro, selenio, así como vitaminas del complejo B y acido fólico (Tabla 1) 
(Biesalski, 2005; McAfee et al., 2010). Según la SAGARPA en el 2005 la producción 
nacional de carne de res fue de 1, 557,707 toneladas. 
 
 
Tabla 1. Composición aproximada del músculo de mamífero adulto después del 
rigor mortis. 
Componente Peso húmedo (%) 
Agua 75 (0.99 aw) 
Proteína 19 
Lípidos 2.5 
Glucógeno a 0.1 
Glucosa ab e intermediarios glucolíticos 0.2 
Acido láctico a 0.9 
Inosinmonofosfato b 0.3 
Creatina b 0.6 
Aminoácidos b 0.35 
Dipéptidos (carnosina y anserina) b 0.35 
pHa 5.5 
a Varían de unos músculos a otros y entre animales distintos. 
b Varían con el tiempo después del rigor mortis. 
Basada en Lawrie (1985). 
 
 
 
 
12 
 La carne es el músculo esquelético estriado de los animales de abasto que 
consta de proteínas miofibrilares contráctiles, proteínas sarcoplasmicas solubles, y 
compuestos solubles de bajo peso molecular, tanto orgánicos como inorgánicos 
(ICMSF, 2001). 
 
 Su alto contenido de agua (un valor alto de actividad acuosa), así como su 
contenido de nutrientes necesarios para el crecimiento de bacterias y hongos 
(levaduras y mohos) hacen que la carne sea uno de los alimentos más perecederos 
(Ercolini et al., 2006). 
 
 
3.2 El tejido muscular como medio de crecimiento para los microorganismos y 
sus características de descomposición 
 
 El tejido muscular fresco es un sustrato muy favorable para el desarrollo 
microbiano y consecuentemente se altera rápidamente, salvo que se modifique o 
almacene en un medio ideado para retrasar la actividad y reproducciónbacteriana. 
Debido a que el deterioro de la carne no siempre es evidente constituye un juicio 
muy subjetivo para el consumidor (Nychas et al., 2008). 
 
 Cuando un alimento presenta cualquier cambio que lo convierta en inaceptable 
sensorialmente se dice que se encuentra en descomposición. Los factores 
asociados con la descomposición comprenden cambios físicos (cambios de color), 
químicos (oxidación), aparición de olores y sabores extraños que son el resultado 
del crecimiento microbiano (Gram et al., 2002). 
 
 En el caso de la carne, el deterioro microbiano lleva al desarrollo de olores 
anómalos y frecuentemente la formación de viscosidad, haciendo al producto 
indeseable para el consumo humano. Los cambios sensoriales pueden variar 
dependiendo de la asociación microbiana contaminante de la carne y de las 
condiciones bajo las cuales esté almacenada (Ercolini et al., 2006). 
 
 
 
13 
 No obstante, se está de acuerdo en que los signos de alteración se empiezan a 
manifestar cuando el número de bacterias de la superficie de la carne alcanzan 
cuentas de 107 UFC/cm2 (Doyle et al., 2001), presentándose aromas a “queso” y 
“mantequilla” (Ercolini et al., 2006). Cuando se alcanzan las 108 UFC/cm2 la 
superficie del tejido muscular comienza a ser pegajosa, lo que representa la primera 
fase de la formación de viscosidad. La viscosidad se atribuye a la síntesis de 
polisacáridos que gradualmente forman una capa pegajosa en la superficie del 
tejido (Doyle et al., 2001). Esto evoluciona a olores afrutados cuando las cuentas 
incrementan a 109 UFC/cm2 (Ercolini et al., 2006). Las bacterias metabolizan 
primero la glucosa, entonces si su concentración en el músculo es alta, tardan más 
tiempo en empezar a metabolizar los aminoácidos y en consecuencia el tiempo en 
el que se detectan los malos olores de la descomposición es mayor (Doyle et al., 
2001). 
 
 
3.3 Origen de la microbiota de la carne de res 
 
 La carne de los animales faenados en condiciones de buenas prácticas de 
manufactura es estéril desde el punto de vista práctico. Por ello, el perfil 
microbiológico de la carne fresca presentada a los consumidores es la suma de las 
aportaciones realizadas durante las operaciones de faena, almacenamiento, 
transporte y distribución. El músculo postmortem ofrece un ambiente altamente 
nutritivo a la microbiota contaminante, pudiendo satisfacer sus necesidades básicas 
para el crecimiento (Signorini et al., 2006). 
 
 Las fuentes de contaminación de la carne se pueden dividir en dos: primarias y 
secundarias. Las fuentes primarias son: pelo, piel, patas, contenido estomacal y 
entérico, cavidades nasofaríngeas y porciones externas del tracto urogenital. 
Mientras que las secundarias son: superficies, equipamiento, y herramientas en la 
cadena de sacrificio, refrigerador y área de deshuesado (Norrung & Buncic, 2007). 
 
 
 
 
 
14 
3.4 Aspectos generales sobre la microbiología de la carne de mamífero 
 
 Según Nychas (2006) la calidad microbiológica de la carne depende del estado 
fisiológico del animal en la matanza, la contaminación y el proceso durante la 
matanza, la temperatura y otras condiciones del almacenamiento y la distribución. 
La flora inicial de la canal proviene fundamentalmente de los microorganismos del 
suelo y de origen fecal, presentes en el cuero, del contenido gastrointestinal, de los 
operarios y equipos. La mayoría de estos microorganismos, son mesófilos Gram 
positivos, por ejemplo Micrococcus, Staphylococcus y Bacillus con cuentas de 101 – 
105 UFC/cm2. Una fracción menor está compuesta por psicrótrofos Gram negativos 
provenientes del suelo, agua y vegetación con menos de 102 UFC/cm2 (Tabla 2). 
Mientras que la contaminación con enterobacterias es menor a 101 – 102 UFC/cm2 
(Hui et al., 2006; Arango & Restrepo, 2008). 
 
 
Tabla 2. Poblaciones bacterianas en canales bovinas en algunos países (Log 
UFC/cm2). 
País Psicrótrofos Mesófilos N Referencia 
Argentina 2.45 ± 0.74 2.06 ± 0.66 230 Lasta et al., 1992 
Australia 2.79 ± 0.75 - 86 Grau, 1979 
Canadá 4.31 ± 0.11 4.22 ± 0.10 40 Jeremiah et al., 1983 
Unión Europea - 2.99 ± 0.55 60 Roberts et al., 1984 
Estados Unidos - 2.68 ± 0.02 2089 USDA, 1995 
Basada en Hui et al. (2006) 
 
 
 La tabla 3 muestra los géneros bacterianos que se pueden llegar a encontrar en 
la carne bajo diferentes condiciones de almacenamiento (Nychas et al., 2007). En 
condiciones aerobias la microbiota alterante está constituida fundamentalmente de 
especies de Pseudomonas, Alcaligenes, Moraxella, Acinetobacter y Aeromonas 
(Doyle et al., 2001). 
 
 
 
 
15 
Tabla 3. Géneros de bacterias comúnmente encontrados en la carne de mamífero y 
aves. 
 Géneros Reacción Gram Fresca Procesada 
Achromobacter - Xa 
Acinetobacter - XXa X 
Aeromonas - XX X 
Alcaligenes - X 
Alteromonas - X X 
Arthrobacter ± X X 
Bacillus + X X 
Brochothrix + X X 
Campylobacter - X 
Carnobacterium + X 
Chromobacterium - X 
Citrobacter - X 
Clostridium + X 
Corynebactenum + X X 
Enterobacter - X X 
Enterococcus + XX X 
Escherichia - X 
Flavobacterium - X 
Hafnia - X X 
Janthinobacterium - X 
Klebsiella - X 
Kluyvera - X 
Kocuria + X X 
Kurthia + X 
Lactobacillus + X XX 
Lactococcus + X 
Leuconostoc + X X 
Listeria + X X 
Continúa… 
 
 
16 
Microorganismos Reacción Gram Fresca Procesada 
Microbacterium + X X 
Micrococcus + X X 
Moraxella - XX 
Paenibacillus + X X 
Pantoea - X 
Proteus - X 
Providencia - X X 
Pseudomonas - XX X 
Shewanella - X X 
Staphylococcus + X X 
Streptococcus + X X 
Vibrio - X 
Weissella + X X 
Yersinia - X 
X = se sabe que se encuentra, XX = señalado con mayor frecuencia. 
a = empacada al vacío no incluido. 
Basada en Nychas et al. (2008). 
 
 
 El genero Pseudomonas spp., crece en todo el intervalo de pH de los alimentos 
musculares (5.5 – 7) y es en la mayoría de los casos el responsable del deterioro de 
la carne almacenada en condiciones aerobias a bajas temperaturas (Mossel et al., 
2003; Nel et al., 2003; Russo et al., 2006; Nychas et al., 2008). Bajo condiciones 
aerobias de almacenamiento tres especies de Pseudomonas; Ps. fragi, Ps. 
fluorescens y Ps. lundensis son las más importantes (Nychas et al., 2008). Se 
propone que la presencia de Pseudomonas fragi está aunada a su habilidad de usar 
creatina y creatinina (Borch et al., 1996). Cuando la cuenta de Pseudomonas spp. 
en la carne es de 107 - 108 UFC/g, se le atribuye la formación de viscosidad y olores 
desagradables (Nychas et al., 2008). Estas características se vuelven evidentes 
debido a su capacidad de degradar la glucosa y los amino ácidos (Ercolini et al., 
2006). 
 
 
 
17 
 En la microbiota de descomposición aerobia de carne refrigerada han sido 
detectadas Brochothrix thermosphacta y bacterias acido lácticas (BAL). Estos 
microorganismos han sido aislados de canales de res durante el deshuese, 
preparación y refrigeración (Nychas et al., 2008). Brochothrix thermosphacta, 
frecuentemente representa una porción significativa de la microbiota de 
descomposición presente en la carne almacenada aeróbicamente o al vacío y es en 
ocasiones el microorganismo dominante (Russo et al., 2006; Pennacchia et al., 2009; 
Ercolini et al., 2006). Sin embargo, mientras menor sea la temperatura mayor es la 
inhibición de B. thermosphacta (Borch et al., 2006). 
 
 Las BAL, por ejemplo: Lactobacillus, Carnobacterium, y Leuconostoc, pueden 
desempeñar un papel importante en la descomposición de la carne cruda refrigerada 
y bajo las condiciones adecuadas también pueden ser reconocidas como 
competidores importantes de otros grupos microbianos de descomposición (Ercolini 
et al., 2006). Las BAL se encuentran presentes en la microbiota inicial en bajas 
cantidades y por lo tanto son raramente responsables de la descomposición de los 
alimentos proteicos frescos(Huis in’t Veld, 2006). 
 
 Los miembros de la familia de Enterobacteriaceae, provenientes de la 
contaminación fecal, raramente contribuyen a la microbiota de descomposición de la 
carne y productos cárnicos; por lo que han sido considerados como indicadores de 
seguridad alimentaria (Zweifel et al., 2005). Los mayores representantes de esta 
familia presentes en la res son: Pantoea agglomerans, Escherichia coli y Serratia 
liquefaciens (Nychas et al., 2008). 
 
 Debido a la gran variedad de fuentes de contaminación, los tipos de 
microorganismos que suelen encontrarse en la carne de res son muchos y muy 
variables, por lo que es necesario indicar algunos factores que determinan la 
microbiología de la carne. Estos factores pueden ser clasificados en cuatro grupos: i) 
intrínsecos, ii) extrínsecos, iii) métodos de procesamiento y conservación e iv) 
implícitos (Huis in’t Veld, 2006). En la tabla 4 se enlistan los principales factores de 
acuerdo con una modificación de la categorización clásica de Mossel (1983), 
adaptada para incluir a los nuevos procesos de conservación (Hui et al., 2006). 
 
 
18 
Tabla 4. Principales factores implicados en la ecología microbiana de la carne y 
productos cárnicos. 
Tipo Principales factores 
Intrínsecos 1, 2 pH 
Actividad de agua ( Aw) 
Potencial redox (Eh) 
Nutrientes 
Viscosidad 
Microestructura 
Antimicrobianos naturales 
Procesamiento 2 Temperatura (Pasterización y esterilización) 
Radiación gamma 
Presión hidrostática alta 
Aditivos antimicrobianos (Conservadores) 
Envasado (Vacío, atmosferas modificadas) 
Extrínsecos 1, 2 Temperatura de almacenamiento (Refrigeración, 
Congelación) 
Atmosfera gaseosa ambiental 
Humedad ambiental 
Implícitos 1, 2 Microorganismos (Naturaleza microbiana) 
Microbiota natural (Competencia, sinergismo) 
Basada en 1 McDonald & Sun (1999), 2Hui et al. (2006). 
 
 
 Los factores intrínsecos son propiedades físicas, químicas y estructurales 
inherentes al alimento. Los más importantes son: la actividad de agua, potencial 
redox, disponibilidad de nutrientes y sustancias antimicrobianas naturales (Huis in’t 
Veld, 2006). 
 
 Los factores extrínsecos se refieren a aquellos relacionados con las condiciones 
del ambiente en el que se almacenan la carne y los productos cárnicos (Hui et al., 
2006). El factor más importante por el cual se ve influenciado el crecimiento 
microbiano es la temperatura, siendo el factor extrínseco primario de control 
(McDonald & Sun, 1999). 
 
 
19 
 Los factores implícitos son: inherentes al microorganismo, a su estado fisiológico 
y a sus interacciones con otros microorganismos (Hui et al., 2006). Estos 
parámetros implícitos son el resultado del desarrollo de microorganismos los cuales 
pueden tener efectos sinérgicos o antagónicos en la actividad microbiana de otros 
microorganismos presentes en el alimento (Huis in’t Veld, 2006). 
 
 
3.5 La congelación como método de conservación de la carne de res 
 
 Desde la antigüedad el hombre ha empleado como alimento la carne de 
animales, la cual era almacenada por largos periodos para su posterior consumo. 
Debido a esto el ser humano se ha percatado de que la aparición de olores 
extraños, coloraciones raras y otras señales indican la falta de frescura de la carne. 
Por ello ha buscado métodos de conservación efectivos para disponer de dicho 
alimento en épocas de carestía. 
 
 La congelación de los alimentos se originó en China, donde cámaras de hielo 
fueron utilizadas para conservar los alimentos desde 1000 A.C. Más adelante, los 
griegos y los romanos almacenaron alimentos en cámaras de nieve comprimida. A 
mediados de 1800 en Estados Unidos los pescados fueron congelados, usando la 
sal y el hielo para reducir la temperatura de donde el pescado era colocado. A 
finales del siglo XIX, la carne congelada empezó a transportarse largas distancias 
(Archer, 2004). 
 
 En Gran Bretaña, la conservación de la carne por congelación a gran escala 
comenzó alrededor de 1880, cuando llegó de Australia el primer cargamento de 
carne de res y cordero congelada. En ese momento había un exceso de carne en el 
sureste del hemisferio, especialmente en Nueva Zelanda y Australia, y la 
congelación ofrecía una conservación significativa de la carne durante los viajes 
entre los dos países (Zhou, 2010). 
 
 En 1922, Clarence Birdseye pionero de la congelación rápida concluyó que esta 
previene la formación de cristales de hielo grandes, limitando el daño de la 
 
 
20 
estructura celular del alimento. Más adelante en 1928, desarrolló una tecnología de 
congelación basada en ese principio; aunque fue hasta 1929 que sus alimentos 
congelados fueron producidos comercialmente (Archer, 2004). 
 
 Aunque en los años 1960s la carne y los productos cárnicos congelados tuvieron 
un desarrollo industrial considerable fue hasta 1970 que los alimentos congelados al 
menudeo tuvieron un aumento en las ventas (Varnam & Sutherland, 1995). 
 
 La congelación rápida, en la que el alimento pasa de 0 ° C a - 4 ° C en 30 
minutos o menos, es considerada una forma de almacenamiento de larga duración 
debido a que evita la multiplicación microbiana (Gaman & Sherrington, 1900; 
Vaclavik & Christia, 2002). Se producen cristales de hielo intracelulares diminutos y 
esto disminuye el goteo en el deshielo (Li & Sun, 2002); por lo que este tipo de 
congelación ha sido ampliamente usada en la industria cárnica. Los alimentos 
congelados son generalmente almacenados a -18 ° C y tienen un tiempo de vida de 
seis meses a dos años (Blackburn, 2006). 
 
 El término “carne fresca” incluye desde la carne de animales recién procesados 
hasta la carne empacada al vacío o en atmósferas controladas, la cual no ha 
llevado ningún tratamiento más que la refrigeración para asegurar su conservación. 
La composición de la carne, la hace un ambiente ideal para el crecimiento de 
microorganismos de descomposición y patógenos de la carne. Por lo que es 
esencial el uso de tecnologías de conservación adecuadas para mantener su 
calidad y seguridad. La mayoría de los procesos empleados para la conservación 
de la carne se basan en inhibir el crecimiento de los microorganismos de 
descomposición, aunque existen otros métodos que además intentan minimizar los 
cambios de deterioro, como el color y cambios oxidativos (Zhou, 2010). 
 
 Tradicionalmente, los métodos de conservación de los alimentos pueden ser 
agrupados en tres amplias categorías basadas en el control de la temperatura, 
control de la humedad, y más directamente, por procesos inhibitorios (bactericidas y 
bacteriostáticos); aunque un método de conservación en particular puede involucrar 
varios principios antimicrobianos. Cada paso de control puede ser considerado 
 
 
21 
como un obstáculo contra la proliferación microbiana y la combinación de procesos 
se puede emplear para alcanzar objetivos particulares en términos de calidad, tanto 
microbiana como organoléptica (Zhou, 2010). 
 
 La congelación rápida por métodos comerciales incluye procedimientos como los 
siguientes: 
 
- Túneles de congelación de aire forzado. 
- Congeladores de placas. 
- Congelación criogénica. 
 
 Los procedimientos de aire forzado utilizan aire frío por convección. Los 
alimentos se colocan en carros que posteriormente se hacen pasar por un túnel, o 
una cinta transportadora, donde aire muy frío se dirige sobre el alimento y cuando 
todas las partes del alimento alcanzan una temperatura de -17.8 ° C, los envases se 
colocan en almacenes de congelación. Equipos de este tipo fueron empleados para 
producir los primeros alimentos congelados, con una velocidad alta de congelación. 
En la actualidad versiones más modernas pueden ser empleadas junto con otros 
métodos de congelación para la conservación de la carne de res y productos 
cárnicos de todo tipo. Estos productosse pueden envasar antes o después de la 
congelación (Hiu et al., 2006; Varnam & Sutherland, 1995; Vaclavik & Christia, 
2002). 
 
 En los congeladores de placas, el alimento envasado se coloca entre placas 
metálicas, las cuales contactan completamente el producto y conducen el frío, de 
esta forma el alimento se lleva a -17.8 ° C de mane ra uniforme. Los congeladores 
de placas de funcionamiento continuo y automático pueden congelar el alimento e 
inmediatamente depositarlo en las áreas para su embalaje y almacenamiento. Estos 
equipos son principalmente usados para congelar productos en bloques de 10 a 15 
kilogramos. Los de disposición vertical han sido especialmente desarrollados para 
pescados enteros o eviscerados, también se utilizan para despojos de pescado o de 
carne destinada para la alimentación animal. Este método de congelación 
 
 
22 
generalmente se utiliza para carne no empaquetada y vísceras como el hígado (Hiu 
et al., 2006; Varnam & Sutherland, 1995; Vaclavik & Christia, 2002). 
 
 La congelación criogénica consiste en la inmersión o pulverización del alimento 
con nitrógeno líquido (NIL). El NIL tiene un punto de ebullición de -196 ° C y por lo 
tanto congela los alimentos mucho más rápido que otras técnicas mecánicas. Las 
técnicas de congelación criogénica incluyen túneles de congelación donde se 
pulveriza NIL sobre el alimento. El NIL se evapora a nitrógeno gaseoso a -196 ° C, 
al final del túnel, y se recircula a la entrada del mismo. Este método de congelación 
ha sido directamente asociado con una mayor calidad en una amplia variedad de 
productos cárnicos, incluyendo carne de aves y filetes de res (Varnam & Sutherland, 
1995; Vaclavik & Christia, 2002). 
 
 Cuando los alimentos congelados se manejan y procesan correctamente, a 
menudo cuentan con características sensoriales y nutritivas superiores a los 
alimentos conservados por otros métodos. Estas características dependen del 
control del sistema de congelación, antes y después de la congelación del alimento 
(George, 1993). La carne a congelar debe proceder de animales sacrificados en 
perfectas condiciones higiénicas y someterse a congelación lo antes posible 
después del sacrificio y/o refrigeración (Fehlhaber & Janetschke, 1995). 
 
 Las tazas de supervivencia después de la congelación dependerán de las 
condiciones de congelación, la naturaleza del alimento y la composición de su 
microbiota, aunque se ha reportado que del 5 al 70 % de las esporas prácticamente 
no son afectadas, la mayoría de las bacterias Gram positivas en estado vegetativo 
son relativamente resistentes y las Gram negativas muestran mayor sensibilidad 
(Fehlhaber & Janetschke, 1995). 
 
 Una temperatura de -55 ° C ha sido sugerida co mo una condición de 
almacenamiento ideal para que se prevengan totalmente cambios en la calidad de 
la carne congelada. A esta temperatura, las reacciones enzimáticas, la rancidez 
oxidativa y la recristalización del hielo es mínima; y pocos cambios de deterioro 
ocurren durante el almacenamiento de la carne a estas temperaturas (Zhou, 2010). 
 
 
23 
 
 Los métodos tradicionales de conservación de la carne de res basados en 
tratamientos térmicos, aunque eficaces para garantizar la seguridad del alimento, 
tienen algunos efectos negativos, como pérdida o reducción de ciertos nutrientes o 
alteración de sus características sensoriales. Por esta razón, los centros de 
investigación especializados de la industria alimentaria están realizando un esfuerzo 
en desarrollar dos líneas de trabajo: por un lado nuevas tecnologías de 
conservación con tratamientos térmicos alternativos, o mejora de los ya existentes; 
y, por otro lado, la búsqueda de procesos de conservación de alimentos sin 
aplicación de calor, es decir, no térmicos (Pelayo, 2007). Estos métodos “no 
térmicos” no afectan, o lo hacen mínimamente, a las características nutritivas y 
sensoriales de los alimentos. 
 
 Gracias a esta búsqueda, hoy en día, los desarrollos tecnológicos alcanzados en 
la conservación, el procesado y la manipulación de los alimentos, han permitido a 
los consumidores obtener productos frescos y de calidad. Entre estas tecnologías 
se encuentran las altas presiones, ultrasonidos, irradiación, entre otras (Herrero & 
Romero de Avila, 2006). 
 
 La aplicación de altas presiones (HHP) (entre 100–1000 MPa) a los alimentos ha 
despertado en los últimos años un enorme interés. Su efecto puede resumirse en lo 
siguiente: disminución de la síntesis de DNA, aumento de la permeabilidad de las 
membranas celulares, desnaturalización de polímeros y proteínas, incluida la 
inactivación de enzimas, por cambios en la estructura intramolecular (>300 MPa). 
Estos hechos pueden afectar, en mayor o menor grado, la viabilidad de los 
microorganismos y otros agentes de descomposición, así como modificar los 
componentes de los alimentos y cambiar las características organolépticas de los 
mismos (Herrero & Romero de Avila, 2006). 
 
 Desde Hite (1899) se sabe que la HHP tiene la capacidad de inactivar a los 
microorganismos pero fue hasta 1990 que en Japón aparecieron los primeros 
alimentos conservados mediante el uso de esta tecnología. Hoy en día, existen 
algunas compañías alrededor del mundo (Japón, USA, España, Alemania y 
 
 
24 
Australia) que emplean la HHP como tecnología de conservación en productos 
cárnicos (Aymerich et al., 2008). 
 
 
3.6 Evolución microbiana durante el almacenamiento a bajas temperaturas 
 
 A pesar de la diversidad de la microbiota inicial de los alimentos musculares y de 
las diferencias entre los tejidos musculares, las características de los 
microorganismos alterantes son muy similares (Doyle et al., 2001). La congelación 
determina una cierta disminución de los microorganismos, especialmente de las 
bacterias Gram negativas. Durante la congelación tiene lugar la mayor parte de la 
caída de los recuentos de los microorganismos viables, pero durante el 
almacenamiento en congelación también van muriendo bacterias con el transcurso 
del tiempo. A pesar de la reducción de los recuentos microbianos, tanto los 
microorganismos alterantes como los potencialmente patógenos sobreviven en la 
carne congelada (por ejemplo Salmonella y E. coli O157:H7) (ICMSF, 2001; Hui et 
al., 2006). 
 
 La refrigeración limita el crecimiento de los mesófilos, que son el componente 
mayoritario de la microbiota inicial y permite que se desarrollen los microorganismos 
psicrótrofos, que pueden dominar la microbiota (Doyle et al., 2001). Muchas 
especies de bacterias psicrótrofas han sido descritas pero relativamente pocas se 
han encontrado como componentes mayoritarios de la microbiota de 
descomposición. Cepas de Pseudomonas, Lactobacillus, Moraxella, Acinetobacter, 
Brochothrix thermosphacta y algunas de la familia de Enterobacteriaceae son los 
tipos bacterianos comúnmente encontrados en la descomposición de la carne (Gill 
& Newton, 1977; Li et al., 2006). Aunque generalmente estas bacterias sólo 
constituyen una pequeña proporción de la flora inicial, los tipos de bacterias que 
finalmente predominan en el almacenamiento son miembros de estos géneros, 
siendo característicos del tejido muscular, de la piel y del ambiente de 
almacenamiento (Doyle et al., 2001). 
 
 
 
 
25 
3.7 Identificación de microorganismos mediante el uso del gen rRNA 16S 
 
 Tradicionalmente los microorganismos se han caracterizado según sus rasgos 
fenotípicos, características observables y componentes celulares. Actualmente, 
existen diferentes métodos basados en técnicas moleculares para la identificación y 
la tipificación de los microorganismos (Ercolini, 2004; Farnleitner et al., 2004). 
 
 La microbiología molecular es un área en constante cambio (Ercolini, 2004); Por 
lo que la introducción de técnicas moleculares para la detección y cuantificación de 
microorganismosha comenzado a crear una mayor comprensión de la diversidad 
microbiana y su papel en la naturaleza. Los microorganismos ahora pueden ser 
agrupados de acuerdo a semejanzas en sus genes, las cuales reflejan mejor sus 
relaciones evolutivas (Balcázar et al., 2007). 
 
 Varias técnicas moleculares se han aplicado para la identificación de la 
población bacteriana dominante aislada de productos cárnicos, tales como SDS-
PAGE de las proteínas celulares, hibridación del rRNA, análisis del gen rRNA 16S, 
PCR-DGGE, y PCR propia de cada especie (Aymerich et al., 2003). 
 
 Con la aparición de la caracterización de la diversidad microbiana mediante la 
filogenia molecular y la clasificación de los microorganismos basada en sus 
relaciones evolutivas, el análisis de la secuencia del gen rRNA 16S se ha convertido 
en un criterio importante para la identificación filogenética de bacterias y se está 
empleando cada vez más para el análisis de las comunidades microbianas (Guan et 
al., 2011). 
 
 Los genes rRNA 16S bacterianos contienen generalmente nueve “regiones 
hipervariables” que demuestran una diversidad considerable en su secuencia entre 
diferentes especies bacterianas y se pueden emplear para su identificación. Las 
regiones hipervariables son flanqueadas por segmentos conservados en la mayoría 
de las bacterias, permitiendo la amplificación de las secuencias blanco usando 
primers universales mediante la PCR. En numerosos estudios se ha reportado que 
las secuencias de las regiones hipervariables del gen rRNA 16S identifican una sola 
 
 
26 
especie bacteriana o la distinguen entre un número limitado de especies o géneros 
(Chakravorty et al., 2007) 
 
 Por lo tanto, el estudio de la secuencia del gen rRNA 16S se ha empleado para 
el análisis comparativo tanto de microorganismos aislados como de especies no 
cultivables, mejorando nuestra comprensión de la estructura y función de las 
comunidades bacterianas (Guan et al., 2011; Muyzer et al., 1993; Escalante et al., 
2004; Balcázar et al., 2007; Chiang et al., 2006; Grahn et al., 2003). Para muchas 
especies bacterianas, el poder discriminatorio del análisis de la secuencia es alta, 
incluso para los fragmentos muy cortos del gen rRNA 16S (Grahn et al., 2003). 
 
 
3.8 Inhibidores de la PCR presentes en alimentos 
 
 Desde su introducción a mediados de 1980 la PCR se ha empleado 
crecientemente como un método de diagnostico específico y sensible para la 
detección de microorganismos en los alimentos (Bhaduri & Cottrell, 1998). La PCR 
se basa en la amplificación enzimática de las secuencias de ácido nucleico blanco 
usando un par de primers específicos y una DNA polimerasa (Lantz et al., 1994). Es 
una tarea desafiante, la cual se ve obstaculizada por la presencia de sustancias que 
inhiben la PCR con frecuencia asociadas a los medios de enriquecimiento, a los 
agentes empleados para la extracción del DNA y a la matriz alimentaria por si 
misma; además de la presencia de microbiota nativa (Ramesh et al., 2002; Bhaduri 
& Cottrell, 1998; Rantsiou & Cocolin, 2006; Pennacchia et al., 2009). Los inhibidores 
generalmente actúan de la siguiente manera: interfieren con la lisis celular 
necesaria para la extracción del DNA, interfieren en la degradación o captura de los 
ácidos nucléicos, o inhiben la actividad de la polimerasa para la amplificación del 
DNA blanco (Wilson, 1997; Kern et al., 2009). 
 
 La calidad y la cantidad de inhibidores varía entre las muestras, por lo que varias 
clases de inhibidores de la PCR han sido caracterizados incluyendo: compuestos 
fenólicos, glucógeno, grasas, celulosa, componentes celulares bacterianos, ácidos 
nucléicos, metales pesados, proteinasas, agentes quelantes, hemoglobina y 
 
 
27 
detergentes (Oikarinen et al., 2009; Ramesh et al., 2002; Teng et al., 2008; Tang et 
al., 2008; Aymerich et al., 2003; Rossen et al., 1991; McGuinness et al., 2009; Kern 
et al., 2009). Sin embargo, no se sabe si la concentración de estos inhibidores se ve 
afectada por diferentes factores como pueden ser: la dieta, la microbiota intestinal, 
los tratamientos realizados durante la producción de la carne, así como parámetros 
físicos y químicos del método de extracción del DNA (Tang et al., 2008; Oikarinen et 
al., 2009; Elsanhoty et al., 2011). 
 
 Por lo tanto, se deben realizar pasos adicionales para disminuir el efecto de 
estos inhibidores. Se han examinado una gran cantidad de métodos para la 
preparación de templados libres de inhibidores como son: dilución, centrifugación, 
filtración, sistemas de dos fases, adsorción y métodos de extracción de DNA 
(Aymerich et al., 2003). La purificación del DNA a partir de homogenizados de 
alimentos por fenol-cloroformo o kits comerciales de purificación son los más 
empleados. Sin embargo estas técnicas, y otras descritas en la literatura son 
relativamente complicadas, lentas y utilizan sustancias químicas dañinas (Bhaduri & 
Cottrell, 1998; Oikarinen et al., 2009). 
 
 En estudios anteriores se ha demostrado que los inhibidores pueden ser 
parcialmente inactivados o unidos por varios compuestos tales como: betaína, 
BSA, formamida, glicerol, gp32, nonidet P-40, dimetil sulfoxi (DMSO) y Tween 20 
(Oikarinen et al., 2009; Maurer, 2006). Por ejemplo, el efecto de las proteinasas en 
los alimentos, las cuales han sido propuestas como inhibidores potenciales de la 
PCR, han sido eliminadas mediante el uso de la BSA o utilizando inhibidores de 
proteasas (Ramesh et al., 2002). Otros inhibidores blanco de la BSA son los 
compuestos fenólicos, los lípidos y los aniones, esto con el propósito de proteger a 
la DNA polimerasa (Volkmann et al., 2007). Un estudio realizado por Oikarinen et al. 
(2009), mostró a pesar de que la BSA reduce la sensibilidad del método de PCR 
inactiva eficazmente los inhibidores de esta naturaleza presentes en la muestra. 
 
 Cuando el DNA extraído se usa como templado para la PCR los residuos de la 
matriz pueden actuar como inhibidores. Por lo tanto, el procedimiento de extracción 
del DNA necesita ser optimizado para (i) obtener una extracción eficiente, y (ii) 
 
 
28 
obtener un grado de pureza adecuado para utilizar el DNA como templado para la 
PCR (Ercolini, 2004). Un estudio realizado por Dooley et al. (2004) en el cual se 
analizaron diferentes tipos de carne de mamíferos (cordero, res, puerco) y aves 
(pollo y pavo), mostró que para el caso de la carne de res la cantidad de templado 
empleada para la reacción de la PCR, puede ser un inhibidor si la cantidad utilizada 
es mayor de 50 ng. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
Justificación 
 
 
 Para la industria cárnica es muy importante investigar la diversidad de los 
microorganismos contaminantes e identificar las especies bacterianas para 
posteriormente controlarlas. Esto es difícil debido a que: la carne es una matriz 
alimentaria compleja, la inhabilidad de detectar algunas bacterias, las interacciones 
entre las especies bacterianas, y la complejidad de las fuentes de contaminación (el 
agua, el suelo, las heces y el ambiente). Actualmente el uso de los métodos 
moleculares tales como la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante 
(PCR-DGGE) pueden superar estos problemas; sin embargo, no se habían 
realizado estudios en la carne de res basados en esta técnica hasta el 2006. Siendo 
necesaria la optimización de los pasos previos al PCR-DGGE para su correcta 
aplicación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
Hipótesis 
 
 
 Ya que los microorganismos no se desarrollan a temperaturas de congelación, 
durante el almacenamiento de carne deres fresca en congelación no se 
presentarán cambios significativos en las cuentas microbianas; sin embargo se 
presentarán cambios en el tipo de microorganismos durante este proceso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
31 
 
Objetivos 
 
 
Objetivo General 
 
 Determinar la variabilidad en la microbiota bacteriana de muestras de carne de 
res fresca durante su almacenamiento en congelación. 
 
 
Objetivos Específicos 
 
� Aislar diferentes tipos de bacterias de carne de res cruda y almacenada a 
diferentes tiempos en congelación. 
 
� Identificar las bacterias aisladas de la carne mediante la comparación de 
secuencias de la región V1 del gen rRNA 16S. 
 
� Determinar la composición microbiológica de las diferentes muestras de 
carne de res, durante su almacenamiento en congelación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
 
 
E
strategia E
xperim
ental 
 
 
 
 
Figura 1. Esquema de trabajo. 
 
 
33 
 
Materiales y Métodos 
 
 
 La Figura 1 muestra el esquema general de trabajo dividiéndose en dos grupos: 
los métodos dependientes de cultivo y los métodos independientes de cultivo. 
 
 
8.1 Material 
 
 Las muestras de carne que se emplearon para la realización de este proyecto 
fueron cortes de res. Se seleccionaron dos cortes de primera: filete de res y sirloin 
de res. Estos se adquirieron en un supermercado al sur de la ciudad de México. La 
carne se encontraba en trozos de aproximadamente 60 g, y la cantidad total de 
carne que se compró fue de 200 g por cada tipo de corte. En el momento de la 
compra, las muestras se encontraban en refrigeración, debidamente empacadas en 
charolas de unicel y con fecha de caducidad posterior a la fecha de compra. Se 
transportaron al laboratorio en una hielera, para conservar su temperatura. 
 
 
8.2 Muestreo de carne 
 
 En condiciones asépticas se cortaron trozos de 30 g de cada corte, se colocaron 
individualmente en bolsas de plástico, se asignaron claves de acuerdo con el plan 
de muestreo (Tabla 5), y se conservaron en congelación a -20 ° C hasta su uso. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
34 
Tabla 5. Tiempo de congelación de los cortes de carne de res almacenados en 
condiciones aerobias a una temperatura de – 20 ° C. 
Muestra Clave Tiempo en congelación 
Carne fresca 0 0 horas 
Carne congelada 1 3horas aprox. 
Carne almacenada 2 1 mes 
Carne almacenada 3 3 meses 
 
 
8.3 Efecto de la congelación en el desarrollo de microorganismos de 
descomposición 
 
 Para determinar el efecto de la congelación en el desarrollo de los 
microorganismos de descomposición se realizó un análisis microbiológico, mediante 
el cual se determinaron las cuentas de microorganismos aerobios mesófilos y 
psicrótrofos usando el método de cuenta en placa por inoculación superficial, con 
peptona al 0.1% como diluyente, con el medio y condiciones que se muestran en la 
Tabla 6. Esto se realizó para cada una de las muestras de carne a tratar, filete y 
sirloin de res, en los tiempos de congelación propuestos anteriormente (Tabla 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
35 
Tabla 6. Medios de cultivo y condiciones usadas para la cuantificación de los 
grupos microbianos. 
Grupo 
microbiano 
Medio de cultivo 
Tiempo de 
incubación 
Temperatura de 
incubación 
Mesófilos 
aerobios 
72 horas 30 ° C 
Psicrótrofos 
aerobios 
Agar cuenta en 
placa (Difco) 
 10 días 5 ° C 
 
 
 Posterior al tiempo de incubación correspondiente en cada caso, se realizaron 
las observaciones morfológicas (tamaño, forma, borde, elevación, textura y color), 
así como el conteo de las colonias reportándose como UFC/g para cada grupo 
microbiano analizado. 
 
 Se seleccionaron las colonias que estuvieran aisladas con características 
morfológicas diferentes basadas en las observaciones realizadas para cada grupo 
microbiano. Para los mesófilos aerobios se seleccionaron trece colonias 
morfológicamente diferentes y para el grupo de psicrótrofos aerobios se 
seleccionaron doce colonias. Se sembraron por agotamiento en el medio agar 
cuenta en placa (Difco), para su purificación y se incubaron a 30 ° C para mesófilos 
aerobios y a 5 ° C para psicrótrofos aerobios. 
 
 Se realizaron observaciones microscópicas para determinar tanto Gram como 
morfología. En caso de que estuvieran puras, se prosiguió con su conservación en 
glicerol al 20% y a temperatura de – 66 ° C. 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
8.4 Identificación de cepas puras mediante la comparación de secuencias del 
gen rRNA 16S 
 
 Debido a que la técnica de PCR-DGGE implica la identificación de 
microorganismos a partir de las bandas obtenidas en un gel de acrilamida-
bisacrilamida, es necesaria la elaboración de un patrón de cepas puras, las cuales 
fueron obtenidas previamente a partir de los cortes de carne analizados. Por ello 
estas cepas fueron sometidas a un proceso de extracción del material genético, 
para posteriormente, poder amplificar la región V1 del gen rRNA 16S. Una vez 
obtenidos los amplificados de cada cepa tratada, se mandaron a secuenciar a la 
Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular, UNAM. Con la 
ayuda del programa BLAST se obtuvo la identificación de las cepas tratadas. Cabe 
mencionar que se mandaron a secuenciar todas las cepas que se lograron purificar 
provenientes de los cortes de carne tratados, tanto microorganismos mesófilos 
aerobios como psicrótrofos. 
 
8.4.1 Extracción de DNA 
 El procedimiento de extracción de DNA fue el siguiente: 
 
a) Activación de cepas puras 
 A partir de las cepas conservadas en glicerol al 20% y almacenadas en el 
ultracongelador a una temperatura de -66 ° C, se to maron 45 µL de la cepa 
deseada y se inocularon en un vial con aproximadamente 4.5 mL de caldo 
nutritivo. El cultivo se incubó durante 48 horas a 30 ° C. 
 
b) Extracción de DNA 
 Para la extracción de DNA de la cepa pura se empleó el Kit de Promega 
(Wizard Genomic DNA Purification). Se tomaron 1.5 mL de cultivo y se pasaron a 
un tubo de microcentrifuga estéril de 1.5 mL. Se centrifugó mediante el Disruptor 
Genie TM (Cat. No. S6001-2 de ZYMO RESEARCH) a una velocidad de 13000 
rpm por 2 minutos, para recuperar la biomasa. Posteriormente se adicionaron 600 
µL de solución de lisis celular (Cat. Promega A7941), se agitó la muestra hasta la 
resuspensión total de las células. Para la lisis celular se incubó en un 
 
 
37 
Thermomixer, Eppendorf a 80 ° C por 5 minutos, y se enfrió a temperatura 
ambiente. Al lisado celular se le adicionaron 3 µL de solución de RNAsa (4 mg/ 
mL) (Cat. Promega A7974) y se mezcló invirtiendo el tubo de 2 a 5 veces. Se 
incubó en un Thermomixer, Eppendorf a 37° C por 45 minutos y se enfrió la 
muestra a temperatura ambiente. Se adicionaron 200 µL de solución de 
precipitación de proteínas (Cat. Promega A7957) a la solución que contiene el 
lisado celular con la RNAsa y se mezcló vigorosamente a alta velocidad por 20 
segundos. Se incubó la muestra en hielo 5 minutos y se centrifugó a 13000 rpm 
por 2 minutos. Se transfirió el sobrenadante que contenía el DNA a un microtubo 
estéril de 1.5 mL que contenía 600 µL de isopropanol frío. Se mezcló hasta la 
aparición de una masa visible de DNA. Se centrifugó a 13000 rpm por 2 minutos y 
se descartó el sobrenadante. Se adicionaron 600 µL de etanol al 70% a 
temperatura ambiente y se mezcló el tubo invirtiéndolo varias veces para lavar el 
botón de DNA. Se centrifugó a 13 000 rpm y se retiró el etanol. Se dejó secar el 
botón durante 24 horas a temperatura ambiente y posteriormentese adicionaron 
100 µL de solución de rehidratación de DNA (Cat. Promega A7964) para 
resuspender el DNA extraído. El DNA genómico obtenido se mantuvo a – 20 ° C 
hasta su uso. 
 
 Para evaluar la integridad del material genético obtenido se realizó una 
electroforesis en gel de agarosa al 1%, depositando 3 µL de cada solución que 
contenía el DNA extraído mediante la técnica descrita arriba y 1 µL de buffer de 
carga [ glicerol 50 %, TAE 2X, azul de bromofenol 0.25%, agua desionizada]. Se 
realizó la electroforesis (POWERPAC BASIC, BIO-RAD, PHARMACIA BIOTECH 
GNA100) a 90 V 30 minutos. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio durante 
15 minutos y las bandas de DNA fueron visualizadas usando un transiluminador 
de luz ultravioleta (FOTO/UV15, FOTODYNE) y fotografiado bajo luz UV (Fluor-S, 
BIO-RAD). Como marcador de peso molecular se empleó el ɸX174 RF DNA/Hae 
III Fragments (Cat. No. 15611-015, Invitrogen). 
 
 
 
 
 
38 
8.4.2 Amplificación por PCR de la región V1 del gen rRNA 16s de cepas 
puras 
 
 Para la amplificación de la región V1 del gen rRNA 16S mediante la reacción 
de PCR se emplearon los cebadores universales para bacteria, pA y 3 (Ampe et 
al., 1999) (Tabla 7). 
 
 
Tabla 7. Cebadores para PCR utilizados para la amplificación de la región V1 del 
gen rRNA 16S. 
Primers Secuencia 5’ – 3’ Orientación 
pA AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Reversa 
3 GTTGCGCTCGTTGCGGGACT Hacia delante 
 
 
 El volumen final de la reacción fue de 50 µL, conteniendo amortiguador para 
PCR 1X, 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM de dNTP, 0.5 ng/ µL de cada cebador y 1 U/ µL 
de Taq, más aproximadamente 10 ng/ µL de DNA (Tabla 8). Se empleó el 
termociclador (Biometra, Tpersonal) programado de acuerdo a lo descrito en la 
tabla 9. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
39 
Tabla 8. Protocolo de PCR para la amplificación de la región V1 del gen rRNA 
16S de cepas puras. 
Reactivo Volumen ( µ L) Concentración final 
Amortiguador 10X (High 
fidelity buffer) 
5 1X 
MgCl2 5 2.5 mM 
dNTPs 1 0.2 mM 
Primer pA 0.5 0.5 ng/ µL 
Primer 3 0.5 0.5 ng/ µL 
Templado (50 ng/ µL) 10 10 ng/ µL 
Taq polimerasa 1 1U/ µL 
Agua desionizada c.b.p. 50 µL - 
 
 
 Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % (p/v) 
en tampón TAE 1X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA pH 8), teñidos con bromuro 
de etidio, separado a 90 V durante 1 hora y fotografiados bajo luz UV (Fluor-S, 
BIO-RAD). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
40 
Tabla 9. Condiciones de la reacción de PCR para amplificar la región V1 del gen 
rRNA 16S. 
Número de ciclos Temperatura (° C) Tiempo (minutos) 
1 94 3 
34 94 1 
 65 1.5 
 72 2 
2 72 15 
 
 
8.4.3 Purificación de productos de PCR 
 
 Concluida la reacción de PCR se tomaron 50 µL de cada reacción y se llevó a 
cabo la purificación del producto amplificado mediante un kit de purificación de 
producto de PCR Millipore (Montage PCR Centrifugal Filter Device). Para la 
purificación con el kit se insertó la membrana de filtración en un tubo de 1.5 mL, se 
colocaron 350 µL de agua estéril y 50 µL del amplificado. Se centrifugó a 3000 
rpm durante 15 minutos. Para evitar que la membrana colapsara o que se 
produjera sequedad en el producto purificado se realizó este paso únicamente una 
vez. Se descartó el tubo de 1.5 mL con el sobrenadante y se colocó un tubo 
limpio. Por ultimo se adicionaron 20 µL de agua destilada estéril en la columna. Se 
invirtió y se centrifugó a 3000 rpm durante 2 minutos. El centrifugado se guardó en 
congelación hasta su uso. 
 
 El producto purificado se visualizó mediante un gel de agarosa al 1.5 % (p/v) en 
tampón TAE 1X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA pH 8). Se corrió la 
electroforesis (POWERPAC BASIC, BIO-RAD, PHARMACIA BIOTECH GNA100) 
a 90 V 30 minutos. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio durante 15 minutos 
y las bandas de los productos purificados fueron visualizadas usando un 
transiluminador de luz ultravioleta (FOTO/UV15, FOTODYNE) y fotografiado bajo 
luz UV con (Fluor-S, BIO-RAD). Como marcador de peso molecular se empleó el 
 
 
41 
(ɸX174 RF DNA/Hae III Fragments, Cat. No. 15611-015, invitrogen). Esto para 
corroborar que se haya eliminado cualquier impureza y que la intensidad de la 
banda fue adecuada para secuenciar. 
 
 Una vez obtenido el producto de PCR puro, las muestras se secuenciaron en la 
Unidad de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular, UNAM. Mediante 
la utilización del primer γ (ACTGCTGCCTCCCGTAGGAG) se obtuvo la secuencia 
de cada una de las cepas, con ayuda del BLAST se buscó la mayor similitud entre 
las cepas puras y la base de datos. 
 
 
8.5 Extracción de DNA de carne 
 
 Con el fin de obtener un protocolo óptimo para la extracción del DNA de la carne 
se probaron cuatro modificaciones al protocolo propuesto por Díaz et al. (2001). 
Estos protocolos se muestran en la Tabla 10. Se seleccionó el protocolo C, debido a 
que fue el óptimo para la extracción del DNA. Este protocolo es descrito a 
continuación. 
 
 Se tomaron 30 g de carne, se homogeneizaron con 10 mL buffer de fosfatos o 
solución amortiguadora de fosfatos [0.1 M pH 8] en un equipo Stomacher 400 
(SEWARD) por 6 minutos a velocidad media. Se tomaron 1.5 mL de la fase liquida 
del homogenizado (por triplicado) en un microtubo para la extracción de DNA. Las 
muestras se centrifugaron (HERMLE Z160M) a 14,000 rpm durante 10 minutos. Se 
retiró el sobrenadante y a los botones se les adicionaron 200 µL de solución de 
lisozima [20 µg. µL-1] en amortiguador TES [50 mM Tris pH 8, 1mM EDTA, 8.56 % 
(p/v) sacarosa] y 20 µL de solución de mutanolisina [1 UI/ µL], después se 
mezclaron con el equipo vortex por un minuto y se incubaron en un Thermomixer, 
Eppendorf a 37 ° C por 1 hora o hasta ver viscosida d. A cada tubo se le adicionaron 
100 µL de solución de proteinasa K [1mg/mL], se agitaron en vortex un minuto y se 
incubaron a 65 ° C en un Thermomixer, Eppendorf por 1 hora. Se adicionaron 40 µL 
de solución de RNAsa [10 µg/ µL], se agitaron en vortex un minuto y se incubaron a 
65 ° C en un Thermomixer, Eppendorf por 1 hora. 
 
42 
 
Tabla 10. Diferencias entre los métodos empleados para la extracción de DNA. 
 
 
43 
 Posteriormente se adicionaron 120 µL de SDS al 10% (p/v) a cada tubo, se 
incubaron nuevamente a 65 ° C en un Thermomixer, Ep pendorf por 10 minutos y se 
dejaron enfriar los tubos. Se adicionaron 300 µL de NaCl 5 M, después se 
agregaron 650 µL de solución de cloroformo-alcohol isoamílico [24:1]. Los tubos se 
agitaron manualmente durante 20 s y posteriormente 10 s en vortex a alta 
velocidad. Las muestras se centrifugaron más de una vez durante 5 minutos a 
14,000 rpm, hasta que la interfase fuera casi nula. Los sobrenadantes se 
recuperaron con una micropipeta y se transfirieron a microtubos de 2 mL, se 
adicionó a cada tubo 650 µL de solución de fenol-cloroformo [24:25] y se agitaron 
en vortex 30 s. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 5000 rpm a 
temperatura ambiente y se transfirieron nuevamente los sobrenadantes (400 µL) a 
microtubos limpios de 1.5 mL. Se agregaron 500 µL de isopropanol frío a cada tubo, 
se agitaron suavemente y se refrigeraron durante 15 minutos. Las muestras se 
centrifugaron durante 15 minutos a 14,000 rpm a temperatura ambiente, se retiró el 
sobrenadante de cada tubo con micropipeta y se lavaron los precipitados con 1 mL 
de etanol absoluto frío. Posteriormente, las muestras se centrifugaron durante 15 
minutos a 14,000 rpm a temperatura ambiente, se retiraron los sobrenadantes con 
micropipeta y se dejaron secar los botones a temperatura ambiente durante toda la 
noche. El DNA se resuspendió en 50 µL de agua estéril, calentando durante 5 
minutos a 37 ° C en un Thermomixer, Eppendorf. Los tubos con el DNA se 
mantuvieron en congelación hasta su uso. 
 
 Para la determinación de la concentración de DNA obtenidose midió la densidad 
óptica a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro UV-visible (Agilent 8453E). Para 
conocer la concentración de DNA se utilizó la ecuación propuesta por Sambrook 
(1989) considerándose además la longitud de la celda (Figura 2). 
 
 
( ) ( )



=




ml
gDNAiónConcentracDNAml
gaAbsorbanci extraídocadenadoblenm
µµ 550260 
Figura 2. Concentración del DNA extraído mediante la medición espectrofotométrica 
a 260 nm, considerando una celda de 2mm. 
 
 
 
 
44 
 Según Sambrook (1989) la relación de los valores de las absorbencias medidas 
a 260 nm y 280 nm (Figura 3) para un DNA de doble cadena con la pureza 
necesaria para ser estudiado se encuentra dentro del intervalo de 1.8 – 2.0 se 
determinó la pureza del DNA extraído mediante la ecuación propuesta por dicho 
autor con el propósito de conocer si el DNA extraído se encontraba en condiciones 
optimas para ser estudiado. 
 
 
extraído
nm
nm DNAPurezaDO
DO =
280
260 
Figura 3. Pureza del DNA extraído mediante la relación entre las mediciones 
espectrofotométricas a 260 nm y 280 nm. 
 
 
 Para evaluar la integridad del DNA se realizó una electroforesis en gel de 
agarosa al 1%. Se corrió la electroforesis (POWERPAC BASIC, BIO-RAD, 
PHARMACIA BIOTECH GNA100, 300V) a 90 V por 30 minutos. Los geles se 
tiñeron en una solución de bromuro de etidio durante 10 minutos y las bandas de 
DNA fueron visualizadas usando un transiluminador de luz ultravioleta 
(FOTO/UV15, FOTODYNE) y fotografiado bajo luz UV con (Fluor-S, BIO-RAD). 
Como marcador de peso molecular se empleo el (ɸX174 RF DNA/Hae III 
Fragments, Cat. No. 15611-015, invitrogen). 
 
 
8.6 Amplificación por PCR de la región V3 del gen rRNA 16S de DNA de carne, 
para su separación por DGGE 
 
 Para la amplificación de la región V3 del gen rRNA 16S mediante la reacción de 
PCR se emplearon los primers, universales para bacteria, Agc338F y B518F (Ampe 
et al., 1999) (Tabla 11). 
 
 
 
 
45 
Tabla 11. Cebadores para PCR utilizados para la amplificación de la región V3 del 
gen rRNA 16S. 
Primers Secuencia 5’ – 3’ Orientación 
Agc 338F 
CGCCCGCCGGGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC
GGGGGGACTCTACGGAGGCAGCAG 
Hacia delante 
B518R ATTACCGCGGCTGCTGG Reversa 
 
 
 El volumen final de la reacción fue 100 µL, conteniendo amortiguador para PCR 
1X, 3 mM MgCl2, 0.20 mM de dNTP, 1 ng/µL de cada primer y 1 U/ µL de Taq 
polimerasa, más aproximadamente 5 ng/ µL de DNA (Tabla 12). Se empleó el 
termociclador (Biometra Tpersonal) programado como se muestra en la Tabla 13. 
 
 
Tabla 12. Protocolo de PCR para la amplificación de la región V3 del gen rRNA 
16S de cepas puras y de muestras de carne. 
Reactivo Volumen ( µ L) Concentración final 
Amortiguador 10X (High 
fidelity buffer) 
10 1X 
MgCl2 12 3 mM 
dNTPs 2 0.20 mM 
Primer Agc338F 2 1 ng/ µL 
Primer 518R 2 1 ng/ µL 
Taq polimerasa 2 1U/ µL 
Templado (50 ng/ µL) 10 5 ng/ µL 
Agua desionizada c.b.p. 100 µL - 
 
 
 
 
46 
 Los productos del PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % (p/v) en 
tampón TAE 1X (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA pH 8), teñidos con bromuro de 
etidio, separados a 70 V durante 1 hora y fotografiados bajo luz UV. Para 
determinar, tanto la concentración óptima de MgCl2 como de templado, se 
realizaron dos curvas de concentración para cada caso. En el caso del MgCl2 se 
probaron concentraciones de: 1.5 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM y 5 mM. Tratándose 
cada una con dos concentraciones diferentes de templado, 5 ng/ µL y 9 ng/ µL. 
 
 
Tabla 13. Condiciones de la reacción de PCR para amplificar la región V3 del gen 
rRNA 16S. 
Número de ciclos Temperatura (° C) Tiempo (minutos) 
1 95 5 
20 94 1 
 65 1.5 
 72 3 
1 72 10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
47 
 
Resultados y Discusión 
 
 
9.1 Análisis microbiológico de la carne congelada 
 
9.1.1 Cuentas Microbianas 
 
 Después de los tres meses de almacenamiento en congelación, ninguna de las 
muestras presentaba signos evidentes de deterioro como: olor putrefacto, 
decoloración o viscosidad en la superficie. Los resultados de las cuentas 
microbianas de los dos cortes de carne (filete de res y sirloin de res) almacenados 
en congelación se presentan en la Tabla 14. 
 
 La cuenta microbiana del filete de res para microorganismos mesófilos 
aerobios (Tabla 14) se mostró variable durante todo el tiempo de muestreo, a 
pesar de que se observó una cuenta menor a los tres meses en congelación con 
respecto al tiempo cero, los valores se mantuvieron en el mismo orden de 
magnitud, no se presentó una tendencia clara de que los microorganismos de éste 
grupo disminuyeran o aumentaran durante el almacenamiento del filete de res en 
congelación. Mientras que las cuentas para el grupo de psicrótrofos aerobios del 
filete de res se mantuvieron constantes con una cuenta alta mayor de 4 log a lo 
largo del tiempo. 
 
 Para las cuentas de ambos grupos microbianos estudiados en el sirloin de res 
se mostró una tendencia un tanto diferente con respecto a las cuentas del filete de 
res. El grupo de los psicrótrofos aerobios se mantuvo dentro del intervalo de 4.9 – 
5.9 Log a lo largo de todo el tiempo, sin mostrar una tendencia clara de 
disminución o de aumento. La cuenta de los microorganismos mesófilos aerobios 
disminuyó prácticamente un ciclo logarítmico después de un almacenamiento en 
congelación de tres meses. 
 
 
 
48 
 Era de esperarse que la cuenta de mesófilos aerobios disminuyera a lo largo 
del experimento ya que este grupo microbiano tiene una temperatura óptima de 
crecimiento de 30 ° C (Hayes, 1993) y al ser almace nados a – 20 ° C no es 
posible que se desarrollen, incluso un almacenamiento prolongado a bajas 
temperaturas puede causar la muerte de estos. Sucediendo algo similar con los 
microorganismos psicrótrofos aerobios los cuales son capaces de crecer a 
temperaturas de entre 0 ° C y 7 ° C (Jay, 1994), pu diendo sobrevivir a bajas 
temperaturas aunque no es posible que se desarrollen. 
 
 
Tabla 14. Concentración de microorganismos mesófilos aerobios y psicrótrofos 
durante diferentes tiempos de almacenamiento en congelación (-20 ° C) de 
sirloin y filete de res. 
Concentración de microorganismos 
Log10 UFC/g Clave 
Tiempo en 
congelación 
Filete de res Sirloin de res 
 Mesófilos Psicrótrofos Mesófilos Psicrótrofos 
0 0 5.2 > 4 5.6 4.9 
1 3 horas 5.3 > 4 4.9 5.5 
2 1 mes 5.7 > 4 5.3 5.9 
3 3 meses 4.9 > 4 4.4 4.9 
 
 
 Una cuenta alta de microorganismos mesófilos aerobios refleja una mala 
calidad sanitaria de los alimentos; indicando, además de las condiciones 
higiénicas de la materia prima la forma como fueron manipulados durante su 
comercialización. En teoría las muestras se almacenaron a bajas temperaturas al 
ser transportadas a los puntos de venta; por lo que fue importante determinar la 
presencia de bacterias psicrotrófas, debido a que este grupo de microorganismos 
puede crecer a temperaturas de refrigeración (entre 5 y 7° C), y sobrevivir a 
temperaturas de congelación (Banwart, 1989; Ercolini et. al., 2009; Pascual, 
2000). Según Pascual (2000) las causas de una cuenta elevada de mesófilos 
aerobios en los alimentos pueden ser las siguientes: 
 
 
49 
- Materia prima excesivamente contaminada. 
- Deficientes métodos de manipulación. 
- Posibilidad de la presencia de patógenos, dado que esta microbiota suele ser 
mesófila. 
 
 La técnica básica para la cuantificación de microorganismos mesófilos y 
psicrótrofos aerobios es la misma, pero cambian las condiciones de incubación 
(tiempo y temperatura). Los microorganismos psicrótrofos a pesar de que pueden 
crecer a temperaturas inferiores (-5 ° C – 7 ° C) a la minima tolerada por la 
mayoría de los mesófilos crecen mejor a temperaturas moderadas, por lo que 
pueden