Determinacion-de-los-principales-glucosidos-de-esteviol-presentes-en-las-hojas-de-la-planta-Stevia-rebaudiana-bertoni-mediante-un-metodo-por-cromatografa-de-lquidos-de-alta-resolucion-CLAR

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
DETERMINACIÓN DE LOS PRINCIPALES 
GLUCÓSIDOS DE ESTEVIOL PRESENTES EN 
LAS HOJAS DE LA PLANTA Stevia rebaudiana 
Bertoni MEDIANTE UN MÉTODO POR 
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA 
RESOLUCIÓN (CLAR) 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICO DE ALIMENTOS 
 
PRESENTA 
JOSÉ JAVIER MARTÍNEZ CALLEJA 
 
 
 
 
usuario
Texto escrito a máquina
CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX 2017
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
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del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
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objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
2 
 
 
Jurado asignado 
Presidente 
 
Lucía Cornejo Barrera 
Vocal 
 
Landy Irene Ramírez Burgos 
Secretario 
 
Marisela Bernal González 
1er Suplente 
 
Rolando Salvador García Gómez 
2do suplente 
 
María del Carmen Duran Domínguez de Bazúa 
 
Sitio donde se desarrolló el tema: 
Laboratorios 301, 302, 303 de Ingeniería Química Ambiental y Química Ambiental. 
Departamento de Ingeniería Química. Facultad de Química, UNAM. Ciudad 
Universitaria, México D. F., 04510. México. Tel. (525) 622-53-00, Fax: (525) 622-
53-03 
 
 
 
Asesor del tema 
 
 
Dra. Marisela Bernal González 
 
 
 
 
Supervisor técnico 
 
 
Dra.-Ing. María del Carmen Durán Domínguez de Bazúa 
 
 
 
 
Sustentante 
 
 
José Javier Martínez Calleja 
 
 
3 
 
 
 
 
 
D E C L A R A T O R I A 
 
 
 
 
 
Declaro conocer el Código de Ética de la Universidad Nacional Autónoma de 
México, plasmada en la Legislación Universitaria en las definiciones de integridad 
y honestidad ahí especificadas, aseguro mediante mi firma al calce que el 
presente trabajo es original y enteramente de mi autoría. Todas las citas de, o 
referencias a, la obra de otros autores aparecen debida y adecuadamente 
señalados, así como acreditadas mediante los recursos editoriales 
convencionales. 
 
 
 
 
 
 
 
 _____________________________________ 
Sustentante 
José Javier Martínez Calleja 
 
 
4 
 
 
AGRADECIMIENTOS A LAS INSTITUCIONES 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) que mediante el 
Proyecto 178656 “Efecto de diferentes edulcorantes sobre la liberación de las 
incretinas GLP y su efecto sobre la lipogénesis a corto y largo plazos”, fueron 
adquiridos los reactivos, consumibles y materiales empleados en esta 
investigación. 
 
A la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA) de la UNAM: 
Los reactivos, consumibles y materiales empleados en esta investigación fueron 
adquiridos con el apoyo financiero parcial del Programa de Apoyo a Proyectos 
para la Innovación y Mejoramiento de la Enseñanza (PAPIME), “Apoyo a la 
enseñanza experimental de los laboratorios terminales de las carreras que se 
imparten en la Facultad de Química de la UNAM”, “Apoyo a la enseñanza 
experimental de las asignaturas terminales de las carreras que se imparten en la 
Facultad de Química de la UNAM” y “Desarrollo de material didáctico para las 
asignaturas ingeniería ambiental y estancia académica de la carrera de ingeniería 
química con base en estudios de caso” Claves EN103704, PE101709 y PE-
100514, respectivamente, de la Dirección General de Asuntos del Personal 
Académico de la UNAM, DGAPA. También contribuyó con recursos financieros 
parciales el Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado de la Facultad de 
Química de la UNAM, PAIP, Clave 50009067. 
 
 
5 
 
 
 
Dedicatorias 
 
A mi mamá y papá: por ser aquellas personas que me motivaron y apoyaron 
durante toda mi vida y carrera, por ser los que siempre 
creyeron en mi esfuerzo y por ser las personas que me 
enseñaron a crecer 
 
 
 
 
A mi familia: 
 
 
 
 
porque siempre se mantuvo unida, haciéndome un 
individuo más fuerte y consciente 
 
 
 
 
 
A mis amigos: 
 
 
 
 
 
que siempre me apoyaron en todas situaciones y 
motivándome para siempre salir adelante 
 
6 
 
Índice 
 Página 
Listado de tablas 8 
Listado de figuras 9 
Abreviaturas 12 
Glosario 14 
Resumen del trabajo 18 
1. Introducción 19 
1.1. Planteamiento del problema 19 
1.2. Hipótesis 20 
1.3. Objetivos 20 
1.3.1. Objetivo general 20 
1.3.2. Objetivos específicos 20 
2. Marco teórico 21 
2.1. Importancia del tema 21 
2.2. Justificación de la investigación 21 
3. Antecedentes 23 
3.1. Historia sobre la Stevia rebaudiana Bertoni 23 
3.2. Características agronómicas y agroclimáticas 24 
3.3. Composición química 25 
3.4. Toxicidad 27 
3.5. Estabilidad 28 
3.6. Efectos biológicos de la Stevia rebaudiana B. 28 
3.6.1. La stevia y su efecto sobre el metabolismo de la glucosa 28 
3.6.2. Metabolismo y excreción 28 
3.6.3. Efecto cariogénico y mutagénico 29 
3.6.4. Acción antioxidante de la stevia 30 
3.6.5. La stevia como diurético 31 
3.6.6. La stevia contra la hipertensión 31 
 
7 
 
Índice continuación… 
 Página 
3.6.7. Efecto antibacteriano de la stevia 32 
3.7. Perfil de sabor de la stevia 32 
3.8. Regulación del uso de glucósidos de esteviol como edulcorante para la 
manufactura de productos alimenticios. 
33 
4.0. Metodología y materiales 38 
4.1. Metodología 40 
4.2. Tratamiento de las hojas secas de S. rebaudiana Bertoni 41 
4.3. Caracterización de las hojas pulverizadas 41 
4.4. Extracción de los glucósidos 44 
4.5. Cuantificación 47 
4.6. Identificación por cromatografía en capa fina, CCF 48 
5. Resultados y discusión 49 
5.1. Caracterización de las hojas pulverizadas 49 
5.2. Cuantificación de los extractos por espectrofotometría 54 
5.3. Identificación de los compuestos por cromatografía en capa fina (CCF) 57 
5.4. Resultados de la cuantificación de los esteviósidos en los diferentes 
extractos por CLAR 
59 
6. Conclusiones y recomendaciones 63 
6.1. Conclusiones 63 
6.2. Recomendaciones 64 
Anexo 1. Cuantificación por CLAR de los extractos A, B y C 66 
Anexo 2. Cromatogramas de extractos A, B y C 68 
Anexo 3. Disposición controlada de los residuos producidos en esta 
investigación 
75 
Bibliografía 77 
 
8 
 
Listado de tablas 
 Página 
Tabla 1. Características generales que presenta la Stevia rebaudiana 
Bertoni (Salvador-Reyes et al., 2014) 
22 
Tabla 2. Clasificación taxonómica de la stevia (Yadav et al., 2011) 23 
Tabla 3. Niveles máximos permitidos de E 960 para la elaboración de 
diversas bebidas de acuerdo al concilio europeo (EFSA, 2014) 
33 
Tabla 4. Niveles máximos permitidos de E 960 para distintos productos 
alimenticios de acuerdo con el Concilio Europeo (EFSA, 2014) 
35 
Tabla 5. Condiciones de operación usadas (temperatura, tiempo y 
proporción de stevia-agua) para la elaboración de las infusiones 
de stevia y las ventajas y desventajas que presenta el método 
de extracción 
39 
Tabla 6. Resultados del primer lote. Caracterización de las hojas secas y 
molidas de Stevia rebaudiana Bertoni 
49 
Tabla 7. Resultados del segundo lote. Caracterización de las hojas 
secas y molidas de Stevia rebaudiana Bertoni 
49 
Tabla 8. Resultados de la cuantificación de la concentración de 
glucósidos 
54 
Tabla 9. Pérdida de Esteviósido y Rebaudiósido A en columnas con 
florisil 
56 
Tabla 10. Resultados de la CCF como identificación de glucósidos 
utilizando la proporción cloroformo:metanol (4:1) 
57 
Tabla 11. Resultados de la CCF como identificación utilizado 
cloroformo:metanol con una proporción (3.5:1.5) 
58 
Tabla 12. Valorespromedio de la cuantificación de Esteviósido y 
Rebaudiósido A por los diferentes métodos de clarificación 
59 
Tabla A1. Cuantificación por CLAR de la concentración de Esteviósido y 
Rebaudiósido A 
67 
 
9 
 
Listado de figuras 
 Página 
Figura 1. Núcleo molecular de esteviol (Kohen, 2008) 25 
Figura 2. Ejemplos de algunos glucósidos presentes en la hoja de la 
Stevia rebaudiana Bertoni (Totté et al., 2000) 
26 
Figura 3. Metodología para la identificación y cuantificación de los 
glucósidos de interés 
40 
Figura 4. Hojas secas de Stevia rebaudiana Bertoni 41 
Figura 5. Pulverización de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni 41 
Figura 6. Tamizado de las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni 41 
Figura 7. Determinación de grasa por el método de Soxhlet 42 
Figura 8. Determinación de cenizas. Calcinación 42 
Figura 9. Cenizas de Stevia rebaudiana Bertoni 42 
Figura 10. Extracción sólido-líquido a 78°C, 56 min 45 
Figura 11. Centrifugación de la infusión 45 
Figura 12. Filtración de la infusión 45 
Figura 13. Cromatografía en columna con empaque de florisil 45 
Figura 14. Filtrado después de la extracción por 24 h con CaCO3 46 
Figura 15. Defecación con hidróxido de calcio 46 
Figura 16. Ajuste de pH cercano a 8 46 
Figura 17. Filtración al vacío 46 
Figura 18. De izquierda a derecha columna: para retención selectiva, 
Amberlita (catiónica), Chelex 100 (aniónica), carbón 
activado 
46 
Figura 19. Extracción sólido-líquido a 92°C, 5 min. Infusión C 46 
Figura 20. Filtración de la infusión C 46 
Figura 21. Cromatografía en columna para la infusión C 46 
Figura 22. CCF. Cámara de elución 48 
Figura 23. CCF. Placas reveladas 48 
 
10 
 
Listado de figuras continuación… 
 Página 
Figura 24. Curva patrón de Rebaudiósido A para la determinación de 
hidratos de carbono totales por el método fenol-sulfúrico 
52 
Figura 25. Curva patrón de esteviósido para determinación de 
hidratos de carbono totales por el método fenol-sulfúrico 
53 
Figura 26. Curva patrón de albúmina sérica bovina para la 
determinación de proteínas solubles 
54 
Figura 27. Curva patrón de Rebaudiósido A: Abs vs concentración 
(mg/L) por espectrofotometría a una λ213 nm 
55 
Figura 28. Curva patrón de esteviósido: Abs vs. concentración (mg/L) 
por espectrofotometría a una λ210 nm 
55 
Figura 29. Barrido espectral realizado a los estándares de Esteviósido 
(mayor absorbancia a λ210 nm) y Rebaudiósido A (mayor 
absorbancia a λ213 nm) 
55 
Figura 30. Cromatogramas obtenidos de los estándares de 
Esteviósido y Rebaudiósido A a partir de soluciones 
preparadas con una concentración de 500 μg/mL 
59 
Figura 31. Muestra comercial Svetia ® analizada por CLAR 62 
Figura 32. Cromatograma obtenido de la muestra comercial Svetia ® 62 
Figura A2.1. Cromatograma obtenido de la muestra EA1. No se 
observan tiempos de retención que concuerden con los 
estándares 
69 
Figura A2.2. Cromatograma obtenido de la muestra EA2. No se 
observan tiempos de retención que concuerden con los 
estándares 
69 
Figura A2.3. Cromatograma obtenido de la muestra EA3. No se 
observan tiempos de retención y picos que concuerden 
con los estándares 
69 
11 
 
Listado de figuras continuación… 
 Página 
Figura A2.4. Cromatograma obtenido de la muestra EB1 70 
Figura A2.5. Cromatograma obtenido de la muestra EB2. No se observó 
el pico para el esteviósido 
70 
Figura A2.6. Cromatograma obtenido de la muestra EB3 70 
Figura A2.7. Cromatograma obtenido de la muestra EC1. No se 
observan tiempos de retención ni picos que concuerden 
con los estándares 
71 
Figura A2.8. Cromatograma obtenido de la muestra EC2 No se 
observan tiempos de retención ni picos que concuerden 
con los estándares 
71 
Figura A2.9. Cromatograma obtenido de la muestra EC3 71 
Figura A2.10. Cromatograma obtenido de la muestra E2A1 72 
Figura A2.11. Cromatograma obtenido de la muestra E2A2 72 
Figura A2.12. Cromatograma obtenido de la muestra E2A3 72 
Figura A2.13. Cromatograma obtenido de la muestra E2B1 73 
Figura A2.14. Cromatograma obtenido de la muestra E2B2 73 
Figura A2.15. Cromatograma obtenido de la muestra E2B3 73 
Figura A2.16. Cromatograma obtenido de la muestra E2C1. No se 
detectó esteviósido 
74 
Figura A2.17. Cromatograma obtenido de la muestra E2C2 74 
Figura A2.18. Cromatograma obtenido de la muestra E2C3. No se 
detectó esteviósido 
74 
 
 
12 
 
Abreviaturas 
Abreviatura Significado 
Å Ångström 
°C Grados Celcius 
°Bx Grados Brix 
Λ longitud de onda 
® marca registrada 
μg Microgramo 
μL Microlito 
μm Micrómetro 
CaCO3 Carbonato de calcio 
CaOH Hidróxido de calcio 
CC Cromatografía en columna 
CCF Cromatografía en capa fina 
CLAR Cromatografía de líquidos de alta resolución 
cm Centímetro 
CTC Carbonato de sodio, tartrato de potasio o sulfato de cobre 
pentahidratado 
C.V. Coeficiente de variación 
DAD Siglas en inglés para Diode Array Detector 
DPHT Siglas en inglés para 1-1-difenil-2 picrilo hidracilo 
D.S. Desviación estándar 
EA Extracto obtenido por cromatografía en columna de la infusión A 
EB Extracto obtenido por cromatografía en columna de la infusión B 
EC Extracto obtenido por cromatografía en columna de la infusión C 
E2A Extracto obtenido por columnas de retención selectiva de la infusión A 
E2B Extracto obtenido por columnas de retención selectiva de la infusión B 
E2C Extracto obtenido por columnas de retención selectiva de la infusión C 
EFSA Siglas en inglés para la European Food Safety Authority 
FDA Siglas en inglés para la Food and Drug Administration 
g Gramos 
GRAS Siglas en inglés para Generalmente Reconocido Como Seguro 
h Horas 
HCl Ácido clorhídrico 
IDA Ingesta diaria admisible 
IUPAC Siglas en inglés para la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada 
JECFA Siglas en inglés para el Joint Expert Committee on Food Additives 
K Kelvin 
kg Kilogramo 
LMP Límite máximo permisible 
M Molar 
13 
 
Abreviaturas continuación… 
M Metro 
min minutos 
mm milímetro 
mAU Siglas en inglés para milli absorption units 
mg miligramo 
mL mililitro 
m/m Masa/masa 
m/v Masa/volumen 
N Normal 
NaOH Hidróxido de sodio 
ND No detectado 
Nm Nanómetros 
PE Poder edulcorante 
pH Potencial de hidrógeno 
Rf Factor de retención 
rpm revoluciones por minuto 
SDS Siglas en inglés para dodecil sulfato de sodio 
SiO2 Óxido de silicio 
T Temperatura 
t Tiempo 
TA Tiempo de aparición de sabor 
TE Tiempo de extinción de sabor 
UV-Vis Luz ultravioleta-luz visible 
V Volumen 
v/m volumen/masa 
 
14 
 
Glosario 
 
Aglicona En química orgánica es el agrupamiento no glucídico de un 
heterósido. Es el compuesto sin glúcidos que queda tras 
reemplazar por un átomo de hidrógeno el grupo glicosilo de un 
glucósido. La aglicona se presenta bajo la forma de alcohol, de 
fenol o de una sustancia que contenga nitrógeno y azufre 
Antioxidante Molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación por la pérdida de 
uno o más electrones de otras moléculas ayudando a neutralizar los 
radicales libres 
Bradicardia Ritmo cardíaco más lento que el normal 
Cariogénico Agente productor de caries dentales 
CC 
(Cromatografía 
en columna) 
Es una técnica de purificación, puesto que permite aislar los 
compuestos deseados de una mezcla. La cromatografía en 
columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un 
soporte sólido adsorbente 
CCF 
(Cromatografía 
en capa fina) 
Es una técnica analítica rápida para determinar el grado de pureza 
de un compuesto Se puede determinar así, por ejemplo, la 
efectividad de una etapa de purificación. Comparar muestras. Si 
dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por el 
contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia 
CLAR 
(Cromatografía 
de líquidos de 
alta resolución) 
Es una técnica para separar mezclas en sus componentes 
individuales para que puedan ser identificados y cuantificados. En 
cromatografía líquida (LC), unlíquido en movimiento (fase móvil) 
lleva la muestra a través de una fase estacionaria (el soporte sólido 
encontrado dentro de una columna de LC). Los componentes de la 
muestra se separan en base a sus diferencias de afinidad con la 
fase estacionaria 
Corimbo Es un tipo de inflorecencia abierta, racimosa en la que el eje corto y 
los pedicelos de las flores son largos y salen a diferentes alturas del 
eje. El largo de cada pedicelo floral es tal que todas las flores del 
corimbo abren a un mismo nivel 
Corola Es el verticilo interno de las flores. Se compone de pétalos 
Corola 
entomófila 
Generalmente es de colores llamativos en las plantas entomófilas 
porque una de sus funciones principales es atraer insectos que 
lleven a cabo la polinización 
Cristalización Es un proceso por el cual ciertas sustancias adoptan la forma 
cristalina 
Diterpeno Los diterpenos tienen por definición 20 átomos de carbono en su 
estructura, lo que significa que muy pocos son los suficientemente 
volátiles para poseer un olor. Debido a esto un solo diterpeno es 
usado en la industria al igual que sus derivados sin olor, son usados 
como solventes. Debido a su hidrofobicidad y baja volatilidad, esos 
solventes también tienen propiedades de fijador 
Diurético Que aumenta la secreción y excreción de orina 
15 
 
Edulcorante Sustancia que edulcora los alimentos o medicamentos 
Edulcorar Endulzar cualquier producto de sabor desagradable o amargo con 
sustancias naturales, como el azúcar, la miel, etc., o sintéticas, 
como la sacarina 
Esteviósido El esteviósido es uno de los glúcidos obtenidos naturalmente de 
Stevia rebaudiana. Se trata de un glúcido diterpeno de masa 
molecular 804.80 g/mol. Es una molécula compleja que contiene 
38 carbonos, 60 hidrógenos y 18 oxígenos 
Glucósido Los glucósidos son moléculas compuestas por un glúcido 
(generalmente monosacáridos) y un compuesto no glucídico. Los 
glucósidos desempeñan numerosos papeles importantes en los 
organismos vivos. Muchas plantas almacenan los productos 
químicos importantes en forma de glucósidos inactivos; si estos 
productos químicos son necesarios, se hidrolizan en presencia de 
agua y una enzima, generando glúcidos importantes en el 
metabolismo de la planta. Según la IUPAC (Unión Internacional de 
Química Pura y Aplicada), es cualquier molécula en la cual un 
glúcido se enlaza a través de su carbono anomérico a otro 
compuesto de diferente naturaleza química, mediante un enlace O-
glucosídico 
Hipocalórico Que contiene o proporciona un número bajo de calorías 
IDA (Ingesta 
diaria 
admisible) 
Se puede definir como un índice capaz de medir el grado de 
peligrosidad de la ingesta de un aditivo alimentario. La definición 
más formal expresa que es la cantidad aproximada (en miligramos) 
de un aditivo presente en un alimento, expresada en relación con la 
masa1 corporal y que se puede ingerir a diario, durante toda la vida 
de una persona, sin que llegue a representar un riesgo apreciable 
para la salud 
Infusión Bebida que se prepara hirviendo o agregando en agua muy caliente 
alguna sustancia vegetal, como hojas, flores, frutos o cortezas de 
ciertas plantas, y dejándola unos minutos de reposo. En 
farmacología, acción de sumergir una sustancia orgánica en un 
líquido caliente, pero sin que llegue a hervir, para que se disuelvan 
sus partes solubles 
 
1
 El peso, en física, es la medida de la fuerza que ejerce la gravedad sobre la masa de un cuerpo. Normalmente, se considera 
respecto de la fuerza de gravedad terrestre. El peso depende de la intensidad del campo gravitatorio, de la posición relativa de 
los cuerpos y de la masa de los mismos. La masa es una propiedad característica de los cuerpos: la cantidad de materia, y no 
depende de la intensidad del campo gravitatorio, ni de su posición en el espacio. Por ejemplo, una persona de 60 kg de masa, 
pesa 60 kg-fuerza en la superficie de la Tierra; pero, la misma persona, en la superficie de la Luna pesaría sólo unos 10 kg-
fuerza; sin embargo, su masa seguirá siendo de 60 kg. Las unidades de peso y masa tienen una larga historia compartida, en 
parte porque su diferencia no fue bien entendida cuando dichas unidades comenzaron a utilizarse. Cotidianamente, el término 
"peso" se utiliza a menudo erróneamente como sinónimo de masa. La unidad de masa del SI es el kilogramo, kg, y la de 
fuerza es el Newton, N, aunque se usa el kg-fuerza que no es una unidad del Sistema Internacional 
(http://www.profesorenlinea.com.mx/fisica/masaypeso.htm) 
16 
 
Masa La masa y el peso son diferentes propiedades que se definen en el 
ámbito de la física. La masa es una medida de la cantidad de 
materia que posee un cuerpo (kg) mientras que el peso es una 
medida de la fuerza que es causada sobre el cuerpo por el campo 
gravitatorio (N): Diferencias entre masa y peso 
(http://cienciasprimeroeso.blogspot.mx/2015/04/masa-versus-
peso.html): 
 
Características de masa Características de peso 
1. Es la cantidad de materia que 
tiene un cuerpo. 
2. Es una magnitud escalar. 
3. Se mide con la balanza. 
4. Su valor es constante, es decir, 
independiente de la altitud y 
latitud. 
5. Sus unidades de medida son el 
gramo (g) y el kilogramo (kg). 
6. Sufre aceleraciones 
1. Es la fuerza que ocasiona la caída de 
los cuerpos. 
2. Es una magnitud vectorial. 
3. Se mide con el dinamómetro. 
4. Varía según su posición, es decir, 
depende de la altitud y latitud. 
5. Sus unidades de medida en el Sistema 
Internacional son la dina y el Newton. 
6. Produce aceleraciones. 
 
Multicaule Se refiere a una planta o arbusto que posee más de un tallo o 
tronco principal. 
Mutagénico Es un agente físico, químico o biológico que altera o cambia la 
información genética (usualmente ADN) de un organismo y ello 
incrementa la frecuencia de mutaciones por encima del nivel natural 
Palatabilidad Conjunto de características organolépticas de un alimento, 
independientemente de su valor nutritivo, que hacen que para un 
determinado individuo dicho alimento sea más o menos placentero. 
Esta calificación es, en gran medida, una apreciación subjetiva 
dependiente de la experiencia previa del individuo 
Panícula Una panícula es una inflorescencia racimosa compuesta de racimos 
que van decreciendo de tamaño hacia el ápice. En otras palabras, 
un racimo ramificado de flores, en el que las ramas son a su vez 
racimos. Se cataloga como un racimo de racimos, posee un raquis 
principal que se subdivide en raquis secundarios de los cuales se 
desprenden flores con pedicelo 
Povidona La polivinilpirrolidona es un polímero soluble en agua, formado por 
cadenas de múltiples vinilpirrolidonas. Se usa frecuentemente como 
desinfectante y antiséptico, principalmente para tratar cortes 
menores en la piel 
Rebaudiósido A El rebaudiósido A es un glucósido de esteviol. El glucósido 
solamente contiene glucosa (excluyendo a otros monosacáridos 
comúnmente encontrados). En total, contiene cuatro moléculas de 
glucosa, con la glucosa central del triplete conectada a la estructura 
principal de esteviol en su grupo hidroxilo y la glucosa restante en 
su grupo carboxilo formando un enlace éster 
17 
 
Sacarosa La sacarosa, popularmente conocida como azúcar común o de 
mesa, es un disacárido que se encuentra formado por la 
combinación de una molécula de glucosa y una de fructosa 
Zeolitas Minerales aluminosilicatos microporosos que destacan por su 
capacidad de hidratarse y deshidratarse reversiblemente 
 
 
 
18 
 
Resumen 
 
El presente trabajo consistió en la evaluación de cultivares de Stevia rebaudiana 
Bertoni provenientes del estado de Veracruz, México. Inicialmente se realizó la 
caracterización de las hojas secas, molidas y tamizadas por malla 80 de Stevia 
rebaudiana Bertoni provenientes de dos lotes distintos. Se elaboraron tres 
infusiones (A, B, C) a partir de hojas secas de Stevia rebaudiana Bertoni 
preparadas en distintas condiciones de tiempo(56 min, 24 h, 5 min) y temperatura 
(78±1, ambiente 20, 92°C), manteniendo una proporción de hojas secas de 
Stevia rebaudiana Bertoni – agua igual en dos de las infusiones A, B (01:14) y 
realizando una variación en la tercera C (0.13:14 m/v). Obtenidos los extractos, se 
prosiguió con dos procesos distintos para su clarificación y la obtención de 
extractos ricos en los esteviósidos de interés (Esteviósido y Rebaudiósido A), así 
como para su evaluación en cuanto a la eficacia de los métodos utilizados. El 
primer método utilizado fue el de cromatografía en columna usando silicato de 
magnesio como empaque. Para este método se determinó la pérdida de los 
esteviósidos durante el paso por la columna. Por otra parte, en el segundo método 
de clarificado, las infusiones obtenidas se pasaron a través de columnas de 
retención selectiva, seguido de columnas con resinas de intercambio iónico, una 
catiónica y una aniónica y, finalmente, por una columna con carbón activado, para 
la obtención de los extractos ricos en glucósidos de esteviol. Los extractos fueron 
evaluados usando cromatografía líquida de alta resolución (CLAR), para la 
cuantificación de los principales esteviósidos presente en las distintas muestras. 
Para la infusión A se siguió la técnica reportada en la literatura, considerada la 
mejor opción para extraer mayor cantidad de esteviósidos, mezclando el polvo de 
hojas secas de stevia con agua destilada en un baño de agua a 78±1°C durante 
56 minutos. Las condiciones de la infusión B fueron 24 h, 20°C y, finalmente, la 
infusión C se hizo a 5 min, 92°C. La cantidad extraída de Rebaudiósido A es 
aproximadamente 5 veces mayor a la del Esteviósido (287.9 y 59.0 μg/mL, 
respectivamente). El mejor método para la clarificación fue el de columnas con 
resinas de intercambio iónico, una catiónica y una aniónica y finalmente por una 
columna con carbón activado. 
19 
 
1. Introducción 
 
1.1. Planteamiento de problema 
El uso de edulcorantes bajos en calorías en diversos productos alimenticios a 
partir de los años 60 del Siglo XX ha propiciado un interés por emplear 
edulcorantes de origen natural, especialmente los glúcidos obtenidos a partir de 
las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni, por su elevado sabor dulce y sinergismo 
con otros edulcorantes (Nieto-Bejarano et al., 2015). El cultivo de esta planta ha 
aumentado desde que algunos investigadores japoneses desarrollaron la 
purificación y extracción de los compuestos edulcorantes presentes en sus hojas 
(Dacome et al., 2005), lo que ha llamado la atención a industrias para su uso en la 
elaboración de diversos productos alimenticios, por su gran poder edulcorante, lo 
que podría ser un beneficio económico para las industrias alimentarias, además 
del creciente interés por parte de los consumidores en cuanto al uso de stevia 
como edulcorante sustituto de la sacarosa, debido a diversas menciones en 
muchas fuentes de información sobre sus múltiples beneficios a la salud así como 
la preocupación de estos por la creciente problemática de la obesidad y otros 
problemas relacionados con la alimentación en México (Orta-Méndez-y-Sánchez, 
2016). 
 
La Stevia rebaudiana Bertoni presenta dos glucósidos diterpeniodes 
mayoritariamente: el Esteviósido y el Rebaudiósido A. Entre las principales 
propiedades de éstos se encuentran su alta solubilidad en agua, elevado sabor 
dulce, escaso aporte calórico y estabilidad en condiciones ácidas (Lorenzo et al., 
2014). Dado que puede haber variaciones en su proporción siendo la planta un ser 
vivo, es necesario conocer la concentración de dichos glucósidos presentes en 
una infusión problema con las hojas de Stevia rebaudiana Bertoni. 
 
 
 
 
20 
 
1.2. Hipótesis 
Nula Ho= El método de extracción y clarificación de los glucósidos no produce 
efectos sobre la cuantificación por un método de CLAR 
 
Alternativa Ha= El método de extracción y clarificación de los glucósidos produce 
efectos sobre la cuantificación por un método de CLAR 
 
1.3. Objetivos 
1.3.1. Objetivo general 
Establecer una metodología para la cuantificación del Esteviósido y Rebaudiósido 
A por medio de cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR). 
 
1.3.2 Objetivos específicos 
 Realizar una caracterización (porcentaje de cenizas, humedad, grasa, 
proteínas, acidez titulable, pH, °Brix)) de las hojas de Stevia rebaudiana 
Bertoni proveniente de Veracruz, México y observar la eficiencia del método 
de extracción del Esteviósido y Rebaudiósido A. 
 Desarrollar un método adecuado para la, clarificación y cuantificación de la 
infusiones obtenidas de Stevia rebaudiana Bertoni 
 Realizar una identificación de los glucósidos de la Stevia rebaudiana Bertoni 
por cromatografía en capa fina con fin de observar la efectividad de los 
métodos de extracción. 
 Determinar los principales glucósidos de esteviol (Esteviósido y 
Rebaudiósido A) mediante CLAR y espectrofotometría UV – Visible, y 
observar la efectividad de cada método de extracción utilizado. 
 
 
 
 
 
 
21 
 
2. Marco teórico 
2.1. Importancia del tema 
El incremento de problemas nutricionales como obesidad, diabetes mellitus, 
problemas cardiovasculares, etc., a causa de las malas formas de alimentación y 
sedentarismo en gran parte de las sociedades actuales, ha provocado en años 
recientes el interés de los consumidores por la búsqueda de productos naturales y 
alternativas nutrimentales. Por ello, los edulcorantes hipocalóricos han sido de 
interés para los consumidores y para las industrias a partir del incremento de este 
tipo de problemas. Para los consumidores, representa la búsqueda de productos 
hipocalóricos para la sustitución de la sacarosa comercial (Puri et al., 2012), la 
cual se cree que es una de las principales causas de problemas de salud en niños 
y adultos (lo que aún no está comprobado), mientras que para las industrias, 
representa la oportunidad de desarrollar productos hipocalóricos sintéticos o de 
origen natural para satisfacer la demanda de los consumidores, así como la 
reducción de costos para la elaboración de sus productos, beneficiándose 
económicamente. La búsqueda de edulcorantes hipocalóricos como la stevia 
presenta beneficios económicos para las industrias, además de que pueden ser 
consumidos por individuos con diabetes, sin poner en riesgo su salud en las 
cantidades recomendadas si es que resultan ser inocuas. Por lo tanto, la Stevia 
rebaudiana Bertoni se ve como una alternativa para resolver parte de los 
problemas de salud pública de las sociedades actuales (Salvador-Reyes et al., 
2014). 
 
2.2. Justificación de la investigación 
Los principales componentes dulces presentes en S. rebaudiana Bertoni son el 
Esteviósido y el Rebaudiósido A. Según Salvador-Reyes et al. (2014), al ser cada 
uno de ellos más dulce que el azúcar convencional y tener la ventaja de que no 
son metabolizados por el cuerpo humano, pueden ser consumidos por individuos 
con diabetes, teniendo un amplio campo de aplicación. Algunas características de 
la Stevia rebaudiana Bertoni se mencionan en la Tabla 1. 
 
22 
 
Tabla 1. Características generales que presenta la Stevia rebaudiana Bertoni 
(Salvador-Reyes et al., 2014) 
Edulcorante Características 
Stevia 
rebaudiana 
Bertoni 
 Poder edulcorante entre 150 a 300 veces más respecto a la 
sacarosa 
 Endulzante natural 
 No se absorbe y es utilizado por enterobacterias 
 Valor energético de 0 kcal/g 
 No cariogénico 
PE: poder edulcorante en una dilución de sacarosa de 30 g/L a 20°C 
 
En la presente investigación se busca realizar de una manera efectiva la 
extracción de dichos glucósidos para posteriormente cuantificarlos mediante CLAR 
debido a que es una forma rápida y precisa para el análisis cuantitativo de 
muestras líquidas con el fin observar la efectividad de los diferentes métodos de 
extracción y clarificación. También se realizó la implementaciónde un método por 
espectrofotometría UV-Vis y CLAR como metodología de respaldo, con el fin de 
comparar y observar la cantidad cuantificada de Esteviósido y Rebaudiósido A. 
Obteniendo estos resultados se podrá justificar si la técnica de clarificación usada 
no afecta en dicha cuantificación. 
 
Esta investigación será de ayuda a futuras investigaciones en las cuales se quiera 
identificar y cuantificar los glucósidos para su aplicación en el desarrollo de nuevos 
productos. 
 
23 
 
 
3. Antecedentes 
3.1. Historia sobre la Stevia rebaudiana Bertoni 
La Stevia rebaudiana Bertoni en una planta herbácea perteneciente a la familia de 
las Asteraceae (Compositae), que se encuentra principalmente en las regiones de 
América del Sur, originariamente en algunas zonas de Paraguay, Brasil y 
provincias del noroeste argentino. El naturalista Moisés Bertoni fue el primero en 
describir la especie y posteriormente el químico paraguayo Ovidio Rebaudi publicó 
para el año de 1900 el primer análisis químico, consiguiendo el aislamiento de los 
principios activos conocidos como esteviósido y rebaudiósido (Kohen, 2008). En la 
Tabla 3 se detalla la clasificación taxonómica de la stevia. La planta es resistente a 
bajas temperaturas pero su ritmo de crecimiento es mayor en temperaturas 
cálidas. Debido a las características y aplicaciones potenciales, la stevia ha sido 
muy estudiada desde principios del siglo XX, por lo que su producción y comercio 
se ha incrementado. Actualmente, los principales países productores de stevia son 
Japón, China, Tailandia, Corea, Brasil, Malasia y Paraguay, mientras que los 
mayores consumidores de stevia son Japón, Brasil, Corea, Israel, Estados Unidos, 
Argentina, China, Canadá, Paraguay e Indonesia (Yadav et al., 2011). 
 
Tabla 2. Clasificación taxonómica de la stevia (Yadav et al., 2011) 
Reino Vegetal 
Subreino Tracheobionta 
División Magnoliophyta 
Subdivisión Spermatophya 
Clase Magnoliopsida 
Subclase Asteridae 
Orden Asterales (Campanulares) 
Familia Asteráceas (Compuestas) 
Género Stevia 
 
24 
 
3.2. Características agronómicas y agroclimáticas 
La planta crece como un arbusto y llega a medir de 40 hasta 80 cm de altura. En 
cuanto a las raíces de la planta, es fibrosas, filiforme, perenne, pivotante, poco 
profunda. Las raíces de la stevia tienden a distribuirse cerca de la superficie y es 
el único órgano que no contienen esteviósidos (Cajas, 2011). 
 
En cuanto al tallo es de color parduzco, sin ramificaciones durante el primer año, 
pero con abundantes ramificaciones a partir del segundo año de crecimiento. Se 
transforma en multicaule después del primer ciclo vegetativo y al cabo de 3 o 4 
años, puede tener entre 20 y 25 tallos. En condiciones óptimas, el tallo puede 
llegar hasta 1.5 m de altura. Las hojas de la stevia son elípticas ovales, presenta 
vellosidad, con bordes aserrados o dentados, las distales agrupadas en número 
de 3 o 4, de un color verde intenso. La hoja es el órgano con mayor contenido de 
edulcorante y su longitud varía de 2.0 a 2.5 cm de largo y de 0.8 a 1.0 cm de 
ancho. La planta es hermafrodita, la corola es de color blanquecino, distribuida en 
pequeños capítulos terminales o axiales, agrupados en panículas terminales 
corimbosas de lóbulos blancos. La stevia tiene la ventaja de que se puede cultivar 
en suelos muy variados. En su estado natural la planta puede crecer en suelos de 
baja fertilidad, ácidos y con alta humedad. En suelos de alta humedad se ha 
logrado observar alta productividad, ya que la respiración de las raíces no decrece 
en condiciones de bajo contenido de oxígeno, debido a que el consumo medio de 
oxígeno de sus raíces es menor que el de otros cultivos de tierra altas. La Stevia 
rebaudiana Bertoni puede crecer en medios subtropicales, semi-húmedos entre 
300 a 1200 m sobre el nivel del mar y de 78% a 85% de humedad relativa. La 
planta se puede desarrollar en lugares donde las condiciones climáticas son de 
intensa luz, con temperaturas tibias, riesgos mínimo de heladas luego de 
brotación, ya que la planta no soporta sequías muy prolongadas, por lo que es 
necesario un sistema de riego extensivo (Cajas, 2011). 
 
Estudios realizados encontraron que la altura de la planta es mayor en lugares 
cercanos al trópico, sin embargo se notó que el rendimiento de hojas por hectárea 
25 
 
fue menor, además que el contenido de glucósidos en plantas cercanas al trópico 
es un 3% mayor, en relación con otros cultivos (Sato y Kawakami, 1975). 
 
Las temperaturas apropiadas para el desarrollo y cultivo de la stevia para un buen 
crecimiento de la planta, se encuentran en un intervalo de 10 a 34°C. Sin 
embargo, las temperaturas entre los 5 y 15°C, inhiben o detiene su desarrollo de 
foliar. Las temperaturas extremas que matan a la planta son inferiores a -6°C y 
mayores a los 43°C (Zubiate, 2007). 
 
3.3. Composición química 
Los compuestos glucósidos presentes en la Stevia rebaudiana Bertoni son los 
responsables del sabor dulce de la hoja. El género Stevia incluye más de 
doscientas especies siendo la Stevia rebaudiana Bertoni la variedad que contiene 
los compuestos más dulces (Brandle et al., 1998). 
 
Los glucósidos son moléculas compuestas por un glúcido (generalmente 
monosacárido) y un compuesto no glucídico. En la plantas los glucósidos son 
almacenados como glucósidos inactivos y éstos se hidrolizan en presencia de 
agua y una enzima, generando glúcidos biodisponibles para la planta. El glúcido 
se enlaza a través de su carbono anomérico (alfa o beta) a otro compuesto de 
diferente naturaleza química. Al glúcido del glucósido se le conoce como glicona y 
el grupo ajeno al glúcido como aglicona del glucósido. Todos los glucósidos de 
esteviol comparten el mismo núcleo molecular (Fig. 1), pero lo que hace la 
diferencia es la cantidad y la disposición de las moléculas de glucosa adheridas al 
núcleo de esteviol (Kohen, 2008). 
 
Fig. 1. Núcleo molecular de esteviol (Kohen, 2008) 
26 
 
 
Los glucósidos de diterpeno son los principales responsables del sabor dulce de la 
hoja. Su contenido varía entre 4 y 20% en las hojas secas (m/m) (Rai et al., 2012). 
Sus hojas tienen un intenso sabor dulce, propiedad que se debe al contenido de 
glucósidos, de los cuales el esteviósido es el que se encuentra en mayor 
proporción. Otros glucósidos de diterpeno presentes en bajas concentraciones son 
el: esteviolbiósido, rebaudiósido B, C, D, F, dulcósido A y rubusósido (Fig. 2). De 
esta manera puede notarse que el producto industrial extraído de la Stevia es en 
realidad una combinación de varios glucósidos, cuyas cantidades varían en 
función a las variedades, de los climas y los terrenos (Totté et al., 2000). 
 
 
Fig. 2. Ejemplos de algunos glucósidos presentes en la hoja de la Stevia rebaudiana Bertoni 
(Totté et al., 2000) 
 
27 
 
Existen estudios en los cuales se realizaron pruebas de estabilidad e interacción 
de los esteviósido con diferentes componentes de los alimentos como ácidos 
orgánicos, donde se concluyó que el esteviósido es estable en soluciones de agua 
a 120°C (Rai et al., 2012). Por lo tanto, se ve a la stevia como un prometedor 
edulcorante potencial. Por otra parte, para la extracción de los esteviósidos de la 
S. rebaudiana Bertoni, se han reportado algunos métodos convencionales que 
implican el uso de disolventes como alcohol o agua, seguido de la precipitación, 
coagulación y cristalización en algunos casos (Puri et al., 2012). 
 
Otras técnicas de extracción modernas reportadas son la extracción de líquido a 
presión, extracciones en agua caliente a presión, extracción asistida por 
microondas y últimamente se han realizado extracciones enzimáticas (Puri et al., 
2012). 
 
3.4. Toxicidad 
De acuerdo con la EFSA (European Food Safety Authority) en el año 2010 (EFSA, 
2010, 2014) concluyó a base de diversos estudios que la stevia no presenta 
riesgos de toxicidaden seres humanos a las dosis utilizadas como edulcorantes, 
así como la FDA (Food and Drug Admisnistration) clasificó a la stevia como 
sustancia GRAS (siglas en inglés para “generalmente reconocido como seguro”) lo 
que permitió el uso de stevia como edulcorante en bebidas y alimentos. La EFSA y 
la JECFA (Comité Mixto de Expertos en Aditivos Alimentarios) determinaron la 
ingesta diaria admisible para esteviol, con un valor de 4 mg/kg de masa 
corporal/día (Carakostas et al., 2008). 
 
Las investigaciones han demostrado que el extracto purificado de la hoja de stevia 
es seguro para su uso en alimentos y bebidas para la población general, las 
embarazadas, los niños y los adultos y niños que padecen diabetes, ya que no se 
han identificado efectos secundarios negativos (GSI, 2013). 
 
28 
 
Los estudios realizados en seres humanos demostraron que las dosis diarias de 
glucósidos de esteviol de hasta 1000 mg por persona al día fueron bien toleradas 
por personas con niveles de metabolización de glucosa normales y por personas 
que padecen diabetes mellitus tipo 2. Esta dosis equivale a 16.6 mg/kg de masa 
corporal por día para una persona de 60 kg (lo que corresponde a, 
aproximadamente, 330 mg de equivalentes de esteviol por persona al día o a 5.5 
mg de equivalentes de esteviol/kg de masa corporal por día) (Maki et al., 2008). 
 
3.5. Estabilidad 
También en los estudios realizados por Pezzuto et al. (1985), se tomaron 
diferentes esteviósidos y se incubaron a valores de pH entre 2 a 8 y temperaturas 
de 5 a 90°C durante un periodo de tiempo de 3 meses máximo, concluyendo que 
el esteviósido no se degrada a esteviol al ser sometido a métodos típicos de 
cocción, almacenamiento o procesamiento. 
 
3.6. Efectos biológicos de la Stevia rebaudiana 
3.6.1. La stevia y su efecto sobre el metabolismo de la glucosa 
Los extractos de stevia han sido utilizados para el tratamiento de la diabetes en 
América del sur debido a que no induce respuesta glucémica tras su ingesta. 
(Kinghorn y Soejarto, 2002). Uno de los primeros estudios mostró que la 
administración de esteviósido en una concentración de 0.05% (m/v) y de polvo de 
hojas de stevia a 10% (m/v), tanto en dietas altas en hidratos de carbono y grasa 
donde se observó la reducción de glucosa en la sangre después de 4 semanas en 
el tratamiento con ratas. Los esteviósidos regulan el nivel de glucosa en la sangre, 
debido al incremento de la secreción de insulina, además hay mejor utilización de 
glucosa por los tejidos periféricos y los músculos en ratas diabéticas (Durán et al., 
2012). 
 
3.6.2. Metabolismo y excreción 
Se han realizado estudios, en donde se observa que el esteviol es el principal 
metabolito del esteviósido como del rebaudiósido A, que aparece en la circulación 
29 
 
sanguínea después de la ingestión oral (Gardana et al., 2003). También los 
estudios del metabolismo del esteviósido en los seres humanos encuentran muy 
bajos niveles sanguíneos de esteviósido o esteviol libre (JECFA, 2005). 
 
Al ser administrados vía oral, tanto el Esteviósido como el Rebaudiósido A, en 
voluntarios humanos, no se detectó esteviol libre en la sangre ni epóxido de 
esteviol, que podría ser mutagénico en humanos (EFSA, 2010, 2014). Además, se 
obtuvieron resultados similares en los experimentos realizados por Gardana et al., 
(2003) en donde se incubaron muestras de Rebaudiósido A y Esteviósido con 
microflora intestinal. Se observó que una degradación a su aglicona de esteviol y 
éste como metabolito final no presentaron cambios durante 72 horas de 
incubación con microflora humana (Gardana et al., 2003). Las bacterias del colon 
utilizan la glucosa liberada, por lo que ésta no es absorbida y no aporta calorías. 
De acuerdo con Gardana et al., (2003), las enterobacterias sp son las 
responsables de la conversión en el tracto intestinal, mientras que las 
bifidobacterias y lactobacilos no están involucrados en la actividad metabólica. 
 
Los glucósidos de esteviol pasan por el cuerpo sin producir ningún tipo de 
acumulación o impacto calórico significativos en el cuerpo. Éstos no se digieren y 
pasan a través del tubo digestivo alto completamente intactos. Las bacterias 
intestinales en el colon (Bacterioides spp) hidrolizan los glucósidos de esteviol en 
esteviol al cortar sus unidades de glucosa, que es metabolizado por el hígado a 
glucorónido de esteviol y, finalmente, es eliminado a través de la orina (Geuns et 
al., 2007). 
 
3.6.3. Efecto cariogénico y mutagénico 
La Stevia rebaudiana Bertoni se utiliza como sustituto del azúcar para la 
elaboración de diversos productos. Un estudio realizó pruebas con el Esteviósido y 
el Rebaudiósido A, principales glucósidos presentes en la planta, para probar si su 
uso prolongado puede tener el potencial cariogénico. El experimento consistió en 
utilizar ratas, las que se alimentaron con una dieta que contenía 0.5% de 
30 
 
Esteviósido y 0.5% de Rebaudiósido A durante 5 semanas. Ninguno de los 
glucósidos mostró un potencial de aumentar el riesgo de desarrollar caries dental 
(Goyal et al., 2010). 
 
En los estudios de mutagenicidad realizados por Pezzuto et al. (1985), se indicó 
que el esteviósido no es mutagénico, así como los glucósidos relacionados 
estructuralmente con el esteviósido, por lo que concluyeron que la falta de 
actividad mutagénica observada en sus ensayos demuestran la seguridad del 
esteviósido. Es importante destacar que la aglicona de esteviol es altamente 
mutagénica, pero se requiere la activación metabólica para potenciar esta 
actividad. 
 
3.6.4. Acción antioxidante de la stevia 
Es sabido que los antioxidantes al ser consumidos en forma de alimentos, tienen 
un importante potencial para reducir el desarrollo de aquellas enfermedades que 
actualmente afectan a la población mundial (enfermedades cardiovasculares, 
tumores y neuro-degenerativas). Se define como antioxidante a una molécula 
capaz de prevenir o retardar la oxidación por la pérdida de uno o más electrones 
de otras moléculas ayudando a neutralizar los radicales libres (Salvador-Reyes et 
al., 2014), generalmente son compuestos biológicos como lípidos, proteínas o 
ácidos nucleicos. Existen estudios donde se evaluó la actividad antioxidante del 
extracto de hojas de Stevia rebaudiana en comparación con ácido ascórbico como 
patrón, donde se determinó el contenido de ácidos fenólicos con el reactivo Foli-
Ciocalteu y posteriormente se comprobó la capacidad para eliminar radicales 
libres mediante la prueba de DPHT (1-1-difenil-2 picrilo hidracilo) a diferentes 
concentraciones. De esta manera se observó que, a mayores concentraciones, la 
absorbancia disminuyó y, por tanto, el extracto de hojas de Stevia rebaudiana 
tiene el poder de eliminar radicales libres e inhibir sus reacciones en cadena 
(Shukla et al., 2012). 
 
 
31 
 
3.6.5. La stevia como diurético 
Conforme al estudio de la Stevia presentado por Salvador-Reyes et al. (2014), los 
diuréticos ayudan a disminuir la presión arterial mediante la excreción de la orina y 
la cantidad de sodio del cuerpo, ayudando así a reducir la sangre que circula en el 
sistema cardiovascular. Melis (1999) realizó un experimento con ratas Wistar 
macho (250 a 350 g cada una) bajo antidiuresis o condiciones de diuresis de agua. 
Para ello inyectó a 10 ratas una dosis de stevia de 0.05 mg/kg de masa vía 
intravenosa. Posteriormente, se evaluó la concentración de sodio y de potasio en 
su orina, encontrando un diferencia significativa en el incremento de estos 
elementos en comparación con las ratas que no consumieron stevia. 
 
3.6.6. La stevia contra la hipertensión 
La presión arterial media varía directamente con el tono de la resistencia sistémica 
vascular periférica o total y el volumen de sangre. En los estados patológicos la 
hipertensión arterial es el resultado de una relación inapropiada entre la capacidad 
vascular/resistencia yel volumen sanguíneo. (Kohen, 2008) 
 
Por años, las tribus guaraníes de Paraguay y Brasil han usado diferentes especies 
de stevia, principalmente Stevia rebaudiana, como endulzante para contrarrestar 
el sabor amargo de los medicamentos a base de diferentes plantas y bebidas, y 
con fines medicinales que incluyen la regulación de la glicemia e hipertensión 
(Durán et al., 2012). Los primeros estudios tanto en animales y seres humanos 
demostraron que el esteviósido y extracto de stevia tiene efecto vasodilatador 
(Lara-García et al., 2009). Se han realizado diversos estudios (tanto en animales 
como en humanos) sobre el efecto del extracto de hojas de stevia contra la 
hipertensión. De acuerdo con los estudios de Melis (1996) se observó un efecto 
hipotensor en ratas entre 40 y 60 días después de la administración de extracto de 
hojas de stevia. Los estudios en seres humanos han demostrado también el efecto 
del Esteviósido en el sistema cardiovascular. El Esteviósido provoca bradicardia e 
hipotensión. Del mismo modo, un efecto hipotensor ligero fue observado en 
32 
 
personas que recibieron un té preparado a partir de Stevia rebaudiana (extracto de 
stevia) al día, durante 30 días. 
 
3.6.7. Efecto antibacteriano de la stevia 
Estudios señalan que el extracto de hojas de stevia actúa como bactericida sobre 
Streptococcus mutans, responsable de las caries dentales al poseer propiedades 
antibacterianas (Kujur et al., 2010). 
 
Un estudio efectuado por Giacaman et al. (2013), evaluó el efecto de los diferentes 
edulcorantes comerciales en la desmineralización del esmalte dental y sobre las 
propiedades cariogénicas del Streptococcus mutans. Las biopelículas de S. 
mutans-UA159 se cultivaron en placas y se expusieron a edulcorantes como: 
Stevia, sucralosa, sacarina, aspartamo y fructosa, durante 5 minutos 3 veces por 
día (durante 5 días). Después de evaluar la pérdida de la dureza del esmalte, los 
resultados indicaron que la stevia redujo el número de células cariogénicas viables 
en comparación con la sacarosa y, por tanto, causó menos daño al esmalte dental 
(artificial). 
 
Por otro lado, se evaluó el efecto del extracto de hojas de stevia en la curación de 
heridas. Para ello, administró dosis de stevia a 150, 250 y 500 mg/kg de masa en 
ratas con heridas; comparando los resultados con el uso de povidona (usado 
como antiséptico comercial) y observó que a los 15 días las heridas tratadas con 
stevia disminuyeron significativamente en comparación con las tratadas con 
povidona, además el efecto cicatrizante aumentó proporcionalmente a la 
concentración de stevia suministrada (Das, 2013). 
 
3.7. Perfil de sabor de la stevia 
De los glucósidos de la stevia, el Rebaudiósido A es el que más se asemeja al 
sabor de la sacarosa en comparación con el esteviósido, por lo que tiene mejor 
perfil de palatabilidad, teniendo un menor sabor amargo al cual se le ha asociado 
(Brahmachari et al., 2011). 
33 
 
 
La percepción de sabor puede tener cambios durante cierto tiempo de anaquel. 
Esta propiedad es muy importante para el empleo en comidas y bebidas ya que es 
un complemento a su perfil del sabor del alimento o producto. 
 
Todos los edulcorantes tienen la característica de un tiempo de aparición de sabor 
(TA) y un tiempo de extinción (TE). Los edulcorantes de alta potencia a diferencia 
de los endulzantes calóricos naturales como la sacarosa, poseen un mayor tiempo 
de extinción, por lo que podrían ser útiles para el desarrollo de productos como 
chicles donde se busca una mayor perduración del sabor (Prakash et al., 2008). 
 
3.8. Regulación del uso de glucósidos de esteviol como 
edulcorante para la manufactura de productos alimenticios 
Actualmente los glucósidos de esteviol clasificado con el número E 960 está 
autorizado en la Unión Europea para uso en productos alimentarios. En el 2010, la 
EFSA (European Food Safety Authority), adoptó un dictamen sobre la seguridad 
de los glucósidos de esteviol (E960), aceptando una IDA (ingesta diaria admisible) 
de 4 mg/kg de masa corporal por día, realizando la consideración de exposición 
tanto en adultos como niños. La Tabla 3 muestra los límites máximos permisibles 
del uso de glucósidos del esteviol E 960 en la manufactura de diversos productos 
alimenticios conformes con el Concilio Europeo. 
 
Tabla 3. Niveles máximos permitidos de E 960 para la elaboración de diversas 
bebidas de acuerdo al concilio europeo (EFSA, 2014) 
Productos alimenticios Nivel máximo (mg/L) 
Productos instantáneos de café y cappuccino instantáneo 10 
Bebidas de té 10 
Bebidas a base de malta y de chocolate/cappuccino 20 
Café y bebidas de infusiones de hierbas 29 
 
34 
 
En la Tabla 4, se presentan los niveles máximos considerados en la evaluación de 
la exposición actual del edulcorante E 960, en el cual se incluyeron siete nuevos 
productos alimenticios como productos confiteros, productos de panadería, 
néctares de frutas y hortalizas, productos elaborados a partir de harinas, nueces 
procesadas y complementos alimenticios. 
 
En la legislación mexicana, el uso de stevia se especifica en la NOM-218-SSA1-
2011 (NORMA, 2011), indicando para la elaboración de bebidas, congelados, 
polvos, jarabes, concentrados y concentrados de manufactura, un límite máximo 
en el producto listo para consumo de 200 (mg/L). 
 
En cuanto a la legislación mexicana, no se encontraron límites máximos 
permisibles para la manufactura de otros productos en comparación con la 
legislación del Concilio Europeo, debido a que el tema del uso de stevia en la 
manufactura de productos alimenticios es relativamente nuevo. 
 
 
35 
 
Tabla 4. Niveles máximos permitidos (mg/L o mg/kg) de E 960 para distintos productos alimenticios de acuerdo al concilio 
europeo (EFSA, 2014) 
Alimento Restricciones / excepciones LMP (mg/L) o 
(mg/kg) 
Productos lácteos fermentados aromatizados, incluidos 
los productos tratados térmicamente 
Sólo los productos o productos sin azúcar 
añadido 
100 
Hielo comestible Sólo con energía reducida o sin azúcar 
añadido 
200 
Frutas y hortalizas en vinagre, aceite o salmuera Sólo conservas agrias de frutas y verduras 100 
Preparados de frutas y hortalizas excluyendo compota Sólo energía reducida 200 
Mermelada extra y jalea extra según lo definido por la 
Directiva 2001/113 / CE 
Sólo energía reducida en jaleas y 
mermeladas 
200 
Jaleas, mermeladas y puré de castaña edulcorada según 
se define por la Directiva 2001/113 / CE 
Sólo jaleas y mermeladas de bajo consumo 200 
Otras frutas u hortalizas similares, se extiende sólo 
emparedado a base de frutas secas 
Pastas alimenticias, de valor energético 
reducido o sin azúcar añadido 
200 
Productos de cacao y chocolate cubiertos. definido por la 
Directiva 2000/36 / CE 
Sólo energía reducida o sin 
glúcidos añadidos 
270 
Otros productos de confitería, incluidos los refrescantes 
para el aliento 
Sólo cacao o frutos secos, sin adición de 
azúcar 
270 
Otros productos de confitería, incluidos los refrescantes 
para el aliento 
Sólo cacao, leche, frutos secos o grasa a 
base de productos para untar, energía 
reducida o que no contengan azúcar añadido 
330 
Otros productos de confitería, incluidos los refrescantes 
para el aliento 
Sólo confitería sin azúcar añadido 350 
Otros productos de confitería, incluidos los refrescantes 
para el aliento 
Sólo pequeños dulces sin azúcar añadido 2000 
Otros productos de confitería, incluidos los refrescantes 
para el aliento 
Sólo fuertemente aromatizado, pastillas 
refrescantes de garganta sin azúcar añadido 
670 
Goma de mascar Sólo sin azúcar añadido 3300 
Decoraciones, revestimientos y rellenos, excepto rellenos 
a base de frutas cubiertos 
Sólo confitería sin azúcar añadido 330 
36 
 
Tabla 4. Continuación……. 
Decoraciones, revestimientos y rellenos, excepto rellenos 
a base de frutas cubiertos 
Sólo cacao o frutos secos, energía reducida,sin adición de azúcar 
270 
cereales para el desayuno Sólo cereales de desayuno con un contenido 
de fibra superior al 15%,y que contiene al 
menos 20% de salvado, con reducción de 
energía o sin azúcar añadido 
330 
Productos de panadería fina Papel para obleas 330 
Pescado elaborado y productos de la pesca incluidos 
moluscos y crustáceos 
Sólo las conservas de dulce- agridulce y semi 
conservas de pescado y marinados de 
pescado, crustáceos y moluscos 
200 
Edulcorantes de mesa en estado líquido - QS 
Endulzantes de mesa en polvo - QS 
Edulcorantes de mesa en comprimidos - QS 
Sopas y caldos Sólo sopas energéticamente reducidas 40 
Salsas Excepto salsa de soja (fermentados y no 
fermentados) 
120 
Salsas Sólo salsa de soja (fermentada y no 
fermentados) 
175 
Alimentos dietéticos para uso médico especial, los fines 
definidos en la 1999/21 / CE 
- 330 
Destinada a sustituir los alimentos diarios, ingesta o una 
comida individual (la total o parcial de la dieta diaria total) 
- 270 
Néctares de frutas, definidos por el Consejo Directiva 
2001/112 / CE y Néctares vegetales y productos similares 
Sólo energía reducida o sin azúcar añadido 100 
Bebidas aromatizadas sólo con reducción de energía o sin azúcar 
añadido 
80 
Bebidas de cerveza y malta Sólo cerveza sin alcohol o con una contenido 
de alcohol no superior a 1.2% vol.; Cervezas 
con acidez mínima de 30 miliequivalentes 
expresada como NaOH 
70 
37 
 
Tabla 4. Continuación……. 
Otras bebidas alcohólicas, incluidas las alcoholes con 
menos del 15% de alcohol mezclas de bebidas 
alcohólicas con bebidas no alcohólicas 
- 150 
Patatas, cereales, harinas o snacks a base de almidón - 20 
Nueces procesadas - 20 
Postres excluidos los productos cubiertos Sólo energía reducida o sin azúcar añadido 100 
Los complementos alimenticios suministrados 
incluyendo cápsulas y tabletas, así como formas 
similares, excluyendo formas masticables 
- 670 
Complementos alimenticios suministrados en un forma 
líquida 
- 200 
Complementos alimenticios suministrados en forma de 
jarabe o masticable 
- 1800 
-: no propuesto; QS: cantidad adecuada 
 
 
38 
 
4. Metodología y materiales 
 
En esta investigación se realizó la extracción por medio de agua como disolvente 
con agitación y aplicando calor y siguiendo la metodología descrita por Mondal et 
al. (2012). 
 
Esta es una forma fácil, rápida y barata de la obtención de un extracto con los 
glucósidos de interés (ver Tabla 5). 
 
También se realizaron dos infusiones más con distintas condiciones para 
comparar la eficacia de las diferentes extracciones propuestas. 
 
Para la clarificación de los extractos es necesario el uso de carbón activado y 
zeolitas o metodologías más especializadas como microfiltración, ultrafiltración y 
nanofiltración. 
 
Estas últimas tienen ventajas de una buena separación de los compuestos de 
interés pero resultan más costosas. 
 
En el presente estudio se implementó la clarificación sustituyendo las zeolitas por 
el florisil (silicato de magnesio), siguiendo las técnicas descritas por Moraes y 
Machado (2001). 
 
Dicha clarificación demostró que la técnica usada no solamente aclaró las 
infusiones, sino que también se observó una buena recuperación de los 
glucósidos después de la adsorción en la columna. 
 
A continuación se presentan en la Tabla 5 las ventajas y desventajas de las 
distintas formas de preparación de las infusiones de stevia, así como las 
condiciones en las que prepararon. 
 
39 
 
 
 
Tabla 5. Condiciones de operación usadas (temperatura, tiempo y proporción de stevia-agua) para la elaboración de las 
infusiones de stevia y las ventajas y desventajas que presenta el método de extracción 
Infusión T(°C) Agitación Tiempo Proporción stevia-
agua (m/v) 
Ventajas Desventajas 
A 78±1 Sí 56 min 01:14 De acuerdo con los resultados obtenidos 
y con lo reportado por Mondal et al. 
(2012) es una forma eficiente y barata de 
extracción de los glucósidos presentes 
en la planta de stevia, además de que 
las condiciones de operación 
mencionadas para la elaboración de la 
infusión, fueron seleccionados con base 
en los experimentos de optimización 
para llevar acabo la máxima extracción 
de esteviósido en solución acuosa 
Hay una mayor dificultad para el 
control de la temperatura, 
además de que es un método 
que es tardado 
B Ambiente 
~20 
No 24 h 01:14 No se requiere calentamiento, por lo que 
hay un ahorro de energía y es una forma 
fácil de preparar la infusión 
Es el método más tardado para 
la obtención de la infusión. Se 
observó que no hubo una buena 
extracción de los glucósidos de 
interés 
No hay agitación, lo que hace 
menor la eficiencia de 
extracción 
C 92 Sí 5 min 0.13:14 Es el método más rápido para la 
preparación de la infusión debido a que 
es una forma comercial rápida de 
preparación de una infusión de stevia 
Se observó que el tiempo no es 
el suficiente para una extracción 
eficiente de los glucósidos de la 
stevia, tomando en cuenta que 
la proporción de stevia que se 
utiliza es menor con respecto a 
las otras dos infusiones 
40 
 
4.1. Metodología 
En la Fig. 3. se presenta la metodología para la identificación y cuantificación de 
Esteviósido y el Rebaudiósido A. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
R: residuo (El tratamiento de los residuos se presenta en el Anexo I) 
 
Fig. 3. Metodología para la identificación y cuantificación de los glucósidos de interés 
Recepción de hojas secas de 
Stevia rebaudiana Bertoni 
Preparación de infusión 
(A) agua-stevia 
(14:1v/m) a 78°C por 56 
minutos 
A partir de hojas tamizadas se 
determinó: 
Cenizas, humedad y grasa 
A partir de la infusión 
(B) se determinaron: 
proteínas, hidratos de 
carbono, pH, sólidos 
solubles totales, acidez 
titulable 
Análisis de resultados y estudios estadísticos 
Ajuste de pH del filtrado y 
filtración a vacío por 
membrana 0.45 µm 
Centrifugación 4000 
rpm y filtración por 
membrana 0.45 µm 
Extracción de glucósidos 
Molienda de la hoja y 
tamizado por malla #80 
Filtración y precipitación 
con CaOH 
Preparación de infusión 
(B) agua-stevia (14:1v/m), 
reposando a temperatura 
ambiente por 24 horas 
Identificación por CCF 
Obtención de extracto 
(A, B y C) 
Limpieza con resina no 
polar, catiónica, aniónica y 
carbón activado 
Cuantificación por espectrofotometría y 
CLAR 
λ210 esteviósido; λ213 rebaudiósido A 
Clarificación del filtrado 
mediante cromatografía en 
columna durante 24 horas 
Preparación de infusión 
(C) agua-stevia 
(14:0.13 v/m) a 92°C 
por 5 minutos 
Clarificación del 
filtrado mediante 
cromatografía en 
columna durante 24 
horas 
R3
 
R1 
 
R2 R1
 
R1 
 
R3
 
R1 
 
R1
 
R1 
 
R4
 
R1 
 
R5
 
R1 
 
41 
 
4.2. Tratamiento de las hojas secas de Stevia rebaudiana Bertoni 
 
Provenientes de Veracruz, México, las hojas se reciben, se almacenan en bolsas 
de papel y se guardan en cajas acondicionadas a temperatura ambiente (Fig. 4). 
Posteriormente, se procede al tratamiento mecánico de las hojas donde son 
pulverizadas (Fig. 5) y tamizadas a malla # 80 (Fig. 6). 
 
 
 
 
 
 
 
Fig.4. Hojas secas de Stevia 
rebaudiana Bertoni 
Fig.5. Pulverización de las 
hojas de Stevia rebaudiana 
Bertoni 
Fig. 6. Tamizado de las 
hojas de Stevia rebaudiana 
Bertoni 
 
4.3. Caracterización de las hojas pulverizadas 
Humedad. Pesar en una balanza Mettler Toledo Modelo AG-245 de 2 a 3 g de 
muestra en un pesafiltro con tapa, el cual fue previamente secado durante 2 horas 
a una temperatura de 130°C para tenerlo a una masa constante. Secar la muestra 
en el horno de secado ARSA Modelo AR-2900 durante 2 horas a 100 a 110°C, 
retirar del horno y tapar, colocar la muestra en un desecador hasta que se 
equilibre la temperatura de la muestra con la temperatura ambiente para 
posteriormente pesar (Kirk et al., 1996). 
 
Materia grasa.El porcentaje de lípidos fue evaluado mediante el método de 
Soxhlet. Se colocaron a masa constante matraces bola de fondo plano con perlas 
o piedras de ebullición (Fig. 7) en un horno de secado ARSA Modelo AR-2900 a 
100ºC, durante 2 horas. Se pesaron en una balanza Mettler Toledo Modelo AG-
245 de 4 a 5 g de la muestra pulverizada sobre un papel, las muestras se 
colocaron en un cartucho de celulosa, para adicionar dos cargas del disolvente 
(hexano). Posteriormente, el matraz fue calentado en parrilla Barnstead 
42 
 
Thermolyne a 35°C. Por diferencia, se calcularon los porcentajes de grasa (James, 
1999). 
 
Fig. 7. Determinación de grasa por el método de Soxhlet 
 
Cenizas. Es necesario llevar a masa constante el crisol. El tamaño de muestra 
utilizada para esta determinación debe comprender una masa de 3 a 5 g, la cual 
es colocada en el crisol previamente pesado. Se calcinó la muestra (Fig. 8), 
primeramente con un mechero y posteriormente se introdujo a la mufla (Furnace 
4800 T) durante un periodo de 2 horas a 550˚C. Repetir la operación anterior si es 
necesario, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramente grises (Fig. 9), 
homogéneas para poder calcular el porcentaje de cenizas (Kirk et al., 1996). 
 
 
Fig. 8. Determinación de cenizas. Calcinación Fig. 9. Cenizas de Stevia rebaudiana Bertoni 
 
 
43 
 
Proteína. Elaborar una solución CTC (carbonato de sodio, tartrato de potasio y 
sulfato de cobre). Pesar 10 g de Na2CO3 y disolver en 50 mL de agua destilada, 
0.1 g de CuSO4.5H2O y 0.2 g de tartrato de potasio y disolver también en 50 mL 
de agua destilada, se mezclan ambas soluciones para tener un volumen final de 
100 mL. Por otra parte se preparó una solución 0.1 N de NaOH y una solución al 
10% de dodecil sulfato de sodio (SDS en inglés). De las soluciones anteriores se 
mezclan volúmenes iguales en el siguiente orden: CTC, NaOH y SDS, momentos 
antes de realizar la técnica. Finalmente se elaborar el reactivo de FOLIN-
CIOCALTEU-FENOL, preparando una solución (1:6), un volumen de reactivo de 
FOLIN más 5 volúmenes de H2O destilada. Para la determinación de la proteína 
en la muestra es necesario tomar 1 mL de la infusión A, la cual debe encontrarse 
en un intervalo de 5 a 100 microgramos de proteína soluble por mililitro y agregar 
1 mL de la solución (CTC, NaOH y SDS) con agitación constante. Dejar reposar a 
temperatura ambiente durante 10 minutos, al término de los 10 minutos agregar 
0.5 mL de la solución FOLIN-CIOCALTEU-FENOL, con agitación continua y dejar 
desarrollar la reacción durante 30 minutos, una vez pasado este tiempo se lee a 
λ750 nanómetros. La concentración de proteína se calcula a partir de una curva 
patrón preparada con albúmina sérica bovina en concentraciones de 10 a 100 
μg/mL, tratada de la misma manera con los reactivos antes mencionados (Nielsen, 
1998). 
 
Determinación de hidratos de carbono. En tubos de ensaye perfectamente 
etiquetados, colocar 1 mL de la solución o suspensión acuosa de la muestra 
(infusión A). Para cada tubo adicionar 0.6 mL de una solución acuosa de fenol al 
5%. Mezclando perfectamente y adicionando cuidadosamente 3.6 mL de ácido 
sulfúrico concentrado, homogeneizar. Dejar enfriar (aproximadamente 30 min.) 
determinar color a una λ 480 nm frente a un blanco preparado de la misma 
manera utilizando agua. Determinar hidratos de carbono a partir de una curva 
patrón preparada con el hidrato de carbono de interés (esteviósido y el 
rebaudiósido A) en un intervalo de 0 – 10 µg/mL tratados de la misma manera 
(Dubois et al., 1956). 
44 
 
 
Sólidos totales. Es necesario tomar 1 mL de la muestra (infusión A) y colocarla 
en la ventana del refractómetro de glúcidos CIVEQ CUQ-4013, la medida en °Brix 
se lee directamente en la escala del equipo. 
 
Valor de pH. Tomar 50 mL de la muestra (infusión A) en un vaso de precipitado, 
introducir el electrodo de pH conectado al potenciómetro marca Thermo modelo 
Orion 720A+ previamente calibrado según el instructivo del fabricante, la lectura 
se toma directamente de la pantalla del equipo. 
 
Acidez titulable. Se tomó 1 mL de la muestra (infusión A) en un matraz aforado 
de 10 mL y se llevó al aforo con agua destilada. La solución se tituló con NaOH 
0.1N, agregando 3 gotas de indicador de fenoftaleína al 0.1% siguiendo el método 
de la AOAC (1995). 
 
4.4. Extracción de los glucósidos 
 
Extracto A. El primer paso fue obtener la infusión A, a partir de las hojas secas de 
Stevia rebaudiana Bertoni siguiendo las condiciones de la metodología descrita 
por Mondal et al. (2012). Mezclando el polvo de hojas secas de stevia con agua 
destilada en una relación 1:14 (m/v) en un baño de agua a 78 ± 1°C durante 56 
minutos (Fig. 10), la infusión fue sometida a centrifugación a 4000 rpm por 26 
minutos (Fig. 11), para posteriormente ser filtrada utilizando una membrana Nylon 
de 0.45 µm (Fig. 12). Posteriormente se realizó la clarificación del filtrado mediante 
las técnicas descritas por Moraes y Machado (2001) en la cual se realizaron 
algunas modificaciones con los materiales utilizados, sustituyeron la zeolita por 
florisil marca Hycel (silicato de magnesio sintético) que fue impregnado con una 
solución de cloruro de calcio al 20% por 1 hora a 75°C en un horno de secado 
ARSA Modelo AR-2900. Fue necesario ajustar el pH del florisil en un intervalo de 5 
a 6 con HCl al 10%, realizando tres lavados, el primero con cloruro de calcio 
seguido de agua destilada. Finalmente, fue secado por 24 horas a 125°C, para ser 
45 
 
empacado en una columna de vidrio que contó con las siguientes medidas: 
diámetro de la columna 2 cm y largo de la columna 30 cm. En la parte inferior de la 
columna se colocó una cama de fibra de vidrio, seguido de 40 g de florisil y 
cubriendo este con fibra de vidrio (Fig. 13). El último paso fue colocar 80 mL del 
filtrado obtenido en el paso anterior y colectar los primeros 20 mL, denominados 
extractos clarificados A, el cual se almacena en un frasco ámbar en refrigeración a 
4°C. 
 
 
Fig. 10. Extracción 
sólido-líquido a 
78°C, 56 min 
Fig. 11. Centrifugación 
de la infusión 
Fig. 12. Filtración de 
la infusión 
Fig. 13. 
Cromatografía en 
columna con 
empaque de florisil 
 
Extracto B. Se realizó mediante las técnicas descritas por Soto y Del Val (2002). 
Se inició la preparación de una infusión B de Stevia rebaudiana Bertoni con 
proporción (14:1 v/m). Se tomaron 14.285 g de hojas secas en 200 mL de agua 
destilada y se adicionaron 0.714 g de carbonato de calcio, se dejó macerar 24 
horas a temperatura ambiente (Fig. 14). Fueron separadas las hojas por filtración y 
se agregaron 1.4285 g de hidróxido de calcio dejando actuar 30 minutos (Fig. 15). 
Se llevó el pH a 8 (Fig. 16) y se filtró por vacío (Fig. 17). Posteriormente el filtrado 
se pasó por una resina de retención selectiva (cartucho C18 supelco de 5 mL para 
extracción en fase sólida) para concentración de los analitos de interés. Los 
glucósidos retenidos se eluyeron con 10 mL de una solución 70:30 de 
alcohol:agua. El volumen eluido se pasó sucesivamente por una resina catiónica 
Amberlita como intercambiador de cationes y Chelex 100 sodio como resina 
aniónica, ambos de la marca Sigma. Los cartuchos que contenían dichas resinas 
fueron preparados colocando 5 g de cada resina y acondicionados previamente 
46 
 
con agua y sulfato de amonio 1.5 M a pH 9 respectivamente, con el fin de mejorar 
la extracción de los esteviósidos (Fig. 18). Finalmente los extractos obtenidos 
fueron pasados por una columna de carbón activado obteniéndose un extracto B 
incoloro. 
 
Fig. 14. Filtrado 
después de la 
extracción por 24 h 
con CaCO3 
Fig. 15. 
Defecación con 
hidróxido de 
calcio 
 
Fig. 16. Ajuste de pH 
cercano a 8 
Fig.17. Filtración al 
vacío 
Fig. 18. De izquierda 
a derecha columna: 
para retención 
selectiva, Amberlita 
(catiónica), Chelex 
100 (aniónica), 
carbónactivado 
 
Extracto C. Se preparó una infusión C, a partir de las hojas secas de Stevia 
rebaudiana Bertoni, mezclando el polvo de hojas secas con agua destilada en una 
relación 14:0.13 (agua- stevia) en un baño de agua a 92 ± 1°C durante 5 minutos 
(Fig. 19), se eliminaron las hojas por filtración y la infusión fue filtrada nuevamente 
utilizando una membrana Nylon de 0.45 µm (Fig. 20). Se realizó la clarificación del 
filtrado mediante las técnicas descritas por Moraes y Machado (2001) en la cual se 
realizaron algunas modificaciones con los materiales utilizados, sustituyeron la 
zeolita por florisil que fue tratado igual que para el extracto A y empacado en una 
columna de vidrio que contó con las siguientes medidas: diámetro de la columna 2 
cm y largo de la columna 30 cm (Fig. 21). 
 
 
Fig. 19. Extracción sólido-líquido 
a 92°C, 5 min. Infusión C 
Fig. 20. Filtración de la infusión C Fig. 21. Cromatografía en 
columna para la infusión C 
 
47 
 
Es necesario colocar una cama de fibra de vidrio en la parte inferior de la columna, 
seguido de 40 g de florisil y cubrir con fibra de vidrio. El último paso fue colocar 
100 mL del filtrado de la infusión C, colectando los primeros 20 mL y 
denominándolos como extracto C clarificado, el cual fue almacenado en un frasco 
ámbar en refrigeración a 4°C. 
 
4.5. Cuantificación 
Preparación de los estándares. Fue necesario hacer una solución madre de 10 
mg/L de cada uno de los glucósidos de interés: el Esteviósido (analytical standard 
≥95% Sigma-Aldrich) y Rebaudiósido A (analytical standard ≥96% HPLC, Sigma-
Aldrich). Posteriormente se realizó un barrido en un espectrofotómetro Cintra 5 
para obtener la longitud de onda de máxima absorción y finalmente se prepararon 
diluciones a partir de la solución madre de cada compuesto en un intervalo de 0 a 
100 mg/L. 
 
Para la cuantificación mediante CLAR se realizaron las infusiones A, B y C de 
Stevia rebaudiana Bertoni en las condiciones mencionadas, se prosiguió a la 
obtención de los extractos A, B y C mediante cromatografía en columna y por 
extracción por diversas columnas y resinas de intercambio iónico también ya 
mencionados en el punto 4.4. Además se preparó una muestra comercial de un 
sustituto de stevia marca Svetia elaborado por Metco (Fig. 31), usando un sobre 
con un gramo de producto en 100 mL de agua destilada. Obtenidos los extractos, 
se precipitaron las proteínas que pudieran estar presente en las muestras usando 
ácido tricloroacético en una proporción al 10% del volumen de la muestra, y se 
centrifugó a una velocidad de 10000 rpm, para su posterior análisis en CLAR 
(Montoro et al., 2013). 
 
Para las condiciones de uso del CLAR, se preparó una solución estándar de 500 
μg/mL. El cromatógrafo de líquidos usado fue un equipo HPLC modelo Infinity 
1260 de Agilent Techonologies. La columna utilizada para evaluar los esteviósidos 
de interés fue una Kinetex® XB-C18 (LC Column 150 x 4.6 mm) 2.6 μm, 100 Å, 
48 
 
SN 19797, PN:00F-44-96-EO, Phenomenex a una temperatura de 35°C. Los 
eluyentes fueron acetonitrilo:agua en proporción de 32:68 respectivamente, 
usando una velocidad de flujo de 1 mL/min. El volumen de inyección fue de 10 μL, 
y se usó un detector DAD fijado a 210 nm. Cabe mencionar que el análisis 
realizado por la metodología de CLAR, se realizó en la USAII (Unidad de Servicios 
y Apoyo a la Investigación y la Industria) de la Facultad de Química de la UNAM. 
 
4.6. Identificación por CCF 
Se realizó la identificación por cromatografía en capa fina (CCF) de los extractos 
A, B y C obtenidos a partir de la técnica de clarificación 2 (con resinas de 
intercambio iónico), donde se observaron legiblemente las manchas en la placa al 
revelarlas con luz Uv y con la cámara de yodo. En el caso de clarificación por 
medio de cromatografía en columna, no se observaron legiblemente las manchas 
al revelar con luz UV y con la cámara de yodo, por lo que no se reportaron 
resultados. Para el eluyente, se evaluaron mezclas de 2 disolventes, cloroformo y 
metanol en diferentes proporciones observando mejores resultados con las 
proporciones 4:1 y 3.5:1.5 de cloroformo y metanol. Se usó como fase estacionaria 
gel de sílice (SiO2, silica gel en inglés), se corrieron las placas en la cámara de 
elución (Fig. 22) y se revelaron las placas con una cámara de yodo (Fig. 23). 
Previamente se preparó una solución patrón para la identificación de los 
compuestos. 
 
 
 
Fig. 22. CCF. Cámara de elución Fig. 23. CCF. Placas reveladas 
49 
 
5. Resultados y discusión 
5.1. Caracterización de las hojas pulverizadas 
En las Tablas 6 y 7 se presentan los resultados de la primera y segunda 
caracterización de las hojas secas y molidas de Stevia rebaudiana Bertoni. La 
segunda caracterización se realizó debido a que se empezó a trabajar con otro 
lote de hojas secas provenientes de Veracruz, México. 
 
Tabla 6. Resultados del primer lote. Caracterización de las hojas secas y molidas de 
Stevia rebaudiana Bertoni 
 Determinación Promedio D.S. C.V. 
 
 
 
Primera 
caracterización 
% Cenizas 9.64 0.03 0.28 
% Humedad 6.88 0.21 3.02 
% Grasa 3.09 - - 
% acidez titulable 0.50 0.06 12.86 
% proteínas en extracto 2.12 0.00 0.12 
mg rebaudiósido A /mL 607.96 0.06 0.01 
mg esteviósido / mL 266.10 0.08 0.03 
pH extracto 5.61 0.02 0.38 
Sólidos totales (°Bx) 5.00 0.00 0.00 
pH extracto clarificado 7.16 0.41 5.74 
Se realizó por duplicado al momento de analizar las muestras para este lote (D.S., 
desviación estándar; C.V., coeficiente de variación) 
 
 
Tabla 7. Resultados del segundo lote. Caracterización de hojas secas y molidas de 
Stevia rebaudiana Bertoni 
 Determinación Promedio D.S. C.V. 
 
 
 
 
Segunda 
caracterización 
% Cenizas 9.21 0.66 7.14 
% Humedad 6.22 0.73 11.80 
% Grasa 3.66 0.22 5.92 
% acidez titulable 0.30 0.05 17.32 
% proteínas en extracto 2.37 0.00 0.11 
mg rebaudiósido A /mL 656.74 0.28 0.04 
mg esteviósido / mL 328.81 0.36 0.11 
pH extracto 5.34 0.07 1.35 
Sólidos totales (°Bx) 4.00 0.00 0.00 
Se realizó por triplicado al momento de analizar las muestras para este lote. (D.S., 
desviación estándar; C.V., coeficiente de variación) 
 
 
Cenizas. Los resultados obtenidos para los dos lotes son similares en la 
determinación de cenizas 9.64±0.03 y 9.21±0.66%, primera y segunda 
50 
 
caracterización, respectivamente. Dichos resultados son cercanos a los resultados 
obtenidos por Pérez et al. (2015) donde reportan un porcentaje de cenizas de 
8.57, 8.84 y 9.64%, de muestras provenientes del Municipio de El Doncello 
(Caquetá, Colombia), cultivadas en tres distintos paisajes. En cuanto a los 
porcentaje de humedad reportados por Pérez et al. (2015) con valores de 4.65, 
3.16 y 10.35% para las tres distintas procedencias (Montaña, Lomerío y Vega). 
Los obtenidos entre los dos lotes son de 6.88±0.21 y 6.22±0.73%, 
respectivamente. Las variaciones de los resultados obtenidos de las 
determinaciones realizadas en esta investigación así como los resultados de las 
referencias citadas, puede depender de varios factores, como la localidad, 
procedencia, tipo de suelo y características fisicoquímicas de éste, además de las 
condiciones climáticas en las que se encuentre el cultivo de Stevia rebaudiana 
Bertoni y la variedad. 
 
Materia grasa. Los resultados de la determinación de materia grasa en las hojas 
secas de Stevia rebaudiana Bertoni fueron de 3.09% para el primer lote (Tabla 6) y 
la determinación se realizó una vez, mientras que para el segundo lote (Tabla 7) la 
determinación se realizó por triplicado y se obtuvo un promedio de 3.66±0.22. De 
acuerdo con los resultados obtenidos por González et al. (2014), quienes indican 
un porcentaje de grasa de hojas de Stevia rebaudiana Bertoni procedentes de 
distintos lugares de 1.2, 1.84 y 1.85%, para tres países: Venezuela (Morita II), 
Colombia (Morita II) y Francia (IANVC-142), respectivamente. El porcentaje