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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN. “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO PRESENTA: GABRIELA BRAVO HERNÁNDEZ Asesor: Dr. Normand García Hernández. Coasesor: M en C Ana Laura Vázquez Martínez. Cuautitlán Izcalli, Estado de México, 2012. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN UNIDAD DE ADMINISTRACIÓN ESCOLAR DEPARTAMENTO DE EXÁMENES PROFESIONALES "J, ·r~ . A. M. ASUNTO: VOTOI. ~<p.R(!)JrAJfORIO ;~'~O~. CUAU ilTlJ-\ r~ DRA. SUEMI RODRÍGUEZ ROMO DIRECTORA DE LA FES CUAUTlTLÁN PRESENTE f ~· ,, ", - i'! .... ". ' rlí1~" ~ . ' " JI~ ' ~ A " ~ ; '1"~ g }.,.,! ... , '"," I ~ ')"- .,_. , 'I". ' ........ ¡¡¡ffrt'~'" ATN: L.A. ARACELI HERRERA(]I'E ÁNDEZ Jefa del Departameii'fií.'/JFEXámenes Profesionales íleHai~Cffii'íl!mlán Con base en el Art. 28 del Reglamento de Exámenes Profesionales nos permitimos comunicar a usted que revisamos la Tesis: Detenninación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CA TVP y en madres de niños sanos Que presenta la pasante: Gabriela Bravo Hernández Con número de cuenta: 30307099-9 para obtener el Título de: Química Farmacéutica Bióloga Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO. , A TENT AMENTE "POR MI RAZA HABLARA EL ESPÍRITU" Cuautitlán Izcalli, Méx. a 29 de noviembre de 2011. PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO NOMBRE PRESIDENTE M. en C. Andrea A. Becerril Osnaya VOCAL Q.F.B. Rosalba Bonilla Sánchez FIRMA SECRETARIO M. en C . . Ana Laura Vázquez Martínez /l'YJJ- ---------------------------------~~~~~~~~("~~ ter SUPLENTE Q.F.B. Sara Hernández Martínez 2do SUPLENTE M. en C. Maritere Domínguez Rojas NOTA : los sinodales suplentes están oblig~dos a presentarse el día y hora del Examen Profesional (art. 120). HHAlpm Dedicada a…. Toda mi familia por siempre estar a mi lado y ser parte fundamental en lo que hoy en día soy y muy especialmente agradezco… A mi madre, por ser mi mayor ejemplo y fortaleza, mi amiga, por siempre mostrar la mejor cara ante la tempestad y luchar día a día por nuestro bienestar. A mi tía Mari, mi segunda madre, gracias por siempre apoyarme en todo. Por ser esa mujer admirable que me enseña el valor de darlo todo sin esperar nada a cambio. Gracias especialmente a ustedes, mis dos grandes madres luchadoras incansables que hasta hoy puedo decir, son un gran ejemplo de vida mi gran fortaleza y mayor apoyo en esta etapa de formación, ustedes son mi todo y no quiero defraudarlas nunca. A mi padre, porque de alguna forma u otra y a su manera siempre has sabido darme sus sabios consejos, apoyándome y siempre mantenerme con los pies en la tierra. A mi hermana Lau, que aunque somos muy diferentes es un gran apoyo y mi gran cómplice desde que tengo memoria y sé que me quiere mucho al igual que yo a ella. A mi hermosa MaFer, por ser mi pequeña nena que siempre me regala su mejor sonrisa y me enseña día a día con su inocencia y ternura que esa sonrisa te cambia todo. A Xchel por ser un gran compañero y amigo, por hacer latir mi corazón y ser el admirable ser humano y excelente ejemplo de constancia y dedicación, por siempre sacar lo mejor de mí y ayudarme en todo. Eres y serás siempre la persona más especial en mi corazón, y mis sentimientos nunca cambiaran. A Lashi, mi mejor amiga y hermana, por todas las risas y platicas interminables, por ser mi apoyo y compañera, por que se y sabe que siempre puede contar conmigo. A todos los compañeros, Iris, Gaby Marmota, Shakira (Diana), Denise, Aldo, Gus, Ivis, Rigo (Alan), Santi por todas y cada una de las aventuras que emprendimos en esta pequeña etapa. 2 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” A mis chicas del Lab, Susi, Conny, Pili y Judith que no se qué sería de mi, sin sus consejos y jalones de orejas claro todo con gran cariño que me ha enseñado a no dejarme de nada ni nadie, su apoyo incondicional es algo por lo que hoy en día me encuentro de pie. A los compañeros de Lab, Abraham, Nacho, Nitz, Sócrates y a todos por su compañía y apoyo, durante esa breve etapa de experimentación. Al Dr. Normand, Biol. Adriana, Dra. Norma y Dra. Rocío, por confiar en mí y dejarme hacer este proyecto. A mis maestros de la FESC, la Mta. Ana Laura, Mtra. Andrea, Dra. Sandra, Mtra. Maritere. Mtra. Rosalba y a todos y cada uno por ser parte importante de mi formación y por todas sus enseñanzas. A todos y cada uno de ustedes, y las personas importantes en esta gran etapa de mi vida que hoy ya por fin término, no me queda más que agradecer a la vida el que me haya puesto en su camino y el permitirme conocerlos y llevar en mi corazón a cada uno de ustedes. 3 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Este trabajo se realizó en la Unidad de Investigación Médica en Genética Humana del Hospital de Pediatría en el Centro Médico Nacional Siglo XXI, IMSS. Bajo la dirección del Dr. Normand García Hernández. 4 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Índice Página 1. Índice de tablas…………………………………………………………………….…….7 2. Índice de figuras………………………………………………………………………….9 3. Abreviaturas……………………………………………………………………………..10 4. Resumen…………………………………………………………………………………12 5. Introducción……………………………………………………………………………..14 5.1. Generalidades……………………………………………………………………….14 5.2. El corazón…………………………………………………………………………...17 5.2.1. Fisiología del corazón………………………………………………………..18 5.3. Cardiopatías congénitas……………………………………………………………..21 5.4. Conexión Anómala Total de Venas Pulmonares……………………………………23 5.4.1. Clasificación…………………………………………………………………23 5.4.2. Embriología…………………………………………………………………..25 5.4.3. Diagnóstico…………………………………………………………………..26 5.4.4. Tratamiento…………………………………………………………………..26 5.4.5. Incidencia…………………………………………………………………….27 5.5. Gen MTHFR…………………………...……………………………………………28 5.6. Enzima MTHFR…………………………………………………………………….29 5.7. Metabolismo en el que interviene…………………………………………………..30 5.8. Homocisteína……………………………………………………………………….33 5.8.1. Hiperhomocisteinemia y homocisteinemia…………………………………..34 5.9. Acido fólico………………....……………………………………………………...40 5.10. Mutaciones en MTHFR………………………………………..………………….425.11. Polimorfismo MTHFR……………………………………………………………44 5 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 6. Marco teórico…………………………………………………………………………….45 7. Planteamiento del problema……………………………………………………………..48 8. Justificación……………………………………………………………………………...48 9. Objetivo………………………………………………………………………………….49 10. Objetivos particulares……………………………………………………………………49 11. Hipótesis…………………………………………………………………………………49 12. Metodología……………………………………………………………………………...50 12.1. Diseño del estudio……………………………………………………………50 12.2. Tamaño de muestra…………………………………………………………..50 12.3. Criterios de selección……………………………………………………...…50 12.4. Extracción de ADN……………………………………………………..……51 12.5. Cuantificación de ADN…………………………………………………...….52 12.6. Integridad de ADN…………………………………………………...………53 12.7. Análisis del polimorfismo C677T mediante PCR-RFLP……………………54 12.8. Restricción enzimática…………………………………………………...…..55 13. Resultados…………………………………………………...…………………………...57 14. Análisis de resultados…………………………………………………………...……….73 15. Conclusiones…………………………………………………...………………………...77 16. Glosario…………………………………………………...……………………………..78 17. Referencias……………………………………………………………….…………...…79 18. Carta de Consentimiento…………………………………………………...……………88 6 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 1. Índice de tablas. Página Tabla 1. Clasificación según la etiología de las cardiopatías……………………...………...20 Tabla 2. Cardiopatías congénitas más comunes……………..……………………...……….21 Tabla 3. Factores que influyen en la concentración de la homocisteína……………...…..…34 Tabla 4. Principales fuentes de ácido fólico en alimentos consumidos en México.…………41 Tabla 5. Condiciones de electroforesis…………………………………………….………...53 Tabla 6. Secuencia de oligonucleótidos (primers)…………………………………..............54 Tabla 7. Condiciones de la PCR punto final………………………………………………...54 Tabla 8. Condiciones para la restricción enzimática………………………………………...55 Tabla 9. Cuantificación de algunas de las muestras, la relación 260/280…………..............58 Tabla 10. Orden de muestras de la Figura 9……………………………………..………….59 Tabla 11. Tipo de Cardiopatías congénitas……………………………………….…………61 Tabla 12. Variables en madres de niños con CC……..……………………………………..61 Tabla 13. Lugar de origen de los casos y los controles.…………………….………....…….62 Tabla 14. Variables en madres de niños con CC………………………………….................64 Tabla 15. Porcentajes de las muestras y controles para los diferentes genotipos……………66 Tabla 16. Frecuencia alelica…………………………………………………………………67 Tabla 17. Equilibrio HW en madres de niños con CATVP………………………………….68 7 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Tabla 18. Equilibrio HW en madres de niños sanos…………………………………………69 Tabla 19. Prueba X 2 en madres de niños con CATVP………………………………………70 Tabla 20. Prueba X 2 en madres de niños sanos……………………………………………...71 Tabla 21. Prueba OR………………………………………………………………………...72 8 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 2. Índice de figuras. Pagina Figura 1. Anatomía del corazón humano………..…………………………………………...19 Figura 2. Esquema de los diferentes tipos de CATVP………………………………………24 Figura 3. Localización y estructura del gen MTHFR ……………………………………... 28 Figura 4. Reducción de 5,10-MTHFR a 5-MTHF…………….…………………………...29 Figura 5. Vías metabólicas en las que interviene la actividad de MTHFR……….................32 Figura 6. La ubicación de las mutaciones en MTHFR……………………...………..............43 Figura 7. Patrones de restricción enzimática………………………………………………...56 Figura 8. Evaluación de integridad del ADN………………………………….…………….57 Figura 9. Productos PCR………………………………………………………….…………59 Figura 10. Genotipificación del polimorfismo C677T………………………….…………...60 Figura 11. Ejemplos de alelos CC, CT, TT.……………………………………....................60 Figura 12. Gráfica con los porcentajes obtenidos en madres de niños con CATVP, para los diferentes alelos………………………………………………………………….…………..63 Figura 13. Zonas geoeconómicas de México y las graficas de los porcentajes de las muestras de madres de niños con CATVP y de madres de niños sanos.......................................……..65 Figura 14. Gráfica con las frecuencias genotípicas, obtenidas en madres de niños con CATVP y madres de niños sanos, para los diferentes alelos………………………………..66 Figura 15. Gráfica de las frecuencias fenotípicas para las dos poblaciones…………………67 Figura 16. Muestra la relación entre las frecuencias génicas y genotípicas en una población en equilibrio Hardy-Weinberg………………………………………………….……………69 9 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 3. Abreviaturas. 5- MTHF - 5-metiltetrahidrofolato. 5,10-MTHFR - 5,10-metiltetrahidrofolato reductasa. ADN – Acido Desoxirribonucleico. ARN – Ácido Ribonucleico CAPVP - Conexión Anómala Parcial de Venas Pulmonares. CATVP - Conexión Anómala Total de Venas Pulmonares. CAV – Comunicación Aurículo Ventricular. CBS - Cistationina –- Sintasa. CC – Cardiopatía Congénita. CH – Cardiopatía Hipertensiva . CI - Comunicación Intrarterial. CIA – Comunicación Interartetial. CIV – Comunicación Interventricular. CM – Miocardiopatía. DE – Desviación estándar. EHW – Equilibrio de Hardy-Weinberg. FAD – Flavina - adenina. g.l – Grados de libertad. HIMFG - Hospital Infantil de México Federico Gómez. 10 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Ho – Hipótesis nula. IC – Intervalo de confianza. MS - metionina sintetasa. MTHFR – Metil tetra hidro folato reductasa. NADPH - Nicotinamida-Adenina Dinucleótido Fosfato. OR – Odds de Ratio. pb - Pares de bases PCR - Reacción en cadena de la polimerasa. PCR-FRLP - Reacción en cadena de la polimerasa- Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism). SAH - S- adenosinhomocisteina. SAM - S-adenosinmetionina. THF - Tetrahidrofolato. X 2 – Chi cuadrado o X cuadrada. 11 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 4. Resumen. A nivel mundial, las malformaciones congénitas más comunes son las cardiopatías congénitas (CC), la prevalencia reportada a nivel mundial va de 2.1 a 12.3 por 1000 recién nacidos. En nuestro país, se desconoce su prevalencia real, sin embargo como causa de muerte infantil, se ubica en el sexto lugar en menores de un año. La conexión anómala total de venas pulmonares (CATVP) es una de las cardiopatías complejas mas diagnosticadas en el Hospital Infantil Federico Gómez (HIMFG) y constituye en México del 1 - 2% de todas las CC; la incidencia es de 6.8 afectados por cada 100,000 individuos y el 68% de estos pacientes son diagnosticados en la etapa neonatal [1, 2]. Existen numerosos estudios para establecer la etiología de las CC, al ser una enfermedad multifactorial, se reconocen factores genéticos y ambientales. Entre los factores genéticosse encuentra el polimorfismo C677T en el gen MTHFR [3,4]. Que codifica para la enzima metiltetrahidrofolatoreductasa (MTHFR), cuyo papel fundamental es el metabolismo de folatos y homocisteína, ya que cataliza la conversión 5,10-metiltetrahidrofolato a 5-metiltetrahidrofolato [5]. Se ha observado que en presencia del polimorfismo se produce una deficiencia de la enzima MTHFR creando una relación inversa, ya que al aumentar los niveles de homocisteína disminuyen los de Acido Fólico, lo que se asocia a diversas patologías [6]. El objetivo de este estudio fue identificar el polimorfismo C677T del gen MTHFR en madres con CATVP y en madres con niños sanos por medio de la técnica PCR-FRLP para estimar la frecuencia y asociación entre el polimorfismo y dicha patología. Los resultados obtenidos fueron de 31 pacientes con CC de las cuales, 14 pacientes presentan CATVP y 80 son los controles. La CC más frecuente fue la CATVP en un 45.16%, la edad promedio de las madres de niños con CATVP es de 27.3 años (D.E.7.52) y para las controles de 25.8 (D.E.5.8). La frecuencia de ingesta de acido fólico en las madres de hijos con CATVP fue del 85.71% y del 90.34% para los controles. Un 9.7% de los casos ingirieron en forma prenatal acido fólico, mientras los controles en un 90.34%. El sexo de los niños con CATVP no es representativo ya que se observo un 50% de sexo femenino y 50% en el masculino. La frecuencia genotípica del homocigoto mutado TT se observó en el 43% de los casos y 57% de los controles. Se observa que la asociación entre la 12 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” ingesta de acido fólico y la presencia del alelo mutado puede ser un factor para que aumente el riesgo de desarrollar CC, sin embargo el presente estudio muestra que el alelo mutado no es predeterminante para la CATVP. 13 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5. Introducción. 5.1. Generalidades En nuestro organismo, se llevan a cabo diversos acontecimientos fisiológicos a distintos niveles biológicos: molecular, subcelular, celular, de órgano o tejido y del organismo completo. Hace algunos años, el estudio de enfermedades humanas consistía solo en el estudio de las anomalías o tejidos en particular. Sin embargo, actualmente los procesos patológicos se estudian también a nivel celular, subcelular y molecular. La biología molecular es una rama de la genética, que estudia la comprensión de todos aquellos procesos celulares que contribuyen a que la información genética se transmita de uno a otros seres vivos y se exprese en nuevos individuos. Para su estudio se recurre a numerosas técnicas. Algunos de los descubrimientos más importantes para poder aplicar esta rama son; el aislamiento de nucleína por Friedrich Miescher (1869), llamada después ácido nucleíco por su composición química altamente ácida. Existen dos tipos de ácidos nucleicos, ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN), químicamente están formados por unidades de nucleótidos, cada nucleótido, está conformado por tres compuestos, un grupo fosfato, una azúcar (pentosa); ribosa para el ARN y desoxirribosa para ADN y una base nitrogenada, las bases púricas; adenina y guanina son iguales para ADN y ARN, las bases pirimídicas para ADN son citosina y timina y en el ARN cambia la timina por uracilo. Oswald Avery y colaboradores (1944), basado en los experimentos de Griffith, con la bacteria Staphylococcus pneumonie neumococo aíslan del ADN y concluyen que el factor de transformación o material hereditario era el ADN. Y son años después Alfred Hershey y Martha Chase usando isotopos radioactivos en 1952 quienes demuestran que el ADN es el portador de la información genética que se transmite a la progenie y no las proteínas. 14 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” La Genética molecular es la en cargada de estudiar la estructura y función de los genes a nivel molecular, aparece desde el descubrimiento de Watson y Crick (1954) que proponen que la estructura del ADN se asemeja a la de una doble hélice, basándose en los estudios de difracción de rayos X, realizados por Rosalind Franklin y Wilkins. Francis Crick y un grupo de investigadores continúan con el estudio del código genético en los años sesentas. Dilucidando que las bases del ADN se leen en tripletes de nucleótidos y la combinación de nucleótidos del triplete significa un aminoácido que formará parte de una proteína. Allí comienza a comprenderse la molécula de ADN y como lleva la información genética que contiene la célula. Con lo que se postula el “Dogma central de la biología molecular”. Arber (1962) descubre las nucleasas de restricción las cuales cortan en fragmentos al ADN, Hamilton Smith (1970) descubre las enzimas de restricción (de tipo II) purificando HindII a partir de Haemophilus influenzae para caracterizar secuencias del ADN y así analizarlo, una enzima de restricción es una proteína que corta sitios específicos en secuencias de nucleótidos denominados palíndromos de 4 a 6 pb. Dicho método enzimático provoca que se rompan enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica mediante su hidrólisis. Existen de 2 tipos, de endonucleasas específicas que rompen aleatoriamente los puentes fosfato de la cadena y las endonucleasas de restricción que rompen la hebra del ADN por enlaces específicos como es el caso de la enzima HinfI de tipo II, que es la que se empleó en este trabajo, la cual presenta un tipo de corte de extremos cohesivos o adherentes (sticky). Eso permite cortar y pegar un fragmento de ADN para estudiar, analizar patologías en ciertos genes, etc. Es importante también nombrar a Werner Sanger en Inglaterra y Walter Gilbert y Allan Maxam en Harvard, en los setentas desarrollan métodos de secuenciación rápida del material genético los cuales hoy en día han acelerado significativamente la investigación y los descubrimientos en biología. Las técnicas actuales permiten realizar esta secuenciación a gran velocidad, lo cual ha sido de gran importancia para proyectos de secuenciación a gran escala como el Proyecto Genoma Humano. 15 http://es.wikipedia.org/wiki/Inglaterra http://es.wikipedia.org/wiki/Walter_Gilbert http://es.wikipedia.org/wiki/Walter_Gilbert http://es.wikipedia.org/wiki/Universidad_de_Harvard http://es.wikipedia.org/wiki/Biolog%C3%ADa http://es.wikipedia.org/wiki/Proyecto_Genoma_Humano “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Hacia fines de los años ochenta, Kary Mullis descubre la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) que revolucionó a la genética molecular, por su practicidad y rapidez para amplificar una región de ADN (ej. Un fragmento del gen de interés) en cantidad suficiente para luego hacer todo tipo de análisis. Son innumerables las aplicaciones de estas técnicas y una de las más usadas hoy en día, es la PCR seguida de una restricción con enzimas y detección de los fragmentos en un gel de agarosa. Cuando se combinan estas dos técnicas se denomina PCR-RFLP (derivado de variación en la longitud de los fragmentos de restricción en inglés). Esta técnica puede usarse, entre otras cosas, para la detección de alelos normales o mutados en un gen (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas bacterianas, virales o alelos más favorables parauna característica de interés productivo y luego aplicarlo a la selección. Estos importantes acontecimientos, solo forman parte de la inmensa historia de investigaciones e investigadores que para mí, preceden este trabajo y que permiten hoy en día la comprensión de algunas enfermedades humana como lo son, en este caso las cardiopatías congénitas y que permiten su aplicación para poder aprender a conocer más sobre su diagnóstico, tratamiento y probablemente en un futuro la prevención temprana. 16 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.2. El corazón. El corazón se encuentra ubicado en la parte inferior de la caja torácica, inmediatamente detrás del esternón y descansando sobre la porción central fibrosa del diafragma. Su localización en la región mediastasica le permite estar relacionado lateralmente con ambos pulmones y posteriormente con la aorta descendente y el esófago. En su aspecto anterior y superior esta en relación con el timo. El corazón humano es un órgano hueco, con forma de una pirámide inclinada, cuya función es bombear la sangre a todo el organismo para proporcionarle oxígeno, nutrientes y eliminar los productos de desecho, bombea la sangre desoxigenada a los pulmones para liberar dióxido de carbono y recoger oxígeno. Está constituido por cuatro cámaras o cavidades, dos de lado derecho y dos de lado izquierdo, las dos cámaras superiores son llamadas aurículas y las dos inferiores se conocen como ventrículos. Las aurículas son más pequeñas y menos musculosas, llamadas con frecuencia cámaras receptoras. Los ventrículos se denominan como cámaras de descarga. La aurícula derecha y el ventrículo derecho forman lo que normalmente se conoce como corazón derecho, debido a que recibe la sangre desoxigenada que proviene de todo el cuerpo, y desemboca en la aurícula derecha a través de la vena cava superior. Esta sangre llega al ventrículo derecho y es enviada la sangre a circulación pulmonar por la arteria pulmonar. La aurícula y ventrículo izquierdos también llamados corazón izquierdo bombean juntos la sangre ahora oxigenada, desde las venas pulmonares hacia la circulación sistémica, como se muestra en la figura 1. Las válvulas cardiacas son estructuras que separan las cavidades evitando que exista reflujo retrogrado. Las válvulas tricúspide y mitral llamadas válvulas aurículo ventriculares, están situadas en los orificios que comunican a las aurículas y los ventrículos, tienen la función de impedir el flujo retrogrado de sangre desde los ventrículos hacia las aurículas durante la sístole que es el movimiento de contracción del corazón, los golpes que se producen en la contracción de los ventrículos originan los latidos, que en el hombre oscilan entre 70 y 80 latidos por minuto. Las válvulas aórtica y pulmonar o válvulas semilunares, impiden el flujo 17 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” retrogrado desde las arterias aorta y pulmonar hacia los ventrículos durante el movimiento de dilatación que es la diástole. El corazón está compuesto de afuera hacia dentro por el pericardio, que es una membrana fibrosa gruesa de doble capa en forma de saco que protege al corazón, tejido muscular cardiaco conocido como miocardio cuyas fibras permiten la sístole y expulsión de la sangre ventricular a través de las válvulas hacia las arterias aorta y pulmonar dichas cámaras están revestidas por tejido liso llamado endocardio cuya función es impedir que la sangre se coagule en el interior del corazón. 5.2.1. Fisiología del corazón. En un corazón normal la sangre desoxigenada llega a la aurícula derecha a través de las venas cavas, pasa al ventrículo derecho a través de la válvula tricúspide. El ventrículo derecho se contrae y envía la sangre a la arteria pulmonar a través de la válvula pulmonar que evita que la sangre retroceda hacia el ventrículo. La arteria pulmonar se bifurca en dos arterias, una para el pulmón derecho y otra para el izquierdo. En el pulmón se oxigena la sangre y regresa ya oxigenada a la aurícula izquierda a través de las venas pulmonares. De la aurícula izquierda pasa al ventrículo izquierdo a través de la válvula mitral y del ventrículo izquierdo a la aorta. De la aorta nacen innumerables ramas que llevan la sangre a todos los órganos y tejidos. Las primeras de estas ramas son las arterias coronarias que llevan sangre oxigenada al corazón, a la masa muscular cardíaca o miocardio de la cual se extrae el oxígeno necesario para seguir latiendo. Así se oxigenan los demás órganos, la sangre ya sin oxígeno regresa al corazón, llega a la aurícula derecha, a través de las venas cavas con lo que se cierra el ciclo. 18 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Vena cava superior (sangre del cuerpo) Aorta (sangre para el cuerpo) Arteria pulmonar (al pulmón derecho) Arteria pulmonar (al pulmón izquierdo) Venas pulmonares (del pulmón derecho) Venas pulmonares (del pulmón izquierdo) Aurícula derecha Aurícula izquierda Válvula aortica. Válvula pulmonar. Válvula tricúspide. Válvula mitral. Ventrículo derecha. Ventrículo izquierdo. Vena cava inferior (sangre del cuerpo) Tabique. Figura 1. Anatomía del corazón humano. Las flechas azules indican sangre desoxigenada y la rojas sangre oxigenada. [Tomado y modificado de Courtesy of www.3DScience.com @ Zygote Media Group.] Cualquier trastorno que afecta el funcionamiento normal del corazón y en sentido estricto la estructura del corazón se llama cardiopatía. Se pueden clasificar según su etiología de la siguiente forma: 19 http://www.3dscience.com/ “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Tabla 1. Clasificación según la etiología de las cardiopatías. [Tomado de http://slevmedicinasemiologiacardiopatiaclas.blogspot.com/]. Cardiopatías congénitas Corto circuito izquierda-derecha. Comunicación intraauricular (CIA) Comunicación intraventricular (CIV) Comunicación auriculoventricular (CAV) Corto circuito derecha- izquierda. Tetralogía de Fallot Trasposición de grandes vasos Tronco arterioso Atresia Tricuspidea Conexión anómala total de venas pulmonares Obstructivas Coartación Aortica Estenosis y Atresia pulmonar Estenosis y Atresia aortica Cardiopatías adquiridas. Enfermedad de Kawrawaki Fiebre reumática Cardiopatía isquémica Aguda: Infarto al miocardio Cardiopatía Isquémica crónica Crónica: Angina de Pecho Muerta súbita cardiaca Cardiopatía Hipertensiva. (CH) CH sistémica (lado izquierdo) CH Pulmonar (lado derecho o Pulmonar) Insuficiencia y estenosis mitral Insuficiencia aortica Cardiopatías valvulares (valvulopatías) Insuficiencia Tricuspidea Endocarditis Infecciosa Endocarditis por LES Cardiomiopatías (CM) CM Dilatada CM Hipertensiva CM Restrictiva Miocarditis Cardiopatía fibrilar o arritmias Por alteración del automatismo Taquicardia sinusal Bradicardia sinusal Por alteración de la excitabilidad Extrasístoles Por alteración de la conductibilidad Bloqueos aurículo ventriculares Complejas Taquicardia paroxística Fibrilación auricular 20 http://slevmedicinasemiologiacardiopatiaclas.blogspot.com/ “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos”5.3. Cardiopatías congénitas. Las cardiopatías congénitas (CC) son lesiones anatómicas de una o varias de las cuatro cámaras cardiacas, de los tabiques que las separan, de las válvulas o de las zonas ventriculares por donde sale la sangre del corazón. En algunas persiste una comunicación entre las dos mitades del corazón, con lo que se mezcla la sangre oxigenada y la desoxigenada al no cerrarse completamente el tabique interventricular durante el desarrollo fetal. Es el tipo de anomalía congénita más común, y es la responsable de más muertes en el primer año de vida que cualquier otro defecto al nacimiento. Algunos de estos defectos se curan con el tiempo y otros requieren tratamiento e intervención quirúrgica. [11] Las CC suele estar dividida en dos tipos: cianóticas que se denominan así por la coloración azulada de la piel debida al aumento de la hemoglobina, la cual se determina mediante la exploración del médico, y acianóticas las cuales presentan ausencia de cianosis, en la tabla 2 muestra las más comunes: Tabla 2. Cardiopatías congénitas más comunes. Cianóticas Acianóticas Tetralogía de Fallot Comunicación interventricular (CIV) Transposición de los grandes vasos Comunicación interauricular (CIA) Atresia tricúspide Conducto arterial persistente (CAP) Atresia pulmonar Estenosis aórtica Tronco arterial Estenosis pulmonar Corazón izquierdo hipoplásico Coartación de la aorta Conexión anómala total de venas pulmonares (CATVP) Canal auriculoventricular (defecto de relieve endocárdiaco) 21 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Los padecimientos cardiovasculares en pediatría generalmente son de tipo congénito y se presentan del 0.5 – 0.8% de recién nacidos, aumentando de 2 – 6% en el segundo embarazo. La incidencia en mortinatos es de (3.4%), en los abortos de (10 – 25%) [12]. En muchas ocasiones se asocian a otras alteraciones multisistémicas y congénitas. La gravedad varía en aproximadamente 2 o 3 lactantes de cada 1000 recién nacidos, presentan una CC sintomática en los primeros años de vida. El diagnóstico se alcanza durante la primera semana de vida del 40 – 50 % de los pacientes y durante el primer mes del 50 – 60%. Las CC se asocian frecuentemente a diversos síndromes genéticos y cromosómicos, los defectos cromosómicos se presentan de 5 a 8%, siendo la más común la trisomía 21; pero también las trisomías 13, 18, 45 y XO (síndrome de Turner). Los defectos Monogénicos Mendelianos Clásicos, afectan al 3% de los pacientes y su riesgo de transmisión es del 25%. La herencia ligada a X rara vez causa defectos estructurales del corazón, pero guarda relación con cardiomiopatía de la distrofia de Duchenne [40]. La aparición de cardiopatías específicas varía en ambos sexos. La transposición de las grandes arterias y las lesiones obstructivas de cavidades izquierdas son algo más frecuentes en las niñas al igual que la comunicación interauricular, la comunicación interventricular y la estenosis pulmonar. [39] La mayoría de las cardiopatías congénitas son susceptibles de una corrección total y definitiva o casi definitiva, permitiendo que el niño disfrute de una vida normal sí es diagnosticada a tiempo. 22 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.4. Conexión anómala total de venas pulmonares (CATVP) Entre las CC complejas se encuentra la CATVP, un defecto poco común, en el que las venas pulmonares drenan directamente o indirectamente en la aurícula derecha a través de una vena sistémica o sistema venoso. El término CATVP fue propuesto por Edwards en 1953 [38] y actualmente es aceptado. Sí todas las venas pulmonares drenan de forma anómala habrá una CATVP; pero sí es solo una o varias venas pulmonares, recibe el nombre de conexión anómala parcial de venas pulmonares (CAPVP). 5.4.1. Clasificación Desde el punto de vista anatómico se utiliza la clasificación de Darling [13]. En donde se clasifican en 4 tipos: Supracardíaco: se presenta en el 55% de los casos, es la más frecuente, ocurre cuando las venas pulmonares drenan o se conectan a la vena cava superior derecha, a la vena cava superior izquierda o a la vena innominada, siendo este último el sitio más frecuente, 3-4 veces más que a la vena cava superior derecha [42]. Intracardíaco: Se presenta en el 30%, cuando las venas pulmonares drenan o se conectan directamente a la aurícula derecha o al seno coronario. Infracardíaco: representa el 12%, ocurre cuando la conexión venosa pulmonar va a desembocar a la vena cava inferior o a alguna de sus tributarias, siendo más frecuente la vena porta. Mixto. Ocupa el porcentaje restante y es una combinación de los grupos anteriores [41]. 0 23 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” VI VCS AD AI C VsPsDs A VV VsPsLs VCS AD C AI B VCI C VCS AD AI C SP Figura 2. Esquema de los diferentes tipos de CATVP. (A. Supracardíaco a la vena cava superior a través de la vena vertical y vena innominada. B. Intracardíaco a la aurícula derecha o al seno coronario. C. Infracardíaco a la vena porta o a la vena cava inferior. VCS: vena cava superior; VI: vena innominada; W: vena vertical; VsPsLs: venas pulmonares izquierdas; VsPsDs: venas pulmonares derechas C: colector; VCI: vena cava inferior; SP: sistema porta; AD: aurícula derecha; AI: aurícula izquierda [Figura tomada del libro de Cardiología Pediátrica, pág. 428]). Desde el punto de vista clínico y fisiopatológico la CATVP puede ser obstructiva o no obstructiva. [42]. Puede existir obstrucción al drenaje venoso pulmonar: a) Por compresión extrínseca del vaso colector. b) Por disminución del calibre del vaso colector. La CATVP no obstructiva se caracteriza por gran sobrecarga de volumen de cavidades derechas, debido al inmenso cortocircuito de izquierda a derecha que existe en el sitio del drenaje. La presión pulmonar va aumentando progresivamente y el flujo a las cavidades izquierdas depende del tamaño del defecto interauricular. Este hiperflujo de sangre causa insuficiencia cardiaca e hipertensión pulmonar. Debido a la mezcla que ocurre en la aurícula derecha con gran cantidad de sangre desoxigenada, estos pacientes no son cianóticos inicialmente, ya que la existencia de una comunicación interarterial (CI) es obligada para que los niños sobrevivan, pues así pasa un poco de sangre mezclada a la aurícula izquierda, ventrículo izquierdo y aorta para proporcionar sangre al cuerpo. Sí no la hay o ésta se cierra 24 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” precozmente al nacer, el recién nacido no puede sobrevivir por lo que es necesario realizar de emergencia una dilatación de la comunicación interarterial con un cateterismo terapéutico (Atrioseptostomía); por el contrario, en la CATVP obstructiva, hay edema pulmonar e hipertensión pulmonar retrógrada severa en forma precoz con muy poca sangre oxigenada que llega a la aurícula derecha y por ende a las cavidades izquierdas, lo que se traduce en cianosis precoz, insuficiencia cardíaca y bajo gasto sistémico, lo que ocasiona la muerte del neonato si no se realiza una corrección quirúrgica a las pocas horas o días de nacimiento dependiendo de la gravedad de la obstrucción [43, 44].5.4.2. Embriología. Embriológicamente para que se produzca esta malformación, la alteración del desarrollo de las venas pulmonares ocurre tempranamente entre los 25 - 27 días de vida intrauterina (etapa llamada Horizonte XII de Streeter en el desarrollo humano), cuando se forma el esbozo de los pulmones [44]. La falla en el desarrollo de la Vena Pulmonar Común, puede deberse a tres procesos: 1) Agenesia 2) Involución 3) Atresia En la mayoría de los casos la involución y la agenesia es los más frecuentes y solo el 3% a atresia. 25 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.4.3. Diagnóstico. Se basa principalmente en la clínica, los signos y síntomas son muy variados dependiendo del tipo anatomopatológico de la malformación, así como presencia o ausencia de obstrucción. La aparición de los síntomas ocurre en el primer mes de vida con síntomas similares de hiperflujo pulmonar como pueden ser: Taquipnea, dificultad para respirar, fatiga, diaforesis, así como poca ganancia de peso, cuadros repetitivos de infecciones respiratorias bajas, la cianosis es muy discreta, en la exploración física existe un corazón grande que a la palpación se siente hiperdinámico, los ruidos son rítmicos con segundo tono reforzado y desdoblado (por cierre valvular pulmonar intenso, secundario a hiperflujo [13], la insuficiencia cardiaca raramente aparece antes de los 6 meses de edad, a menos que exista obstrucción del colector en donde los síntomas de edema agudo pulmonar aparecen rápidamente y se pueden incrementar cuando el paciente se coloca en decúbito ventral o se flexiona sobre su abdomen (aumenta la obstrucción). Con la ayuda de estudios auxiliares de gabinete como radiografía de tórax, electrocardiograma, y para un diagnóstico definitivo se realiza ecocardiograma transtorácivo en las del 90% de los casos. Sin tratamiento adecuado el 80 o 90% fallecen antes del primer año de vida y la mayoría en los primeros meses si hay obstrucción. 5.4.4. Tratamiento. Se divide en dos grupos: Con obstrucción y sin obstrucción. Por lo general un paciente recién nacido con obstrucción presenta insuficiencia cardiaca grave, edema pulmonar y acidosis metabólica por lo que requiere una intervención urgente, debe ser manejado con intubación endotraqueal, se corrige en forma rápida su cuadro metabólico y es apoyado con inotrópicos, vasodilatadores y diuréticos. El paciente de tipo no obstructivo, no es urgente y la cirugía se puede programar en forma selectiva ya que la sintomatología puede ser leve o el inicio temprano de la terapia anticongestiva mejora las condiciones clínicas de los pacientes. El diagnóstico y la anatomía quirúrgica la muestra un ecocardiograma, el cual determina el tipo de conexión anómala, el sitio de la obstrucción sí es que la hay, el grado de hipertensión 26 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” pulmonar y la presencia de cardiopatías asociadas a aspectos fundamentales para hacer un plan quirúrgico. La operación consiste en ocluir la vena vertical, conectar el colector a la aurícula izquierda y en cerrar la comunicación intraauricular. Estas dos últimas cosas se realizan con simple sutura directa. [11] El cateterismo cardiaco sólo debe reservarse para aquellos pacientes en los cuales el diagnóstico con el ecocardiograma no es claro [45]. En los casos de CATVP, la mortalidad por cirugía correctiva ha disminuido considerablemente (2 a 3%) especialmente en pacientes con CATVP no obstructiva. En pacientes con CATVP obstructiva, y sobre todo en las infradiafragmáticas la mortalidad llega hasta un 15 – 20% [46]. 5.4.5. Incidencia. Es una patología que se encuentra entre el 1 a 2 % del total de las cardiopatías, pero si se toma la incidencia en el primer año de vida, se reporta en 2% [41] de las cardiopatías. Es más frecuente en el sexo masculino que en el femenino (2:1). La etiología de la enfermedad no está definida, sin embargo, se sugiere que la etiología de las CC presentan una heterogeneidad genética, relacionándose tanto con patrones de herencia mendelianos como alteraciones cromosómicas y aspectos relacionados con herencia de origen multifactorial. En el análisis de enfermedades multifactoriales, los avances logrados en el campo de la genética y la biología molecular han permitido la identificación de genes asociados a CC, por ejemplo el polimorfismo C677T del gen MTHFR se ha encontrado en mayor proporción en pacientes con CC que en la población sana, sugiriendo que la presencia del polimorfismo es un factor de riesgo para el desarrollo de CC [47]. 27 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.5. Gen MTHFR El gen MTHFR humano se encuentra ubicado en el cromosoma 1p36.3 [3], su locus es único y no se ha descrito la existencia de pseudogenes. Está conformado por 11 exones con tamaños desde 102 hasta 432 pb y 10 intrones que oscilan entre las 250 y 4200 pb. Como se puede observar en la figura 3. Figura 3. Localización y estructura del gen MTHFR. [Tomado de NCBI Chromosome 1 - NC_000001.10]. La proteína MTHFR es un homodímero compuesto de 656 aminoácidos con una masa molecular de 150 kDa, cada una de las subunidades tiene un peso de 77 kDa; aunque se ha detectado una isoforma de 70 kDa [21]. Inicialmente esta proteína fue aislada y purificada de hígado porcino, a partir de la secuencia peptídica porcina y mediante el uso de oligonucleótidos degenerados se logro aislar una secuencia de 90pb de ADNc la cual fue usada para buscar el ADNc humano homologo en una biblioteca de ADN, (Rowenad Matthews y colaboradores) [22]. La secuencia de aminoácidos predicha muestra una fuerte homología entre la MTHFR porcina, humana y el gen bacteriano metF. El análisis de “Northern blot” ha revelado que el gen MTHFR produce transcritos de 2.8, 7.2 - 7.7 kb en tejidos y de 9.5 kb en cerebro, músculo, placenta y estomago, observándose una mayor expresión en testículos, una mediana expresión en cerebro y riñones así como menor en otros tejidos examinados. Los diferentes tamaños en los transcritos son resultado de sitios alternativos en el inicio de la transcripción y de señales de poliadenilación. El análisis de la región promotora del gen MTHFR mostró que carece de cajas TATA, sin embargo se ha identificado la presencia de múltiples sitios de unión SP1, así como islas CpG propensas a experimentar eventos epigenéticos como metilación y otros sitios de unión a diversos factores de transcripción [23]. 28 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.6. Enzima MTHFR La MTHFR (Metilenetetrahidrofolatoreductasa) es una enzima termolábil clave en el metabolismo de folato y la homocisteína. La región catalítica está ubicada en el extremo N-terminal de la proteína teniendo un peso aproximado de 40 kDa, el centro catalítico contiene un sitio de unión para flavín- adeníndinucleótido (FADH), otro para nicotín-adeníndinucleótido fosfato (NADPH) y un tercero para el 5,10 metiléntetrahidrofolato. La región C- terminal es de 37 kDa, interviene en la regulación de la enzima ya que tiene un sitio de fijación para el regulador alostérico S-adenosilmetionina (SAM). Las porciones C- terminal y N-terminal de la proteína están unidas por una zona central extremadamente hidrofílica [24]. La MTHFR catalizala reducción de 5,10-metilentetrahidrofolatoreductasa (5,10- MTHFR) a 5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF), usando como cofactor a NADPH (Nicotinamida-Adenina Dinucleótido Fosfato), la 5- MTHF es la forma predominante del folato y dona un grupo metil en la remetilación de la homocisteína a metionina, proceso dependiente de vitamina B12. Dicha reacción se muestra en la figura 4. 5,10-metilentetrahidrofolato 5-metiltetrahidrofolato Figura 4. Reducción de 5,10-MTHFR a 5-MTHF. 29 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” La investigación en los últimos años ha aclarado y aportado una mayor comprensión de la deficiente actividad hereditaria de la MTHFR. La deficiencia de la actividad enzimática de la MTHFR se asocia principalmente como el error innato más común del metabolismo de los folatos. Un bloqueo en la producción de MTHFR conduce a elevados niveles de homocisteína con niveles de metionina que oscilan desde bajos hasta los normales, así como su asociación con múltiples enfermedades como retraso del desarrollo, neuropatía periférica, cáncer, ateroesclerosis, malformaciones congénitas. Se ha demostrado que los niveles elevados de homocisteína en plasma constituye un factor de riesgo independiente para padecimientos cardiovasculares [16]. La enzima MTHFR ha sido estudiada desde hace varios años, ya que interviene en múltiples enfermedades, como errores innatos del metabolismo de los folatos, que lleva a la hiperhomocisteina y homocistinuria, así como su asociación con la enfermedad arterial coronaria [16]. 5.7. Metabolismo en el que interviene. La homocisteína se obtiene como resultado del metabolismo del aminoácido metionina este aminoácido proviene de la dieta diaria. La metionina es metabolizada por la enzima metionina adenosiltransferasa a S-adenosil metionina (SAM), la cual actúa como donador de grupos metilo por medio de la enzima metiltransferasa, en procesos de metilación de ADN, proteínas, neurotransmisores y fosfolípidos. El producto de esta reacción genera S- adenosilhomocisteína (SAH), la cual es metabolizada por la enzima adenosilhomocisteina que elimina adenosina y forma homocisteína, una vez sintetizada puede seguir 2 rutas: 30 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” La transulfuración representa la alternativa en el caso de que la metionina esté en relativo exceso en el organismo y no se requiera su recuperación, y permite la síntesis del aminoácido cisteína. En este proceso la homocisteína se condensa con la serina de forma reversible para formar cistationina, reacción catalizada por la CBS (cistationina sintasa) y es también dependiente del piridoxal-5´-fosfato (PLP) metabolito activo de la vitamina B6, como un cofactor. La cistationina hidrolizada a cisteína por la enzima cistationasa es también una reacción dependiente de vitamina B6. La cisteína, así generada, puede utilizarse en la síntesis de proteínas o como precursor del antioxidante glutatión. Este proceso de transulfuración es irreversible y dirige a la homocisteína al catabolismo hacia su producto final, los sulfatos. Alternativamente la metionina puede volverse a formar por la vía de remetilación que permite que la homocisteína se recicle, esto ocurre cuando el grupo metilo del 5-MTHF es donado a la homocisteína reacción catalizada por la metionina sintasa (MS) y su co-sustrato la vitamina B12. En esta vía la MTHFR es una enzima clave en el metabolismo de la homocisteína ya que cataliza la conversión de 5,10-MTHFR en 5-MTF. Por otro lado el grupo metilo puede ser donado por la betaína en una reacción catalizada por la betaína - homocisteinametiltransferasa (BHMT), formando dimetilglicina y metionina. La reacción de la betaína - homocisteína no es dependiente ni de vitamina B12 ni del folato, pero probablemente esta reacción está limitada al hígado, riñón y las glándulas suprarrenales. 31 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Figura 5. Vías metabólicas en las que interviene la actividad de MTHFR. Tomado de [Botto L.D, et al, 2000]. El metabolismo normal de la homocisteína requiere de la presencia de cantidades adecuadas de ácido fólico y vitaminas B6 y B12 ya que participan en la degradación metabólica de la homocisteína. La deficiencia de estas tres vitaminas se ha asociado con niveles altos de homocisteína en sangre. Por lo que existe una relación inversamente proporcional entre la cantidad de folato y la cantidad de homocisteína, a niveles bajos de folato; la disminución de la actividad en la MTHFR ocasiona la acumulación de homocisteína, disminuye la concentración de SAM y 5-MTHF, así como la metilación del ADN y por el contrario aumenta los niveles de SAH, así como la síntesis de purinas. Otras condiciones que provocan elevación de los niveles de homocisteína en sangre incluyen a la insuficiencia renal, el estado heterocigoto de homocisteinuria y mutaciones de la enzima 5, 10 metiltetrahidrofolato reductasa, la leucemia linfoblástica, los cánceres de ovario, mama y páncreas, el consumo del tabaco y el empleo de medicamentos tóxicos antagonistas del folato como metotrexato, fenitoina, carbamacepina, antagonistas de la vitamina B6: teofilina, azarabine y estrógenos [26, 27, 28]. 32 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.8. Homocisteína. La homocisteína es un aminoácido azufrado caracterizado por la presencia de un grupo tiol libre, que no está presente en las proteínas de la dieta sino que se forma exclusivamente como producto intermediario en el metabolismo de la metionina a cisteína. Por tanto, la única fuente de homocisteína en el organismo es el aminoácido esencial metionina [29]. Debido al valor del pKa (constante de activación) de su grupo tiol (pKa = 8,9) al pH fisiológico, la homocisteína se oxida rápidamente para formar distintos tipos de disulfuros. Así, en plasma se diferencian distintos tipos circulantes de homocisteína: un compuesto libre reducido y 3 oxidados, en los que un monómero de homocisteína se encuentra unido a otro compuesto mediante puentes disulfuro: el heterodímero homocisteína - cisteína, el homodímero de homocisteína (homocistina) y la homocisteína unida a proteínas [30]. La suma de todas ellas se denomina homocisteína total. La concentración de homocisteína libre en plasma es muy baja y representa menos de un 2% de la homocisteína plasmática total. Los dímeros homocisteína - cisteína y homocistina representan un 10-15% de la homocisteína total, mientras que la fracción mayoritaria está formada por la homocisteína unida a proteínas, principalmente albúmina, fracción que representa un 80-85% de la homocisteína total [31]. En esta última década, la determinación de los valores séricos de homocisteína total se ha convertido en un área de interés debido a su relación con el riesgo cardiovascular, se sabe que la homocisteína es teratogénica, provocando defectos en el tubo neural (DTN) y CC entre otras malformaciones [48, 49]. En circunstancias metabólicas normales, existe un balance estricto entre la formación de homocisteína y su eliminación. Normalmente el 50% de la homocisteína formada se remetíla a metionina; sin embargo, cuando hay un exceso de ingesta proteínica o de metionina, el porcentaje que se cataboliza por la vía de la transulfuración es superior.33 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Sí la producción de homocisteína se incrementa en relación con su consumo, la homocisteína se excreta de las células, hecho que se puede detectar como un aumento de la concentración de homocisteína en el plasma, el suero o la orina. La concentración deseable de homocisteína es < 1 µ mol/L. 5.8.1. Hiperhomocisteinemia y homocistinuria. La concentración elevada de homocisteína total en sangre se define como hiperhomocisteinemia. Se puede dividir en: Débil (15-30 µ mol/L). Intermedia (30-100 µ mol/L). Grave (> 100 µ mol/L) 6 . Homocistinuria es la presencia de homocisteína en orina a consecuencia de una hiperhomocisteinemia grave originada por defectos congénitos en el metabolismo de la homocisteína. La concentración de homocisteína total es función de una compleja interacción entre múltiples factores genéticos, ambientales y fisiológicos. En la siguiente tabla se mencionan algunos factores que influyen en las concentraciones de homocisteína. Tabla 3. Factores que influyen en la concentración de la homocisteína. Factores fisiológicos Factores genéticos Factores ambientales Edad Polimorfismo MTHFR Estado nutricional Sexo Deficiencia de la MS Exceso de metionina Raza Deficiencia de MTHFR Consumo de café Menopausia Deficiencia de la CBS Tabaco Embarazo Fármacos Ejercicio físico Consumo de alcohol 34 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Factores fisiológicos: Edad. Las concentraciones de homocisteína se elevan a lo largo de la vida en ambos sexos. Antes de la pubertad, todos los niños presentan concentraciones bajas y similares, en torno a los 5 µ mol/L. Durante la pubertad, estos valores se elevan considerablemente, más en los niños que en las niñas, de modo que, a los 40 años de edad, existe una diferencia de unos 2 µ mol/L entre ambos sexos, con valores medios en torno a los 11 µ mol/L en los varones y 9 µ mol/L en las mujeres. Posteriormente, a medida que se eleva la edad, aumenta la homocisteína total, hecho que puede relacionarse con la disminución de la filtración glomerular, el déficit vitamínico y la mala absorción intestinal. Sexo. Los varones presentan concentraciones de homocisteína total superiores a las mujeres. La diferencia entre sexos podría deberse a diferencias en la masa muscular, ya que la síntesis de creatina es superior en los varones que en las mujeres, y existe una correlación significativa entre la homocisteína total plasmática y la concentración de creatina plasmática. Raza. La concentración de homocisteína muestra diferencias entre las distintas razas. Un estudio interétnico realizado en Los Ángeles mostró valores de homocisteína total menores en la raza negra y en los asiáticos que en las personas de raza blanca, mientras que los latinoamericanos tenían concentraciones intermedias. No obstante, en todas las etnias, los varones presentaban concentraciones de homocisteína superiores a las de las mujeres. Es posible que estas diferencias observadas entre razas se expliquen por la mayor o la menor prevalencia de las mutaciones en los genes que codifican las enzimas involucradas en el metabolismo de la homocisteína total. Por ejemplo, el polimorfismo en el gen de la MTHFR, que predispone a aumentos en la homocisteína total plasmática en condiciones de alteración en el estatus de folato, muestra importantes diferencias étnicas. En la raza blanca aparece con una elevada frecuencia (un 10% en el genotipo TT), mientras que casi está ausente en los afroamericanos. 35 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Menopausia y embarazo. Las mujeres posmenopáusicas presentan una elevación media del 20% en las concentraciones de homocisteína total en ayunas con respecto a las premenopáusicas; sin embargo, aquellas sometidas a terapia hormonal sustitutiva consiguen reducir su homocisteína total. En el embarazo, la concentración de la homocisteína total disminuye entre un 30-50%, para normalizarse a los 2-4 días posparto. Factores genéticos: Los defectos genéticos en las enzimas involucradas en el metabolismo de la homocisteína conducen a elevaciones, de leves a graves, en la concentración de homocisteína. Deficiencia de la CBS. Es la causa más frecuente de homocistinuria. Se hereda de forma autosómica recesiva. Sus manifestaciones clínicas incluyen retraso mental, anormalidades esqueléticas y trombosis, tanto arteriales como venosas prematuras. Bioquímicamente, incluye la elevación de las concentraciones de homocisteína total en plasma y orina. En los sujetos homocigotos (homocistinuria congénita), éstas pueden ser superiores a 400 µ mol/L en ayunas, mientras que en los heterocigotos oscilan entre 20 y 40 µ mol/L, debido a la actividad residual de la enzima. Deficiencia de la MTHFR. La frecuencia de una deficiencia grave dependerá de la población ya que puede originar una elevación muy marcada de la concentración de homocisteína total en sangre y orina, así como la disminución de la concentración de metionina en sangre. La gravedad de las manifestaciones clínicas es paralela al grado de deficiencia enzimática y se incrementa la susceptibilidad de desarrollar hiperhomocisteinemia, en particular, cuando las concentraciones de folato son escasas. El polimorfismo de la MTHFR se observa con una frecuencia del 10-15% en los caucásicos, aunque las diferencias interétnicas son notables. La prevalencia es baja (0-2%) en indios, africanos o canadienses y llega al 20% o más en los asiáticos e italianos del norte. Su presencia se correlaciona con concentraciones altas de 36 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” homocisteína total, con la enfermedad arterial coronaria y con la gravedad de las estenosis. Deficiencia de la MS. La deficiencia funcional de esta enzima es consecuencia de las alteraciones nutricionales y/o genéticas que afectan a la formación de la metilcobalamina y del ácido 5-metiltetrahidrofólico. Factores ambientales: Estado nutricional. El déficit de ácido fólico, vitamina B6 y B12, más frecuentes en las personas mayores, son la principal causa de hiperhomocisteinemia. Este hallazgo está avalado por la presencia de bajas concentraciones de homocisteína total en las personas que toman suplementos vitamínicos, así como por la asociación negativa entre los valores plasmáticos de homocisteína [32] y las concentraciones plasmáticas o la ingesta de estas vitaminas. En México, este factor es especialmente de gran importancia ya que la mayoría de los pacientes que llegan al HIMFG, son de bajos recursos y originarias de zonas marginadas del país, por lo que la suplementación de ácido fólico y vitaminas en el embarazo es deficiente o nula. Contenido en metionina de las proteínas de la dieta. A las 8 h de realizar una comida rica en proteínas, la homocisteína total aumenta un 14%. Sin embargo, la respuesta de la homocisteína tras sobrecarga de metionina o en ayunas no parece relacionarse con la metionina o la ingesta proteínica de la dieta. Por el contrario, los estudios recientes sugieren que una ingesta proteínica o de metionina elevada puede reducir la homocisteína total basal, posiblemente debido al elevado contenido en vitamina B12 de muchos de los alimentos ricos en metionina. Aunque lo más probable es que la disminuciónde la homocisteína total se deba a diferencias en el estado vitamínico, más que a los efectos directos de un consumo superior de metionina, hecho comprobado al observar que la elevación de la homocisteína total no es frecuente en sujetos con elevado consumo de carne. En los vegetarianos se ha detectado elevación de las concentraciones de homocisteína total. 37 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Consumo de café. Fue uno de los determinantes del estilo de vida más fuertemente relacionado con la homocisteína total en el estudio Hordaland, donde se observa una marcada relación dosis-respuesta entre la homocisteína total y el consumo de café. Los sujetos que consumían más de 6 tazas de café al día presentaron concentraciones de homocisteína total 2-3 µ mol/L más altas que los que no las tomaban. Incluso en algunos trabajos se ha demostrado que el procesamiento del café también puede influir en las concentraciones de homocisteína [34]. Tabaco. La concentración de homocisteína total es superior en los fumadores que en los no fumadores, y se observa una fuerte relación dosis-respuesta entre el número de cigarrillos y la homocisteína total, independiente de la edad y el sexo. Entre las diversas causas que podrían explicar este efecto están: el consumo de una dieta menos sana, con más grasa y menos vegetales que los no fumadores y la producción, al fumar tabaco, de abundantes radicales libres que originan un estrés oxidativo que afecta al estado redox de los tioles, entre los que se incluye la homocisteína total. Ejercicio físico. El ejercicio parece reducir la homocisteína total. En el estudio Hordaland, su práctica fue un determinante débil pero significativo de la homocisteína total [34]. Alcohol. El consumo crónico de bebidas alcohólicas se asocia con la elevación de la homocisteína total. En contraste, un consumo moderado parece asociarse con concentraciones inferiores. El tipo de bebida consumida también influye en la homocisteína total. Al comparar una ingesta de 40 g de alcohol/día con la ingesta libre de agua, se observa un aumento de la concentración de homocisteína total de un 8% sí lo que se consume es vino tinto y de un 9% si son licores. En cambio se ha demostrado que el consumo de cerveza en diabéticos se correlaciona con una disminución de las concentraciones de homocisteína circulante. 38 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Fármacos. Numerosos fármacos influyen en la concentración de la homocisteína total. El mecanismo implicado en la mayoría de ellos, es la interferencia con alguna de las etapas del metabolismo de la homocisteína. Se clasifican en: o Medicamentos que conducen a la elevación de la homocisteína: Metotrexato. Antagonista del folato, inhibe la dihidrofolatoreductasa y depleciona las células de folatos reducidos. Este efecto se puede revertir con altas dosis de ácido fólico. Óxido nitroso. Por su efecto antagonista de la vitamina B12 e inhibidor de la MS, eleva la concentración de la homocisteína. Ciclosporina. Inmunosupresor que ocasiona elevaciones moderadas de la homocisteína total. Fármacos que interfieren en la absorción del ácido fólico y la vitamina B12, como la metformina y el omeprazol. Anticonvulsionantes. Interfieren en el metabolismo del folato. Fármacos que interfieren con la función de la vitamina B6 por un mecanismo común que implica la inhibición de la piridoxalcinasa, la niacina, la azarabina y la teofilina. Fenofibrato, al intervenir en el metabolismo del folato. o Fármacos que disminuyen la concentración de homocisteína: Tamoxifeno y algunos anticonceptivos orales. Aminotioles (penicilamina, acetilcisteína), al aumentar el aclaramiento renal o por desplazar a la homocisteína de sus sitios de unión a proteínas, reducen la homocisteína. 39 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.9. Ácido fólico. El ácido fólico es una vitamina hidrosoluble incluida en el grupo de vitaminas del complejo B, el folato es un donador de carbono involucrado en la biosíntesis de purinas y pirimidinas con la remetilación de homocisteína y produciendo grupos metilo para la metilación de ADN, proteínas y lípidos. Por lo tanto la importancia del folato es esencial para la expresión de múltiples genes asociados a la proliferación y diferenciación celular durante la embriogénesis [50]. La incidencia de defectos congénitos se puede reducir por el uso de suplementación con ácido fólico durante el embarazo. La base biológica no está completamente aclarada, sin embargo, se toman en cuenta dos hipótesis sobre el mecanismo patogénico de la deficiencia de folato: la hipermetilación del ADN, debido a la participación de los folatos para mantener la SAM que es el donador primario de los grupos metilo; y el efecto teratogénico de la hiperhomocisteinemia. Cuando la concentración de 5-MTHF está reducida, la remetilación de homocisteína en metionina disminuirá y pocos grupos metilos quedaran disponibles para la metilación de ADN. La hipometilación puede cambiar la transcripción y supresión de algunos genes involucrados en la formación del embrión y el nivel elevado de homocisteína resultante es posible que sea teratogénico. Varios estudios han propuesto que el consumo de ácido fólico, durante el embarazo protege contra la ocurrencia y recurrencia de CC. Debido a que el organismo es incapaz de sintetizar los folatos, es indispensable consumir alimentos ricos en esta vitamina. Es importante considerar que los folatos son inactivados con la cocción de los alimentos y con la exposición a la UV, durante su almacenamiento. Se encuentran presentes en alimentos como vegetales de hojas verdes, hígado, frutas y jugos cítricos, pan de trigo integral, levadura de cerveza, el contenido de folatos varía de acuerdo a cada alimento. La Secretaría de Salud considera deficiencia de folatos valores intereritrocitarios menores a 160ng/mL, así como menores a 3mg/mL en suero. 40 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Debido a que en México, se tiene una alta prevalencia de malformaciones congénitas la “NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-034-SSA2-2002, para la prevención y control de los defectos al nacimiento”, indica los siguientes puntos: 6.13.3 A toda mujer en edad reproductiva se le recomendará una ingesta diaria de ácido fólico de 400 microgramos/día o 0.4 miligramos, especialmente durante la etapa periconcepcional (tres meses previos al embarazo y hasta la semana 12 de la gestación). 6.13.4 En las mujeres en las que, por antecedentes o condición social o geográfica, se identifique riesgo alto para defectos del tubo neural deberán ingerir ácido fólico (4 miligramos/día los tres meses previos al embarazo y las primeras 12 semanas del desarrollo fetal). Por lo anterior en México se establecieron los principales alimentos consumidos en México ricos en acido fólico, los cuales se observan en la Tabla 4. Tabla 4. Principales fuentes de ácido fólico en alimentos consumidos en México. [Tomado de: Valor nutritivo de los alimentos de mayor consumo en México. México: Instituto Nacional de la Nutrición y Ciencias de la Salud “Salvador Zubirán”]. Alimento (100 gramos) Acido fólico (mg) Hígado de pollo. 738.0 Hígado de res. 248.0 Hígado de carnero. 220.0 berros 200.0Perejil. 183.0 Yema de huevo. 152.0 Cacahuate. 145.0 Lechuga. 136.0 Espinaca. 140.0 Almendras. 96.0 Acelgas. 90.0 Quelite. 85.0 Brócoli. 71.0 Coliflor. 67.0 Chícharo. 65.0 Aguacate. 62.0 Pan integral (trigo) 39.0 Plátano. 22.0 41 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Se ha determinado también que la concentración de folatos en eritrocitos varía de acuerdo al genotipo respecto a la variante C677T del gen MTHFR, mencionando que los homocigotos T677T presentan una acumulación de tetrahidrofolatos no reducidos, mientras que en los homocigotos C677C predomina la enzima 5- MTHF, por lo que la disminución de folatos está relacionada con la variante termolábil de la MTHFR , ligada a la disminución de folatos disponibles para las reacciones de metilación, que a su vez favorece la síntesis de purinas y pirimidinas [52]. 5.10. Mutaciones en MTHFR. Se han sido identificadas 34 mutaciones en el gen MTHFR en pacientes con homocistinuria, las cuales dan lugar a una menor actividad de la enzima MTHFR. De las 34 mutaciones de pueden clasificar como 8 sin sentido, 23 de sentido equivocado, 1 deleción y 2 variantes de “splicing” [3, 50, 51]. En la figura 6 se muestra la ubicación de las mutaciones. La mayoría de las mutaciones identificadas hasta la fecha están situadas en el extremo 5´de la secuencia codificante, que es la región de la que se piensa que codifica el dominio catalítico de la MTHFR. El análisis de las mutaciones ha sido útil para empezar a abordar los aspectos relativos a la relación existente entre la estructura y las propiedades funcionales de la enzima, así como para empezar a entender los diversos fenotipos en la deficiencia severa de la MTHFR. 42 Figura 6. La ubicación de las mutaciones en MTHFR, en el polipéptido y ADN. (Pares de bases se muestran a continuación de la proteína mientras se muestran los cambios de aminoácido por encima. Círculos rojos, mutaciones de Sentido equivocado; diamantes amarillos, mutaciones sin sentido; naranja triángulo apuntando hacia arriba, eliminación; triángulos azules hacia abajo, las mutaciones de empalme. Los polimorfismos en las posiciones 677 y 1298 aparecen en verde. [Tomado de: Madame Curie BioscienceDatabase. Landes Bioscience; 2000, NCBI Bookshelf.] ). “ D eterm in a ció n d el p o lim o rfism o C 6 6 7 T d el g en M T H F R en m a d res d e n iñ o s co n C A T V P y en m a d res d e n iñ o s sa n o s” 4 3 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 5.11. Polimorfismo MTHFR Un polimorfismo se define como las variaciones normales en la secuencia del ADN entre unos individuos a otros que superan el 1% de la población, los de mayor importancia en el gen MTHFR son C677T y A1298C ambos polimorfismos de un nucleótido SNP. Uno de los polimorfismos en estudio es el C677T del gen MTHFR, está localizado en el exón 4, más concretamente en la región que codifica la unión del folato, y consiste en un cambio de C por T en el nucleótido 677 del gen, lo que se traduce en un cambio de alanina por valina en la secuencia aminoacídica de la proteína. Los individuos homocigotos para esta variante muestran la enzima 5,10-MTHFR termolábil cuya actividad enzimática es aproximadamente de un 35% de la que presentan los individuos sin mutación, y que con lleva a una disminución en la síntesis de 5-metiltetrahidrofolato [2; 19]. Además, los portadores de dos alelos valina muestran una distribución anormal de los folatos en los eritrocitos y homocisteina [20]. La frecuencia del polimorfismo C677T es relativamente elevada alrededor del mundo [51] la prevalencia varía dependiendo la población estudiada. Se ha encontrado una mayor frecuencia en población Italiana (44 a 47%), en hispanos de Atlanta y California (41.1 y 42%), así como población de Francia y Japón (36 y 34% respectivamente). [54,55]. En población mexicana, el polimorfismo del gen MTHFR (677T) es más frecuente que en otras poblaciones: en el grupo étnico mestizo se presenta entre el 50 y 58%. Estudios de la población de Guadalajara reportan una frecuencia de 44% y en población de taraumaras de 34%. La frecuencia genotípica para el homocigoto TT ha sido reportada de 32 a 35.7%. Gueant-Rodriguez, et.al. 2006, realizaron estudios en 1277 adultos sanos de la Ciudad de México, Oeste de África, Francia e Italia se reportaron frecuencias alélicas y los resultados fueron para 677T de 9% en el Oeste de África, 36.1% en Francia, 47.3% en Italia y en la Ciudad de México 49%. 44 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” 6. Marco teórico. La participación de MTHFR en la enfermedad fue publicada inicialmente por Mudd y colaboradores. En 1972 [15], identificó a un paciente con homocistinuria debido a una grave deficiencia de la enzima. En 1988 Kang y colaboradores, identificaron una variante termolábil de la MTHFR, mediante ensayos enzimáticos de linfocitos en pacientes con enfermedades cardiovasculares, realizando mediciones antes y después del tratamiento térmico [16]. Este tipo de deficiencia de MTHFR, es el error innato del metabolismo de ácido fólico es muy común con herencia autosómica recesiva, resultando una leve a moderada elevación de homocisteína en plasma total. Rosenblentt [17], determinó como factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, encontrando la actividad óptima de la enzima, estableciendo que a elevadas temperaturas dicha enzima era menos estable a falta de FAD. Tras ser incubada la enzima a 55°C con una concentración adecuada de FAD, observaba la inactivación parcial de la enzima por 30 minutos, en fibroblastos controles y en pacientes era mayor la inactivación de la enzima. Las relaciones entre las deficiencias graves y leves fueron claras, sobre todo porque MTHFR termolábil también había observado en algunas familias con homocistinuria. En esos años las investigaciones de deficiencia MTHFR se limitaron a los laboratorios con experiencia en metodologías de genética bioquímica. El aislamiento del ADN en 1994 abrió vías de enfoques genéticos moleculares para estudiar las deficiencias MTHFR. Goyette P. et al [3], aisló el ADNc del gen MTHFR y determinaron nueve variantes de deficiencia enzimática severa a través de PCR y secuenciación en ese mismo año. En 1995 Frosst y colaboradores [2] identifican la más importante mutación C677T causada por la sustitución de la secuencia en la posición 677 del gen, una citosina por una timina, la cual produce un cambio de alanina por valina en la posición 222 de la secuencia de aminoácidos, que codifica la forma termolábil de la enzima. 45 “Determinación del polimorfismo C667T del gen MTHFR en madres de niños con CATVP y en madres de niños sanos” Esta alteración trae como consecuencia una reducción de hasta un 50% de la actividad específica de la MTHFR. La técnica empleada y estandarizada por Frosst determinó que dicho polimorfismo genera un sitio de restricción para la endonucleasa de restricción HinfI, lo que permitió obtener resultados más confiables y reducir costos al comparar la técnica con la secuenciación empleada por Goyette, este análisis sencillo agrupa a 3 posibles alelos CC alelo silvestre. CT alelo heterocigoto y TT alelo mutado, reduciendo la actividad enzimática de la enzima en 67%, 56% y 22%. Esta variante se reconoció como la causa genética más común de la hiperhomocisteinemia y se ha investigado ampliamente
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