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23/7/2022

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Biología

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FACULTAD DE QUÍMICA

Determinación de Valores de Referencia de Subpoblaciones
Linfocitarias en una Población Pediátrica del Hospital General Centro
Médico Nacional "La Raza"

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

QUÍMICA FARMACÉUTICO BIÓLOGA

PRESENTA

María del Carmen Ravelo Ochoa

CIUDAD UNIVERSITARIA, CD. MX. 2018

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

Margarita
Texto escrito a máquina
FACULTAD DE QUÍMICA

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Prof. Rodolfo Pastelín Palacios

VOCAL: Prof. Abel Gutiérrez Ramos

SECRETARIO: Prof. Mario Adán Moreno Eutimio

1er. SUPLENTE: Prof. Tania Angélica Ramírez Palma

2º. SUPLENTE: Prof. Enrique De León Lara

SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:

Laboratorio de Hematología Especial, Hospital General Centro Médico Nacional
"La Raza". Ciudad de México.

ASESOR DEL TEMA:
Rodolfo Pastelín Palacios __________________
FIRMA

SUPERVISOR TÉCNICO:
Juana Wendy Aguilera Caldera __________________
FIRMA

SUSTENTANTE:
María del Carmen Ravelo Ochoa __________________
FIRMA

1. INDICE
2. INTRODUCCIÓN. 2
2.1. OBJETIVOS. 3
2.2. HIPÓTESIS. 3
3. ANTECEDENTES. 4
3.1. Valores de Referencia Biológicos 4
3.1.1. Definición de la población y selección de los individuos de
Referencia.
5
3.1.2. Criterios de partición. 6
3.1.3. Tamaño de la muestra de referencia. 7
3.1.4. Eliminación de valores aberrantes. 7
3.1.5. Determinación de los límites de referencia biológicos. 7
3.1.6. Adopción de intervalos de referencia biológicos. 9
3.2. Linfocitos. 10
3.2.1. Componentes del Sistema Inmunitario Adaptativo. 11
3.2.1.1. Linfocitos T cooperadores y Linfocitos T citotóxicos. 13
3.2.1.2. Funciones de los Linfocitos T CD4+. 15
3.2.1.3. Funciones de los Linfocitos T CD8+. 16
3.2.2. Linfocitos Citolíticos Naturales (NK). 20
3.2.2.1. Funciones de las Células NK. 21
3.3. Inmunodeficiencias. 22
3.3.1. Inmunodeficiencias congénitas o primarias. 24
3.3.1.1. Defectos en la inmunidad innata. 24
3.3.1.2. Inmunodeficiencias combinadas graves. 25
3.3.1.3. Deficiencias de anticuerpos. 26
3.3.1.4. Defectos en la activación y función del linfocito T. 26
3.3.2. Inmunodeficiencias adquiridas o secundarias. 27
3.3.2.1. Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH). 28
3.4. Citometría de flujo. 30
3.4.1. Fluorocromos. 31
3.4.2. Componentes del citómetro de flujo. 35
3.4.2.1. Sistema de flujo celular. 36
3.4.2.2. Sistema óptico. 37
3.4.2.3. Sistema electrónico. 39
3.4.2.4. Unidad de procesamiento e interpretación de datos. 39
3.4.3. Citometría de Flujo y VIH. 42
4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL. 43
4.1. Población estudiada. 43
4.2. Procesamiento de las muestras. 43
4.3. Diagrama de Flujo. 53
5. RESULTADOS 54
6. DISCUSION 58
7. CONCLUSIÓN. 60
8. BIBLIOGRAFIA. 61
9. APENDICE. 64

"Determinación de Valores de Referencia de Subpoblaciones Linfocitarias en
una Población Pediátrica del Hospital General Centro Médico Nacional La
Raza"
2. INTRODUCCIÓN.
La cuantificación de los subconjuntos de linfocitos sanguíneos es una herramienta
básica en el proceso de diagnóstico de inmunodeficiencias primarias, sin embargo,
la exactitud de este proceso en niños depende mucho de la disponibilidad de
intervalos de referencia relacionados con la edad, pues el recuento absoluto y
relativo de subconjuntos de linfocitos varía mucho según la edad.
Este estudio se realizó en muestras de sangre periférica de un total de 186 niños
sanos de ambos sexos residentes de la región noreste de la Ciudad de México y
zona conurbada, atendidos en el Hospital General del Centro Médico Nacional "La
Raza". El rango de edad fue de 0 meses a 192 meses (16 años), divididos en 5
grupos, de los cuales 94 niños contaban con 3 años de edad o menos y 92 niños
eran mayores de 3 años de edad. Todos eran individuos en buen estado de salud.
Todas las muestras se tiñeron con anticuerpos monoclonales, se procesaron con
una técnica de lisis de sangre completa y fueron analizadas por citometría de flujo
de 4 colores a 10,000 eventos. Se analizó la distribución de las poblaciones
estudiadas para conocer si presentan un comportamiento dentro de la normalidad
mediante datos de asimetría y curtosis. Se obtuvieron los valores absolutos y
relativos de las diferentes subpoblaciones linfocitarias y los valores de referencia
se establecieron tomando en cuenta la mediana y los percentiles 2.5 y 97.5
obtenidos.
Para la mayoría de las poblaciones linfocitarias los cambios más significativos se
observaron a los 3 años de edad.
Los números absolutos de las distintas poblaciones se muestran inicialmente altos
en los primeros 3 años de vida y después su reducción es ligera hasta pasados los
6 años de edad, donde inicia una recuperación y estabilidad en sus valores.
Se encontró que la variación en los tamaños relativos de las poblaciones de
células individuales no era directamente compatible con la variación en los
recuentos absolutos, pues mientras los primeros tienden a incrementarse, los
segundos tienden a disminuir.

No se observa una correlación significativa entre el porcentaje relativo de los
subgrupos de linfocitos y la edad, pero esto no significa que ambos parámetros
sean independientes entre sí.
Se establecieron los valores de referencia de las subpoblaciones linfocitarias
CD3+, CD4+, CD8+, relación CD4+/CD8+, CD19+ y NK (CD16+56+), utilizando
resultados obtenidos en el periodo de tiempo 2010-2015.
Los intervalos de referencia de los subgrupos de linfocitos ajustados por edad
deben utilizarse para la evaluación clínica y el tratamiento adecuados de los
pacientes pediátricos y pueden ser una herramienta útil al proporcionar al médico
valores de relevancia clínica para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades
del sistema inmunológico.
2.1. OBJETIVOS.
 General: Establecer los valores de referencia de las subpoblaciones
linfocitarias CD3+, CD4+, CD8+, relación CD4+/CD8+, CD19+ y NK.
 Particulares:
a) Realizar el análisis estadístico de los resultados de estudios realizados a
pacientes en el periodo 2010-2015.
b) Establecer dichos valores de referencia para una población pediátrica de
la región noreste de la Ciudad de México y zona conurbada, que son
atendidos en el Hospital General Centro Médico Nacional "La Raza".

2.2. HIPÓTESIS.
Los valores de referencia para las subpoblaciones linfocitarias en una población
pediátrica están directamente relacionados con la edad y solo serán deutilidad
diagnóstica para las unidades médicas que apliquen la misma metodología para
su establecimiento.

3. ANTECEDENTES.
En la labor clínica cotidiana se realizan determinaciones analíticas
complementarias a solicitud del médico, para evidenciar el estado de salud de un
paciente y confirmar o descartar un diagnóstico. Esto implica el estudio de
distintas muestras biológicas que son procesadas mediante diversos métodos, en
busca de un resultado particular y objetivo. Dicho resultado puede ser cuantitativo
o cualitativo.
Para poder interpretar el resultado de una magnitud biológica de un paciente es
importante conocer uno o más valores de esa magnitud medidos en individuos
similares y compararlos. Debido a esta necesidad surge el concepto de valor de
referencia biológico.

3.1. Valores de Referencia Biológicos 1.
Un valor de referencia biológico es un valor medido de una magnitud particular
obtenido con fines comparativos en un individuo de referencia que cumple con
ciertos requisitos preestablecidos. Estos requisitos dependerán de la finalidad de
los valores de referencia biológicos; así, pueden existir valores de referencia
biológicos de individuos sanos o con alguna enfermedad concreta. Lo importante
es definir detalladamente al grupo estudiado. Sin embargo, los más usados son
los correspondientes a individuos presuntamente sanos. Los valores de referencia
biológicos dependen, obviamente, de la población de referencia. Esto es
importante, ya que cierta magnitud biológica en individuos sanos de una región
geográfica será diferente de la observada en individuos sanos de otra región. Los
valores de referencia biológicos de dicha magnitud biológica dependen del
procedimiento empleado para la medida de la misma. Esto implica que cada
procedimiento aplicado conduce a un resultado diferente. Así, los intervalos de
referencia biológicos que aparecen en diversas publicaciones no deben utilizarse
con fines diagnósticos. Sólo pueden utilizarse aquéllos donde se describa la
población de referencia y el procedimiento de medida utilizado, siempre y cuando,

1 International Federation of Clinical Chemistry, International Committee for Standardization in Haematology.
Approved recommendation (1987) on the theory of reference values. Part 1. The concept of reference values. J
Clin Chem Clin Biochem 1987;25:337-342.

tanto la población como el procedimiento de medida coincidan con los que afectan
al paciente en estudio.
Con fines diagnósticos una magnitud biológica determinada en un paciente se
debe comparar con los límites de referencia biológicos propios del laboratorio que
ha efectuado la medición en cuestión. Los intervalos de referencia pueden
obtenerse a partir de valores de referencia producidos por el propio laboratorio, o
formando parte de un equipo de varios laboratorios. Si no dispone de intervalos de
referencia propios, puede utilizar ajenos sólo después de validarlos en el propio
laboratorio.
La Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) ha elaborado
recomendaciones para la producción de valores de referencia biológicos
poblacionales.
De acuerdo a esto, es necesario disponer de un procedimiento de medida de
calidad y de un procedimiento de obtención, traslado y manipulación de muestras
normalizado que evite la variabilidad previa a la medición de la magnitud en
estudio. Por otro lado, deben conocerse los factores de variabilidad biológica que
ayudarán a definir los criterios de exclusión y partición. Los criterios de exclusión
servirán para que en la muestra de referencia no exista variabilidad iatrogénica
(debida a tratamientos farmacológicos) ni variabilidad patológica, mientras que los
criterios de partición permitirán la selección de individuos de referencia que formen
grupos en los que la variabilidad biológica sea mínima.

3.1.1. Definición de la población y selección de los individuos de
referencia2,3.
Para seleccionar los individuos de referencia es necesario que se haya definido
explícitamente la población de referencia. Para lo anterior se debe especificar el
estado de salud y las propiedades biológicas que más influyen en los valores de

2 International Federation of Clinical Chemistry, International Committee for Standardization in Haematology.
Approved recommendation (1987) on the theory of reference values. Part 2. Selection of individua los for the
production of reference values. J Clin Chem Clin Biochem 1987;25:639-644.

3 International Federation of Clinical Chemistry, International Committee for Standardization in Haematology.
Approved recommendation (1987) on the theory of reference values. Part 5. Stistical treatment of collected
reference values. Determination of reference limits. J Clin Chem Clin Biochem 1987;25:645-656.

las magnitudes biológicas, como el sexo, la edad o la raza, que podrán implicar la
división de la población de referencia. También deben especificarse claramente
cuáles son los criterios de exclusión más frecuentes: enfermedades antiguas o
recientes, embarazo, lactancia, consumo de alcohol, tabaquismo, administración
de medicamentos, consumo de drogas, hipertensión, dietas especiales, obesidad,
ingesta reciente de alimentos, ejercicio intenso reciente.

3.1.2. Criterios de partición.
Los factores que deben tenerse más en cuenta para el establecimiento de
particiones son: ayuno, dieta, edad, ejercicio, fase del ciclo menstrual, grupo
sanguíneo, hora de la obtención del espécimen, localización geográfica, origen
étnico, ritmo circadiano, sexo, tabaquismo, tiempo de embarazo. Pero en la
práctica, para cada magnitud biológica, sólo hay que tener en cuenta aquellos
factores de variación de los que se sabe por la bibliografía que son lo
suficientemente importantes como para dar lugar a particiones.
E. K. Harris y J.C. Boyd describieron un método estadístico que ayuda a tomar la
decisión de establecer una partición. Este método se aplica a dos grupos de
valores de referencia biológicos con el mismo número de datos (60 o más cada
uno) para decidir si deben mantenerse separados o pueden mezclarse. El método
utiliza dos criterios, el segundo de los cuales se aplica según el resultado de
aplicar el primero:
Primer criterio: Si el cociente entre las desviaciones estándar de cada grupo,
usando la mayor de ellas como numerador, es superior a 1.5 es aconsejable
mantener separados los dos grupos.
Segundo criterio: Si el cociente anterior es igual o menor a 1.5 se deben calcular
los parámetros estadísticos
z = √( x 2 – x 1)n /√(s22 + s21) y z* = 3√(n/120)
donde z y z* son los parámetros estadísticos que deben calcularse para la prueba,
x 2 y x 1 son las medias de los dos grupos, s21 y s22 las varianzas de los dos
grupos y n el número de datos de ambos grupos. Entonces, si z > z* es
aconsejable mantener separados los dos grupos.

3.1.3. Tamaño de la muestra de referencia.
Para la determinación de los límites de referencia biológicos se usan distintos
métodos estadísticos dependiendo de que la distribución de los valores de
referencia biológicos, o de alguna transformación matemática de los mismos, siga
la ley de Laplace-Gauss (método paramétrico) o no la siga (método no
paramétrico). Cuando se utiliza el método paramétrico, el número de individuos de
referencia de cada grupo homogéneo debe ser de 30 como mínimo, pero si se
utiliza el método no paramétrico, 120 es el número mínimo. En cualquier caso, a
mayor número de valores de referencia biológicos (no aberrantes) obtenidos,
mejor será la estimación del intervalo de referencia.
Si se debe aplicar el método de Harris y Boyd para decidir si hay que hacer alguna
partición, entonces el mínimo devalores (no aberrantes) pasa de 30 a 60 por cada
partición.

3.1.4. Eliminación de valores aberrantes.
Una vez obtenidos los valores de referencia biológicos hay que eliminar los
valores aberrantes existentes. Un valor aberrante es un valor muy alto o muy bajo
que se encuentra fuera de un intervalo de tolerancia definido para todos los
valores del conjunto.
Para la detección de valores aberrantes se pueden utilizar métodos estadísticos
simples y efectivos, como la modificación del método de Dixon:
En una serie de resultados ordenados de menor a mayor se considera que
xn es aberrante si xn – xn-1 > (xn – x1)/3 y x1 es aberrante si x2 – x1 = (xn – x1)/3.

3.1.5. Determinación de los límites de referencia biológicos.
Existen varias pruebas estadísticas para verificar si un conjunto de valores de
referencia biológicos se distribuye siguiendo la ley de Laplace-Gauss. De acuerdo
a la IFCC se considera que una de las más adecuadas es la de Anderson-
Darling, cuando se aplica para probar si un conjunto de datos siguen una
distribución normal y por lo tanto detectar desviaciones de la normalidad.
Los límites de referencia biológicos poblacionales son los valores extremos del
intervalo de referencia que comprende generalmente el 95% central de todos los

valores de referencia biológicos; es decir los límites de referencia biológicos
poblacionales son los percentiles 2.5 y 97.5 de los valores de referencia
biológicos. Estos percentiles se calculan dependiendo de si la distribución de los
valores de referencia biológicos, o una transformación matemática de los mismos,
sigue o no la ley de Laplace-Gauss: si sigue la ley se aplica un método
paramétrico; si no la sigue se aplica un el método no paramétrico.

Estimación paramétrica.
La estimación paramétrica de los percentiles 2.5 y 97.5 se basa en la propiedad
que tiene la distribución de Laplace-Gauss de que x - 1,96s y x + 1,96s coinciden
con los percentiles mencionados. Así, cuando la distribución de los valores de
referencia biológicos, o los de una transformación matemática de los mismos,
sigue la ley de Laplace-Gauss, el cálculo de los límites de referencia biológicos se
limita al cálculo de la x y la s de los valores de referencia biológicos, después de
eliminar los valores aberrantes existentes. En el caso de los valores de referencia
biológicos transformados matemáticamente (logaritmos, raíces, etc.), una vez
obtenidos los límites de referencia biológicos de los mismos, deben ser
reconvertidos (antilogaritmos, cuadrados, etc.).

Estimación no paramétrica.
Si los valores de referencia biológicos, o sus transformaciones matemáticas, no
siguen la ley de Laplace-Gauss, se debe recurrir a la estimación no paramétrica de
los percentiles 2.5 y 97.5, utilizando para ello un mínimo de 120 datos. Este
cálculo se realiza ordenando los valores de referencia biológicos y tomando el
valor con número de orden igual a 0,025(n+1), correspondiente al percentil 2.5, y
el valor con número de orden igual a 0,975(n+1), correspondiente al percentil 97.5.

3.1.6. Adopción de intervalos de referencia biológicos4.
Son pocos los laboratorios clínicos que producen sus propios valores de referencia
biológicos para cada magnitud. Esto se debe principalmente a que es difícil
conseguir voluntarios que sirvan como individuos de referencia y al elevado costo
económico propio de las mediciones utilizadas para la producción de valores de
referencia biológicos. En estos casos, los laboratorios por lo general adoptan
límites de referencia biológicos obtenidos por otros laboratorios, aunque esta
adopción sólo debería realizarse al validar esos límites.
Por otro lado, en el laboratorio clínico es frecuente tener que comparar dos
procedimientos de medida de una misma magnitud para saber si los resultados
generados por ambos procedimientos son intercambiables, lo que implicaría que
intervalos de referencia biológicos estimados con un procedimiento sirvan para el
otro, es decir, sean transferibles.
El proceso para validar o rechazar un intervalo de referencia adoptado y demostrar
su transferibilidad, se desarrolla de acuerdo a dos casos generales:
Se seleccionan 20 individuos de referencia y se realizan las mediciones que
convengan (por ejemplo, se pueden utilizar los resultados de trabajadores del
laboratorio sometidos a una revisión de medicina preventiva):
Si 2 o menos resultados están fuera del intervalo de referencia biológico
candidato, este intervalo puede adoptarse.
Si 2 o más resultados están fuera del intervalo de referencia biológico candidato,
deben obtenerse 20 nuevos valores en otros 20 individuos de referencia diferentes
a los primeros.
Si de estos nuevos 20 resultados, 2 o menos resultados están fuera del intervalo
de referencia biológico candidato, este intervalo puede adoptarse; en caso
contrario, el intervalo de referencia biológico candidato debe rechazarse.

4 International Federation of Clinical Chemistry, International Committee for Standardization in Haematology.
Approved recommendation (1987) on the theory of reference values. Part 6. Presentation of observed values
related to reference values. J Clin Chem Clin Biochem 1987;25:657-662.

3.2. Linfocitos5.
Inmunidad Innata y Adaptativa.
La defensa contra los microorganismos está mediada por las reacciones
tempranas de la inmunidad innata y las respuestas tardías de la inmunidad
adaptativa. La inmunidad innata (también llamada inmunidad natural o nativa) es
la primera línea de defensa contra los microorganismos. Se conforma por
mecanismos de defensa celulares y bioquímicos que existen antes de la infección
y que pueden responder con rapidez a ella. Estos mecanismos reaccionan con los
productos de los microorganismos y de las células dañadas, y responden de una
forma prácticamente idéntica a infecciones recurrentes. Los principales
componentes de la inmunidad innata son:
1. Barreras físicas y químicas, como el epitelio y las sustancias químicas
antimicrobianas producidas en las superficies epiteliales.
2. Células fagocíticas (neutrófilos, macrófagos), células dendríticas y linfocitos
citolíticos naturales (NK) y otras células linfocíticas innatas.
3. Proteínas sanguíneas, sistema del complemento y otros intermediarios de
la inflamación.
Existen otras respuestas inmunitarias estimuladas por la exposición a
microorganismos infecciosos que aumentan en magnitud y capacidades
defensivas con cada exposición sucesiva a un microoganismo en particular.
Debido a que esta forma de inmunidad surge como respuesta a la infección y se
adapta a ella, se le llama inmunidad adaptativa. El sistema inmunitario adaptativo
reconoce un gran número de sustancias microbianas y no microbianas y reacciona
frente a ellas. Las características que definen la inmunidad adaptativa son la
capacidad de distinguir diferentes sustancias, lo que se llama especificidad, y la
capacidad de responder de forma más intensa a exposiciones repetidas al mismo
microoganismo, lo que se conoce como memoria. Los únicos componentes de la
inmunidad adaptativa son las células llamadas linfocitos y algunos de sus
productos de secreción, los anticuerpos.

5 ABBAS, Abul K. "Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015).
Pags.2-24, 63-69, 213-220, 231-238.

Las respuestas inmunitarias adaptativas actúan potenciando los mecanismos
protectores de la inmunidad innata, lo que las hace más eficaces al combatir a los
microoganismos patógenos.

Inmunidad Humoral y Celular.
Existen dos tipos de respuestas inmunitarias adaptativas, llamadas inmunidad
humoral e inmunidad celular, en las que intervienen componentes diferentesdel
sistema inmunitario y que sirven para eliminar microoganismos de distintos tipos.
La inmunidad humoral la conforman moléculas presentes en la sangre y en las
secreciones mucosas, que reciben el nombre de anticuerpos, producidas por las
células llamadas linfocitos B. Los anticuerpos reconocen los antígenos
microbianos y los marcan para su eliminación por varios mecanismos. La
inmunidad humoral es el principal mecanismo de defensa contra los
microoganismos extracelulares y sus toxinas, debido a que los anticuerpos
pueden unirse a ellos y contribuir a su destrucción mediante diversos mecanismos
(mecanismos efectores). Por ejemplo, algunos anticuerpos favorecen la fagocitosis
de los microorganismos por las células del anfitrión, mientras que otros se fijan a
ellos y desencadenan la liberación celular de los intermediarios de la inflamación.
La inmunidad celular es representada por los linfocitos T. Los microoganismos
intracelulares, como los virus y algunas bacterias, sobreviven y proliferan en el
interior de los fagocitos y de otras células del anfitrión, donde los anticuerpos
circulantes no los tienen a su alcance. La defensa contra estas infecciones
corresponde a la inmunidad celular, que fomenta la destrucción de los
microorganismos residentes en los fagocitos o la eliminación de las células
infectadas para suprimir los reservorios de la infección.

3.2.1. Componentes del Sistema Inmunitario Adaptativo.
Las principales células del sistema inmunitario adaptativo son los linfocitos, las
células presentadoras de antígenos y las células efectoras. Los linfocitos son las
células que reconocen los antígenos extraños de manera específica y responden
contra ellos. Existen diferentes subpoblaciones que difieren en sus funciones y en
la forma en que reconocen a los antígenos. Los linfocitos B son las únicas células

capaces de producir anticuerpos. Reconocen antígenos solubles extracelulares y
de la superficie celular. Los linfocitos T, reconocen los antígenos de los
microorganismos intracelulares y sirven para destruir a estos o a las células
infectadas. Los linfocitos T no producen moléculas de anticuerpo. Los linfocitos T
presentan una especificidad restringida hacia los antígenos; reconocen péptidos
derivados de proteínas extrañas que están unidas a proteínas propias llamadas
moléculas del complejo principal de histocompatibilidad o MHC (que están
especializadas en la presentación de péptidos al sistema inmunitario adaptativo),
que se expresan en las superficies de otras células. Como resultado de ello, estos
linfocitos T reconocen y responden a antígenos asociados a la superficie celular.
Los linfocitos se encuentran concentrados en unos órganos linfáticos
independientes anatómicamente, donde interaccionan entre sí para iniciar las
respuestas inmunitarias. Los linfocitos también están presentes en la sangre y,
desde ella, pueden volver a circular por los tejidos linfáticos y asentarse en lugares
de la periferia expuestos a los antígenos para proceder a su eliminación.
Los linfocitos son las únicas células del cuerpo que expresan receptores
específicos frente a un determinante antigénico diferente. Cada clon de linfocitos T
y B expresa receptores para el antígeno con una sola especificidad, que es
diferente de las especificidades de los receptores de todos los demás clones. Por
lo tanto, hay millones de clones de linfocitos en el cuerpo, que posibilitan que el
organismo reconozca y responda a millones de antígenos extraños.
El número total de linfocitos en un adulto sano es de 5 X 1011. De ellos,
aproximadamente el 2% están en la sangre, 4% en la piel, 10% en la médula
ósea, 15% en los tejidos linfáticos mucosos de las vías digestiva y respiratoria y
65% en los órganos linfáticos (principalmente en el bazo y los ganglios linfáticos).
Los linfocitos vírgenes son linfocitos T o B maduros que se encuentran en los
órganos linfáticos periféricos y en la circulación, y que nunca se han encontrado
con un antígeno extraño (o sea, estas células carecen de experiencia inmunitaria
porque no han estado en contacto con el antígeno). Los linfocitos vírgenes suelen
morir 1 a 3 meses después si no reconocen antígenos.
Las citocinas (proteínas que regulan la función de las células que las producen
sobre otros tipos de células) son esenciales para la supervivencia de los linfocitos
https://es.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
https://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

vírgenes, y los linfocitos T vírgenes expresan receptores para estas citocinas. La
más importante de estas citocinas es la interleucina 7 (IL-7).
Los linfocitos T constan de poblaciones con funciones diferentes, entre ellas, las
mejor definidas son las de los linfocitos T cooperadores y los linfocitos T
citotóxicos (o citolíticos) (CTL, del inglés cytotoxic T lymphocyte).

Fig. 3.1. Resumen de las funciones principales de los linfocitos T. Tomada y modificada de
ABBAS, Abul K. "Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders,
España (2015). Pág. 8.

3.2.1.1. Linfocitos T cooperadores y Linfocitos T citotóxicos.
Después de activarse los linfocitos vírgenes, se hacen más grandes y comienzan
a proliferar. Algunas de estas células se diferencian en linfocitos efectores, que
producen moléculas capaces de eliminar antígenos extraños. Los linfocitos T
efectores son los linfocitos cooperadores y los CTL. Los linfocitos T cooperadores,
que por lo general son CD4+, expresan moléculas de superficie, como el ligando
CD40 (CD154), y secretan citocinas que se unen a los receptores en los
macrófagos y los activa. Los CTL tienen gránulos citoplasmáticos llenos de
proteínas que, cuando se liberan, matan a las células que los CTL reconocen, que
suelen ser células infectadas por virus y tumorales. La mayoría de los linfocitos T
efectores diferenciados viven poco tiempo y no se autorrenuevan.

Los linfocitos T, surgen de la médula ósea, migran al timo y maduran allí (linfocitos
T se refiere a linfocitos derivados del timo).
Los dos principales subgrupos de linfocitos T son los linfocitos T cooperadores
CD4+ y los CTL CD8+, que expresan receptores para el antígeno llamados
receptores (αβ) del linfocito T (TCR, del inglés T cell receptor) y actúan como
intermediarios de la inmunidad celular.
El TCR de los linfocitos T CD4+ cooperadores y de los linfocitos T citotóxicos
(CTL) CD8+ es un heterodímero conformado por dos cadenas polipeptídicas
transmembranales, designado TCR α y β, unidas entre sí de forma covalente por
un enlace disulfuro. Estos linfocitos T se llaman linfocitos T αβ.
Las proteínas CD3 se asocian de forma no covalente al heterodímero αβ del TCR
para formar el complejo TCR:CD3 y, cuando el TCR reconoce al antígeno, estas
proteínas asociadas traducen las señales que llevan a la activación del linfocito T.
Por lo tanto la función de las proteínas CD3 es transmisora de señales y no de
reconocimiento del antígeno. Las proteínas CD3 son necesarias para la expresión
en la superficie del linfocito T del complejo receptor completo. Son moléculas
accesorias.
La expresión de varias proteínas de membrana se utiliza para distinguir las
diferentes poblaciones de linfocitos (tabla 3.1). Por ejemplo, la mayoría de los
linfocitos T cooperadores expresan una proteína de superficie llamada CD4 y la
mayoría de los CTL expresan una proteína de superficie diferente llamada CD8. A
estas y a otras proteínas de superficie se las llama marcadores, porque identifican
poblaciones celulares diferentes.
La nomenclatura de los cúmulos (o grupos) de diferenciación (CD, del inglés
cluster of differentiation) es un método adoptado para nombrar las moléculas de la
superficie celular que son características de una línea celular en particular o de un
estadio de diferenciación, tienen una estructura definida y son reconocidaspor un
grupo de anticuerpos monoclonales (anticuerpos marcados y específicos a una
molécula). Así, todas las moléculas de superficie con una estructura bien definida
reciben un número CD (por ejemplo, CD1, CD2, etc.).

Tabla 3.1. Clases de Linfocitos T. Tomada y modificada de ABBAS, Abul K. "Inmunología
Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015). Pág. 19.

3.2.1.2. Funciones de los Linfocitos T CD4+.
Las funciones de los linfocitos T efectores CD4+ son activar a los fagocitos
(macrófagos y neutrófilos) y otros leucocitos para que destruyan a los
microoganismos intracelulares y algunos extracelulares.
Algunos linfocitos T CD4+ activan a otras células diferentes a los fagocitos, como
los eosinófilos, para que destruyan tipos particulares de microoganismos.
Los linfocitos T reconocen específicamente a los antígenos microbianos, pero son
los fagocitos (leucocitos activados por este reconocimiento) los que destruyen
realmente a los microorganismos patógenos. Este concepto procede de estudios
realizados sobre la inmunidad celular frente a la bacteria intracelular Listeria
monocytogenes.
Los linfocitos T efectores CD4+ activan a los fagocitos a través de moléculas de la
superficie, principalmente el ligando del CD40, y de citocinas secretadas.
La inflamación, que consiste en la activación de leucocitos, forma parte de muchas
de las reacciones de los linfocitos T CD4+ y puede dañar los tejidos normales
(figura 3.2).

Fig. 3.2. Funciones de los Linfocitos T CD4+. Tomada y modificada de ABBAS, Abul K.
"Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015).
Pág. 214.

La principal población efectora de linfocitos T mediada por los fagocitos es el TH1.
La diferenciación TH1 está dirigida principalmente por las citocinas IL-12 y el IFN-
gamma y en respuesta a bacterias intracelulares, micobacterias, virus y algunos
parásitos, como Leishmania; todos los cuales infectan a las células dendríticas, los
macrófagos y los linfocitos NK.

3.2.1.3. Funciones de los Linfocitos T CD8+.
Los virus no pueden destruirse si las células infectadas no tienen mecanismos
microbicidas propios o si los virus están en el citosol donde son inaccesibles para
estos mecanismos. En estas situaciones, la única forma de eliminar la infección es
matar a las células infectadas, sacar al virus de su hogar y lograr que sea incapaz
de sobrevivir y replicarse. Esta función está mediada por los linfocitos T citotóxicos
CD8+ (CTL), los linfocitos efectores de la línea CD8+.
Dentro del citoplasma de los CTL hay numerosos lisosomas modificados
(llamados gránulos) que contienen proteínas, incluidas la perforina y las
granzimas, cuya función es matar a otras células. Además, los CTL son capaces
de secretar citocinas, sobre todo IFN-gamma, que activan a los fagocitos.

La vía de la clase I del MHC de presentación del antígeno a los linfocitos T CD8+
necesita que los antígenos proteínicos estén presentes en el citosol de las células
infectadas para que estas proteínas puedan degradarse en los proteasomas.
Las células dendríticas especializadas ingieren células infectadas, transfieren los
antígenos proteínicos al citosol y procesan los antígenos para que entren en la vía
de la clase I del MHC de presentación del antígeno para su reconocimiento por los
linfocitos T CD8+.
Los linfocitos T cooperadores pueden secretar citocinas que estimulan la
diferenciación de los linfocitos T CD8+.
La IL-2 promueve la proliferación y diferenciación de los linfocitos T CD8+ en CTL
y linfocitos de memoria. La IL-15 es importante para la supervivencia de los
linfocitos CD8+ memoria.
Estas citocinas pueden producirlas diferentes poblaciones de células dendríticas
durante la respuesta inmunitaria innata a las infecciones víricas y algunas
bacterianas.
Los linfocitos T cooperadores activados expresan el ligando del CD40 (CD40L),
que puede unirse al CD40 en las células dendríticas cargadas con el antígeno.
Esta interacción las activa para que sean más eficientes estimulando la
diferenciación de los linfocitos T CD8+
La falta de la función cooperadora del linfocito T CD4+ es la explicación aceptada
de los defectos en la generación de CTL en individuos infectados por el VIH, que
infecta y elimina solo a los linfocitos T CD4+.
Además de la muerte celular directa, los linfocitos T CD8+ secretan IFN-gamma y
así ayudan a la activación clásica del macrófago en la defensa del anfitrión.
Los CTL matan a las células diana que expresan el mismo antígeno asociado a la
clase I del MHC que desencadenó la proliferación y diferenciación de los linfocitos
T CD8+ vírgenes y no matan a las células no infectadas que no expresan este
antígeno.
El proceso es muy específico porque se produce una "sinapsis", en el lugar de
contacto entre el CTL y la célula que expresa el antígeno. Así, las moléculas que
ejecutan la acción se secretan en la sinapsis y no pueden difundirse a las células
cercanas.

Una vez que los linfocitos T CD8+ específicos frente a un antígeno se han
diferenciado en CTL completamente funcionales, pueden matar a cualquier célula
nucleada que presente ese antígeno sin la intervención de las citocinas o
coestimuladores que fueron necesarios para su diferenciación en CTL.
La muerte de la célula diana se produce durante las 2 a 6 horas siguientes al
reconocimiento del antígeno y procede incluso cuando el CTL se ha desprendido.
El principal mecanismo de la muerte de la célula diana promovida por el CTL es la
liberación de proteínas citotóxicas almacenadas en los gránulos citoplasmáticos
(también llamados lisosomas secretores) en la célula diana, lo que desencadena
la apoptosis de la célula diana.

Granzimas y Perforina.
Las principales proteínas citotóxicas en los gránulos del CTL (y de los linfocitos
NK) son las granzimas y la perforina. Las granzimas A, B y C son serina-
proteasas. La granzima B corta o separa las proteínas después de los residuos as-
partato y es la única necesaria para la citotoxicidad del CTL en vivo. Puede activar
a caspasas (proteínas cisteín-proteasas que también cortan al nivel de un residuo
aspartato) que inducen la muerte celular. La perforina es una molécula que afecta
la membrana y es similar a la proteína del complemento C9. Los gránulos también
contienen la serglicina, que sirve para ensamblar un complejo que contiene
granzimas y perforina.
La principal función de la perforina es facilitar la liberación de las granzimas en el
citosol de la célula diana. La perforina puede polimerizarse y formar poros acuosos
en la membrana de la célula diana.
Los complejos de granzima B, perforina y serglicina se colocan sobre la célula
diana y la inserción de la perforina en su membrana desencadena un proceso de
reparación de la membrana, lo que ayuda a que se introduzca la perforina y las
granzimas en los endosomas. La perforina actúa sobre la membrana del
endosoma y facilita la liberación de las granzimas en el citosol de la célula diana.
En el citosol, las granzimas cortan o separan varios sustratos e inician la muerte
de la célula por apoptosis.

Ligando de Fas.
Los CTL también usan un mecanismo que se lleva a cabo por interacciones de
moléculas de membrana del CTL y de las células diana. Una vez activados, los
CTL expresan una proteína de membrana llamada ligando de Fas (FasL) que se
une al receptor Fas, que se expresa en muchos tipos de células. Esta interacción
provoca la apoptosis de las células que expresan Fas y también da lugar a la
activación de las caspasas (figura 3.3).

Fig. 3.3. Funciones de los Linfocitos T CD8+ (CTL). Tomada y modificada de ABBAS, Abul K.
"Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015).
Pág. 237.

La destrucción de lascélulas infectadas por los CTL es una causa de lesión tisular
en algunas enfermedades infecciosas. Por ejemplo, en la infección por los virus de
las hepatitis B y C, los hepatocitos infectados mueren por la respuesta de los CTL

y los linfocitos NK del anfitrión y no por el virus. Estos virus no dañan a la célula,
pero el anfitrión detecta el microoganismo infeccioso y reacciona contra él, y no es
capaz de distinguir los microoganismos perjudiciales de los relativamente inocuos.

3.2.2. Linfocitos Citolíticos Naturales (NK).
Las células linfocíticas innatas (ILC, del inglés innate lymphoid cells) comprenden
varios subgrupos de células que derivan de la médula ósea, tienen funciones
efectoras similares a las de los linfocitos T, pero que carecen de los receptores
TCR del linfocito T. Las principales funciones de las ILC son proporcionar una
defensa temprana contra los microorganismos patógenos infecciosos, reconocer
células estresadas y dañadas del anfitrión y ayudar a eliminarlas.
Las primeras células linfocíticas innatas son los linfocitos citolíticos naturales (NK,
del inglés natural killer), que matan a las células infectadas y dañadas y secretan
IFN-gamma.
Estas células surgen totalmente capaces de realizar funciones efectoras sin
necesidad de expansión clonal ni diferenciación. Las ILC usan mecanismos
efectores que comparten con los linfocitos T, como la capacidad de producir varias
citocinas y realizan funciones importantes en las respuestas inmunitarias innatas
sobre todo contra virus y bacterias intracelulares. El término citolítico natural deriva
del hecho de que su principal función es matar a las células infectadas, como
hacen los linfocitos T citotóxicos (CTL) y están listos para hacerlo una vez que se
desarrollan, sin una mayor diferenciación (por ello son naturales). Los linfocitos NK
conforman el 5-15% de las células mononucleares de la sangre y el bazo y
abundan más en órganos como el hígado y el útero grávido. Los linfocitos NK de
la sangre aparecen como linfocitos grandes con numerosos gránulos
citoplasmáticos. Pueden identificarse en la sangre por la expresión del marcador
CD56 y la falta del marcador CD3. La mayoría de los linfocitos NK sanguíneos
también expresan CD16, que participa en el reconocimiento de las células
cubiertas de anticuerpos.

3.2.2.1. Funciones de las Células NK.
Las funciones efectoras de los linfocitos NK son matar a las células infectadas y
producir IFN-gamma, que activa a los macrófagos para que destruyan a los
microoganismos fagocitados (figura 3.4).
El IFN-gamma (glicoproteína del grupo de las citocinas), aunque posee actividad
antivírica (por interferir en la replicación de los virus en las células del anfitrión),
no es una citocina antivírica potente, y actúa también como un activador de los
linfocitos efectores.
El mecanismo de citotoxicidad del linfocito NK es prácticamente el mismo que el
del CTL CD8+. Los linfocitos NK como los CTL, tienen gránulos que contienen
proteínas que promueven la muerte de las células diana. Cuando los linfocitos NK
se activan, la exocitosis de los gránulos libera estas proteínas junto a las células
diana. Una proteína del gránulo del linfocito NK, perforina, facilita la entrada de
otras proteínas del gránulo, granzimas, al citosol de las células diana. Las
granzimas son enzimas que inician una secuencia de señales que da lugar a la
muerte de las células diana por apoptosis. Al matar a las células infectadas por los
virus y las bacterias intracelulares, los linfocitos NK eliminan los reservorios de la
infección. En el curso de la infección vírica, los linfocitos NK se expanden y activan
por la IL-12 y la IL-15 y matan a las células infectadas.

El IFN-gamma derivado del linfocito NK incrementa la capacidad de los
macrófagos de matar a las bacterias fagocitadas. Esta interacción dependiente del
IFN-gamma entre el linfocito NK y el macrófago puede controlar una infección por
bacterias intracelulares durante varios días o semanas y de este modo dar tiempo
a que se desarrolle la inmunidad mediada por el linfocito T y erradique la infección.
Tomando en cuenta lo anterior, la pérdida de los linfocitos NK lleva a una mayor
susceptibilidad de infecciones por virus y bacterias intracelulares.

3.3. Inmunodeficiencias6,7.
Los defectos de uno o más componentes del sistema inmunitario pueden llevar a
trastornos graves e incluso mortales, que se llaman en conjunto enfermedades por
inmunodeficiencias. La principal consecuencia de la inmunodeficiencia es una
mayor propensión a la infección. Se clasifican dos grupos. Las inmunodeficiencias

6 Parvaneh N, Casanova JL, Notarangelo LD, Conley ME. "Primary immunodeficiencies: a rapidly evolving story".
Journal of Allergy and Clinical Immunology 131:314-323, 2013.

7 Fischer Alain. "Human primary immunodeficiency diseases: a perspective". Nature Immunology 2004, 5: 23-30.

Fig. 3.4. Funciones de las Células
NK. . Tomada y modificada de
ABBAS, Abul K. "Inmunología
Celular y Molecular", 8a. edición,
Editorial Elsevier Saunders,
España (2015). Pág. 65.

congénitas o primarias son defectos genéticos que aumentan la propensión a las
infecciones y que se manifiestan con frecuencia en la lactancia y la infancia, pero
a veces en fases posteriores de la vida.
Las inmunodeficiencias adquiridas o secundarias no son hereditarias, sino que
aparecen como consecuencia de la malnutrición, el cáncer diseminado, el
tratamiento con fármacos inmunosupresores o la infección de las células del
sistema inmunitario, sobre todo por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
La naturaleza de la infección de cada paciente depende en gran medida del
componente del sistema inmunitario que sea defectuoso (tabla 3.2). Los defectos
de la inmunidad humoral dan lugar regularmente a una propensión a la infección
por bacterias encapsuladas y formadoras de pus y por algunos virus, mientras que
los defectos en la inmunidad celular llevan a la infección por virus y otros
microorganismos intracelulares. Las deficiencias combinadas de las inmunidades
humoral y celular vuelven al paciente propenso a infecciones provocadas por
todas las clases de microorganismos.

Tabla 3.2. Características de las inmunodeficiencias que afectan a los linfocitos.
Característica Deficiencia de Linfocitos B Deficiencia de Linfocitos T
Deficiencia de
Linfocitos NK
Propensión a la infección
Bacterias piógenas (otitis,
neumonía, meningitis,
osteomielitis), bacterias
entéricas y virus, algunos
parásitos
Gran variedad de virus,
micobacterias atípicas,
hongos
Gran variedad de virus

Existen casos de adultos con infecciones recurrentes o graves que albergan
mutaciones en los genes que regulan su función inmunitaria.
Los pacientes con inmunodeficiencias también son propensos a ciertos tipos de
cáncer. Muchos de estos son causados por virus cancerígenos, como el virus de
Epstein-Barr y el del papiloma humano. Se observa una mayor incidencia de
cáncer en las inmunodeficiencias por linfocitos T, pues estos desempeñan una
función importante en la vigilancia contra los tumores cancerígenos.
La inmunodeficiencia puede deberse a defectos en el desarrollo o activación del
linfocito o a defectos en los mecanismos efectores de las inmunidades innata y
adaptativa.

3.3.1. Inmunodeficiencias congénitas o primarias.
En estos casos, la alteración puede estar en componentes del sistema innato, en
diferentes etapas del desarrollo del linfocito o en las respuestas de los linfocitos
maduros al estímulo antigénico. Las alteraciones hereditarias que afectan a la
inmunidad innata regularmente afectan a la vía del complemento o a los fagocitos.
Las alteraciones en el desarrollo y función del linfocito Btienen como
consecuencia una producción deficiente de anticuerpos y se diagnostican por una
reducción en las concentraciones séricas de inmunoglobulinas (Ig), respuestas
defectuosas de anticuerpos a la vacunación y, en algunos casos, un número
reducido de linfocitos B en la circulación o en los tejidos linfáticos (tabla 3.2).
Las alteraciones en la maduración y función del linfocito T pueden deberse a
mutaciones en genes que codifican enzimas, proteínas de transporte y factores de
transcripción.
Las inmunodeficiencias primarias del linfocito T se diagnostican por un número
reducido de linfocitos T en la sangre periférica, bajas respuestas proliferativas de
linfocitos sanguíneos a los activadores del linfocito T y reacciones cutáneas
deficientes frente a antígenos microbianos omnipresentes, como los de Candida.

3.3.1.1. Defectos en la inmunidad innata.
Los defectos del fagocito dan lugar generalmente a infecciones de la piel, de las
vías respiratorias por bacterias u hongos (predominan Aspergillus y Candida) y
bucales como la estomatitis oral. Los defectos en las señales del interferón del tipo
I (IFN-alfa e IFN-beta) pueden derivar en infecciones piógenas (generadoras de
pus) recurrentes, así como en infecciones víricas graves; los defectos en la vía de
la IL-12 y el IFN-gamma aumentan la propensión a infecciones por
microorganismos intracelulares, principalmente por micobacterias (tabla 3.3).

Tabla 3.3. Trastornos congénitos de la inmunidad innata. Tomada y modificada de ABBAS,
Abul K. "Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España
(2015). Pág. 439.

3.3.1.2. Inmunodeficiencias combinadas graves.
Las inmunodeficiencias que afectan a las inmunidades humoral y celular se llaman
inmunodeficiencias combinadas graves (IDCG). Esta se debe a una alteración en
el desarrollo del linfocito T con o sin defectos en la maduración del linfocito B.
Cuando el desarrollo del linfocito B se da normalmente, el defecto en la inmunidad
humoral se debe a la falta de la ayuda del linfocito T.
La manifestación clínica de la IDCG implica infecciones graves que pueden poner
la vida en peligro. Estas infecciones abarcan la neumonía, la meningitis y la
bacteriemia diseminada. Entre los microorganismos más peligrosos está el hongo
Pneumocystis jiroveci, que puede causar una neumonía grave. Muchos virus
producen enfermedades graves en pacientes con IDCG. La varicela en los
pacientes con IDCG puede progresar hasta afectar a los pulmones, hígado y
encéfalo. El citomegalovirus (CMV), que está presente en forma de infección
latente en la mayoría de las personas, puede reactivarse y provocar una neumonía
mortal en los pacientes con IDCG. Los niños con IDCG sufren infecciones

digestivas causadas por rotavirus, especies de Cryptosporidium, Giardia lamblia y
citomegalovirus, que conducen a una mala absorción y diarrea persistente.

3.3.1.3. Deficiencias de anticuerpos.
Mientras que los defectos en el desarrollo del linfocito T o en el desarrollo de los
linfocitos T y B contribuyen al surgimiento de la IDCG, defectos más limitados a los
linfocitos B dan lugar a trastornos de la producción de anticuerpos. Algunos de
estos trastornos se deben a defectos en el desarrollo y activación del linfocito B y
otros a la síntesis anómala de anticuerpos (tabla 3.4).

Tabla 3.4. Deficiencias de anticuerpos. Tomada y modificada de ABBAS, Abul K.
"Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015).
Pág. 446.

3.3.1.4. Defectos en la activación y función del linfocito T.
Incluidos en esta categoría están algunos trastornos de la composición o
exocitosis de los gránulos de los CTL y de los linfocitos NK. Los trastornos
sumados a la expresión defectuosa del MHC también dan lugar a una activación
defectuosa de los linfocitos T que maduran y salen del timo (tabla 3.5).

Tabla 3.5. Defectos en la activación del Linfocito T. Tomada y modificada de ABBAS, Abul
K. "Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España
(2015). Pág. 448.

3.3.2. Inmunodeficiencias adquiridas o secundarias.
Estas deficiencias del sistema inmunitario surgen debido a anomalías que no son
genéticas, sino que se adquieren a lo largo de la vida (tabla 3.6). Las
enfermedades por inmunodeficiencia adquirida se deben a distintos mecanismos
patogénicos. Primero, la inmunosupresión puede deberse a una complicación
biológica de otro proceso. Segundo, las inmunodeficiencias iatrogénicas pueden
surgir como complicaciones del tratamiento de otras enfermedades. Tercero, la
inmunodeficiencia puede adquirirse por una infección dirigida a las células del
sistema inmunitario. La más conocida es la infección por el VIH.

Tabla 3.6. Inmunodeficiencias adquiridas.
Causa Mecanismo
Infección por el VIH Pérdida de linfocitos T CD4+
Malnutrición proteico-calórica
Alteraciones metabólicas inhiben la maduración y
función del linfocito
Irradiación y quimioterapia para el cáncer
Reducción de precursores linfocíticos en la médula
ósea
Metástasis neoplásicas y leucémicas que afectan a
la médula ósea
Menor sitio para el desarrollo del leucocito
Inmunosupresión para trasplantes, enfermedades
autoinmunes
Menor activación del linfocito, bloqueo de citocinas,
alteración del tráfico del leucocito
Extirpación del bazo Reducción de la fagocitosis de los microbios

3.3.2.1. Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)8,9.
El SIDA (Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida) es la enfermedad causada
por la infección por el VIH y se caracteriza por una inmunosupresión profunda con
infecciones oportunistas y tumores malignos asociados y degeneración del
sistema nervioso central. El VIH infecta a varias células del sistema inmunitario,
como los linfocitos T CD4+ cooperadores, los macrófagos y las células dendríticas.
Una causa importante de pérdida de linfocitos T CD4+ en las personas infectadas
por el VIH es el efecto directo de la infección de estas células por el VIH. La
muerte de los linfocitos T CD4+ se asocia a la producción del virus en las células
infectadas y es una causa importante de la reducción del número de estas células,
especialmente en la fase temprana (aguda) de la infección. Existen varios efectos
tóxicos directos del VIH sobre los linfocitos CD4+ infectados:
 El proceso de producción del virus, con la expresión del gp41
(glucoproteína transmembranal de la cubierta vírica, que se asocia con la
proteína externa gp120 de forma no covalente y son necesarias para la
infección de las células) en la membrana plasmática y la gemación de
partículas víricas, puede aumentar la permeabilidad de la membrana

8 ABBAS, Abul K. "Inmunología Celular y Molecular", 8a. edición, Editorial Elsevier Saunders, España (2015).
Pags. 451-461.

9 Noda Albelo, Amauri Lázaro y col. "Interpretación clínica del conteo de linfocitos T CD4 positivos en la infección
por VIH". Revista Cubana de Medicina. 2013;52(2):118-127.

plasmática y provocar la entrada de cantidades mortales de calcio, lo que
induce la apoptosis o la lisis osmótica de la célula causada por la entrada
de agua.
 La producción vírica puede interferir con la síntesis de proteínas celulares y
así llevar a la muerte celular.
 La membrana plasmática de los linfocitos T infectados por el VIH se fusiona
con la de los linfocitos T CD4+ no infectados mediante interacciones gp120-
CD4.
 Además, gp120 y gp41, que se expresan en la membrana plasmática de las
células infectadas antes de que se libere el virus, pueden mediar la fusión
intercelular con una célula sin infectar que exprese el CD4 y los
correceptores, y los genomas del VIH pueden pasar directamente entre lascélulas fusionadas.
 Después de que el virus completa su ciclo vital en la célula infectada, se
liberan partículas víricas libres de la célula infectada que se unen a una
célula no infectada, lo que propaga la infección.
 Hay CTL específicos frente al VIH en muchos pacientes con SIDA y estas
células pueden matar a los linfocitos T CD4+ infectados. Además, los
anticuerpos contra las proteínas de la cubierta del VIH pueden unirse a los
linfocitos T CD4+ infectados por el VIH y dirigir a las células hacia una
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
La respuesta inmunitaria adaptativa inicial a la infección por el VIH se caracteriza
por la expansión de los linfocitos T CD8+ específicos frente a péptidos del VIH.
Hasta el 10% o más de los linfocitos T CD8+ circulantes pueden ser específicos
frente al VIH durante la infección aguda. Estos CTL controlan la infección en la
fase inicial, pero finalmente se muestran ineficaces por la aparición de mutantes
del virus (variantes con antígenos mutados). Los linfocitos T CD4+ también
responden al virus y estos pueden contribuir al control vírico de diferentes formas.
Es necesaria una respuesta de linfocitos T CD4+ eficaz para la cooperación con la
generación de linfocitos T CD8+ de memoria.

La enfermedad producida por el VIH progresa hasta la fase final y casi siempre
mortal, SIDA, cuando la cifra de linfocitos T CD4+ disminuye por debajo de las 200
células/ mm3.

3.4. Citometría de flujo10,11,12,13.
La citometría de flujo es la mejor técnica para proveer información en cuanto al
análisis y separación de poblaciones celulares. Es la medición de las propiedades
de las células que se encuentran suspendidas en un fluido y que pasan alineadas
de una en una dentro de un flujo (500 a 4000 por segundo) interrumpiendo un haz
de luz láser. El método permite el análisis cualitativo y cuantitativo de diferentes
propiedades como tamaño, estructura y contenido (análisis multiparámetrico), de
poblaciones celulares en líquidos corporales, así como de cualquier partícula tan
pequeña como 0.1 μm.
Una ventaja de la citometría de flujo es la habilidad de hacer mediciones
cuantitativas y multiparamétricas en un número estadísticamente significativo de
células para definir las propiedades de una población celular o de sus
subpoblaciones. Con el análisis multiparamétrico se pueden evaluar poblaciones
celulares particulares dentro de una mezcla compleja, pues se aprovechan
propiedades intrínsecas de la célula como la dispersión de la luz y características
controladas como la fluorescencia. Lo anterior es la base de la técnica conocida
como FACS (del inglés, Fluorescence Activated Cell Sorting).

10 Beckton Dickinson Immunocytometry Systems. "FACSCalibur Instructions for use". 2007. Pags. 13-19.

11
Scheffold, A. y Kern, F. 2000. "Recent Developments in Flow Cytometry". Journal of Clinical Immunology,
20(6): 400-407.

12
Barrera Ramírez, Lourdes María y col. "Citometría de Flujo: Vínculo entre la investigación básica y la
aplicación clínica". Revista del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, México 2004; Vol. 17(1):42-55.

13 Cortés Barberena, Edith y col. "Manual de Prácticas de Laboratorio. Citometría de Flujo". Universidad
Autónoma Metropolitana, México 2014. Pags. 5-14, 27-32.

Tabla 3.7. Algunas aplicaciones clínicas generales de la Citometría de Flujo. Tomada y
modificada de Barrera Ramírez, Lourdes María y col. "Citometría de Flujo: Vínculo entre la
investigación básica y la aplicación clínica". Revista del Instituto Nacional de Enfermedades
Respiratorias, México 2004; Vol. 17(1):47.

Cuando una molécula con dobles enlaces conjugados, y los electrones que se
encuentran en estos enlaces absorben luz, y por tanto energía, pueden alcanzar
una órbita de mayor energía. Se dice entonces que la molécula ha alcanzado un
estado de excitación, y puede volver a su estado basal cuando estos electrones
vuelven a su órbita de menor energía, desprendiendo energía en forma de calor y
emitiendo luz a una longitud de onda mayor a la absorbida. Esta transición se
denomina fluorescencia y a este tipo de compuestos se les denomina
fluorescentes o fluorocromos.

3.4.1. Fluorocromos.
Cada fluorocromo absorbe en una longitud de onda específica de luz, y emite en
otra longitud también característica.
Las recomendaciones más importantes para una selección adecuada de
fluorocromos con base en sus características se enlistan a continuación:

• Su espectro de excitación coincide con la longitud de onda de los láseres
disponibles en el citómetro de flujo.
• Se pueden unir fácilmente a estructuras químicas.
• Tienen intensidades de fluorescencia altas al asociarse a las células.
• Presentan, entre ellos, poca superposición en los espectros de emisión.
En la tabla 3.8 se muestran los fluorocromos más comunes para tinciones
específicas en el FACS.

Tabla 3.8. Fluorocromos más comunes para tinciones específicas en el FACS. Tomada de
Cortés Barberena, Edith y col. "Manual de Prácticas de Laboratorio. Citometría de Flujo".
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2014. Pág. 13.

El FACS proporciona datos tales como el tamaño relativo de la célula,
granularidad o complejidad interna y la intensidad relativa de fluorescencia.
Los parámetros que normalmente se miden de forma simultánea por cada célula
son:
1. Dispersión frontal de la luz (Forward Scatter, FSC), valor proporcional al tamaño
celular.
2. Dispersión lateral (o perpendicular) de la luz (Side Scatter, SSC), proporcional a
la cantidad de estructuras granulares presentes o complejidad de la célula.
3. Intensidad de fluorescencia a diferentes longitudes de onda (figuras 3.5 y 3.6).

Fig. 3.5. Dispersión de la luz en Citometría de Flujo14.

Fig. 3.6. Escatergrama de dispersión de la luz en el FACS14.

La información producida puede agruparse en dos tipos principales: la generada
por la dispersión de la luz y la relacionada con la emisión de luz por los
fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitados por el rayo láser (a
la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente). Las señales luminosas
detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se

convierten en señales digitales que son procesadas por una computadora,
permitiendo la medición de varios parámetros al mismo tiempo en una sola célula
(figura 3.7):
• Parámetros nucleares.
• Parámetros citoplasmáticos.
• Parámetros de superficie.
• Parámetros extracelulares.

Fig. 3.7. Escatergrama de fluorescencia y dispersión lateral de la luz en el FACS14.

Una ventaja de la citometría de flujo, es la posibilidad de medir tantos parámetros
como anticuerpos marcados con distintos fluorocromos se tengan disponibles. Así,
se puede caracterizar una célula por su fenotipo de superficie y al mismo tiempo,
intracelularmente, su patrón de secreción de citocinas, o incluso, la etapa del ciclo
celular en la que se encuentra. También permite identificar en una muestra
subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están escasamente
presentes.
El objetivo del análisis por inmunofluorescencia en citometría de flujo es asignar a
cada célula a un grupo específico de células con las que comparte propiedades
comunes.

Por ejemplo, para el análisis de subpoblaciones linfocitarias se requiere distinguir
los leucocitos por sus propiedades de dispersión de luz (tamaño contra
complejidad celular). Una vez que las células de interés han sido distinguidas de
los otros tipos celulares, se puede usar la inmunofluorescencia para determinar la
proporción o el número de células que poseen un determinado marcador, por
ejemplo, del marcador CD4. La proporción relativa de linfocitos,macrófagos y
granulocitos se determina fácilmente a partir de gráficas de tamaño (FSC) contra
complejidad celular (SSC). Los estudios de fluorescencia empleando diferentes
fluorocromos permiten determinar fácilmente la composición de subconjuntos de
linfocitos (CD4+ y CD8+).
Con los citómetros de flujo se pueden evaluar de 4 a 8 parámetros, los que
usualmente incluyen mediciones de tamaño y granularidad junto con 4 a 8 colores
de fluorescencia. Algunos citómetros de flujo pueden separar físicamente las
células basándose en diferencias de cualquier parámetro medible.

3.4.2. Componentes del citómetro de flujo.
El sistema de citometría de flujo está compuesto por cinco unidades principales:
una fuente de luz (lámpara de mercurio o láser), sistema de flujo celular, unidad de
filtros ópticos para la detección de longitudes de onda específicas, fotodiodos o
fotomultiplicadores para la amplificación de la señal y una unidad de operación y
procesamiento de datos (figura 3.8).

Fig. 3.8. Esquema general del sistema de Citometría de Flujo14.

3.4.2.1. Sistema de flujo celular.
El sistema de flujo del FACS posee un capilar a través del cual se hace pasar un
líquido isotónico, a manera de una funda, con una velocidad y presión constante;
estas características son necesarias para la formación de un flujo laminar (sin
turbulencia). Al mismo tiempo, por el centro del capilar se hace pasar la
suspensión celular, con aproximadamente de 5 x 105 a 2 x 107 células/mL y a una
presión mayor que la del flujo acarreador. Este enfoque hidrodinámico (figura 3.9)
asegura que las células permanezcan centradas y viajen una tras otra en el chorro
de inyección.

Fig. 3.9. Sistema de flujo celular del citómetro de flujo14.

14
Guía multimedia de funcionamiento del Analizador Hematológico Automático Sysmex XT-2000i. Sysmex Corporation,
Japón 2002.

3.4.2.2. Sistema óptico.
Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro
reducido para impactar sobre el menor número de partículas o células teñidas o
sin teñir posibles al mismo tiempo. El láser más común en los citómetros actuales
es uno de argón, enfriado por aire, que produce una luz azul de 488nm.
La membrana celular produce una desviación de luz con un ángulo pequeño de
0.5° a 5° con respecto al eje del láser, y ésta genera un cono que refleja el tamaño
de la célula.
Por otro lado, la luz que se interna dentro de la célula, se encuentra con las
membranas internas y se desvía en cualquier ángulo. Entre más membranas
internas más dispersión lateral se genera. La luz dispersada hacia el frente es
colectada por un detector que capta la luz difractada hasta 10º arriba o abajo del
punto de incidencia del láser. La luz dispersada lateralmente y la fluorescencia son
colectadas por un lente que está a 90º del eje de incidencia del láser (figura 3.10).
Fig. 3.10. Dispersión de la luz y complejidad celular. Tomada y modificada de Cortés
Barberena, Edith y col. "Manual de Prácticas de Laboratorio. Citometría de Flujo".
Universidad Autónoma Metropolitana, México 2014. Pág. 11.

Un lente de colección se encarga de dirigir la luz desviada frontalmente por la
célula hacia el detector correspondiente, mientras que otro lente se encarga de
dirigir la luz desviada lateralmente y la fluorescencia, hacia los filtros ópticos.

Esta luz lateral y la fluorescencia son divididas por un "Divisor del rayo" (del inglés,
beamsplitter) para separar la luz difractada y la fluorescencia.
Los filtros dicroicos permiten el paso de luz en un intervalo de longitud de onda y
reflejan la que esté fuera de ese intervalo.
Los filtros de longitud amplia (longpass) permiten el paso de luz de longitud de
onda mayor mientras que reflejan la de menor longitud de onda; los de longitud
corta (shortpass) permiten el paso de la luz de longitud de onda menor. Los filtros
de intervalo (bandpass) permiten solamente el paso de luz de longitudes de onda
en un intervalo (o banda) y el resto lo reflejan.
El uso de diferentes filtros dicroicos permite que las señales luminosas se dirijan a
los detectores adecuados.
Cada detector de fluorescencia tiene otros filtros ópticos para excluir la luz del
láser dispersada y para dejar pasar la luz con la longitud de onda deseada para
ese detector.
En las figuras 3.11 se muestra un arreglo del sistema óptico similar al utilizado por
el citómetro FACSCalibur.

Fig. 3.11. Ejemplo del sistema óptico de un citómetro de flujo. Tomada de Cortés Barberena,
Edith y col. "Manual de Prácticas de Laboratorio. Citometría de Flujo". Universidad
Autónoma Metropolitana, México 2014. Pág. 12.

3.4.2.3. Sistema electrónico.
Las señales luminosas generadas cuando el láser incide en la célula deben
traducirse a señales electrónicas, para esto se requieren sensores sensibles a la
luz capaces de esta conversión. Los dos tipos principales de sensores luminosos
son los fotodiodos de silicón y los fotomultiplicadores.
Los fotodiodos de silicón son utilizados principalmente para detectar la extinción y
la FSC de luz. Los fotomultiplicadores son requeridos para captar señales más
débiles, como la fluorescencia y la SSC de luz.
Los electrones que se generan en los detectores cuando captan los fotones, se
convierten en una corriente eléctrica que es proporcional a la señal detectada.
Este pulso es amplificado aplicando un mayor voltaje.
Un convertidor análogo-digital (Analog-to-Digital Converter, ADC) transforma el
pulso de voltaje análogo en un número que representa un canal, en una escala de
0 a 1024 canales. Estos valores se transfieren a la computadora y se pueden
representar en una gráfica con ayuda de un programa computacional.

3.4.2.4. Unidad de procesamiento e interpretación de datos.
El equipo FACS va acompañado por una computadora que adquiere los datos
proporcionados por el sistema eléctrico y hace una presentación gráfica. La
computadora produce un histograma o un despliegue de dos parámetros (dot plot
o contour plot) a partir de la luz dispersada por las células o a partir de la
fluorescencia. La computadora permite almacenar datos de miles de células por
cada muestra. Para el análisis de los datos se puede elegir el total de los mismos
o solamente una parte de ellos, pudiéndose hacer el estudio en una población
especifica.
En la figuras 3.12 y 3.13, se presenta una gráfica de punto (dot plot) del análisis de
varias poblaciones, en la gráfica cada punto corresponde a un evento (una célula);
y se muestra un histograma en donde se analiza solamente una población que
incluye más del 90% de los eventos de la misma.

Figs. 3.12 y 3.13. Gráfica de punto e histograma para el análisis poblacional múltiple e
individual respectivamente. Tomada de Cortés Barberena, Edith y col. "Manual de Prácticas
de Laboratorio. Citometría de Flujo". Universidad Autónoma Metropolitana, México 2014.
Pág. 68.

En la figura 3.14 se muestra como ejemplo una gráfica de puntos en donde se
observa la identificación de linfocitos T y B en sangre periférica, basándose en la
tinción con dos diferentes fluorocromos (isotiocianato de fluoresceína o FITC y
ficoeritrina o PE). Los linfocitos T CD3+ son positivos al fluorocromo FITC y se
observan en el cuadrante inferior derecho. Los linfocitos B CD45RA+ son positivos
al fluorocromo PE y se localizan en el cuadrante superior izquierdo.
Las células negativas a ambos fluorocromos (no son linfocitos T, ni linfocitos B) se
muestran en el cuadrante inferior izquierdo. Los linfocitos positivos para ambos
fluorocromos se encuentran en el cuadrante superior derecho.

Fig. 3.14. Gráfica de punto para dos diferentes poblaciones celulares marcadas con dos
diferentes fluorocromos. Tomada de CortésBarberena, Edith y col. "Manual de Prácticas de
Laboratorio. Citometría de Flujo". Universidad Autónoma Metropolitana, México 2014. Pág.
30.

La citometría de flujo es la técnica más útil en el estudio de la mayoría de las
inmunodeficiencias primarias, ya que permite evaluar las poblaciones y
subpoblaciones celulares. Como parte del estudio de las inmunodeficiencias
primarias, es útil realizar un inmunofenotipo de las poblaciones celulares de la
sangre mediante la identificación de marcadores celulares de superficie por
citometría de flujo. Con ello se logra un diagnóstico presuntivo de la mayoría de la
inmunodeficiencias primarias de células T y células B, que se confirma mediante
otros estudios.
Algunos de los puntos a evaluar por citometría de flujo para el estudio de las
inmunodeficiencias son:
1. Cuantificación de linfocitos T CD4+ y T CD8+ en pacientes HIV/SIDA. La
relación CD4+/CD8+ es el marcador más importante para estudiar la
evolución de esta enfermedad.
2. Cuantificación de poblaciones linfocitarias: Linfocitos T, B y NK y
subpoblaciones T CD4+ y T CD8+ en:
a. Pacientes con infecciones recurrentes.
b. Monitorización de tratamientos con anticuerpos monoclonales y
tratamientos con suero anti- linfocitos T.

3. Análisis de subpoblaciones de linfocitos B para clasificación de pacientes
con Inmunodeficiencia Común Variable (IDCV).
4. Cuantificación de subpoblaciones linfocitarias para monitorizar la
recuperación inmunológica postrasplante de células progenitoras
hematopoyéticas.

3.4.3. Citometría de Flujo y VIH.
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA), principalmente la cuantificación en sangre periférica de las
células CD4+ y los linfocitos CD8+ aporta un valor diagnóstico y pronóstico en
esta patología, por lo que se requieren hacer controles periódicos de las mismas.
El antígeno CD4 es el receptor para el VIH. Cuando éste infecta humanos, las
células que con más frecuencia infecta son las CD4+, que se multiplican para
combatir infecciones y producir más copias del VIH.
El número absoluto de linfocitos T CD4+ es el parámetro celular asociado a la
evolución de la enfermedad causada por el VIH. La relación entre los linfocitos T
CD4+ y CD8+ (CD4+/CD8+), se conoce como la relación cooperador/supresor. En
personas sanas esta relación se encuentra entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay
una a dos células CD4 por cada célula CD8. Para esta evaluación se propone el
uso de citometría de flujo y un panel de anticuerpos monoclonales combinados:
CD3+/CD4+ (para medir linfocitos T cooperadores); CD3+/CD8+ (para medir
linfocitos T supresores); CD3+/CD19+ (para separar la población de linfocitos T y
B) y CD3+/CD56+ (para separar las células NK).

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
4.1 Población estudiada.
Se realizó el estudio en un total de 186 niños sanos de ambos sexos residentes de
la región noreste de la Ciudad de México y zona conurbada, que acudieron a
análisis clínicos rutinarios al Hospital General del Centro Médico Nacional "La
Raza", el cual es un número estadísticamente significativo para definir y
determinar valores de referencia en el laboratorio clínico. El rango de edad fue de
0 meses a 192 meses (16 años), de los cuales 94 niños contaban con 3 años de
edad o menos y 92 niños eran mayores de 3 años de edad. Todos eran individuos
en buen estado de salud y sin historia de infección viral o bacteriana, o toma de
medicamentos por lo menos un mes antes del estudio.

4.2. Procesamiento de las muestras.
 Se obtuvieron 0.5 a 5 mL de sangre anticoagulada con EDTA de todos los
sujetos estudiados. La flebotomía, en todos los casos se efectuó entre las
7:00 y las 9:00 horas.
 La cuenta de leucocitos se realizó del tubo con anticoagulante EDTA en el
equipo Sysmex XN-2000, para obtener los valores absolutos y relativos de
linfocitos para cada sujeto.
 Del tubo con EDTA se adicionaron en 3 distintos tubos 50 µL de sangre
total, el tubo 1 solo contenía 50 µL de sangre total y los tubos 2 y 3, 50 µL
de sangre total + 5 µL de cada uno de los siguientes anticuerpos
monoclonales conjugados con los fluorocromos Isotiocianato de
Fluoresceína (FITC), Ficoeritrina (PE), Peridinin Clorofila (PerCP) y
Aloficocianina (APC):
Tubo 2) BD Multitest: CD3(FITC)/CD8(PE)/CD45(PerCP)/CD4(APC)
Tubo 3) BD Multitest: CD3/CD16+CD56/CD45/CD19
 El tubo control solo contiene 50 µL de sangre total.
 Se incubaron durante 15 minutos protegidos de la luz a temperatura
ambiente. Después de este tiempo, a las alícuotas teñidas se les agregó 2
mL de solución de lisis BD FACS Lysing Solution (dilución 1:10 con agua
inyectable) y se incubaron por 10 minutos protegidas de la luz.

 Las muestras se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos, se decantó y al
botón celular se le adicionaron 2 mL de la solución buffer FACS Flow
 Se repitió la centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos, se decantó y al botón
celular se le adicionó 1 mL de la solución buffer FACS Flow.
 Calibrar el instrumento mediante las opciones Instruments Settings,
FACStation, BD Files, Calib File. La calibración se realiza mediante
microesferas suspendidas en FacsFlow (buffer), marcadas con 4
fluorocromos: FITC, APC, PerCP y PE.

Todas las alícuotas de sangre fueron analizadas en un citómetro de flujo
FACSCalibur (Becton Dickinson) de 4 colores a 10,000 eventos. Mediante el
software CellQuest Pro.

1. Ingresar a CellQuest a través del menú Apple.
2. Seleccionar la plantilla (configuración de parámetros para al análisis de la
muestra) dentro de la carpeta de plantillas en el equipo, mediante las opciones del
menú File, Open Document.
3. En el menú de herramientas abrir Cytometer e interfasar el citómetro con la
computadora al presionar en el menú Acquire, Connect to Cytometer.

4. Presionar las teclas "Command 1234" para abrir las herramientas
Detectors/Amps , Threshold, Compensation y Status.

5. Con la barra de íconos (opción Windows, Show Palette) modificar parámetros
como el nombre de la plantilla y el número de leucocitos obtenidos en el equipo
Sysmex XN-2000, con la opción fx.
6. Crear la hoja de adquisición (opción Acquire, Parameter Description) con las
siguientes gráficas de punto:
Tubo 1 o Control, FSC vs SSC.
Tubo 2 o BD Multitest: CD3/CD8/CD45/CD4 (gráficas CD3 vs CD4 y CD3 vs
CD8)
Tubo 3 o BD Multitest: CD3/CD16+CD56/CD45/CD19 (gráficas CD3 vs CD19 y
CD3 vs CD16+CD56)

7. Colocar el tubo 1 (Control), seleccionarlo en el Browser y para iniciar su
procesamiento, seleccionar la gráfica de punto correspondiente en la parte
superior de la plantilla.
8. Adquirir a 10,000 eventos para cada tubo.
9. Seleccionar Parameter Description del menú Acquire para crear el folder y
guardar los resultados obtenidos.
10. Seleccionar la región de linfocitos (R1) en la gráfica de puntos "Tamaño (FSC)
contra Granularidad (SSC)". Esta región incluye a los linfocitos CD4+, CD8+,
CD19+ y CD16+CD56+ (o NK). Ver gráfica abajo.
Nota: A partir de esta región se adquieren 10,000 eventos para cuantificar el %
que representan los linfocitos en la muestra de sangre del tubo (% de "gated").
Este valor es obtenido de la muestra control sin la presencia de anticuerpos
marcados con fluorocromos.

En estas gráficas de puntos de "Tamaño (FSC) contra Granularidad (SSC)" se
representa la cuantificación