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T E S I S E X P E R I M E N T A L Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Carrera de Biología Determinantes energéticos de la interacción entre la GTPasa ribosomal EFL1 y su factor intercambiador de nucleótidos SBDS P A R A O B T E N E R E L T Í T U L O D E B I Ó L O G O P R E S E N T A ROBERTO CRUZ CASTAÑEDA DIRECTOR DE TESIS: DR. CHRISTIAN AXEL LUVIANO JARDÓN ASESOR INTERNO: DR. ELIA ROLDAN REYES Ciudad de México, abril 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Bioquímica 2 y Biología Molecular del Departamento de Química de Biomacromoléculas del Instituto de Química de la UNAM, bajo la dirección de los profesores Dr. Christian Axel Luviano Jardón (Profesor de la FES-Zaragoza, UNAM) y Dr. Enrique García Hernández (Investigador Titular del Instituto de Química, UNAM) y el asesoramiento de la Dra. Elia Roldan Reyes (Profesor Titular de la FES-Zaragoza, UNAM). El presente proyecto conto con el financiamiento del proyecto CONACYT “Bases energético-estructurales del funcionamiento de proteínas con arquitectura modular” clave 235831. AGRADECIMIENTOS Al Prof. Axel Luviano por darme la oportunidad de realizar junto con él este proyecto que, en medio de corajes, alegrías, fracasos y éxitos, disfrutamos mucho como alumno y maestro. Agradezco su paciencia y haber confiado en mí con ojos cerrados, no solo en este, sino también, en muchos de sus sueños que pronto se volvieron míos. Este trabajo es mi agradecimiento y prueba de que es un pilar en mi vida académica adentrándome en el mundo de las proteínas. Al Dr. Enrique García por su guía, sin duda lo mejor que me dejo la tesis de licenciatura fue la oportunidad de integrarme a su equipo de trabajo y venderle mi alma unos años más. Gracias por las largas charlas tanto emocionales y académicas donde ha sembrado en mí el criterio y la curiosidad científica. A la Dra. Nuri Sánchez quien me brindo la confianza en dejarme la puerta abierta de su laboratorio para trabajar por largos meses. Al grupo de trabajo del Dr. Enrique: Homero, Lalo, George… al buen Luigui quien mientras Axel me abandonaba siempre me brindaba una mano en el laboratorio y en especial al grupo de los ABLologos (Itzel, Manuel y Axel) con quienes aún nos falta mucho que contar a la comunidad científica. A otros alumnos del departamento: Nancy, Alfonso, Arnulfo, Bety, Isa… quienes me brindaron su apoyo comprendiendo nuestras carencias y facilitándonos el uso de sus equipos y material. Hago una mención especial a Jesús por los geles de acrilamida. A la Dra. Patricia Cano, le agradezco la confianza y lo divertido de su compañía, por sus enseñanzas académicas y también el defenderme de Axel, quien injustamente me quiere mantener atado a una silla por horas. Lo único que no agradezco es la enorme cantidad de material que me ha puesto a lavar. A los miembros de mi jurado: Dra. Francisca L. Sánchez, Dra, Yolanda Córdova Galaviz, M. en C. Rosalva Rangel Corona por sus comentarios y revisiones que enriquecieron el presente trabajo. Agradezco especialmente a la Dra. Elia Roldán quien no solo fue mi asesora interna sino una motivación académica constante desde 2do semestres de mi carrera, ojalá las largas platicas aun permanezcan. A mis profesores de la carrera que no terminaría en mencionarlos, quienes permitieron encontrara mi vocación y me formaron para la vida profesional. A la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza de nuestra máxima casa de estudios la Universidad Nacional Autónoma de México. ¡Por mi raza hablara el espíritu! Dedicatorias A mi madre Eva Castañeda a quien admiro y respeto por librar una de las batallas más duras en la vida, educar y cuidar a cuatro niños con admirable esfuerzo y dedicación. Cuando leas esta tesis quizás no comprendas mí trabajo, pero algo entenderás, esta tesis también te pertenece pues es el fruto de tus esfuerzos y en cada renglón está escrito un gracias, un te amo, un te admiro, un te quiero y un Dios te bendiga. ¡Te amo mamá! A mi querida hermana Elizabeth quien por años has sido mi cómplice y mi compañera de juegos. Además, ¿cómo olvidar los agarrones de greñas? A ti te dedico mi trabajo porque ambos sabemos cuán difíciles fue crecer solos, porque sabemos que nuestras metas serán más difíciles que las de muchas personas, pero también sabemos que mientras nos tengamos, podremos librar muchas batallas. A mis hermanos Nayeli y Luis, quienes son mi inspiración en la vida, por quienes cada día me esfuerzo en ser mejor hermano, quizás no lo he sido, pero ustedes dúo de locos son el mejor regalo de la vida. A la Sra. Mago porque cuando nadie estuvo, usted nos vigiló, nos alimentó y nos ayudó. No podría describir lo agradecido que estoy; la admiración y cariño que le tengo, lo que si puedo escribir es que la llevo en mi corazón en cada paso de mi vida. A mi hermosa sobrina Mariana quien ha sido una luz en mi vida, porque te quiero con todo mi corazón y con toda mi alegría. A Roberto Cruz y Octavio Cruz quienes ya no están con nosotros, pero su linaje vive para recordarlos. A mis Abuelos Bertín y Remedios por las enseñanzas y cuidados que tuvieron conmigo rindieron frutos. A Magaly quien por largo tiempo ha sido pilar importante, simplemente no estaría escribiendo esto si nunca te hubieras cruzado en mi vida, tú quien verdaderamente apostaste por mí sin ninguna garantía, gracias totales pues no existen palabras para agradecer la felicidad y bendición que me has sido para mí. ¡Siempre serás tu Chavi! A la Sra. Magda por los consejos, los jalones de oreja, el cariño y las decenas de sándwich preparados. Usted se convirtió en mi segunda madre siempre llenándome de atenciones y animándome a continuar, estaré eternamente agradecido y en deuda. A la ingeniosa Thali, quien no me deja subir el escalón, siempre haciéndome ver que el Doctorado no quita lo… inocente. Definitivamente a lo largo de mi carrera fuiste fuente de largas horas de risa y diversión sobre todo cuando lo necesitaba. A mi tío Sergio quien me educo y por quien siento un profundo cariño pues aun en mi mente existen los consejos dados y la guía espiritual que necesitaba. A mi tía Aby quien se convirtió en mi amiga, mi confidente y un apoyo incondicional, siempre me dio amor, cariño y me sigue consintiendo por el gran amor y respeto que tuvo por mi padre. A mis tíos Irene y Ricardo quieres corrigieron mi camino cuando me equivoque y hoy se alegran por mis triunfos, gracias porque sin su intervención quizás mi camino hubiera sido otro. A José Margarito Torres, el hermano mayor que la vida me dio, porque en ti tengo un amigo y un apoyo, te admiro y respeto enormemente. Se que papá te agradecería todo el apoyo dado. A la Familia Galicia Rodríguez por siempre tener consideraciones hacia conmigo. A todas esas bellas personas que siempre llevare en el corazón y que han contribuidoa hacer una mejor versión de mí. Quisiera mencionar muchas cosas sobre ustedes, pero haría varias tesis, así que entiendan la limitante de este párrafo y sepan que su nombre está aquí porque son importantes en mi vida. Quizás nunca lean esto, pero es mi deber dejar plasmado mi agradecimiento. A Christma San Agustín, Anayeli Jacuinde, Rosario Ortega, Alejandro Maza, Andrés Olivo, Marcos Carrera, Ismael Pérez, Sr. Plutarco, Sra. Lilia, Manuel Pérez y Hugo Mina. Por último, pero no menos importante a mis amigos de la Universidad quienes le dieron el toque necesario para que la academia fuera menos intensa. A Vladimir de las mejores personas que me dejo la Universidad, mi gemelo perdido quien deseo se quede en mi vida mucho tiempo más. A Mario por que fuiste pieza clave para que llegara a este proyecto. Gracias por la amistad y siempre tendrás un lugar especial en mi vida. A Mary y Yasmín quienes han mostrado una amistad incondicional y han evitado mi muerte prematura en campo. A los “Mamíferos” (Edgar, Karen, Yadira y Fernanda) por las grandiosas aventuras que aun vivimos. A Axel que se ha convirtió en un buen he increíble amigo, reafirmo mi admiración y respeto para ti. Gracias al cielo te conocí al final sino nunca hubiera terminado la carrera. Gracias por todo el apoyo. A Fernando Morales, Josué, Efraín, Arturo Valle, Mary Jorge, Paola, Beto, con quienes recuerdo increíbles momentos. Gracias por su compañía en toda esta travesía Al que estas sentado en el trono, al que vive para siempre y siempre, sea la gloria, sea la honra y el poder. – Marcos Brunet La característica extraordinaria de las leyes de la física es que se aplican en todos lados, sea que tú elijas o no creer en ellas. Lo bueno de las ciencias es que siempre tienen la verdad, quieras creerla o no. – Neil deGrasse Tyson Porque el Señor da la sabiduría y de su boca viene el conocimiento y la inteligencia. – Proverbios 2:6 nullius in verba: “(no creas) en la palabra de nadie”; en otras palabras “cuestiona la autoridad”. – Lema de la Royal Society of London Solo puede, él que cree poder. – Chavi Si las cosas que valen la pena fueran fáciles, todo mundo las haría. – Anthony Quinn Un científico en su laboratorio no es sólo un técnico: es también un niño colocado ante fenómenos naturales que le impresionan como un cuento de hadas. – Marie Curie Ningún soñador es pequeño y ningún sueño es demasiado grande. – Anónimo ÍNDICE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ________________________________________________________________ 1 RESUMEN _________________________________________________________________________________ 2 1. MARCO TEÓRICO ______________________________________________________________________ 3 1.1 GTPASAS ____________________________________________________________________________ 3 1.2 PARTICIPACIÓN DE LA GTPASA EFL1 Y DE LA PROTEÍNA SBDS EN LA BIOGÉNESIS RIBOSOMAL ___________________ 10 1.3 RIBOSOMOPATÍAS Y SÍNDROME DE SHWACHMAN-DIAMOND _________________________________________ 14 1.4 GENERALIDADES ESTRUCTURALES DE EFL1 Y SBDS _______________________________________________ 15 1.5 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES _____________________________________ 18 1.6 DICROÍSMO CIRCULAR___________________________________________________________________ 20 1.7 TERMODINÁMICA DE LA INTERACCIÓN PROTEÍNA-LIGANDO __________________________________________ 22 1.8 PRINCIPIOS DE ITC _____________________________________________________________________ 27 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ________________________________________________________ 30 3. JUSTIFICACIÓN _______________________________________________________________________ 31 4. HIPÓTESIS ___________________________________________________________________________ 31 5. OBJETIVO GENERAL ___________________________________________________________________ 32 5.1 OBJETIVOS PARTICULARES ________________________________________________________________ 32 6. MATERIALES Y METODOS _______________________________________________________________ 33 6.1 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE EFL1 Y SBDS RECOMBINANTE ____________________________________ 33 6.1.1 Vector de expresión de EFL1 recombinante __________________________________________ 33 6.1.2 Cepa de Saccharomyces cerevisiae BCY123 __________________________________________ 33 6.1.3 Transformación de células de levadura con el plásmido pRS426-EFL1 _____________________ 33 6.1.4 Sobreexpresión y purificación de EFL1 recombinante __________________________________ 34 6.1.5 Cromatografía de afinidad a níquel ________________________________________________ 35 6.1.6 Corte con TEV _________________________________________________________________ 35 6.1.7 Purificación por cromatografía de exclusión molecular _________________________________ 35 6.1.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) _________ 36 6.1.9 Cuantificación y preparación de las muestras ________________________________________ 36 6.2 ANÁLISIS DE DICROÍSMO CIRCULAR __________________________________________________________ 37 6.3 ESPECTROMETRÍA DE MASAS ______________________________________________________________ 37 6.4 CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA ____________________________________________________ 37 6.5 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS SBDS _________________________________________ 38 6.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO __________________________________________________________________ 39 7. RESULTADOS _________________________________________________________________________ 40 7.1 SOBREEXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE EFL1 Y SBDS _______________________________________________ 40 7.1.1 Expresión y purificación de EFL1 ___________________________________________________ 41 7.2 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE SBDS ________________________________________________________ 44 7.3 PLEGAMIENTO Y ESTABILIDAD TÉRMICA DE EFL1 Y SBDS ___________________________________________ 46 7.4 CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA ____________________________________________________ 48 7.4.1 EFL1 posee mayor afinidad por GDP que por GTP _____________________________________ 48 7.4.2 EFL1 y SBDS interaccionan directamente con alta afinidad ______________________________ 50 7.4.3 SBDS cambia la afinidad de EFL1 por GDP/GTP _______________________________________ 52 7.4.4 Cambios en la capacidad calorífica de EFL1(-SBDS) al unir nucleotidos de guanina ___________ 54 8. DISCUSIÓN __________________________________________________________________________ 56 8.1 PURIFICACIÓN, PLEGAMIENTO Y ESTABILIDAD TÉRMICA DE EFL1 Y SBDS _________________________________ 56 8.2 ENERGÉTICA DE UNIÓN ENTRE EFL1 Y NUCLEÓTIDOS DE GUANINA EN PRESENCIA Y AUSENCIA DE SBDS _____________ 58 8.3 CAMBIOS CONFORMACIONALES ACOPLADOS A LA UNIÓN DE NUCLEÓTIDOS DE GUANINA EN EFL1 AISLADA Y EN COMPLEJO CON SBDS _______________________________________________________________________________ 61 8.4 MODELO DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO EFL1-GT(D)P-SBDS _____________________________________ 66 9. CONCLUSIONES _______________________________________________________________________ 68 10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS __________________________________________________________ 69 11. ANEXOS _____________________________________________________________________________ 74 SOLUCIONES AMORTIGUADORAS, REACTIVOS Y MEDIOS _________________________________________________ 74 1 ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ARNm: Ácido ribonucleico mensajero ASA: Área superficial accesible al solvente DC: Dicroísmo circular DO600: Densidad óptica a 600nm Ec: Ecuación EFL1: Del inglés Elongation Factor-like 1 GAP: Del inglés GTPase-Activating Protein GDP: Guanosín Difosfato GEF: Del inglés Guanine Exchange Factor GNBPs: Del inglés Guanine Nucleotide Binding Proteins GTP:Guanosín trifosfato GTPasa: Guanosina trifosfatasa o trifosfatasas de guanosina IPTG: isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido ITC: Del inglés Isotermal Titration Calorimetry Ka: Constante de asociación Kd: Contaste de disociación LB: medio Luria-Bertani MALDI-TOF: Del inglés Matriz Assisted Laser Desortion/Ionization-Time Of Flight P-loop: Del Inglés phosphate-binding loop PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo PR: Proteína Recombinante SBDS: Proteína mutada en el síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond SDS: Shwachman-Diamond Syndrome SD-URA: Synthetic Drop-out sin uracilo T: Temperatura TIF6: Del inglés translation initiation factor 6 UA: Unidades de absorbancia ΔASA: Cambio de área superficial accesible al solvente ΔCp: Cambio en la capacidad calorífica ΔG: Cambio en la energía libre de Gibbs ΔH: Cambio en la entalpía ΔS: Cambio en la entropía http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27146429 2 RESUMEN Las GTPasas son proteínas que hidrolizan el GTP para producir GDP y fosfato inorgánico, utilizando la energía de hidrólisis para llevar a cabo diferentes funciones. Estas proteínas se encuentran altamente conservadas en los tres dominios de la vida, llevando a cabo varias funciones celulares como el control del ciclo celular, la traducción de proteínas y la maduración ribosomal. La maduración ribosomal, es un proceso altamente regulado por aproximadamente 200 factores proteicos, entre los que destacan las GTPasas. Algunas GTPasas requieren de factores GAP y GEF para poder acelerar la hidrólisis del trinucleótido e intercambiar el GDP por el GTP, respectivamente. Entre las GTPasas se encuentra la proteína EFL1 que participa en los últimos pasos de la maduración de la subunidad ribosomal 60S. EFL1 junto con la proteína SBDS promueven la liberación del factor antiasociación TIF6, este último factor inhibe la unión prematura de las subunidades 40S y 60S. Fallas en la maduración ribosomal conduce a enfermedades denominadas, ribosomopatías entre las que se encuentra el síndrome de Shwachman-Bodian-Diamond, donde el 90% de los pacientes presenta una mutación en el gen que traduce para la proteína SBDS. Con el fin de caracterizar la interacción de EFL1-SBDS y comprender las bases energético- estructurales de la unión de nucleótidos por parte de EFL1 en presencia y ausencia de SBDS, en este trabajo se realizó la sobreexpresión y purificación de SBDS y EFL1 recombinantes en sistemas de bacteria y levadura respectivamente, obteniendo un rendimiento en el orden de miligramos. El plegamiento y la integridad estructural fueron comprobados mediante dicroísmo circular. Los experimentos de interacción mediante calorimetría de titulación isotérmica mostraron que ambas proteínas interaccionan directamente con afinidad del orden micromolar. EFL1 une GDP y GTP con diferentes afinidades, teniendo una mayor afinidad por GDP que por GTP, sin embargo, la presencia de SBDS, cambia la afinidad de EFL1 por ambos nucleótidos, tornando a que EFL1 tenga una mayor afinidad por GTP. Además, las determinaciones de Cpa para cada complejo estudiado, señalan que la unión de nucleótidos a EFL1 es acompañada por cambios conformacionales de diferente magnitud, llevando a EFL1 a adoptar varias conformaciones diferentes. SBDS conduce a EFL1 a adoptar una conformación activa o apta para unir GTP, por lo que SBDS funciona como un factor intercambiador de nucleótidos que estabiliza la conformación unida a GTP. 3 1. MARCO TEÓRICO 1.1 GTPasas Las proteínas de unión a nucleótidos de guanina (GNBPs, del inglés Guanine Nucleotide Binding Proteins) desempeñan funciones reguladoras para muchos procesos celulares, fundamentales como síntesis de proteínas [1], control del ciclo celular [2, 3], señalización celular [4], biogénesis ribosomal [5, 6], motilidad [7] y migración celular [8]. Alteraciones en la función o estructura de estas proteínas las involucran en el desarrollo y progresión de cáncer [9, 10]. Entre las GNBPs se encuentran la superfamilia de Ras como Rho, Arf, Rab y Ran así como las proteínas G heterotriméricas y los factores de elongación involucrados en la traducción de proteínas. Un total de 37,767 proteínas que contienen un dominio de unión a GTP se han identificado en 1,383 genomas, estando presentes en los tres dominios de la vida (Bacteria, Arquea y Eucaria) presentándose en mayor proporción en los eucariontes conteniendo a más de 100 GNPBs[11, 12]. La clasificación más aceptada de GNBPs es la propuesta por Leipe y colaboradores [13]. La superclase de las proteínas G se puede subdividir en la clase TRAFAC (del inglés, TRAnslational FACtors), que incluye factores de traducción, proteínas G heterotriméricas, los miembros de la superfamilia Ras, septinas, y la superfamilia dinamina como miembros más representativos. La segunda clase llamada SIMIBI (del inglés, SIgnal recongnition particle, MInD, y BIoD) incluye a la partícula de reconocimiento de señal (SRP), MinD, ArsA, entre otras[13]. Las proteínas G más universalmente conservadas son los factores de traducción de proteínas, que participan en la biosíntesis de proteínas[11]. El GTP es una molécula importante utilizada para la regulación de GNBP’s. Las GTPasas actúan como interruptores (switchs) moleculares que se encuentran oscilando entre un estado “inactivo” y otro estado “activo”, generalmente estos dos estados son estructuralmente diferentes. Este ciclo permite controlar procesos como la diferenciación y crecimiento celular, transporte vesicular y nuclear, traducción de proteínas y maduración ribosomal. Estos dos estados conformacionales consisten en: uno unido a GTP (estado "activo") y otro unido a GDP (estado "inactivo"). En el estado "activo", las GTPasas reconocen proteínas blanco y generan una respuesta, la hidrólisis de GTP devuelve la GTPasa a su estado "inactivo" o unida a GDP[12, 14, 15]. Los elementos estructurales denominados switch I (efector) y switch II (inhibidor) permiten a la GTPasa discriminar entre GTP y GDP[16]. 4 Debido a su importancia biológica, en los últimos años el estudio de las GTPasas se ha intensificado, mediante métodos bioquímicos y estructurales encaminados a comprender el funcionamiento de estas proteínas y su participación tanto en procesos celulares normales como patológicos. Sin embargo, al ser un grupo tan heterogéneo de proteínas, las estrategias para estudio de las GTPasa se deben dirigir a casos particulares. Si bien en términos de secuencia y estructura, las GTPasas tienen una baja homología, posee un sitio funcional altamente conservado responsable de la unión de nucleótidos de guanina e hidrólisis de GTP a GDP y fosfato inorgánico. Este sitio es el dominio G, que consta de alrededor de 250 aminoácidos y consiste en una mezcla de seis hebras- y cinco hélices-, por lo que se considera una /-proteína (Figura 1A). Contiene 5 motivos estructurales, que se clasifican del G1 al G5 distribuidos en el sitio de reconocimiento de nucleótidos [12]. El motivo G1 o lazo de unión de fosfato (P-loop del inglés phosphate-binding loop) contacta a los fosfatos y del GD(T)P y contiene una secuencia consenso que es A/GXXXXGKS/T [12, 17]. Este P-loop es un motivo conservado entre proteínas que reconocen nucleótidos de adenina y guanina, aunque puede diferir en secuencia [18]. El motivo G2 o switch I, contiene una treonina (T) altamente conservada, en ocasiones sustituida por una serina, responsable de la coordinación del Mg(II) esencial para la actividad catalítica y coordinado por los átomos de oxigeno de los fosfatos y . En GTPasas tradicionales, esta T es parte de una secuencia consenso RXITI. El papel de la treonina (o serina) es promover la unión selectiva a GTP en relación con el GDP, además de prevenir la hidrólisis prematura de GTP, debido a que este elemento es el que contacta a la proteínaefectora[16]. El motivo G3 o Switch II también participa en la discriminación de GTP por interacción de una Glicina (G) y el fosfato- teniendo la secuencia consenso D/EXXG, el Ácido aspártico (D) se sitúa cerca del ion Mg(II) aunque puede o no contactarlo directamente o indirectamente mediante una molécula de agua. Cuando D es sustituido por un ácido glutámico (E) puede o no contactar al nucleótido [11, 19, 20]. Los motivos que participan en el reconocimiento y selectividad del anillo de la guanina y ribosa son G4 (T/NKXD) y G5 (SAL/K), la A del G5 se une al átomo de oxígeno (O6) de la guanina que impide por razones estéricas y electrostáticas la unión con el grupo NH2-6 de la adenina del ATP (Figura 1B)[1, 6, 11, 16, 20, 21] 5 Figura 1. Generalidades estructurales del dominio G. A) Estructura cristalográfica de la GTPasa Ras en complejo con GppNHp y el ion Mg(II) (PDB 5P21) en donde se muestran los elementos estructurales responsables de la unión a nucleótidos: G1 o P-loop (beis), G2 o swI (cian), el swII (rosa) que contiene al dominio G3 (morado), G4 (azul marino) y G5 (amarillo). Las hélices- se enumeran en color azul y las hebras- en color negro. B) Residuos que participan en la unión de nucleótidos de guanina. Se muestran con el mismo código de colores de la figura 1A. (Adaptado de Wittinghofer & Vetter [11]) Estructuralmente, las GTPasas actúan como switchs moleculares, oscilando entre una conformación D, unida a GDP y otra conformación T, unida a GTP, generalmente estos dos estados son estructuralmente diferentes. En la conformación T también denominada activa, la GTPasa puede reconocer a sus proteínas efectoras, sin embargo, en esta conformación T/activa no necesariamente es catalíticamente activa, debido a que muchas GTPasas requieren de otros factores activadores que pueden ser proteínas, cofactores o RNA. A estos factores activadores se les conoce como proteínas activadoras de GTPasa (GAP, del inglés, GTPase-Activating Protein)[12, 14, 15] Los cambios conformacionales que se generan en el domino G ocurren en las regiones de switch I y switch II, descritos en base a estudios estructurales de cristalografía de rayos X, de resonancia magnética nuclear y resonancia paramagnética electrónica de GTPasas unidas a GDP y GTP, estas diferencias pueden ser sutiles o grandes dependiendo de la GTPasa. (Figura 2) [22, 23]. B 6 Figura 2. El cambio conformacional de EF-Tu. El cambio del factor de elongación termoinestable (EF-Tu) bacteriano, es causado por la transición de GDP-GTP con la conformación GDP (azul) y GTP (verde), respectivamente. Switch I y II se indican con flechas y colores ligeramente diferentes. Las flechas rojas muestran la transición entre las dos conformaciones (Adaptado de Wittinghofer & Vetter [11]). Es de destacar que estructuras 3D del dominio G de diferentes GTPasas muestran una gran variación en sus detalles cuando se encuentran unidas a GDP, mientras que en las formas unidas a GTP las estructuras tienen un rearreglo conformacional muy parecido [16]. Este cambio conformacional pude ser mejor descrito como un mecanismo de resorte en la que las uniones entre los oxígenos del fosfato- se unen al grupo NH de los aminoácidos invariantes (T en switch I y G en switch II), acercando las dos regiones switch al fosfato- en la conformación T y la hidrólisis de GTP permite que las dos regiones de switch se relajen adquiriendo una conformación D (Figura 3)[11]. 7 Figura 3. Mecanismo de resorte en las GTPasas. A) El mecanismo de conmutación canónica implica la formación de puentes de hidrógeno entre los oxígenos del fosfato-γ con la Thr y Gly del switch I y II respectivamente (conformación T). B) hidrólisis de fosfato G por la asistencia de una GAP. C) Liberación de las regiones de switch después de la hidrólisis de GTP debido a la pérdida de los puentes de hidrógeno (conformación D) D) Intercambio del GDP por GTP debido a la contribución de la GEF (Adaptado de Vetter & Wittinghofer [12]). La adquisición de una conformación T o D depende de la unión del ligando funcionando a manera de ciclo de intercambio de nucleótidos. Este ciclo puede ser regulado por otros elementos accesorios. Por ejemplo, el intercambio de GDP por GTP se acelera por otra proteína o péptido específico denominado factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF, del inglés Guanine nucleotide Exchange Factor), mientras que la actividad de GTPasa es estimulada por una GAP. Durante el intercambio de GDP por GTP, la GEF se une a GTPasa y disminuye su afinidad por el GDP, lo que debilita la interacción GTPasa-GDP. A continuación, el GDP se disocia de la GTPasa y su lugar puede ser ocupado por GTP formando un complejo GTPasa-GTP, para su posterior hidrólisis favorecida por una GAP (Figura 4)[12, 24, 25]. 8 Figura 4. El ciclo funcional de las proteínas G con las GEF y las GAP. Las GEF ayudaran a el intercambio de GDP por GTP y las GAP aumenta la velocidad de fosforilación del GTP (Adaptado de Wittinghofer & Vetter [11]) Este ciclo funcional involucra una serie de reacciones rápidas que dirigen de un complejo binario GTPasa-GDP a uno terciario GEF-GTPasa-GDP de baja estabilidad para pasar de nuevo a una forma binaria libre de nucleótido GEF-GTPasa de mayor estabilidad en ausencia de nucleótido [26]. Este nuevo complejo binario solo existe transitoriamente en la célula ya que no se acumula, pasando nuevamente a un complejo terciario GEF-GTPasa-GTP, siendo disociado por la unión de GTP se estabiliza en una forma final GTPasa-GTP, lista para llevar su función y poder hidrolizar el GTP en GDP y Pi, completando finalmente el ciclo (Figura 5) [27]. Figura 5. La reacción de proteínas G y GEFs llevando de GDP a GTP. Las interacciones de las proteínas G y sus GEFs adoptan diferentes estados: A, C y E y posiblemente también en las fases B y D, siendo estas de vida muy corta por razones de afinidad (Adaptado de Cherfils & Chardin [27]). 9 Las GAPs tienen un papel fundamental en varios procesos celulares en donde algunas GTPasas necesitan ser activadas tras la unión a GTP. Intrínsecamente la actividad de las GTPasas es lenta, pero puede ser acelerada en varios órdenes de magnitud por las GAPs. Molecularmente las GAPs proporcionan un residuo cargado positivamente, como la arginina, acelerando la hidrólisis de GTP, esta arginina es denominada “dedo de arginina”, formando parte de la maquinaria catalítica para estabilizar el estado de transición y por tanto disminuir la energía de activación[28]. La velocidad de reacción en el caso de las la proteínas Ras o los factores de traducción están en el orden de 10-4 – 10-5 s-1. Cuando estas GTPasas forman un complejo con sus respectivas GAPs se acelera la reacción hasta los 10-1 s-1[11] . El mecanismo de la hidrólisis asistida por las GAP no es aplicable a todas las GTPasas. Para los factores de elongación el ribosoma desempeña el papel de GAP[12]. De esta forma las GAPs generan el paso de ser simples proteínas de unión a nucleótidos a GTPasas eficientes[29]. 10 1.2 Participación de la GTPasa EFL1 y de la proteína SBDS en la biogénesis ribosomal Los ribosomas juegan un papel fundamental en la vida de todas las células siendo un complejo ribonucleoproteico responsable de las síntesis de proteínas, decodificando la información del ARN mensajero (ARNm) en proteínas. La síntesis de ribosomas es uno de los procesos que demandan una mayor cantidad de energía en las células. En eucariontes la biogénesis ribosomal requiere de la coordinación de las tres ARN polimerasas y un trabajo finamente orquestado por más de 200 factoresde ensamble, los cuales se asocian a las partículas pre-ribosomales de forma transitoria. Estudios recientes han demostrado que los defectos en la biogénesis de ribosomas están asociados con varias enfermedades hereditarias denominadas ribosomopatías[30, 31, 32]. En los tres dominios filogenéticos de la vida, la maquinaria ribosomal completa y funcional se compone de dos subunidades, cada una construida en su propio andamio de ARN ribosomal (ARNr). El ribosoma 80S (S: unidad de sedimentación Svedberg) comprende a la subunidad ribosomal mayor 60S, que contiene los ARNr 25S, 5.8S y 5S así como 46 proteínas ribosomales (r-proteínas) y a la subunidad ribosomal menor 40S que contiene un ARNr 18S y 33 r-proteínas. Dentro de la gran cantidad de factores de maduración están incluidas ATPasas, GTPasas, helicasas, cinasas, endo- y exonucleasas, todas ellas dirigiendo modificaciones, ordenando, plegando y procesando el ARNr así como reclutando y ensamblando de forma secuencial r-proteínas[31, 32, 33, 34]. El ensamblaje y maduración de ribosomas eucariontes se lleva a cabo en diferentes compartimentos celulares, el pre-ensamblaje se lleva a cabo en el nucléolo y terminan madurando en el citoplasma[31, 35, 36]. Las proteínas ribosomales se sintetizan en el citoplasma y son importadas al núcleo. La formación de las dos subunidades ribosomales se inicia en el nucléolo donde se realiza la síntesis y procesamiento de ARNr así como la unión de algunas r-proteínas de asociación temprana mediante una serie de pasos precisos y sincronizados, la estabilidad de las proteínas ribosomales individuales aumenta dramáticamente en cada paso de la maduración de ribosomas, incluyendo el montaje en subunidades, exportación desde el núcleo y la unión a ARNm[37, 38, 39]. 11 Figura 6. Proceso de maduración ribosomal. El ARNr es procesado por factores de ensamblaje montando proteínas ribosomales para dar lugar a la partícula 90S. una gran cantidad de GTPasa es necesaria para la maduración de la subunidad mayor, así como de factores de exportación para pasar del núcleo al citoplasma, donde se llevan a cabo el último proceso de maduración, los cuales son reciclados para ser utilizados con partículas pre-60S nacientes. Adaptado de Nissan et al., 2002 [40]. Como se muestra en la figura 6, la maduración de la subunidad 60S requiere un amplio inventario de factores de maduración que se asocian y se disocian durante todo el proceso [40, 41]. En general, la maduración de la subunidad pre-60S se caracteriza por una reducción gradual de la complejidad de los factores de ensamblaje asociados cuando se mueve desde el núcleo al citoplasma[40]. Una vez que la subunidad pre-60S se ha exportado al citoplasma, reordenamientos estructurales son requeridos para pasar de las partículas inactivas pre-60S a partículas 60S funcionales. El resto de proteínas ribosomales se asocian a la subunidad mayor y la maduración de 12 ARNr se completa, mientras que los factores de maduración restantes se disocian y algunos se reciclan al núcleo. La liberación de los factores restantes parece seguir un proceso jerárquico que está mediado predominantemente por GTPasas[42]. Durante la fase final de la maduración ribosomal el factor de iniciación de la traducción 6 (TIF6 del inglés translation initiation factor 6) es liberado del precursor 60S y transportado de vuelta al núcleo para participar en rondas adicionales de maduración. El factor TIF6 (en humano eIF6) es cargado a la subunidad pre-60S desde el núcleo y es necesario para su exportación al citoplasma, debido a la fosforilación de dos residuos expuestos, Ser-174 y Ser-175[43, 44, 45]. La depleción de TIF6/IF6 conduce a una disminución de la actividad traduccional debido a la pérdida de disponibilidad de subunidad 60S en el citoplasma, siendo finalmente letal para la célula[46]. En la partícula pre-60S, TIF6/eIF6 se encuentra en el sitio que conformará la interfase de unión con la subunidad 40S bloqueando de esta manera la unión entre ambas subunidades. TIF6/eIF6 estableciendo contactos con diferentes sitios de la pre-60S: una región denominada B6, el bucle sarcina-ricina (SRL del inglés Sarcin Rincin Loop) y las proteínas estructurales Rpl23 y Rpl24 (en Saccharomyces cerevisiae) [47, 48], lo que explica su papel como factor de antiasociación (Figura 7)[49, 50, 51]. Por lo tanto, la eliminación de TIF6 de las subunidades nacientes 60S es un requisito indispensable para el montaje los ribosomas tradicionalmente activos 80S[51]. El mecanismo de liberación de TIF6/eIF6 de la subunidad pre-60S involucra la hidrólisis de GTP por EFL1 que actúa de forma conjunta con la proteína SBDS, permitiendo el ensamble del ribosoma 80S (Figura 7) [52]. Además, EFL1 evalúa el correcto montaje del tallo ribosomal y un bucle de rpl10 ubicado en el sitio P en el que las GTPasas se asocian durante la traducción [30, 35]. Experimentos de cinética enzimática realizados por Gijsbers et al. en el 2013, demostraron que en presencia de SBDS la Km de la GTPasa EFL1 se redujo a la mitad de su valor, lo que se traduce en un aumento de la afinidad a GTP, mientras que la velocidad intrínseca de hidrólisis no se alteró, esto parece sugerir que SBDS actúa como un GEF de EFL1[53]. 13 Figura 7. Modelos de liberación de TIF6 por SBDS (Sdo1) y EFL1. TIF6 se encuentra montada en la subunidad pre-60S, para su liberación es necesario la participación de SBDS y EFL1, SBDS es necesaria para la hidrólisis de EFL1 lo que genera la liberación de fosforo inorgánico entonces, EFL1 adopta una conformación cuando esta unidad a GDP y el dominio I de SBDS tienen un cambio conformacional, provocando que la liberación de TIF6 lo que permite la formación del ribosoma 80S (PDB 5ANB, 5ANC, 2L9N, 1FJG, 4WFN). Adaptado de Finch et al., 2011 [52]. 14 1.3 Ribosomopatías y síndrome de Shwachman-Diamond Las ribosomopatías son trastornos genéticos causan la alteración en la biogénesis y la función de los ribosomas, produciendo fenotipos clínicos específicos como fallos maquinaria ribosomal que llevan a la desregulación celular, incluso a la muerte de la misma [54]. Algunas ribosomopatías como la leucemia de Diamond-Blackfan, el síndrome de Shwachman-Diamond, disqueratosis congénita, hipoplasia cartílago-cabello y el síndrome de Treacher Collins, tienen cuadros clínicos como insuficiencia medular, anomalías físicas frecuentes y predisposición al cáncer. Siendo su mayor característica la presencia de mutaciones en genes que participan en la biogénesis o en proteínas estructurales del ribosoma [54, 55]. Se ha sugerido que la proteína p53 se activa por defectos en la biogénesis ribosomal, siendo esta vía el mediador critico de muchas las características clínicas de las ribosomopatías [56]. Entre las ribosomopatías se encuentra el Síndrome de Shwachman-Diamond (SDS), un trastorno autosómico recesivo causado por las mutaciones en el gen que codifica para la proteína SBDS, caracterizado por anomalías esqueléticas, insuficiencia pancreática exócrina y la alta predisposición a desarrollar síndrome mielodisplásico (SMD) y leucemia mieloide aguda (LMA)[50, 57, 58, 59]. Entre las características particulares es la presencia de un bajo número de neutrófilos en los niños con una incidencia entre el 88-100% de los pacientes. El SDS una incidencia de 1:168,000 en nacimientos vivos, lamentablemente en México no existen estadísticas que reflejen la cantidad de casos en el país. Los pacientes presentan susceptibilidad a infecciones bacterianas, micóticas y virales, siendo una sepsis la causa más común de fallecimientos a edades tempranas. Las personas con este padecimiento tienen probabilidad de padecer síndrome mielodisplásico o leucemia [60, 61].En el SDS el sistema óseo es mayormente afectado seguido del sistema pancreático y hematopoyético, entre otros órganos afectados se encuentra el hígado, cerebro, riñones, ojos, corazón, piel, testículos, corazón, estructura craneofacial y el sistema pancreático endocrino y nervioso [61]. El SDS ocupa el tercer lugar como el más común de falla medular después de la anemia de Fanconi y la anemia Blackfan-Diaminds [55]. Conocer la bases energético-estructurales de unión de SBDS a proteínas con las que interacciona, permitirá entender su papel en la maduración ribosomal, por consiguiente, conocer la implicación que tiene la presencia de mutaciones sobre SBDS en enfermedades como el SDS y así en un futuro generar estrategias para tratamientos sitio específicos que mejoren la calidad de vida de los pacientes. 15 1.4 Generalidades estructurales de EFL1 y SBDS EFL1 es una proteína de 1110 aminoácidos y es una GTPasa homóloga a los factores de elongación EF-G/EF-2 por lo que contiene la misma organización estructural básica, un dominio G en el dominio I y dominios del II al V, como en los otros factores de elongación el C-terminal está en el dominio IV. Una característica distintiva de EFL1 es la presencia de una inserción de 160 aminoácidos en el dominio II (Figura 8). Este fragmento no tiene equivalente en otros factores de elongación, interesantemente la ausencia de esta inserción resulta en un fenotipo termosensitivo. Lo anterior sugiere que es un elemento importante en la función de EFL1, aunque los detalles aún no están claros[62, 63]. Se han resuelto estructuras por microscopia crio-electrónica (Cryo-EM; Cryo- electron Microscopy) unidas al ribosoma en presencia y de SBDS y TIF6 (Figura 9) [64]. Experimentos bioquímicos han mostrado que el dominio de inserción es intrincadamente desestructurado[65]. Figura 8. Organización estructural de dominios de las proteínas EF-2 y EFL1. Ambas proteínas poseen dominios del I-V, en el dominio I se encuentra el dominio G que conserva los motivos de unión a nucleótidos de guanina (G1-G5). Una característica distintiva de EFL1 es una secuencia de inserción dentro del dominio II, que no se encuentra en otras GTPasas. Adaptado de Weis et al., 2015 [64]. 16 Figura 9. Estructura de resonancia magnética nuclear de la proteína SBDS. Se muestran los dominios del I-V, como la inserción en el mismo código de colores que en la figura 8, en el sitio de unión a nucleótidos se alcanza a ver algunos aminoácidos que participan en el reconocimiento de GDP/GTP (PDB 5ANB). La proteína SBDS humana tiene una arquitectura modular tridominio: el dominio I, también llamado Fysh que va del residuo 2 al 96; dominio II del residuo 97 al 170 y el dominio III que abarca los residuos del 171 al 250 (Figura 10). Finch y colaboradores demostraron mediante experimentos de RMN la alta flexibilidad de SBDS, mostrando que el dominio I se comporta como un módulo prácticamente independiente con respecto a los dominios II-III. El dominio I consiste en una hoja-β anti-paralela de cinco hebras retorcidas y cuatro hélices situadas en una cara de la hoja- . El dominio central (II) se compone de tres hélices-, mientras que el dominio III tiene un plegamiento similar a la ferredoxina. Las propiedades de estructura secundaria, plegamiento global y flexibilidad de SBDS humana son idénticas a su ortóloga en levadura [52]. 17 Figura 10. Estructura de resonancia magnética nuclear de la proteína SBDS. Se muestran los dominios I-III, la unión entre el dominio I y II (azul) es muy flexible [52] permitiendo el movimiento del dominio I con respecto a los otros dos dominios (PDB 2L9N). La interacción entre EFL1 y SBDS se rige por el dominio de inserción en EFL1 y los dominios II-III de SBDS [66, 65], mientras que el dominio I de SBDS interacciona con el ARN ribosomal [67]. Experimentos cinéticos de unión de EFL1 con nucleótidos de guanina han mostrado es un proceso caracterizado por un reordenamiento estructural del complejo tras la asociación inicial con el nucleótido [68]. Además, se han sugerido diversas funciones alternativas para SBDS en células de mamíferos, incluyendo la estabilización del huso mitótico [69], la quimiotaxis [70], apoptosis inducida por el ligando Fas [71], respuesta celular al estrés [72] y la migración de monocitos mediada por Rac2 [73]. El gen que codifica para la proteína SBDS se encuentra altamente conservado y existen ortólogos en arquea, plantas y otros eucariotas [65] 18 1.5 Sobreexpresión y purificación de proteínas recombinantes Gracias al estudio del DNA se han logrado desarrollar técnicas moleculares para su manipulación, lo que da como resultado un gran entendimiento de cómo funcionan los seres vivos. Gracias a estos avances es posible manipular diversos organismos genéticamente para poder biosintetizar proteínas de interés para ser usadas tanto en el ámbito industrial, médico y de investigación. La sobreexpresión heteróloga es la síntesis de proteínas de algún organismo, en otro completamente diferente desde bacterias hasta células eucariontes, a estas proteínas se les conoce como proteínas recombinantes (PR), también adquieren este término proteínas de sobreexpresión homóloga, aquellas proteínas que pertenecen y son producidas en el mismo organismo y que están bajo el control de un promotor. Las PR generalmente tienen características estructurales y funcionales muy similares a las proteínas nativas y se pueden producir con alta eficiencia, sin embargo, algunas pueden no ser funcionales o sufren problemas de plegamiento sobre todo cuando son proteínas de eucariontes superiores y se expresan en células procariontes. Para solucionar estos problemas se puede hacer una coexpresión con otras proteínas como las chaperonas o hacer uso de cepas modificadas para la sobreexpresión, así como utilizar diferentes organismos (p. ej. plantas, insectos, levaduras, entre otros) [74]. Figura 11. Características estructurales comunes en un plásmido. Se muestran las regiones del gen de resistencia a antibiótico, el gen insertado que codifica par nuestra proteína de interés y su región promotora. Adaptado de AddGene [75]. 19 El procedimiento para producir una PR consiste en 3 fases: la construcción del vector, la transformación y la sobreexpresión. En la construcción se diseña lo que se conoce como vector (plásmidos, virus, etc.), el cual contiene un origen de replicación, una región promotora, un sitio de clonación múltiple (SCM) donde se coloca la secuencia codificante de la proteína de interés; y genes reporteros o de resistencia a antibióticos (Figura 11). La transformación se realiza al insertar el plásmido dentro de una la célula hospedera convirtiéndola en la fábrica de síntesis de la proteína. La bacteria E. coli es uno de los sistemas de sobreexpresión más utilizados para la producción de PR, esta ofrece una gran cantidad de ventajas pues gracias a su rápida reproducción y el uso de medios de cultivo relativamente baratos es uno de los mejores sistemas para este propósito. Las levaduras también son células adecuadas para sobreexpresión de complejos proteicos que no son tan eficientemente producidas por bacterias. La sobreexpresión se refiere a la producción masiva de la proteína llevada a cabo por las bacterias o levaduras siendo más eficiente en la fase exponencial de crecimiento. Generalmente la región promotora se regula por el modelo del operón lac en bacteria y gal en levadura, con lo cual se regula el momento de la sobreexpresión, y al añadir un inductor como el isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, un análogo de la lactosano hidrolizable) o galactosa, el promotor deja de estar reprimido e inicia la síntesis de la PR [74, 76]. 20 1.6 Dicroísmo circular El dicroísmo circular (DC) es una técnica espectroscópica que provee información a nivel estructural de proteínas como estimación del contenido de estructura secundaria, procesos de plegamiento y desplegamiento y en general permite monitorear cambios conformacionales inducidos por diferentes factores como pH, temperatura, fármacos, ligandos, entre otros. El fenómeno de DC se define como la diferencia entre la absorción de un componente de luz polarizada circularmente a la izquierda y otro componente de luz polarizada circularmente hacia la derecha por compuestos ópticamente activos, es decir, una sustancia presenta dicroísmo circular cuando la absorción de un componente es diferente a la absorción del componente opuesto. En proteínas el DC permite estimar la estructura secundaria y su conformación debido a que el enlace peptídico es capaz de actuar como cromóforo en la región del UV lejano (180-250 nm) (Figura 12). De tal forma que permite diferenciar el contenido relativo de hélices-, hebras- y secuencias no repetitivas. El DC se presenta sólo en proteínas con estructura tridimensional definida de tal forma que permite diferenciar entre una estructura proteica plegada de una desplegada y en ciertos casos o bajo ciertas condiciones las transiciones presentes en el proceso de desplegamiento/plegamiento, esto último permite conocer las especies que se encuentran involucradas en la vía de plegamiento [77]. Las amidas como cromóforos tienen dos transiciones electrónicas denominadas n→π* y π→π* que muestran DC en 210-220 nm y en 190 nm, respectivamente. En el caso de las hélices- la transición n→π* es causante de una banda negativa con un mínimo a 222 nm y en el caso de las hebras- una banda negativa con un mínimo a 216-218 nm. La transición π→π* es responsable en el caso de hélices- de una banda positiva con un máximo a 190 nm y una banda negativa con un mínimo a 208 nm, así mismo es causante de una banda positiva con máximo a 198 nm, característica de hebras-β (Figura 12). Una banda sin DC que tiende al negativo con un mínimo alrededor de 200 nm indica la ausencia de estructura secundaria como lo es una proteína desplegada. En un ensayo de DC una señal negativa significa que se absorbe luz polarizada a la izquierda y una señal positiva que se absorbe luz polarizada a la derecha [78]. 21 Figura 102. Espectros de DC característicos para hélices-, hebras- y secuencias no repetitivas. El espectro para una proteína con estructura predominante de hélices- (línea negra) presenta dos bandas negativas de magnitud similar con mínimos en 222 y 208 nm, y una banda positiva con un máximo en 190 nm. El espectro para una proteína con estructura predominantemente hebras-(línea discontinua azul) presenta una banda negativa con un mínimo en 216-220 nm, y una banda positiva con un máximo alrededor de 195 nm. El espectro para una proteína desplegada o secuencias no repetitivas (p. ej. giros, lazos) presenta una banda que tiende al negativo con un mínimo alrededor de 200 nm (línea punteada rosa). En el inserto se muestran los cromóforos de las proteínas en la región del espectro electromagnético del UV/visible. Adaptado de Correa y Ramos, 2009 [77]. 22 1.7 Termodinámica de la interacción proteína-ligando Todos los procesos biológicos son finamente regulados por eventos de asociación molecular no covalentes. Procesos como la replicación de DNA, la comunicación celular, la sinapsis neuronal, la acción de las hormonas, el ingreso y degradación de fuentes de energía son solo algunos ejemplos en los cuales las interacciones proteicas tienen un papel protagónico. El conocer a detalle la forma en que interaccionan las proteínas con sus ligandos tanto cualitativa como cuantitativamente, constituye una herramienta clave para la comprensión de las bases moleculares de los procesos celulares fundamentales, del funcionamiento proteico, de las enfermedades y del mecanismo de acción de fármacos. Canónicamente, existen dos factores que gobiernan una interacción biomolecular, el factor estructural que depende de la complementariedad de la proteína con su ligando y el factor energético asociado a como las fuerzas moleculares se combinan para hacer de la interacción proteica un proceso espontaneo, es decir la termodinámica del proceso de asociación. El objetivo de conocer la termodinámica de un proceso de unión, no está sólo enfocado a incrementar el conocimiento sobre los factores subyacentes que contribuyen a la relación estructura- estabilidad-función proteica, triada central en la lógica molecular de la vida, a su vez permite la construcción de un marco lo suficientemente cuantitativo que conlleve al desarrollo de modelos energético-estructurales útiles en el diseño específico de fármacos e ingeniería de proteínas [79, 80, 81, 82]. Las interacciones proteína-proteína son fundamentales en un gran número de procesos biológicos. La afinidad entre estas interacciones, no solo se da por las disposiciones espaciales de los grupos interactuantes (entalpia), sino también por la dinámica de estos grupos (entropía), incluyendo los efectos del solvente [83]. El marco cuantitativo que permite develar las bases energéticas de un proceso de unión biomolecular puede ser descrito en términos de los parámetros termodinámicos de cambio de energía libre ΔGa, cambio de entalpia ΔHa, cambio de entropía ΔSa y cambio en la capacidad calorífica ΔCpa [84]. La formación de un complejo Proteína-Ligando puede ser expresado de la forma más simple por la relación [P] + [L] [PL], donde [P] y [L] son las concentraciones de las especies 23 reactantes de proteína P y ligando L libres, respectivamente y [PL] es la concentración del complejo formado en condiciones de equilibrio. Bajo estas condiciones, la distribución del complejo y de las moléculas libres está definida por la constante de asociación de equilibrio Ka o su expresión recíproca en términos de disociación Kd: 𝐾𝑎 = [𝑃𝐿] [𝑃][𝐿] = 1 𝐾𝑑 (ec. 1) 𝐾𝑑 = [𝑃][𝐿] [𝑃𝐿] = 1 𝐾𝑎 (ec. 2) A su vez, la estabilidad de un complejo proteico está dada por la diferencia en el ΔGa de las moléculas interactuantes y el complejo formado, por lo que, la Ka/Kd depende directamente de esta función de estado mediante la relación: [79, 85]. ∆𝐺𝑎 = −𝑅𝑇 ln 𝐾𝑎 = 𝑅𝑇 ln 𝐾𝑑 (ec. 3) donde R es la constante de los gases (R=1.98 cal mol-1 K-1) y T es la temperatura absoluta en Kelvin. El valor de ΔGa dicta la condición de equilibrio y determina la espontaneidad del proceso, aportando información sobre como las fuerzas moleculares se combinan para hacer de la asociación un proceso favorable. En un proceso de asociación que se lleva a cabo a T constante, el Ga puede ser disecado en sus componentes termodinámicos de Ha y Sa mediante la relación: [83]. ∆𝐺𝑎 = ∆𝐻𝑎 − 𝑇∆𝑆𝑎 (ec. 4) En un proceso de asociación molecular en medio acuoso, el Ha es aproximadamente igual al cambio de energía interna de los solutos y el solvente cuando P y L interaccionan formando un complejo P-L. Para un proceso de asociación exotérmico, el Ha es negativo e implica la formación de interacciones no covalentes energéticamente favorables entre átomos. En cambio, para un proceso endotérmico, el Ha es positivo debido a la eliminación de interacciones no covalentes energéticamente favorables [86]. A su vez, el Ha se puede disecar en dos componentes,uno intrínseco (Hintr) y otro de solvatación (Hsolv): ∆𝐻𝑎 = ∆𝐻𝑖𝑛𝑡𝑟 + ∆𝐻𝑠𝑜𝑙𝑣 (ec. 5) 24 El primero de ellos (Hintr) es relativo a la creación de nuevas interacciones electrostáticas y contactos de Van der Waals entre P y L debido a su complementariedad estereoquímica, por lo que resulta un componente favorable en la formación del complejo proteico. El segundo componente (Hsolv) es relativo a la desolvatación de grupos polares y no polares del sitio de unión debido a la interacción P-L, en donde, son eliminadas interacciones electrostáticas establecidas entre moléculas del solvente y los reactantes. El costo energético de remover estas moléculas del solvente, resulta en un componente desfavorable [83]. La entropía está relacionada con la pérdida o ganancia de grados de libertad. Los grados de libertad son las trayectorias necesarias para describir un sistema termodinámico. Las principales contribuciones al Sa, son la entropía de solvatación (ΔSsolv), la entropía conformacional (ΔSconf) y la entropía roto-traslacional (ΔSr/t): ∆𝑆𝑎 = ∆𝑆𝑠𝑜𝑙𝑣 + ∆𝑆𝑐𝑜𝑛𝑓 + ∆𝑆𝑟/𝑡 (ec. 6) El primero de ellos (ΔSsolv) es favorable para la asociación, y se origina de la liberación de las moléculas de agua al existir una desolvatación parcial o completa de la interfase de unión de la proteína y el ligando. Este efecto es la fuerza predominante en la asociación de grupos hidrofóbicos. El ΔSconf casi siempre es desfavorable, ya que el proceso de unión por lo general involucra el congelamiento de enlaces rotables covalentes sencillos en la proteína y el ligando. El ΔSr/t está asociado a la reducción del número de partículas en el medio debido a la asociación P-L, por lo que es una contribución siempre desfavorable y de la misma magnitud independientemente del tipo de complejo formado. Para un proceso de asociación bimolecular diversos estudios tanto empíricos como teóricos han calculado el valor ΔSr/t entre -4 y -10 cal mol-1 K-1, de acuerdo a otros autores un valor de -8 cal/mol K es aceptable para interacciones proteicas [83]. La asociación entre dos moléculas puede ser favorecida por contribuciones negativas de ΔH (entálpicamente dirigida) y/o positivas de ΔS (entrópicamente dirigida). Cuando los dos términos son favorables, pero uno de ellos es mucho más favorable que el otro, se dice que el parámetro que dirige la reacción es el que posee el valor más alto. Cuando los dos términos son favorables y de valores similares se dice que la asociación es tanto entálpico como entrópicamente dirigida [83, 86]. 25 Los cambios conformacionales acoplados a la interacción proteína-ligando constituyen las bases estructurales y energéticas fundamentales de la cooperatividad, alosterismo y en general de la regulación de las proteínas. En este sentido, el cambio en la capacidad calorífica (Cp) juega un papel primordial en la determinación de la energética asociada al plegamiento proteico y al reconocimiento molecular o interacción proteína-ligando (Cpa), ya que es un sensor de los rearreglos del solvente inducidos por cambios en la exposición de solutos como producto de la interacción, en otras palabras, indica los cambios conformacionales que tienen lugar en la proteína tras la unión del ligando [87, 88]. El Ha y el Sa se relacionan con el Cpa de forma dependiente de la temperatura mediante: ∆𝐻𝑎 𝑇 = ∆𝐻𝑎 𝑇0 + ∆𝐶𝑝𝑎(𝑇 − 𝑇0) (ec. 7) ∆𝑆𝑎 𝑇 = ∆𝑆𝑎 𝑇0 + ∆𝐶𝑝𝑎 ln 𝑇 𝑇0 (ec. 8) donde ∆𝐻𝑎 𝑇 y ∆𝑆𝑎 𝑇 son los cambios de entalpía y entropía de asociación a una determinada temperatura respectivamente, ∆𝐻𝑎 𝑇0 y ∆𝑆𝑎 𝑇0 son los cambios de entalpía y entropía de asociación a una temperatura de referencia 𝑇0, respectivamente. Debido a que el Ha es una función lineal simple con respecto a la T, la dependencia térmica del Ha nos proporciona directamente el valor de Cpa, que corresponde al valor de la pendiente en una regresión lineal [87, 88]. Grandes cambios en el Cpa dan evidencia de la existencia de interacciones hidrofóbicas en un proceso de asociación molecular. En el caso de la exposición de un residuo hidrofóbico u ocultamiento de un residuo polar en un medio acuoso, la estructuración de moléculas de agua alrededor del residuo, son desestabilizadas a medida que se aumenta la temperatura, absorbiendo la energía térmica lo que resulta en un aumento de la capacidad calorífica (Cpa > 0), y experimentalmente será más difícil el incremento de la T del medio acuoso. Por el contrario, el ocultamiento de residuos hidrofóbicos o exposición de residuos polares da lugar a un Cpa negativo, debido a que los puentes de hidrógeno que estabilizan la estructura del agua son tan energéticos que no pueden absorber la energía térmica, y la T aumenta más fácilmente [87, 88]. En interacciones P-L, el Cpa conecta los parámetros termodinámicos con información estructural debido a que es asociado al cambio de áreas superficiales accesibles al solvente polares 26 (ASAp) y no polares (ASAnp), en otras palabras, el ocultamiento o exposición al solvente de residuos no polares y polares [88]. Diversos estudios sobre compuestos modelo y datos de proteínas han relacionado la solvatación de ASAnp y ASAp con el incremento y decremento del valor Cpa, respectivamente, de acuerdo a la parametrización [87, 89]: ∆𝐶𝑝𝑎 = 𝛼 ∆𝐴𝑆𝐴𝑛𝑝 + 𝛽 ∆𝐴𝑆𝐴𝑝 (ec. 9) donde y son coeficientes de área para la solvatación de grupos no polares y polares respectivamente. De acuerdo a Murphy y Freire [89] la transferencia de áreas no polares de un estado expuesto al solvente a un estado no expuesto () ocasiona un decremento del ΔCpa de 0.45 cal (K mol Å2)-1, mientras que el ocultamiento de áreas polares () genera un aumento de ΔCpa de -0.26 cal (K mol Å2)-1. 27 1.8 Principios de ITC La herramienta más poderosa en la actualidad para determinar las propiedades energéticas de una reacción de asociación proteína-fármaco es la calorimetría de titulación isotérmica (ITC, del inglés Isothermal Titration Calorimetry) [85, 90]. Esta herramienta es capaz de determinar en un solo experimento los valores de constante de unión (Ka), estequiometría (n), ΔGa, ΔHa, ΔSa. El ΔCp puede ser determinado mediante la dependencia del ΔHa con respecto a la temperatura, ya sea realizando mediciones independientes a diferentes temperaturas o en un solo experimento a través del método de calorimetría de titulación multitérmica [84]. El calorímetro de titulación isotérmica está compuesto de dos celdas idénticas rodeadas por una cubierta adiabática. Un sensor detecta la diferencia de temperatura entre las celdas y a su vez entre las celdas y la cubierta. En el experimento, la muestra de proteína por lo general es colocada en la celda de muestra y la celda de referencia es llenada con solución amortiguadora o agua. En una jeringa acoplada se coloca el ligando. Antes de comenzar la titulación, una potencia constante es aplicada a la celda de referencia, esta señal activa el circuito de alimentación eléctrica localizado en la celda de muestra y representa la línea base. Experimentalmente, se observa directamente la potencia aplicada para mantener la temperatura de las dos celdas igual (isotérmicamente) dependientes del tiempo (Figura 13, parte superior). Durante la titulación, después de cada adición de pequeñas alícuotas de ligando, el calor absorbido o liberado en la celda de muestra es medido con respecto a la celda de referencia. Para una reacción exotérmica, la temperatura de la celda de muestra se incrementará, y la potencia de alimentación será desactivada paramantener la T entre las dos celdas igual. Para una reacción endotérmica, la T de la celda de muestra disminuye, por lo que el instrumento incrementa el poder de alimentación[84, 85]. Al inicio del experimento la celda de reacción es llenada con un volumen efectivo (V0) de proteína (P) que es detectado calorimétricamente. En cada inyección de ligando (L) un volumen de líquido sale de la celda de referencia que es igual al volumen de la inyección (v) disminuyendo ligeramente la concentración de la proteína. Para el análisis de las isotermas hay que corregir el total de las concentraciones tanto de la proteína [P]t como del ligando [L]t después de cada inyección (i). Esto se realiza mediante las ecuaciones 10 y 11 para la corrección del ligando y la proteína [91]. [𝐿]𝑡,𝑖 = [𝐿]0 (1 − (1 − 𝑣 𝑉0 ) 𝑖 ) (ec. 10) 28 [𝑃]𝑡,𝑖 = [𝑃]0 (1 − 𝑣 𝑉0 ) 𝑖 (ec. 11) donde [P]0 y [L]0 son las concentraciones iniciales de la proteína y el ligando respectivamente. Después de cada inyección una concentración de ligando [L]t se adiciona al total de volumen de proteína en la celda [P]t y como resultado de la unión la concentración del ligando libre [L] y del complejo cambian [PL] (ec. 1). En la interacción hay un intercambio de calor medido por el equipo como la energía necesaria para mantener la temperatura constante en cal/s. Para cada inyección el calor asociado (Q) a la reacción se obtiene integrando el área bajo la curva de cada pico, que es proporcional a la fracción de ligando unido [PL] (ec. 12) [92]. 𝑄 = 𝑛[𝑀]𝑡𝑉0∆𝐻 2 [1 + [𝑋]𝑡 𝑛[𝑀]𝑡 + 1 𝑛𝐾𝑎[𝑀]𝑡 − √(1 + [𝑋]𝑡 𝑛[𝑀]𝑡 + 1 𝑛𝐾𝑎[𝑀]𝑡 ) 2 − 4[𝑋]𝑡 𝑛[𝑀]𝑡 ] (ec. 12) A medida que la proteína se satura con el ligando, las magnitudes de los picos disminuyen hasta que el tamaño del pico refleja el calor de solo la dilución, dando como resultado una curva sigmoidea para un modelo de un solo sitio de unión de acuerdo a Wiseman y colaboradores [92]. De esta curva denominada isoterma de unión se extraen los parámetros termodinámicos: constante de asociación Ka, el cambio en la entalpía de asociación ΔHa, y la estequiometría n en un solo experimento (Figura 13) [85]. 29 Figura 13. Experimento típico de ITC. En la parte superior se muestran los datos crudos obtenidos mediante la titulación de una proteína [P] con un ligando [L], cada pico corresponde al potencial aplicado o disminuido para mantener la celda de referencia y la celda experimental a la misma temperatura. Al normalizar estos datos en función de la concentración se obtiene una isoterma de unión (parte inferior). El ajuste no lineal de un modelo de unión permite determinar directamente el valor de ΔHa (que determina la altura de la isoterma), la estequiometría n (la cual ocurre en el punto de inflexión de la curva), y la Ka (que determina lo abrupto del cambio de pendiente instantánea de la curva). El ΔGa se calcula a partir de la Ka según la ecuación 3 y el valor de ΔSa se calcula a partir de la ecuación 4. Adicionalmente, el análisis del ΔHa a diferentes temperaturas (T) nos permite calcular el valor del cambio en la capacidad calorífica de asociación (ΔCpa) (ecuación 13) [84, 85]. ΔCpa = ΔH/T (ec. 13) 30 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA EFL1 es una GTPasa que en eucariontes actúa de forma conjunta con la proteína SBDS para permitir la maduración de la subunidad ribosomal mayor 60S liberando al factor de antiasociación TIF6 de la superficie de la partícula pre-60S. Sin embargo, aún no se ha caracterizado la interacción de EFL1 con SBDS, tampoco se sabe si la afinidad por nucleótidos de guanina por parte de EFL1 se altera en la presencia de SBDS ni los cambios conformacionales que sufren las proteínas como resultado de la interacción. Es claro que esta información es crucial para comprender en detalle las últimas etapas de la maduración ribosomal y poder establecer un marco cuantitativo que permita la futura comprensión de las bases moleculares tanto del proceso normal, así como la participación de SBDS en el síndrome de Shwachman-Diamond. 31 3. JUSTIFICACIÓN La biogénesis ribosomal es un proceso finamente regulado por proteínas en donde las GTPasas juegan un papel protagónico permitiendo la disociación de factores de la superficie de las subunidades ribosomales inmaduras. EFL1 es una GTPasa que permite la liberación de TIF6 de la subunidad 60S y actúa de forma conjunta con la proteína SBDS. Aún se desconocen las bases energéticas y estructurales de la interacción entre EFL1 y SBDS, así como tampoco se han descrito los cambios conformacionales que tienen lugar en ambas proteínas tras su interacción. En este trabajo se pretende elucidar por primera vez y en detalle la energética asociada a la interacción de EFL1 con la proteína SBDS, así como caracterizar los cambios en el reconocimiento molecular de nucleótidos de guanina por parte de EFL1 en presencia y ausencia de SBDS para comprender con mayor detalle el último paso de la maduración de la subunidad ribosomal mayor 60S. 4. HIPÓTESIS Estudios previos de cinética enzimática (Gijsbers y col., 2013) sugieren que SBDS es el factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) de la GTPasa EFL1, por lo que, en nuestras mediciones calorimétricas, la presencia de SBDS incrementará la afinidad de EFL1 por el sustrato (GTP) y disminuirá su afinidad por el producto (GDP). 32 5. OBJETIVO GENERAL Caracterizar los determinantes energéticos (Ga, Sa, Ha y Cp) de la interacción entre la GTPasa ribosomal EFL1 y su factor intercambiador de nucleótidos SBDS mediante calorimetría de titulación isotérmica para comprender las bases energético-estructurales de la formación del complejo EFL1-GT(D)P-SBDS. 5.1 Objetivos particulares • Sobre expresar las proteínas recombinantes, EFL1 y SBDS en sistema de levadura y bacteria respectivamente. • Purificar la proteína EFL1 y SBDS mediante las técnicas de cromatografía convencionales. • Caracterizar a EFL1 y SBDS recombinantes mediante espectrometría de masas y dicroísmo circular. • Determinar mediante calorimetría de titulación isotérmica los parámetros de interacción (Ka, Ga, Sa, Ha) de la formación de complejos EFL1-GD(T)P y del complejo binario EFL1-SBDS con nucleótidos de guanina a diferentes temperaturas. 33 6. MATERIALES Y METODOS 6.1 Sobreexpresión y purificación de EFL1 y SBDS recombinante 6.1.1 Vector de expresión de EFL1 recombinante El vector de expresión pRS426-EFL1 que codifica para la proteína EFL1 fue proporcionado por la Dra. Nuria Sánchez Puig del Instituto de Química-UNAM. Esta construcción contiene en el extremo C-terminal una secuencia de reconocimiento para la proteasa TEV seguida de una etiqueta de histidinas (8xHis Tag) para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad a níquel. El marcador de selección para su replicación en bacteria es la resistencia a ampicilina y para su sobreexpresión en levadura es la complementación genética autótrofa a uracilo conferida por la presencia del gen URA3, lo que permite a la cepa huésped crecer en medio de cultivo carente de uracilo. La expresión de la proteína está bajo el control del promotor GAL1 y el terminador MATα, por lo que se utiliza galactosa como agente inductor. 6.1.2 Cepa de Saccharomyces cerevisiae BCY123 La cepa de expresión que se empleó fue Saccharomyces cerevisiae BCY123. Sus principales cualidades son: ser deficiente en proteasas y su capacidad de sobre expresar al factor de transcripción GAL4. Estas características permiten que sea unacepa idónea para la expresión de proteínas heterólogas presentes en plásmidos URA3+ y cuya expresión este controlada por el promotor GAL1. El genotipo relevante de BCY123 es MATα pep4::HIS3 pbr1::LEU2 bar1::HISG lus2::GAL1/10-GAL4 can1 ade2 trp1 ura3 his3 leu2-3. 6.1.3 Transformación de células de levadura con el plásmido pRS426-EFL1 La transformación de células de levadura se realizó por el método de acetato de litio según el procedimiento descrito por Giets & Schiestl[93] con menores modificaciones. Brevemente, se preparó un preinóculo de 100 mL con células Saccharomyces cerevisiae de la cepa BCY123 en medio YED(D). Se dejaron en agitación toda la noche a 35°C en un equipo de Excella E24 incubator Shaker (New Brunswich®). Se tomaron 1.5 mL de este cultivo y se inocularon en 50 mL de medio YEp(D), para incubar en agitación a 30°C por 3-5 h o hasta una DO600 de 0.6-0.7. Después, se colectaron las células por centrifugación a 5,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en una centrífuga Beckman-Coulter rotor JA-14. 34 El paquete celular se lavó con 3 mL de agua estéril por pipeteo y se volvió a centrifugar de la misma forma. El paquete celular se resuspendió con 1 mL de una solución estéril 1X TE/LiAc. Así las células están competentes para su transformación. Para introducir el plásmido de interés se mezclaron 200 uL de células, 200 uL de esperma de salmón (DNA acarreador) y 400 ng de ADN plasmídico. Se agregó 500 ml de solución estéril 1X TE/LiAc/PEG y se incubo a 30°C en agitación por 1 hora. Se agregó 60 uL de DMSO antes de dar un choque térmico a 43°C por 15 min. Una vez pasado el tiempo se colectaron las células por centrifugación y se resuspendió en 100-200 uL de 1x TE y se sembraron en medio SD-URA para incubarse por 1-2 días a 30°C. 6.1.4 Sobreexpresión y purificación de EFL1 recombinante Para la sobreexpresión, un preinóculo preparado a partir de una colonia de transformantes resuspendidas en 50 mL de medio sintético sin uracilo con solución 1X de leucina y triptófano (SD- URA Leu+Trp) suplementado con 2 % de glucosa se dejó crecer durante 12 h a 30 °C/200 rpm. Al cabo de este tiempo, el preinóculo fue repartido en cuatro matraces con 1.5 L de medio SD-URA Leu+Trp suplementado con 0.4 % de glucosa c/u, ajustando la densidad óptica (DO) a 0.1 y se incubaron a 30°C/200 rpm alrededor de 12 h hasta alcanzar una densidad óptica de ~2. Al cabo de este tiempo, se indujeron adicionando 250 mL de galactosa al 20 % a cada matraz y se incubaron por 18 h a 30°C/200 rpm. Finalmente, las células fueron colectadas por centrifugación (5000 rpm/5 min) en una centrífuga Beckman-Coulter rotor JA-14, distribuidas en cuatro tubos cónicos con 15-20 g de paquete celular cada uno y almacenados a -18 °C o resuspendidos en amortiguador de lisis para su inmediata purificación. En la purificación las células recién cosechadas o descongeladas fueron resuspendidas en 15 mL de amortiguador de amortiguador de lisis, suplementado con inhibidor de proteasas (PMSF) a una concentración final de 0.3 mM. La resuspención celular fue vertida al contener del equipo Bead-Beater previamente cargado con 50 mL de perlas humedecidas con amortiguador de lisis. Se aforó el contenedor con amortiguador de lisis al tope, se adaptó a la licuadora y se procedió a lisar. La lisis celular procedió con el esquema de 1 minutos de encendido con intervalos de 20 minutos de apagado, hasta completar 10 minutos de encendido. 35 El lisado fue colectado por decantación y aclarado por centrifugación a 15000 rpm durante 30 minutos para separar el detrito celular del extracto crudo (sobrenadante). A continuación, el extracto crudo se filtró por una membrana de 0.22 m (Merck Millipore). 6.1.5 Cromatografía de afinidad a níquel El sobrenadante filtrado obtenido de la lisis, se purifico mediante cromatografía de afinidad a níquel HisTrap FF de 5 mL (GE Healthcare) acoplada a una bomba peristáltica (mod. P-1, GE Healthcare) mediante le siguiente protocolo: i. 3 vol. de agua desionizada ii. 5 vol. de amortiguador A-Ni iii. Extracto crudo (se colecta la fracción No Retenido) iv. 5 vol. de amortiguador A-Ni (se colecta la fracción Lavado) v. 5 vol. de amortiguador B-Ni (se colecta la fracción Elución-Ni) vi. 5 vol. de amortiguador B-Ni vii. 3 vol. de agua desionizada viii. 3 vol. de etanol al 20 % Las fracciones fueron analizadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12 % en condiciones desnaturalizantes. 6.1.6 Corte con TEV La elución de la columna de níquel fue suplementada con 10 mg/mL de proteasa TEV recombinante y sometida a diálisis durante 18 h a 4°C. La muestra colectada se preparó para una cromatografía de exclusión molecular, concentrando hasta un volumen de 2 mL con un sistema amicon a 5000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga Beckman-Coulter rotor JA-14. 6.1.7 Purificación por cromatografía de exclusión molecular Para la purificación fue necesaria una columna HiLoad 16/600 Superdex 200 PG (GE Healthcare). Se equilibró con 150 mL de solución amortiguadora para la exclusión molecular (buffer Tris-HCl pH 8, 5 mM de MgCl2, 100 mM de NaCl y 5% de glicerol). Se inyectan los 2 ml de muestra obtenida después del corte con TEV, con un flujo de 0.7 mL/min. se recolectaron alícuotas de 2.5 36 mL y se identificó por espectrometría a una absorbancia de 280nm en que fracciones está contenida la proteína. Este proceso de purificación solo se aplicó a la proteína EFL1. 6.1.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) El análisis SDS-PAGE de las fracciones obtenidas de la purificación de EFL1 fueron analizadas empleando un gel de poliacrilamida al 10 % con una fracción concentradora al inicio del gel que contenía una concentración de poliacrilamida del 4 %. El marcador de peso molecular empleado fue BLUEstain 2 Protein ladder (Gold Bio, US). Las muestras fueron preparadas mezclando 20 l de cada fracción colectada con 20 l de amortiguador de carga y calentadas en un baño de agua hirviendo durante 5 min. Una vez aplicadas las muestras la migración electroforética procedió a 100 V con la cámara de electroforesis sumergida en un baño de hielo hasta que el indicador de bromofenol llegara aproximadamente 1 cm antes del final del gel (≈40-50 min). Posteriormente el gel fue fijado con una solución que contenía 10 % de ácido acético glacial, 50 % de MeOH y 40 % de agua destilada durante 15 minutos y teñido con una solución de azul de Comassie al 0.1 %. Una vez teñido se lavó con agua hasta eliminar el colorante en exceso. 6.1.9 Cuantificación y preparación de las muestras Las fracciones se dializaron en una membrana de corte de 12-14 kDa/25 mm (Spectra/Por® 2 Dry Standard RC Dialysis Tubing, Spectra Labs, US) contra amortiguador de calorimetría a 4 °C por alrededor de 18 h. La proteína dializada se filtró por una membrana de 0.45 m y el filtrado fue diafiltrado y concentrado en tubos centricones con membrana de 30 kDa para EFL1 y 10 kDa para SBDS de corte de peso molecular (Amicon® Ultra 15 mL Centrifugal Filters Merck Millipore, US) mediante centrifugación a 4500 rpm y periodos de 10-15 minutos por tres ocasiones intercambiando con amortiguador de calorimetría. La cuantificación se realizó por lectura de la absorbancia a 280 nm (A280) en un espectrofotómetro UV-1800 (Shimadzu, US) empleando una celda de cuarzo de 1 cm de paso de luz. El cálculo se realizó utilizando un coeficiente de extinción molar 280 calculado mediante el servidor Expasy-ProtParam tool (http://web.expasy.org/protparam/) asumiendo que todos los residuos de cisteína se encuentran reducidos. La muestra a cuantificar se preparó diluyendo la proteína 1:5 con amortiguador de calorimetría y obteniendo la lectura directamente del equipo el 37 cual descuenta de forma automática el blanco ya que cuenta
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