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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
DISEÑO Y VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA PARA 
LA DETERMINACIÓN DE ISONIAZIDA, PIRAZINAMIDA Y 
RIFAMPICINA EN PLASMA HUMANO. 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
PRESENTA 
MIRIAM ESQUIVEL RIVERO 
MÉXICO, D.F. 2014 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
PRESIDENTE: Dr. Fausto Rivero Cruz. 
VOCAL: M. en C. Juan Manuel Rodríguez. 
SECRETARIO: Dra. Miriam del Carmen Carrasco Portugal. 
1er SUPLENTE: M. EN C. Alejandro Ortiz Osornio. 
2° SUPLENTE: M. EN C. Kennet Rubio Carrasco 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: UNIDAD DE INVESTIGACIÓN EN
FARMACOLOGÍA, INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS “ISMAEL
COSÍO VILLEGAS”. 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Miriam del Carmen Carrasco Portugal. 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
M. EN C. ARIADNA NATALIA CERVANTES NEVÁREZ 
SUSTENTANTE: 
Miriam Esquivel Rivero 
I 
Índice. Página. 
Índice de figuras. V 
Índice de gráficas. VI 
Índice de tablas. VII 
Lista de abreviaturas. XI 
Capitulo 1. Resumen. 1 
Capítulo 2. Antecedentes. 3 
2.1. Métodos analíticos. 3 
2.2. Instrumentos analíticos. 3 
2.3. Parámetros de calidad. 5 
2.3.1. Rango 
2.3.2. Recuperación. 
2.3.3. Linealidad. 
2.3.4. Precisión. 
2.3.5. Exactitud. 
2.3.6. Estabilidad. 
2.3.7. Límite de cuantificación. 
2.3.8. Límite de detección. 
2.3.9. Selectividad. 
2.3.10. Tolerancia. 
6 
6 
6 
7 
7 
7 
7 
8 
8 
8 
2.4. Cromatografía. 8 
2.4.1. Tipos de cromatografía. 
2.4.2. Cromatogramas. 
2.4.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 
2.4.4. Algunas aplicaciones de la cromatografía en el campo 
farmacéutico. 
9 
10 
11 
13 
II 
Índice. Página. 
2.5. Cuantificación de fármacos en muestras biológicas. 13 
 2.5.1. Muestras biológicas. 
 2.5.2. Métodos de extracción. 
14 
15 
2.6 Farmacocinética. 18 
2.6.1. Liberación. 
2.6.2. Absorción. 
2.6.3. Distribución. 
2.6.4. Metabolismo. 
2.6.5. Excreción. 
2.6.6. Semivida biológica o vida media de eliminación del 
fármaco. 
19 
19 
19 
20 
20 
20 
2.7 Fármacos de interés y tratamiento contra la tuberculosis. 21 
2.6.1. Isoniazida (ISO) 
2.6.2. Pirazinamida (PRA) 
2.6.3. Rifampicina (RFA) 
21 
23 
25 
2.7. Tuberculosis. 28 
Capítulo 3. Materiales y método. 30 
3.1. Materiales. 30 
3.1.1. Reactivos y sustancias de referencia. 
3.1.2. Materiales. 
3.1.3. Instrumentos. 
30 
30 
31 
3.2. Desarrollo del método analítico. 32 
3.2.1. Preparación de soluciones. 
3.2.2. Soluciones stock, curva de calibración y controles. 
3.2.3. Solución de Adecuabilidad. 
3.2.4. Solventes del método de extracción. 
32 
34 
38 
38 
III 
3.2.5. Matriz biológica. 
3.2.6. Método de extracción. 
3.2.7. Condiciones cromatográficas. 
39 
39 
41 
3.2.8. Método de Procesamiento de datos. 41 
3.3. Validación del método analítico. 43 
3.3.1. Pruebas de confiabilidad del sistema. 
3.3.2. Selectividad del método. 
3.3.3. Recobro. 
3.3.4. Linealidad. 
3.3.5. Precisión y exactitud del método. 
3.3.6. Límite de cuantificación. 
3.3.7. Límite de detección. 
3.3.8. Estabilidad de la muestra. 
3.3.9. Estabilidad de soluciones estándar. 
3.3.10. Efecto de dilución. 
3.3.11. Tolerancias. 
43 
44 
45 
46 
47 
48 
49 
49 
51 
51 
52 
Capítulo 4. Resultados y análisis de resultados. 54 
4.1. Desarrollo del método analítico. 54 
4.1.1. Elección de la columna cromatográfica. 
4.1.2. Fase móvil, tiempo de retención (Tr), velocidad de 
flujo y longitud de onda. 
4.1.3. Método de extracción. 
54 
55 
56 
4.2. Validación del método analítico. 59 
4.2.1. Pruebas de confiabilidad del sistema. 
4.2.2. Selectividad del método. 
4.2.3. Recobro. 
4.2.4. Linealidad. 
4.2.5. Precisión y exactitud. 
59 
60 
62 
63 
76 
IV 
4.2.6. Límite de cuantificación y límite de detección. 
4.2.7. Estabilidad de la muestra. 
78 
81 
4.2.8. Estabilidad de soluciones estándar. 
4.2.9. Efecto de dilución. 
84 
86 
4.2.10. Tolerancias. 87 
4.3. Aplicación del método analítico. 91 
Capítulo 5. Conclusiones. 94 
Bibliografía 95 
V 
Índice de figuras. Página. 
Figura 2.1. Línea recta trazada por el método de mínimos 
cuadrados. 
5 
Figura 2.2. Cromatograma. 11 
Figura 2.3. Esquema representativo de un equipo HPLC. 12 
Figura 2.4. Celda de detector ultravioleta en HPLC 13 
Figura 2.5. Representación esquemática del sistema LADME. 18 
Figura 2.6. Estructura molecular de ISO 21 
Figura 2.7. Estructura molecular de PRA. 23 
Figura 2.8. Estructura molecular de RFA. 25 
Figura 2.9. Los principios activos incluidos en DOTBAL® 28 
Diagrama 3.1. Esquema de extracción en plasma de 
Isoniazida, Pirazinamida y Rifampicina. 
40 
Figura 4.1. Prueba de selectividad 60 
Figura 4.2. Selectividad del método 61 
Figura 4.3. Cromatogramas representativos del límite de 
detección y cuantificación de cada uno de los 
analitos 
80 
VI 
Índice de gráficos. Página. 
Gráfico 4.1. Linealidad en solución de ISO en el rango de 2.0 a 
20.0 µg/mL. 
64 
Gráfico 4.2. Identidad de la recta de ISO en sistema 65 
Gráfico 4.2. Linealidad en solución de PRA en el rango de 4.0 a 
40.0 µg/mL 
66 
Gráfico 4.4. Identidad de la recta en sistema de PRA 67 
Gráfico 4.3. Linealidad en solución de RFA en el rango de 3.0 a 
20.0 µg/mL 
68 
Gráfico 4.6. Identidad de la recta de RFA en sistema 69 
Gráfico 4.7. Linealidad en método de ISO en el rango de 2.0 a 
20.0 µg/mL 
70 
Gráfico 4.8. Identidad de la recta en método de ISO 72 
Gráfico 4.4. Linealidad del método de PRA en el rango de 4.0 a 
40.0 µg/mL 
73 
Gráfico 4.10. Identidad de la recta de PRA 74 
Gráfico 4.5. Linealidad del método de RFA en el rango de 3.0 a 
20.0 µg/mL 
75 
Gráfico 4.12. Identidad de la recta en método de RFA. 76 
Gráfico 4.13. Comparación de las concentraciones plasmáticas 
antes y después del ajuste de dosis 
93 
VII 
Índice de tablas Página. 
Tabla 3.1. Curva de calibración y controles de calidad de 
Rifampicina 
35 
Tabla 3.2.Curva de calibración y controles de calidad de 
Isoniazida y Pirazinamida 
37 
Tabla 3.3. Condiciones cromatográficas para la determinación 
de Isoniazida, Pirazinamida y Rifampicina 
42 
Tabla 3.4. Cmax de cafeína, acetaminofén e ibuprofeno y la 
preparación de las muestras de trabajo para la 
prueba de selectividad del método. 
45 
Tabla 4.1. Recobro del método analítico 62 
Tabla 4.2. Linealidad del sistema de Isoniazida. Promedio de 
quintuplicado de curvas de calibración en solución 
y sus parámetros estadísticos 
64 
Tabla 4.3. Consistencia de las curvas de calibración de 
Isoniazida en sistema 
64 
Tabla 4.4. Identidad de la recta de ISO. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva 
65 
Tabla 4.5. Linealidad del sistema de PRA. Promedio de la 
respuesta, altura de cada punto de cinco curvas de 
calibración en solución 
66 
VIII 
Índice de tablas Página. 
Tabla 4.6. Consistencia de las curvas de calibración de 
Pirazinamida en sistema. 
66 
Tabla 4.7. Identidad de la recta de PRA. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva 
67 
Tabla 4.8. Linealidad del sistema de RFA. Promedio de la 
respuesta, área de cada punto de cinco curvas de 
calibraciónen solución 
68 
Tabla 4.9. Consistencia de las curvas de calibración de 
Rifampicina en sistema 
68 
Tabla 4.10. Identidad de la recta de RFA. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva 
69 
Tabla 4.11. Linealidad del método de Isoniazida. Promedio de 
quintuplicado de curvas de calibración en solución 
y sus parámetros estadísticos 
70 
Tabla 4.5. Consistencia de las curvas de calibración de 
Isoniazida en método 
71 
Tabla 4.13. Identidad de la recta de ISO. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva 
71 
Tabla 4.14. Linealidad del método de PRA. Promedio de la 
respuesta, altura de cada punto de cinco curvas 
de calibración en solución. 
72 
Tabla 4.65. Consistencia de las curvas de calibración de 
Pirazinamida en método 
73 
IX 
Índice de tablas Página. 
Tabla 4.16. Identidad de la recta de PRA. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva. 
74 
Tabla 4.17. Linealidad del método de RFA. Promedio de la 
respuesta, altura de cada punto de cinco curvas de 
calibración en método 
75 
Tabla 4.187. Consistencia de las curvas de calibración de 
Rifampicina en método. 
75 
Tabla 4.198. Identidad de la recta de RFA. Promedio de la 
concentración calculada para cada uno de los 
puntos de la curva 
76 
Tabla 4.90. Repetibilidad del método analítico para cuantificar 
ISO, PRA y RFA en plasma. Promedio del 
quintuplicado analizado en un mismo día de 
trabajo 
77 
Tabla 4.101. Reproducibilidad del método analítico para 
cuantificar ISO, PRA y RFA en plasma. Promedio 
de los duplicados analizados en tres días 
diferentes. 
78 
Tabla 4.112. Límite de cuantificación. Promedio y datos 
estadísticos de las 5 determinaciones 
79 
Tabla 4.23. Comparación de la respuesta del límite de 
cuantificación con la señal ruido del blanco de 
plasma 
79 
Tabla 4.24. Límite de detección. Promedio y datos estadísticos 
de las 5 determinaciones 
79 
Tabla 4.25. Comparación de la respuesta del 79 
X 
Índice de tablas Página. 
Tabla 4.26. Estabilidad a temperatura ambiente (3 horas) 81 
Tabla 4.27. Estabilidad en refrigeración (4-8°C durante 6 
horas) 
82 
Tabla 4.28. Estabilidad de muestra procesada. 24 horas 
almacenadas en autoinyector 
82 
Tabla 4.29. Estabilidad de la muestra en ciclos de congelado-
descongelado. Durante dos ciclos. 
83 
Tabla 4.30. Estabilidad de la muestra a largo plazo. 
Almacenada a -70±10°C durante 59 días 
83 
Tabla 4.31. Estabilidad de soluciones en 2 meses. Se 
almacenaron en refrigeración (4-8°C/durante 52 
días) protegidos de la luz. 
85 
Tabla 4.32. Estabilidad de soluciones en 3 meses. Se 
almacenaron en refrigeración (4-8°C/durante 97 
días) protegidos de la luz. 
86 
Tabla 4.33. Prueba de efecto de dilución. 87 
Tabla 4.34. Tolerancia al cambio de proporción orgánica en la 
fase móvil de RFA, ±2% de acetonitrilo 
87 
Tabla 4.35. Tolerancia a preparar la mezcla de fase móvil 
manualmente 
88 
Tabla 4.36. Tolerancia al cambio de equipo 89 
Tabla 4.37. Tolerancia al cambio de pH en la fase móvil de 
Isoniazida y Pirazinamida ±0.2 unidades. 
90 
Tabla 4.38. Monitoreo de concentraciones plasmáticas de ISO, 
PRA y RFA. 
91 
Tabla 4.39. Monitoreo de las concentraciones plasmáticas de 
ISO, PRA y RFA. 
92 
XI 
Lista de abreviaturas. 
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución, por sus siglas en ingles 
High Performance Liquit Chromatography. 
psi: Del inglés pounds per sauiare inch, libra-fuerza por pulgada 
cuadrada. 
t1/2: Tiempo de vida media. 
TB: Tuberculosis. 
ISO: Isoniazida 
PAR: Pirazinamida. 
RFA: Rifampicina. 
pKa: Constante de disociación ácida. 
pH: Potencial de hidrógeno. 
PAS: ácido p-aminosalicílico. 
M. TB: Mycobacterium tuberculosis. 
CIM: Contracción mínima inhibitoria. 
IM: Intramuscular. 
LCR: Líquido cefalorraquídeo. 
°C: Grados centígrados. 
KH2PO4: Fosfato de potasio. 
NaH2PO4: Fosfato de sodio. 
TFA: Ácido trifluoroacético. 
LD. Límite de detección. 
LC: Límite de cuantificación. 
CC: Curva de calibración. 
XII 
Cmax: Concentración máxima. 
BR: Blanco de reactivos. 
BP: Blanco de plasma. 
ID: Diámetro interno. 
Tr: Tiempo de retención. 
Conc.: Concentración. 
Desv. Std.: Desviación estándar. 
C.V.: coeficiente de variación. 
EE: Error estándar. 
Desv. Abs.: Desviación absoluta. 
Capítulo 1 
Resumen 
1 
La cromatografía líquida de alta resolución o mejor conocida como HPLC 
es uno de los métodos analíticos más ampliamente utilizados en la 
identificación y cuantificación de componentes endógenos y exógenos en 
fluidos biológicos. 
Dentro del campo de la farmacología clínica una de las aplicaciones más 
importantes es el monitoreo terapéutico de los medicamentos, esto con 
la finalidad de llevar a cabo ajustes en la dosificación manteniendo las 
concentraciones de los fármacos dentro de la ventana terapéutica y así 
obtener la máxima eficacia terapéutica con el mínimo riesgo de 
toxicidad. 
Los métodos analíticos utilizados en un laboratorio deben ser evaluados 
y sometidos a pruebas que aseguren la reproducción de resultados 
válidos y coherentes con el objetivo previsto, es decir, han de ser 
validados. 
El principal objetivo de este trabajo fue desarrollar y validar el método 
analítico por HPLC, para la determinación y cuantificación de los 
fármacos Isoniazida, Pirazinamida y Rifampicina en plasma humano; 
estos tres principios activos son la base del tratamiento de primera 
elección contra la tuberculosis, una enfermedad que demanda atención 
constante y diseño de estrategias innovadoras para su combate por 
parte del Sistema de Salud. 
El proyecto se desarrollo con apego a la NOM-177-SSA1-1998 [1], 
apartado 9.1 validación de un método analítico, cumpliendo con los 
criterios de linealidad, precisión (repetibilidad y reproducibilidad 
intralaboratorio), exactitud, estabilidades a condiciones de 
Capitulo 1 
Resumen 
2 
almacenamiento, efecto de dilución, límite de cuantificación y de 
detección, selectividad y tolerancia. 
Los rangos de concentración fueron de 2.0 - 20.0; 4.0 - 40.0 y 3.0 - 
20.0 µg/mL con puntos control de 4.5, 9.0 y 18.0; 9.0, 18.0 y 
36.0 µg/mL y 6.0, 11.0 y 16.0 µg/mL para Isoniazida, Pirazinamida y 
Rifampicina, respectivamente. Se recobraron de manera simultánea los 
fármacos en un método de extracción en fase sólida y su cuantificación 
se llevó a cabo por HPLC acoplado a detección UV. 
El método validado permite la cuantificación sencilla, rápida, sensible y 
reproducible de Isoniazida, Rifampicina y Pirazinamida, lo que lo hace 
útil para la determinación de los fármacos en estudios farmacocinéticos, 
y de monitoreo terapéutico en pacientes con tuberculosis. 
Capítulo 2 
Antecedentes 
3 
2.1. Métodos analíticos. 
Los métodos químicos están basados en interacciones materia-materia, 
esto es, en reacciones químicas. La revolución tecnológica e industrial, 
a la vez que plantea nuevos problemas, ha impulsado el desarrollo de 
nuevos métodos, de forma que actualmente puede afirmarse que todas 
las propiedades de la materia pueden utilizarse para el establecimiento 
de un método de análisis. Surgen así una gran cantidad de métodos 
instrumentales basados en interacciones materia-energía [2]. 
Los métodos de análisis se clasifican en cualitativos, donde a partir de 
una propiedad se puede indicar la presencia o ausencia de un analito 
en una matriz y; cuantitativos, donde la propiedad medida es 
proporcional a la concentración del analito en la matriz. 
Frecuentemente, el mismo método instrumental es usado para el 
análisis cualitativo y cuantitativo. 
2.2. Instrumentos analíticos. 
Puede considerarse que un instrumento analítico es un dispositivo que 
convierte una señal, que no suele ser detectable directamente por el 
ser humano, en una forma que si lo sea. 
En muchos análisis químicos se mide la respuesta delprocedimiento 
analítico a cantidades conocidas de analitos (patrones o estándares) 
para interpretar luego la respuesta a cantidades desconocidas, para 
ello se prepara una curva de calibración, que es un gráfico que 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
4 
representa la respuesta de un método analítico en función de 
cantidades conocidas del analito. 
Las curvas de calibración obtenidas a partir de series de datos de 
estándares es, posiblemente, el método más utilizado. Consiste en 
medir la propiedad analítica de interés (P) en una serie de muestras de 
composición (C) conocida preparadas todas ellas en las mismas 
condiciones. 
El calibrado obtenido se emplea para determinar la cantidad de 
concentración en una muestra desconocida midiendo la magnitud de P 
en idénticas condiciones que los estándares y obteniendo C por 
interpolación. 
Las curvas de calibración se representan siempre con la respuesta del 
instrumento en el eje vertical (y) y las concentraciones sobre el eje 
horizontal (x). 
El valor de C se puede obtener teniendo en cuenta la precisión de las 
medidas para las diversas concentraciones, para ello se emplean 
métodos estadísticos. 
El método de mínimos cuadrados es la técnica más ampliamente 
utilizada para ajustar una recta (o una curva) a un conjunto de datos y 
estimar por interpolación la concentración de muestras problemas [3]. 
 
Se utiliza la ecuación de la línea recta 
 
Donde m es la pendiente y b es la ordenada de origen. 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
5 
 
Figura 2.1. Línea recta trazada por el método de mínimos cuadrados. 
Donde m (pendiente) corresponde a la relación lineal entre la señal 
analítica (y) y la concentración (x); b (ordenada al origen) es el 
punto de corte con el eje y [3]. 
 
Del método de mínimos cuadrados también se obtienen datos como el 
coeficiente de correlación, r (parámetro que se utiliza para estimar el 
grado de ajuste de los puntos experimentales a la recta). 
 
2.3. Parámetros de calidad. 
Los parámetros de calidad son los criterios cuantitativos que se utilizan 
para decidir si un método es adecuado o no para resolver un 
determinado problema analítico. Son, por lo tanto, los criterios que se 
utilizan en la validación de métodos analíticos [4]. Son la 
materialización o expresión numérica de características o indicadores 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
6 
de la calidad de los métodos tales como la precisión, exactitud, 
sensibilidad, selectividad, etc. 
La Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-1998 que establece las 
pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es 
intercambiable. Requisitos a que deben sujetarse los terceros 
autorizados que realizan pruebas. En su sección 9.1. Validación de 
métodos analíticos, establece los parámetros y valores mínimos 
aceptables para cada uno de ellos necesarios para validar un método 
analítico. 
2.3.1. Rango: Al intervalo de un método analítico definido por 
las concentraciones comprendidas entre el nivel superior 
e inferior del compuesto, en el cual se ha demostrado 
que el método analítico es preciso, exacto y lineal. 
 
2.3.2. Recuperación absoluta: Es la eficiencia de un método 
analítico para cuantificar el o los compuestos por 
analizar en la muestra biológica. 
 
2.3.3. Linealidad: Se considera que un método es lineal si 
existe una relación directamente proporcional entre la 
respuesta obtenida y la concentración del analito 
buscado cuando se aplica el método. Frecuentemente se 
utiliza como criterio de la linealidad un coeficiente de 
correlación (r) elevado, mayor de 0.99. 
 Se debe definir un modelo que describa la relación matemática entre 
concentración y respuesta. Esta relación debe ser continua y 
reproducible a lo largo del rango. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
7 
2.3.4. Precisión. Mide el grado de dispersión entre los 
resultados analíticos obtenidos de una serie de 
mediciones repetidas del mismo analito realizadas en las 
mismas condiciones previas en el método. Refleja los 
errores aleatorios que se producen cuando se utiliza un 
método. 
La precisión se mide como repetibilidad y reproducibilidad. 
La precisión se expresa en términos de coeficiente de variación o 
desviación típica relativa de los resultados analíticos obtenidos. 
2.3.5. Exactitud: Mide el error sistemático o determinado de un 
método analítico. Se puede determinar por comparación 
con muestras estándar y con un método patrón. 
La exactitud se expresa en términos de la desviación absoluta entre los 
datos teóricos y los resultados obtenidos. 
 De esta forma la exactitud y la precisión determinan el error total del 
análisis. 
2.3.6. Estabilidad: Determina las condiciones de temperatura y 
tiempo entre otros, en las que el compuesto permanece 
estable en la matriz biológica durante su manejo, 
almacenamiento y procesamiento. 
 
2.3.7. Límite de cuantificación: Es el menor contenido 
mensurable que permite cuantificar el analito con 
exactitud y precisión. 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
8 
2.3.8. Límite de detección: Determina la concentración a la 
cual la señal del compuesto por analizar en la matriz 
biológica puede distinguirse de los niveles de ruido. Se 
debe sustentar científicamente el criterio empleado para 
establecerlo. 
 
2.3.9. Selectividad: Hace referencia al grado de interferencia 
de una especie sobre la identificación de otras. 
 
2.3.10. Tolerancia: Evalúa la tolerancia del método analítico a 
pequeñas, pero deliberadas modificaciones (p. ej. pH, 
disolventes, fase móvil, longitud de onda, temperatura, 
tiempo de incubación, etc.). 
 
2.4. Cromatografía. 
La cromatografía es una de las técnicas analíticas más utilizada en el 
laboratorio químico para separar, identificar y cuantificar los 
componentes de una mezcla compleja [5]. 
Se basa en la distribución de especies distintas entre dos fases, una de 
ellas denominada fase estacionaria, y la otra, fase móvil. 
La fase estacionaria es un sólido, un líquido o un gel viscoso que 
recubre un sólido. La fase móvil puede ser un líquido o un gas que 
fluye en contacto con la fase estacionaria. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
9 
El fenómeno de migración de los componentes de la mezcla a lo largo 
de la fase estacionaria, impulsados por la fase móvil, recibe el nombre 
de elución. 
La elución de los compuestos presentes a velocidades diferentes por la 
fase móvil conduce a su separación. 
 
2.4.1. Tipos de cromatografía. 
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase móvil 
se pueden distinguir los siguientes tipos de cromatografía: 
 Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y 
la móvil un líquido. 
 
 Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido 
anclado a un soporte sólido. 
 
 Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no 
volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas. 
 
 Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la 
móvil un gas. 
Según el tipo de interacciones que se establecen entre los 
componentes de la mezcla, la fase móvil y la estacionaria se pueden 
distinguir entre: 
 Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un sólido 
polar capaz de adsorber a los componentes de la mezcla 
mediante interacciones de tipo polar. Como ejemplo se puede 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
10 
hacer mención a la interacción de los analitos con la columna 
cromatográfica del sistema HPLC. 
 
 Cromatografía de partición: La separación se basa en las 
diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla en las 
fases estacionaria y móvil, donde ambas fases son líquidas. 
 
 Cromatografía de intercambio iónico: La fase estacionaria es un 
sólido que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya 
carga se puede intercambiar por aquellos iones presentes en la 
fase móvil. Como ejemplo se puede hacer mención al método de 
separaciónen fase sólida empleado en este proyecto donde la 
columna de separación es un dispositivo recubierto de sílica 
preparada con dos monómeros: N-vinilpirrolidona y 
divinilbenceno que le proporcionan un balance hidrofílico-lipofílico 
con la capacidad de separar componentes ácidos, básicos y 
neutros en muestras complejas. 
 
 
2.4.2. Cromatogramas. 
El resultado obtenido con cualquier técnica cromatográfica es un 
gráfico que recibe el nombre de cromatograma (Figura 2.2). En el que 
se representa una señal dependiente de las moléculas presentes en la 
muestra frente al tiempo transcurrido desde que se haya añadido la 
fase móvil. Este cromatograma presenta picos u oscilaciones con los 
que es posible realizar análisis cualitativos y cuantitativos. Los 
primeros se basan en la posición de los picos en el eje del tiempo, 
identificando los distintos componentes de la muestra, mientras que los 
segundos se basan en el área bajo los picos o intensidad de los 
mismos, determinando la cantidad presente de cada analito. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
11 
 
Figura 2.2. Cromatograma. En este cromatograma se observan tres 
diferentes analitos: A, B y C con diferentes tiempos de retención y respuesta 
[6]. 
 
2.4.3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es la técnica de 
separación más ampliamente utilizada en la actualidad debido a su 
sensibilidad, a su adecuación para realizar determinaciones 
cuantitativas exactas y a su gran aplicabilidad a diferentes tipos de 
sustancias [7]. 
El esquema fundamental de un cromatógrafo de alta resolución está 
constituido por un depósito y dispositivo de bombeo de la fase móvil 
que opera a presión elevada (hasta 5000 psi), un sistema de inyección 
de la muestra, columnas resistentes con rellenos, generalmente de 
acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria de tamaño de partícula 
entre 3 y 10 µm, un detector y un sistema de registro gráfico (Figura 
2.3). 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
12 
 
Figura 2.3. Esquema representativo de un equipo HPLC. 
 
Entre los detectores más utilizados destacan los de absorbancia, de 
fluorescencia y de espectrometría de masas, siendo estos últimos los 
más utilizados hoy en día [7]; Sin embargo por su aplicación en este 
proyecto solo se mencionaran las características del detector UV-
Visible. 
Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los 
que uno de los haces pasa por la muestra y el otro a través de un filtro 
que reduce su intensidad (Figura 2.4). Para comparar las intensidades 
de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. 
También se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las 
medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de 
un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
13 
 
Figura 2.4. Celda de detector ultravioleta en HPLC 
 
2.4.4. Algunas aplicaciones de la cromatografía en el campo 
farmacéutico. 
Entre las aplicaciones más importantes se encuentra la identificación y 
cuantificación de fármacos tomados con fines no terapéuticos, 
generalmente analgésicos, sedantes, tranquilizantes y estimulantes. 
Suele darse en pacientes inconscientes o semiconscientes en los que 
debe averiguarse cuál fue el fármaco ingerido [8], sin embargo por los 
costos solo se utiliza en laboratorios especializados para el análisis de 
fármacos poco frecuentes. 
La cromatografía líquida de alta eficiencia es una de las técnicas más 
importantes en el análisis de fármacos y ha contribuido al reciente 
desarrollo de la monitorización farmacoterapéutica. 
 
2.5. Cuantificación de fármacos en muestras biologicas. 
En fluidos biológicos el fármaco de interés se encuentra inmerso en una 
mezcla compleja de carbohidratos, proteínas, lípidos y otros 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
14 
componentes, que pueden interactuar entres si interfiriendo su 
determinación. Es por ellos que la selección de la matriz biológica en la 
que se realizará la cuantificación del fármaco, se vuelve un factor 
importante durante el desarrollo de un método analítico. La sangre, el 
plasma, el suero y la orina son los fluidos biológicos más comúnmente 
utilizados para el análisis de fármacos [9]. 
 
2.5.1. Muestras bilógicas. 
El análisis de una muestra representativa es esencial ya que se analiza 
solo una pequeña porción de una muestra de mayor volumen y los 
datos analíticos se interpretan en términos de la muestra entera. Los 
análisis validos de orina o heces requieren de obtener la nulidad total 
de un periodo de recolección dado y que las alícuotas analizadas sean 
de una muestra total cuya uniformidad sea garantizada por mezclado u 
homogenización. 
Ya que las muestras biológicas son perecederas, es necesario el uso de 
preservativos o congelarlas si hay un retraso en su análisis. Si un 
ensayo requiere la separación de plasma o suero de una muestra de 
sangre total, se debe obtener de la muestra recién extraída antes de la 
adición de preservativos o del almacenamiento. Congelar sangre total 
causa lisis en las células evitando así la subsecuente separación de 
plasma o suero. La sangre total se puede almacenar con citrato, 
oxalato o heparina para evitar su coagulación. Las muestras de orina 
pueden ser estabilizadas con tolueno para retardar el crecimiento 
microbiano, mientras que tejidos o heces no requieren preservativos si 
son congelados inmediatamente (-18 °C). Lo más recomendable es 
analizar los especímenes enseguida del muestreo evitando la 
degradación [10]. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
15 
2.5.2. Métodos de extracción. 
Una vez obtenida una muestra representativa para su análisis se debe 
proceder a la preparación o tratamiento de la muestra que conlleve a la 
determinación del analito en ausencia de interferencias, tratando de 
disminuir la manipulación de la muestra minimizando problemas de 
contaminación y pérdidas del analito. 
A continuación se mencionaran los métodos de extracción de mayor 
uso en los laboratorios analíticos. 
 
 Extracción líquido-líquido. 
La extracción líquido-líquido es un proceso de transferencia de uno o 
varios analitos desde una fase líquida (muestra problema) a otra 
también líquida inmiscible con la primera. Inicialmente se mezcla un 
disolvente insoluble (fase orgánica) con la muestra (fase acuosa) para 
obtener un sistema de dos fases. La selección del disolvente apropiado, 
el ajuste de pH de la fase acuosa y la adición de agentes salinos son 
fundamentales para conseguir una mayor eficiencia en la extracción. 
No obstante este tipo de extracción tiene una serie de inconvenientes 
como son la formación de emulsiones, el manejo de volúmenes 
elevados de muestra, empleo de disolventes tóxicos e inflamables, así 
como el riesgo de pérdida o contaminación durante las distintas 
etapas. 
 
 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
16 
 Extracción en fase sólida. 
La extracción en fase sólida es actualmente la técnica más empleada 
para la preparación muestras y ha remplazado en muchos casos a la 
extracción líquido-líquido. En esta técnica se hace pasar a la muestra a 
través de una fase sólida (polar, no polar, intercambio iónico, etc.), 
quedando retenidos algunos de los compuestos y el resto pasan 
inalterados. Posteriormente, si los analitos de interés han quedado 
retenidos, éstos podrán ser eluidos con un pequeño volumen de 
disolvente. 
Los objetivos que se consiguen con la extracción en fase sólida son: 
preconcentración de trazas, limpieza de las muestras, estabilización de 
los analitos de interés, cambio de fase y fraccionamiento de mezclas 
complejas. 
El modo de adsorción del analito en el material de extracción en fase 
sólida depende de las características de los materiales aplicados. El 
mecanismo de interacción del soluto con la superficie de la faseestacionaria (RP_C18, poliestireno-divinilbenceno, etc) se lleva a cabo 
por fuerzas de Van der Waals, de dispersión o hidrofóbicas. Es un 
proceso de baja energía (5Kcal/mol) análogo al que tiene lugar en la 
extracción líquido-líquido. También pueden darse en menor proporción 
y dependiendo del sorbente, otros tipos de interacciones como dipolo-
dipolo, enlaces de hidrogeno e intercambios iónicos [11]. 
 
 Precipitación de proteínas. 
Existen dos procedimientos que difieren en su principio y pueden ser 
utilizados para lograr la desnaturalización y precipitación de proteínas. 
El primero y más sencillo consiste en la adición de ácidos, sales o 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
17 
disolventes orgánicos para precipitar las proteínas. Los problemas 
asociados a este proceso es que el fármaco de interés puede 
degradarse o precipitar junto con las proteínas presentes en la matriz 
biológica. Con el uso de disolventes orgánicos, se puede contrarrestar 
ese problema. El segundo método consiste en la adición de enzimas 
plasmáticas, sin embargo al utilizar dichas proteínas se necesitan 
condiciones de temperatura y pH extremadamente controlados además 
de que las enzimas proteolíticas son especificas para ciertas proteínas 
[9]. 
 
 Extracción con fluidos supercríticos. 
Es una técnica alternativa de extracción sólido-líquido que tiene varias 
ventajas sobre otros métodos como lo son menor tiempo de 
extracción, menor cantidad de solventes y reducción de la temperatura 
de trabajo. Sin embargo, la alta inversión requerida para el montaje 
del equipo así como los pocos datos ingenieriles y termodinámicos, 
reportados sobre el tema han impedido el empleo masivo de ésta 
técnica de extracción. 
El poder solvatante de un fluido supercrítico radica en la alta densidad 
que presenta (similar a la de los líquidos), ya que la densidad 
determina la intensidad de las fuerzas intermoleculares entre las 
moléculas de solvente y las de soluto. La baja viscosidad y la alta 
difusión que presentan estos fluidos permiten que la transferencia de 
masa sea rápida y con gran capacidad. Además debido a la nula 
tensión superficial, ellos pueden penetrar a través de pequeños poros 
del material a extraer, como consecuencia de lo anterior, los fluidos 
supercríticos poseen un poder solvente similar al de los líquidos con 
características propias de los gases [12]. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
18 
2.6. Farmacocinética. 
La farmacocinética se define como la parte de la farmacología 
dedicada al estudio del curso temporal de las concentraciones de los 
fármacos en el organismo, así como su relación con la respuesta 
farmacológica. Estos procesos cinéticos o conjunto de mecanismos que 
se desarrollan en el organismo sobre el medicamento administrado 
son: absorción, distribución, metabolismo y excreción. 
En la figura 2.5 se representan los posibles procesos cinéticos que 
pueden influir en la respuesta del fármaco, esto no implica que todos 
tengan lugar sobre cada uno de los medicamentos. 
 
 
Figura 2.5. Representación esquemática del proceso LADME (Liberación-Absorción-
Metabolismo-Eliminación), para formas farmacéuticas con diferentes vías de 
administración [13] 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
19 
La aplicación de los estudios cinéticos a la práctica clínica es lo que se 
conoce con el nombre de monitorización de fármacos. 
 
A continuación una breve descripción de los parámetros 
farmacocinéticos: 
2.6.1. Liberación. Este proceso se refiere a las diferentes 
formas por las que el principio activo se separa del 
medicamento administrado para poder ser 
posteriormente absorbido por el organismo. 
 
2.6.2. Absorción. Proceso farmacocinético por el que el 
fármaco, una vez liberado, alcanza la circulación 
sanguínea. 
 
2.6.3. Distribución. Se entiende como el paso del fármaco a los 
diferentes compartimentos celulares, ya sea intracelular, 
extra-celular o intersticial. 
 
Una vez que el fármaco llega a la circulación sanguínea, tiene lugar la 
distribución por el organismo hasta alcanzar un estado de equilibrio 
dinámico. 
 
El paso del fármaco de los capilares sanguíneos a los tejidos solo se 
puede producir si está en su forma libre, y en función de sus 
características fisicoquímicas, tamaño molecular o grado de unión a 
proteínas plasmáticas, siguiendo diferentes mecanismos: 
 
 Difusión pasiva, a favor de un gradiente de concentraciones 
a través de la membrana fosfolipídica. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
20 
 Transporte pasivo, en sus dos modalidades, mediado por 
canales o por transportadores. Este proceso no requiere 
energía dado que tienen lugar a favor del gradiente de 
concentración. 
 Transporte activo, mediado por transportadores que 
consumen energía al actuar contra el gradiente de 
concentración. 
 Filtración por entre los espacios intercelulares. 
 Pinocitocis. 
 
2.6.4. Metabolismo. También denominado biotransformación, 
se refiere a las modificaciones que pueden sufrir los 
fármacos como consecuencia de reacciones bioquímicas 
que se producen en el organismo. 
 
2.6.5. Excreción. La excreción incluye aquellos procesos 
mediante los cuales el fármaco es llevado desde la 
circulación general hasta el exterior del organismo, o 
bien hasta conductos que comunican con el exterior, 
como el pulmón, las vías urinarias, el intestino, la saliva 
o el sudor. 
 
2.6.6. Semivida biológica o vida media de eliminación del 
fármaco (t1/2), que se define como el tiempo que tarda 
la concentración de un fármaco en plasma en reducirse 
a la mitad. 
 
 
 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
21 
2.7. Fármacos de interés y tratamiento contra la tuberculosis (TB). 
 
El tratamiento de la tuberculosis (TB) se basa en la combinación de 3 
a 4 principios activos con la finalidad de prevenir la resistencia 
bacteriana; Isoniazida (ISO), Pirazinamida (PRA), Rifampicina (RFA) y 
Etambutol son los fármacos de primera elección ya que combinan el 
mayor nivel de eficacia con un grado aceptable de toxicidad [14]. 
Siendo los fármacos de interés de este proyecto ISO, PZA y RFA 
conocidos también como la base de la terapia antituberculosa. 
A continuación se mencionan las características físico-químicas y 
farmacológicas de cada uno. 
 
 
2.7.1. Isoniazida (ISO1 ). 
 
Figura 2.6. Estructura molecular de ISO. 
C6H7N3O, No. CAS 54-85-3, MM 137.14 
También conocida como hidrazida del ácido 4-pirinocarboxílico ó 
isonicotihidrazida (INH). Tiene aspecto de cristales incoloros o blancos, 
o polvo cristalino-blanco, inodoro, es afectado lentamente por la 
exposición al aire y a la luz, las soluciones son casi neutras frente al 
 
1 *INH es la forma universal de abreviar Isoniazida, sin embargo por procedimiento del 
laboratorio se utilizaron las letras ISO para este analito considerando la letra inicial seguida del la 
primera consonante y finalizando con la primera vocal del nombre del fármaco. 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
22 
tornasol, se funde entre 170-173°C; con valores de pKa de 1.8, 3.5 y 
9.5; con pH (solución 1 en 100) de 5.5 a 6.5 [15].Es poco soluble en 
etanol y ligeramente en cloroformo y éter dietílico. 
Herbert Fox y John Gibas investigaron la actividad tuberculostática de 
la hidrazida del ácido isonicotínico (Isoniazida) la cual mostró una 
actividad extraordinaria, mayor que cualquier otra sustancia conocida 
hasta aquel entonces, 10-20 veces más activa que la estreptomicina y 
700 veces superior al ácido p-aminosalicílico (PAS) [16]. 
 
 Farmacología 
ISO es el fármaco de elección en el tratamiento y la profilaxis de la TB, 
en todas sus formas. 
Los miembros del complejo tuberculoso son generalmente muy 
sensibles a ISO, mientras que el papel de este fármaco en el 
tratamiento de otras micobacterias es muy limitado. 
La ISO inhibe la biosíntesis de ácidos micólicos, constituyente deimportancia de la pared de la célula micobacteriana. 
La ISO es bactericida tan solo frente a los bacilos en replicación activa, 
siendo su papel muy limitado en las poblaciones que se replican 
lentamente o en las poblaciones latentes como las del interior de los 
macrófagos. La CIM en las cepas sensibles oscila entre 0.025 y 0.05 
µg/mL. Las concentraciones séricas después de 2 h de una dosis oral 
de 300 mg son de 4.5 a 7.0 µg/mL [17]. 
Se degrada sobre todo por acetilación hepática con una velocidad 
variable. En los acetiladores rápidos la vida media va desde 1 a 1.5 
horas, mientras que en los lentos, es de 2 a 5 horas. La inyección IM 
suele provocar irritación local. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
23 
 Efectos adversos. 
Puede considerarse un fármaco poco tóxico y ello ha contribuido a su 
actual posición en la terapéutica antituberculosa. Sin embargo, deben 
vigilarse con especial cuidado los signos de alteración hepática y 
neurológica. 
 
La alteración hepática no es frecuente, pero puede llegar a provocar 
hepatitis entre las 4 y las 8 semanas de tratamiento y necrosis. 
 
Las alteraciones neurológicas abarcan el sistema periférico y el central. 
Puede producir neuritis periférica, neuritis óptica con atrofia, sacudidas 
musculares, convulsiones, ataxia, mareo, parestesias, encefalopatía 
tóxica y alteraciones mentales de diversos tipos, incluidas las de 
carácter psicótico. A pesar de ello, no está contraindicada en pacientes 
epilépticos y psiquiátricos. 
 
Otras reacciones son: erupciones, fiebre, trastornos hematológicos 
(agranulocitosis, eosinofilia y anemia), vasculitis, síndromes artríticos y 
molestias gástricas. 
 
2.7.2. Pirazinamida (PRA2). 
 
Figura 2.7. Estructura molecular de PRA. 
C5H5N3O, No. CAS 98-96-4, MM 123.11 
 
2
 Al igual que para Isoniazida a Pirazinamida se le abrevio como PRA, siendo mejor conocida como PZA. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
24 
También llamada Pirazinacarboxamida o pirazina-2-carboxamina, 
derivado sintético de la nicotinamida, es un polvo cristalino blanco a 
prácticamente blanco, se sublima a 60°C, funde alrededor de 190°C: 
pKa 0.5. Es soluble en agua, ligeramente en alcohol, éter dietílico y 
cloroformo. Debe almacenarse en un lugar fresco y bien cerrado [15]. 
 Farmacología. 
Posee un potente efecto esterilizante sobre los bacilos tuberculosos 
latentes en el interior de los macrófagos, que permite, cuando se usa 
asociada a la RFA, acortar la duración del tratamiento de la TB no 
complicada a 6 meses. No obstante carece de actividad frente a las 
demás micobacterias, incluyendo otros componentes del complejo M. 
tuberculosis 
La PZA difunde pasivamente al interior de los macrófagos, donde es 
convertida en ácido piracinoico que se acumula intracelularmente. El 
ácido piracinoico actúa sobre su diana, una enzima implicada en la 
síntesis de los ácidos micólicos, disminuyendo el pH intracelular por 
debajo de los límites tolerados por esta enzima. 
La CIM promedio de M. tuberculosis es de 20 µg/mL. Se absorbe bien 
por vía oral con un tmax de 2 h, de una dosis de 1 g se obtienen picos 
séricos de alrededor de 45 µg/mL. Se distribuye por los tejidos y 
penetra en el líquido cefalorraquídeo. Es metabolizada por hidrólisis, 
seguida de hidroxilación, siendo excretados los metabolitos por orina. 
La semivida de eliminación es de 10-16 horas [17]. 
 Reacciones adversas. 
 
La más importante es la hepatotoxicidad, que guarda relación con la 
dosis. A dosis de 3 g/día en asociación con ISO, la incidencia de 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
25 
lesiones hepáticas alcanza el 14%, llegando en ocasiones a ser mortal; 
pero a las dosis más habituales de hasta 30 mg/Kg/día, la incidencia de 
hepatotoxicidad es pequeña, sobre todo si la administración no supera 
los 2 meses. En cualquier caso, es necesario vigilar la función hepática. 
 
Produce rutinariamente hiperuricemia que puede llegar a los 12-14 
mg/dl, por inhibir la secreción de ácido úrico; si provoca síntomas de 
gota, se aconseja asociar alopurinol. En ocasiones provoca malestar, 
artralgias, fiebre, molestias digestivas, erupción cutánea y 
fotosensibilidad. 
 
 
2.7.3. Rifampicina (RFA3) 
 
Figura 2.8. Estructura molecular de RFA. 
 C41H38N4O12, No. CAS 13292-46-1, MM 822.95 
También conocida como 3-[[(4-metil-1-piperazinil)imino]metil]-
rifamicina; rifampicin; rifadin; rimactane; 5,6,9,17,19,21 hexahidroxi-
23-metoxi-2,4,12,16,18,20,22heptametil-8-(N-(4-metil)-
piperazinil)fromimidoil)-2,7-(epoxipentadeca[1,11,13] trienimino-
(nafto [2,1-b] furan-1,11(2H)-dione 21 acetato. Es un derivado 
 
3
 Al igual que con los otros dos analitos las siglas utilizadas corresponden a las asignadas de forma interna 
en el laboratorio, pero es mejor conocida como RIF 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
26 
semisintético de la Rifamicina descrito como un polvo cristalino rojo 
parduzco; inodoro, inestable a la luz, el calor, el aire atmosférico y la 
humedad; se funde entre 183 y 188°C con descomposición; pKa 1.7, 
7.9. Es muy soluble en cloroformo, soluble en metanol y lo es poco en 
agua, acetona y éter dietílico. Debe almacenarse en un lugar fresco y 
protegido de la luz [15]. 
 
 Farmacología. 
Es un antimicrobiano semisintético introducido en terapéutica en el año 
1967 [16]. Es un potente inhibidor de la síntesis de ARN mensajero 
(ARNm) y por tanto de la transcripción genética, al unirse a la 
polimerasa de ARN dependiente de ADN de los procariotas. Además de 
un efecto bactericida sobre las células de M. tuberculosis 
metabólicamente activas, también posee una excelente acción 
esterilizante de las bacterias en estado de latencia, tanto en los focos 
necróticos como en el interior de los macrófagos. 
Las CIM para M. tuberculosis son muy bajas (0.005-0.2 µg/mL. El pico 
sérico a las 2-4 horas de una dosis oral de 600 mg es de 5-10 µg/mL. 
La resistencia a la RFA se asocia a la resistencia a la ISO, por lo que su 
detección constituye un marcador de multirresistencia [17]. 
 
 Efectos adversos. 
 
Es uno de los medicamentos mejor tolerados por los pacientes; puede 
producir inicialmente algunas molestias digestivas, erupción cutánea, 
algias musculares, articulares y calambres en las extremidades, pero la 
reacción más frecuente e importante es de carácter hepático. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
27 
Se han descrito también síntomas de tipo neurológico como fatiga, 
somnolencia, cefalea, mareo, ataxia, desorientación, falta de 
concentración y parestesias. 
 
A veces ocurre una reacción de tipo inmunológico, más frecuente 
según algunos, si la administración es intermitente. Consiste en un 
síndrome de carácter gripal con disnea, sibilancias, a veces purpurea 
con trombocitopenia y leucopenia; rara vez pueden aparecer hemólisis 
con hematuria y hemoglobinuria e insuficiencia renal. En estos casos se 
debe reducir la dosis y si no basta, suspender el tratamiento con RFA. 
 
Debe indicarse a los pacientes que la orina, las heces, la saliva, el 
sudor, el semen y las lágrimas pueden teñirse de rojo o naranja. 
 
 
Los fármacos antituberculosos de primera línea, a pesar de ser, 
generalmente bien tolerados, pueden presentar efectos secundarios o 
reacciones adversas, como ya se han descrito anteriormente. 
 
Actualmente existen presentaciones farmacéuticas capaces de 
combinar los tres principios activos y etambutol en una sola dosis, tal 
es el caso de DOTBAL®, medicamento administrado a los pacientes de 
la clínica de Tuberculosis del Instituto Nacional de Enfermedades 
Respiratorias (INER) Ismael Cosió Villegas, siendo su formulación la 
siguiente: 
 
 
 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
28 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La mayoría de los pacientes completan su tratamiento, sin presentar 
ningún efecto significativo a los medicamentos.Sin embargo, algunos 
pacientes experimentan efectos adversos. Por lo tanto es importante 
que sean controlados clínicamente durante el tratamiento, de esta 
manera se pueden detectar precozmente y manejar de forma adecuada 
los efectos adversos. 
 
2.8. Tuberculosis. 
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por el 
complejo Mycobacterium tuberculosis, es la segunda causa mundial de 
mortalidad, después del SIDA, causada por un agente infeccioso. 
De acuerdo al informe anual de la TB 2012 de la OMS tan solo en el 
2011 8.7 millones de personas contrajeron la enfermedad, fue causa 
de muerte de 1.4 millones alrededor del mundo y es la causa de 
muerte de casi una tercera parte de la población mundial cada año. 
Cada tableta contiene: 
Rifampicina…………………………150mg 
Isoniazida……………………………..75mg 
Pirazinamida……………...........400mg 
Clorhidrato de 
etambutol…………………………300mg 
Excipiente, cbp……………….1 tableta 
Figura 2.9. Los principios activos incluidos en DOTBAL® presentan 
actividad contra las tres distintas poblaciones bacterianas presentes en 
la tuberculosis. 
Capitulo 2 
Antecedentes. 
 
29 
En México cada año se reportan 20 mil casos nuevos de TB. El Instituto 
Nacional de Enfermedades Respiratorias (INER) “Ismael Cosío Villegas” 
atiende a un alto porcentaje de los pacientes de la zona conurbana y 
los estados de la periferia del D.F. 
En el 2011 la TB y secuelas de TB en el INER arrojaron los siguientes 
resultados: en morbilidad hospitalaria se reportaron 83 casos en el 
rango de 1 a más de 65 años en ambos sexos. En cuanto a la 
mortalidad hospitalaria se reportaron 5 casos en un rango de edades 
de 15 a más de 65 años [18]. Entre los principales factores de riesgo 
para el desarrollo de TB está la diabetes mellitus (DM), en la población 
mexicana su papel como factor de riesgo parece ser aún mayor que el 
de la infección por VIH. 
Se tiene reportado que el 20 por ciento de los pacientes con TB tiene 
como enfermedad asociada la DM B. [19] Estudios en pacientes con 
diabetes mellitus tipo 2 demostraron que aumenta el riesgo de 
desarrollar TB de 1.8 a 8 veces más que en la población no diabética, 
también incrementa el número de fracasos al tratamiento anti-TB y la 
susceptibilidad a la infección con cepas farmacorresistentes de M. 
tuberculosis [20]. La DM afecta a 150 millones de individuos en el 
mundo, en México afecta entre el 10 y el 15% de la población adulta 
siendo hoy día una de las enfermedades de mayor relevancia a nivel 
nacional. 
De acuerdo a la información anterior la TB es una enfermedad de alta 
relevancia a nivel mundial y uno de los retos de la OMS para ser 
erradicada en 2015, de aquí la importancia de apoyar a ésta meta con 
la aportación de un método analítico capaz de monitorear las 
concentraciones plasmáticas de los fármacos antes mencionados y 
determinar de esta forma la mejor posología en cada paciente. 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
30 
3.1 Materiales 
 
3.1.1. Reactivos y sustancias de referencia. 
 
 Estándar secundario Isoniazida 99.1% Base húmeda (ISO, 
laboratorios Silanes, México) 
 Estándar secundario Pirazinamida 99.0% Base húmeda (PRA, 
laboratorios Silanes, México) 
 Estándar secundario Rifampicina 95.6% Base húmeda (RFA, 
laboratorios Silanes, México) 
 Fosfato de potasio monobásico grado reactivo (KH2PO4 , JT 
Backer, Philipsburg, EUA) 
 Fosfato de sodio monobásico monohidratado grado reactivo 
(NaH2PO4, JT Backer, Philipsburg, EUA) 
 Ácido Trifluoroacético grado cromatográfico (CHCF3, JT Backer, 
Philipsburg, EUA) 
 Acetonitrilo grado cromatográfico (CHCNO3, Merck, Damstadt, 
Alemania) 
 Metanol grado cromatográfico (CH3OH, Merck, Damstadt, 
Alemania) 
 Agua desionizada (Equipo Milli-Q, Merck, Damstadt, Alemania). 
 
3.1.2. Materiales 
 
 Cartuchos para extracción en fase sólida OASIS HLB (2 mg/mL), 
WATERS. 
 Cámara de vacío. 
 Micropipetas Eppendorf 
 Micropipeta repetidora Eppendorf 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
31 
 Combitips (2.50 µL, 5.0 y 12.5 mL) 
 Tubos Eppendorf de polipropileno 2 mL 
 Viales de alto recobro 1mL 
 Tubos de vidrio 13x100 
 Matraces volumétricos (10, 25, 500 y 1000 mL) 
 Tubos polipropileno (30 y 60 mL) 
 Vasos de precipitados (500 y 1000 mL) 
 
3.1.3. Instrumentos. 
 
 Cromatógrafo de líquidos de alta resolución marca Waters, 
equipado con una bomba cuaternaria, detector Dual λ 
absorbance detector 2487, módulo de separación Alliance 2695 
 Cromatógrafo de líquidos de alta resolución marca Waters, 
equipado con una bomba cuaternaria, detector UV/Visible 2489, 
módulo de separación Alliance e2695 
 Balanza analítica Scientech® con sensibilidad de 0.0001 g 
 Balanza Ohaus con sensibilidad de ± 0.1 mg 
 Ultracentrífuga Eppendorf modelo 5415D 
 Centrífuga refrigerada Sorvall Leyend MACH 1.6/R 
 Agitador Vortex Genie-2 
 Evaporador Calipper Lifesciences turbo Vap® LP 
 Potenciómetro Pinnacle series M530P 
 Ultracongelador REVCO ULT 1786-5-D39 (-70°C) 
 Refrigerador TORREY (4-8°C) 
 Sistema de obtención de agua ultrapura, Millli-Q. Millipore 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
32 
3.2. Desarrollo del método analítico. 
 
3.2.1 Preparación de soluciones. 
 
 KH2PO4 50 mM pH 4.5. 
Se pesaron 3.4228 g de la sal en papel glassine y colocaron en un vaso 
de precipitados de 500 mL agregándole aproximadamente 400 mL de 
agua desionizada, se disolvió y se ajustó el pH a 4.50 con ácido fosfórico 
1 M, posteriormente se transvaso a un matraz volumétrico de 500 mL y 
se aforó con agua desionizada, se filtró a través de una membrana de 
0.45 µm y se guardó en un frasco reservorio de polipropileno de 
500 mL. 
Esta solución se empleó en la preparación de soluciones estándares de 
la curva de calibración y en el método de extracción como solvente de 
acondicionamiento y lavado de la fase sólida. 
 
Ejemplo del cálculo para soluciones buffer: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Peso teórico de reactivo a utilizar: 3.4111 g. 
 
Peso real utilizado del reactivo: 3.4228 g 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
33 
 NaH2PO4 25 mM pH 3.30. 
Se pesaron 3.4499 g de la sal en papel glassine, se colocaron en un 
vaso de precipitados de 1000 mL agregándole aproximadamente 900 
mL de agua desionizada, se disolvió y ajustó el pH a 3.30 con ácido 
fosfórico 1 M, posteriormente se transvaso a un matraz volumétrico de 
1000 mL y se aforó con agua desionizada, se filtró a través de una 
membrana de 0.45 µm y se guardó en un frasco reservorio de vidrio de 
1000 mL y se colocó en la línea “D” del sistema cromatográfico para la 
determinación de Isoniazida y Pirazinamida. 
 
 Ácido trifluoroacético 0.1% v/v (TFA). 
Se colocaron 500 mL de agua desionizada en una probeta de 500 mL, se 
transvaso a un frasco reservorio de la misma capacidad a la cual se le 
agregaron 500 µL de ácido trifluoroacético concentrado, se tapó 
rápidamente ya que el ácido es muy volátil, y se agitó vigorosamente. 
Una vez homogenizado se colocó en la línea “D” del sistema 
cromatográfico para la determinación de Rifampicina. 
 
Ejemplo del cálculo. 
 
 
 
 
 
 Metanol:Buffer KH2PO4 50 mM pH 4.5 (70:30 v/v). 
Se prepararon 10 mL de la mezcla de acuerdo a la cantidad de metanol 
y buffer presentes en las soluciones estándar de Rifampicina, Isoniazida 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
34 
y Pirazinamida en una muestra de plasma cargado. Esta solución se 
utilizó para el blanco de plasma 
 
 Metanol:Acetonitrilo (50:50 v/v). 
Esta mezcla se preparó con los disolventes previamente filtrados a 
través de membrana de 0.45 µm, posteriormente se midieron 25 mL de 
cadauno en una probeta de 50 mL, se colocaron en un frasco reservorio 
de 50 mL y se agitaron vigorosamente, se guardó en refrigeración a 
temperatura de 4-8°C hasta su uso. Esta solución se utilizó como blanco 
de reactivos y solución de dilución para sistema 
 
 NaH2PO4 25 mM pH 3.30:Acetonitrilo (99:1 v/v) 
Se prepararon 100 mL de esta solución colocando en una probeta 
graduada de 100 mL, 1 mL de acetonitrilo el cual fue medido con 
micropipeta y llevando al volumen de 100 mL con buffer NaH2PO4 
25 mM pH 3.30, se colocó en un frasco reservorio de vidrio de 150 mL, 
se agitó vigorosamente y se guardó en refrigeración hasta su uso. Esta 
solución se utilizó como blanco de reactivos, solución de reconstitución y 
de dilución para sistema. 
 
3.2.2 Soluciones stock, curva de calibración y controles: 
 
 
 Solución Stock de Rifampicina, RFA [500 µg/mL]. 
Se pesaron 13.1 mg de Rifampicina en papel glassine y se transfirieron 
a un matraz volumétrico de 25 mL, se disolvió en metanol con 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
35 
aproximadamente 5 mL y ya completamente disuelto se llevó al aforo 
con metanol 100%, una vez homogenizada la solución se transvaso a un 
frasco de polipropileno de 30 mL protegido de la luz. 
 
Ejemplo del cálculo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Peso teórico de estándar para preparar la solución stock de Rifampicina: 
13.0208 mg 
Cantidad pesada del estándar de Rifampicina: 13.1 mg 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 503.04 µg/mL RFA 
Concentración real de la solución stock de Rifampicina: 503.04 µg/mL. 
 
Las curvas de concentración se establecieron en función de las 
concentraciones plasmáticas máximas reportadas en la literatura por 
cada uno de los principios activos y el valor de vida media de 
eliminación. Los rangos de concentraciones se establecieron en: 2.0 a 
20.0; 4.0 a 40.0 y 3.0 a 20.0 µg/mL para Isoniazida, Pirazinamida y 
Rifampicina respectivamente. 
 
 Curva de Calibración y Controles de Rifampicina. 
Para la preparación de estas soluciones se sigue la tabla 3.1 donde se 
muestran las alícuotas a tomar de la solución stock para preparar las 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
36 
soluciones estándar de la curva de calibración y controles de calidad 
tanto en sistema como en método. 
Tabla 3.1. Curva de calibración y controles de calidad de Rifampicina 
RFA Solución 
stock 
mL 
[µg/mL] 
en 10 
mL 
MeOH 
Alícuota 
µL 
[µg/mL] 
en 500 
µL 
plasma 
LD 0.20 10.0 50.0 1.0 
1LC 0.60 30.0 50.0 3.0 
2 1.00 50.0 50.0 5.0 
CB 1.20 60.0 50.0 6.0 
3 1.40 70.0 50.0 7.0 
4 1.80 90.0 50.0 9.0 
CM 2.20 110.0 50.0 11.0 
5 2.60 130.0 50.0 13.0 
6 3.00 150.0 50.0 15.0 
CA 3.20 160.0 50.0 16.0 
7 4.00 200.0 50.0 20.0 
 
Ejemplo del cálculo con el límite de detección (LD): 
Curva de calibración a partir de la solución stock: 
 
 
 
 
 
 
 
Sistema: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Método. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
37 
 Solución Stock de Isoniazida/Pirazinamida [500 µg/mL] / 
[1000 µg/mL]. 
En un mismo papel glassine se pesaron 12.6 mg de Isoniazida y 
25.3 mg de Pirazinamida, se transfirieron a un matraz de 25.0 mL, se 
disolvieron en metanol y una vez completamente disueltos se aforó con 
metanol 100%, se transvasó a un recipiente de polipropileno de 30 mL 
protegido de la luz. 
Concentración real de Isoniazida: 499.45 µg/mL 
Concentración real de Pirazinamida: 1001.88 µg/mL 
 
 Curva de calibración y controles de Isoniazida y Pirazinamida. 
Para la preparación de las soluciones estándares de la curva de 
calibración y controles de calidad de estos analitos tanto en sistema 
como en método se sigue la tabla 3.2. 
Tabla 3.2.Curva de calibración y controles de calidad de Isoniazida y 
Pirazinamida. 
CC 
ISO/ 
PRA 
Solución 
stock 
mL 
 
[µg/mL] en 
10 mL 
MeOH:Buffer 
40:60 
Alícuota 
µL 
[µg/mL] 
en 500 µL 
plasma/FM 
 ISO PRA ISO PRA 
LD 0.20 10.0 20.0 50.0 1.0 2.0 
1(LC) 0.40 20.0 40.0 50.0 2.0 4.0 
2 0.80 40.0 80.0 50.0 4.0 8.0 
CB 0.90 45.0 90.0 50.0 4.5 9.0 
3 1.00 50.0 100.0 50.0 5.0 10.0 
4 1.40 70.0 140.0 50.0 7.0 14.0 
CM 1.80 90.0 180.0 50.0 9.0 18.0 
5 2.40 120.0 240.0 50.0 12.0 24.0 
6 3.00 150.0 300.0 50.0 15.0 30.0 
CA 3.60 180.0 360.0 50.0 18.0 36.0 
7 4.00 200.0 400.0 50.0 20.0 40.0 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
38 
3.2.3. Solución de Adecuabilidad. 
 
 Rifampicina: 
Se mezclaron en un vial de alto recobro 50 µL de solución estándar de 
control alto de Rifampicina, 50 µL de control alto de 
Isoniazida/Pirazinamida y 900 µL del blanco de reactivos MeOH:ACN 
50:50 v/v, se tiene una concentración final de Rifampicina de 
8.0 µg/mL. 
 
 Isoniazida/Pirazinamida 
Se mezclaron en un vial de alto recobro 50 µL de solución estándar de 
control medio de Rifampicina, 50 µL de control medio de 
Isoniazida/Pirazinamida y 400 µL de fase móvil de ISO/PRA, teniendo una 
concentración final de 9.0 µg/mL de Isoniazida y 18.0 µg/mL de Pirazinamida. 
Ambas soluciones de adecuabilidad se prepararon en cada día de 
trabajo. 
 
3.2.4. Solventes del método de extracción. 
Los solventes utilizados para el método de extracción son metanol y 
acetonitrilo de los cuales se filtraron 500 mL de cada uno a través de 
membrana de 0.45 µm y se almacenaron en frascos de polipropileno de 
500 mL hasta su uso. 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
39 
3.2.5. Matriz biológica. 
El plasma empleado fue solicitado al banco de sangre del INER donde se 
verificó que fueran de sujetos sanos, acompañados con documentos que 
avalaron su bioseguridad. Se evaluó por separado cada unidad en el 
método de extracción como blancos de matriz biológica, sustituyendo el 
volumen de las soluciones estándar con mezcla de metanol: KH2PO4 
50 mM pH 4.5 en proporción 70:30 v/v para comprobar que no existían 
interferencias principalmente de compuestos endógenos con los analitos 
en sus respectivos tiempos de retención. Una vez evaluadas dichas 
unidades se preparó un “pool” con 6 unidades diferentes, las cuales no 
presentaron interferencias endógenas representativas en los tiempos de 
retención de Isoniazida, Pirazinamida o Rifampicina y se almacenó en 
refrigeración a temperatura de 2-8°C durante la validación. 
 
3.2.6. Método de extracción. 
El plasma empleado para la extracción de los analitos fue centrifugado a 
3500 rpm durante 8 minutos para clarificarlo. 
El blanco de plasma consistió en 500 µL de plasma libre de fármaco al 
que se le agregaron 100 µL de la mezcla previamente descrita para 
blancos de plasma. 
Las muestras de curva de calibración y controles de calidad se 
prepararon con 500 µL del pool de plasma, 50 µL de la solución estándar 
de RFA y 50 µL de la solución estándar de ISO/PRA correspondiente a la 
concentración requerida. 
El procedimiento para la extracción de los fármacos de la matriz 
biológica se representa en el Diagrama 3.1. 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
40 
Diagrama 3.1. Esquema de extracción en plasma de Isoniazida, 
Pirazinamida y Rifampicina en Cartuchos para extracción en fase sólida 
OASIS HLB WATERS (2 mg/mL) recubiertos de los monómeros N-
vinilpirrolidona y divinilbenceno. 
* No se aplica presión al sistema de extracción. 
 
 
 
Acondicionamiento*
•2X1 mL metanol.
•2x1 mL agua desionizada.
•1 mL buffer KH2PO4 25mM pH 4.5
Muestra.
•Muestra plasmática*.
•Una vez que todo el plasma haya pasado por 
el cartucho se deja secar a máxima presión 
durante 10 minutos.Lavado 
•1 mL buffer KH2PO4 25mM pH 4.5 con 
presión de 5 mmHg 
•Se deja secar durante 10 minutos a 
máxima presión.
Elución*.
•0.5 mL acetonitrilo.
•0.5 mL metanol
Rifampicina.
•Centrifugar a 3600 rpm durante 8 minutos.
•Tomar 200 µL y colocarlos en un vial de alto 
recobro.
•Inyectar 20.0 µL en el sistema cromatográfico.
Isoniazida y 
Pirazinamida
•Evaporar el resto de la elución a 45 °C durante 8 
minutos con flujo de aire.
•Reconstituir con 0.4 mL de fase móvil para estos 
analitos.
•Transvasarlo a vial de alto recobro.
•Inyectar 15.0 µL al sistema cromatográfico.
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
41 
3.2.7. Condiciones cromatográficas. 
Para la determinación de los analitos se empleó Cromatografía Líquida 
de Alta Resolución con detección ultravioleta. Por las propiedades físico-
químicas de los fármacos se llevó a cabo en dos sistemas 
cromatográficos, en uno de ellos se determinó de manera simultánea 
isoniazida y pirazinamida y en el otro unicamente rifampicina. 
Las condiciones cromatográficas para cada unos de los sistemas de 
detección se describen en la tabla 3.3. 
 
3.2.8. Método de Procesamiento de datos 
El software Empower de Waters, fue utilizado para determinar la altura 
de Isoniazida y Pirazinamida (y) la cual se ajustó a la concentración 
correspondiente de cada uno de ellos (x), por medio de un análisis de 
regresión lineal y=mx+b, donde b es la ordenada y m es la pendiente 
de la curva de calibración, con ponderación 1/x. La concentración 
experimental (recuperada) se obtuvo introduciendo la altura de los 
mismos en la ecuación de la línea recta generada. 
Se utilizó el mismo integrador para determinar el área de Rifampicina 
(y) la cual se ajustó a la concentración de Rifampicina (x), por medio de 
un análisis de regresión y=mx+b, con ponderación 1/y2. La 
concentración experimental (recuperada) se obtuvo introduciendo el 
área de Rifampicina en la ecuación de la línea recta. 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
 
42 
Tabla 3.3. Condiciones cromatográficas para la determinación de Isoniazida, Pirazinamida y Rifampicina. 
 Rifampicina (RFA) Isoniazida y pirazinamida (ISO/PRA) 
Módulo Waters Alliance 2695 Waters Alliance e2695 
Detector UV-VIS 
Waters Dual λ absorbance 
detector 2489 
Waters UV/Visible detector 2489 
Longitud de onda 270 nm 270 nm 
Columna 
XTERRATM MS C8 
(5µm,150x3.00mm) 
Phenomenex Luna5u CN 100 A 
(5µm,150x3.0mm) 
Precolumna. NA Phenomenex CN 
Fase móvil. TFA: Acetonitrilo 50:50 (v/v) NaH2PO4 25mM pH 3.30: Acetonitrilo 99:1(v/v) 
Velocidad de flujo. 1.0 mL/min 0.8 mL/min 
Temp. columna. 25°C 25°C 
Temp. automuestreador. 5°C NA 
Volumen de inyección. 20.0 µL 15.0 µL 
Tiempo de retención. 3.3 min 
ISO 1.5 min 
PRA 1.8 min 
Tiempo de corrida. 4.5 min 3.0 min 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
43 
3.3. Validación del método analítico. 
 
3.3.1 Pruebas de confiabilidad del sistema. 
Las siguientes pruebas se realizaron con el fin de verificar que el 
sistema de medición funciona apropiada e independientemente de las 
condiciones ambientales. 
 
 Adecuabilidad del sistema. 
Metodología para determinar la adecuabilidad del sistema. 
Se inyectó por sextuplicado de forma continua al inicio de cada corrida 
la solución de adecuabilidad del sistema y se reportaron los siguientes 
parámetros para cada analito: 
 Tiempo de retención 
 Respuesta (área o altura dependiendo del método de 
integración) 
 Simetría del pico (≤1.5) 
 Número de platos teóricos 
 Resolución (≥1.2) 
Para cada uno de estos parámetros se establece que la desviación 
estándar debe ser menor o igual a 3.0 %. 
 
 Prueba de acarreo 
Con esta prueba se verificó la correcta limpieza de aguja e inyector del 
sistema cromatográfico, evitando así posibles interferencias en la 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
44 
cuantificación de los analitos de interés por impurezas retenidas en el 
sistema. 
Esta prueba se realiza enseguida de la adecuabilidad programando una 
inyección del blanco de reactivos seguida de la concentración más alta, 
límite superior de la curva de calibración en método y se finaliza con una 
segunda inyección del blanco de reactivos. Para considerar que no existe 
acarreo en el sistema, el segundo blanco de reactivo no debe presentar 
señal ruido en el tiempo de retención de los analitos de interés. 
 
 Selectividad. 
En cada día de análisis se compararon los cromatogramas del blanco de 
reactivos, blanco de plasma, límite de cuantificación y solución de 
adecuabilidad con la finalidad de demostrar que las señales ruido de los 
dos primeros no intervengan con nuestros analitos de interés, o en cuyo 
caso esta señal sea mínimo 10 veces más pequeña a la del límite de 
cuantificación. 
 
3.3.2. Selectividad del método. 
La selectividad del método se demostró por la no interferencia de los 
compuestos endógenos del plasma (pool de plasma conformado por 6 
unidades diferentes), con los tiempos de retención de ISO, PRA y RFA, 
al ser sometido al método de extracción del diagrama 3.1. 
Otras pruebas de selectividad fueron en plasma libre de fármaco 
hemolizado, lipémico y con heparina con la finalidad de determinar 
posibles interferencias de muestras plasmáticas con estas características 
y nuestros analitos de interés. 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
45 
También fue necesario demostrar que el método es selectivo ante 
fármacos de uso común como cafeína, acetaminofén e ibuprofeno. Para 
esto se comparó la Cmax de cada unos de estos fármacos en plasma 
sometidos al método de extracción descrito en el diagrama 3.1 y el 
límite de cuantificación de ISO, PRA y RFA. 
Se trabajó con soluciones estándares de 1 mg/mL de cafeína, 
acetaminofén e ibuprofeno y se prepararon muestras con la 
concentración de Cmax por duplicado en 500 µL de plasma libre de 
fármaco, de cada uno de ellos. En la tabla 3.4 se muestran las alícuotas 
para conseguir la Cmax de estos fármacos en el volumen de plasma 
ocupado. 
 
Tabla 3.4. Cmax de cafeína, acetaminofén e ibuprofeno y la 
preparación de las muestras de trabajo para la prueba de selectividad 
del método. 
 Cmax 
(µg/mL) 
Solución 
estándar 
(mg/mL) 
Alícuota de la 
solución 
estándar (µL) 
Concentración 
en 500 µL de 
plasma (µg/mL) 
Cafeína 10 1 5 10 
Acetaminofen 20 1 10 20 
Ibuprofeno 60 1 30 60 
Los cálculos para determinar las alícuotas se basan en los previamente mostrados para la 
preparación de las curvas de calibración. 
 
3.3.3. Recobro. 
Los controles de calidad consistieron en 3 concentraciones conocidas 
(baja, media y alta) dentro del rango de calibración sin ser parte de 
dicha curva. Para este proyecto se prepararon controles de calidad con 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
46 
concentraciones de ISO de 4.5, 9.0 y 18.0 µg/mL; de PRA de 9.0, 18.0 y 
36.0 µg/mL y de RFA de 6.0, 11.0 y 16.0 µg/mL. 
Se analizaron por quintuplicado en método los controles de calidad de 
cada uno de los fármacos y se compararon los resultados con las 
respuestas en solución de las mismas concentraciones y en los mismos 
disolventes. 
El criterio de aceptación para esta prueba es obtener un método de 
extracción reproducible donde el porcentaje de analitos extraídos sea 
consistente entre cada nivel de concentración aunque la recuperación no 
sea del 100%. 
 
3.3.4. Linealidad. 
 
 Linealidad del sistema 
Se inyectaron 5 curvas de calibración en solución de cada uno de los 
fármacos de acuerdo a las tablas 3.1. y 3.2. 
 Linealidad del sistema de Isoniazida y Pirazinamida. 
Las soluciones se preparan con 50 µL de la solución estándar de estos 
analitos, 50 µL de solución estándar de RFA correspondientes a cada 
punto de la curva de calibración, y 400 µL de fase móvil 99:1 v/v 
NaH2PO4 25 mM pH 3.30: acetonitrilo. 
 
 Linealidad del sistema de Rifampicina. 
Las soluciones se prepararon con 50 µL del estándar de ISO/PRA, 50 µL 
delestándar de RFA, correspondiente a cada punto de la curva de 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
47 
calibración y 900 µL del blanco de reactivos metanol:acetonitrilo 50: 
50 v/v. 
 
 Linealidad del Método. 
Se realizó preparando cinco curvas de calibración independientes con 
plasma libre de fármaco al cual se le adicionaron 50 µL de solución 
estándar de ISO/PRA y 50 µL de solución estándar de RFA de acuerdo a 
las tablas 3.1 y 3.2 y sometidos al método de extracción antes descrito, 
teniendo rangos de concentración de 2.0-20.0 µg/mL ISO; 4.0-40.0 
µg/mL PRA y 3.0-20.0 µg/mL de RFA. 
Se determinó el coeficiente de correlación (r), la pendiente (m) y la 
ordenada de origen (b) para cada una de las curvas. 
 La linealidad del método se acepta si r es igual o mayor a 0.990 en 
todas las curvas de calibración y la desviación de cada uno de los puntos 
de la curva son menores o iguales al 15%. 
 
3.3.5. Precisión y exactitud del método. 
Se evaluó la precisión (% del coeficiente de variación) y exactitud del 
método en un solo día, intradía, (repetibilidad) como en diferentes días, 
interdía (reproducibilidad). Se trabajó con los controles de calidad de 
cada analito en los tres niveles de concentración. 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
48 
 Repetibilidad. 
Se analizaron en un mismo día por quintuplicado cada uno de los 
controles de calidad en método y se cuantificaron con una curva de 
calibración procesada en ese mismo día. 
 Reproducibilidad. 
Se analizaron por duplicado durante 3 días cada uno de los controles de 
calidad en método y se cuantificaron con una curva de calibración 
procesada en cada día de trabajo 
 
Para demostrar la precisión y exactitud del método dichos controles de 
calidad deben cumplir con un porcentaje de coeficiente de variación de 
desviación absoluta menor o igual al 15% con respecto al valor nominal 
de cada nivel de concentración. 
 
3.3.6. Límite de cuantificación. 
El valor de los límites de cuantificación en este proyecto son 2.0 µg/mL 
de ISO, 4.0 µg/ml de PRA y 3.0 µg/mL de RFA, cabe señalar que estos 
valores corresponden al límite inferior de la curva de calibración de cada 
unos de los analitos. 
Cada una de estas concentraciones fue analizada por quintuplicado en 
un mismo día siendo aceptadas como límites de cuantificación, si su 
valor presenta una desviación absoluta y coeficiente de variación menor 
o igual al 20% al valor nominal y la respuesta obtenida es 10 veces 
mayor con respecto a la señal ruido de la matriz biológica. 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
49 
3.3.7. Límite de detección. 
Se analizaron por quintuplicado en un mismo día de trabajo 
concentraciones en plasma de 1.0 µg/mL ISO; 2.0 µg/mL de PRA y 1.0 
µg/mL de RFA. Teniendo como criterio de aceptación que la respuesta 
obtenida de cada unos de los analitos debe ser al menos tres veces 
mayor a la respuesta de la señal del ruido del blanco de plasma. 
Tanto el límite de detección como el de cuantificación se establecieron 
comparando la respuesta de la señal ruido del blanco de plasma con la 
respuesta de una concentración conocida, con esta comparación se 
calcula la concentración del fármaco a la cual la respuesta obtenida sea 
“X” cantidad de veces mayor a la señal del blanco de plasma. 
3.3.8. Estabilidad de la muestra. 
Se determinaron las condiciones de temperatura y tiempo a las cuales 
los analitos de interés permanecieron estables en plasma, realizando las 
siguientes pruebas: 
 Estabilidad a temperatura ambiente. Se prepararon los controles 
y se mantuvieron tres horas en la mesa de trabajo. 
 
 Estabilidad en refrigeración. Se prepararon los controles y se 
almacenaron seis horas en el refrigerador a temperatura de 2-
4°C. 
 
 Estabilidad de muestra procesada. Se prepararon los controles y 
se procesaron por el método de extracción, las muestras 
obtenidas se almacenaron en el autoinyector por 24 horas. 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
50 
 Estabilidad en ciclos de congelación-descongelación. Se 
prepararon los controles y se almacenaron a -70°C durante 
aproximadamente una hora, tiempo suficiente para congelar 
completamente la muestra, después se descongelo a 
temperatura ambiente en la mesa de trabajo por 
aproximadamente media hora cumpliéndose así un ciclo. Este 
procedimiento se repitió una vez más para someter a la muestra 
a dos ciclos de congelado-descongelado. 
 
 
 Estabilidad de largo plazo. Se prepararon los controles y se 
almacenaron bajo congelación (-70 ± 10°C) durante un periodo 
de 59 días. 
 
Se evaluó la respuesta de la concentración de cada control de calidad de 
ISO, PRA Y RFA analizadas en método por triplicado, sometidos a 
condiciones de estabilidad y comparándolas con la respuesta de las 
mismas concentraciones sin ser sometidas a dichas condiciones 
(controles frescos), procesadas en el mismo día de análisis e igualmente 
analizadas por triplicado. Para ser considerados como estables en las 
diferentes condiciones evaluadas la desviación absoluta, en relación a 
los controles frescos debe ser menor o igual al 15%. 
La curva de calibración, los controles frescos y sometidos a condiciones 
de estabilidad se prepararon según el procedimiento antes descrito en el 
apartado de muestra plasmática. 
 
 
 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
51 
3.3.9. Estabilidad de soluciones estándar. 
Se prepararon en sistema por triplicado cada uno de los controles de 
calidad de ISO (4.5,9.0 y 18.0 µg/mL), PRA (9.0,18.0 y 36.0 µg/mL) y 
RFA (6.0,11.0 y 16.0 µg/mL) de soluciones almacenadas en 
refrigeración (2-4°C) durante un periodo de 52 y 89 días y se comparó 
la respuesta, área de RFA y altura de ISO y PRA, con las obtenidas del 
triplicado de soluciones recién preparadas de las mismas 
concentraciones. 
 
3.3.10. Efecto de dilución. 
Para demostrar una cuantificación precisa y exacta de muestras con 
concentraciones por arriba del rango de calibración se evaluó el efecto 
de dilución, preparando en un tubo de ensayo de 13x100 una muestra 
concentrada de los tres fármacos. Se mezclaron 160 µL de la solución 
estándar de 200 µg/mL de RFA (punto 7 de la curva de calibración), 160 
µL de la solución estándar de 200/400 µg/mL de ISO/PRA (punto 7 de la 
curva de calibración) y 680 µL de plasma libre de fármaco y se agitó por 
10 segundos. 
 
Ejemplo del cálculo. 
Volumen final de la muestra concentrada: 
160 µL RFA + 160 µL ISO/PRA+ 680 µL plasma libre de fármacos= 1000 
µL 
Concentración de RFA en la muestra concentrada (m.c.). 
Capítulo 3 
Materiales y método 
 
 
52 
 
 
 
 
 
 
 
 
Por triplicado, se tomaron 250 µL de plasma cargado, se colocaron en 
un tubo eppendorf de 2 mL y se le adicionaron 250 µL de plasma libre 
de fármaco, se agitó por 10 segundos y se centrifugó a 7300 rpm 
durante 5 minutos y finalmente se procesó por el método de extracción 
antes descrito. 
 
3.3.11. Tolerancias. 
Se evaluó la capacidad del método analítico para obtener resultados 
confiables ante variaciones pequeñas pero deliberadas del método 
analítico, evaluando las siguientes condiciones: 
 Cambio de proporción orgánica en la fase móvil (± 2%). Para 
esta prueba se modificó la fase móvil de RFA a 48:52 ACN:TFA 
0.1% y a 52:48% v/v ACN:TFA 0.1%, la mezcla fue preparada 
de manera automática por el equipo cromatográfico. En el caso 
de ISO y PRA este cambio no es posible debido a las propiedades 
de su fase móvil. 
 
 Cambio de pH en la fase móvil (± 0.2 unidades). Esta 
modificación se realizó únicamente para el sistema 
cromatográfico de ISO y Pirazinamida. Utilizando solución 
amortiguadora de fosfatos (Na2PO4H2O 25 mM) con pH 3.10 y 
3.50, el pH se ajustó con H3PO4 1 M y NaOH 0.1 M. Para RFA 
este cambio no se realizo pues en la fase móvil no utilizó alguna 
Capítulo 3 
Materiales y método