Distribucion-y-conservacion-de-las-enzimas-del-ciclo-del-acido-ctrico-reverso

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE CIENCIAS 
 
 
DISTRIBUCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS ENZIMAS DEL 
CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO REVERSO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 BIÓLOGO 
 P R E S E N T A : 
 
MARIO RIVAS MEDRANO 
 
 
 
DIRECTOR DE TESIS 
DR. ANTONIO LAZCANO-ARAUJO REYES 
2011 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 2 
Hoja de Datos del Jurado 
 
1. Datos del Alumno 
Rivas 
Medrano 
Mario 
56 22 48 23 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
09926199-9 
 
2. Datos del Tutor 
Doctor 
Antonio 
Lazcano-Araujo 
Reyes 
 
3. Datos del Sinodal 1 
Doctor 
Víctor Manuel 
Valdés 
López 
 
4. Datos del Sinodal 2 
Doctora 
Alicia 
Negrón 
Mendoza 
 
5. Datos del Sinodal 3 
Doctor 
Diego 
González 
Halphen 
 
6. Datos del Sinodal 4 
Doctor 
Arturo 
Becerra 
Bracho 
 
7. Datos del Trabajo Escrito 
Distribución y conservación de las enzimas del ciclo del ácido cítrico reverso 
44p 
2011 
 
 3 
Resumen 
 
La facilidad con la que se sintetizan compuestos orgánicos bajo posibles condiciones de Tierra 
primitiva ha apoyado fuertemente la hipótesis sobre el origen heterotrófico de las primeras formas de 
vida. No obstante, a) la presencia de centros Fe-S en diversas enzimas del metabolismo central; b) la 
posición basal de procariontes quimiolitoautótrofos termofílicos o hipertermofílicos en diversos árboles 
filogenéticos; y c) la síntesis de algunos compuestos orgánicos en presencia de pirita (FeS2) como 
catalizador, han llevado a la idea de la reducción de CO2 como parte de un metabolismo autotrófico 
primigenio. En el mismo sentido se ha argumentado a favor del papel central del ciclo reductivo del 
ácido cítrico al cual, por su naturaleza esencialmente reductora y su estrecha interacción con múltiples 
rutas metabólicas, le ha sido atribuido un carácter primordial que apoyaría un posible origen autotrófico 
para la vida. En este estudio se presentan los resultados obtenidos a partir de un estudio genómico de la 
distribución de los genes que codifican para las enzimas del ciclo reverso de Krebs, así como un 
análisis filogenético de las enzimas del ciclo consideradas cruciales para el establecimiento de la 
química reductiva propia de dicho ciclo. Nuestros resultados permiten concluir que el ciclo reverso de 
ácido cítrico (CRAC) no constituye un núcleo metabólico conservado ni ampliamente distribuido en la 
filogenia, ya que se encuentra ligado a una porción muy acotada de la diversidad bacteriana. Ello 
sugiere que el CRAC no parece haber jugado un papel central en el metabolismo primordial 
intrínsecamente reductor como supone la teoría autotrófica. 
 
Palabras clave: Ciclo reductivo de Krebs, origen autotrófico de la vida, origen heterotrófico de la vida, 
síntesis dependiente de pirita, reducción primigenia de CO2. 
 
 
 4 
Agradecimientos 
 
Institucionales 
Expreso mi profundo agradecimiento por el apoyo económico otorgado al proyecto “Distribución y 
conservación de las enzimas del ciclo del ácido cítrico reverso” por parte del SNI y del CONACYT, 
mediante el proyecto 102731 correspondiente a la “Convocatoria 2008 de apoyo para investigadores 
nacionales para el fortalecimiento de actividades de tutoría y asesoría de estudiantes de nivel 
licenciatura“. 
 
Se reconoce también el apoyo económico del CONACYT mediante el proyecto 100199 a cargo del Dr. 
Arturo Becerra Bracho; así como al proyecto CONACYT 50520Q a cargo del Dr. Antonio Lazcano. 
 
Personales 
A María Amada Medrano Trujano cuyo tiempo en este mundo termino antes de que este trabajo llegara 
a su fin. A María Margarita Hortensia Rivas Medrano cuyo sacrificio al encontrarnos geográficamente 
separados la mayor parte del tiempo me ha permitido desarrollarme profesionalmente. Y a María 
Silvina Rivas Medrano, mi ejemplo de superación, sin cuyo apoyo ético y económico no se habría 
terminado el presente trabajo. Eres tú a quien le debo las innumerables oportunidades y el apoyo a mis 
decisiones durante mi formación académica, pero sobre todo durante mi desarrollo personal. 
 
A mis hermanos putativos y hermanas putativas. César Antonio Martínez Gutiérrez, Abraham Martínez 
Flores, Mónica Leticia Martínez Pacheco y Deni Tanibe Zenteno Gómez por su consejo y apoyo 
incondicional. Ustedes son el accidente histórico que más aprecio en la vida. 
 
 5 
A mi tutor y amigo el Dr. Antonio Lazcano por la paciencia, confianza y el gran apoyo que me brindo 
como guía durante el desarrollo del proyecto, quien además demostró ser una persona con altos 
estándares éticos y un profundo sentido de la amistad y la lealtad. No tengo palabras para agradecerte, 
y sobra decir aún me queda mucho (muchísimo) por aprender de ti. 
 
Al Dr. Arturo Becerra quien aparte de todo su apoyo, confianza y amistad, me mostró una generosidad 
intelectual incomparable. Doctore, eres la persona más noble que he conocido mira que soportarnos a 
tod@s, debiste pecar mucho para tener semejante penitencia. 
 
A los miembros del comité por su generosidad al dedicar parte de su invaluable tiempo en la revisión 
del presente trabajo. Son el comité ideal de titulación que planeé por años. 
 
A mis compañeros del laboratorio Ricardo Hernández, Daniel Ortíz, Ervin Silva, Sara Islas, Héctor 
Vasquéz, Fernando Andrade, Yetzi Robles y Luis Delaye cuya amistad y apoyo técnico valoro mucho; 
y a quienes tengo en una altísima estima y respeto. No obstante algun@s de ustedes me desquicien de 
vez en cuando. 
 
 6 
Índice 
 
Resumen…………………………………………………………………………………………….........3 
 
Agradecimientos…………………………………………………………………………………………4 
 
Introducción……………………………………………………………………………………………...7 
 
Metodología…………………………………………………………………………………………….10 
 
Resultados………………………………………………………………………………………………12 
 
Discusión……………………………………………………………………………………………......15 
 
Conclusiones……………………………………………………………………………………………18 
 
Referencias……………………………………………………………………………………………...19 
 
Figuras……………………………………………………………………………………………..........23 
 
Anexo……………………………………………………………………………………………...........34 
 
 7 
Introducción 
 
A pesar de que no existe evidencia directa acerca de la naturaleza de las primeras formas de vida ni de 
las condiciones ambientales que existían al surgir los primeros sistemas biológicos, la facilidad con la 
que se pueden sintetizar compuestos orgánicos en condiciones como las que pudieron existir en la 
Tierra primitiva ha sido tomada como evidencia a favor de una hipótesis heterotrófica sobre el 
surgimiento de la vida (Johnson et al, 2008). No obstante, existen propuestas alternativas que suponen 
un origen autotrófico de la vida. Un ejemplo es la propuesta de Wächtershäuser (1988, 1990 y 2007), 
por mucho la más articulada hasta el momento. Dicha propuesta supone que la reducción de dióxido de 
carbono (CO2) utilizando pirita (FeS2) como catalizador y la acumulación de diversos compuestos 
orgánicos fruto de este proceso, eventualmente dieron origen a ciclos metabólicos ancestrales. En este 
mismo sentido se hasugerido que el descubrimiento del ciclo reductivo del ácido cítrico, primero en 
Chlrorobium thiosulfatophilum (Evans et al. 1966) [hoy conocida como Chlorobium limicola] y luego 
en otros procariontes, respalda la idea de un origen autotrófico de la vida (Maden, 1995) gracias a su 
naturaleza química esencialmente reductora. Diversos autores han sugerido también que la presencia de 
los centros hierro-azufre (Fe-S) en enzimas claves del metabolismo central (cf. Hazen, 2005), como la 
glutamin-PRPP amidotransferasa y la endonucleasa III, puede ser vista como una evidencia más en 
favor de la teoría autotrófica sobre el origen de la vida, debido a que la química que rodea a estos 
centros es característica de ambientes que se piensan primigenios. 
 
Sin embargo, hay que considerar que si el ciclo reductivo del ácido cítrico se hubiera dado en la Tierra 
primitiva, la falta de enzimas, fuentes de energía como el ATP o el GTP y de cofactores como biotina, 
tiamina, coenzima A (CoA) o ferredoxina reducida, debió requerir altos niveles de eficiencia en cada 
una de las reacciones que componen el ciclo, suponiendo además que no se formaran productos 
secundarios que fueran incorporados a otras reacciones, ciclos o hipotéticas rutas metabólicas 
 8 
primigenias (Orgel, 2008). De otro modo, las concentraciones de los compuestos disminuirían 
exponencialmente hasta extinguir el ciclo (Orgel, 2008). Argumentos como este minimizan la 
posibilidad de que el ciclo reductivo de Krebs haya jugado un papel importante en el origen de la vida. 
 
En el mismo sentido se ha propuesto que si el ciclo del ácido cítrico o de Krebs es un ciclo metabólico 
conservado, en consecuencia también el ciclo del ácido cítrico en sentido reductivo debe estar 
igualmente conservado (Smith y Morowitz, 2004). Sorprendentemente, la búsqueda realizada por 
Huynen et al. (1999) de los genes que codifican las enzimas del ciclo del ácido cítrico en su sentido 
oxidativo para varios genomas completamente secuenciados concluyó que el ciclo de Krebs no solo no 
se encuentra completo en todos los organismos estudiados, sino que está completamente ausente en 
muchas especies. Ello implica que el ciclo reductivo de Krebs no es un ciclo metabólico conservado, ni 
está ampliamente distribuido. Más aún, el hecho de que no todas las enzimas de ambos ciclos se 
compartan hace evidente la imposibilidad del establecimiento del sentido reductivo aunque se tenga la 
maquinaria enzimática necesaria para sostener el ciclo oxidativo. Lo anterior queda ejemplificado por 
la ATP citrato liasa (EC 2.3.3.8), la 2-oxoglutarato ferrodoxin oxidoreductase (EC 1.2.7.3) y la 
fumarato reductasa (EC 1.3.99.1); dado que son enzimas indispensables del ciclo reductivo de Krebs y 
no forman parte de la maquinaria enzimática del ciclo oxidativo (Hügler, et. al., 2005). 
 
Se sabe que en todos los grandes grupos de procariontes descritos a la fecha existen organismos que 
poseen la habilidad de crecer autotróficamente (Hügler et al. 2005). De hecho, se han descrito por lo 
menos 6 diferentes maneras de fijar CO2 en muy distintos grupos de procariontes. Algunos ejemplos 
incluyen: a) el ciclo reductivo de las pentosas fosfato mejor conocido como el ciclo de Calvin-Benson, 
que es principalmente utilizado por bacterias aerobias autotróficas como las cianobacterias o bacterias 
purpuras de los tipos α, β ó γ (Watson y Tabita, 1997); b) el ciclo reductivo del ácido cítrico 
identificado en bacterias de la subdivisión α-proteobacteria como el coco marino Magnetotactil MC1 
 9 
(Williams et al. 2006), así como en algunas especies de la subdivisión ε-proteobacteria, como 
Thiomicrospira denitrificans y Thiomicrospira candidatus (Hügler, 2005); c) el ciclo de fijación de 
CO2 del 3-hidroxipropionato es la principal ruta por la que el carbono es fijado en Chloroflexus 
auranticus, una bacteria verde no sulfurosa (Zarzycki et al. 2009; Tabita, 2009); d) el sentido reductivo 
de la ruta de la acetil coenzima A (acetil CoA), mediante el cual también se fija CO2, ha sido reportado 
en algunas bacterias anaerobias como la sulfato-reductora Desulfobacterium autotrophicum, una δ-
proteobacteria y en algunas bacterias metanógenas (Strittmatter, 2009); e) la ruta híbrida del 3-
hidroxipropionato/4-hidroxibutirato descrita en Metallosphaera sedula, una arquea del orden 
Sulfolobales (Berg et al. 2007); y f) la ruta híbrida del dicarboxilato/4-hidroxibutirato descrita en 
Ignicoccus hospitalis, una arquea anaerobia, autotrófica e hipertermofílica, que es además el hospedero 
de Nanoarchaeum equitans, otra arquea simbionte/parásita (Huber et al. 2008). 
 
Todo lo anterior sugiere que el ciclo reductivo del ácido cítrico no es ni un ciclo metabólico conservado 
ni está ampliamente distribuido a lo largo de la diversidad procarionte, como se asume dentro de la 
teoría autotrófica del surgimiento de la vida (Wächtershäuser, 1988, 1990 y 2007), sino también que en 
distintos grupos procariontes otros ciclos y rutas metabólicas son de hecho igualmente importantes para 
la fijación de CO2. Una manera de acercarse a la confirmación de esta posibilidad es la búsqueda 
genómica de la presencia de las enzimas del ciclo reductivo del ácido cítrico en los organismos 
completamente secuenciados disponibles en bases de datos de acceso público, lo que permitirá conocer 
su distribución filogenética y su nivel de conservación. En el presente trabajo se exponen resultados de 
un análisis de este tipo usando metodologías bioinformáticas sobre la identificación y la distribución de 
las enzimas que participan en el ciclo reductivo de Krebs. 
 
 
 10 
Metodología 
 
Secuencias Problema 
Las enzimas de la base de datos KEGG LIGAND (Kanehisa y Goto, 2006) de compuestos químicos 
que mostraron concordancia entre los compuestos que integran el ciclo de Krebs en sentido reductivo y 
las reacciones descritas para dicho ciclo fueron reclutadas, sin importar si estaban o no reportadas 
dentro de la base de datos KEGG PATHWAY (Kanehisa y Goto, 2006) como participantes activas del 
ciclo reductivo del ácido cítrico. Ello permitió cubrir todas las combinaciones posibles entre enzimas 
consideradas capaces de completar el ciclo. Los compuestos químicos de las reacciones del ciclo 
fueron tomados de Evans et al., (1966) y de la base de datos KEGG PATHWAY. 
 
Base de Datos de Proteomas 
Todos los proteomas disponibles al 2 de septiembre de 2008 fueron incorporados a una base de datos 
principal llamada proteos. Dicha base engloba un total de 837 proteomas de organismos completamente 
secuenciados y publicados en la literatura científica, localizados en la base de datos publica Kyoto 
Encyclopedia of Genes and Genomes (Kanehisa y Goto, 2006). De los 837 proteomas estudiados, 686 
son de bacterias (81.96% del total), 99 son de eucariontes (11.83% del total) y 52 son de arqueas 
(6.21% del total). 
 
Búsqueda de Secuencias Homólogas 
Con el propósito de acotar el número de resultados en cada búsqueda y que los resultados tuviesen un 
sentido biológico en términos de función catalítica, se eligió el programa hmmer v2.3.2 
(http://hmmer.janelia.org/) “the profile hmmer search” que utiliza modelos probabilísticos llamados 
“profile hidden Markov models”, ya que en este tipo de búsquedas se asigna una mayor prioridad a la 
detección de dominios funcionales en las secuencias proteicas así como al orden en el que se presentan 
 11 
dichos dominios. Las secuencias ortólogas necesarias para la construcción de los “profiles” se 
obtuvieron de la base de datos KEGG ORTHOLOGY, KO (Kanehisa y Goto, 2006) mediante un 
proceso de selección aleatorizado. Las alineaciones previas a la construcción de los “profiles” se 
realizaron con el algoritmo clustalw v2.0.9-1 (Thompson et al. 1994). Los “profiles” utilizados para las 
búsquedas fueron construidos con las instrucciones del manual de usuario disponible en el sitio web de 
hmmer (http://hmmer.janelia.org/).Por último se generaron un total de 43 “profiles”, con los que se 
llevo a cabo la búsqueda de proteínas homólogas en la base local “proteos” usando el programa 
hmmersearch v2.3.2 con un valor umbral E de 1x10-3. 
 
Filogenias 
Se desarrolló una filogenia para las subunidades, cuya función es necesaria en la catálisis de la 
reacción, de las enzimas del ciclo consideradas cruciales para el establecimiento de la química 
reductiva característica del ciclo en cuestión (piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa). En la 
construcción de dichas filogenias se incluyeron las secuencias ortólogas de los organismos para los 
cuales se dedujo la presencia del ciclo reductivo del ácido cítrico, así como las secuencias ortólogas de 
organismos representativos de algunos grupos de bacterias y arqueas en las que se puede reconocer la 
presencia de la enzima; y en los que, sin embargo, existe la posibilidad de que dicha enzima pueda estar 
participando en una ruta metabólica diferente dado que estos organismos no cuentan con el total de 
enzimas necesarias para sostener el ciclo reductivo. Las secuencias se alinearon utilizando el programa 
clustalw v2.0.9-1 (Thompson, 1994), y las filogenias de las enzimas fueron construidas utilizando la 
metodología de Neighbor Joining en el programa MEGA v4.0 (Kumar, 2008) con un bootstrap de 1000 
repeticiones. 
 
 
 12 
Resultados 
 
Con base en los ciclos guía empleados en el presente estudio, se dedujo la existencia de por lo menos 
cuatro variantes del ciclo. Hemos denominado a dichas variantes como ciclo completo, ciclo 
alternativo, ciclo corto y ciclo corto alternativo. Tal distinción es meramente teórica, ya que hasta el 
momento no tenemos conocimiento sobre la existencia de evidencias experimentales de tales variantes. 
Se utilizó una nomenclatura que facilita el reconocimiento de los pasos metabólicos: cada una de las 
reacciones fue numerada de acuerdo con el sentido reductivo y se relacionó con las enzimas que 
pueden catalizar tal reacción. Ello permitió la construcción de un ciclo hipotético que conjunta la 
información bioquímica recabada (Figura 1). 
 
Sin importar la variante, se identificaron dos enzimas que parecen ser centrales para el establecimiento 
del flujo reductivo del ciclo. Ellas son la piruvato sintasa (EC 1.2.7.1) y la 2-oxoglutarato sintasa (EC 
1.2.7.3). La importancia de la piruvato sintasa resulta de su actividad catalítica en la síntesis de piruvato 
a partir de Acetil-CoA, y de la reducción de una molécula de CO2 en los ciclos completo y alternativo. 
La 2-oxoglutarato sintasa, por otra parte, resulta indispensable, para cualquiera de las cuatro variantes 
del ciclo, por su actividad catalítica durante la síntesis de 2-oxoglutarato a partir de Succinil-CoA y la 
reducción de una molécula de CO2. La actividad de ambas enzimas depende de la ferredoxina reducida, 
un cofactor cuya naturaleza química asemeja a la de la pirita (FeS2), y gracias a la cual se establece el 
flujo reductivo (Figura 1). 
 
Por otro, lado la maquinaria enzimática (Tabla 1) necesaria para utilizar alguna de las variantes del 
ciclo reductivo de Krebs no parece estar presente de manera homogénea en todos los organismos 
estudiados. En cambio, pudimos identificar dos grupos principales en ramas específicas de la filogenia 
en donde ello si ocurre. En primer lugar, se puede identificar la presencia de un grupo compacto y bien 
 13 
definido integrado por 11 bacterias pertenecientes al grupo conocido como bacterias verdes sulfurosas 
(GSB, Green Sulfur Bacteria) y que constituyen el 100% de los organismos con genoma 
completamente secuenciado representados en dicho grupo al momento de la construcción de la base de 
datos (Tabla 2). Históricamente, a las bacterias verdes sulfurosas se les ha atribuido la capacidad de 
fijar CO2 mediante el uso del ciclo reductivo de Krebs gracias a la caracterización del ciclo hecha por 
Evans et al. (1966) en Chlorobium limicola, y a la extrapolación de estos resultados a los demás 
miembros de este grupo. Durante la revisión bibliográfica que se realizó a la par del desarrollo del 
presente trabajo, se encontró evidencia experimental de la presencia del ciclo reductivo en 
Chlorobaculum tepidum, actualmente conocida como Chlorobium tepidum, en la cual se rastrearon 
bioquímicamente las reacciones que integran el ciclo reverso del ácido cítrico, así como también las 
enzimas de la fase oxidativa (Tang y Blankenship, 2010. Feng, et al., 2010). Hasta donde se sabe, este 
enfoque no se ha llevado a cabo en algún otro representante del genero Chlorobi. 
 
Pudimos distinguir un segundo grupo, un poco menos compacto, que consta de siete especies de 
bacterias, en las cuales se identificaron las enzimas necesarias para llevar a cabo al menos una variante 
del ciclo de Krebs en su sentido reductivo. Dichos organismos están distribuidos entre las subdivisiones 
de Proteobacterias Alfa (α), Beta (β), Delta (δ) y Épsilon (ε) (Tabla 2). 
 
Hay casos particulares como el de Actinobacteria bacterium y Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1, 
que son miembros de los grupos bacterianos Acidobacterias y Aquificae, respectivamente. Son los 
únicos organismos en sus respectivos taxa a los cuales les pudimos detectar las enzimas necesarias para 
fijar CO2 mediante alguna variante del ciclo reductivo del ácido cítrico (Tabla 2). 
 
 14 
Sorprendentemente, y en contraste con lo sugerido por la teoría autotrófica del surgimiento de la vida 
(Wächtershäuser, 1988, 1990 y 2007), ninguna arquea incluida dentro de la base de datos proteos 
presenta las enzimas necesarias para fijar CO2 con alguna variante del ciclo. 
 
De todo lo anterior se puede concluir que hay 20 especies bacterianas (de un total de 837 especies que 
abarcan los tres dominios de la vida) que cuentan con las enzimas requeridas para fijar CO2 mediante 
alguna de las variantes del ciclo reductivo de Krebs (Cuadro 1). 
 
Para dilucidar la historia evolutiva del ciclo y dado lo compacto de los grupos que presentan las 
enzimas necesarias para sostener alguna variante teórica del ciclo reductivo de Krebs se decidió 
construir una filogenia con las subunidades α y β de las enzimas piruvato sintasa (EC 1.2.7.1) y 2-
oxoglutarato sintasa (1.2.7.3) consideradas decisivas para el establecimiento del ciclo de Krebs reverso. 
En las filogenias de las subunidades α y β de las enzimas piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa es 
notable la reciente sinapomorfía en el grupo de las bacterias verdes sulfurosas, que contrasta con la 
posición de los miembros de los grupos de α-, β-, δ- y ε- Proteobacterias positivos a la presencia de las 
enzimas del ciclo reverso. Es importante hacer notar que en cada filogenia la posición de los miembros 
de los grupos de Proteobacterias así como la posición de Actinobacteria bacterium y 
Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1 parecen variar dependiendo de la secuencia de la cadena proteica 
utilizada para construir la respectiva filogenia (Figura 2a, 2b, 2c y 2d). 
 
 
 15 
Discusión 
 
La revisión de la bioquímica del ciclo reductivo de Krebs mostró que no existe un ciclo único. En lugar 
de ello, podemos observar variantes teóricas del mismo, las cuales incluyen algunos pasos metabólicos 
donde se encuentran enzimas con actividad redundante, es decir, la reacción puede ser catalizada por 
más de una enzima. Ello sugiere que no es difícil el surgimiento de diversas variantes del ciclo, si se 
cuenta con la maquinaria enzimática necesaria. Un ejemplo de lo anterior es el caso del parásito de la 
malaria Plasmodium falciparum, en el que el ciclo oxidativo del ácido cítrico se encuentra totalmente 
desconectado de la glucólisis y que fundamentalmente utiliza glutamato y glutamina como fuentes de 
carbono, lo que hace que algunas reacciones ocurran en sentido reverso con respecto a la dirección 
oxidativa habitual. Ello provoca, que a su vez, la ruta metabólica no sea cíclicasino se convierta en un 
complejo enramado metabólico (Olszewski, et. al., 2010) 
 
No obstante, la eficiencia total del ciclo reductivo depende de aspectos como la concentración de los 
diversos intermediarios, cofactores y coenzimas como la biotina, tiamina o coenzima A, ferredoxina 
reducida, así como de una fuente de energía disponible como el ATP y/o el GTP (Orgel, 2008). De 
igual manera, las cuatro reacciones del ciclo reductivo en las que se fija CO2 parecen depender de la 
concentración de sus respectivos sustratos. Dichas concentraciones son alcanzadas gracias al uso de 
ATP o GTP, como se observa en los casos de la síntesis de acetil-CoA, fosfoenolpiruvato o succinil-
CoA a partir de sus respectivos precursores dentro del ciclo. Si dichas concentraciones no se alcanzan 
entonces el sentido oxidativo del ciclo es el que se vería favorecido (Orgel, 2008). 
 
El hecho de que a) en las reacciones R3, R5, R10 y R11 del ciclo (Figura 1) se lleve a cabo la fijación 
de CO2; b) que R5 y R11 presenten una redundancia enzimática reportada en las bases de datos; c) que 
R3 y R10 solo pueden ocurrir mediante la acción respectiva de las enzimas piruvato sintasa y 2-
 16 
oxoglutarato sintasa; y d) que estas dos últimas enzimas son dependientes de ferredoxina, hace que 
estas ultimas sean cruciales para el establecimiento del ciclo. Es decir, sin ellas el ciclo no puede 
llevarse a cabo, y no se conoce ninguna enzima en las bases de datos disponibles a la fecha que puedan 
reemplazarlas. Con ello en mente, se puede dilucidar una versión hipotética mínima del ciclo, en donde 
la enzima 2-oxoglutarato sintasa sería indispensable, aunque la fijación de CO2 y la cantidad de citrato 
generado en un ciclo con estas características se reduce justamente a la mitad (Figura 1). 
 
El metabolismo especializado que se requiere para crecer en ambientes como las chimeneas 
hidrotermales o quimioclinas donde la concentración de oxígeno es mínima (Casamayor, 2002; 
Glaeser, 2003) sin duda es favorable a organismos como las bacterias verdes sulfurosas. No obstante el 
metabolismo quimiolitoautotrófico, los ambientes más comunes donde se han aislado los miembros de 
la familia Chlorobiaceae son altamente contrastantes, algunos ejemplos son: ambientes dulceacuícolas 
como lagos, ambientes salobres y ambientes marinos (Inhoff, 2003). 
 
Es razonable suponer que uno de los procesos evolutivos que originó al grupo de las bacterias verdes-
sulfurosas involucró en algún momento al ciclo reductivo de Krebs como un muy importante recurso 
mediante el cual se podían cubrir las necesidades de carbono en un hipotético ancestro de estos 
organismos. Ello explicaría las sinapomorfías en las filogenias de las subunidades alfa y beta de las 
enzimas piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa. La presencia de alguna variante hipotética del ciclo 
en las diferentes especies de los grupos de Proteobacterias, Acidobacteria y Aquificae puede ser 
explicada entendiendo el ambiente en el que este tipo de organismos viven actualmente, y que resulta 
ser muy similar, si no es que el mismo, que el de las bacterias verdes sulfurosas (Hügler et al. 2005). 
 
A pesar que las enzimas piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa parecen ser usadas por algunos 
representantes de Proteobacterias, Acidobacterias y Aquificae en alguna variante del ciclo reductivo del 
 17 
ácido cítrico (Tabla 3), dichas enzimas guardan un parecido mayor a nivel de estructura primaria con 
sus homólogos de otros organismos. En estos otros organismos muy probablemente dichas enzimas son 
utilizadas en rutas metabólicas como la glucólisis, la gluconeogénesis, el ciclo de los ácidos 
tricarboxílicos, el metabolismo del piruvato o el metabolismo del butanoato. Ello se puede explicar 
gracias a que en principio la síntesis de piruvato y de 2-oxoglutarato es importante no solo para el ciclo 
de Krebs tanto en sentido oxidativo como en sentido reductivo, sino también para las rutas antes 
mencionadas. Todo lo anterior sugiere fuertemente que el ciclo puede integrarse como respuesta a las 
necesidades de los organismos que presenten una plasticidad genotípica suficiente. 
 
 
 18 
Conclusiones 
 
El estudio de la distribución y el análisis de los genes ortólogos del ciclo reductivo del ácido cítrico no 
muestra que éste proceso sea un núcleo metabólico conservado ni cuente con una amplia distribución 
filogenética. Por el contrario, todo indica que se trata de un metabolismo altamente especializado que 
cumple con la función de proporcionar carbón orgánico a los organismos capaces de establecer dicho 
ciclo utilizando el CO2 disponible en el ambiente. 
 
El análisis de las cadenas α y β de las enzimas piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa parece indicar 
que las bacterias verdes sulfurosas tienen un ancestro común especializado en fijar CO2 mediante este 
ciclo. En contraste, los organismos de los demás grupos como el de las Proteobacterias parecen haber 
adaptado su maquinaria enzimática a inéditas condiciones mientras colonizaban un nicho ecológico 
nuevo compitiendo por el espacio y los recursos en contra de organismos previamente adaptados como 
las bacterias verdes sulfurosas. 
 
Todo ello sugiere que el ciclo reductivo del ácido cítrico no es un ciclo metabólico ancestral, o bien que 
si alguna vez lo fue, extrañamente las huellas genómicas se han perdido. 
 
 
 19 
Referencias 
En estricto orden alfabético 
 
Berg, Ivan A., Kockelkorn, Daniel., Buckel, Wolfgang y Fuchs, Georg. 2007. A 3-
Hydroxypropionate/4-Hydroxybutyrate autotrophic carbon dioxide assimilation pathway in Archaea. 
Science. 318: 1782-1786. 
Casamayor, Emilio., Pedrós-Alió, Carlos., Muyzer, Gerard y Amann, Rudolf. 2002. 
Microheterogeneity in 16S ribosomal DNA-defined bacterial populations from a stratified planktonic 
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 23 
Figuras 
 
Figura 1. Ciclo reductivo del ácido cítrico. Requerimientos energéticos, coenzimas y cofactores 
necesarios. Los ciclos completo y alternativo incluyen las reacciones de R1 a R12 con la salvedad de 
poder iniciar con la enzima “citrato (pro-3S)-liase” (E.C. 4.1.3.6) o con la enzima “ATP citrato sintase” 
(E.C. 2.3.3.8) R1 y R1’ respectivamente. Los ciclos corto y corto alternativo incluye las mismas 
reacciones iniciales (R1 o R1') pero en estas variantes únicamente se contemplan de la reacción R6 a la 
R12 después de que el citrato es descompuesto en oxaloacetato y se asume que el acetato o la acetil 
CoA, derivados de la hidrolisis del citrato, son utilizados en por otros sistemas metabólicos. 
 
 24 
 
 
 
 
 
# R E.C. Nombre de la Enzima 
1 4.1.3.6 Citrato liase 
1' 2.3.3.8 Citrato sintase 
2 
6.2.1.13 Acetato: CoA ligasa (ADP) 
6.2.1.1 Acetato: CoA ligasa (AMP) 
3 1.2.7.1 Piruvato sintasa 
4 
2.7.9.2 Piruvato H2O dicinasa 
2.7.1.40 Piruvato cinasa 
2.7.9.1 Piruvato fosfato cinasa 
5 
4.1.1.49 
Fosfoenolpiruvato carboxicinasa 
(ATP) 
4.1.1.31 Fosfoenolpiruvato carboxilasa 
4.1.1.32 
Fosfoenolpiruvato carboxicinasa 
(GTP) 
6 
1.1.1.37 Malato deshidrogenasa 
1.1.99.16 Malato deshidrogenasa 
7 4.2.1.2 Fumarato hidratasa 
8 1.3.99.1 Succinato deshidrogenasa 
9 6.2.1.5 Succinato: CoA ligasa 
10 1.2.7.3 2-oxoglutarato sintasa 
11 
1.1.1.42 Isocitrato deshidrogenasa (NADP+) 
1.1.1.41 Isocitrato deshidrogenasa (NAD+) 
12 y 13 4.2.1.3 Aconitato hidratasa 
 
Tabla 1. Numero de reacción del ciclo (ver Figura 1), numero E.C. de las enzimas relacionadas a cada 
reacción y nombre de las mismas. Se incluyen las enzimas descritas por Evans, et al. (1966), las 
enzimas marcadas por la ruta de KEGG PATHWAYS (Kanehisa y Goto, 2006) y las enzimas 
localizadas por su relación con la reacción química correspondiente mediante KEGG LIGAND 
(Kanehisa y Goto, 2006). 
 
 25 
 
 
Tabla 2 a) Primeras Reacciones del Ciclo (R1 a R5). 
 
 
 
 
2
.3
.3
.8
6
.2
.1
.1
3
6
.2
.1
.1
2
.7
.9
.2
2
.7
.1
.4
0
2
.7
.9
.1
4
.1
.1
.4
9
4
.1
.1
.3
1
4
.1
.1
.3
2
Organismos Subunidades α β γ - - - α β δ γ - - - - - -
1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0
0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0
1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1
0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1
0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1
0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1
0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0
Prosthecochloris aestuarii
Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1
Chlorobium phaeobacteroides BS1
Chlorobium limicola
Prosthecochloris vibrioformis
Pelodictyon luteolum
Pelodictyon phaeoclathratiforme
Chloroherpeton thalassium
Rhodopseudomonas palustris BisA53
Acidobacteria bacterium
Chlorobaculum tepidum
Chlorobaculum parvum NCIB 8327
Chlorobium chlorochromatii
Chlorobium phaeobacteroides DSM 266
Rhodoferax ferrireducens
Thiomicrospira denitrificans
Nitratiruptor sp. SB155-2
Sulfurovum sp. NBC37-1
Geobacter bemidjiensis
Pelobacter propionicus
Numero EC
4
.1
.3
.6
1
.2
.7
.1
Numero de reacción 1 2 3 4 5
I 
 26 
 
 
Tabla 2 b) Ultimas reacciones del ciclo (R6 a R8). 
 
 
 
 
 
1
.1
.9
9
.1
6
Organismos Subunidades C1 C2 - C1 α β C2 F I M HM F' I' M' HM'
0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0
0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0
0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0
0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0
0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0
Prosthecochloris aestuarii
Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1
Chlorobium phaeobacteroides BS1
Chlorobium limicola
Prosthecochloris vibrioformis
Pelodictyon luteolum
Pelodictyon phaeoclathratiforme
Chloroherpeton thalassium
Rhodopseudomonas palustris BisA53
Acidobacteria bacterium
Chlorobaculum tepidum
Chlorobaculum parvum NCIB 8327
Chlorobium chlorochromatii
Chlorobium phaeobacteroides DSM 266
Rhodoferax ferrireducens
Thiomicrospira denitrificans
Nitratiruptor sp. SB155-2
Sulfurovum sp.NBC37-1
Geobacter bemidjiensis
Pelobacter propionicus
Numero EC
1
.1
.1
.3
7
4
.2
.1
.2
1
.3
.9
9
.1
6 7 8Numero de reacción
I 
 27 
 
 
Tabla 2 c) Ultimas reacciones del ciclo (R9 a R12). 
 
 
 
Tabla 2. Presencia/ausencia de los genes, representado por cero y uno (0/1), que codifican las enzimas 
necesarias para sostener alguna variante teórica del ciclo reductivo del ácido cítrico. 20 Organismos de 
4 grupos bacterianos Proteobacterias, Acidobacterias, Bacterias verdes sulfurosas (Chlorobi) y 
Aquificae. Subunidades de las enzimas multimericas con la nomenclatura respectiva reportada en la 
literatura. Sección “a” reacciones 1 a 5 (R1 – R5), sección “b” reacciones 6 a 8 (R6 – R8) y sección “c” 
reacciones 9 a 12 (R9 – R12) de acuerdo a la figura 1. 
 
1
.1
.1
.4
2
1
.1
.1
.4
1
Organismos Subunidades α β α' β' α β δ γ - - H1 H2
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
11 12
Numero EC
6
.2
.1
.5
1
.2
.7
.3
4
.2
.1
.3
Numero de reacción 9 10
Rhodoferax ferrireducens
Thiomicrospira denitrificans
Nitratiruptor sp. SB155-2
Sulfurovum sp. NBC37-1
Geobacter bemidjiensis
Pelobacter propionicus
Rhodopseudomonas palustris BisA53
Acidobacteria bacterium
Chlorobaculum tepidum
Chlorobaculum parvum NCIB 8327
Chlorobium chlorochromatii
Chlorobium phaeobacteroides DSM 266
Prosthecochloris aestuarii
Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1
Chlorobium phaeobacteroides BS1
Chlorobium limicola
Prosthecochloris vibrioformis
Pelodictyon luteolum
Pelodictyon phaeoclathratiforme
Chloroherpeton thalassium
 28 
 
 
 
 
 
Grupo de 
Bacterias Clasificación Organismo 
Clave 
KEGG 
Proteobacteria 
Betaproteobacteria Rhodoferax ferrireducens rfr 
Epsilonproteobacteria 
Thiomicrospira denitrificans tdn 
Nitratiruptor sp. SB155-2 nis 
Sulfurovum sp. NBC37-1 sun 
Deltaproteobacteria 
Geobacter bemidjiensis gbm 
Pelobacter propionicus ppd 
Alphaproteobacteria Rhodopseudomonas palustris BisA53 rpe 
Acidobacteria Acidobacteria bacterium aba 
Chlorobi (GSB) Chlorobiaceae 
Chlorobaculum tepidum cte 
Chlorobaculum parvum NCIB 8327 cpc 
Chlorobium chlorochromatii cch 
Chlorobium phaeobacteroides DSM 266 cph 
Chlorobium phaeobacteroides BS1 cpb 
Chlorobium limicola cli 
Prosthecochloris vibrioformis pvi 
Pelodictyon luteolum plt 
Pelodictyon phaeoclathratiforme pph 
Chloroherpeton thalassium cts 
Prosthecochloris aestuarii paa 
Aquificae Sulfurihydrogenibium sp. YO3AOP1 sul 
 
Cuadro 1. Grupos taxonómicos de los 20 organismos donde se dedujo la presencia de las enzimas 
necesarias para sostener alguna variante del ciclo reductivo junto a su respectiva clave de 3 letras 
incluida en las filogenias. 
 
 
 29 
 
a) P iruvato Sintasa 
Subunidad a 
Proteobacterias 
(··· · · · · ··Actinob¡¡cie¡ia·¡;i;c·ie¡i~·;;; · .. ····· .. · 
! y . 
l. Sulfurihydrogenibium sp. Y03AOPl ¡ ....................................................................... 
" 
2Z 
~ 
" 
.. 
lOO 
" 
~. 
'P' 
'pb 
PO' 
L ___ _ ~ • 
... ,. ... . " 
~ 
" -..,. 
Ix 
"" 
Bacterias verdes sulfurosas 
 30 
 
 
b) P iruvato Sintasa 
Subunidad P 
Proteobacterias 
(_··· ···· ··Acti;;;;bacie~a"iiilc·ier¡üm· ······ ··· ··: 
¡. Sulfurihydrogenibium sp. Y03AOPl ! ....................................................................... 
'00 
" 
" 
" 
" 
1 
" 
,. 
" 
" 
" 
89 
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7<3 ... 
pIt 
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" 
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" 
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pgn 
hy. 
ohy 
_po 
.'" "h ... ... 
'K 
'" mba 
'po 
'" pmo 
, ... 
k" 
Bacterias verdes sulfurosas 
 31 
 
 
e) 2-0xoglutarato Sintasa 
Subunidad a cpe 
'---c'" 
'---- ,.. 
dó Bacterias verdes su~urosas 
cph 
.. 
Proteobacterias 
(····· .. ··Actinobacie~a-¡j¡lc·ie~¡l;;;;············: 
¡ ... ~~ff.~!.!h.r~'.~~.e.~~~!~.'!!. . ~p. ... v..? 3.~~p..~) 
" 
et. " ., 
cch 
L-___ pph 
'------et. 
r---'" ... 
15 
.. 
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"y' 
.. 
' P' ,. chy .. .~ 
100 ",u 
.... 
ku 
 32 
 
 
 
d) 2-0xoglutarate Sintase 
Subunidad P 
Proteobacterias " 
(_· · · ···· · ·Acti;;;;bacie~a"iiilc·ier¡üm· ····· ·· ··· " .. 
61 
' .. 
di 
OO. 
' .. 
'" '----- ct. 
'" 
" 
,,, .. .. 
[. Sulfurihy drogenibium sp. Y03AOPl .i '-------". 
.. •....•.••..•••.•.•.••.•.••••.•.•..•.•.•..•...••..•..•••••.•.•..•.• .. 79 '--------- ct • ... 
100 99 
100 ... 
"" 
100 "" 
". 
" '---- oto 
60 '-----" " 
" 
" .. ... 
,~ 
" '.-.~ 
mOa 
OK 
' LO 
'P' 
" 
" 
ohy 
100 em 
'---------------~ 
'-----------------k" 
Bacterias verdes sulfurosas 
 33 
Figura 2: Filogenias de a) subunidad alfa de la piruvato sintasa, b) subunidad beta de la piruvato 
sintasa, c) subunidad alpha de la 2-oxoglutarato sintasa y d) subunidad beta de la 2-oxoglutarato 
sintasa. Se incluyen los 20 organismos en los que se identificó la presencia de las enzimas del ciclo 
reductivo del ácido cítrico y organismos representativos de otros grupos bacterianos en los que se 
identifico la presencia de las enzimas piruvato sintasa y 2-oxoglutarato sintasa que parecen ser 
utilizadas en otras rutas o ciclos metabólicos. La polaridad del árbol se obtuvo utilizando las secuencias 
de la arquea Candidatus Korarchaeum cryptofilum en los cuatro casos. 
 
 
 34 
Anexo 
 
 
 
 
 
 
Metalloproteins and the Pyrite-based Origin of Life: 
A Critical Assessment 
 
METALLOPROTEINS
Metalloproteins and the Pyrite-based Origin of Life:
A Critical Assessment
Mario Rivas & Arturo Becerra & Juli Peretó &
Jeffrey L. Bada & Antonio Lazcano
Received: 29 December 2010 /Accepted: 5 March 2011 /
Published online: 24 March 2011
# Springer Science+Business Media B.V. 2011
Abstract We critically examine the proposal by Wächtershäuser (Prokaryotes 1:275–283,
2006a, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 361: 787–1808, 2006b) that putative transition
metal binding sites in protein components of the translation machinery of hyper-
thermophiles provide evidence of a direct relationship with the FeS clusters of pyrite and
thus indicate an autotrophic origin of life in volcanic environments. Analysis of completely
sequenced cellular genomes of Bacteria, Archaea and Eucarya does not support the
suggestion by Wächtershäuser (Prokaryotes 1:275–283, 2006a, Philos Trans R Soc Lond B
Biol Sci 361: 787–1808, 2006b) that aminoacyl-tRNA synthetases and ribosomal proteins
bear sequence signatures typical of strong covalent metal bonding whose absence in
mesophilic species reveals a process of adaptation towards less extreme environments.
Keywords FeS clusters . FeS protein folds . Pyrite-dependent primordial autotrophy .
Aminoacyl-tRNA synthetases . Reverse Krebs cycle
Abbreviations
RS aminoacyl-tRNA synthetase
r-proteins ribosomal proteins
CoA coenzyme A
Orig Life Evol Biosph (2011) 41:347–356
DOI 10.1007/s11084-011-9238-1
M. Rivas : A. Becerra :A. Lazcano (*)
Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo. Postal 70-407 Cd.
Universitaria, 04510 México D.F., Mexico
e-mail: alar@ciencias.unam.mx
J. Peretó
Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biología Evolutiva, Universitat de València, Apartat Postal 22085,
46071 València, Spain
J. L. Bada
Scripps Institution of Oceanography, University of California at San Diego, La Jolla, CA 92093-0212,
USA
Introduction
During the past few decades a numberof opposing hypothesis on how life first appeared
have been suggested. Although the proposal of an heterotrophic origin of life based on the
prebiotic synthesis and accumulation of organic compounds is supported by several major
lines of evidence (Bada and Lazcano 2009), the antiquity of the reverse Krebs cycle, the
basal distribution of hyperthermophilic organisms in some phylogenetic trees, and the
catalytic properties of pyrite have been advocated in support of an autotrophic origin of life
(Wächtershäuser 1988; Smith and Morowitz 2004; Russell and Hall 1997; Martin and
Russell 2003). So far, the most articulate autotrophic hypothesis stems from the work of
Wächtershäuser (1988, 1997, 1998, 2006a, b, 2007), who has argued that life started
without genetic information with the appearance of a prebiotic autocatalytic reductive
tricarboxylic acid (rTCA) cycle (also called the reductive citric acid cycle, or reverse Krebs
cycle), that is assumed to be originally based on the formation of the highly insoluble
mineral pyrite in sulfur-rich volcanic environments.
Recognition of the key metabolic role of the citric acid cycle led Hartman (1975) to
propose an autotrophic origin of life involving clays, transition state metals, disulfides,
dithiols, ultraviolet light and CN−. The primordial chemoautotrophic carbon fixation
pathway advocated by Wächtershäuser (1988, 1992, 1997, 2006a, b, 2007) is assumed to
be a reductive citric acid cycle, i.e., an Arnon-type cycle, like the one originally described
for the photosynthetic green sulfur bacterium Chlorobium limicola (Evans et al. 1966).
Molecular phylogenetic trees show that this mode of carbon fixation is found in anaerobic
Archaea and in the most deeply divergent (eu)Bacteria, which has been interpreted as
evidence of its primitive character (Maden 1995). Similar arguments have been applied to
other biosynthetic routes, such as the reductive acetyl-CoA or the different versions of the
hydroxypropionate/hydroxybutarate pathway found in Archaea (Berg et al. 2010).
Wächtershäuser’s proposal, which is part of a trend that assumes that genetic material
was not essential for the origin of life (Lazcano 2010), has been modified by Russell and
Hall (1997) and Martin and Russell (2003), who have argued that primordial life depended
on a primitive version of the acetyl-CoA pathway that is assumed to have originated within
the FeS-rich mineral boundaries of low-temperature alkaline hydrothermal vents.
As argued by Wächtershäuser (1988, 2007), the formation of pyrrhotite (Fe1-xS) and
pyrite (FeS2) provides a continuous input of redox energy that fueled the formation of the
first living entities. The FeS/H2S combination is a strong reducing agent, and has been
shown to provide an efficient source of electrons for the reduction of nitrogen and organic
compounds under mild and extreme conditions. Although not all proposals of a
hydrothermal origin of life favor a high-temperature regime (Martin and Russell 2007), the
scenario proposed by Wächtershäuser (1988, 2007) fits well with the environmental conditions
found deep-sea hydrothermal vents rich in transition metals and H2S, CO2, and CO.
Awide range of minerals, including Fe and Cu sulfides, have been shown to be catalysts,
with Ni and Co being particularly efficient in abiotic carbon fixation reactions under
laboratory conditions simulating extreme environments (Huber and Wächtershäuser 1997,
2006; Cody 2004; Cody et al. 2004). It has also been argued that the hypothetical
evolutionary relationship between FeS metalloproteins and the FeS clusters found in pyrite
and other hydrothermal minerals is one of the outcomes of the pyrite-dependent abiotic
synthesis of activated organic compounds (Huber and Wächtershäuser 1997). Here we
critically examine the suggestion by Wächtershäuser (2006a, b) that the patterns of
sequence signatures present in protein components of the translational machinery of
348 M. Rivas et al.
hyperthermophiles support his proposal of a pyrite-dependent origin of life in volcanic
environments rich in transition-metal sulfides.
The iron-sulfur protein fold clusters are versatile prosthetic groups found in a wide variety of
proteins present in all known cells. Due to their electron transfer properties, they play a major
role in bioenergetic processes, catalysis and regulation, and are involved in iron/sulfur storage,
and regulation of gene expression processes involved in the response to oxidative stress and
photosynthetic and respiratory processes (Johnson et al. 2005; Meyer 2008; Lill 2009).
The possibility that extant metabolic processes reflect the early recruitment of widely
distributed minerals like FeS endowed with catalytic properties was suggested long ago
(Lipmann 1965; Eck and Dayhoff 1966; Hall et al. 1971, 1974a,b). The presence of two
[4Fe-4S] clusters in ferredoxins (Eck and Dayhoff 1966), and the demonstration that certain
denaturalized apoproteins would spontaneously refold by the addition of sulfur and iron
ions (Malkin and Rabnowitz 1966) was first interpreted as indicating an enzyme-free
process of self-assembly leading to primitive electron-transfer polypeptides.
Wächtershäuser (2006a) has argued that several ancient protein components of the
translation machinery bear evidence of the gradual loss by “degeneration rather than by
adaptation” of strong S-metal covalent bonds as mesophily evolved. According to this
proposal, a number of hyperthermophilic aminoacyl-tRNA synthetases (RSs), i.e., valyl-,
isoleucyl-, leucyl-, methionyl-, histidyl-, phenylalanyl- and prolyl-RSs, and of ribosomal
proteins (S4, S14, S17, S18, L24, L28, L31, L33, and L36) exhibit patterns of sequence
signatures formed by 4n Cys units (n=1 to 6), which are present in protein folds found in
zinc-finger families and other strong covalent metal bonding sites Wächtershäuser (2006a,
b). The availability of large numbers of completely sequenced cellular genomes from the
three major lineages has allowed us to test this scheme. Here we present the results of such
an analysis.
Material and Methods
Sequences
Sequences encoding valyl-, isoleucyl-, leucyl-, methionyl-, histidyl-, phenylalanyl- and
prolyl-RSs, together with those of the genes of ribosomal proteins L33, S17, L24, S14,
L36, S4, L31, L28 and S18 discussed by Wächtershäuser (2006a), were retrieved from the
completely sequenced Escherichia coli (eco), Methanocaldococcus jannaschii (mja), Homo
sapiens (hsa) and Saccharomyces cerevisiae (sce) genomes available in the Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG, Kanehisa and Goto 2000). The KEGG,
BRENDA (Schomburg et al. 2002) and PDB (Berman et al. 2000) databases were searched
for bibliographic reports of the chemical interaction of aminoacyl tRNA synthetases with
Zn and other transition metal cations.
Homology Searches
In order to detect the presence of any protein signature associated with a strong covalent
metal bonding (e.g., Zn) on the RSs and the r-proteins discussed by Wächtershäuser
(2006a), their sequences were compared to the Pfam (Finn et al. 2010) database of protein
domains, using HAMMER software (http://hmmer.org/). The cut-off value used here was
10.00, in order to avoid false negatives.
Metalloproteins and the Pyrite-based Origin of Life 349
http://hmmer.org/
In order to identify and retrieve the sequences encoding these RSs and r-proteins, a
search was made using BLAST (Karlin and Altschul 1990, 1993) against 86 archaeal, 508
bacterial, and 133 eucaryal complete genomes derived from the KEGG database as of
October 2010. Redundancies were avoided by selecting only one genome when several
organisms of the same species were available, and only one strain was selected for each
species. The cut-off value was E=0.00001. In order to identify the 4n C units (n=1 to 6)
signature, the homologous sequences were aligned using ClustalW (Thompson et al. 1994).
Results
The compilation of the metallic cofactors required by RSs using the KEGG database is
shown in Table 1. With the exceptionof potassium, the available reports indicate that Mg2+,
Mn2+ and Zn2+, together with other divalent metallic cations (Ca2+, Co2+) appear to be
almost universal requirements for the aminoacyl-tRNA synthetases discussed here.
We have also studied the distribution of the 4nCys (n=1 to 6) signatures in the RSs
discussed by Wächtershäuser (2006a) using multiple gene alignments of homologous
sequences derived from fully sequenced cellular genomes available in public databases as
of October 2010. In contrast to what Wächsterhäuser has suggested, the 4nCys motif is
found indistinctly in mesophilic, thermophilic and hyperthermophilic species, i.e., there is
no evidence of a correlation of the presence of this motif with the organisms’ lifestyles. For
instance, the 4nCys box is present only in the archaeal thermophilic and hyperthermophilic
methionyl- and phenylalanyl-RSs, but is found in all bacterial methionyl-RSs, regardless of
the organisms’ growth temperature. Although cysteinyl-sulfur is the most frequently
observed ligand of Fe-S clusters, histidyl residues are also known to replace cysteine
(Meyer 2008). We therefore searched for cysteine-histidine variants of the 4nCys
signatures, such as 3Cys-1His and 2Cys-2His. These modified motifs are present in all
bacterial phenylalanyl-RSs, regardless of the optimal environmental temperature of the
organisms (Table 2).
Simple 4Cys (i.e., Cys2Cys2) Zn-finger domains are a well-characterized trait of many
ribosomal proteins (Dresios et al. 2005). The presence of superkingdom-specific
rubredoxin-like zinc fingers in the L24, L31 and S14 ribosomal proteins shown in Table 2
is consistent with the wide phylogenetic distribution of this motif. However, like the RSs
discussed above, there is no evidence of a correlation between their presence in r-proteins
and the organism’s lifestyle (Tables 2). For instance, the archaeal S14 ribosomal protein,
together with the bacterial L31 and L36 r-proteins exhibit the 4nCys signature, but the
Table 1 Metallic cofactors required for the different aminoacyl-tRNA synthetases analyzed here. Data was
derived from the KEGG, BRENDA and PDB databases
Aminoacyl tRNA synthetase Metallic Cofactor(s)
Valyl-RS Mg2+ Mn2+ Zn2+ Ca2+ Co2+
Isoleucyl-RS Mg2+ Zn2+
Leucyl-RS Mg2+ Mn2+ Ca2+ Co2+ Fe2+ Al2+ Ba2+ K+ Sn2+
Methionyl-RS Mg2+ Mn2+ Zn2+ Ca2+ Co2+
Histidyl-RS Mg2+
Phenylalanyl-RS Mg2+ Mn2+ Zn2+ Fe2+ Cd2+
Prolyl- RS Mg2+ Mn2+ Zn2+
350 M. Rivas et al.
Table 2 The optimal growth temperatures are indicated in fourth, fifth and sixth columns. The void boxes in
the E rows of the third and fourth columns are due to the absence of any known hyperthermophilic
eukaryotes. The void boxes in the prokaryotic B and A rows indicate that no 4nCys or His-containing zinc
fingers have been detected. (a) 4nCys zinc finger motifs and His-containing zinc finger-like signatures in
aminoacyl-tRNA synthetases in the genomes of Archaea (A), Bacteria (B) and Eucarya (E) discussed in this
work. The 4nCys and His-containing motifs of phenylalanyl-tRNA synthetases α and β heterodimer subunits
are also shown; (b) 4nCys and His-containing zinc finger-like boxes identified in the sequences of small (S)
and large (L) ribosomal subunit proteins. Paralog pairs for the archaeal S14, S17 (A1, A2) and L24 (A1, A2)
ribosomal proteins, and for the bacterial L31 (B1, B2) and L36 r-proteins are shown in the second column.
See text for discussion
Superkingdom Hyperthermophiles
80°C or greater
Thermophiles Between
60 and 80°C
Mesophiles
60°C or less
(a) Aminoacyl tRNA Synthetase
Valyl-RS A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 3C-H/2C-2H
Isoleucyl-RS A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4n Cys/3C-H
Leucyl-RS A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4n Cys/3C-H
Methionyl-RS A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4n Cys/3C-H
Histidyl-RS A – – –
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 3C-H/2C-2H
Phenylalanyl-RS α A – – 3C-H/2C-2H
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4H
Phenylalanyl-RS β A 2C-2H – –
B – – –
E – – 3C-H/2C-2H
Prolyl- RS A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 3C-H/2C-2H 4H 2C-2H
E – – 4n Cys/2C-2H
(b) Ribosomal Protein
S4 A1 4H 4H 4H
A2 4H C-3H/4H C-3H/4H
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4n Cys
S14 A 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B – – –
E – – –
S17 A1 4n Cys 4n Cys 4n Cys
A2 – – –
Metalloproteins and the Pyrite-based Origin of Life 351
sequence is absent in the archaeal L31 and in one of the bacterial L36 r-protein paralogs
included in our sample.
Our search for cysteine-histidine-containing variants of the 4nCys-Zn finger motifs in r-
proteins (Dresios et al. 2005) shows that with the exception of the S14, L24 and L31
ribosomal proteins, histidine-containing Zn finger-like variants are present in the S4, S17,
S18, L24, L28, L31, L33, and L36 ribosomal proteins of all genomes analyzed here. We
found no evidence of the presence of a 4Cys box or its variants in the paralogous copies of
the archaeal S17 and L24 ribosomal proteins, nor in hyperthermophilic and thermophilic
bacterial L31 paralogs (Table 2).
Discussion
Iron-sulfur clusters are highly ubiquitous prosthetic groups that play a key role in many
ancestral fundamental biochemical processes. However, analysis of sets of highly conserved
sequences that may have been part of the gene complement of the last common ancestor (Harris
et al. 2003; Delaye et al. 2005) shows that they are surprisingly rare among enzymes involved
in nucleotide metabolism, as well as among those involved in polymerization, translation,
transcription, and RNA processing and degradation. The few cases of FeS protein fold-
enzymes associated with nucleic acid synthesis and processing include (a) the (eu)bacterial
endonuclease III, which is involved in DNA repair (Cunningham et al. 1989); (b) the
Sulfolobus solfataricus DNA-dependent RNA polymerase, where the Fe-S cluster is removed
from the catalytic site and probably plays a structural role (Hirata and Murakami 2009); and
(c) the eukaryotic and archaeal DNA primase endowed with a [4Fe-4S] cluster that appears to
have a regulatory role (Weiner et al. 2007; Klinge et al. 2007). A FeS protein fold has also
been identified in Thermotoga maritima tryptophanyl-tRNA synthase, but no functional role
has been assigned to it (Han et al. 2010).
Table 2 (continued)
Superkingdom Hyperthermophiles
80°C or greater
Thermophiles Between
60 and 80°C
Mesophiles
60°C or less
B 3C-H – 2C-2H
E – – –
S18 B 3C-H 3C-H 3C-H
E – – –
L24 A1 – – –
A2 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B 4n Cys 4n Cys 4n Cys
E – – 4n Cys
L28 B – – C-3H
L31 A – – –
B1 4n Cys 4n Cys 4n Cys
B2 – – 4n Cys
L33 B – – –
L36 B1 3C-H 3C-H 3C-H
B2 – – –
352 M. Rivas et al.
Wächtershäuser (2006a) has hypothesized that protein components of the hyper-
thermophilic translation machinery exhibit 4nCys patterns whose absence in a number of
mesophilic RSs (valyl-, isoleucyl-, leucyl-, methionyl-, phenylalanyl-, histidyl, and prolyl-
aminoacyl tRNA synthetases) and ribosomal proteins (S4, S14, S17, S18, L24, L28, L31,
L33, and L36) is an outcome of the gradual adaptation of ancestral life forms from hot
volcanic environments to low temperature conditions. The structural similarities between
the rubredoxin Fe(Cys)4 active site and the Zn-containing folds of zinc-finger proteins
(Dauter et al. 1996; Meyer 2008) support the feasibility of such transitions. Cysteine-
histidine boxes in RSs are known to bind to zinc, cobalt, and other metallic cations (Miller
et al. 1991; Rees 2002). However, the 4nCys boxes and their histidine-containing variants
are equally distributed among hyper/thermophilic and mesophilic Archaea and Bacteria
(Table 2). As a whole, the results of the searches summarized in Tables 2 demonstrate that
detailed analysis of a statistically significant sample of completely sequenced cell genomes
do not support Wächtershäuser’s (2006a) proposal.
It is of course possible that during prebiotic times catalytic FeS in pyrite and other
sulfur-bearing minerals interacted with otherchemical species, including amino acids and
small peptides of abiotic origin. While this may have contributed to enhance the synthesis
of organic compounds, such chemical complexes would not have been inherited prior to the
emergence of an encoding mechanism. On the other hand, four of the central reactions
involved in protein biosynthesis, including peptide-bond formation, are catalyzed by
ribozymes, which suggest that they first evolved in an RNA world (Kumar and Yarus
2001). This implies that ribosomal proteins must have emerged after the appearance of
catalytic rRNA. Not all the ribosomal proteins are equally ancient (Fox 2010), and the
distribution of their zinc-finger sequences exhibits no correlation with their relative age nor
appears to support Wächtershäuser’s proposal (2006a, b). Of the list discussed by
Wächtershäuser (2006a) only L24, which ranks among the oldest proteins (Fox 2010), is
endowed with a zinc-finger domain (Laity et al. 2001, and Table 2). The absence of zinc-
fingers boxes in the bacterial L33 ribosomal protein, which appears to be a late addition to
the ribosome (Fox 2010), fits well with Wächtershäuser’s proposal. However, the bacterial
L36 proteins are also endowed with zinc fingers (Urlaub et al. 1995). It is unlikely that such
complex distribution reflects a non-homogenous process of Zn-finger loss along
evolutionary time, and cannot be used to support Wächtershäuser (2006a,b) proposal of
an autotrophic hot origin of life.
Conclusions
The recognition that pyrite formation can catalyze the production of molecular hydrogen,
the fixation of carbon and nitrogen, and reduce a few organic molecules supports the
possibility that Hadean hydrothermal vent systems may have served as primordial chemical
reactors where organic synthesis took place fueled by the input of redox energy of iron
sulfide minerals. Experiments using the FeS/H2S combination are also compatible with a
more general, modified model of the primitive soup in which pyrite formation is recognized
as an important source of electrons for the reduction of organic compounds, i.e., pyrite-
dependent abiotic synthesis may have contributed to the formation of the primitive soup
(Bada and Lazcano 2002, 2009).
Regardless of their unique catalytic and structural properties, protein-associated FeS
clusters do not provide by themselves phylogenetic information (cf. Zuckerkandl and
Pauling 1965). However, an evolutionary analysis of the distribution of the different types
Metalloproteins and the Pyrite-based Origin of Life 353
of transition-metal clusters, the enzymes to which they are associated, and the type of folds
that host them provides important insights on the early evolution of redox reactions.
Wächtershäuser (2006a) has argued that the sequence signatures with 4n Cys units found
in hyperthermophilic RSs and r-proteins and their absence in their mesophilic counterparts,
provide evidence of the gradual loss of strong S-metal covalent bonds as mesophily
evolved. The results presented here, which are based on a detailed analysis of statistically
significant numbers of sequences homologous to the proteins discussed by Wächtershäuser
(2006a) do not confirm such possibility. In other words, the distribution of transition-metal
bonding motifs in protein components of the translation apparatus cannot be used to argue
for an origin of life under high temperature sulfur-rich volcanic environments.
The lines of evidence supporting the possibility that ribonucleotide cofactors that
provide reducing power are vestiges of the RNA world (Jadhav and Yarus 2002) implies
that a ribozyme-dependent biosphere predated the emergence of iron-sulfur protein folds, i.
e., that the ubiquity of biological Fe/S complexes does not constitute by itself an indication
of a pyrite-dependent origin of life. The discovery of self-acylating ribozymes that produce
acetyl-CoA and butyryl-CoA as RNA-bounded products suggest that CoA-SH nucleophi-
licity and redox SH groups may have appeared in an RNAworld (Jadhav and Yarus 2002).
This is consistent with the proposal that once protein biosynthesis had evolved, natural
selection favored the incorporation of cysteine in primitive proteins because of its ability to
form RNA-recognizing zinc-fingers, to bind to Fe/S clusters and to dimerize and covalently
link to form disulfide bonds that play a key role in maintaining functional three-
dimensionally folded structures (Parker et al. 2010).
Acknowledgements We are indebted to Ricardo Hernández-Morales for help in the compilation and
analysis of ribosomal protein evolution. Support from a UC Mexus-CONACYT Fellowship to A.L. is
gratefully acknowledged. Financial support from CONACYT (Mexico) projects 102731 and 100199 to M.
R. and A.B., respectively, is acknowledged. Support to J. P. was provided by grants BFU2009-12895-CO2-
01/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and the Prometeo program from the
Generalitat Valenciana. J. L. B. is also affiliated with the Center for Chemical Evolution at the Georgia
Institute of Technology, which is jointly supported by the National Science Foundation (NSF) and the NASA
Astrobiology Program, under the NSF-CHE-1004570.
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	Portada
	Resumen
	Índice
	Introducción
	Metodología
	Resultados
	Discusión
	Conclusiones
	Referencias
	Figuras
	Anexo
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