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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA DIVERSIDAD DE BACTERIAS LÁCTICAS DEL ATOLE AGRIO DE VILLAHERMOSA TABASCO. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA ANITA VALDERRAMA MEMBRILLO MÉXICO, D.F. 2012 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO PRESIDENTE: PROFESOR: DRA. MARÍA DEL CARMEN WACHER RODARTE VOCAL: PROFESOR: QFB. ALEJANDRO CAMACHO CRUZ SECRETARIO: PROFESOR: QFB. MARTHA GÓMEZ GILES 1er. SUPLENTE: PROFESOR: BEATRIZ RUIZ VILLAFAN 2° SUPLENTE: PROFESOR: DRA. GLORIA DÍAZ RUIZ SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: LABORATORIO 324, DEPARTAMENTO DE ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA, CONJUNTO E, FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM. Dra. Ma. del Carmen Wacher Rodarte Asesor del tema Dra. Gloria Díaz Ruiz Supervisor del tema Anita Valderrama Membrillo Sustentante AGRADECIMIENTOS A la UNAM por permitirme formar parte de esta maravillosa casa de estudios. A las Dra. María del Carmen Wacher Rodarte y Dra. Gloria Díaz Ruiz por permitirme trabajar con ellas, por la confianza que depositaron en mí y por concederme la fortuna de formar parte de la gran familia del laboratorio 324. Gracias por su paciencia, apoyo y consejos. A las profesoras Judith Espinosa y Dora Centurión por su apoyo en la realización de la tesis. Gracias por su amabilidad, paciencia y atenciones que tuvieron durante mi estancia en Villahermosa, Tabasco. A la Biol. Teresa Flores por su paciencia, apoyo y consejos. A todos mis compañeros y amigos del laboratorio 324 del depto. de Alimentos y Biotecnología del Conjunto E de la Facultad de Química por su apoyo y platicas durante esos días de largo trabajo. A Karina Esquivel por tu amistad y apoyo incondicional. Al financiamiento al proyecto de Ciencia Básica CONACYT CB-2008-01 No. 101784 “Metagenómica funcional de alimentos fermentados tradicionales de maíz: Búsqueda de enzimas de interés biotecnológico y estudio de la diversidad microbiana”. DEDICATORIAS A ti niñito hermoso “NIÑOPA” por quererme, acompañarme y siempre hacerme saber que estas a mi lado. Gracias por cuidarme en los momentos difíciles que he pasado, gracias por ayudarme a culminar esta etapa tan importante y bonita de mi vida, gracias Dios. A ti abuelita Felipa, que aunque ya no estás más conmigo espero que estés muy orgullosa de mi, gracias por mandarme tus bendiciones desde el cielo. A mi mamita linda muchas gracias por todo el amor y apoyo que me has brindado, por las noches de desvelo, el esfuerzo, dedicación y la paciencia. Eres mi ejemplo de vida, sin duda la mejor madre que Dios me pudo regalar. A mi papito, gracias por todo tu esfuerzo para sacarme adelante, por el amor y la confianza que me has tenido. A mi hermano, por quererme tanto, apoyarme y regalarme palabras de aliento en momentos difíciles, siempre contaras conmigo. A mi tía Leti, por ser una buena amiga, apoyarme incondicionalmente y quererme como una hija, mil gracias. A David el amor de mi vida, gracias por acompañarme en esta etapa tan linda de mi vida, por todo el amor, la paciencia, el apoyo incondicional, y palabras de aliento que me diste. Fuiste fundamental para que yo terminara la carrera. Gracias por ser mi compañero de vida, te amo. A mis amigos que me brindaron su apoyo en los momentos malos y buenos, con los que compartí muchos días de trabajo y de felicidad. Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor, la electricidad y la energía atómica: la voluntad. Albert Einstein http://www.sabidurias.com/autor/albert-einstein/es/318 I ÍNDICE Contenido Página Índice general……………………………………………………………. I Lista de tablas………….………………………………………………... V Lista de figuras…………………………………………………………... VIII Resumen………………………………………………………………..... X 1.0. INTRODUCCIÓN…………………………………………………... 1 2.0. ANTECEDENTES………………………………………………….. 3 2.1. Alimentos fermentados………………………..…………………... 3 2.2. Alimentos fermentados tradicionales…...……………………….. 3 2.3. Alimentos fermentados tradicionales de México…..…………… 7 2.3.1. Alimentos fermentados mexicanos elaborados a base de maíz……………………………………………………………….. 9 2.4. Atoles agrios……………………………………………………….. 13 2.4.1. Atole agrio de Villahermosa, Tabasco………………………… 13 2.5. Composición química del maíz…………………………………… 14 2.6. Características generales del almidón…………………………... 16 2.6.1. Amilosa……………………………………………………………. 17 2.6.2. Amilopectina……………………………………………………… 17 2.7. Amilasas…………………………………………………………….. 17 2.8. Microbiología en los alimentos fermentados tradicionales…..... 18 2.8.1. Bacterias lácticas en los alimentos fermentados tradicionales………………………………………………………. 19 2.8.2. Bacterias lácticas amilolíticas en los alimentos fermentados tradicionales………………………………………………………. 20 2.9. Bacterias lácticas…………………………………………………... 21 II 2.9.1. Características…………………………………………………… Página 23 2.9.2. Metabolismo……………………………………………………… 26 2.10. Identificación de microorganismos……………………………… 29 2.10.1. Pruebas bioquímicas…………………………………………… 30 2.10.1.1. Galería API 50CH de BioMérieux para la identificación de bacterias lácticas…………………………………………. 30 3.0. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………… 32 4.0. HIPÓTESIS…………………………………………………………. 33 5.0. OBJETIVOS………………………………………………………… 33 6.0. METODOLOGÍA…………………………………………………… 34 6.1. Muestreo del atole agrio…………………………………………… 35 6.2. Medios de cultivo…………………………………………………… 36 6.3. Materia prima…………………………………………………......... 37 6.4. Instrumentos para la elaboración del atole agrio……………….. 37 6.5. Preparación del atole agrio de Villahermosa, Tabasco………... 38 6.5.1. Fermentación sólida…………………………………….............. 40 6.5.2. Fermentación líquida……………………………………………..41 6.5.3. Cocción del atole agrio………………………………………….. 43 6.6. Muestras: agua, maíz después de la molienda, líquido y masa de fermentación 43 6.7. Cuantificación de grupos microbianos en las materias primas y en el atole agrio…………………………………………………... 44 6.7.1. Inoculación de las muestras en los medios de cultivo MRS, MRS-A, ACP, PDA y BRVA.......................................... 44 III Página 6.7.2. Cuenta en placa de los diferentes grupos microbianos.......... 47 6.8. Medición de pH durante la fermentación………………………... 47 6.9. Aislamiento de bacterias lácticas totales y bacterias lácticas amilolíticas………………………………………………………….. 48 6.10. Purificación de bacterias lácticas y bacterias lácticas amilolíticas………………………………………………………… 48 6.11. Conservación de las cepas de las bacterias lácticas………… 49 6.12. Caracterización bioquímica de las bacterias lácticas mediante la galería API 50CH…………………………………... 49 7.0. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………… 52 7.1. Recopilación de datos de materias primas y proceso de elaboración del atole agrio……………………………………….. 52 7.1.1. Atole agrio de Villahermosa, Tabasco…...……………………. 52 7.1.2. Materia base: Maíz de dobla…………………………………… 52 7.2. Elaboración del atole agrio de Villahermosa, Tabasco………… 53 7.3. Análisis microbiológico…………………………………………….. 56 7.3.1. Cuantificación de grupos microbianos del agua de la Comunidad de Cerro Blanco……………………………………. 56 7.3.2. Cuantificación de grupos microbianos del maíz de dobla después de la molienda (masa)………………………………... 57 7.3.3. Cuantificación de grupos microbianos en la fermentación líquida del atole agrio…………………………………………… 57 7.3.4. Cuantificación de grupos microbianos en la fermentación sólida del atole agrio…………………………………………….. 59 7.3.5. Cuantificación de grupos microbianos en el atole agrio después de la cocción…………………………………………… 63 7.4. Seguimiento de pH-potenciométrico…………………………….. 64 IV Página 7.5. Aislamiento de bacterias lácticas y amilolíticas………………… 66 7.6. Conservación de las cepas de bacterias lácticas y bacterias lácticas amilolíticas……………………………………................. 69 7.7. Identificación de las cepas lácticas y amilolíticas………………. 70 8.0. CONCLUSIONES………………………………………………….. 78 9.0. PERSPECTIVAS........................................................................ 79 10.0. ANEXOS…………………………………………………………... 80 10.1. Tinción de Gram y prueba de catalasa………………………… 80 10.1.1.Fundamento de la tinción de Gram…………………………… 80 10.1.2. Técnica de la tinción de Gram………………………………… 81 10.1.3. Fundamento de la prueba de catalasa……………................ 82 10.1.4. Técnica de la prueba de catalasa…………………................ 82 10.2. Diluciones para el estudio microbiológico del atole agrio……. 83 10.3. Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas y amilolíticas aisladas y purificadas de la fermentación líquida y sólida del atole agrio. 85 10.4. Medios de cultivo…………………………………………………. 90 11.0. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………... 93 V LISTA DE TABLAS Número Título Página 2.2.1. Algunos alimentos fermentados tradicionales a base de maíz. 6 2.3.1.1. Distribución en México de algunas bebidas fermentadas de maíz. 11 2.3.1.2. Breve descripción de algunas bebidas fermentadas de México. 12 2.5.1. Composición promedio del grano de maíz. 15 2.5.2. Principales azúcares del grano de maíz. 15 2.9.1.1. Características de las bacterias lácticas. 23 2.9.1.2. Características diferenciales de bacterias lácticas. 25 6.1.1. Lugares donde se realizaron los muestreos de la materia prima y de los diferentes tiempos de fermentación. 36 6.2.1. Grupos microbianos cuantificados en el atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 37 6.12.1. Composición de la galería API 50CH BioMérieux. 50 7.3.1.1. Concentración de microorganismos del agua de manantial que abastece a la Comunidad de Cerro Blanco (UFC/ml). 56 7.3.2.1. Concentración de microorganismos del maíz recién molido (UFC/g). 57 7.3.3.1. Concentración de microorganismos en la fermentación líquida (UFC/ml), lote 1. 58 7.3.3.2. Concentración de microorganismos en la fermentación líquida (UFC/ml), lote 2. 59 7.3.4.1. Concentración de microorganismos en la fermentación sólida (UFC/g), lote 1. 60 7.3.4.2. Concentración de microorganismos en la fermentación sólida (UFC/g), lote 2. 60 VI Número Título Página 7.3.5.1. Concentración de microorganismos en el atole agrio de las fermentaciones líquida y sólida después de la cocción (UFC/ml y UFC/g respectivamente). 64 7.7.1. Perfil de fermentación de carbohidratos de las cepas de bacterias lácticas de la fermentación líquida y sólida provenientes del atole agrio mediante el sistema API 50CH de BioMérieux a las 48 horas de incubación. 71 7.7.2. Perfil de fermentación de carbohidratos de las cepas de bacterias lácticas amilolíticas de la fermentación líquida y sólida provenientes del atole agrio mediante el sistema API 50CH de BioMérieux a las 48 horas de incubación. 72 7.7.3. Identificación de bacterias lácticas que provenían de la fermentación líquida del atole agrio mediante sistema API 50CH de BioMérieux. 74 7.7.4. Identificación de bacterias lácticas que provenían de la fermentación sólida del atole agrio mediante el sistema API 50CH de BioMérieux. 74 7.7.5. Identificación de bacterias lácticas amilolíticas que provenían de la fermentación líquida del atole agrio mediante el sistema API 50CH de BioMérieux. 74 7.7.6. Identificación de bacterias lácticas amilolíticas que provenían de la fermentación sólida del atole agrio mediante sistema API 50CH de BioMérieux. 74 10.2.1. Diluciones para el estudio microbiológico de las materias primas, líquido y solido de fermentación y producto terminado. 83 10.3.1. Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas aisladas y purificadas de la fermentación líquida lote 1 del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 85 10.3.2. Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas aisladas y purificadas de la fermentación líquida lote 2 del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 86VII Número Título Página 10.3.3. Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas aisladas y purificadas de la fermentación sólida lote 1 del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 87 10.3.4. Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas aisladas y purificadas de la fermentación sólida lote 2 del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 88 10.3.5 Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas amilolíticas aisladas y purificadas de la fermentación líquida del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 89 10.3.6 Morfología macroscópica, microscópica y prueba de catalasa de las cepas de bacterias lácticas amilolíticas aisladas y purificadas de la fermentación sólida del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 89 VIII LISTA DE FIGURAS Número Título Página 2.5.1. Grano de maíz. 14 2.9.2.1. a) Fermentación homoláctica, vía Embden-Meyerhof. b) Fermentación heteroláctica, vía 6-fosfogluconato/ fosfocetolasa. 28 6.1. Diagrama de la metodología de trabajo para la caracterización bioquímica de las bacterias lácticas del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 34 6.5.1. Mazorcas de maíz para la elaboración del atole agrio. 38 6.5.2. 6.5.3. Desgranado del maíz de dobla para la preparación del atole agrio. Molienda de los granos del maíz de dobla. 39 39 6.5.1.1. Formación de bolas de masa para la fermentación sólida. 40 6.5.1.2. Fermentación sólida. Se muestran las bolas de masa en recipientes cubiertos con gasa. 41 6.5.2.1. Homogenización de la masa para la fermentación líquida. 42 6.5.2.2. Fermentación líquida. Se muestran los recipientes que se usaron para realizar la fermentación, con el sustrato. 42 6.5.3.1. Producto terminado de la fermentación sólida. 43 6.7.1.1. Homogenización de las muestras de masa para su análisis microbiológico. 45 6.7.1.2. Diagrama que muestra el proceso de cuantificación de grupos microbianos en las muestras de atole agrio (fermentación sólida y líquida). 46 6.12.1. Fermentación de carbohidratos mediante el sistema API 50CH de BioMérieux. 51 IX Número Título Página 7.1.2.1. Maíz de dobla. 53 7.2.1. Diagrama de elaboración del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 55 7.4.1. Valores de pH de las diferentes etapas de las fermentaciones sólida y líquida. 65 7.5.1. Colonias de bacterias lácticas aisladas de la fermentación líquida. 67 7.5.2. Colonias de bacterias amilolíticas aisladas de la fermentación líquida. 67 7.5.3. Frecuencia de las características morfológicas macroscópicas de las colonias aisladas de la fermentación líquida y sólida del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 68 7.5.4. Frecuencia de la morfología microscópica de las bacterias lácticas aisladas de la fermentación líquida y sólida del atole agrio de Villahermosa, Tabasco. 69 X RESUMEN El atole agrio de Villahermosa, Tabasco es una bebida tradicional mexica que no ha sido objeto de ningún tipo de investigación, así mismo tampoco se han descrito las etapas de su elaboración. La materia base para elaborar este atole agrio es el maíz, llamado localmente como maíz de dobla, debido a que el tallo de la planta es doblado a la mitad y de esta manera, al quedar unido a la planta está protegido por ella, mientras pierde humedad. De otra forma se tienen pérdidas durante el secado, ya que se separan las mazorcas y en algunas crecen microorganismos. Su proceso de elaboración, que incluye maíz de dobla que no se nixtamaliza podría influir en la microbiota del atole y podría ser diferente a la de otros productos elaborados a partir de maíz. El objetivo de este trabajo fue conocer las etapas de su elaboración, detectar las concentraciones de grupos microbianos tales como: bacterias lácticas (BAL), bacterias lácticas amilolíticas (BALA), mesófilos aerobios, mohos, levaduras y coliformes; aislar e identificar en particular las bacterias lácticas y bacterias lácticas amilolíticas. Finalmente comparar la microbiota encontrada con lo reportado en otros alimentos elaborados a partir de maíz. Para cumplir los objetivos se realizó un muestreo del atole agrio. La elaboración de la bebida se hizo de manera tradicional y se encontró que las etapas de elaboración incluyen: desgranado de las mazorcas, molienda, amasado, fermentación sólida o líquida, eliminación de la cascarilla del maíz y cocción. XI La investigación incluyó el uso de métodos tradicionales de microbiología. En el atole agrio se detectaron y cuantificaron BAL, BALA, mesófilos aerobios, coliformes y levaduras en diferentes tiempos de fermentación. Dichos grupos microbianos también han sido encontrados en otros alimentos fermentados tradicionales de México como el pozol. En ambos lotes de la fermentación líquida el conteo en placa para todos los grupos microbianos evaluados fue alto, el crecimiento fue masivo y ninguno de los grupos microbianos fue inhibido por la reducción del valor de pH (pH de inicio 6.5 y después de 6 horas disminuyó a 4.05). Al finalizar 6 horas de fermentación líquida se obtuvo una concentración microbiana (UFC/ml) del orden de >106 para BAL y mesófilos, >105 para BALA y levaduras y >104 para coliformes. No se observó la presencia de mohos. En la fermentación sólida en general todos los grupos microbianos evaluados crecieron de forma masiva, el conteo en placa fue alto desde el inicio del estudio en ambos lotes. Después de 12 horas de fermentación se obtuvo una concentración microbiana (UFC/g) del orden de >106 para BAL y mesófilos, >105 para amilolíticas y levaduras y >104 para coliformes. No se observó la presencia de mohos. El valor de pH al inicio fue de 6.38 y descendió a 4.46 después de 12 horas de fermentación. Solo la cuenta en placa de coliformes en ambos lotes disminuyó después de 24 horas a 102 UFC/g cuando el valor de pH era de 4.21. Se aislaron un total de 72 cepas de bacterias lácticas y 8 cepas de bacterias lácticas amilolíticas Gram (+) y Catalasa (-) de los diferentes tiempos de las XII fermentaciones sólida y líquida. De acuerdo a las pruebas bioquímicas API 50CH de BioMérieux se identificaron bacterias lácticas de las especies: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii y Lactococcus lactis ssp. lactis. El microorganismo Lactococcus lactis ssp. lactis se identificó en diferentes etapas de la fermentación sólida y líquida desde el inicio hasta el término de estas, de igual forma todas las cepas identificadascomo amilolíticas corresponden a Lactococcus lactis ssp. lactis por lo anterior se asume que su presencia debe ser relevante para el proceso fermentativo, sin embargo, no ha sido reportado como parte de la microbiota láctica en productos fermentados similares. La bacteria láctica Lactobacillus plantarum aislada e identificada en el atole agrio se presenta de manera frecuente en bebidas que tienen como sustrato al maíz como el ogi, mahewu y pozol. Al parecer el atole agrio tiene en común microbiota láctica con otros productos fermentados tradicionales que tienen como base al maíz, a pesar de que en el proceso de elaboración se incluye maíz de dobla que no es nixtamalizado. 1 1.0. INTRODUCCIÓN Los alimentos fermentados tradicionales son aquéllos en los cuales ocurren cambios microbiológicos/enzimáticos en los sustratos utilizados para su elaboración generándose sabores, aromas y texturas aceptables para los consumidores humanos. Se obtienen mediante fermentaciones naturales, es decir, no se añaden inóculos sino que actúan los microorganismos naturalmente presentes en el alimento y están constituidos por microbiotas complejas. Se elaboran a partir de sustratos amiláceos (maíz, sorgo, trigo, etc.) o azucarados (frutas, savia de algunas plantas) y se consumen con diversos fines, pudiendo ser nutricionales, estimulantes, medicinales y/o ceremoniales (Díaz y Wacher, 2003). En el estado de Tabasco diversos grupos indígenas y mestizos consumen una bebida regional ácida, no alcohólica preparada con una masa elaborada con maíz de dobla, no nixtamalizado y fermentado, que se conoce como atole agrio. Se le llama localmente maíz de dobla debido a que el tallo de la planta es doblado a la mitad con el fin de que el maíz pierda humedad, evitando la acción de microorganismos. El doblado del tallo se realiza alrededor de treinta días antes de cosechar. Este atole se elabora únicamente en el periodo de dobla, en los meses de mayo y septiembre. El tipo de maíz (de dobla en vez de uno maduro), sin nixtamalizar y que se puede fermentar sólido o líquido son diferencias que presenta esta bebida con respecto a otras de maíz. Estas particularidades podrían influir en el tipo de 2 microbiota, por lo que resulta interesante su estudio, en el que además es posible el aislamiento de microorganismos que pudieran usarse en algún proceso biotecnológico. Este trabajo es el primer acercamiento para conocer con mayor detalle las etapas de elaboración del atole agrio así como la microbiota involucrada en el proceso fermentativo, en particular las bacterias lácticas. 3 2.0. ANTECEDENTES 2.1. Alimentos fermentados. Los microorganismos ya estaban presentes en la tierra cuando el hombre llegó al planeta. Así, heredó los microbios, las plantas y los procesos microbianos, aunque no tuviera los conceptos de microbiología, química o fermentaciones. Es probable que la fermentación empezó a jugar un papel importante en la dieta del hombre cuando éste comenzó a recolectar alimentos y colocarlos en recipientes. El tipo de estos, a su vez, influyó en el tipo de fermentación que se desarrolló. Los alimentos fermentados son aquéllos en los cuales ocurren cambios microbiológicos/enzimáticos en los sustratos utilizados para su elaboración generándose sabores, aromas y texturas aceptables para los consumidores humanos. La leche se acidifica naturalmente produciendo leches agrias/yogurts, y si se mantiene por periodos prolongados se convierten en quesos. Los jugos de frutas se fermentan naturalmente y generan vinos, y estos a su vez, si se almacenan en condiciones anaeróbicas se fermentan naturalmente para producir vinagre (Steinkraus, 1993). El uso del mortero y pistilo fue esencial para la producción de algunos alimentos como atoles y pan, que requieren de molienda, pulverización o descascarillado. 2.2. Alimentos fermentados tradicionales. Los alimentos fermentados tradicionales se obtienen sin añadir inóculos, por lo que actúan los microorganismos naturalmente presentes en el alimento y están 4 constituidos por microbiotas complejas (Díaz y Wacher, 2003). El proceso involucra mezclas de cultivos como hongos, levaduras o bacterias. Estos alimentos son un recurso enorme de microorganismos y algunos de ellos tienen características probióticas. Estos alimentos se han preparado y consumido por cientos de años y están fuertemente asociados a culturas y tradiciones de millones de personas alrededor del mundo, especialmente en comunidades rurales (Tabla 2.2.1). Los alimentos fermentados son componentes importantes de la dieta como alimento básico, complemento de la alimentación básica, condimentos y bebidas (Wacher y Lappe, 1993). Algunas características benéficas de los alimentos fermentados incluyen (Steinkraus, 1994): a) Conservación de una gran cantidad de alimentos debido a la fermentación láctica, acética, alcohólica y/o alcalina. b) El crecimiento de microorganismos de descomposición o patógenos se inhibe y los productos se conservan. c) El valor nutritivo puede incrementarse, debido al enriquecimiento biológico del alimento con proteínas, aminoácidos esenciales, ácidos orgánicos, ácidos grasos esenciales y vitaminas. d) La digestibilidad del alimento fermentado generalmente se mejora en comparación con el sustrato del cual se parte. e) Detoxificación durante el proceso fermentativo. f) Disminución en los requerimientos energéticos y tiempos de cocción. 5 g) Enriquecimiento de la dieta a través del desarrollo de una diversidad de sabores, aromas y texturas en sustratos de alimentos. La mayoría de los alimentos fermentados se producen a nivel artesanal, mientras que un número considerable de procesos de alimentos fermentados se han escalado a nivel industrial con fines comerciales. Las fermentaciones han sido utilizadas por siglos y en muchos países para conservar y mejorar la calidad de los alimentos básicos, pero muy pocas naciones han llegado a producir versiones industriales de sus fermentaciones étnicas. Por ejemplo, en Europa las fermentaciones de los productos lácteos han evolucionado desde las recetas tradicionales hasta los procedimientos sofisticados que requieren aislamiento y propagación de cultivos microbianos especializados, llamados iniciadores los cuales han sido clasificados y mejorados usando técnicas de microbiología y de biología molecular (Hoschke et al., 1984). 6 Tabla 2.2.1. Algunos alimentos fermentados tradicionales a base de maíz. (Modificado de Nout et al., 2007) Producto País (es) y/o área (s) Sustratos Microbiota funcional Tipo de fermentación Descripción Banku Egipto Maíz o yuca LAB, Levaduras FSS, N Bola de masa Busaa Kenia, Uganda Maíz, mijo africano LAB, Levaduras SmF, N Bebida alcohólica ácida Chicha Sudamérica Maíz LAB, mohos, levaduras, bacterias acéticas SmF, N Bebida alcohólica ácida, efervescente, translúcida amarillenta Kenkey Ghana Maíz LAB, Levaduras SSF, N Bola de masa, cocida Mahewu Sudáfrica Maíz LABSmF, N Bebida no alcohólica, ácida Mawé Benin, Congo Maíz LAB, Levaduras SSF, N Masa ácida convertida en atole o molida Munkoyo Zambia, Zaire Maíz LAB, Levaduras SmF, N Bebida alcohólica dulce, ácida Ogi Nigeria, Oeste África Maíz, sorgo o mijo LAB, bacterias acéticas, mohos y levaduras SmF, N Hojuelas ácidas Poto-poto Congo Maíz LAB, Levaduras SSF, N Bolas de masa ácidas convertidas en atole u hojuelas Pozol México Nixtamal LAB, otras bacterias, mohos, levaduras SSF, N Bolas diluidas con agua para hacer un atole ácido no alcohólico LAB Bacterias ácido lácticas; FSS Fermentación semisólida; SmF Fermentación sumergida; N Fermentación Natural 7 2.3. Alimentos fermentados tradicionales de México. A pesar de que en su mayoría son poco conocidos, tienen importancia alimentaria, social y económica para los grupos étnicos que regularmente los preparan y consumen, se trata de productos locales elaborados mediante métodos de fermentación transmitidos de generación en generación hasta la actualidad. Se elaboran a partir de sustratos amiláceos (maíz, sorgo, trigo, etc.) o azucarados (frutas, savia de algunas plantas etc.) y se consumen con diversos fines, pudiendo ser nutricionales, estimulantes, medicinales y/o ceremoniales. En la actualidad de toda la variedad de bebidas y alimentos fermentados existentes en nuestro país, sólo algunos han sido objeto de investigaciones étnicas, antropológicas, sociales, microbiológicas y químicas (Herrera, 1993). Las bebidas y los alimentos fermentados han sido de gran importancia en la vida diaria y ceremonial de grupos indígenas de México desde la época prehispánica de manera que la tradición de su consumo ha continuado hasta la época actual, no solo por los grupos étnicos, pues en mayor o en menor grado, los grupos mestizos y en forma más restringida, los criollos y los de inmigración reciente aceptan esporádicamente algunos productos fermentados, por el contrario de los indígenas que llegan a consumir algunos de ellos como parte de su alimentación cotidiana (Herrera, 1993). Las bebidas y los alimentos fermentados mexicanos pueden ser clasificados de acuerdo con las materias primas que se utilizan en su preparación y con base en su composición química. En términos generales, puede hacerse una clara 8 distinción entre los productos fermentados alcohólicos y los no alcohólicos; siguiendo otro enfoque estos pueden ser divididos en dos grupos: autóctonos o indígenas y alóctonos o de origen extranjero, aunque esta clasificación no siempre está bien delimitada porque existen varias modalidades en ambos tipos, de manera que es posible considerar bebidas y alimentos fermentados distintos a los originales o de tipo mixto, especialmente elaborados por poblaciones mestizas, a menudo con características intermedias entre los tipos indígenas y los introducidos. Entre las bebidas y los alimentos alcohólicos autóctonos de México los siguientes son algunos de los más apreciados: pulque, tepache, colonche, tesgüino y balché; por otra parte, entre los no alcohólicos de origen prehispánico, el pozol es el más importante (Herrera, 1993). En México se elaboran actualmente o se preparaban en épocas pasadas, mediante procesos de fermentación, numerosos alimentos bebidas, tanto autóctonos como alóctonos, aunque solo algunos como los mencionados anteriormente han llegado a alcanzar una gran aceptación en zonas amplias del país, pues muchos de estos están restringidos a pequeñas extensiones territoriales en relación a factores ecológicos y a las predilecciones de determinados grupos étnicos por ciertos alimentos, cuyo consumo se vuelve rutinario y llega a ser tradicional. 9 2.3.1. Alimentos fermentados mexicanos elaborados a base de maíz. Mesoamérica es una de las principales regiones para el desarrollo histórico de la agricultura mundial. Entre las diversas plantas domesticadas en esa región, se destaca al maíz, que ha formado parte sustancial de la dieta local desde hace varios milenios. La tecnología indígena del maíz ha evolucionado de un estilo artesanal hasta una industria moderna que usa las recetas antiguas pero con procedimientos mecanizados y de esta manera ha logrado preservar sus ventajas de gran valor nutritivo. De primordial importancia es el uso de la llamada técnica de elaborar el “nixtamal” o masa cocida de maíz, cuya etimología náhuatl (nixte = ceniza, tamalli = masa cocida) denota su antigüedad y origen. Esta tecnología conservó el cocimiento alcalino que ha sido encontrado muy ventajoso porque texturiza la masa, aumenta la concentración de calcio, aumenta la digestibilidad, mejora el balance isoleucina/leucina, libera parte de la niacina que no está biodisponible inicialmente en el grano y promueve una mejor asimilación de las vitaminas (Viniegra, 1993). A pesar de estas ventajas de la tecnología del nixtamal, es muy sabido que la proteína del maíz es deficiente en lisina y triptófano pero afortunadamente se puede complementar con la proteína de los frijoles comunes. Pero, otra alternativa tradicional para mejorar la calidad de la proteína del maíz, es la fermentación láctica, ya que puede transformar parte de la proteína vegetal en biomasa microbiana con alto contenido de lisina y triptófano (Erdman et al., 1977). 10 Otras fermentaciones indígenas del maíz, alcohólicas y no alcohólicas, han sido examinadas por Cruz-Ulloa y Ulloa (1973) su distribución aproximada en México se muestra en la Tabla 2.3.1.1. Estos autores han indicado que 24 grupos étnicos tienen sus propios procesos de fermentación y cerca de la mitad de los procesos son no alcohólicos (probablemente lácticos). La recopilación del Museo Nacional de las culturas Populares (1982) indica la preservación de una gran variedad de fermentaciones indígenas del maíz, a pesar de la fuerte competencia de las bebidas industrializadas de origen extranjero. Se incluyen en la lista productos con nombres tales como chicha, chilote, elisquiate, mejengue, piznate, pozol, te rico y tesgüino, se indica brevemente sus recetas tradicionales (Tabla 2.3.1.2). Por lo tanto, a pesar de la fuerte competencia industrial, las fermentaciones indígenas del maíz aún ofrecen la posibilidad de ser rescatadas y convertirse en alternativas novedosas para la dieta mexicana, en espera de ser redescubiertas y reinventadas para usos modernos en la dieta de la población urbana (Viniegra, 1993). 11 Tabla 2.3.1.1 Distribución en México de algunas bebidas fermentadas de maíz* A. BEBIDAS ALCOHÓLICAS NOMBRE ESTADOS GRUPOS ETNICOS Sendenchó México, Michoacán Mazahuas Tepache Sonora, Oaxaca Pápagos, Triques, Mixtecos, Amuzgos, Chinantecos Tesgüino Oaxaca, Sonora, Chihuahua, Nayarit, Jalisco, Durango Zapotecos, Pimas, Yaquis, Tarahumaras, Tepehuanos, Huicholes. *Datos compilados por Cruz-Ulloa (1973). B. BEBIDAS NO-ALCOHÓLICAS NOMBRE ESTADOS GRUPOS ETNICOS Agua agria San Luis Potosí, Veracruz, Hidalgo, Puebla, D.F. Nahuas Atole Guanajuato Chichimeca-jonaz Atole agrio Oaxaca Mazatecos Pozol Chiapas, Yucatán,Tabasco Zoques, Lacandones, Mayas, Tzotziles, Tojolabales, Chontales 12 Tabla 2.3.1.2 Breve descripción de algunas bebidas fermentadas de México* *Datos compilados por el Museo de Culturas Populares (1982). NOMBRE DESCRIPCIÓN Chicha Los granos se cuecen y fermentan. Se puede añadir azúcar de caña Chilote Los granos de maíz se muelen con miel y azúcar de caña. La mezcla se cuece y se fermenta. Elisquiate Los granos de maíz se remojan, muelen y se mezclan con panela y chile. Mejenge El grano se mezcla con hojas de maíz, panela, agua y pulque. La fermentación dura 3 días. Se añaden rebanadas de plátano y piñas con canela. Se permite otro día de fermentación Piznate El maíz se tuesta, muele y se mezcla con agua, piloncillo y canela. Se consume después de 2 o 3 días de fermentación. Pozol Los granos remojados se hierven con cal hasta que se desprenden la cutícula y se ablandan. Se muelen y la masa se deja fermentar para después diluirse con agua y mezclarse con azúcar y especias (vainilla, canela, etc.) Te rico Se muelen las tortillas tostadas y se mezclan con agua, azúcar o miel, canela u hojas de limón. Tesgüino Los granos se germinan por 9 días. La malta se muele y se hierven por 10 horas. Se consume después de fermentarse con azúcar 13 2.4. Atoles agrios. Los atoles se preparan con masa o maíz agriado y representan uno de los tantos productos que se elaboran con masa de maíz con o sin el proceso de nixtamalización. En sus diversas modalidades son muy apreciados en algunas partes del centro y sur de México (Herrera, 1993). Uno de los atoles agrios mexicanos que ha sido objeto de estudio es el Axocotl, consumido por los náhuatls del municipio de Cuetzalan, Puebla. Se trata de una bebida agria no embriagante de color verdoso, preparada con maíz hecho masa y nixtamalizado, fermentado de 3-4 días. El Axocotl es de color verdoso debido a que el fermentado de maíz se mezcla con una hierba conocida como “la hierba del axocot” la cual le da un sabor dulce al preparado (Guadarrama, 2007) 2.4.1. Atole agrio de Villahermosa, Tabasco. En el estado de Tabasco diversos grupos indígenas y mestizos consumen una bebida regional ácida, no alcohólica preparada con masa de maíz de dobla, no nixtamalizado y fermentado, que se conoce como atole agrio. La materia base para elaborar este atole es el maíz, llamado localmente como maíz de dobla. El atole agrio se elabora únicamente en el periodo de dobla, en los meses de mayo y septiembre. Este atole se puede adicionar de azúcar. Tradicionalmente, es consumido por mujeres que acaban de dar a luz y se encuentran en el periodo de lactancia, ya que se cree que este aumenta la cantidad de leche que se produce, así mismo los habitantes de la comunidad le atribuyen una mejora a la salud cuando se padece de diarrea. También es 14 preparado para la celebración del día de Muertos para colocarlo en las ofrendas dedicadas a los difuntos que disfrutaban de esta bebida. 2.5. Composición química del maíz. El maíz es una de las plantas más útiles al hombre. Una de las principales características es su gran adaptación en suelos y climas muy diversos. La composición química es variable y está relacionada con: estadio, raza, variedad, tecnología de cultivo y clima (Reyes, 1990). El grano de maiz (Figura 2.5.1.) está constituido por: pericarpio, aleurona, endospermo, escutelo, embrión o germen y capa terminal. El endospermo conforma el 82% del grano; el pericarpio el 6% y el germen el 12%. Figura 2.5.1. Grano de maíz (Reyes, 1990). La composición química promedio de la materia seca del grano entero, se presenta en la Tabla 2.5.1. Endospermo Pericarpio Germen Capa terminal Escutelo Aleurona 15 Tabla 2.5.1. Composición promedio del grano de maíz (Reyes, 1990). Componente Por ciento Almidón 72.40 Grasa (aceite) 4.70 Proteína 9.60 Cenizas 1.43 Azúcares 1.94 Fibra 9.93 Durante el desarrollo del grano de maiz se sintetizan los polímeros estructurales y de almacenamiento así como una variedad de carbohidratos simples (Tabla 2.5.2.). Los carbohidratos del maíz están distribuidos entre muchos tejidos del grano. El mayor carbohidrato constituyente de todo el grano es el almidón con un 72% de peso seco, mientras que los carbohidratos sencillos como D-fructosa y D- glucosa generalmente se encuentran en niveles bajos. La sacarosa es el disacárido que se encuentra en mayor concentración en el grano de maíz, seguido por niveles bajos de maltosa. Algunos trisacáridos y oligosacáridos son constituyentes menores del grano de maiz; se han reportado niveles bajos del trisacárido rafinosa. El sorbitol se encuentra en algunas variedades de maíz dulce (Boyer y Shannon, 1987). Tabla 2.5.2. Principales azúcares del grano de maíz (Boyer y Shannon, 1987). Monosacáridos Glucosa Fructosa Disacáridos y trisacáridos Sacarosa Maltosa Rafinosa Maltotriosa Azúcares-alcohol Sorbitol myo-inositol Fitato Carbohidratos complejos Almidón Hemicelulosa Celulosa Lignina 16 Muchos polisacáridos tienen un papel importante en la estructura de los granos de maíz. Estos se pueden clasificar como sustancias pécticas, hemicelulosas y celulosas. Se ha encontrado que el pericarpio de maíz está compuesto de 70% de hemicelulosa, 23% de celulosa y 0.1% de lignina con base a peso seco. Las fibras de celulosa son la unidad estructural básica de la pared celular y están asociadas con otros polisacáridos de la pared celular primaria y secundaria; estos polímeros contienen varios azúcares, incluyendo glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ramnosa y manosa (Boyer y Shannon, 1987). 2.6. Características generales del almidón. El almidón se encuentra en los granos de los cereales en forma de gránulos y está ampliamente distribuido en los más diversos órganos de las plantas como carbohidratos de reserva que se produce a través de la fotosíntesis en las plantas. Es un componente importante de diversos alimentos y la fuente más importante de carbohidratos de la alimentación humana. Las fuentes más importantes de almidón son los cereales (40 a 90% de su peso seco) y tubérculos (65 a 85%). El almidón es una mezcla de dos glucanos, amilosa y amilopectina. En términos generales, los almidones contienen aproximadamente 17-27 % de amilosa y el resto es amilopectina. Los gránulos de almidón son insolubles en agua fría debido a que su estructura está altamente organizada y a que presentan estabilidad debido a las múltiples interacciones que existen con sus dos moléculas constituyentes amilosa y amilopectina (Badui, 2006; Dendy y Bogdan, 2001 y Hoseney, 1991). 17 2.6.1. Amilosa. La amilosa es una larga cadena lineal formada por monómeros de glucosa unidos entre sí por enlaces glucosídicos α-1,4. Tienen la facilidad de adquirir una conformación tridimensional helicoidal, en la que cada vuelta de hélice consta de seis moléculas de glucosa; capaces de incluir a otras moléculas como ácidos grasos, así mismo estafracción es la responsable de la coloración azul que presenta el almidón con el yodo ya que la molécula hidratada atrapa a las moléculas de yodo. Generalmente insolubles o poco solubles en agua y sólo se solubilizan mediante el uso de condiciones más o menos drásticas, por ejemplo con altas temperaturas o por ruptura de los puentes de hidrógeno con reactivos adecuados como bases fuertes (Badui, 2006; Dendy y Bogdan, 2001). 2.6.2. Amilopectina. Por otra parte la amilopectina es la parte ramificada del almidón, formada por monómeros de glucosa unidos por enlaces glusídicos α-1,4 en las partes lineales y α-1,6 en las partes ramificadas. Como promedio existe una ramificación cada 15- 30 restos de glucosa. Presenta color café frente a una solución de yodo (Badui, 2006; Dendy y Bogdan, 2001). 2.7. Amilasas. Las enzimas capaces de hidrolizar las uniones α-glucosidicas del almidón se denominan enzimas amilolíticas o α-glucanasas y son producidas por animales, plantas y microorganismos. Diversas enzimas amilolíticas hidrolizan el almidón o sus productos de degradación. Las acciones de estas enzimas pueden dividirse en 18 dos categorías. Las endoamilasas, que rompen uniones al azar en el interior de la molécula de almidón y las exoenzimas, que hidrolizan a partir del extremo no reductor, produciendo productos pequeños. Se puede distinguir otra división de las amilasas, de acuerdo con los enlaces que las enzimas son capaces de degradar, por ejemplo, las enzimas desramificantes pueden hidrolizar uniones α-1,6. La α- amilasa es una endoenzima que hidroliza enlaces internos α-1,4 y que puede saltarse las uniones-1,6. La β-amilasa es una exoenzima que libera maltosa hidrolizando uniones-1,4 a partir del extremo no reductor, no puede saltarse los enlaces-1,6 por lo que siempre habrá dextrinas. La glucoamilasa produce glucosa y puede degradar tanto enlaces 1,4 como 1,6 (Vihinen y Mäntsälä, 1989). Una variedad de levaduras, hongos y bacterias son capaces de degradar al almidón por la formación de enzimas extracelulares amilolíticas (Antranikian, 1990). 2.8. Microbiología en los alimentos fermentados tradicionales. La microbiología de muchos de estos productos es complicada y no conocida. En la mayoría de estos productos la fermentación es natural e involucra cultivos mixtos de levaduras, bacterias y hongos. Algunos microorganismos pueden participar paralelamente, mientras otros actúan secuencialmente cambiando la microbiota dominante durante el transcurso de la fermentación. Las especies de bacterias más comunes de la fermentación son Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Micrococcus y Bacillus. Entre los hongos se encuentran: Aspergillus, Paecilomyces, Cladosporium, Fusarium, Penicillium y 19 Trichothecium; las levaduras más comunes son las especies del género Saccharomyces. (Blandino et al., 2003). 2.8.1. Bacterias lácticas en los alimentos fermentados tradicionales. En México una de las bebidas fermentadas tradicionales que más se ha estudiado es el pozol, es una bebida ácida no alcohólica, resultante de la fermentación de la masa de maíz nixtamalizado (Ulloa et al., 1987). Estudios realizados (Wacher et al., 2000) demuestran que el pozol cuenta con una microbiota compleja conformada por hongos, levaduras y bacterias de diferentes tipos, siendo las bacterias lácticas las más abundantes durante la fermentación de la masa de maíz. Mediante técnicas tradicionales de microbiología se identificaron a bacterias lácticas de los géneros Leuconostoc sp., Lactobacillus sp., Pediococcus sp. y Lactococcus sp. Posteriormente haciendo usos de técnicas moleculares como la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE) Ampe et al., 1999 se corroboró que las bacterias lácticas constituyen la microbiota predominante en el pozol, ya que representaron del 90 al 97% de la microbiota activa de la masa de maíz fermentada, así mismo se encontró que los miembros del género Streptococcus representaron del 25 al 50% de la microbiota y que Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum, junto con los miembros de los géneros Leuconostoc y Weissella, fueron los organismos dominantes durante la fermentación. Los estudios realizados por Ampe y Miambi (2000), en las comunidades bacterianas de los alimentos fermentados de maíz (pozol, poto poto y ogi) de 20 México, Congo y Benin mediante el uso de la técnica de DGGE mostraron que, el pozol tiene una mayor diversidad microbiana. En los tres alimentos fermentados de maíz encontraron la presencia de especies de bacterias lácticas tales como Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii y Lactobacillus fermentum. La omnipresencia de estas bacterias sugirió que se trata de especies importantes en la fermentación del maíz. La distribución de cepas de Lactobacillus plantarum en los alimentos vegetales fermentados ha sido bien documentada (Daeschel et al., 1987). Por el contrario, el papel ecológico de Lactobacillus fermentum y Lactobacillus delbrueckii en la fermentación de material vegetal no se conoce. Sus resultados sugirieron que estas especies están muy extendidas entre las fermentaciones tradicionales del maíz en los países tropicales. En el atole agrio Axocotl de Cuetzalan, Puebla (bebida agria no alcohólica, hecha de masa de maíz nixtamalizado, adicionada de una hierba dulce) se realizó un estudio microbiológico mediante el análisis de la restricción del ADN ribosomal amplificado (ARDRA) y se encontraron Lactobacillus paracasei, Pediococcus damnosus y Lactobacillus plantarum (Guadarrama, 2007). 2.8.2. Bacterias lácticas amilolíticas en alimentos fermentados tradicionales. Se han aislado diversas bacterias ácido lácticas amilolíticas (BALA) de diferentes alimentos fermentados tropicales elaborados con materias amiláceas, principalmente de yuca y cereales (por ejemplo, maíz y sorgo). Cepas de Lactobacillus plantarum han sido aisladas de productos a base de yuca fermentada en África (Nwankwo et al., 1989). 21 Cepas amilolíticas de Lactobacillus fermentum se aislaron por primera vez en Benín, de una masa fermentada de maíz (ogi y mawe) por Agati et al. (1998). Sanni et al., (2002) describió cepas amilolíticas de L. plantarum y L. fermentum en varios alimentos amiláceos fermentados tradicionales de Nigeria. La forma en que la materia prima es procesada puede determinar la composición de la microbiota y, en particular, la aparición de las bacterias lácticas amilolíticas (Guyot et al., 2000). Debido a la capacidad de sus α-amilasas de hidrolizar parcialmente el almidón crudo (Rodríguez-Sanoja et al., 2000), BALA pueden fermentar diferentes tipos de material amiláceo, como el maíz (Nakamura, 1981), papa (Chatterjee et al., 1997), o la yuca (Giraud et al., 1991) entre otros. Estudios realizados por Díaz et al., 2003 determinaron que Streptococcus bovis (actualmente Streptococcus infantarius subsp. infantarius) es la especie dominante entre las cepas de bacterias lácticas amilolíticas aisladas del pozol. 2.9. Bacterias lácticas. El concepto bacterias acido lácticas (BAL) como un grupo de organismos se desarrollo a inicios del año 1900, precedida por científicos pioneros y la evolución técnica durante la última parte del siglo XIX. Las interacciones de las BAL en los alimentos llamaron la atención de los científicosy dio lugar a la contribución significativa de Pasteur sobre la fermentación ácido-láctica en 1857, quién estudió los procesos fermentativos y demostró que se deben a la presencia de microorganismos. Seguido del primer aislamiento de un cultivo bacteriano puro, Bacterium Iactis, por Lister en 1873 (Stiles y Holzapfel, 1997). BAL son típicas en 22 un gran número de fermentaciones espontáneas en los alimentos, pero también están estrechamente asociadas con el ser humano y el ambiente (Stiles y Holzapfel, 1997). Como resultado de su extremada especialización fisiológica, las bacterias lácticas están confinadas a unos cuantos ambientes naturales característicos. Algunas viven en asociación con plantas y crecen a expensas de los nutrientes liberados tras la muerte y descomposición de los tejidos vegetales. Se encuentran en alimentos y bebidas preparadas a partir de materiales vegetales: encurtidos, col ácida, pienso ensilado, vino y cerveza (Stanier, 1992). Otras bacterias lácticas constituyen parte de la microbiota normal del cuerpo de un animal y se encuentran en un número considerable en la nasofaringe, el tracto intestinal y la vagina de mamíferos (Stanier et al., 1992). Las primeras definiciones de bacterias ácido lácticas como grupo se basaron en la capacidad para fermentar y coagular la leche incluidas las bacterias coliformes. La descripción de Lactobacillus por Beijerinck en 1901 como bacterias Gram-positivas separó a los coliformes de las BAL. De acuerdo con Orla-Jensen en 1919 “las bacterias verdaderas ácido lácticas” forman un grupo natural de bacterias Gram- positivas, inmóviles, no formadoras de esporas, con forma de cocos, y que fermentan hidratos de carbono y alcoholes superiores para formar ácido láctico principalmente (Stiles y Holzaptel, 1997). Las bacterias lácticas son un grupo de microorganismos que comparten características fisiológicas, metabólicas y morfológicas. Históricamente los géneros Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y Streptococcus forman el centro del grupo; aunque también se sugieren como bacterias lácticas: 23 Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dolosigranulum, Enterococcus, Globicatella, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Stiles y Holzaptel, 1997). Las BAL forman un grupo diverso de microorganismos, las de importancia en los alimentos pertenecen a los géneros: Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weissella (Stiles y Holzapfel, 1997). 2.9.1. Características. En general las bacterias lácticas cuentan con las características que se muestran en la tabla 2.9.1.1 Tabla 2.9.1.1. Características de las bacterias lácticas (Carr et al., 2002). La clasificación en diversos géneros de bacterias lácticas, se basa en gran medida en la morfología, el tipo de fermentación de la glucosa, el crecimiento a diversas Gram-positivas Aerobias facultativas o anaerobias No esporuladas Morfología de cocos o de bacilos Oxidasa, catalasa y bencidina negativo debido a la falta de citocromos y porfirinas No reducen nitratos a nitritos No utilizan como sustrato el lactato Formación de isómeros D, L y DL del ácido láctico 24 temperaturas, la configuración del ácido láctico producido, la capacidad para crecer a altas concentraciones de sal y la tolerancia a la acidez o alcalinidad como se muestra en la tabla 2.9.1.2 (Carr et al., 2002). En cuanto a los nutrientes para su crecimiento, requieren de una fuente de carbono para extraer la energía necesaria para su metabolismo (hidratos de carbono tales como, azúcares y almidón), así como el nitrógeno, el fósforo y el azufre, los cuales se incorporan a las moléculas estructurales de la célula. Los medios de cultivo para estas bacterias generalmente deben contener nitrógeno bajo la forma de nitrógeno proteico (extracto de levadura) los otros dos elementos importantes se incluyen como sales de fosfato y sulfato respectivamente, y una serie de micronutrientes (vitaminas, hierro cobalto, cobre, zinc, etc.) (Mönckeberg, 1988). Aun creciendo en medios muy ricos, las colonias de las bacterias del ácido láctico siempre son relativamente pequeñas de 2-3 mm, casi nunca están pigmentadas; como resultado de la ausencia de citocromos la colonia tiene un aspecto blanco color yeso, muy característico. El tamaño pequeño de las colonias es atribuible, en primer lugar a los bajos rendimientos del crecimiento, consecuencia de su metabolismo exclusivamente fermentativo (Stainer et al., 1992). El crecimiento y las características morfológicas se basan en las propiedades de crecimiento en un medio sólido o líquido (color, textura y forma de las colonias) o al ser teñidas mediante tinción de Gram. Las BAL pueden crecer a temperaturas de 5 a 45°C, la mayoría de las cepas son capaces de crecer a un pH de 4.4. El crecimiento es óptimo de 5.5-6.5 (Gopal et al., 2008). 25 Tabla 2.9.1.2. Características diferenciales de bacterias ácido lácticas (Carr et al., 2002). CARACTERISTICAS BACILOS COCOS Carnobac- terium Lactoba- cillus Enterococ- cus Lactococ-cus Vagococ-cus Leuconostoc Oenococcus Pediococ- cus Strepto- coccus Tetragen- ococcus Weissella Fermentación Homo Homo Homo Homo Hetero Homo Homo Homo Hetero Crecimiento a 10°C + ± + + + ± - + + Crecimiento a 45°C - ± + - - ± ± - - Crecimiento a 6.5% NaCl NDa ± + - ± ± - + ± Crecimiento a 18% NaCl - - - - - - - + - Crecimiento a pH 4.4 ND ± + ± ± + - - ± Crecimiento a pH 9.6 - - + - - - - + - Acido lácticob L D, L, DLc L L D L, DLc L L D, DLc Formación de tétradas - - - - - + - + - + = positiva; - = negativa; ± = varía entre especies; a = no determinado; b = configuración del ácido láctico producido por la glucosa; c = Producción de ácido láctico varía entre especies. 26 2.9.2. Metabolismo. Hacia 1920, Orla-Jensen señaló que las bacterias lácticas podían dividirse en dos subgrupos bioquímicos, que se distinguen por los productos formados a partir de la glucosa. Las BAL que llevan a cabo una fermentación homoláctica (homofermentadoras) obtienen como producto principal ácido láctico a partir de la fermentación de la glucosa, vía Embden–Meyerhof. Estas bacterias poseen la enzima aldosa y por ello son capaces de fermentar la glucosa de manera más directa al ácido láctico (Figura 2.9.2.1.). Por otro lado las BAL que realizan una fermentación heteroláctica (heterofermentadoras) no sólo producen ácido láctico sino también, dióxido de carbono, etanol y ácido acético, vía 6-fosfogluconato/fosfocetolasa. Las BAL heterofermentadoras carecen de la enzima aldosa por lo que efectúan una conversión a la molécula de glucosa (6 carbonos) a una pentosa (5 carbonos) (Figura 2.9.2.1.) (Stanier et al., 1992 y Carr et al., 2002). La característica esencial del metabolismo de las BAL es la fermentación eficiente de carbohidratos acoplada a la fosforilación a nivel sustrato debido a la carencia de compuestos porfirínicos (porfirinasy citocromos). El ATP generado es subsecuentemente utilizado para propósitos biosintéticos. Las bacterias ácido lácticas son un grupo que presentan una enorme capacidad de degradar diferentes carbohidratos y compuestos relacionados, produciendo energía solo por la fermentación de azúcares (Axelsson, 1994). 27 Las BAL homofermentadoras producen más del 85% de ácido láctico. Se fermenta 1 mol de glucosa a 2 moles de ácido láctico, lo que genera un rendimiento neto de 2 moles de ATP por molécula de glucosa metabolizada. Mientras que las BAL heterofermentadoras generan solo el 50% de ácido láctico. Estas fermentan 1 mol de glucosa a 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2. Un mol de ATP se genera por un mol de glucosa, resultando en un menor rendimiento por mol de glucosa metabolizada (Gopal et al., 2007). Las bacterias lácticas también se han caracterizado por su capacidad de formar isómeros de ácido láctico a partir de la fermentación de la glucosa, el dextrógiro (D), el levógiro (L) y una mezcla racémica (DL) (Gopal et al., 2007). La capacidad de las bacterias lácticas para producir y tolerar una concentración relativamente elevada de ácido láctico tiene un gran valor selectivo, ya que les permite eliminar la competencia de la mayoría de las otras bacterias en ambientes que son ricos en nutrientes. Dentro de las BAL homofermentadoras se incluyen especies de Streptococcus y Pediococcus. Las BAL heterofermentadoras están conformadas por especies de Lactobacillus y Leuconostoc (Carr et al., 2002). 28 Figura 2.9.2.1 a) Fermentación homoláctica, vía Embden-Meyerhof. b) Fermentación heteroláctica, vía 6-fosfogluconato/fosfocetolasa. (Stainer et al., 1992) a) b) 29 2.10. Identificación de microorganismos. Los alimentos fermentados contienen generalmente microbiotas complejas, que son difíciles de describir y de estudiar experimentalmente. Una alternativa para la determinación de la estructura microbiana de estos alimentos es aislar microorganismos y tipificarlos; otra es utilizar métodos que no dependan del cultivo, en los que se extraen ácidos nucleicos directamente del alimento (Díaz y Wacher, 2003). El estudio de las comunidades microbianas durante mucho tiempo estuvo basado en el uso de técnicas microbiológicas tradicionales, sin embargo, en años recientes se ha descrito que resultan insuficientes para dicho estudio ya que se ha determinado que más del 90% de los microorganismos de los ambientes naturales no pueden ser cultivados usando estas metodologías (Amann y Kühl, 1998), sin embargo, siguen estando vigentes y se recomienda incluirlas en los métodos de identificación de microorganismos. Durante el último siglo se ha dependido del aislamiento y cultivo de los microorganismos para su identificación. Estos han sido caracterizados tradicionalmente por su fenotipo, el conjunto de propiedades celulares observables, como su morfología, propiedades fisiológicas y por la estructura de sus componentes celulares, entre otros. Para la caracterización de las bacterias ácido lácticas se emplean reacciones bioquímicas tradicionales, fermentación de carbohidratos y pruebas de inhibición (temperatura, pH y sal) (Salminen y Von Wright, 1993) 30 2.10.1. Pruebas bioquímicas. Las pruebas bioquímicas se basan en la actividad metabólica de los organismos. Sistemas de huella digital fenotípica miniaturizados y automatizados han sido introducidos reemplazando a los clásicos análisis fenotípicos, ya que dan resultados reproducibles obtenidos en condiciones estandarizadas, están basados en caracteres nutricionales y bioquímicos de los microorganismos. El procedimiento de estos sistemas incluye la comparación de un gran número de propiedades fenotípicas de un organismo con las mismas de otros considerados como referencia y el grado de similitud respecto a las cepas tipo es calculado con programas de cómputo. Los sistemas API (BioMérieux), Enterotube II y Oxi-Ferm Tube (Becton Dickinson Microbiological Systems), Sistema Pasco (Difco Laboratories), Sistema biolog (Biolog, Inc.,) entre otros, son ejemplos de sistemas comercialmente validos de identificación miniaturizados. Estos sistemas son fáciles de llevar a cabo y los resultados son obtenidos en corto tiempo, son prácticos en la identificación de cepas bacterianas dentro de un contexto quimiotaxonómico y molecular (Busse et al., 1996) 2.10.1.1. Galería API 50CH para la identificación de bacterias lácticas. La galería API 50CH de BioMérieux es un sistema estandarizado que está compuesto por 49 pozos y un control, cada uno con una cantidad definida de sustrato deshidratado, que permite observar la fermentación de los sustratos que incluye la galería, los cuales pertenecen a la familia de los hidratos de carbono y derivados (heterósidos, polialcoholes, ácidos urónicos) y se consideran como 31 ensayos bioquímicos. Se adiciona una suspensión bacteriana y se rehidratan los sustratos de ensayo de fermentación, cuando ésta se lleva a cabo, se produce un cambio de color en el pozo, debido al catabolismo de los suatratos, dando lugar a la producción de ácido en anaerobiosis revelada por el indicador de pH púrpura de bromocresol. El sistema API 50CH miniaturizado es un método rápido, sencillo y fiable que permite la identificación de microorganismos fermentadores de carbohidratros como las bacterias lácticas. Esta galería es la de mayor espectro de aplicación, pues identifica especies de los géneros más comunes de BAL tales como: Aerococcus, Carnobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus y Weissella (Manual API 50CH de BioMérieux). 32 3.0. JUSTIFICACIÓN. México cuenta con una gran variedad de alimentos fermentados tradicionales, sin embargo, sólo algunos han sido objeto de investigaciones étnicas, antropológicas, sociales, microbiológicas y químicas. Estos alimentos tienen importancia alimentaria entre los grupos étnicos y en mayor o en menor grado por algunos grupos mestizos que regularmente los preparan y consumen. Los productos son elaborados mediante métodos de fermentación transmitidos de generación en generación hasta la actualidad, es entonces importante el estudio de estos productos porque forman parte de nuestra cultura así como para preservarlos o expandir el mercado de productos fermentados de bajo costo y desarrollar nuevos productos pues hoy en día se prefieren los productos naturales. Es importante conocer a detalle las materias primas, el proceso de elaboración y los microorganismos involucrados en el proceso fermentativo, así como investigar los beneficios a la salud que se les atribuyen. El atole agrio, es una bebida fermentada tradicional de México que no ha sido estudiada, no se han descrito las materias primas, las etapas de elaboración ni el procesos fermentativo. Su método de elaboración, que es diferente al de la mayoría de los alimentos fermentados de maíz que se han reportado,podría contener una microbiota diferente debido a la ausencia de la nixtamalización del maíz. Es importante entonces estudiar la diversidad de su microbiota, para comprender el efecto del procesamiento del maíz en el establecimiento de bacterias lácticas y por otra parte para desarrollar en un futuro un cultivo iniciador para su producción en condiciones controladas con calidad constante e inocuidad. 33 4.0. HIPÓTESIS. La diversidad de bacterias lácticas del atole agrio de Villahermosa, Tabasco será diferente a la de otros alimentos fermentados elaborados a partir de maíz debido a que su proceso de elaboración incluye maíz de dobla que no se nixtamaliza. 5.0. OBJETIVOS. Conocer la microbiota láctica del atole agrio de Villahermosa, Tabasco y describir el proceso de su elaboración. Objetivos particulares: Describir con detalle las etapas de elaboración del atole. Detectar en cada una de las etapas anteriores las concentraciones de grupos microbianos que pudieran desarrollarse: bacterias lácticas, bacterias lácticas amilolíticas, mesófilos aerobios, mohos, levaduras y coliformes. Aislar e identificar bacterias lácticas y bacterias lácticas amilolíticas. Comparar la microbiota encontrada con la reportada para otros productos elaborados a partir de maíz. 34 6.0. METODOLOGÍA. Figura 6.1. Diagrama de la metodología de trabajo para la caracterización bioquímica de las bacterias lácticas del atole agrio de Villahermosa Tabasco. Estudio de campo en la Comunidad Cerro Blanco Quinta Sección Tacotalpa, Tabasco. Recopilación de datos de la materia prima y del proceso de elaboración del atole agrio. Estudio de las fermentaciones sólida y líquida. Cuantificación de los grupos microbianos: bacterias lácticas, amilolíticas, mesofilos, coliformes hongos y levadura Estudio de pH potenciométricamente Aislamiento de bacterias lácticas y amilolíticas Purificación Se conservan en glicerol/-66°C las cepas Gram (+) y catalasa (-) Caracterización bioquímica mediante la galería API 50CH Tinción de Gram y prueba de catalasa 35 6.1. Muestreo del atole agrio. El muestreo del atole agrio se realizó en Septiembre de 2010 en la comunidad Cerro Blanco Quinta Sección Tacotalpa, Tabasco. La comunidad se encuentra ubicada aproximadamente a dos horas de la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco (UJAT), por ello fue necesario trasladar a la comunidad el equipo necesario (micropipetas, balanza analítica (OHAUS Adventurer) y material estéril como: guantes, puntas, bolsas y recipientes de plástico) para muestrear la materia prima así como los primeros tiempos fermentación sólida y líquida de la manera más asépticamente posible. Posteriormente el seguimiento de las fermentaciones y el procesamiento de las muestras se realizó en la universidad, en la tabla 6.1.1 se indica el lugar en donde se muestreo la materia prima así como los diferentes tiempos de las fermentaciones. En la UJAT las muestras se procesaron inmediatamente y se trabajó en condiciones de asepsia en campanas de flujo laminar (Veco). El muestreo de las fermentaciones se efectuó de la siguiente manera: Fermentación líquida se siguió al inicio y después de cada hora durante un período de 6 horas. Fermentación sólida se estudió al inicio y después de cada 2 horas durante 12 horas y a las 24 horas de fermentación. Las mediciones de pH se realizaron al mismo tiempo que los muestreos de las fermentaciones. 36 Tabla 6.1.1. Lugares donde se realizaron los muestreos de la materia primara y de los diferentes tiempos de las fermentaciones líquida y sólida. LUGAR DONDE SE MUESTREO MUESTRAS Comunidad de cerro blanco Quinta Sección Tacotalpa, Tabasco Agua Maíz de dobla después de la molienda (masa) Tiempo 0, 1 y 2 h de la fermentación líquida. Tiempo 0 y 2 h de la fermentación sólida. Universidad Juárez Autónoma de Tabasco Tiempo 3, 4, 5 y 6 h de la fermentación líquida Tiempo 4, 6, 8, 10, 12 y 24 h de la fermentación sólida. 6.2. Medios de cultivo. Los medios de cultivo se prepararon dos días antes del muestreo en la Universidad Juárez Autónoma de Tabasco. Se sometieron a prueba de esterilidad, incubándose por 24 h a 28°C (Incubadora Carbolite). Los grupos microbianos que se estudiaron así como los medios de cultivos característicos para su crecimiento se muestran en la tabla 6.2.1. Todos los medios se prepararon de a cuerdo a las instrucciones de los fabricantes (Anexo 10.4.). Así mismo, se preparó agua peptonada estéril al 0.1% en tubos de ensayo y matraces Erlenmeyer de 250 ml para realizar las diluciones. Una vez preparados los medios de cultivo se colocó una clave sobre la caja de Petri para su identificación las claves se muestran a continuación: -1, -2, -3, -4 a -6 (ml de atole/ ml) = Dilución S = Fermentación sólida L = Fermentación líquida 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 12 = Tiempo de fermentación (h) P = Producto final A = Agua M = Masa 37 Tabla 6.2.1 Grupos microbianos cuantificados en el atole agrio de Villahermosa Tabasco 6.3. Materia prima. Se emplearon 60 mazorcas de tamaño mediano recién cosechadas de una parcela familiar, del periodo de dobla de septiembre. El agua para la elaboración del atole agrio se tomó directamente de la llave al momento de la preparación. 6.4. Instrumentos para la elaboración del atole agrio. Para desgranar las mazorcas se utilizó un utensilio de metal llamado desgranador. Se empleó un molino eléctrico para realizar la molienda de los granos de maíz. Grupo microbiano Medio de cultivo Descripción de la colonia típica Bacterias lácticas totales MRS (Man, Rogosa y Sharpe Agar MRS) (Difco) Colonias pequeñas circulares. Casi nunca están pigmentadas; la colonia tiene un aspecto blanco color yeso, muy característico (Stainer, 1992). Bacterias lácticas amilolíticas Man, Rogosa y Sharpe Agar suplementado con almidón MRS-A (Componentes, anexo 10.4) Colonias pequeñas circulares. Casi nunca están pigmentadas; la colonia tiene un aspecto blanco color yeso. Tienen un halo claro alrededor de la colonia (Stainer, 1992). Mesófilos aerobios Agar Cuenta Estándar (Difco) Recuento total, se incluyen totas las colonias presentes en el medio de cultivo (Camacho et al., 2007). Mohos y levaduras Agar Papa Dextrosa (Oxoid) La forma de las colonias puede ser desde esférica a ovoide. Son húmedas y algo mucosas. La mayoría son blancuzcas aunque algunas tienen un color crema o rosado. Los mohos son aterciopelados o algodonosos, a veces pigmentados (Camacho et al., 2007) Coliformes Agar Bilis Rojo Violeta (Difco) Colonias de color rojo oscuro generalmente rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa (Camacho et al., 2007). 38 Para llevar a cabo la fermentación líquida se utilizaron botes de plástico de aproximadamente 4 litros de capacidad. En la fermentación sólida se emplearon
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