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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN ECOSISTEMAS Y SUSTENTABILIDAD ECOLOGÍA EFECTO DEL ABONO ORGÁNICO TIPO BOKASHI SOBRE EL DESARROLLO DEL MAÍZ Y SUS INTERACCIONES MICORRÍZICAS TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: ANDREA IOVANNA RAYA HERNÁNDEZ TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. PABLO FABIÁN JARAMILLO LÓPEZ TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN ECOSISTEMAS Y . TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: SUSTENTABILIDAD, UNAM COMITÉ TUTOR: DR. ALEJANDRO ALARCÓN COLEGIO DE POSTGRADUADOS, CAMPUS MONTECILLO. TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: DR. ERICK DE LA BARRERA MONTPELLIER TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: INSTITUTO DE INVESTIGACIONES EN ECOSISTEMAS Y TUTOR PRINCIPAL DE TESIS: SUSTENTABILIDAD, UNAM. CD. MX. JUNIO DE 2018. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. UN MJkiI POSG DOWf~ COORDINACiÓN Ciencias io lógicas u OFICIO CPCS/31612018 Asunto: Oficio d, Jurado para Examen de Grado Uc. Ivonn. Ram lrez Wence Directora General de Administraci6n Escolar, UNAM Presente Por medio de la presente me permito informar a usted, que el Subcomité de Ecología y Manejo Integral de Ecosistemas del Posgrado en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinaria del día 26 de febrero de 2018, aprobó el siguiente jurado para la presentación del examen para obtener el grado de MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS a la alumna RAYA HERNÁNDEZ ANDREA IOIJANNA, con número de cuenta 616012162 , con la tesis titulada " Efecto del abono orgánico t ipo bokashl 8ob,.. el d_.rrello del malz y sus Interacciones micorrlzicas", realizada bajo la dlrecclon del DR. PABLO FABIÁN JARAMILLO LÓPEZ: Presidente: O" Marta Astier Calderón Vocal' Dra. Ek del Val de Gonan Secretario: Oc. Erick de la Barrera Monlppellier Suplente: Oc. Roberto Antonio Lindig Clsneros Suplente: Oc Guillermo Nicolás Murray Tortarolo Sin olro particular, quedo de usled. ATENTAMENTE " POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU" DR. ADOLFO GERARDO¡NAVARRO SIGÜENZA COOROINADOR/OELPROGRAMA COORCINACION Unidad de Po. grado • Coordmaclón del Po,grado en Ciencias Biológica. Edificio D. It:r. Piso. Clrcullo de Posgrado~ Cd. Universi laria Delegación COyoao:ál\ c.P. O4S 10 Cd, :-'1:<. Te1. 5623 7002 hnp:. pcbiol.posgrado unam.m!C. AGRADECIMIENTOS INSTITUCIONALES Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) por su apoyo académico y administrativo. A Leonarda Terán Cárdenas por su apoyo en todos los trámites administrativos. Al programa de becas del Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología (CONACYT) por la beca otorgada (CVU/becario: 708064/516012162) para el financiamiento de mis estudios de posgrado. Quiero agradecer a mi asesor, el Dr. Pablo Fabián Jaramillo López por la orientación brindada para la elaboración del proyecto. A los miembros de mi comité tutor el Dr. Erick de la Barrera Montppellier y el Dr. Alejandro Alarcón por su confianza y aportaciones durante la realizacion de esta investigación. AGRADECIMIENTOS PERSONALES Agradezco a mis padres, Eulalia Hernández Rubalcaba y Fernando Raya Tovar. Las personas más importantes en mi vida y a quienes les debo todo. Por su apoyo incondicional en momentos difíciles y por nunca perder la fe en mí. A mis hermanos Karla Vanessa y Erick González por su amor y cariño. A mi asesor Pablo Jaramillo por apoyarme y alentarme durante todo el proceso de esta investigación. Al Dr. John Larsen por todas sus aportaciones y el gran apoyo en la realización del proyecto. Al Dr. Jose Alfredo Carrera Valtierra, del Centro Regional Universitario Centro Occidente (CRUCO) por su guía y apoyo en la realización del proyecto. A mi amigo, Dante A. López Carmona por todos sus consejos académicos y personales. Siempre estaré agradecida por tu apoyo. Un especial agradecimiento a mis compañeros del laboratorio de Agroecología: Omar, Semiramis, Dante, Ivonne, Netza, Rosa, Rebeca, Tsiri, Karla, Claudio, Ceci, Ana Lidia, Martina, Giovanni, Adán, Guillermo, Clara y Brenda, por su ayuda en las cosechas y salidas a campo, sin su ayuda no hubiera sido posible realizar este proyecto. A mis amigas Semiramis, Nayelli, Rebeca, Monica y Zareth por estar presentes en mi vida y ayudarme a salir adelante. Tengo mucha suerte de tenerlas a mi lado. Al laboratorio de Agroecología, del Instituto de Investigaciones en Ecosistemas y Sustentabilidad (IIES) por las facilidades en el uso sus instalaciones para la realización de este estudio. A Maribel Nava Mendoza tecnica acádemica del laboratorio de Biogeoquímica de Ecosistemas Tropicales, del Instituto de Investigaciones en Ecosistemas y Sustentabilidad (IIES) , por el apoyo en los análisis de Nitrógeno y Fósforo de suelo y tejido vegetal realizados en esta investigación. VI ÍNDICE ÍNDICE DE CUADROS ...................................................................................................... IX ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................... X ÍNDICE DE ANEXOS ........................................................................................................ XII Resumen ............................................................................................................................ XIII Abstract ............................................................................................................................. XIV 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1 1.1 Hipótesis ...................................................................................................................... 3 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 3 2.1 Objetivo general .......................................................................................................... 3 2.2 Objetivos particulares .................................................................................................. 3 3. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 4 3.1 Generalidades del maíz ............................................................................................... 4 3.2 Importancia de la rizósfera .......................................................................................... 5 3.3 Microorganismos rizosféricos ..................................................................................... 5 3.4 Hongos micorrízicos ................................................................................................... 6 3.5 Descripción de los hongos micorrízicos arbusculares ................................................. 7 3.5.1 Ciclo de vida .....................................................................................................7 3.5.2 Efectos benéficos de los HMA ......................................................................... 9 3.5.3 Los HMA y su relación con la fertilidad del suelo .......................................... 9 3.6 Nutrición de las plantas ......................................................................................... 10 3.7 Enmiendas orgánicas ............................................................................................. 11 4. METODOLOGÍA ............................................................................................................ 13 4.1 Fase experimental 1 ................................................................................................... 13 4.1.1 Sitio de estudio ............................................................................................... 13 4.1.2 Variedad de maíz utilizado ............................................................................. 14 4.1.3 Diseño experimental ....................................................................................... 14 4.1.4 Fuentes de fertilización .................................................................................. 14 4.1.5 Establecimiento de experimento .................................................................... 16 4.1.6 Propiedades físicas y químicas del suelo ....................................................... 17 4.1.7 Cosecha .......................................................................................................... 18 4.1.8 Variables de respuesta .................................................................................... 18 VII 5. Fase experimental 2 ................................................................................................... 20 5.1.1 Sitio de estudio ............................................................................................... 20 5.1.2 Variedad de maíz utilizado ............................................................................. 21 5.1.3 Diseño experimental ....................................................................................... 21 5.1.4 Fuentes de fertilización .................................................................................. 22 5.1.5 Propiedades físicas y químicas del suelo ....................................................... 23 5.1.6 Establecimiento y manejo del experimento ................................................... 24 5.1.7 Cosecha y toma de muestras .......................................................................... 25 5.1.8 Variables de respuesta .................................................................................... 27 5.1.9 Análisis estadísticos ....................................................................................... 28 6. RESULTADOS ................................................................................................................ 29 6.1 FASE 1. Promoción del crecimiento de maíz estimulado por un abono orgánico tipo bokashi en plantas con presencia y ausencia de MRN (microorganismos rizosféricos nativos) ............................................................................................................................. 29 6.1.1 Altura .............................................................................................................. 29 6.1.2 Peso seco de la parte aérea de las plantas ....................................................... 31 6.1.3 Peso seco raíz ................................................................................................. 32 6.1.4 Relación raíz follaje ....................................................................................... 33 6.1.5 Longitud de raíz ............................................................................................. 34 6.1.6 Colonización micorrízica ............................................................................... 35 6.1.7 Contenido de nitrógeno y fósforo en suelo .................................................... 35 6.2 FASE 2. Efectos de la fertilización mineral y orgánica en los HMA y en dos genotipos de maíz ............................................................................................................. 36 6.2.1 Peso seco aéreo ............................................................................................... 36 6.2.2 Peso seco de raíz ............................................................................................ 39 6.2.3 Relación raíz follaje ....................................................................................... 40 6.2.4 Colonización micorrízica ............................................................................... 42 6.2.5 Maíz ................................................................................................................ 44 6.2.6 Nitrógeno y fósforo de tejido vegetal ............................................................. 48 6.2.7 Nitrógeno y fósforo de suelo .......................................................................... 49 7. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 51 Fertilizantes orgánicos y minerales estimulan el crecimiento de maíz ............................ 51 Los microorganismos rizosféricos nativos en el desempeño vegetal ............................... 53 VIII Fertilizantes (minerales y orgánicos) sobre los HMA ...................................................... 55 Contenidos de N y P en suelo ........................................................................................... 56 8. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 58 9. REFERENCIAS ............................................................................................................... 59 10. ANEXOS ........................................................................................................................ 68 IX ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Características generales de los hongos micorrízicos (Smith y Read 2008). ........ 7 Cuadro 2. Soluciones nutritivas utilizadas en los tratamientos con fertilización mineral de la fase experimental 1. Desarrollada por el Laboratorio Nacional Riso, Dinamarca. ......... 16 Cuadro 3. Propiedades físicas y químicas del suelo de Napízaro, Michoacán. ................... 18 Cuadro 4. Cantidad de fertilizante aplicado por parcela y por surco ................................... 22 Cuadro 5. Propiedades físicas y químicas del suelo de Santiago Undameo, Michoacán. ... 24 Cuadro 6. Valores de probabilidad (p) del análisis de varianza para altura, peso seco raíz y aéreo, longitud de raíz, relación raíz/follaje y colonización micorrízica *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ........................................................................................................................... 29 Cuadro 7. Concentración de nitrógeno y fósforo en muestras compuestas de suelo ........... 36 Cuadro 8. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza de peso seco aéreo de la primera, segunda y tercera cosecha *p<0.05 ***p<0.01 ***p<0.001 ............................. 37 Cuadro 9. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza para la variable peso seco de raíz *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ........................................................................ 39 Cuadro 10. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza para la variable relación raíz/follaje *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ............................................................ 41 Cuadro 11. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza para la variableporcentaje de colonización *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ................................................ 43 Cuadro 12. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza para las variables peso de la mazorca, grano y olote; diámetro y largo de la mazorca *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 ........................................................................................................................... 45 Cuadro 13. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza para la concentración de nitrógeno y fósforo de la parte vegetal *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 .. 48 X ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1.Esquema de los componentes de la rizósfera ........................................................... 5 Figura 2.Ciclo de vida de los hongos micorrízicos arbusculares. .......................................... 8 Figura 3. Relación entre la fertilidad del suelos y la biomasa micorrízica .......................... 10 Figura 4. Fases experimentales. ........................................................................................... 13 Figura 5. Ubicación de la parcela experimental de la primera fase. . .................................. 14 Figura 6. Establecimiento del primer experimento .............................................................. 17 Figura 7. Método de estimación de porcentaje de colonización micorrízica y longitud de raíz ...................................................................................................................................... 20 Figura 8. Ubicación de la parcela experimental de la segunda fase. .................................... 21 Figura 9. Delimitación y medidas de las parcelas experimentales de la segunda fase ........ 22 Figura 10. Cálculo del volumen de suelo ocupado por una planta de maíz ......................... 23 Figura 11. Establecimiento del segundo experimento ......................................................... 25 Figura 12. Primer y segundo muestreo ................................................................................. 26 Figura 13. Tercer muestreo .................................................................................................. 27 Figura 14. Efecto de los MRN y fertilización mineral y orgánica sobre la altura ............... 30 Figura 15. Plantas de maíz con distintos tratamientos. ........................................................ 31 Figura 16. Efecto de los microorganismos rizosféricos nativos y la aplicación de fertilización mineral y orgánica sobre el peso seco de la parte aérea en plantas de maíz. ... 31 Figura 17. Efecto de los MRN, y la aplicación de fertilización mineral y bokashi sobre el peso seco de las raíces de plantas de maíz. .......................................................................... 32 Figura 18. Raíces de plantas de maíz. .................................................................................. 33 Figura 19. Efecto de los MRN y el tipo de fertilización sobre la relación raíz follaje en plantas de maíz. .................................................................................................................... 34 Figura 20. Efecto de los MRN y el tipo de fertilización sobre la longitud de raíz por gramo de suelo ................................................................................................................................. 35 Figura 21. Efecto de la fertilización mineral y orgánica sobre el porcentaje de colonización micorrízica en raíces de maíz ............................................................................................... 35 Figura 22. Concentración de nitrógeno y fósforo (mg kg-1 de suelo) total de suelo de Napízaro. .............................................................................................................................. 36 XI Figura 23. Efectos de los tratamientos sobre el peso seco de la parte aérea de la segunda fase. ...................................................................................................................................... 38 Figura 24. Efectos de los tratamientos sobre el peso seco de raíz de la segunda fase. ........ 40 Figura 25. Efectos de los tratamientos sobre la relación raíz/follaje. .................................. 42 Figura 26. Efectos de los tratamientos sobre el porcentaje de colonización micorrízica. .... 44 Figura 27. Efectos de los tratamientos sobre el peso de olote, diámetro de mazorca y largo de mazorca. ........................................................................................................................... 47 Figura 28. Mazorcas cosechadas de distintos tratamientos.. ................................................ 48 Figura 29. Efecto de la fertilización mineral sobre la concentración de nitrógeno (mg g-1 de tejido vegetal). ...................................................................................................................... 49 Figura 30. Contenido de nitrógeno y fósforo (mg g-1 de suelo) total de suelo del experimento desarrollado en la localidad de Santiago Undameo. ....................................... 50 XII ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1. Diseño experimental de la primera fase. .............................................................. 68 Anexo 2. Cálculos para obtener el 15% p/p de bokashi ....................................................... 68 Anexo 3. Análisis de suelo de Napízaro, Michoacán .......................................................... 69 Anexo 4. Variables analizadas en la primera fase. ............................................................... 70 Anexo 5. Valores promedio de las variables analizadas en la primera fase. ........................ 70 Anexo 6. Análisis de suelo de Santiago Undameo, Michoacán ........................................... 71 Anexo 7. Diseño experimental de la segunda fase. Experimento. ....................................... 72 Anexo 8. Variables de respuesta analizadas en la segunda fase. ......................................... 72 Anexo 9. Promedios del peso seco aéreo de la primera, segunda y tercera cosecha ........... 73 Anexo 10. Promedios del peso seco de raíz de la primera y segunda cosecha .................... 74 Anexo 11. Promedios de la relación raíz/follaje de la primera y segunda cosecha ............. 75 Anexo 12. Promedios del porcentaje de colonización de la primera y segunda cosecha .... 77 Anexo 13. Promedios de los pesos secos de la mazorca, grano y olote. .............................. 78 Anexo 14. Promedios del contenido de nitrógeno y fósforo en tejido vegetal .................... 79 XIII Resumen El uso desmedido de fertilizantes minerales tiene un impacto negativo en el medio ambiente, por lo que se necesitan buscar alternativas para una agricultura más sostenible. Una posibilidad es el uso de enmiendas orgánicas elaboradas con desechos orgánicos generados de los mismos cultivos, que pueden ayudar a recuperar la salud y nutrición del suelo. El bokashi es un tipo de enmienda orgánica que pasa por un proceso de fermentación, lo que resulta en un abono más estable que puede liberar lentamente nutrimentos al suelo. Otra opción es el uso de microorganismos rizósfericos, como los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) los cuales proveen de múltiples beneficios para las plantas. Los HMA facilitan la absorción del fósforo del suelo, nutrimento esencial que limita la producción agrícola. El presente estudio tuvo como objetivo examinar el efecto de la aplicación de bokashi y fertilización química sobre la nutrición del maíz y la comunidad de HMA nativos. El estudio constó de dos fases experimentales. En la primera fase se evaluó el efecto de la fertilización mineral (NK y NPK) y orgánica (bokashi) en suelo con y sin microorganismos rizósfericos nativos (suelo estéril y no estéril) en 56 microparcelas. Enla segunda fase se consideraron, además de los fertilizantes, dos genotipos de maíz (híbrido y nativo) y los HMA (con y sin) y se realizó en parcelas similares a las utilizadas en un sistema convencional de producción de maíz, es decir, en siembra directa al suelo. Los resultados de la primera fase mostraron que la fertilización con bokashi aumentó el crecimiento vegetal (peso seco aéreo y de raíz) del maíz en un 45.3% y 51.4%, respectivamente en comparación con el control, mientras que los microorganismos rizósfericos nativos (MRN) la disminuyeron en un 29.6% y 37.5%, respectivamente. Por otro lado, la fertilización mineral con NK presentó el mayor porcentaje de colonización micorrízica (38%), pero la fertilización con bokashi también promovió el porcentaje de colonización (25%) en comparación con el control. En la segunda fase no se observaron patrones claros de los efectos de la fertilización mineral u orgánica sobre el crecimiento vegetal o producción del maíz. En cuanto al porcentaje de colonización micorrízica, el bokashi promovió la colonización en el genotipo híbrido y la disminuyó en el nativo. En conclusión existen múltiples factores (ambientales y biológicos) que pueden intervenir en los efectos del bokashi sobre el maíz y los microorganismos del suelo. XIV Abstract The overuse of agro chemical fertilizers has a negative impact on the ecosystem which is why more sustainable alternatives have to be developed. One such alternative is the use of organic soil amendments made from organic crop residues that can help restore the health of the soil and its nutrition. Bokashi is a type of soil organic amendment that relies on the fermentation of organic matter and results in a more stable form of amendment that releases nutrients more slowly and more steadily. Another alternative is to use rhizosphere microorganisms such as arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) which provide multiple benefits for the plants. AMF facilitate the absorption of phosphorous from the soil, which is a limiting nutrient for agricultural production. The main objective of this study was to examine the effect that bokashi and chemical fertilizers have on maize nutrition and the native community of AMF. The study included two experimental phases. For phase one, the effect of chemical (NK and NPK) and organic (bokashi) fertilization to the soil with and without native rhizosphere microorganisms (sterile and non-sterile soil) was evaluated in 56 microplots. For phase two, and in addition to the fertilizers, two maize genotypes (native and hybrid) and AMF (with and without) were included and evaluated. These treatments were established in a conventional agricultural plot and the seeds were sown directly to the soil in order to have real field conditions. The results from phase one showed that the fertilization with bokashi increased plant development (dry weight of plant and root) of maize plants by 45.3% and 51.4%, respectively when compared to the control, while native rhizosphere microorganisms (NRM) reduced plant development by 29.6% and 37.5%, respectively. On the other hand, chemical fertilization with NK had higher mycorrhizal colonization percentage (38%) and bokashi showed similar trends (25%) when compared to the control. In phase two, no clear patters of the effects of chemical and organic fertilization on plant development and maize yield were observed. Regarding mycorrhizal colonization, bokashi promoted the colonization in the hybrid genotype and reduced it for the native genotype. We can conclude that there are various factors (environmental and biological) that can intervene with the effects of bokashi over maize development and yield and on soil microorganisms. 1 1. INTRODUCCIÓN Mesoamérica es el centro de origen y diversificación del maíz. Tan solo en México se han descrito 64 razas que están adaptadas a condiciones ambientales locales y además, son la base genética de los maíces híbridos de alto rendimiento que se comercializan en México. Es por esto que el maíz tiene gran valor económico, cultural y alimenticio y por ende es el principal cultivo en México (Ortega-Paczka, 2003). La mayor parte de la producción de maíz se realiza bajo un sistema de agricultura convencional. Este tipo de agricultura se ha desarrollado en base a la aplicación de insumos agrícolas para mejorar la fertilidad del suelo y para controlar las plagas y enfermedades de las plantas. Adicionalmente, se han desarrollado técnicas de aplicación de riego, variedades mejoradas y se han mecanizado las labores culturales en la agricultura (Gliessman, 2002). El uso de estas técnicas ha dado como resultado un aumento en el rendimiento de este cultivo hasta alcanzar aproximadamente 32 millones de toneladas anuales de maíz (Tester y Langridg, 2010). El uso de fertilizantes químicos en la agricultura convencional, ha generado problemas ambientales como la contaminación de cuerpos de agua y el desbalance de las propiedades físicas y químicas del suelo (Vitousek et al., 2009). En ese sentido, la agricultura orgánica o agricultura alternativa ha surgido como respuesta a los actuales problemas que la agricultura convencional ha ocasionado desde la revolución verde (Aulakh, 2010). La incorporación de materia orgánica (M. O.) al suelo es muy importante en la agricultura orgánica. Esto se debe a que la M.O. es de suma importancia para mantener la fertilidad y evitar problemas de compactación y erosión de los suelos (López-Mtz et al., 2001). Una forma de incorporar la M.O. a los suelos es mediante el uso de enmiendas orgánicas y, además, es una forma de aprovechar los desechos orgánicos, los cuales a menudo no se aprovechan (Diacono y Montemurro, 2011). Es por esto que es importante desarrollar estrategias para reciclar los desechos orgánicos en la agricultura y aprovecharlos para recuperar la fertilidad del suelo. 2 Un tipo de enmienda orgánica es el bokashi. La palabra bokashi proviene del japonés y significa materia orgánica fermentada. Algunas de las ventajas del uso de esta enmienda es que se puede elaborar en la mayoría de los ambientes donde se realicen actividades agropecuarias y es una forma de reproducir los microorganismos nativos del suelo. Por otra parte, la elaboración depende de las condiciones económicas y de las necesidades de cada productor (FAO, 2011). El bokashi se basa en un proceso de fermentación de desechos vegetales y animales, como estiércoles, los cuales son descompuestos y mineralizados por efecto de microorganismos como levaduras, hongos y bacterias. El bokashi mejora el desarrollo de las plantas a través del aporte de nutrientes. Adicionalmente, esta enmienda orgánica activa la microbiota edáfica y mejora las propiedades físicas y químicas del suelo (Mayer et al., 2010). Otra alternativa al uso de fertilizantes minerales es el uso de microorganismos benéficos, como son los hongos micorrízicos arbusculares (HMA). Estos microorganismos establecen simbiosis obligada con las raíces de las plantas para complementar su ciclo de vida. Los HMA son microorganismos que se consideran benéficos y son una alternativa al uso de agroquímicos por que promueven el crecimiento de las plantas a través del transporte de nutrientes del suelo a las plantas (Smith y Read, 2008). Específicamente en el cultivo del maíz han mostrado ser eficientes como controladores biológicos, reducen la deficiencia de fósforo de las plantas, reducen el estrés hídrico y mejoran los procesos fotosintéticos (Ruiz- Lozano et al., 2012; Larsen et al., 2015; Aguilar et al., 2017). Se han realizado múltiples experimentos en condiciones controladas, donde se ha propuesto que un uso adecuado de la diversidad de microorganismos de los agroecosistemas, como los hongos micorrízicos arbusculares (HMA), podría ser una estrategia para el desarrollo de sistemas de producciónagrícola más sustentables (Gianinazzi et al., 2010). Sin embargo, son pocos trabajos los que se han llevado a cabo en condiciones reales de campo. Tampoco se tiene información sobre el efecto que tiene el bokashi sobre el desarrollo de maíz y si el uso de este abono orgánico promueve el establecimiento los HMA nativos en campo. 3 1.1 Hipótesis La contribución de los hongos micorrízicos arbusculares nativos en la nutrición de maíz depende del tipo de fertilización que se aplique al suelo. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Examinar el efecto de la aplicación de bokashi y fertilización química sobre la nutrición del maíz y sobre la comunidad de HMA nativos en campo. 2.2 Objetivos particulares • Analizar el efecto de una fertilización química y bokashi sobre el desempeño vegetativo de maíz en campo. • Evaluar el efecto de una fertilización química y bokashi en los hongos micorrízicos arbusculares nativos en campo. 4 3. ANTECEDENTES 3.1 Generalidades del maíz El maíz es una especie cuyo origen, domesticación y diversificación ocurrió en Mesoamérica. Es una de las principales especies para la alimentación humana y constituye un pilar para la economía del país, además es fundamental en la cultura de México (Takeo et al., 2006). Por su valor económico, cultural y biológico, el maíz es la planta cultivada más importante alrededor del mundo. El maíz tiene múltiples usos, entre ellos destaca: el consumo animal como forraje, consumo humano de forma directa o transformado en harinas o mieles y como fuente energética para la producción de etanol (Ranum et al., 2014). El género Zea comprende cinco especies originarias de México y Centroamérica. La especie cultivada es Zea mays L., la cual es descendiente del teocintle (Doebley, 2004). Zea mays agrupa cuatro subespecies o razas Zea mays L. ssp. huehuetenangensis, Zea mays L. ssp. mexicana, Zea mays L. ssp. parviglumis, el teocintle, y Zea mays L. ssp. mays, este último es el maíz cultivado en México (Kato et al., 2009). Tan solo en México, una de las clasificaciones más aceptadas de maíz describe 59 distintas razas clasificadas con base en marcadores bioquímicos y atributos morfológicos (Sanchez et al., 2000). Las razas de maíz son la base del material genético de las variedades modernas de maíz mejorado. Además, las razas de maíz se han diversificado a partir de poblaciones que han recibido el flujo genético de otras razas o genotipos mejorados y están adaptadas a múltiples condiciones ambientales locales como el clima, el suelo, la altitud, la época de crecimiento e incluso prácticas de manejo del cultivo agrícola (Ortega-Paczka, 2003). El maíz es una planta de crecimiento anual. Las hojas nacen de manera alternada en los nudos a lo largo del tallo. Desarrolla raíces fibrosas y raíces adventicias más finas que nacen en los primeros nudos por encima de la superficie del suelo (Jugenheimer, 1988). El maíz es una planta monoica, el fruto es una inflorescencia, conocida como mazorca, en la que se desarrollan los granos o semillas fecundados individualmente. Las semillas tienen 5 propiedades físicas y químicas (color, textura, tamaño, número) que pueden ser la clave para la clasificación de las razas, variedades e híbridos (Ortega-Paczka, 2003). 3.2 Importancia de la rizósfera La forma clásica para definir la rizósfera, es como la proporción del suelo que está influenciada por las raíces (Hiltner, 1904). Un acercamiento más apropiado lo hicieron Lynch y Leij (2012), quienes definieron a la rizósfera como toda la zona que está influenciada por las raíces y componentes provenientes de ellas, así como la interacción con el ambiente. Este concepto permite considerar la influencia de la rizodeposición de las plantas, la actividad microbiana y los cambios físicos, químicos y biológicos del suelo influenciado por las raíces (Figura 1). Figura 1.Esquema de los componentes de la rizósfera La rizósfera puede ejercer cambios físicos, químicos y biológicos con respecto al resto del suelo. El cambio químico más importante es la variación del pH, que puede, dependiendo del tipo de cambio, promover o reducir la disponibilidad de los nutrientes para las plantas. De igual manera, los microorganismos junto con las rizodeposiciones pueden promover la formación de agregados y hacer cambios en la estructura de la comunidad de microorganismos (Hinsinger et al. 2005; Drinkwater y Snapp, 2007). 3.3 Microorganismos rizosféricos Los microorganismos son un componente esencial del funcionamiento de la rizósfera. Se puede referir de forma genérica a los microorganismos rizosféricos como todos aquellos 6 microorganismos que se desarrollan por el estímulo de las rizodeposiciones y/o que establecen interacciones con las raíces de las plantas (Larsen et al., 2015). Los microorganismos rizosféricos se pueden clasificar como antagónicos y promotores del crecimiento vegetal (Lynch and de Leij 2012). Microorganismos de los géneros Pythium, Fusarium, Stenocarpella, Rhizoctonia, Plimyxa, Verticillium, Phytophthora, etc., son algunos ejemplos de microorganismos patógenos que producen enfermedades en cultivos agrícolas. Mientras que entre los microorganismos promotores del crecimiento vegetal destacan: Trichoderma, Beauveria, Glumus, Metarhizium, Gigaspora, Streptomyces (Larsen et al., 2015). Se ha identificado que los microorganismos promotores del crecimiento vegetal pueden estimular el crecimiento y funciones metabólicas de las plantas a través de la fijación biológica de nitrógeno, síntesis de fitohormonas, solubilización de nutrientes del suelo, control biológico de patógenos, mineralización de nutrientes, mejoramiento de la estructura del suelo y del transporte de nutrientes del suelo a la plantas (Lynch y de Leij, 2012). Uno de los grupos más estudiados de microorganismos benéficos son los hongos micorrízicos (Smith y Read, 2008). 3.4 Hongos micorrízicos Smith y Read (2008) definieron como hongos micorrízicos a un grupo genérico de hongos que establecen simbiosis con las raíces de las plantas y ambos simbiontes obtienen un beneficio. Los hongos micorrízicos pueden ser clasificados en siete tipos de asociaciones micorrízicas con base al tipo de estructuras que desarrollan dentro de las raíces (intra o extracelulares) (Cuadro 1). El grupo de hongos micorrízicos más estudiados y difundidos en los sistemas agrícolas son las micorrizas arbusculares, denominados también hongos micorrízicos arbusculares (HMA) (Larsen et al., 2014). Los HMA son el grupo de HM con mayor distribución en el mundo, se encuentran en la mayoría de los ecosistemas naturales y manejados y, además, establecen simbiosis con aproximadamente el 80 % de las plantas vasculares (Smith y Read, 2008). 7 Cuadro 1. Características generales de los hongos micorrízicos (tomado de Smith y Read 2008). 3.5 Descripción de los hongos micorrízicos arbusculares Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) pertenecen al filo Glomeromycota, el cual cuenta con tres clases (Archaeosporomycetes, Glomeromycetes y Paraglomeromycetes), cinco órdenes (Archaeosporales, Diversisporales, Gigasporales, Glomerales y Paraglomerales), 14 familias y 29 géneros, de los cuales Acaulospora, Entrophospora, Gigaspora, Glomus, Sclerocystis y Scutellospora son los más estudiados (Oehl et al., 2011). 3.5.1 Ciclo de vida A diferencia de otros hongos, los HMA son simbiontes obligados que no tienen fase sexual y sus esporas germinan (Figura 2 a) con el estímulo de exudados de las plantas (Smith y Read 2008). El establecimiento de la simbiosis micorrízica comienza cuando las hifas germinan de propágalos (hifas o raíces muertas) o esporas que se encuentran en el suelo (este tipo de micelio es asimbiótico). Cuando la hifa percibe los exudados de la planta hospedera comienza a ramificarse, esto para incrementar laoportunidad de ponerse en contacto con la superficie de la raíz. El hongo reconoce las moléculas de señalización de la 8 planta y comienza a ramificarse, las fitohormonas (strigolactonas) son las que estimulan la ramificación del hongo. Por su parte la planta percibe señales del hongo que inducen una respuesta de simbiosis específica en la raíz de la planta hospedera. Esta etapa, que ocurre antes del contacto físico entre la raíz y el hongo, constituye la etapa pre-simbiótica (Requena et al., 2007, Besserer et al., 2006). Después de que la hifa hace contacto con las células epidérmicas de la raíz, comienza la etapa simbiótica, donde, la hifa del hongo desarrolla un apresorio, con el cual el hongo penetra las células epidérmicas y procede la colonización desarrollando micelio intraradical (Figura 2 b). Dentro de las células de la raíz los HMA pueden formar estructuras llamadas arbúsculos (Figura 2 c) y es por medio de estas estructuras que la planta recibe los nutrientes que aporta el hongo (Requena et al., 2007). Los HMA también forman vesículas, que son estructuras de almacenamiento de lípidos. No todos los HMA producen vesículas como aquellos pertenecientes a los géneros Gigaspora y Scutellospora (Requena et al., 2007). Figura 2.Ciclo de vida de los hongos micorrízicos arbusculares. a) germinación de espora. b) colonización del cortex de la raíz. c) arbúsculos en las células de la raíz. d) micelio externo. Modificado de Requena et al., 2007. 9 3.5.2 Efectos benéficos de los HMA Los HMA facilitan el transporte de nutrientes del suelo a la planta hospedera cuando estos son escasos o tienen una baja movilidad en la solución del suelo (Bago et al., 2003). Algunos de los nutrientes que los HMA pueden facilitar son el nitrógeno, cobre, zinc y en especial fósforo (P). La planta a cambio provee al hongo compuestos carbonados productos de la fotosíntesis (Smith y Smith, 2011). Los HMA incrementan la resistencia a patógenos de la raíz (Larsen et al., 2015), mejoran la estructura del suelo (Smith y Read, 2008) e incrementan la tolerancia a condiciones ambientales desfavorables, como la sequía (Ruíz- Lozano et al., 2012), y a contaminantes por metales pesados (Joner et al., 2000). El P es crítico para el crecimiento de las plantas representando un 0.2% del peso seco total, y es uno de los nutrimentos que más les cuesta adquirir (Smith et al., 2011). Por lo general, las plantas tienen dificultad para obtener este nutriente porque se encuentra en formas poco disponibles. Es por esto que en ambientes con baja disponibilidad de P las plantas y microorganismos deben producir enzimas que conviertan al P en formas disponibles (fosfatos PO43-) (Aerts y Chapin, 2000). Algunos mecanismos sugeridos para la mejora en la adquisición del fósforo tomado por las plantas micorrízadas son: (1) las hifas de los hongos pueden explorar mayor volumen de suelo, lo que disminuye la distancia que los iones de P deben difundir a la raíz y aumenta el área de superficie de absorción; (2) La solubilización del fósforo del suelo, mediante la liberación de ácidos orgánicos y enzimas como la fosfatasa; la toma más rápida de P por las hifas, ya que la micorriza entrega rápidamente el P a las células corticales dentro de la raíz (Bolan, 1991, Smith et al., 2011). 3.5.3 Los HMA y su relación con la fertilidad del suelo La disponibilidad de nutrientes en los sistemas agrícolas es uno de los principales factores que limita la producción de las plantas. Una de las prácticas más comunes para subsanar la baja fertilidad en los sistemas agrícolas, es la incorporación de fertilizantes químicos o enmiendas orgánicas (Larsen et al., 2015). Treseder y Allen (2002) describieron un modelo general entre la biomasa micorrízica y la fertilidad en el suelo. Cuando un suelo tiene alta disponibilidad de nutrientes (por aplicación de fertilizantes), las plantas no son limitadas por nitrógeno y/o fósforo y por 10 ende hay una reducción del crecimiento de la biomasa de los HMA debido a que las plantas asignan más carbono al crecimiento vegetal que al mantenimiento de la simbiosis (Figura 3). Figura 3. Relación entre la fertilidad del suelos y la biomasa micorrízica tomado de Treseder & Allen (2002). 3.6 Nutrición de las plantas Una de las vías para la absorción de nutrientes de las raíces de las plantas, es la absorción activa. Esto ocurre directamente por las células corticales de la raíz. La otra vía, depende del suministro de nutrientes en la superficie de la raíz. Este suministro depende de varios factores como: la concentración de nutrientes en la solución del suelo, el poder de amortiguación del suelo y del movimiento de nutrientes en la interfase suelo-raíz (por difusión o por flujo de masa) con el agua del suelo (Chapin, 1980). Otros procesos que intervienen son, la capacidad de la planta de hacer simbiosis con micorrizas o bacterias fijadoras de nitrógeno y la modificación del suelo, ya que puede mejorar el suministro de nutrientes (Aers y Chapin 1999). Los nutrientes necesarios para un adecuado desarrollo de las plantas pueden ser clasificados como macronutrientes (carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, azufre y magnesio) y micronutrientes (molibleno, cobre, zinc, manganeso, cloro y niquel) (Taiz y Zeiger, 2006). También se ha establecido la presencia de mínimas concentraciones 11 de otros elementos (traza) pero, en muchos casos, la función de estos elementos traza no se ha determinado por completo (Markert, 1995). El pH es el principal factor del suelo que limita la disponibilidad de los nutrientes para que puedan ser absorbidos por las plantas. De este modo la disponibilidad de los principales nutrientes (nitrógeno, fósforo y potasio) está en valores de pH cercanos al neutro. El nitrógeno para las plantas se absorbe básicamente en forma de amonio (NH4+) y de nitrato (NO3-). El amonio es más abundante en suelos con pH de neutro a ácido, mientras que en suelos ácidos domina el nitrato. La forma de nitrógeno dominante es muy importante para conocer la susceptibilidad del sistema al enriquecimiento o empobrecimiento del nitrógeno (Hayatsu et al., 2008). El fósforo es absorbido por las plantas en forma de ortofosfato (PO4), sin embargo, es un nutriente altamente reactivo con otros compuestos del suelo y arcillas, por lo que su disponibilidad suele ser baja. El fósforo en pHs ácidos puede precipitarse como fosfato de hierro (Fe 2+ 3+) o aluminio (Al 3+), mientras que en suelos alcalinos puede formar fosfatos de potasio (K+), calcio (Ca2+) o magnesio (Mg2+) (Barančíková et al., 2007). 3.7 Enmiendas orgánicas Las enmiendas orgánicas son aquellas que se originan, en su mayor parte, de residuos vegetales o animales. Las enmiendas orgánicas contienen moléculas biológicamente activas como vitaminas, reguladores de crecimiento, toxinas y sustancias húmicas de baja masa molecular que pueden afectar a los microorganismos del suelo (Scotti et al., 2015). Una de las principales funciones de las enmiendas orgánicas es la de aportar materia orgánica al suelo. Por ende, la aplicación directa de enmiendas orgánicas a los suelos agrícolas puede mejorar la calidad del suelo al modificar muchos parámetros como la aireación del suelo, la estructura, el drenaje, la retención de la humedad, la disponibilidad de los nutrientes y la ecología microbiana (Bailey and Lazarovits, 2003; Dorand and Zeiss, 2000). Además, pueden llegar a ser un sustituto de fertilizantes sintéticos (Sridhar et al., 2001), y promover el establecimiento de bacterias que mejoran la salud del sistema de raíces (Tiquia et al., 2002; Danon et al., 2008). Dichas enmiendas orgánicas provienen de la conversión de los 12 desperdicios orgánicos en una sustancia estable, benigna y con menos volumen (Albiach, 2001). 13 4. METODOLOGÍA Para llevara cabo el presente estudio, se realizaron dos fases experimentales (Figura 4). En ninguna de las fases experimentales se contó con riego y todo el aporte hídrico fue de las lluvias. En la primera fase y con la finalidad de tener condiciones semi-controladas de rizosfera, se trabajó con microparcelas (macetas de 11 l) las cuales se colocaron en campo abierto. El objetivo de esta fase fue evaluar los efectos de la fertilización mineral y orgánica en los HMA así como en el desempeño vegetal del maíz en condiciones de campo y con rizósfera aislada. La segunda fase se realizó con el objetivo de determinar la relación de los HMA nativos y el tipo de fertilizante en la nutrición, crecimiento y rendimiento en Zea mays a campo abierto. Figura 4. Fases experimentales para la evaluación del efecto de la aplicación de bokashi y fertilización química sobre la nutrición del maíz y su microbiología rizosférica asociada. 4.1 Fase experimental 1 4.1.1 Sitio de estudio El experimento se llevó a cabo en la localidad de Napízaro (N 19°36’04.0’’ W 101°41’56.2’’) que está situada en el Municipio de Erongaricuaro, Michoacán (Figura 5) a una altitud de 1946 m. La temperatura media fue de 17.8°C con variaciones extremas que van de los 8.5°C hasta los 31°C y un promedio de humedad ambiental de 81.4% (datos obtenidos con sensores de humedad y temperatura (Hygrochron, Embedded Data Systems, 14 Lawrenceburg, Ky, USA), los cuales fueron colocados en la parcela durante el tiempo que permaneció el experimento). Figura 5. Ubicación de la parcela experimental de la primera fase. Parcela situada en la localidad de Napízaro, Municipio de Erongarícuaro, Michoacán. 4.1.2 Variedad de maíz utilizado Se utilizó la variedad de maíz híbrido DK-2061 que es comercializada por la empresa DEKALB. Este maíz tiene una altura promedio de 245 – 265 cm y un hábito de crecimiento intermedio con tiempo aproximado de cosecha de 175 a 180 días. 4.1.3 Diseño experimental Se estableció un experimento con tratamientos completamente al azar. El diseño experimental consistió de dos factores: (F1) Microorganismos rizosféricos nativos (MRN) (con y sin) y (F2) fertilización (control, NK, NPK y bokashi). En total fueron 8 tratamientos con 7 repeticiones cada uno, dando 56 unidades experimentales (Anexo 1). Es importante señalar que la forma en que se controló la comunidad de microorganismos fue mediante la esterilización del suelo. 4.1.4 Fuentes de fertilización Fertilización mineral. La fertilización se realizó con base en una solución nutritiva, que incluyó macro y micro nutrientes. La solución nutritiva fue aplicada antes de la siembra y se revolvió junto con el suelo para hacer una mezcla homogénea. La fórmula de fertilización mineral utilizada fue desarrollada por el Laboratorio Nacional Riso en Dinamarca (Cuadro 2). Se agregó la formulación completa a los tratamientos con nitrógeno, 15 fósforo y potasio (NPK) mientas que a los tratamientos con NK no se les aplicó fósforo (solución V). 16 Cuadro 2. Soluciones nutritivas utilizadas en los tratamientos con fertilización mineral de la fase experimental 1. Desarrollada por el Laboratorio Nacional Riso, Dinamarca. Solución nutritiva Solución Formula Concentración (g L-1) Suministro por Kg de suelo Total aplicado por unidad experimental (ml) mg kg-1 de suelo ml kg-1 de suelo I K2S04 61.72 370.31 (K:166) 6 66 II CaCl2 x 2H2O 25 75 (Ca:20) 3 33 III MnSO4 x 7H2O 3.5 10.5 (Mn:3.4) 3 33 ZnSO4 x 5H2O 1.8 5.4 (Zn:1.2) CuSO4 x 5H2O 0.7 2.1 (Cu:0.5) Na2MoO4 x 2H2O 0.06 0.18 (Mo:0.1) IV NH4NO3 95.24 285.71 (N:100) 3 33 V KH2PO4 43.93 (10 mg P ml-1) Según tratamiento 1.81 20 solo a los tratamientos con NPK VI MgSO4 x 7H2O 134.14 405.43 (Mg:40) 3 3 Enmienda orgánica tipo bokashi. Se utilizó el 15% p/p (Anexo 2) el cual representó 2 kg de bokashi por unidad experimental. El bokashi se elaboró en el Instituto de Investigaciones en Ecosistemas y Sustentabilidad (IIES), UNAM. Los ingredientes que se utilizaron fueron: estiércol de vaca, salvado de trigo, rastrojo de maíz, suelo agrícola, levadura común (Saccharomyces cerevisiae), agua y piloncillo (Jaramillo-López et al., 2015). Se midió la concentración de fósforo del bokashi con el método Olsen (1954) dando como resultado una concentración de 30.27 mg kg-1 4.1.5 Establecimiento de experimento Se colectó y tamizó 616 kg de suelo del sitio de estudio. La mitad del suelo se esterilizó durante 24 h a 80°C en una esterilizadora de suelo “Pro-grow, electric soil sterilizer, model SS-30, WI, USA” (Figura 6b), esto se realizó dos veces con un intervalo de reposo de 24 h. 17 Los distintos tratamientos se colocaron en las microparcelas (macetas de plástico de 11L), las cuales se distribuyeron al azar dentro del terreno (Figura 6d). Se sembraron 6 semillas por microparcela para asegurar la germinación de por lo menos una planta (Figura 6e). Después de 36 días de crecimiento se eliminaron las plantas con el fin de tener solo una planta por unidad experimental (Figura 6f). Durante el crecimiento de las plantas se realizaron deshierbes dentro y fuera de la maceta para reducir la competencia por nutrientes y efectos de las hierbas fuera de la maceta (Figura 6f). La altura de las plantas se comenzó a tomar a los 44 días de crecimiento después de la siembra y se tomó aproximadamente cada 7 días, las plantas se midieron desde el suelo hasta el ápice de la hoja más larga (Figura 6g). Figura 6. Establecimiento del experimento a) tamizaje de suelo b) esterilización de suelo c) aplicación y mezcla de los tratamientos, fertilizantes minerales y orgánicos d) distribución de los tratamientos en la parcela e) siembra de semillas f) raleo dentro y fuera de las microparcelas g) toma de altura. 4.1.6 Propiedades físicas y químicas del suelo Se analizaron las propiedades físicas y químicas del suelo (Anexo 3) de una muestra compuesta tomada directamente de la parcela a una profundidad de 25 cm. El suelo fue 18 analizado en el Laboratorio Nacional de Fertilidad de Suelos y Nutrición Vegetal del INIFAP (Cuadro 3). Cuadro 3. Propiedades físicas y químicas del suelo de la localidad de Napízaro, Michoacán. Propiedad Características / Unidades Tipo de suelo Franco limoso Textura Arena 31.48%, arcilla 15.28%, limo 53.24% pH (1:2 agua) 6.06 MO 2.29% N-Inorgánico 41.53 mg kg-1 P- Bray 30.11 mg kg-1 K 350.985 mg kg-1 CE 0.34S m-1 4.1.7 Cosecha La cosecha se realizó 63 días después de la siembra. Para esto se trasladaron las unidades experimentales (plantas) con rizósfera al IIES, Morelia para su procesamiento y análisis. Se realizó una mezcla compuesta de suelo por tratamiento. Las raíces se lavaron y se separaron de la parte aérea para determinar la biomasa de ambas partes de forma independiente. De la raíz fresca se tomó una muestra de 2gr para la estimación de la colonización micorrízica. 4.1.8 Variables de respuesta Se analizó el desempeño vegetal (altura, peso seco aéreo, radical y longitud de raíz), el nitrógeno y fósforo total del suelo y la colonización de HMA (Anexo 4). 4.1.8.1 Planta La raíz y la parte aérea se colocaron en un horno de secado a 80°C por 72 horas para luego determinar la biomasa. Para determinar la relación raíz/follaje se utilizó la siguiente formula: Relación raíz/follaje = Peso seco de raíz Peso seco de tallo 19 4.1.8.2 Nitrógeno y fósforo total de suelo Se tomó una muestra de suelo de cada unidad experimental. Posteriormente se realizó una muestra compuesta por cada uno de los tratamientos de fertilización (control, NK, NPK y bokashi). Previo al análisis, las muestras se secaron, molieron y tamizaron con una malla de 2.0 mm. Se pesaron 3 gr de muestra tamizada y se colocaron en tubos de 250 ml, se prepararon dos blancos que llevaron el mismo procedimiento quelas muestras de suelo. Se adicionó 1.1 gr de mezcla digestora compuesta por sulfato cúprico y sulfato de potasio. Se adicionaron 3 ml de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30% y se dejó reposar por un periodo aproximado de 10 min para que hiciera reacción la muestra. Posteriormente se agregó lentamente 20 ml de ácido sulfúrico y se dejó reposar por 24 horas. Los tubos se colocaron en un bloque digestor para elevar la temperatura gradualmente (50°C cada 20 minutos) hasta alcanzar los 375°C y se mantuvo esta temperatura durante 3 horas, hasta que las muestras tomaron un color blanquecino o transparente. Las muestras se dejaron enfriar y se aforaron a 250 ml con agua desionizada. Luego se filtraron en papel Whatman No.1 (125 mm) y se recuperó el extracto en viales de cristal. Se realizaron diluciones de los extractos para después hacer la lectura en el autoanalizador 3, BRAN LUEBBE, dilución 1:5 para fósforo y el extracto para nitrógeno. 4.1.8.3 Determinación del porcentaje de colonización de HMA Se tiñeron las raíces mediante la técnica descrita por Phillips y Hayman (1970). Para esto se colocaron 2 gramos de raíces aleatorizadas en hidróxido de potasio (KOH) al 10% por 30 minutos en baño maría a 70°C. Posteriormente se enjuagaron y se colocaron en peróxido de hidrógeno (H2O2) por 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente se tiñeron con azul tripano al 0.05% por 5 minutos en baño maría a 70°C. Las raíces teñidas se almacenaron en frascos de plástico con glicerol para su posterior análisis. Para estimar el porcentaje de colonización y la longitud de raíz se utilizó el método de Newman (1966). Las observaciones de HMA se realizaron en un microscopio estereoscópico. En una caja Petri marcada con quince puntos se colocaron las raíces teñidas. Con el fin de calibrar las mediciones, se enfocó exactamente un centímetro de la línea del micrómetro ocular y esta pasó por el medio de cada uno de los puntos observados. 20 Se cuantificó la cantidad de raíces que tocaban esta línea y también se determinó la presencia o ausencia de las estructuras de hongos arbusculares (hifas, vesículas, arbúsculos). La presencia de HMA sólo se cuantificó cuando alguna estructura de los hongos micorrízicos tocaba el micrómetro ocular (Figura 7). Figura 7. Método de estimación de porcentaje de colonización micorrízica y longitud de raíz (Newman, 1966). 5. Fase experimental 2 5.1.1 Sitio de estudio El experimento se llevó a cabo en una parcela ubicada en localidad de Santiago Undameo (N 19°41'56" y W 101°16'1") que forma parte del Municipio de Morelia, Michoacán (Figura 8) una altitud de 2014 msnm. La temperatura media fue de 18.9°C con variaciones extremas que van de los 3.6°C hasta los 36.1°C y un porcentaje de humedad promedio de 81.07% en el tiempo que duró el experimento. Los parámetros meteorológicos fueron estimados con sensores de humedad y temperatura (Hygrochron, Embedded Data Systems, Lawrenceburg, Ky, USA), los cuales fueron colocados en la parcela durante el tiempo que permaneció el experimento. 21 Figura 8. Ubicación de la parcela experimental de la segunda fase. Localidad de Santiago Undameo, Municipio de Morelia, Michoacán, México. 5.1.2 Variedad de maíz utilizado Se utilizaron dos genotipos de maíz, una raza nativa (ancho) y un híbrido (antílope). La semilla del genotipo de maíz ancho fue cultivada en el Municipio de Morelia y se compró en una casa de insumos agrícolas. El maíz ancho se caracteriza por sus mazorcas semicilíndricas, grano largo y delgado generalmente dentado (Benz 1986; Ron et al., 2006). El genotipo híbrido es de ciclo intermedio comercializado por la empresa Asgrow, este maíz tiene una altura promedio de 265 – 285 cm y un tiempo aproximado de cosecha de 170 – 185 días. 5.1.3 Diseño experimental Se estableció un experimento factorial con tres factores: F1: HMA (Fungicida (Benomilo) con y sin), F2: Fertilización (control, NK, NPK y bokashi); F3: Genotipo de maíz (nativo (ancho) e híbrido (antílope)). En total se tuvieron 16 tratamientos con 4 repeticiones y un total de 64 unidades experimentales (Anexo 5). Se realizó un manejo in situ de las poblaciones nativas de HMA mediante la aplicación del fungicida (benomilo). Se realizaron dos aplicaciones del fungicida durante el crecimiento de las plantas. La primera aplicación se realizó al momento de la siembra y la segunda aplicación a los 48 días de crecimiento de las plantas. El experimento se estableció en bloques con parcelas divididas. Cada unidad experimental tuvo 4 surcos de 3.5 metros de largo con una separación entre surcos de 80 centímetros 22 (Figura 9). Los muestreos se realizaron sólo en los surcos centrales mientras que los surcos externos tuvieron la función de amortiguar el efecto borde. Figura 9. Delimitación y medidas de las parcelas experimentales de la segunda fase en la localidad de Santiago Undameo, Morelia, Michoacán. 5.1.4 Fuentes de fertilización Fertilización mineral- Se utilizó la formula agronómica 100-60-40 de N-P-K respectivamente. El total del fertilizante se colocó en dos aplicaciones, la primera al momento de la siembra y la segunda durante la labor cultural de aporque (48 días). Con base en la dosis agronómica por hectárea, se estimó la cantidad de fertilizante por unidad experimental (3.5m x 3.4.m=11.9m2) (Cuadro 4). Como fuente de nitrógeno se utilizó sulfato de amonio (20.5-00-00), fosfato de amonio dibásico (16-46-00) como fuente de fósforo y cloruro de potasio (00 – 00 – 60) para el aporte de potasio. Cuadro 4. Cantidad de fertilizante aplicado por parcela y por surco Fertilizante Ha (kg) Parcela (g) Surco (g) N 162.6 193.5 48.4 P 292.8 348.4 87.1 K 66.7 79.3 19.8 Para esta fase, se utilizó un abono orgánico tipo bokashi elaborado en la ciudad de Zitácuaro, Michoacán, México. Este abono fue elaborado con el mismo método utilizado en 23 la primera fase (Jaramillo-López et al., 2015), con la diferencia de que se utilizó suelo orgánico forestal en lugar de suelo agrícola Para calcular la cantidad de abono orgánico, se estimó el volumen de suelo que ocupa la raíz de una planta. Se consideró un largo y ancho de 10 cm y una profundidad de 15 cm (Figura 10). Para convertirlo a volumen se multiplico por 1000. Al igual que en la primera etapa, se utilizó la densidad de un suelo estándar (1.2) para calcular la masa. Para calcular el 15% de la masa total (1.8 kg) se utilizó una regla de tres, dando como resultado 0.27 kg de bokashi por planta. Cada surco midió 350 cm y la distancia entre plantas fue de 15 cm, 23 plantas por surco aproximadamente, por lo que se añadió 6.21 kg de bokashi por surco y 24.84 kg por parcela (comunicación personal, Jaramillo-López, 10 de junio de 2016). La aplicación del abono orgánico fue en forma manual. Al igual que la fertilización mineral, se realizaron dos aplicaciones, la primera en la siembra y la segunda a los 48 días. Figura 10. Cálculo del volumen de suelo ocupado por una planta de maíz 5.1.5 Propiedades físicas y químicas del suelo Se analizaron las propiedades físicas y químicas del suelo (Anexo 6) de una muestra compuesta tomada directamente de la parcela a una profundidad de 25 cm. El suelo se tamizó con una malla de 2.0 mm y fue analizado en el Laboratorio Nacional de Fertilidad de Suelos y Nutrición Vegetal del INIFAP (Cuadro 5). 0.1m x 0.1m x 0.15m = 0.0015 m3 0.0015 m3 x 1000 = 1.5 L 𝑚 = 𝛿 ∙ 𝑣 𝑚 = 1.2 x 1.5 𝑚 = 1.8 kg 24 Cuadro 5. Propiedades físicas y químicas del suelo de Santiago Undameo. Propiedad Características / Unidades Tipo de suelo Franco arcilloso arenoso Textura Arena 57.48%, arcilla 22.28%, limo 17.24% pH (1:2 agua) 5.73 MO 2.06% N-Inorgánico 46.14 mg kg-1 P- Bray 2.82 mg kg-1 K 252.217 mg kg-1 CE 0.46 dS m-1 5.1.6 Establecimiento y manejo del experimento El experimento se establecióel 15 de Junio de 2016. Antes de la siembra, se preparó el suelo con tractor (Figura 11a). Se delimitaron las parcelas y calles con hilo de dos cabos y las semillas se sembraron manualmente a una distancia de 20 cm (Figura 11b). La distancia entre surcos fue de 0.80 m. La siembra se realizó en la parte alta del surco donde el tractor no removió el suelo, esto con la finalidad de tener micelio micorrízico intacto a manera de labranza cero o labranza de conservación. Los fertilizantes fueron aplicados manualmente quedando en contacto con las semillas. Para eliminar los HMA nativos se aplicó el fungicida Benomilo (metil 1-(butilcarbamoil) bencimidazol-2-il carbamato, 50%, producido por ADAMA) a razón de 0.5 gr de benomilo diluido en 25 ml de agua por planta. Se realizaron dos aplicaciones del fungicida, la primera al momento de la siembra y la segunda aplicación a los 48 días después de la siembra. El manejo de las arvenses y las plagas se realizó mediante control convencional. Dada la persistencia de hierbas, se deshierbó de forma manual cada una de las unidades experimentales (Figura 11c). 25 Figura 11. Establecimiento del experimento a) Preparación del suelo para la siembra b) siembra de semillas a 20 cm de distancia c) deshierbe manual de las unidades experimentales. 5.1.7 Cosecha y toma de muestras Se realizaron tres muestreos durante la etapa de crecimiento del cultivo. El primer muestreo se realizó a los 48 días después de la siembra, el segundo al momento de la floración del maíz y el último a la cosecha del maíz. En el primer y segundo muestreo se tomaron dos plantas por unidad experimental junto con su respectiva rizósfera (Figura 12). Se separó la parte aérea de la raíz y se secaron en un horno a 80°C por 96 horas para obtener la biomasa seca de ambas partes (Figura 12 b, c). Antes de secar la raíz se tomaron 2 gr para estimar la colonización los HMA nativos. 26 Figura 12. Primer y segundo muestreo a) toma de dos plantas por unidad experimental con rizósfera b) corte de la parte aérea para secar en horno c) lavado de raíces. En el tercer muestreo se cosecharon las mazorcas de las plantas restantes de cada unidad experimental (Figura 13a). Las plantas se cortaron a nivel del suelo y se dejaron secando en campo (Figura 13b). 27 Figura 13. Tercer muestreo a) cosecha de mazorcas b) plantas secándose en campo c) grano para pesar d) grano almacenado y olotes 5.1.8 Variables de respuesta Las variables evaluadas en la segunda fase para las plantas fueron peso seco de raíz y parte aérea. Para determinar la biomasa seca de las primeras dos cosechas se separó la parte aérea de la raíz y se colocaron en un horno de secado a 80°C por 96 horas. Nitrógeno y fósforo total de tejido vegetal sólo se determinaron para la segunda cosecha. Para el maíz se calculó el peso seco de la mazorca, grano y olote, además del largo y ancho de mazorca. En cuanto al suelo sólo en la tercera cosecha se midió el N y P total por tratamiento. Finalmente se determinó la colonización de raíces con HMA en las dos primeras cosechas (Anexo 7). 5.1.8.1 Nitrógeno y fósforo total de planta y suelo El N y P de tejido vegetal y suelo se realizó con el mismo método explicado en la primera fase, con la diferencia que para tejido vegetal se colocó 0.25 gr de muestra en tubos de 75ml. La dilución de los extractos fue de 1:5 para nitrógeno y fósforo. 5.1.8.2 Determinación del porcentaje de colonización de HMA El método de tinción de las raíces fue el mismo que en el de la primera fase (Phillips y Hayman, 1970), pero para determinar el porcentaje de colonización de HMA se utilizó el método de Giovanetti y Mosse (1980). En una caja Petri con cuadrícula se distribuyó homogéneamente la muestra de raíz teñida. Para estimar el porcentaje de colonización 28 micorrízica, en un microscopio estereoscópico se revisó la presencia o ausencia de HMA, así como el crecimiento de otros microorganismos no micorrízicos. En total se observaron 100 fragmentos de raíces, que estuvieron en las intersecciones de la cuadricula. 5.1.9 Análisis estadísticos Los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza multifactorial de tres factores y se realizó la verificación de varianza para todas las variables. En el caso del peso seco de la parte aérea (Napízaro) y el peso seco de raíz (Santiago Undameo, primera cosecha) fue necesario transformar logarítmicamente los datos. Se utilizó un test de significancia de LSD con una p≤0.05. Todos los datos se analizaron en el programa estadístico Statgraphics Centurion XV Versión 15.2.06. y las figuras se elaboraron con el software GraphPad Prism 7. 29 6. RESULTADOS Los resultados se presentan en dos fases. En primer lugar se muestran los resultados del experimento en microparcelas. Posteriormente los resultados del experimento a campo abierto, es decir, en parcelas similares a las utilizadas en sistemas de producción convencional de maíz. 6.1 FASE 1. Promoción del crecimiento de maíz estimulado por un abono orgánico tipo bokashi en plantas con presencia y ausencia de MRN (microorganismos rizosféricos nativos) En este experimento se evaluó el efecto de la fertilización y de los MRN sobre el desarrollo de una variedad híbrida de maíz (Antilope, Asgrow). La altura, el peso seco aéreo y de raíz presentaron efectos significativos individuales con ambos factores, pero no se observó ninguna interacción entre fertilización y MRN (Cuadro 6). La interacción de los factores afectó significativamente la longitud de la raíz (Cuadro 6). La relación raíz/follaje no presentó ningún efecto significativo (Cuadro 9). Finalmente, los fertilizantes tuvieron un efecto significativo en la colonización de HMA (Cuadro 6). Los valores promedio se pueden ver en el Anexo 8. Cuadro 6. Valores de probabilidad (p) del análisis de varianza para altura, peso seco raíz y aéreo, longitud de raíz, relación raíz/follaje y colonización micorrízica *p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001 Factores Altura (días) Peso seco Longitud de raíz Relación raíz/follaje Colonización de HMA 45 55 63 Aéreo Raíz MRN *** *** *** *** *** *** 0.2189 N/A Fertilizantes * *** *** *** *** *** 0.091 *** MRN x Fertilizantes 0.15 0.16 0.3 0.09 0.09 *** 0.771 - 6.1.1 Altura La altura de las plantas disminuyó significativamente con la presencia de MRN. Este efecto se mantuvo desde la primera estimación (día 45) hasta el día 63 (Figura 14a y c). A partir del día 45 de crecimiento se observó que las plantas con bokashi crecieron más que las 30 plantas control y con fertilización mineral (NK y NPK). Esta tendencia se mantuvo hasta el final del experimento (Figura 14 b y d). Fue posible observar que sólo el bokashi tuvo la capacidad de estimular el crecimiento (altura) de las plantas de maíz en comparación con el resto de tratamientos (Figura 14 d). Las diferencias en la altura y porte de las plantas fueron observadas directamente en campo, donde las plantas con MRN tuvieron un menor crecimiento (Figura 15). Las plantas fertilizadas con bokashi tuvieron el mayor tamaño (Figura 15). Figura 14. Efecto de los MRN y fertilización mineral y orgánica sobre la altura (media ± ES;. LSD p≤0.05) de plantas de maíz a los 45, 55 y 63 días de crecimiento (a, b) y en el día 63 (c, d). 31 Figura 15. Plantas de maíz con distintos tratamientos. De lado izquierdo plantas con MRN y de lado derecho plantas sin MRN. Se muestran los cuatro tratamientos de fertilización control, nitrógeno y potasio (NK), nitrógeno, fósforo y potasio (NPK) y bokashi. 6.1.2 Peso seco de la parte aérea de las plantas La ausencia de MRN promovió un mayor peso seco del follaje de las plantas (Figura 16 a) resultados similares a lo ocurrido con la variable altura. De igual manera, las plantas fertilizadas con bokashi presentaron un mayor pesoseco (de la parte aérea) en comparación con el control y todos los tratamientos de fertilización mineral (Figura 16 b). Figura 16. Efecto de los microorganismos rizosféricos nativos (a) y la aplicación de fertilización mineral y orgánica (b) sobre el peso seco de la parte aérea (media ± ES; LSD p≤0.05) en plantas de maíz. 32 6.1.3 Peso seco raíz La presencia de MRN disminuyó el peso seco de raíz (Figura 17a). Por otra parte, la fertilización con bokashi registró un mayor peso seco (de raíz) en comparación con el control y la fertilización mineral (Figura 17 b). Las plantas fertilizadas con bokashi mostraron significativamente mayor biomasa radicular, en comparación con las plantas fertilizadas con fertilizantes sintéticos, y también lo hicieron las no tratadas con MRN (Figura 18). Figura 17. Efecto de los MRN (a) y la aplicación de fertilización mineral y bokashi (b) sobre el peso seco de las raíces (media ± ES; LSD p≤0.05) de plantas de maíz. 33 Figura 18. Raíces de plantas de maíz. De lado izquierdo raíces con MRN y de lado derecho sin MRN. De arriba hacia abajo la fertilización control, nitrógeno y fósforo (NK), nitrógeno, fósforo y potasio (NPK) y bokashi. 6.1.4 Relación raíz follaje Todos los tratamientos registraron una mayor biomasa en la parte aérea que en las raíces. Al comparar dentro de cada tratamiento de fertilización, el manejo de los MRN no tuvo ningún efecto en la respuesta de la relación raíz/follaje. Solo el tratamiento con MRN y fertilización con NPK presentó una mayor relación raíz/follaje que los tratamientos con fertilización orgánica sin importar si estos tenían o no MRN (Figura 19). 34 Figura 19. Efecto de los MRN y el tipo de fertilización sobre la relación raíz follaje (media ± ES; LSD p≤0.05) en plantas de maíz. 6.1.5 Longitud de raíz Los microorganismos rizosféricos nativos disminuyeron de forma significativa la longitud de raíz en todos los escenarios de fertilización (Figura 20). Para los tratamientos sin MRN, la fertilización con bokashi incrementó la longitud de raíz en comparación con la fertilización mineral y el control. Los fertilizantes minerales también aumentaron la longitud de raíz en comparación con el control (Figura 20). Con la presencia de los MRN, sólo el bokashi incrementó significativamente la longitud de la raíz, mientras que el resto de tratamientos fueron estadísticamente similares (Figura 20). 35 Figura 20. Efecto de los MRN y el tipo de fertilización sobre la longitud de raíz por gramo de suelo (media ± ES). 6.1.6 Colonización micorrízica Para el porcentaje de colonización micorrízica sólo se muestran los resultados de los tratamientos con HMA. La colonización, producto de la contaminación, que presentaron los tratamientos con suelo estéril (sin HMA) fue menor al 5%. La fertilización con NK aumentó el porcentaje de colonización en comparación con el resto de los tratamientos. El tratamiento control fue el que obtuvo el menor porcentaje de colonización, mientras que la fertilización con NPK y bokashi no tuvieron diferencias significativas (Figura 21). Figura 21. Efecto de la fertilización mineral y orgánica sobre el porcentaje de colonización micorrízica en raíces de maíz (media ± ES). 6.1.7 Contenido de nitrógeno y fósforo en suelo La caracterización del contenido de nitrógeno y fósforo de las muestras compuestas de suelo (Cuadro 7) mostraron que el suelo fertilizado con NPK y bokashi presentarón mayor cantidad de nitrógeno y fósforo por mg g-1 de suelo aunque esto no fue probado estadísticamente (Figura 22). 36 Cuadro 7. Contenido de nitrógeno y fósforo en muestras compuestas de suelo Nitrógeno (mg kg-1 de suelo) Fósforo (mg kg-1 de suelo) Control 18 82 NK 57 173 NPK 645 676 Bokashi 915 695 Figura 22. Concentración de nitrógeno (a) y fósforo (b) (mg kg-1 de suelo) total de suelo de Napízaro. Muestras compuestas por cada tratamiento de fertilización. 6.2 FASE 2. Efectos de la fertilización mineral y orgánica en los HMA y en dos genotipos de maíz En este experimento se evaluó el efecto de la fertilización mineral (NK y NPK) y orgánica (bokashi) y el manejo de los HMA, sobre el crecimiento de dos genotipos de maíz (nativo e híbrido) a campo abierto. 6.2.1 Peso seco aéreo En la primera cosecha que se realizó, 48 días después de la siembra, se observó que la interacción de fertilización y genotipo tuvo un efecto significativo para el peso seco de la parte aérea (Cuadro 8). En la segunda cosecha, en la etapa de floración del maíz, se encontró que la interacción entre los HMA y la fertilización tuvieron un efecto significativo en el peso seco de la parte aérea (Cuadro 8). Mientras que para la tercera cosecha, que se realizó en la senescencia de la planta, los factores fertilización y genotipo tuvieron un 37 efecto individual significativo sobre el peso seco de la parte aérea (Cuadro 8). Los valores promedio se pueden ver en el Anexo 9 Cuadro 8. Valores de probabilidad (p) a partir del análisis de varianza de peso seco aéreo de la primera, segunda y tercera cosecha *p<0.05 ***p<0.01 ***p<0.001 EFECTOS PRINCIPALES Peso seco aéreo Primera cosecha Segunda cosecha Tercera cosecha HMA 0.2239 0.6912 0.92 Fertilización 0.7143 0.0866 *** Genotipo 0.0648 0.4564 ** HMA x Fertilización 0.9 ** 0.79 HMA x Genotipo 0.2385 0.1664 0.33 Fertilización x Genotipo * 0.3528 0.56 HMA x Fertilización x Genotipo 0.8829 0.505 0.65 En la primera cosecha, el genotipo híbrido presentó un mayor peso seco de follaje que el genotipo nativo en los tratamientos control (Figura 23 a). En el genotipo híbrido, la fertilización con NPK y bokashi disminuyeron significativamente el peso seco de la parte aérea en comparación con el control (Figura 23a). Ninguno de los fertilizantes estimuló la biomasa del follaje del genotipo nativo (Figura 23a). En la segunda cosecha, el efecto de la fertilización mineral, orgánica y tratamiento control sobre la acumulación de biomasa aérea fue estadísticamente similar en todos los tratamientos donde se eliminaron los MRN (Figura 23b). Los MRN en combinación con el fertilizante NK provocaron una disminución de la biomasa aérea en comparación con la fertilización con bokashi y el tratamiento control (Figura 23 b). El bokashi en combinación con los MRN promovieron una mayor biomasa aérea en comparación con el tratamiento control sin hongos micorrízicos. El tratamiento con bokashi sin MRN presentó un mayor peso seco aéreo en comparación al fertilizante NK con MRN (Figura 23b). Para la tercera cosecha, las plantas de maíz nativo presentaron un mayor peso seco aéreo en comparación con las plantas del genotipo híbrido (Figura 23c). Los tratamientos que recibieron fertilización mineral (NK y NPK) presentaron un incremento del peso seco de la parte aérea en comparación con la fertilización orgánica (bokashi) y el control (Figura 23c). 38 Figura 23. Efectos sobre el peso seco de la parte aérea. En la primera cosecha se observa el efecto del genotipo y distintos tipos de fertilizantes (a); en la segunda cosecha el efecto de a) 35 a ab ~ 30 Cl -o 25 Q) ... -Q) ro 20 o (J 15 Q) IIJ o 10 IIJ Q) 5 D.. O Control NK NPK Bokashi D Nativo _ Híbrido b) 150 § abe a o ~ 100 -Q) ro o (J Q) IIJ 50 o IIJ Q) D.. o Control NK NPK Bokashi D Sin HMA _ ConHMA e) a a § 'O o ~ a O> -O> ~ .. -O> o .. " o .. " '" O> o b '" '" ~ 1 .. Q. .. -;;; 5 . IL o ...J O Control NK NPK Bokashi Nativo Hibrido 39 la interacción de los HMA y fertilizantes (b); en la tercera cosecha los efectos individuales de los fertilizantes y el genotipo (c); (media ± ES). 6.2.2 Peso seco de raíz En la primera cosecha el peso seco de la raíz presentó un efecto significativo con el factor HMA. Para la segunda cosecha
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