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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
EFECTO DE LA CARBONATACIÓN APLICADA A UNA LECHE 
FERMENTADA, SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA VIABILIDAD DE 
Bifidobacterium sp. 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
QUÍMICA DE ALIMENTOS 
 
 
PRESENTA 
DENNIS ANDIVY MARCELA ARCINIEGA BAUTISTA 
 
 
 
 MÉXICO, D.F. 2011 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Amelia María de Guadalupe Farrés González Saravia 
VOCAL: María del Carmen Wacher Rodarte 
SECRETARIO: Rina María González Cervantes 
1er. SUPLENTE: Aurora Irma Ortegón Ávila 
2° SUPLENTE: Aleida Mina Cetina 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLO EL TEMA: 
 
 Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Departamento de 
Sistemas Biológicos. Laboratorio de Biotecnología. 
 
 
 Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química, Departamento de 
Alimentos y Biotecnología. Laboratorio 324. 
 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
 
 
 
Dra. Rina María González 
Cervantes 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
 
 
 
Dra. Gloria Díaz Ruíz 
SUSTENTANTE: 
 
 
 
Dennis Andivy Marcela 
Arciniega Bautista 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis papás por darme la fortuna de la vida, por apoyarme por sobre todas las cosas, por 
los consejos, por tener un abrazo que me aliente a seguir adelante y por todo el amor... 
 
A Lynette por arreglar los días más grises con una sonrisa y un abrazo. A Lily y a Yuri por 
escucharme, alentarme, por su cariño y compañía... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mi Universidad por darme la oportunidad de pertenecer a ella, por formarme como 
profesionista, por permitirme conocer a las personas que me han acompañado desde 
hace diez años, y sobre todo por enseñarme mucho de lo que poco que hasta ahora sé. 
 
A la Universidad Autónoma Metropolitana por abrirme sus puertas y recibirme con la 
calidez con la que se siente el estar en casa. 
 
A las Dras. Rina y Gloria por lo aprendido, la confianza, paciencia, aliento y sobre todo por 
el tiempo que siempre tuvieron desde un principio y hasta el final de este proyecto. 
 
A las Dras. Carmen Wacher y Amelia Farrés por sus atenciones, apoyo y tiempo para 
culminar este trabajo. 
 
A las facilidades para realizar esta tesis de los profesores Arturo Navarro, Hilda y Rebeca 
de la UNAM, y a las personas que trabajan en el laboratorio de Biotecnología de la UAM, 
en especial al Dr. Alejandro al profesor Hugo y a la profesora Gloria. 
 
A mis profesores de la universidad por las enseñanzas y por permitirme ir más allá de lo 
académico bridándome su confianza para emprender cosas nuevas. 
 
A mis compañeros de la facultad y a mis amigos Aarón, Adrián, Alexis, Ana Gaby, Ana 
Laura, Ania, Cinthya, Diana, Héctor, Ireri, Itzia, Jess, Lili, Marco, Maty y Zaine por todos los 
momentos compartidos en la carrera, por los que aún seguimos compartiendo y por 
todos los que vienen. 
 
 
A la gran familia PUMITAS en especial a Migue, Chino, Luis, David y Andrea por haber 
llegado en un momento tan difícil, por el cariño, por lo que me han enseñado, por las risas 
y por hacer que recordara los pequeños grandes detalles que alegran la vida. 
 
A mis primos y tíos que a pesar de todas las adversidades siempre están presentes. 
 
A mis amigas incondicionales de toda la vida Angelita, Paula y Jessica. A Amely por el 
aliento, amistad, y por hacer que un par de tenis encontrara metas logradas. A todas las 
personas que han dejado una huella en mi vida y a la Rueda. 
 
A la vida porque todos los días me sorprende y siempre me da una presencia cálida para 
acompañarme. 
 
ÍNDICE 
 Página 
RESUMEN 1 
1. INTRODUCCIÓN 3 
2. ANTECEDENTES 
2.1. Definición de probiótico 5 
2.2. Definición de prebiótico 5 
2.3. Alimentos funcionales 6 
2.4. Productos lácteos fermentados 6 
2.5. Consumo de probióticos y sus beneficios 8 
2.6. Microbiota gastrointestinal 10 
2.7. Criterios a considerar para que a un microorganismo se le atribuya el efecto 
de probiótico 
11 
2.8. Microorganismos probióticos 11 
2.9. Género Bifidobacterium sp. 12 
2.9.1. Bifidobacterium y sus beneficios en la salud 12 
2.9.2. Características del género 15 
2.9.3. Métodos de aislamiento e identificación 18 
2.9.4. Condiciones de anaerobiosis para Bifidobacterium sp. 20 
2.10. Tipos de productos lácteos fermentados para beber 21 
2.10.1. Bebidas de yogurt carbonatadas endulzadas y/o saborizadas 21 
2.11. La aplicación de dióxido de carbono en bebidas 23 
2.11.1. Otros efectos del dióxido de carbono y su mecanismo de acción 25 
2.11.2. Sistemas de aplicación en la industria 26 
2.12. Métodos de detección de dióxido de carbono en bebidas carbonatadas 27 
2.12.1. Método oficial AOAC 940.17. Dióxido de carbono en cerveza. 
Método manométrico 
29 
2.12.2. Método oficial AOAC 960.21. Dióxido de carbono en vinos. Método 
volumétrico 
30 
2.12.3. Método oficial AOAC 988.07. Dióxido de Carbono en vinos. Método 
por titulación 
30 
3. JUSTIFICACIÓN 31 
4. OBJETIVOS 
3.1. Objetivo General 32 
3.2. Objetivos Específicos 32 
5. HIPÓTESIS 33 
6. METODOLOGÍA 34 
6.1. Selección de cepas 35 
6.1.1. Preparación de células para conservación 36 
6.1.2. Pureza de las cepas 36 
6.1.3. Preparación de los medios de cultivo líquidos en anaerobiosis 37 
6.1.4. Estimación de parámetros cinéticos del inóculo inicial 37 
6.2. Métodos de aplicación de dióxido de carbono para lograr diferentes 
concentraciones en los medios de cultivo 
38 
6.2.1. Aplicación directa de dióxido de carbono por burbujeo 38 
6.2.2. Aplicación de dióxido de carbono utilizando agua gasificada 39 
6.2.2.1. Selección de las proporciones de agua gasificada a utilizar 
para la preparación de los medios de cultivo 
38 
6.2.3. Aplicación de dióxido de carbono en leche descremada reconstituida 
al 4% p/v utilizando agua gasificada 
40 
6.3. Técnica para la determinación de la concentración de dióxido de carbono en 
los medios de cultivo 
40 
6.4. Fermentaciones 41 
6.4.1. Parámetros de evaluación del crecimiento de Bifidobacterium sp. 
durante las fermentaciones 42 
6.4.1.1. Densidad óptica 42 
6.4.1.2. Acidez titulable 43 
6.4.1.3. pH 43 
6.4.1.4. Evaluación de la viabilidad de Bifidobacterium sp. durante las 
fermentaciones 
43 
6.4.1.5. Cuantificación de ácido acético y ácido láctico por medio de 
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) 
44 
6.4.1.6. Análisis del rendimiento de la fermentación de 
Bifidobacterium animalis en leche descremada 4% p/v 
44 
6.5. Análisis estadístico de los resultados 45 
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
7.1. Selección de cepas 46 
7.1.1. Conteo en placa de células viables y confirmación de la pureza de las 
cepas 
46 
7.1.2. Fermentación para la estimación de parámetros cinéticos del inóculo 47 
7.2. Variación de la concentración de dióxido de carbono en los medios de 
cultivo 
48 
7.2.1. Aplicación directa de dióxido de carbono por burbujeo 48 
7.2.2. Evaluación del crecimiento y viabilidad de B. animalis bajo diferentes 
concentraciones de dióxido de carbono 
52 
7.2.3. Aplicación de dióxido de carbono utilizando agua gasificada 55 
7.2.4. Fermentación de B. animalis en los medios decultivo: TPY con 
glucosa, leche descremada 4% y 8% p/v sin gasificar 
56 
7.2.5. Concentración de dióxido de carbono en leche descremada al 4% p/v 
adicionando diferentes proporciones de agua gasificada y agua 
destilada 
57 
7.2.5.1. Evaluación del crecimiento y viabilidad de B. animalis en leche 
descremada 4% p/v gasificada 
59 
7.2.6. Análisis de la producción de ácido acético y ácido láctico de B. 
animalis en leche descremada 4% p/v gasificada 
63 
8. CONCLUSIONES 68 
9. RECOMENDACIONES 70 
10. ANEXOS 
A. Composición de los medios de cultivo y soluciones 71 
B. Curva patrón para la cuantificación de ácido acético y ácido láctico por medio 
de cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) 
75 
C. Análisis estadístico de la concentración de CO2 aplicado por burbujeo en caldo 
MRS-Cys y en agua destilada 
76 
D. Análisis estadístico de la viabilidad de B. animalis en caldo MRS-Cys bajos dos 
concentraciones de CO2 
74 
E. Análisis estadístico de la concentración de CO2 adicionando agua gasificada en 
LD 4% p/v y en agua (blanco de referencia) 
75 
F. Análisis estadístico de la viabilidad de B. animalis a las 10 horas de 
fermentación en LD 4% p/v gasificada 
77 
11. BIBLIOGRAFÍA 78 
 
1 
 
RESUMEN 
 
Se ha incrementado el interés por el estudio de los organismos probióticos y su aplicación 
en productos de consumo humano debido a los beneficios que se le atribuyen. Existen 
numerosos productos lácteos fermentados en el mercado, elaborados a base de yogurt, 
que utilizan como cultivos iniciadores las cepas Lactobacillus y Streptococcus, los que 
recientemente se han innovado con la inclusión de bifidobacterias. Sin embargo, en 
México, debido a la complejidad de manipulación de estos microorganismos por su 
naturaleza anaerobia, en ningún producto comercial se incluye exclusivamente a este 
género. 
 
En este trabajo se propone evaluar el desarrollo y viabilidad de Bifidobacterium sp. en un 
producto lácteo bajo diferentes condiciones de dióxido de carbono con el fin utilizarlo en 
un producto comercial, en el que la carbonatación ligera será una manera de hacer esta 
opción más atractiva al consumidor. 
 
Se aplicó dióxido de carbono a un medio de cultivo lácteo, en el que se utilizaron mezclas 
en diferentes proporciones de agua gasificada y agua destilada. La concentración de 
dióxido de carbono en los medios de cultivo se determinó adecuando una metodología 
analítica de la AOAC utilizada en la industria vitivinícola. 
 
Se estandarizaron los concentrados celulares de dos cepas, B. adolescentis y B. animalis, y 
se determinaron los parámetros cinéticos de velocidad específica de crecimiento (µ) y 
tiempo de duplicación (td) en caldo MRS adicionado con cisteína (MRS-Cys). Con estos 
resultados fue posible realizar una fermentación utilizando un inóculo de células 
fisiológicamente activas. 
 
Se evaluó el desarrollo de B. animalis en leche descremada al 4% p/v (LD 4%) y gasificada, 
monitoreando el pH y la producción de acidez, se tuvo a la par un control de la misma 
2 
 
fermentación en caldo TPY con glucosa (TPY-G). Así mismo bajo las diferentes 
concentraciones de dióxido de carbono se evaluó la viabilidad de la cepa, en donde se 
encontró un valor mayor en la condición que utilizó un 40% de agua gasificada para la 
preparación del medio de cultivo con 165.4 mg de CO2/100 mlmuestra. 
 
Al analizar la concentración de los principales productos de fermentación (ácido acético y 
láctico) de la cepa en el medio lácteo gasificado y sin gasificar se encontró que las 
concentraciones se incrementan en relación a un medio de cultivo control (TPY-G sin 
gasificar). 
 
Los resultados indican que en una fermentación de B. animalis en presencia de lactosa y 
cierta concentración de dióxido de carbono (165.4 mg CO2/100 mlmuestra), la producción de 
biomasa se favorece, más que la producción de metabolitos de fermentación por unidad 
celular. Bajo estas condiciones resulta factible proponer el diseño una bebida láctea 
probiótica gasificada. 
 
 
 
3 
 
1. INTRODUCCION 
 
Las bifidobacterias poseen metabolismo heterofermentativo, producen acetato y lactato 
a partir de glucosa (Ostile et al., 2005); son bacterias anaerobias Gram positivas que 
habitan naturalmente el tracto gastrointestinal tanto de humanos como de animales, a las 
cuales se les han atribuido efectos benéficos a la salud (Jay, 1994). Comúnmente se 
utilizan en preparaciones de productos probióticos, tanto en alimentos como en 
presentaciones farmacéuticas. 
 
El término probiótico se refiere a microorganismos vivos que sobreviven el paso a través 
del tracto gastrointestinal, que producen efectos benéficos al organismo (De Ross y 
Katan, 2000). Los probióticos son capaces de estimular, así como de regular varios 
aspectos del sistema inmune. Existe evidencia que el consumo de probióticos es efectivo 
en la prevención y/o manejo de gastroenteritis, diarrea y trastornos intestinales 
inflamatorios, como colitis ulcerativa, la enfermedad de Crohn y algunos casos pediátricos. 
Se ha encontrado también cierta relación en la regulación de los niveles de colesterol en el 
organismo, la prevención de cáncer, alivio al estreñimiento y a malestares causados por la 
intolerancia a la lactosa (De Ross y Katan, 2000; Leahy et al., 2005; Teitelbaum y Walker, 
2002). 
 
Uno de los aspectos tecnológicos a ser considerados en la selección de cepas probióticas, 
es la viabilidad de los microorganismos durante el procesamiento de los productos en los 
que van a estar incluidos. Entre los factores significativos que afectan la viabilidad de las 
bifidobacterias está el oxígeno, debido a que las especies de bifidobacterias no poseen ni 
cadena respiratoria ni catalasa, por ello es que se les considera como anaerobios estrictos 
(Jay, 1994). Estos organismos comúnmente se incluyen en bebidas lácteas fermentadas en 
conjunto con otros microorganismos, pero nunca como únicas cepas probióticas debido a 
la dificultad de su manejo. 
4 
 
Una de las estrategias con la que se puede contrarrestar la dificultad de crecimiento de 
estas bacterias en presencia de oxígeno es la aplicación de dióxido de carbono (CO2), ya 
que este gas es capaz de promover un ambiente de anaerobiosis debido a su capacidad de 
desplazar al oxígeno del medio (Lück, 2000). Una alternativa para mantener condiciones 
de anaerobiosis en un producto probiótico sería la carbonatación del medio en donde se 
van a incluir. 
 
En la actualidad, las bebidas carbonatadas son productos muy populares, ya que los 
consumidores disfrutan la sensación que produce el burbujeo de CO2, pues se estimulan 
algunos receptores en la cavidad bucal (Descoins et al., 2006). La presencia del gas en la 
bebida cumpliría con dos propósitos: mantener la viabilidad de las bifidobacterias 
mediante la generación de un ambiente anaerobio y utilizar como vehículo una bebida de 
alta aceptación para el consumidor. Por ello es importante evaluar el efecto de la 
carbonatación a diferentes concentraciones de dióxido de carbono sobre el crecimiento y 
viabilidad de estas bacterias. 
 
Un producto lácteo carbonatado al que se le han adicionado bacterias probióticas, se 
puede considerar como un alimento funcional; estos proveen ventajas adicionales al valor 
nutritivo y derivan en beneficios fisiológicos al consumidor si se consumen como parte de 
una dieta normal (Dwyer, 2007). 
 
En este trabajo se evaluó el efecto del dióxido de carbono sobre el crecimiento y la 
viabilidad de Bifidobacterium sp. con el fin de proponer la carbonatación como opción en 
el desarrollo de productos probióticos utilizando estos microorganismos. 
 
 
5 
 
2. ANTECEDENTES 
 
2.1. Definición de probiótico 
 
El término probiótico, significa literalmente “a favor de la vida” (Klaenhammer, 2001). Y se 
refiere a microorganismos vivos que sobreviven el paso a través del tracto gastrointestinaldando efectos benéficos al organismo (De Ross y Katan, 2000). También se podría definir 
como “una preparación o un producto que contiene microorganismos definidos viables en 
números suficientes para alterar la microbiota gastrointestinal, (por implantación o 
colonización), en un compartimiento del hospedero y debe ejercer efectos positivos para 
la salud de éste” (Teitelbaum y Walker, 2002). 
 
A lo largo del tiempo, el término ha sido objeto de discusión entre los expertos y se han 
sugerido numerosas definiciones; en el 2001 la FAO (Food and Agriculture Organisation) 
en conjunto con la WHO (World Health Organisation) definieron como probióticos a los 
“microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un 
beneficio de salud en el hospedero” (www.usprobiotics.org, 2010). 
 
2.2. Definición de prebiótico 
 
Los prebióticos se definen como ingredientes alimenticios no digeribles que afectan 
benéficamente al hospedero selectivamente, estimulando el crecimiento y/o actividad 
metabólica de una o de un número limitado de bacterias en el colon principalmente. Son 
típicamente oligosacáridos, y el concepto tiene fundamentalmente el mismo objetivo que 
el de los probióticos, el cual es mejorar la salud del hospedero modulando la microbiota 
intestinal aunque por otra vía (Leahy et al., 2005). Se sabe que el consumo de 
oligosacáridos favorece a la proliferación de bifidobacterias en el colon, las cuales son 
antagónicas de las bacterias de putrefacción y reducen la formación de productos de 
6 
 
fermentación tóxicos. Cuando un alimento o producto contiene tanto probióticos como 
prebióticos, es denominado simbiótico (Mazza, 2000). 
 
2.3. Alimentos funcionales 
 
La expresión de alimentos funcionales se introdujo en los años ochenta en Japón y se ha 
utilizado para describir alimentos que tienen algún beneficio sobre la salud y valores 
nutricionales básicos. Por lo que la elaboración de un alimento con microorganismos que 
desempeñen funciones de probióticos, son considerados como alimentos funcionales 
(Leahy et al., 2005). En la industria esta expresión se utiliza para referirse a alimentos que 
proporcionan determinados efectos fisiológicos benéficos no nutricionales que pueden 
mejorar la salud (Mazza, 2000). 
 
A diferencia de los alimentos funcionales, un producto nutracéutico es el que se elabora a 
partir de un alimento, pero que se vende en forma de píldoras, polvos u otras 
presentaciones farmacéuticas, que han demostrado tener propiedades fisiológicas 
benéficas. Un alimento funcional debe tener la forma de “alimento” y no de concentrado, 
(como sería el caso de un producto nutracéutico), se consume como parte de una dieta 
normal y, además de su función nutritiva básica, presenta propiedades fisiológicas 
benéficas y/o reduce el riesgo de contraer enfermedades crónicas (Mazza, 2000). 
 
2.4. Productos lácteos fermentados 
 
Desde la época de Metchnikoff (1908), los científicos han estudiado los efectos benéficos 
para la salud de los productos lácteos fermentados como el yogurt, kéfir o varios tipos de 
leches fermentadas. En este tipo de productos la funcionalidad está ligada a las bacterias 
lácticas y a los productos metabólicos que resultan de su interacción con el medio lácteo. 
 
 
7 
 
 
 
Tabla 2.1. Productos lácteos fermentados disponibles en el mercado de México. 
 
TIPO DE PRODUCTO 
 
Denominación/ Marca /Contenido Neto 
TIPO Y CONTENIDO DE BACTERIAS 
 BENÉFICAS VIVAS 
Tipo UFC/g (x106) 
A
lim
e
n
to
 lá
ct
e
o
 f
er
m
en
ta
d
o
 
 b
at
id
o
 
Alimento lácteo fermentado sin grasa con 
fresa/ Vitalinea Danone /150 g 
Lactobacillus y Streptococcus 360 
Bifidobacterium 16000 
Alimento lácteo fermentado sabor fresa/ 
Soful Yakult /108 g 
Lactobacillus y Streptococcus 92 
Lactobacillus casei shirota 30 a 440 
Compuesto lácteo fermentado natural con 
bificápsulas/ Yoplait Yoplus /150 g 
Lactobacillus y Streptococcus 3000 
Bifidobacterium 240 
Alimento lácteo fermentado con fibra y 
bifidus de fresa/ LALA Vive Vitalle /125 g 
Lactobacillus y Streptococcus 4000 
Bifidobacterium 18 a 180 
Alimento lácteo fermentado con frutas y 
vegetales/ Alpura Vivendi Defensas /160 g 
Lactobacillus y Streptococcus 420 
Bifidobacterium 31 
Alimento lácteo fermentado natural/ 
Activia Danone /125 g 
Lactobacillus y Streptococcus 450 
Bifidobacterium 590 
P
ro
d
u
ct
o
 lá
ct
e
o
 
fe
rm
e
n
ta
d
o
 
Producto lácteo fermentado/ 
 Chamyto Nestlé /80 g 
Lactobacillus paracasei 0.6 a 20 
Producto lácteo fermentado/ 
Yakult /80 ml 
Lactobacillus casei shirota 140 a 200 
Producto lácteo fermentado/ 
Bonacult /120 ml 
Lactobacillus casei 
rhamnosus 
0.7 a 1.3 
A
lim
en
to
 lá
ct
e
o
 p
ar
a 
b
eb
er
 
y 
 b
eb
id
a 
lá
ct
e
a 
fe
rm
en
ta
d
a 
Bebida láctea fermentada con fresa light 
0% grasa con bificápsulas/ 
Yoplait Yoplus /250 g 
Lactobacillus y Streptococcus 6200 
Bifidobacterium 630 
Alimento lácteo fermentado natural/ 
Activia Danone /250 g 
Lactobacillus y Streptococcus 120 a 1400 
Bifidobacterium 47 a 130 
Alimento lácteo fermentado sin grasa con 
fresa/ Vitalinea Danone /250 g 
Lactobacillus y Streptococcus 530 a 600 
Bifidobacterium 0.3 
Alimento lácteo fermentado contiene 
bifidobacterias y fibra soluble/ Masau 
Good Digestion /250 g 
Lactobacillus y Streptococcus 230 
Bifidobacterium 27 
Bebida láctea fermentada sabor natural/ 
LALA Bio 4 /120 g 
Lactobacillus y Streptococcus 1700 
Lactobacillus casei 6 a 23 
Fuente: PROFECO, 2006. 
 
 
8 
 
El procesamiento de estos productos fermentados no es en principio muy complejo, pues 
consiste básicamente en la incubación de la leche con el fermento en condiciones 
controladas de temperatura en tanques de fermentación. Puede ser necesario modificar 
determinadas etapas del proceso, como tratamientos térmicos y de filtración con 
membrana, así como la formulación del producto (Mazza, 2000). 
 
Uno de los productos lácteos fermentados más común de consumo humano es el yogurt, 
el cual usualmente se elabora a partir de dos tipos de microorganismos Lactobacillus 
delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus 
(microorganismos incluidos en el grupo genérico de bacterias ácido lácticas). Durante su 
fermentación se producen aminoácidos, dióxido de carbono y formato, metabolitos que 
actúan estimulando el crecimiento de ambas cepas, para finalmente tener como 
productos ácido láctico y acetaldehído, los cuales le confieren un sabor característico al 
yogurt (Lee, 2006). En los últimos años ha resurgido el interés sobre estos 
microorganismos al considerarse ahora como agentes probióticos y terapéuticos (Lee, 
2006), incluso se ha trabajado en optimizar este tipo de productos añadiéndoles cepas del 
género Bifidobacterium (Varnam et al., 1995). 
 
Además de los yogurts batidos o para beber naturales y/o saborizados; se pueden 
encontrar otros productos lácteos fermentados, los que en su gran mayoría se elaboran a 
partir de las bacterias ácido lácticas comúnmente utilizadas, y que pueden contener 
además bifidobacterias u otra especie de lactobacilos, en la tabla 2.1. se presentan 
algunos ejemplos de estos disponibles en el mercado mexicano (PROFECO, 2006). 
 
2.5. Consumo de probióticos y sus beneficios 
 
La historia de los probióticos comenzó cuando el Dr. Elie Metchnikoff pionero en su 
estudio y que ganó el premio Nobel en base a su hipótesis de que la longevidad de los 
caucásicos aparentemente se debía a que consumían grandes cantidades de productos 
9 
 
lácteos fermentados como el requesón y la mantequilla. Él creía que el acido láctico de las 
bacterias en los productos eliminaba a los organismos nocivos en los intestinos y por lo 
tanto se reducía la producción de toxinas que conducen a enfermedades e infecciones; 
sugirió que “la dependencia de los microbios intestinales en los alimentoshace posible 
adoptar medidas para modificar la microbiota en nuestros organismos y reemplazar 
microorganismos dañinos por microorganismos útiles” (Leahy et al., 2005). 
 
En la actualidad se siguen haciendo investigaciones acerca de los beneficios asociados al 
consumo de organismos probióticos. Cada vez existe más información en cuanto a tipos y 
cantidades adecuadas de consumo. Diversos estudios han demostrado que los probióticos 
ayudan a restaurar el equilibrio de la microbiota intestinal y su consumo regular puede 
fortalecer las defensas naturales del organismo (www.usprobiotics.org, 2010). 
 
Entre muchos otros beneficios, algunas investigaciones sugieren que los probióticos 
pueden: 
 
 Producir riboflavina, niacina, tiamina, vitamina B6, B12 y ácido fólico 
 Incrementar la absorción de minerales 
 Mejorar la intolerancia a la lactosa 
 Prevenir varios tipos de cáncer (sobre todo de colon) 
 Reducir el colesterol sérico 
 Reducir el desarrollo de algunas alergias en niños 
 Reducir problemas de estreñimiento 
 Disminuir el riesgo de padecer caries dental causada por microorganismos 
 Disminuir la colonización de Helicobacter pylori en el estómago 
 Mejorar la función inmunológica reduciendo así las infecciones gastrointestinales 
(p. ej. diarrea) 
 Ayudar a restaurar la microbiota intestinal dañada por terapias con antibióticos 
 Impedir el crecimiento y colonización de bacterias patógenas y así combatir 
enfermedades por medio de la producción de ácidos acético y láctico; y 
bacteriocinas 
Fuente: Mazza, 2000; www.usprobiotics.org, 2010. 
 
http://www.usprobiotics.org/
10 
 
Los probióticos tienen su lugar de acción sobre el intestino, y ahí deben mantener su 
capacidad de desarrollarse (Teitelbaum y Walker, 2002). 
 
2.6. Microbiota gastrointestinal 
 
El tracto gastrointestinal es un hábitat natural para una microbiota compleja. Su 
colonización comienza desde el nacimiento y es en el colon en donde se encuentra 
concentrada la mayor población microbiana del cuerpo humano. La microbiota del 
intestino de un adulto consiste predominantemente de microorganismos anaerobios 
facultativos y anaerobios obligados o estrictos como son Bacteroides, Bifidobacterium, 
Eubacterium, Clostridium, Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Escherichia, 
Enterobacter, Enterococcus, Klebsiella, Lactobacillus y Proteus (Leahy et al., 2005). 
 
La microbiota intestinal tiene un papel importante en determinar la salud de un individuo, 
ya que influye en las actividades metabólicas del intestino y sobre el sistema 
inmunológico, proveyendo protección a los hospederos que lo colonizan compitiendo así 
con microorganismos patógenos (Madigan et al., 2000). El metabolismo microbiano 
también está relacionado con la formación de ácidos grasos de cadena corta, la 
producción de vitamina K y la absorción de iones. Además, la microbiota intestinal actúa 
como modulador vital del sistema inmune (Leahy et al., 2005). 
 
Para que estas actividades metabólicas se puedan llevar a cabo es necesario que exista un 
equilibrio en la microbiota gastrointestinal, el cual se logra cuando el número de bacterias 
benéficas es mucho mayor que el de las bacterias dañinas. La mala alimentación, estrés, 
consumo de medicamentos, edad, exceso en la ingestión de alcohol y la falta de higiene 
son factores que pueden causar desequilibrio (Mazza, 2000). 
 
 
 
11 
 
2.7. Criterios a considerar para que a un microorganismo se le atribuya el efecto 
de probiótico 
 
Para que una bacteria sea considerada como probiótica existen diferentes criterios que 
deben ser tomados en cuenta. En la tabla 2.2. se muestran algunos de ellos. 
 
Para que el consumidor se beneficie realmente del efecto fisiológico de estos organismos 
a partir de un producto comercial, se debe conseguir que estas bacterias probióticas, 
sobrevivan en concentraciones suficientemente altas, típicamente mayores a 106 células 
viables/ml y se debe consumir una cantidad mayor a 100 ml al menos dos veces por 
semana (Mazza, 2000). 
 
Tabla 2.2. Características de microorganismos probióticos. 
 Ser de naturaleza no patógena 
 Ser resistentes a la destrucción por ácidos gástricos y biliares 
 Ser capaces de adherirse al tejido epitelial intestinal 
 Ser capaces de colonizar el tracto gastrointestinal 
 Producir sustancias antimicrobianas 
 Modular respuestas inmunes 
 Tener influencia sobre actividades metabólicas (por ej. asimilación 
de colesterol, producción de vitaminas, etc.) 
Fuente: De Ross y Katan, 2000; Teitelbaum y Walker, 2002. 
 
2.8. Microorganismos probióticos 
 
Debido al gran interés científico e industrial en las bacterias probióticas, en la actualidad 
podemos encontrar productos comerciales probióticos como cápsulas, polvos, yogurts, 
productos lácteos fermentados y leches. Las bacterias productoras de ácido láctico son 
componentes comunes en este tipo de preparaciones. Algunos ejemplos de 
microorganismos probióticos son Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus y 
Bifidobacterium bifidum. Se consideran también como microorganismos probióticos 
algunos enterococos y enterobacterias e inclusive algunas levaduras, tabla 2.3. (De Ross y 
Katan, 2000; Klaenhammer, 2001; Leahy et al., 2005). 
12 
 
Tabla 2.3. Especies de microorganismos probióticos. 
Género Especie Género Especie 
Saccharomyces boulardii 
Lactobacillus 
acidophilus 
Streptococcus 
salivarius subsp. delbrueckii subsp. bulgaricus 
thermophilus casei 
Bifidobacterium 
breve fermentum 
longum Johnsonii 
lactis paracasei 
Lactobacillus 
plantarum rhamnsosus 
reuteri salivarius 
Fuente: Klaenhammer, 2001. 
 
2.9. Género Bifidobacterium sp. 
 
Las bifidobacterias fueron aisladas a partir de heces de niños alimentados con leche 
materna y descritas en el periodo de 1899 - 1900 por Henry Tissier, un pediatra Francés. 
Por su morfología se nombraron Bacillus bifidum (Leahy et al., 2005). 
 
Posteriormente, Orla-Jensen en 1924 reconoció la existencia del género Bifidobacterium 
como un taxón separado, pero debido a algunas similitudes bioquímicas y taxonómicas 
con el género Lactobacillus, las bifidobacterias fueron incluidas en este género. Más 
adelante, en 1974 se reconoció al género Bifidobacterium sp. como independiente, 
definiéndose como ahora lo conocemos “bacilos irregulares, no esporulados, Gram 
positivos” (Biavati et al., 2006). Están representadas por alrededor de 30 especies, que 
han sido aisladas principalmente del tracto gastrointestinal de diversos animales y 
humanos, tabla 2.4. (Leahy et al., 2005). Las especies del género Bifidobacterium no son 
patógenas excepto las que son aisladas de caries dentales (Biavati et al., 2006). 
 
2.9.1. Bifidobacterium y sus beneficios en la salud 
 
Desde inicios del siglo pasado las bifidobacterias se han considerado organismos clave en 
la interacción con otros microorganismos, y se cree que tienen un papel importante en 
13 
 
mantener la salud del tracto gastrointestinal. Aún no están definidos del todo los 
mecanismos de estas bacterias para realizar tales beneficios. Se espera que la 
secuenciación de genomas de bacterias probióticas proporcione mayor información con el 
fin de entender mejor sus mecanismos de acción en el organismo humano (Leahy et al., 
2005). 
 
Algunos de los beneficios atribuidos al consumo de bacterias del género Bifidobacterium 
se muestran en la tabla 2.5. 
 
Tabla 2.5. Beneficios a la salud atribuidos al consumo de bifidobacterias. 
 Alivio a estreñimiento 
 Alivio a malestares causados por la intolerancia a la lactosa, e incluso 
pueden aumentar el nivel de tolerancia a esta. 
 Combatir la llamada “diarrea del viajero” 
 Estimulación del sistema inmune 
 Prevención de cáncer 
 Prevención y/o manejo de desórdenes intestinales inflamatorios, 
como colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn 
 Prevención y/o manejo de gastroenteritis agudaRegulación de los niveles de colesterol 
 Tratamiento de diarrea asociada a antibióticos y diarrea por rotavirus 
 Tratamiento de resistencia a infecciones microbianas 
Fuente: De Ross y Katan, 2000; Teitelbaum y Walker, 2002; Leahy et al., 2005. 
 
Los efectos benéficos atribuidos a la presencia de bifidobacterias en el tracto 
gastrointestinal dependen de su viabilidad y actividad metabólica, promovidas por 
carbohidratos complejos y otros factores bifidogénicos, que son en su mayoría 
oligosacáridos de cadena corta (3-10 unidades de monosacáridos) con propiedades 
funcionales especiales, ya que no son fácilmente digeridos y al parecer estimulan el 
crecimiento de bifidobacterias y lactobacilos, aumentan la biodisponibilidad del calcio y el 
magnesio e incluso impiden algunas fases de la carcinogénesis (Mazza, 2000). 
 
 
14 
 
Tabla 2.4. Hábitat de algunas especies del género Bifidobacterium. 
Especie Fuente 
B. adolescentis Heces de infantes y adultos, apéndice, caries dentales y 
vagina 
B. angulatum Heces de adultos 
B. animalis Heces de ratas, pollos, conejos y terneros 
B. asteroides Abejas 
B. bifidum Heces de infantes y adultos; vagina 
B. boum Rumen y heces de cerdos 
B. breve Heces de infantes y vagina 
B. catenulatum Heces de infantes, adultos y vagina 
B. choerinum Heces de cerdos 
B. coryneforme Abejas 
B. cuniculi Heces de conejos 
B. denticolens Caries dentales de humanos 
B. dentium Caries dentales de humanos, cavidad oral y heces de 
adultos 
B. gallicum Heces de adultos 
B. gallinarium Heces de pollos 
B. infantis Heces de infantes y vagina 
B. inpinatum Caries dentales de humanos 
B. lactis Leche fermentada 
B. longum Heces de infantes y adultos y vagina 
B. magnum Heces de conejos 
B. merycicum Rumen 
B. minimum Alcantarillado 
B. pseudocatenulatum Heces de infantes 
B. pseudolongum sp. Cerdos, ratas, heces de pollos, terneros y rumen 
B. pseudolongum subsp. 
globosum 
Heces de cerdos, ratas, conejos, terneros, corderos y 
rumen 
B. psychraerophilum Heces de cerdos 
B. pullorum Heces de pollos 
B. ruminantium Rumen 
B. saeculare Heces de conejos 
B. scardovii Heces de adultos 
B. subtile Alcantarillado 
B. suis Heces de cerdos 
B. thermacidophilum Digestor anaeróbio 
B. thermophilum Heces de cerdos, pollos y terneros; rumen 
B. thermoacidophilum 
subsp. porcimun 
Heces de cerdos 
Fuente: Leahy et al., 2005. 
 
15 
 
2.9.2. Características del género 
 
Las bacterias del género Bifidobacterium se caracterizan por ser anaerobias, Gram 
positivas, no productoras de gas, no móviles, no tienen cápsula, no forman esporas; su 
apariencia es variable y se pueden encontrar curveadas, bifurcadas en forma de Y y V, 
pueden estar aisladas, o agrupadas en cadenas o grupos (Leahy et al., 2005; Biavati et al., 
2006). 
 
Son negativas a las pruebas de indol, catalasa (excepto para B. indicum y B. asteorides 
cuando crecen en presencia de aire), y oxidasa. Producen vitaminas, principalmente las 
del grupo B, también producen enzimas digestivas como caseína, fosfatasa y lisozima. Y 
aunque están descritas como bacterias anaeróbicas estrictas, algunas cepas pueden 
tolerar ciertas concentraciones de oxígeno pero solo en presencia de dióxido de carbono. 
La sensibilidad al oxígeno, puede diferir entre especies y entre diferentes cepas dentro de 
las mismas especies incluso (Teitelbaum y Walker, 2002; Biavati et al., 2006; Kawasaki et 
al., 2007). 
 
Son bacterias sacarolíticas, ya que tienen la capacidad de fermentar glucosa, galactosa y 
fructosa. Bifidobacterium representa el mayor número de bacterias sacarolíticas en el 
intestino; las cuentas representan cerca del 25% en el colon de un adulto y 95% en el 
colon de un recién nacido alimentado con leche materna (Leahy et al., 2005). 
 
Poseen un metabolismo heterofermentativo; por cada dos moles de glucosa como 
productos principales del metabolismo se forman tres moles de ácido acético y dos de 
ácido láctico (3:2), por la vía fructosa-6-fosfato, razón por la cual este género se incluyó 
durante algún tiempo en el grupo de bacterias lácticas. Si se requiere monitorear el 
crecimiento de esta cepa resulta de gran utilidad cuantificar la producción de ambos 
metabolitos mediante cromatografía líquida de alta eficiencia (Ostile, 2005; Leahy et al., 
2005). 
16 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.1. Formación de acetato y lactato por Bifidobacterium. 1: hexocinasa y glucosa-6-
fosfoisomerasa. 2: fructosa-6-fosfato fosfocetolasa. 3: transaldolasa. 4: transcetolasa. 5: ribosa-5-
fosfato isomerasa. 6: ribulosa-5-fosfato 3-epimerasa. 7: xilulosa-5-fosfato fosfocetolasa. 8: acetato 
cinasa. 9: enzimas de la vía homofermentativa (Parés, 1997). 
17 
 
Estas bacterias poseen característicamente la enzima fructosa-6-fosfato fosfocetolasa (F-
6-PPK), que convierte fructosa-6-fosfato en acetilfosfato y eritrosa-4-fosfato (figura 2.1.). 
La detección de esta enzima se utiliza para identificar a las bifidobacterias a nivel genérico 
(Biavati et al., 2006). 
 
En esta vía, la glucosa es convertida a fructosa-6-fosfato por la acción de la hexocinasa y la 
glucosa-6-fosfato para dar eritrosa-4-fosfato y acetil fosfato. La formación de ácido acético 
a partir de acetil-fosfato es catalizada por la enzima acetato cinasa. La eritrosa-4-fosfato y 
la fructosa-6-fosfato son convertidas a dos moles de pentosa-fosfato por la acción de las 
enzimas transaldolasa y transcetolasa. La enzima xilulasa-5-fosfafato-fosfocetolasa corta 
dos moles de xilulosa-5-fosfato para dar dos moles tanto de acetil-fosfato como de 6-
digliceraldehído-3-fosfato. A partir de acetil-fosfato se forma ácido acético y el 
gliceraldehído-3-fosfato es convertido a ácido pirúvico a través de las reacciones de la 
glucólisis. El ácido pirúvico es reducido a L(+)-ácido láctico por la acción de la enzima LDH 
(Parés, 1997). 
 
El rendimiento de ATP, es de 2.5 moles de ATP por mol de glucosa. En las vías 
homofermentativa y heterofermentativa, los rendimientos de ATP son de 2 ATP por mol 
de glucosa y un ATP por mol de glucosa respectivamente (Rasic y Kurman, 1983). 
 
El ácido láctico y acético tienen el efecto de disminuir el pH del ambiente en donde se 
encuentren estas bacterias, e incluso pueden proporcionar efectos antibacterianos (Jay, 
1994). Al disminuir el pH del ambiente pueden inhibir bacterias que producen sustancias 
tóxicas y de mal olor, como aminas, amoníaco y ácido sulfhídrico. Las aminas, por ejemplo, 
incrementan la presión sanguínea y pueden reaccionar con nitritos para formar 
nitrosaminas que son cancerígenas (Mazza, 2000). 
 
Por otro lado, son bacterias ácido tolerantes y crecen mejor en la escala de pH 
comprendida entre los valores 5 y 8 (Jay, 1994). Las especies de B. lactis y B. animalis 
18 
 
pueden sobrevivir a un valor de pH de 3.5, mientras que a 8.5, el género Bifidobacterium 
sp. no sobrevive (Leahy et al., 2005). 
 
Sus temperaturas mínima y máxima de crecimiento oscilan entre los 25 y 28°C y entre los 
43° y 45°C, respectivamente. La mayoría de las cepas humanas de bifidobacterias crecen a 
una temperatura óptima de entre 36° - 38°C, mientras que las cepas de animales tienen 
una temperatura óptima más elevada, 41°-43°C (Jay, 1994). Sin embargo, diversos 
estudios muestran un buen crecimiento a una temperatura de 35-39°C (Biavati et al., 
2006). 
 
Los estudios in vitro con Bifidobacterium sp. revelan que la sobrevivencia de estos 
microorganismos depende de numerosos factores, incluyendo el grado de acidez del 
estómago, el tiempo de exposición al ácido, concentración y tiempo de exposición a las 
sales biliares y el nivel de actividad de la hidrolasa de las sales biliares (Teitelbaum y 
Walker, 2002). 
 
2.9.3. Métodos de aislamiento e identificación 
 
Existen diversos medios de cultivo para aislar y/o enumerar bifidobacterias, y estos 
pueden ser selectivos y no selectivos. Dos medios no selectivos utilizados con muchafrecuencia son el medio TPY (Peptona de caseína, soya y extracto de levadura) y MRS 
(Man Rogosa y Sharpe). El medio TPY permite cultivar y aislar cepas de diferentes especies 
del género Bifidobacterium sp., debido a que contiene dos componentes que por su 
origen, le dan cierta estabilidad al medio para su desarrollo (peptona de soya y de 
caseína), la fuente de carbono es glucosa, que puede ir desde un 5 hasta un 15 % (Biavati 
et al., 2006). 
 
En estudios preliminares se ha observado que en el medio MRS se presenta un buen 
crecimiento al adicionar cisteína (0.5 gr/l), ya que este aminoácido provoca una 
19 
 
disminución en el potencial de óxido reducción del medio, permitiendo captar parte del 
oxígeno, ayudando así la proliferación celular (Rodríguez, 2003). Al ser bacterias 
anaerobias, tienen tendencia a crecer con lentitud y de ahí que se necesiten varios días 
para obtener resultados experimentales. En estos medios también pueden desarrollarse 
estreptococos y lactobacilos, de ahí la importancia de identificar el tipo de 
microorganismos que se desarrollan (Jay, 1994). 
 
Por otro lado, para dar selectividad a los medios de cultivo e inhibir el crecimiento de 
microorganismos contaminantes se pueden añadir factores de inhibición como (cloruro de 
litio, propionato de sodio, ácido yodoacético, disminuir el pH entre 5.0 y 5.5) o incluso se 
pueden utilizar antibióticos que son añadidos a este tipo de medio de cultivos. Se pueden 
añadir también componentes que ayuden a la proliferación de bifidobacterias como 
riboflavina, bases nitrogenadas y ácido pirúvico, carbohidratos como rafinosa, lactulosa, 
oligosacáridos, etc. (Biavati et al., 2006). 
 
La morfología es de gran ayuda para la identificación de bifidobacterias. En medio TPY 
existen características morfológicas como disposición, número de agrupaciones, forma, 
dimensiones y arreglo de grupos que son típicas de algunas especies de Bifidobacterium 
crecidas en medio TPY sólido (figura 2.2.). 
 
 
Figura 2.2. Microfotografía al microscopio electrónico de barrido de Bifidobacterium sp. 
(www.buyprobiotics.com, 2011). 
http://www.buyprobiotics.com,/
20 
 
Otra forma de identificación del género puede ser por la cuantificación de sus productos 
de fermentación en donde el ácido acético predomina sobre el ácido láctico. Una de las 
formas más directas y confiables para la identificación del género está basada en 
identificar de un extracto celular la enzima fructosa-6-fosfato fosfocetolasa, o con técnicas 
moleculares como con el uso de cebadores (primers) específicos (Biavati et al., 2006). 
Comúnmente se utilizan por ejemplo los Im26-F e Im3-R y los Bif164F con Bif662R 
(Satokari et al., 2001). 
 
2.9.4. Condiciones de anaerobiosis para Bifidobacterium sp. 
 
Por su naturaleza anaerobia no pueden desarrollarse ni sobrevivir en presencia de 
oxígeno, sin embargo, se ha reportado que algunas especies en su crecimiento pueden 
tolerar un cierto porcentaje de oxígeno pero solo en presencia de dióxido de carbono, 
como por ejemplo B. indicum, B. asteroides, B. globosum, B. boum, B. thermophilum, B. 
lactis y B. animalis (Meile et al., 1997; González et al., 2004). También se ha encontrado 
que las especies B. bifidum y B. longum, son muy sensibles al oxígeno, ya que es más difícil 
su desarrollo en presencia de CO2 y O2 en conjunto (Biavati et al., 2006; Kawasaki, et al., 
2007). 
 
El dióxido de carbono actúa inhibiendo principalmente a los microorganismos aerobios 
obligados. Los hongos y levaduras son sumamente resistentes al CO2 y su crecimiento no 
puede ser totalmente detenido mediante el tratamiento con este gas a presión normal. 
Muchas bacterias ácido lácticas y la bifidobacterias son bastante resistentes al dióxido de 
carbono, e incluso este puede fomentar su crecimiento (Lück y Pager, 2000). 
 
Al ser microorganismos a los que les resulta tóxico el oxígeno, se ha encontrado que una 
de las estrategias con la que se puede contrarrestar la dificultad de crecimiento de estas 
en anaerobiosis es utilizar sistemas cerrados a los que se les ha aplicado directamente 
dióxido de carbono gaseoso. La aplicación directa de este gas al medio de cultivo permite 
21 
 
desplazar parte del oxígeno disuelto y proporcionar así una atmósfera anaerobia (Lück y 
Pager, 2000; Rodríguez, 2003). 
 
2.10. Tipos de productos lácteos fermentados para beber 
 
En el mercado se pueden encontrar numerosos tipos de productos lácteos fermentados 
para beber; de acuerdo a sus características físicas se pueden clasificar en productos 
viscosos, productos diluidos o para beber, e incluso productos carbonatados. Pueden ser 
“frescos” (con organismos vivos) o con vida de anaquel extendida (sin microorganismos 
vivos) (Tamine, 2006). 
 
Una bebida láctea fermentada exótica muy popular en varios países Asiáticos es un tipo de 
producto elaborado a base de yogurt regularmente diluido, al que usualmente se le añade 
un 0.5% de sal, y algunas veces saborizantes, frutas, menta e incluso especias como 
comino o chile. Es conocida como Lavan en países Árabes, Lassi en India, Dough o Mast en 
Irán e Irak, respectivamente; Ayran en Turquía y el Líbano (Tamine, 2006). 
 
La bebida Iraní, Dough, es exclusiva de esta región, su manufactura es muy simple y lleva 
consigo la elaboración tradicional de un yogurt con leche de borrego, que al término de la 
fermentación es diluido con agua, se le adiciona sal, se empaca en botellas de refresco con 
corcholata, y se enfría para ser distribuida y consumida; recientemente ha sido 
carbonatada para ofrecer un producto gaseoso como una variante al producto tradicional 
(Choi et al., 1985; Tamine, 2006). 
 
2.10.1. Bebidas de yogurt carbonatadas endulzadas y/o saborizadas 
 
En la Universidad de Cornell, Nueva York, se evaluó el desarrollo de un yogurt para beber 
carbonatado, elaborado tradicionalmente con las cepas L. bulgaricus y S. thermophilus. A 
este se le aplicó dióxido de carbono por medio de un tanque y una llenadora con 0.5 kg de 
22 
 
CO2/cm
2 a 4°C utilizando bajas presiones. Sensorialmente el producto mostró gran 
aceptación tanto para personas que acostumbran consumir yogurts y refrescos como para 
las que no lo acostumbran; incluso algunas personas describieron como sensación 
refrescante, al efecto en la boca del “hormigueo” resultado de la carbonatación. Una de 
las ventajas que mostró el aplicar dióxido de carbono a bajas presiones en el yogurt para 
beber, es que si se almacena a bajas temperaturas la vida de anaquel se prolonga, según 
el estudio, hasta cuatro veces más que un yogurt sin carbonatar (el cual solo duró un 
mes); esto, debido a que se retrasa la producción de ácido, manteniendo así una calidad 
óptima del producto por más tiempo (Choi et al., 1985). 
 
En los yogurts para beber, la principal causa de descomposición durante el 
almacenamiento en frío, aparentemente es la actividad de la enzima lactato 
deshidrogenasa la cual produce una alta acidez dando como resultado notas amargas. La 
actividad enzimática no se detiene por completo durante el almacenamiento pero si se 
reduce. Choi y colaboradores (1985), proponen que el dióxido de carbono inhibe dicha 
acidificación al penetrar en la membrana celular, lo cual interrumpe el equilibrio 
enzimático interno. Las temperaturas de refrigeración mejoran esta función al aumentar 
la solubilidad del dióxido de carbono en los fluidos. 
 
En otro estudio realizado por la Universidad de Mississippi, en donde se evaluó un 
producto similar mediante un panel sensorial, se encontró que el hecho de carbonatar un 
yogurt probiótico (elaborado a partir de L. acidophilus y B. longum con una presión de 
0.08-0.09 kg de CO2/cm
2 en el producto final), endulzado, saborizado y bajo en grasa, no 
afectó la aceptabilidad del producto ni sus propiedades sensoriales. Estos datos proponen 
que con la carbonatación se logra dar a los yogurtspara beber, tradicionales, dulces y/o 
saborizados, una sensación de burbujeo refrescante al ser consumido. 
 
En principio la producción en línea de un yogurt carbonatado es muy parecida a la 
elaboración de un yogurt para beber normal; la única diferencia es que se coloca una 
23 
 
unidad de inyección de gas justo antes del equipo de empaque. Esto se puede hacer 
utilizando un módulo de carbonatación en línea, que consiste en un mezclador especial 
que crea micro burbujas las cuales aseguran la disolución completa del gas en el yogurt. El 
CO2 se inyecta en el yogurt frío después del último tratamiento térmico del producto, con 
el gas a una presión de 1 g/kg. Posteriormente, el producto se envasa asépticamente en 
botes de plástico PET o incluso se puede envasar en envases de cartón; en donde es 
importante cuidar la permeabilidad al CO2 del material de empaque, ya que con el paso 
del tiempo el gas podría escaparse poco a poco del producto una vez empacado 
totalmente. Este producto se puede conservar almacenado a temperatura ambiente por 
mucho más tiempo que un yogurt normal, incluso por meses. Sin embargo es importante 
cuidar que el envase del yogurt carbonatado no se abombe como efecto de la 
insolubilidad del gas a altas temperaturas; al ocurrir esto lo que se hace es enfriar el 
producto y agitarlo para reincorporar el gas (Tamine, 2006). 
 
Otra alternativa para gasificar el producto es la adición de dióxido de carbono 
directamente a la leche después del tratamiento térmico y antes de la inoculación, lo que 
rinde una materia prima de excelente calidad para el desarrollo de bacterias lácticas 
(Blanno, 2004). 
 
Un producto lácteo carbonatado al que se le han adicionado bacterias probióticas, se 
puede considerar como un alimento funcional, ya que estos son alimentos que proveen 
alguna ventaja adicional al valor nutritivo y que deriva en beneficios fisiológicos al 
consumidor (Dwyer, 2007). 
 
2.11. La aplicación de dióxido de carbono en bebidas 
 
La adición de dióxido de carbono en bebidas tiene efecto sobre sus propiedades 
organolépticas, ya que resalta su característica refrescante (Lück y Pager, 2000). El 
24 
 
contenido de CO2 de las bebidas carbonatadas sin alcohol oscila entre 4 y 10 g/l 
(Tscheuschner, 2001). 
 
Las bebidas carbonatas son productos muy populares, los consumidores disfrutan la 
sensación que produce el burbujeo de CO2, ya que se estimulan algunos receptores en la 
lengua y en conjunto en la cavidad bucal (Descoins et al., 2006). 
 
Las sensaciones que producen las bebidas carbonatadas al ser ingeridas son tanto de 
origen mecánico como de origen quimogénico. El estallamiento de burbujas de CO2 que 
estimulan mecanoreceptores en la lengua es un ejemplo del efecto mecánico, mientras 
que la formación de ácido carbónico (H2CO3) es una reacción catalizada por la anhidrasa 
carbónica que estimula receptores en las cavidades bucales siendo un efecto 
quimogénico. 
 
Las burbujas de CO2 aparecen cuando las concentraciones de los niveles de este gas son 
de tres a cinco veces más altas que el valor de equilibrio de saturación, lo cual depende de 
las interfaces gas-líquido preexistentes; el número y tamaño de estas burbujas también 
tienen un impacto importante en las propiedades sensoriales de las bebidas 
carbonatadas. La proporción de crecimiento y velocidad de ascendencia de las burbujas 
están influenciadas por la concentración de CO2 disponible en la fase líquida y por la 
presencia de moléculas tensoactivas (proteínas, azúcares) en solución y en la pared de la 
burbuja haciendo este crecimiento más lento o más rápido (Descoins et al., 2006). 
 
Según cifras del INEGI, México ocupa el primer lugar mundial en consumo per cápita de 
refrescos y el segundo en importancia en ventas después de Estados Unidos. Entre 1998 y 
2008 el consumo per cápita creció de 120 a 152 litros y con ello el gasto de las familias de 
2 mil 850 pesos a más de 5 mil pesos anualmente, una cifra importante si se considera que 
las bebidas carbonatadas no son productos de primera necesidad (INEGI, 2008). 
 
25 
 
2.11.1. Otros efectos del dióxido de carbono y su mecanismo de acción 
 
El dióxido de carbono posee un efecto antioxidante, ya que tiene un bajo nivel de 
reactividad y actúa desplazando al oxígeno (Lück y Pager, 2000). Se sabe que la disolución 
de CO2 en un medio acuoso puede retardar el crecimiento de microorganismos Gram 
positivos y negativos. Concretamente para el caso de la leche, se ha visto que tiene efecto 
sobre Listeria monocytogenes, Escherichia coli, Bacillus licheniformis, Bacillus subtillis y 
Pseudomonas flourescens (Blanno, 2004). 
 
El mecanismo de acción no está totalmente claro, varios de ellos pueden estar implicados 
y actuar simultáneamente, entre los que destacan: 
 
 La hidratación del CO2 rinde una reducción del pH por la formación de ácido carbónico 
con lo que se crea un ambiente menos favorable para los microorganismos, figura 2.3. 
(Descoins et al., 2006). 
 
 
Figura 2.3. Formación de ácido carbónico en condiciones acuosas, (ac). 
 
 El dióxido de carbono es un metabolito en varias rutas metabólicas encontradas en los 
microorganismos y su presencia puede ocasionar que dichas rutas se inhiban o se 
detengan (inhibición por concentración de sustrato). 
 
 Las moléculas de dióxido de carbono son no polares y por tanto más solubles en 
lípidos que en el agua. Cuando el dióxido de carbono llega a estar en contacto con la 
membrana celular de las bacterias se disuelve preferencialmente en la bicapa lipídica 
CO2(gas)  CO2(ac) 
CO2(ac) + H2O  H2CO3 
H2CO3(ac) + H2O  HCO3
-
(ac) + H3O
+ 
 
26 
 
con ello se afecta la permeabilidad de este órgano. Así, el citoplasma de la célula 
queda más expuesto al medio ambiente tóxico. Si la concentración de CO2 es lo 
suficientemente grande, éste puede solubilizarse y posteriormente, reducir el pH del 
ambiente y con ello afectar el metabolismo normal de la bacteria. 
 
 Generalmente el CO2 no elimina los microorganismos, al menos durante períodos de 
tiempo cortos, sino que solamente inhibe su crecimiento. Los microorganismos se 
mantienen en fase latente, en la que no se reproducen, pero son capaces aún de 
mantener cierta actividad enzimática (Blanno, 2004). 
 
2.11.2. Sistemas de aplicación en la industria 
 
El dióxido de carbono al emplearse en forma de gas licuado puede ser fácilmente 
bombeado. Para que se pueda utilizar en alimentos, su pureza debe de ser del 99.8%. En 
la mayoría de los países no está sujeto a limitaciones legales alimentarias (Lück y Pager, 
2000). 
 
La carbonatación se puede lograr inyectando el gas dentro de un envase cerrado a 
presión; la inyección gaseosa aumenta la presión interna y en efecto la solubilidad del CO2 
(Descoins et al., 2006). La solubilidad del dióxido de carbono en agua aumenta al disminuir 
la temperatura (Lück y Pager, 2000). El CO2 es un aditivo generalmente reconocido como 
seguro (GRAS) y puede ser utilizado para extender la vida de anaquel de una gran variedad 
de productos lácteos que incluyen desde leche bronca concentrada, leche pasteurizada, 
yogurt, queso cottage, base para helado, etc. (Blanno, 2004). 
 
El sistema de carbonatación que se utiliza en las industrias de las bebidas gasificadas es un 
poco más complejo que lo mencionado anteriormente; sin embargo, el principio es el 
mismo. El proceso de carbonatación se hace en línea con la elaboración del producto, 
previo a su envasado, y consiste en disolver el dióxido de carbono en la bebida, utilizando 
27 
 
tanques de mezclado bajo condiciones de presión y temperaturas controladas en donde el 
CO2 debe permanecer disuelto, en algunos casos específicos se pueden emplear también 
otros gases como nitrógeno. Posteriormente la bebida es alimentada a la llenadora en 
óptimas condiciones para que no haya pérdida de gas y es envasada asépticamente(Tamine, 2006). La cantidad de CO2 varía según el tipo de bebida (puede ser de unos 8 g/l 
en bebidas refrescantes, 4 g/l en aguas minerales y hasta 14 g/l por ejemplo en vinos 
espumosos) (www.gyminternacional.es, 2010). 
 
En la industria, además del monitoreo de la concentración de CO2 en el líquido durante el 
proceso de carbonatación es importante evaluar la influencia de aditivos, ya que éstos 
pueden modificar los mecanismos de absorción o desorción de CO2. 
 
2.12. Métodos de detección de dióxido de carbono en bebidas carbonatadas 
 
Para el monitoreo de concentración de CO2 se utilizan sensores específicos montados 
sobre las líneas de producción en la fase de mezclado del gas con el líquido. El principio de 
medición en el que se basan es en la ley de Henry en donde a una temperatura constante, 
la concentración de un gas disuelto en un líquido es proporcional a la presión que ejerce 
ese gas sobre el líquido y a su coeficiente de solubilidad (Redmore, 1981). 
 
Al igual que existen sensores en línea para medir la concentración de CO2 durante la 
elaboración de bebidas, existen instrumentos que se basan en el mismo principio de 
análisis (Ley de Henry) y que permiten la medición directa del CO2 disuelto en bebidas 
carbonatadas ya envasadas. Son equipos muy exactos, simples de operar, requieren 
volúmenes de muestra bajos y proporcionan resultados rápidos en valores de 
concentración del gas en g/l (figura 2.4.) (www.anton-paar.com, 2008). 
http://www.gyminternacional.es/
http://es.wikipedia.org/wiki/Temperatura
http://es.wikipedia.org/wiki/Presi%C3%B3n_parcial
http://www.anton-paar.com/
28 
 
 
Figura 2.4. Medidores de carbonatación (www.anton-paar.com, 2008). 
 
Por otro lado existen también metodologías analíticas oficiales para las determinaciones 
de concentración de CO2 para la industria de bebidas carbonatadas las cuales resultan 
menos costosas y suelen utilizarse a nivel laboratorio. 
 
Los análisis de concentración de CO2 se pueden realizar utilizando un cromatógrafo de 
gases, o por medio de espectrómetro de masas, e incluso con un detector infrarrojo 
(Descoins et al., 2006). 
 
Otra alternativa más simple es utilizando electrodos de membrana sensibles a gases. Son 
celdas electroquímicas construidas con un electrodo específico de iones y uno de 
referencia sumergidos en una disolución interna que está retenida por una delgada 
membrana permeable a gases. Cuando una disolución que contiene CO2 se pone en 
contacto con la membrana microporosa el gas se difunde a través de esta, 
estableciéndose un equilibrio en donde se detecta un cambio de pH por los iones 
hidrogeno (H+): 
CO2 (ac)  CO2 + H2O  H2CO3  HCO3
- + H+ 
 
http://www.anton-paar.com/
29 
 
Las especies que pueden interferir en esta determinación son los gases disueltos que 
puedan pasar a través de la membrana y que además afecten el pH de la disolución 
interna; en general este electrodo se puede emplear para medir CO2 en presencia de otras 
sustancias. El tiempo de respuesta de estos es de unos segundos o minutos, se hace la 
determinación de la concentración de CO2 directa en la muestra, sin necesidad de 
prepararla. La lectura se obtiene de un equipo calibrado de detección de CO2 al que se 
encuentra acoplado el electrodo (Harris, 2001). 
 
El inconveniente de las metodologías anteriores es que los equipos son costosos. Otras 
alternativas analíticas oficiales son las que dispone la AOAC, American Official Analysis 
Methods, algunas de las cuales se describen a continuación brevemente. 
 
2.12.1. Método oficial AOAC 940.17. Dióxido de carbono en cerveza. Método 
manométrico 
 
Se utiliza un equipo que consta principalmente de un dispositivo de acero para la 
perforación de tapas de botellas y latas conectado a un manómetro; una bureta de 
absorción y una bombilla niveladora, (figura 2.5.). 
 
 
Figura 2.5. Equipo para medición de CO2 en cerveza, método manométrico (AOAC, 2005). 
30 
 
La determinación se hace a 25°C, al perforar la lata o tapa de la botella en donde se 
encuentra la cerveza se hace la lectura de la presión que ejerce el gas presente, 
despejando esta presión de una serie de ecuaciones se puede conocer el porcentaje de 
dióxido de carbono por peso y por volumen (AOAC, 2005). 
 
En la industria hay equipos que se basan en este mismo fundamento que permiten 
conocer la temperatura y presión de CO2 dentro de las bebidas y por medio de tablas que 
relacionan ambos parámetros se puede conocer la concentración del gas CO2 en la bebida 
(www.zahmnagel.com, 2008). 
 
2.12.2. Método oficial AOAC 960.21. Dióxido de carbono en vinos. Método 
volumétrico 
 
Otra metodología que utiliza un sistema más complejo es alcalinizando la muestra. 
Posteriormente, se destila el CO2 y el destilado se recibe en cloruro de bario. Con una 
titulación ácido base utilizando ácido clorhídrico y fenolftaleína como indicador, es posible 
conocer el peso del CO2 en g/100 ml de muestra (AOAC, 2005). 
 
2.12.3. Método oficial AOAC 988.07. Dióxido de Carbono en vinos. Método por 
titulación 
 
La porción de una muestra se alcaliniza al adicionar hidróxido de sodio; se forma 
carbonato, el cual es titulado con ácido sulfúrico y por medio de una ecuación que 
relaciona el volumen de ácido gastado en la titulación de la muestra y de un blanco 
(muestra desgasificada), se puede conocer la concentración de CO2 en mg de CO2/100 ml 
de muestra. Esta metodología es aplicable para vinos que contengan una cantidad menor 
o igual a 400 mg CO2/100 ml (≤ 4g/l) (AOAC, 2005). Debido a la disponibilidad de reactivos 
y materiales esta metodología se adaptó para determinar la concentración del dióxido de 
carbono de los sistemas utilizados en este trabajo. 
http://www.zahmnagel.com/
31 
 
3. JUSTIFICACION 
 
En México hay gran una variedad de alimentos funcionales, entre los que se encuentran 
los yogurts y leches fermentadas adicionadas con probióticos. En este tipo de productos 
las cepas iniciadoras que participan en la fermentación pertenecen a los géneros 
Lactobacillus sp. y Streptococcus sp; en algunos productos están presentes 
microorganismos del género Bifidobacterium sp. los cuales, debido a su naturaleza 
anaerobia, son añadidos una vez que el producto ya fue fermentado, o en algunos casos, 
en la fase final de la fermentación. Algunos fabricantes utilizan tecnologías de 
microencapsulación para garantizar su sobrevivencia en productos comerciales. En México 
no existen productos lácteos fermentados en donde la única cepa probiótica pertenezca al 
género Bifidobacterium. Sería interesante, pues, explotar sus propiedades probióticas y 
formular bebidas que lo contengan. 
 
Se sabe que en nuestro país se consume una cantidad considerable de bebidas 
carbonatadas; por lo que se propone gasificar un medio de cultivo lácteo, en donde al 
tener una atmósfera anaerobia se pueda mantener la viabilidad de las bifidobacterias y 
además establecer las condiciones aptas para el desarrollo de una bebida láctea 
probiótica gasificada. 
 
 
 
32 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1. Objetivo general 
 
Evaluar el efecto de la aplicación de diferentes concentraciones de dióxido de carbono, 
sobre el crecimiento y la viabilidad de Bifidobacterium sp. con el fin de poder aplicar este 
microorganismo en la elaboración de una bebida probiótica láctea carbonatada. 
 
4.2. Objetivos particulares 
 
Seleccionar una cepa específica de Bifidobacterium, para su aplicación posterior en una 
bebida. 
 
Estandarizar la técnica de aplicación de dióxido de carbono en leche descremada, la cual 
se utilizará para elaborar la bebida probiótica. 
 
Evaluar la técnica reportada por la AOAC (Dióxido de Carbono en vinos. Método por 
titulación), para la determinación de CO2 en los diferentes medios de cultivo en los que se 
trabajará. 
 
Determinar la viabilidad (UFC/ml) y la tasa de crecimiento específica (μ) deBifidobacterium a diferentes concentraciones de dióxido de carbono, para establecer la 
concentración más adecuada de este gas para el desarrollo del microorganismo. 
 
Evaluar los posibles cambios en el metabolismo de Bifidobacterium en la condición de 
concentración de dióxido de carbono seleccionada y en leche descremada, a través del 
análisis de producción de ácido láctico y acido acético. 
 
33 
 
5. HIPÓTESIS 
 
El dióxido de carbono es capaz de reemplazar al oxigeno del medio proveyendo así un 
ambiente de anaerobiosis. La tasa específica de crecimiento y la viabilidad de los 
microorganismos del género Bifidobacterium, variarán en función de la concentración del 
dióxido de carbono presente en el medio de cultivo. 
 
34 
 
6. METODOLOGIA 
 
Estrategia general de trabajo 
LD 4% con CO2
0, 20, 40, 60 80 %AG + AD
Aplicación
 de CO2 
MRS-Cys con CO2
0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 y 20 min CO2
Análisis [CO2] 
ANOVA
Análisis [CO2] 
ANOVA
Burbujeo directo 
de CO2 por 
diferentes tiempos
A
Mezclas de agua gasificada 
AG + agua destilada AD
 
 
Figura 6.1.A. Diagrama general para la aplicación y determinación de la concentración de dióxido 
de carbono en los medios de cultivo MRS adicionado con cisteína (MRS-Cys) y leche descremada 
reconstituida al 4% p/v (LD 4%). 
 
Selección
 de cepas
B. adolescentis
B. animalis
* Reactivación
* Conteo en placa UFC/ml
* Cinética de crecimiento
* Conservación -80°C
B. animalis
Fermentación
 LD 4% con CO2
* pH 
* DO
* UFC/ml (ANOVA)
* pH
* % Acidez
* UFC/ml (ANOVA)
Condición
LD 4% / 40% AG + 60%AD
Ácido láctico
Ácido Acético
(TPY-G control)
B
LD 8% 
sin CO2
LD 4%
sin CO2
Fermentación
MRS-Cys con CO2
 
 
Figura 6.1.B. Diagrama general de las fermentaciones en los medios de cultivo MRS-Cys, LD 
reconstituida al 4 y 8% p/v y TPY adicionado con glucosa (TPY-G). 
35 
 
Las figuras 6.1. A y B representan la metodología general que se siguió. En la fig. 6.1.A. se 
muestra el diagrama para obtener diferentes concentraciones de dióxido de carbono 
(CO2) en los medios de cultivo en donde se probaron dos métodos de aplicación. Por 
burbujeo directo al medio MRS adicionado con cisteína (MRS-Cys), y añadiendo agua 
gasificada (AG) en distintas proporciones en conjunto con agua destilada (AD) para leche 
descremada reconstituida al 4% p/v (LD 4%). Las diferencias de concentración de CO2 se 
evaluaron por un análisis estadístico de varianza, ANOVA. 
 
La fig. 6.1.B. indica las fermentaciones que se hicieron en un principio con las cepas B. 
animalis y B. adolescentis para su estandarización. La fermentación con la cepa B. animalis 
se realizó en MRS-Cys aplicando directamente CO2 por burbujeo al medio de cultivo desde 
un tanque. Por otro lado la fermentación de la misma cepa en leche descremada 
reconstituida a distintas concentraciones (4% y 8% p/v); y por último en leche descremada 
4% con CO2 utilizando agua gasificada. De esta última fermentación se tomaron las 
muestras para analizar la producción de ácido acético y láctico. 
 
6.2. Selección de cepas 
 
Se trabajó con dos especies diferentes del género Bifidobacterium, las cuales se 
conservaron congeladas a -80°C en medio MRS adicionado con cisteína (5 g/l) (MRS-Cys), 
y glicerol (1:1), el cual es un medio de conservación a largo plazo, (tabla 6.1.). 
 
Tabla 6.1. Cepas de Bifidobacterium utilizadas en el estudio. 
Cepa Colección 
Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 
Bifidobacterium animalis ATCC 25527 
* American Type Culture Collection 15703. Bifidocterium adolescentis Reuter. 
(www.atcc.org, 2010). 
**American Type Culture Collection 25527. Bifidobacterium animalis subsp. animalis 
(Mitsuoka) Scardovi and Trovatelli deposited as Bifidobacterium longum subsp. 
animalis Mitsuoka (www.atcc.org, 2010). 
http://www.atcc.org/
http://www.atcc.org/
36 
 
6.1.1. Preparación de células para conservación 
 
Se inoculó 0.1 ml de las cepas provenientes del conservado en MRS-Cys con glicerol (1:1) a 
-80°C en 10 ml de caldo MRS-Cys por duplicado; y se incubaron en anaerobiosis, por 48 
horas a 37°C. 
 
Para lograr la condición de anaerobiosis en el caldo de cultivo MRS-Cys, este se preparó 
como se indica en el anexo A, se vertieron 10 ml de caldo en viales de vidrio y se les aplico 
directamente dióxido de carbono gaseoso (CO2(gas) 99.9%, Praxair) a un flujo de 150 
ml/min por un minuto. Los viales se sellaron inmediatamente con un tapón de goma de 
caucho y tapa de aluminio; los cuales impiden el intercambio de gases del sistema con la 
atmósfera, y así la entrada de oxígeno al medio. Posteriormente se esterilizaron a 121°C 
por 15 min, se dejaron enfriar a temperatura ambiente para poder ser inoculados. 
 
El cultivo obtenido se centrifugó a una velocidad de 20 000 rpm por 10 minutos a 4°C. Se 
añadieron 10 ml de caldo MRS-Cys y 10 ml de glicerol 95% estériles, el concentrado celular 
se distribuyó en microtubos de 1.5 ml que se conservaron a una temperatura de -80°C, 
disponible para posteriores determinaciones. A esta suspensión se le hizo posteriormente 
cuenta en placa en agar MRS-Cys para conocer la concentración celular por mililitro 
(UFC/ml). 
 
6.1.2. Pureza de las cepas 
 
El microorganismo se sembró en agar MRS-Cys y se incubó en una cámara de anaerobiosis 
(Forma-Scientific, cuya mezcla de gases en el interior es de 5% H2, 10% CO2 y 85% N2), por 
48 horas; se verificó visualmente la homogeneidad en la morfología de las colonias en 
agar, y también se observaron las células al microscopio después de realizar una tinción de 
Gram. Para el caso de bifidobacterias son colonias circulares bien definidas de color 
blanquecino y al microscopio son bacilos Gram positivos. 
37 
 
6.1.3. Preparación de los medios de cultivo líquidos en anaerobiosis 
 
Los medios de cultivo líquidos que se utilizaron fueron MRS con Cisteína (0.5 g/l, MRS-
Cys); TPY con glucosa (5 g/l, TPY-G), y leche descremada reconstituida al 4 y 8% p/v (LD 4% 
y LD 8%); para ser reconstituidos se prepararon según las especificaciones que se marcan 
en el anexo A. Para lograr condiciones anaerobias en los medios de cultivo, a los 
volúmenes de trabajo deseados ya contenidos en envases de vidrio (viales); se les aplicó 
directamente CO2 gaseoso (CO2(gas) 99.9%, Praxair) a un flujo de 150 ml/min, por un 
tiempo de dos minutos para 100 ml de caldo y un minuto para volúmenes de 10 y 50 ml. 
Los viales se sellaron inmediatamente con un tapón de goma de caucho y tapa de 
aluminio. Posteriormente los medios de cultivo se esterilizaron a 121°C por 15 min, 
excepto para los medios de LD 4% y LD 8% cuyas condiciones fueron 10 min a 115°C. Se 
dejaron enfriar a temperatura ambiente y se almacenaron en refrigeración a 5°C hasta 
que fueron utilizados. 
 
6.1.4. Estimación de parámetros cinéticos del inóculo inicial 
 
Se inoculó 0.1 ml de los concentrados celulares previamente preparados en 50 ml de 
caldo de cultivo MRS-Cys y se incubó en anaerobiosis con agitación de 100 rpm por 24 
horas a 37°C. Se tomaron muestras de 3 ml (con jeringa estéril) cada dos horas registrando 
los valores de pH y absorbancia a una longitud de onda de 600 nm (densidad óptica). En 
base a estos datos se determinó el tiempo en el que el microorganismo llega a fase 
exponencial media, eligiéndose esta etapa para la cosecha del microorganismo y se utilizó 
como inóculo para fermentaciones posteriores. Los valores de velocidad específica de 
crecimiento (µ) y tiempo de duplicación celular (td) para ambas cepas fueron 
determinados gráficamente a partir de los resultados obtenidos anteriormente. 
 
 
 
38 
 
6.2. Métodos de aplicación de dióxido de carbono para lograr diferentes 
concentraciones en los medios de cultivo 
 
6.2.1. Aplicación directa de dióxido de carbono por burbujeo 
 
Se aplicó dióxido de carbono gaseoso de forma directa a los medios de cultivo a un flujo 
constante de 150 ml/min variando los tiemposde aplicación, los cuales fueron de: 2.5, 5, 
7.5, 10, 15, 20 y 0 minutos (este último como control). 
 
Utilizando esta técnica se preparó caldo MRS-Cys y agua destilada en las mismas 
condiciones, la cual fue utilizada como blanco de referencia para los análisis de la 
cuantificación de la concentración de CO2. 
 
6.2.2. Aplicación de dióxido de carbono utilizando agua gasificada 
 
Otra de las metodologías para lograr tener diferentes atmósferas de anaerobiosis en los 
medios de cultivo, fue reconstituirlos con diferentes proporciones en volumen de agua 
destilada (AD) y agua comercial gasificada (AG), en donde, entre mayor sea el porcentaje 
de agua gasificada añadida al medio, mayor sería la concentración de CO2 en éste. 
 
6.2.2.1. Selección de las proporciones de agua gasificada a utilizar para la 
preparación de los medios de cultivo 
 
Se prepararon mezclas en diferentes proporciones de agua destilada y agua gasificada a 
5°C como se indica en la tabla 6.2. Las mezclas se prepararon en viales de vidrio de 100 ml, 
se sellaron con tapón de goma y tapa de aluminio para evitar el intercambio de gases, se 
esterilizaron a 121°C por 15 min y se dejaron enfriar a 5°C previas 24 horas a su análisis. La 
concentración de CO2 obtenida en estos sistemas se analizó como lo indica la metodología 
en el punto 6.3. El sistema que no contiene agua gasificada (AD*) se utilizó como blanco 
de referencia. 
39 
 
Tabla 6.2. Proporciones de agua utilizada para lograr distintas 
condiciones de dióxido de carbono. 
% Agua gasificada 
adicionada 
Condición 
0 100 ml AD* 
20 80 ml AD + 20 ml AG 
40 60 ml AD + 40 ml AG 
60 40 ml AD + 60 ml AG 
80 20 ml AD + 80 ml AG 
100 100 ml AG 
AD: agua destilada, AG: agua gasificada, AD*: blanco de referencia. 
 
6.2.3. Aplicación de dióxido de carbono en leche descremada reconstituida al 4% 
p/v utilizando agua gasificada 
 
Se utilizaron diferentes proporciones de agua gasificada (de 0% a 80%), y se prepararon 
los medios de cultivo de LD 4% p/v; estos se prepararon en dos partes: se reconstituyó el 
total del medio de cultivo con el volumen de agua destilada correspondiente a cada 
condición, y este se vertió en viales de vidrio. Los viales se taparon con algodón y gasa, se 
esterilizaron a 115°C por 10 min. y se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente. 
Posteriormente, con material estéril y en la campana, se añadió a los medios preparados 
la cantidad de agua gasificada, (a 5°C), correspondiente a cada condición, los viales se 
sellaron con tapones de goma de caucho y tapas de aluminio y se refrigeraron a 5°C hasta 
ser utilizados. La condición de 0% fue utilizada como referencia. 
 
La proporción de agua destilada y de agua gasificada que se utilizó para reconstituir los 
medios de cultivo en un volumen total de 100 ml fue como el caso anterior (tabla 6.2.). 
 
Por otro lado, para ser utilizada como blanco de referencia para los análisis de 
concentración de CO2 en un vial de vidrio sellado se esterilizaron 100 ml de agua destilada 
a 121°C por 15 minutos. 
40 
 
6.3. Técnica para la determinación de la concentración de dióxido de carbono en 
los medios de cultivo 
 
Para este trabajo se adaptó una técnica de titulación de la AOAC utilizada para medir 
dióxido de carbono en vinos. En este caso se utilizó para medir las diferentes 
concentraciones de CO2 en los medios de cultivo MRS-Cys, leche descremada 
reconstituida y dos presentaciones distintas de agua gasificada; utilizando como blanco de 
referencia en todos los casos agua destilada (AOAC, 2005). 
 
Las muestras para el análisis se enfriaron a 5°C. Se adicionaron 5 ml de hidróxido de sodio 
(NaOH) 50% p/v con pipeta de vidrio graduada, por cada 375 ml de muestra. En el caso de 
los viales sellados se inyectó 1.3 ml de la solución de hidróxido de sodio a 100 ml de 
muestra y se mezcló el contenido manualmente de forma suave. Una vez mezclada la 
muestra con el NaOH se tomaron 10 ml de la mezcla y se depositaron en 40 ml de agua 
destilada contenidos en un vaso de precipitados de 100 ml. Por último, se añadieron 3 
gotas de anhidrasa carbónica (Sigma Chemical) 0.01% p/v, enzima que cataliza la 
conversión de dióxido de carbono a los iones bicarbonato e hidronio, pasando por la 
formación del ácido carbónico: CO2 + H2O  H2CO3  HCO3
-(ac) + H3O
+. 
 
Sobre una parrilla de agitación se montó una bureta con ácido sulfúrico (H2SO4) 0.0228 M 
y un potenciómetro, (a esta concentración 1 ml de H2SO4 equivalen a 20 mg de CO2 por 
100 ml de muestra). A temperatura ambiente y con agitación constante se tituló la 
muestra que se preparó hasta pH 8.6, se registró el volumen de ácido gastado (a). Se 
continuó la titulación hasta pH 4.0 y se registró nuevamente el volumen de ácido gastado 
(b). Se calculó el volumen de ácido sulfúrico utilizado al titular la muestra de pH 8.6 a 4 (b-
a = valor A). 
 
Para el blanco de referencia: Se utilizó agua destilada y se siguió la misma metodología 
descrita; en donde el volumen de ácido sulfúrico utilizado al titular el blanco de pH 8.6 a 4 
corresponde al valor B. 
41 
 
 Por último, con la siguiente ecuación se calcularon los mg de CO2 presentes por 100 ml de 
muestra: 
ml CO2 / 100 mlmuestra = (Aml – Bml) x 20 x 1.013 
 
6.4. Fermentaciones 
 
Para reactivar la cepa se inoculó 0.1 ml del concentrado celular conservado a -80°C de B. 
animalis en 50 ml de caldo MRS-Cys y se incubó en un vial de vidrio en anaerobiosis con 
agitación a 100 rpm a 37°por 10 horas. 
 
Se evaluó el efecto del crecimiento de la cepa B. animalis sobre las diferentes 
concentraciones de CO2 en los medios de cultivo mostrados en la tabla 6.3. 
 
Para cada condición se aplicó el inoculo previamente reactivado al 5% v/v y se incubó en 
anaerobiosis con agitación de 100 rpm a 37°C. 
 
Se tomaron 3 ml de muestra de cada fermentación en intervalos de dos horas, con jeringa 
estéril. Los parámetros a evaluar fueron para MRS-Cys y TPY-G, densidad óptica a 600 nm 
(como indicador de crecimiento) y pH; y para LD porcentaje de acidez titulable y pH. La 
viabilidad se determinó realizando conteo en placa de células viables (UFC/ml) por el 
método de vertido en placa para cada condición, descritos en la sección 6.4.1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
Tabla 6.3. Condiciones de fermentación para B. animalis. 
Medio de 
cultivo 
Aplicación de dióxido de 
carbono al medio 
 
Parámetros a evaluar 
Caldo 
MRS-Cys 
Burbujeo directo a diferentes 
tiempos. Met. 6.2.1. 
 
 
 Crecimiento por 10 horas en siete 
condiciones distintas de CO2 
 
 Viabilidad a las 0 y 6 h para las 
condiciones con 0 y 20 min de 
aplicación de CO2 
 
Leche 
descremada 
4% p/v 
Sin adición 
 
 
 Selección de la concentración de 
leche descremada en polvo a utilizar 
como propuesta para la bebida láctea 
probiótica 
 
Adición de agua gasificada en 
distintas proporciones. Met.6.2.3. 
 
 
 Crecimiento por 12 horas en cinco 
condiciones distintas de CO2 
 
 Viabilidad a las 0 y 10 h bajo estas 
mismas condiciones 
 
Leche 
descremada 
8% p/v 
Sin adición 
 
 
 Selección de la concentración de 
leche descremada en polvo a utilizar 
como propuesta para la bebida láctea 
probiótica 
 
Caldo 
TPY-G 
Sin adición 
 
 
 Crecimiento evaluado en paralelo 
como control positivo 
 
 
6.4.1. Parámetros de evaluación del crecimiento de Bifidobacterium sp. durante 
las fermentaciones 
 
6.4.1.1. Densidad óptica 
 
Para evaluar el crecimiento se determinó la densidad óptica de los medios de 
fermentación en un espectrofotómetro (Cary 50 UV-VIS) a 600 nm de longitud de onda; la 
lectura se realizó directamente de la muestra. Para las condiciones de fermentación en 
medio MRS-Cys y TPY-G se utilizó como blanco MRS-Cys o TPY-G sin fermentar. 
 
 
43 
 
6.4.1.2. Acidez titulable 
 
Para evaluar el crecimiento en leche descremada se utilizó el parámetro