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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA EFECTO DE LA GERMINACIÓN DE SEMILLAS DE CHÍA (Salvia hispanica L.) SOBRE SU CALIDAD NUTRIMENTAL T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: QUÍMICA DE ALIMENTOS PRESENTA: RUTH ARELI BUENROSTRO RODRÍGUEZ CDMX 2018 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTE: Dr. Hermilo Leal Lara VOCAL: QFB. Juan Diego Ortiz Palma Pérez SECRETARIO: Dr. Enrique Martínez Manrique 1er. SUPLENTE: M.C. Bertha Julieta Sandoval Guillen 2° SUPLENTE: M.C. Brenda Sánchez Salazar SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Laboratorio de Bioquímica y Fisiología de Granos de la FES Cuautitlán, UNAM. ASESOR DEL TEMA: Dr. Enrique Martínez Manrique SUPERVISOR TÉCNICO: I.A. Verónica Jiménez Vera SUSTENTANTE: Ruth Areli Buenrostro Rodríguez AGRADECIMIENTOS El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de Bioquímica y Fisiología de Granos de la FES Cuautitlán, UNAM, como un proyecto del Taller Multidisciplinario de Procesos Tecnológicos de Cereales con el apoyo del programa PIAPI-1606. ÍNDICE RESUMEN ............................................................................................................................... - 7 - INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ - 8 - 1. MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... - 10 - 1.1 Chía (Salvia hispanica L.) ........................................................................................... - 10 - 1.1.1 Origen e historia ................................................................................................... - 10 - 1.1.2 Descripción botánica ............................................................................................ - 12 - 1.1.3 Características de la semilla ................................................................................ - 15 - 1.1.4 Composición nutrimental de la semilla ................................................................. - 16 - 1.1.5 Cultivo de chía en México y alrededor del mundo ................................................ - 22 - 1.2 Semillas y germinación ............................................................................................... - 23 - 1.2.1 Aspectos generales de las semillas ..................................................................... - 23 - 1.2.2 Germinación en semillas ...................................................................................... - 24 - 1.2.3 Condiciones de germinación ................................................................................ - 25 - 1.3. Germinados como alimentos funcionales .................................................................. - 27 - 1.4 Factores Antinutrimentales ......................................................................................... - 28 - 1.4.1 Taninos ................................................................................................................ - 28 - 1.4.2 Ácido fítico ........................................................................................................... - 29 - 1.4.3 Inhibidores de tripsina .......................................................................................... - 30 - 2. OBJETIVOS ........................................................................................................................ - 31 - 2.1 Objetivo general ......................................................................................................... - 31 - 2.2 Objetivos particulares ................................................................................................. - 31 - 3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................. - 32 - 3.1 Cuadro metodológico.................................................................................................. - 32 - 3.2 Material biológico ........................................................................................................ - 33 - 3.3 Actividades previas ..................................................................................................... - 33 - 3.3.1 Germinación de la semilla .................................................................................... - 33 - 3.3.2 Obtención de muestra seca ................................................................................. - 33 - 3.3.3 Medición de la plántula......................................................................................... - 33 - 3.3.4 Índice de conversión ............................................................................................ - 34 - 3.4 Análisis Químico Proximal (AQP) ............................................................................... - 34 - iii 3.4.1 Determinación de humedad por el método de sólidos totales y humedad en harina (925.09, AOAC) ............................................................................................................ - 34 - 3.4.2 Determinación de porcentaje de proteínas por el método Microkjeldahl (954.01, AOAC) ............................................................................................................ - 35 - 3.4.3 Determinación de porcentaje de lípidos o extracto etéreo por la técnica de extracción Soxhlet (920.39, AOAC) ................................................................................................ - 37 - 3.4.4 Determinación de porcentaje de cenizas por el método de incineración (923.03, AOAC) ............................................................................................................ - 38 - 3.4.5 Determinación de fibra por el método de fibra cruda o Weende (989.03, AOAC) . - 38 - 3.4.6 Determinación de porcentaje de hidratos de carbono .......................................... - 39 - 3.5 Determinación de la calidad de proteína ..................................................................... - 40 - 3.5.1 Digestibilidad in vitro (Hsu et al., 1977) ................................................................ - 40 - 3.5.2 Determinación de triptófano (Rama Roa et al., 1974) .......................................... - 41 - 3.6 Factores antinutrimentales ........................................................................................ - 41 - 3.6.1 Determinación de taninos (ISO 9684, 1988). ........................................................ - 41 - 3.6.2 Determinación ácido fítico (Haug y Lantzsch, 1983) ............................................. - 42 - 3.6.3 Determinación de inhibidores de tripsina (Kakade et. al., 1974) .......................... - 43 - 3.7 Relación de Eficiencia Proteica (REP o PER en inglés) (960.48, AOAC).................... - 44 - 3.8 Análisis estadístico ..................................................................................................... - 46 - 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................ - 47 - 4.1 Crecimiento de plántula e índice de conversión.......................................................... - 47 - 4.2 Análisis Químico Proximal .......................................................................................... - 49 - 4.3 Calidad proteica: digestibilidad in vitro, contenido de triptófano y digestibilidad in vivo - 52 - 4.4 Determinación de factores antinutrimentales .............................................................. - 55 - 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................... - 57 - 6. REFERENCIAS ................................................................................................................... - 60 - i v ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Mujer a punto de dar a luz con bebida de chía y carne de cola de tlacuache. Códice Florentino, libro XI, figura 171v. ............................................................................... - 10 - Figura 2. Chía fresca. Bebida a base de agua, jugo de limón y semillas de chía que sobrevive hasta nuestros días .............................................................................................................. - 11 - Figura 3. Planta de Chía (Salvia hispanica L.)...................................................................... - 13 - Figura 4. Cultivo de chía (Salvia hispanica L.) en los Altos, Jalisco ...................................... - 14 - Figura 5. Chía negra y chía blanca, con escala de 1 centímetro (A) y 1000 micras (B) ........ - 15 - Figura 6. Partes de una semilla de Ricinus communis ......................................................... - 24 - Figura 7. Etapas de germinación de una semilla .................................................................. - 26 - Figura 8. Estructura química de un tanino condensado ........................................................ - 29 - Figura 9. Estructura química del ácido fítico ......................................................................... - 30 - Figura 10. Culebra japonesa de las ratas utilizadas durante la experimentación .................. - 45 - Figura 11. Comparación de tamaño de las plántulas a los diferentes días de germinación .. - 48 - Figura 12. Germinados de chía de tres días ........................................................................ - 48 - Figura 13. Germinados de chía de cuatro días..................................................................... - 48 - Figura 14. Germinados de chía de cinco días ...................................................................... - 48 - Figura 15. Germinados de chía de seis días ........................................................................ - 48 - Figura 16. Variación del porcentaje de proteína conforme al tiempo de germinación de la semilla de chía. .................................................................................................................... - 50 - Figura 17. Variación del porcentaje de lípidos totales conforme al tiempo de germinación de la semilla de chía. .................................................................................................................... - 51 - v ÍNDICE DE TABLAS Tabla I. Clasificación taxonómica de la chía (Salvia hispanica L.) propuesta por Lineo........ - 12 - Tabla II. Composición proximal de la semilla de chía mexicana. .......................................... - 16 - Tabla III. Ácidos fenólicos e isoflavonas presentes en chía (Salvia hispanica L.) ................. - 21 - Tabla IV. Producción mundial de chía .................................................................................. - 22 - Tabla V. Longitud de plántulas e índice de conversión de semillas de chía a diferentes tiempos de germinación .................................................................................................................... - 47 - Tabla VI. Resultados del Análisis Químico Proximal (AQP) de las muestras de germinados de chía de diferentes días ......................................................................................................... - 49 - Tabla VII. Resultados de digestibilidad in vitro y contenido de triptófano en germinados de Chía (Salvia hispanica L.). ............................................................................................................ - 53 - Tabla VIII. Resultados de Digestibilidad in vivo y PER ajustado para las dietas de caseína, chía control y germinado de chía ................................................................................................. - 54 - Tabla IX. Contenido de factores antinutrimentales en germinados de Chía (Salvia hispanica L.). ............................................................................................................ - 55 - iv RESUMEN La chía (Salvia hispanica L.) es una planta herbácea anual originaria de Mesoamérica y nativa de las regiones montañosas de México, fue una semilla muy importante en la dieta prehispánica, pero su cultivo se vio desplazado por los conquistadores hasta casi desaparecer. Sin embargo, gracias a estudios científicos que han demostrado su alto valor nutrimental y poder antioxidante, ha resurgido el interés en la semilla en años recientes. Los germinados, por otra parte, surgen como una nueva forma de alimentación en el mundo occidental, siendo considerados alimentos funcionales debido a su valor nutritivo. Por eso, en el presente trabajo se evaluó la calidad nutrimental de los germinados de chía. Se probaron cuatro tiempos de germinación (3, 4, 5 y 6 días) determinando el crecimiento de la plántula, composición química del germinado, digestibilidad in vitro e in vivo, contenido de triptófano y la presencia de factores antinutrimentales (taninos, ácido fítico e inhibidores de tripsina). Se encontró un incremento en el tamaño de la plántula y el índice de conversión en relación directa con el tiempo de germinación, esto mismo ocurrió con el contenido de proteínas. Los lípidos disminuyeron conforme aumentaba el tiempo de germinación; la concentración de cenizas se mantuvo constante y la fibra tuvo un incremento al quinto día. La digestibilidad de la proteína del germinado fue similar a la de la semilla, tanto en la prueba in vitro como in vivo, y el contenido de triptófano decreció desde el tercer día de germinación. En los factores antinutrimentales, la concentración de taninos se incrementó significativamente al tercer día de germinación, pero permaneció constante durante los días siguientes, mismo comportamiento presentó el ácido fítico; los inhibidores de tripsina no presentaron diferencia significativa entre el contenido de la semilla y la de los germinados, a excepción del valor a los 4 días de germinación donde presentó un pico. Con base en los resultados obtenidos, se puede decir que el germinado de chía presentó una buena calidad nutrimental comparada con la semilla, y puede ser una opción nueva y diferente para el consumo de este alimento. - 7 - INTRODUCCIÓN La chía (Salvia hispanica L.), cuyo nombre proviene del vocablo náhuatl chian y significa semilla de la que se obtiene aceite (Salgado-Cruz et al., 2014), es una planta herbácea anual de origen Mesoamericano y nativa de las zonas montañosas de México, siendo la variedad nativa de la República la Chionocalyx fernald (SAGARPA, 2015). Crece apropiadamente en suelos arcillosos o arenosos, pero no tolera heladas ni crece en la sombra (Duarte, 2011). En la parte superior de la planta se encuentra una inflorescencia o racimo con flores que van de los tonos lilas a los blancos, una vez concluido el período de floración estás se caen revelando un esquizocarpo de lóculos indehiscentes y dividido en cuatro fructificaciones llamadas mericarpios, dentro de estos se encuentra contenida la semilla de chía (Salgado-Cruz, 2014; Segura-Campos et al., 2014). Fue una semilla muy importante en la vida diaria durante la época prehispánica, ya queera utilizada como alimento, en la producción de aceites, como pago de tributos y como ofrenda para sus dioses (Ayerza & Coates, 2005; Rovati et al., 2012; Alonso-Calderón et al., 2013), pero el cultivo se vio desplazado con la llegada de los conquistadores hasta casi desaparecer (Ayerza, 2008). Gracias a recientes estudios científicos que han demostrado su alto valor nutrimental y poder antioxidante, ha resurgido el interés en ella en los últimos años, ya que es una buena fuente de proteínas, ácidos grasos (principalmente de omegas 3 y 6) y de fibra (Olivos-Lugo et al., 2010), así como de vitaminas y minerales (Muñoz et al., 2013; Salgado-Cruz et al., 2014); además presenta varios de los compuestos antioxidantes más potentes de origen natural, como el ácido rosmárico, el ácido protocatéquico, ácido cafeico, ácido gálico y daidzeína (Martínez & Paredes, 2014). El consumo de chía se ha incrementado en los últimos años, actualmente México cosecha anualmente alrededor de 7 mil toneladas de chía (SAGARPA, 2017), colocándose como el cuarto productor a nivel mundial (Scalise, 2014). Sin embargo, el mercado de la chía se encuentra estancado debido a que cada vez más países la - 8 - producen, provocando que aquellos que en un principio se encontraban como principales productores (como México) tengan que competir con otros, principalmente en el tema de la exportación. Los germinados, por otra parte, surgen como una nueva forma de alimentación en el mundo occidental y han sido considerados alimentos funcionales debido a su valor nutritivo que incluye un alto contenido de aminoácidos, fibra, elementos traza y vitaminas, así como flavonoides y ácidos fenólicos (Pásko et al., 2009). Análisis científicos realizados a otros germinados, como amaranto, soya y quínoa, han demostrado la gran calidad nutricia de estos, ya que se mejora la digestibilidad de su proteína y disminuye la concentración de factores antinutrimentales. Con base en lo anterior, se decidió trabajar con germinados de chía, planteando como objetivo general el evaluar el efecto de la germinación de la chía sobre su calidad nutrimental, comparando esta contra la de la semilla y determinar si es mejor su consumo como germinado. Para cumplir con este objetivo se evaluaron las condiciones de germinación de la semilla de chía a 25 °C y en ausencia de luz, por 3, 4, 5 y 6 días, mediante el crecimiento de la plántula y el índice de conversión, debido a que no hay estudios previos donde hayan germinado chía mexicana para tomarlos como referencia. Se determinó el efecto del tiempo de germinación de la semilla de chía sobre su calidad nutrimental mediante un análisis químico proximal (AQP), digestibilidad in vitro e in vivo y contenido de triptófano en la proteína del germinado. Finalmente se evaluar los factores antinutrimentales (taninos, ácido fítico e inhibidores de tripsina) presentes en los germinados y se analizó su comportamiento conforme al tiempo de germinación. - 9 - 1. MARCO TEÓRICO 1.1 Chía (Salvia hispanica L.) 1.1.1 Origen e historia La palabra “chía” es una adaptación al español del vocablo náhuatl chian o chien en plural, que significa "semilla de la que se obtiene aceite" (Salgado-Cruz et al., 2014). Es un cultivo anual cuyo origen procede del suroeste de nuestro país y noreste de América Central. Existe evidencia de que la chía comenzó a usarse para la alimentación humana en la época precolombina, aproximadamente en el 3500 a.C. (Beltrán-Orozco & Romero, 2003). Entre los años 2600 – 2000 a.C. comenzó su cultivo en el Valle de México por las civilizaciones Teotihuacanas y Toltecas antes de que los Aztecas se establecieran en este territorio. Su cultivo era únicamente superado por el maíz y el frijol, y seguido por el amaranto, lo que denota la importancia de este (Cahill, 2003; Vázquez-Ovando et al., 2010; Muñoz et al., 2013). Figura 1. Mujer a punto de dar a luz con bebida de chía y carne de cola de tlacuache. Códice Florentino, libro XI, figura 171v. Fuente: Arqueología Mexicana, 2007 - 10 - En el códice Florentino (figura 1), escrito por Fray Bernardino de Sahagún y que transcribe la “Historia general de las cosas de la Nueva España”, se detalla la importancia de esta semilla y se describen aspectos de producción, comercialización y uso por los Aztecas y Mayas, y aunque para éstos últimos no existe evidencia de que realizaran su cultivo, comerciaban intensamente con los centros Teotihuacanos, un hecho que duró por varios siglos y que hace suponer que la chía también era conocida por este pueblo precolombino, el cual ocupó una gran parte de México, Guatemala, Honduras y El Salvador (Ayerza & Coates, 2005). Como alimento se utilizaba en las comidas diarias, en forma de harina, mezclada con otros alimentos desde las tortillas hasta los tamales, emulsionada en agua y jugos para obtener bebidas refrescantes, uso que persiste hasta nuestros días en forma de una bebida conocida como “chía fresca” (figura 2) que consistía en agua, jugo de limón y semillas de chía (Valdivia-López & Tecante, 2015; Muñoz et al., 2013) y en forma de chiapinolli, semillas de chía tostadas y trituradas (Reyes-Caudillo et al., 2008; Cahill, 2003). Figura 2. Chía fresca. Bebida a base de agua, jugo de limón y semillas de chía que sobrevive hasta nuestros días Fuente: Chía Seed Super Foods, 2014 - 11 - Tuvo otros usos, por ejemplo: en el campo de la medicina y en la producción de aceites que servían de base para pinturas decorativas o en ungüentos cosméticos (Ayerza & Coates, 2005). Además de ser un cultivo de gran relevancia en la dieta de los Aztecas, también formaba parte de sus cultos religiosos y era ofrendada a los Dioses (Alonso- Calderón et al., 2013). Durante las guerras, su consumo fue indispensable por su condición energizante, y se usó para pago de tributos anuales por parte de los pueblos conquistados por los aztecas, recibiendo entre 5000 y 15000 toneladas de chía en su capital Tenochtitlan (Códice Mendoza, 1542; Rovati et al., 2012). A pesar de ser una especie botánica domesticada por los pueblos mesoamericanos, su cultivo se vio desplazado hasta casi desaparecer debido a las nuevas especies traídas por los conquistadores y a su asociación con prácticas religiosa (Ayerza, 2008). 1.1.2 Descripción botánica La chía recibe el nombre científico de Salvia hispanica de Carlos Lineo (1707-1778), quien la descubrió en el Nuevo Mundo y al confundirla con una planta nativa de España la clasifico como Salvia (tabla I), palabra que deriva del latín Salvare y significa el curandero. Tabla I. Clasificación taxonómica de la chía (Salvia hispanica L.) propuesta por Lineo Clasificación taxonómica Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta División: Magnoloiphyta Clase: Magnoliopsida o Dicotyledoneae Orden: Lamiales Familia: Laminaceae Subfamilia: Nepotoideae Género: Salvia Especie: hispanica Fuente: Muñoz et al., 2013. - 12 - Pertenece a la familia de las Lamiaceae (familia a la que pertenecen la menta, tomillo, romero y orégano); de esta se desprenden 7 subfamilias, 300 géneros y 7500 especies, distribuidas entre las regiones cálidas y templadas de ambos hemisferios. El género Salvia es el más diverso de la familia con alrededor de 900 especies. La chía es una planta herbácea anual de aproximadamente un metro de altura (figura 3), crece apropiadamente en suelos arcillosos o arenosos e incluso en zonas áridas, no tolera heladas, ni crece en la sombra (Duarte, 2011). Sus hojas son alargadas o en forma ovalada, de color verde oscuro en el anverso y verde pálido en el reverso (Biblioteca digital de la Medicina Tradicional Mexicana, 2009). Figura 3. Planta de Chía (Salvia hispanica L.) Fuente: Edwards, 1819. - 13 - Como se observa en la figura 4, en la parte superior presentauna inflorescencia o racimo con flores que van de los tonos lilas a los blancos (Salgado-Cruz et al., 2014). Una vez concluido el período de floración, que comprende entre Julio y Agosto, estas se caen para revelar un esquizocarpo de lóculos indehiscentes y divididos en cuatro fructificaciones llamadas mericarpios. La semilla de chía se encuentra contenida dentro de estás fructificaciones (Segura-Campos et al., 2014). Figura 4. Cultivo de chía (Salvia hispanica L.) en los Altos, Jalisco Fuente: Gaceta de la Universidad de Guadalajara, 2014 Es originaria de Mesoamérica y nativa del suroeste de California, Texas y de las regiones montañosas de México. La variedad nativa de la República Mexicana es la Chionocalyx fernald. Su cultivo en México está distribuido en los estados de Jalisco, Michoacán y Puebla (SAGARPA, 2015). - 14 - 1.1.3 Características de la semilla La semilla de chía es pequeña, lisa y brillante; presenta una forma ovalada (figura 5), es de color gris obscuro con pequeñas líneas negras, aunque ocasionalmente puede ser blanca o albina, mide aproximadamente 2mm de largo por 1 mm de ancho (Muñoz, et al., 2013). Estructuralmente está formada por tres capas de células, la primera corresponde a la capa epidermal, llamada también Exotesta (17 – 18µm). La segunda capa o subepidermal es más gruesa que la anterior (40 a 42µm) y presenta una estructura celular más compacta, mientras que la tercera o endospermo, constituye aproximadamente el 80% de la semilla. La epidermis de la semilla está formada por una superficie reticulada y ligeramente rugosa, con capas de células con formas geométricas irregulares y dispuestas en una cuadricula (Salgado-Cruz et al., 2013; Valdivia-López & Tecante, 2015). En la exotesta se presenta el mucílago, una substancia hecha de polisacáridos que se hidrata e hincha cuando entra en contacto con el agua, formando una capsula gelatinosa y pegajosa alrededor de cada semilla, la cual está fuertemente adherida a esta última capa. Actualmente se desconoce la función del mucílago, sin embargo, se cree que su Figura 5. Chía negra y chía blanca, con escala de 1 centímetro (A) y 1000 micras (B). Fuentes: (A) Valdivia-López & Tecante, 2015 y (B) Muñoz et al., 2013. B B A - 15 - presencia regula la pérdida de agua de la semilla permitiendo el crecimiento y desarrollo de la planta en regiones áridas (Ting et al., 1990). Normalmente son muy estables en condiciones de almacenamiento, debido a que no son altamente higroscópicas (Moreira et al., 2012). 1.1.4 Composición nutrimental de la semilla La composición de las semillas es variable y depende de la región donde creció el cultivo. A pesar de que la planta crece mejor en regiones tropicales y subtropicales, las plantas de chía también pueden cultivarse en climas templados (Coates & Ayerza, 1996). Debido al desconocimiento de sus propiedades nutrimentales, en la actualidad la chía no forma parte de la dieta habitual en la mayor parte del mundo; encontrándose relegada a dietas prometedoras con escasa base científica. Todo ello ha desencadenado diversos estudios científicos que están haciendo conciencia acerca de las verdaderas características nutrimentales de esta semilla no convencional. En la tabla II se aprecia que la semilla de chía es una buena fuente de proteínas y lípidos, principalmente compuestos por ácidos grasos insaturados. También presenta un importante contenido de fibra dietética y es una fuente importante de vitaminas, minerales y antioxidantes. Tabla II. Composición proximal de la semilla de chía mexicana. Componente Valor* (g/ 100 g, gramos secos) Humedad 5.94±0.4 Lípidos 32.23±0.8 Proteína 24.60±2.5 Cenizas 5.96±0.6 Fibra dietética (total) 34.59±0.7 Carbohidratos (por diferencia) 2.62 * promedio ± DE (Desviación Estándar), n = 3 Fuente: Olivos-Lugo et al., 2010 - 16 - 1.1.4.1 Lípidos Alrededor del 25 al 30% de la semilla está compuesta por lípidos y una de las características más importantes es su alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (Álvarez-Chávez et al., 2008). Se ha encontrado que el 97% del aceite de chía está compuesto por lípidos neutros, y el 57% de éstos son ácido α-linolénico. Este es un ácido graso con tres insaturaciones conocido como omega 3 y cuyo consumo repercute en importantes beneficios, como en la reducción del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares. También se reporta un 17% de ácido linoleico (omega 6), 9% de oleico y sólo un 1% de ácidos grasos saturados: palmítico, esteárico y araquídico principalmente (Vázquez-Ovando et al., 2010). En el estudio específico de la fracción lipídica de la chía mexicana, Álvarez-Chávez (2008) encontró un porcentaje mayor de ácido α-linolénico con un 62% para las semillas cultivadas en los estados en Sinaloa y Jalisco. Además, en el mismo trabajo, se encontró que el aceite de chía es una fuente rica en fitoesteroles comparada con otros aceites vegetal de gran importancia comercial como el de oliva, cacahuate y de semillas de sésamo. La importancia de los omega 3 radica en que son precursores de los ácidos eicosapentanoico EPA (C20:5) y docosahexanoico DHA (C22:6), estos ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs por sus siglas en inglés) son considerados como esenciales debido a que no son producidos naturalmente por el cuerpo humano; además tienen un importante papel en la coagulación sanguínea (EPA) y en la disminución de la agregación plaquetaria y de los niveles de triglicéridos en sangre (Bemelmans et al., 2002). La semilla de chía tiene el mayor porcentaje de ácido α-linolénico (ALA) conocido para una fuente vegetal, y la mejor relación entre omegas 6 y 3 (n-6/n-3) (0.32) comparada con otras semillas como la linaza y la perilla, así como un interesante contenido de tocoferoles y esteroles (Cifti et al., 2012; Sargi et al., 2013). - 17 - 1.1.4.2 Fibra La fibra dietética contenida en los alimentos, y especialmente en granos enteros es un importante biocomponente debido a su potencial beneficio a la salud. Es una mezcla de compuestos, consistiendo principalmente de oligosacáridos y polisacáridos propios de las plantas, como la celulosa, hemicelulosa, pectinas y gomas que pueden estar asociadas a ligninas y otros componentes que no pertenecen a los carbohidratos, por ejemplo polifenoles, ceras, saponinas, cutinas, fitatos, y proteínas resistentes (Valdivia-López & Tecante, 2015). La semilla de chía es considerada una excelente fuente de fibra (compuesta por celulosa, hemicelulosa y ligninas); tanto la semilla completa como la fracción fibrosa de la chía presentan una alta concentración de Fibra Dietética Total (FDT, 33.5±2.7 g/100 g sólidos secos), consistiendo principalmente en Fibra Dietética Insoluble (FDI, 25.4±2.2 g/100 g sólidos secos) y Fibra Dietética Soluble (FDS, 8.2±0.8 g/100 g sólidos secos) (Sandoval- Oliveros y Paredes-López, 2013). El principal componente de la FDI es la lignina Klason (KL), la cual representa del 39- 41% del total. La KL supuestamente protege a los ácidos grasos insaturados de la chía incorporándolos a su estructura fuerte y resistente, así como por sus propiedad para ligar antioxidantes a sí misma. El contenido de carbohidratos neutros en la FDI es del 13.79% al 14.97%, observando la presencia principalmente de celulosa y hemicelulosa, y un bajo contenido de ácido urónico (3.05-3.60%), que representa el contenido de residuos del ácido glucuronico, asociado con la hemicelulosa insoluble (Valdivia-López & Tecante, 2015; Reyes-Caudillo et al., 2008). El mucilago presente en la chía actúa como fibra soluble (FDS), está compuesto principalmente por azúcares neutros. El bajo contenido de ácido urónico sugiereque no hay pectina asociada al mucílago (Lin et al., 1994). Tiene una excelente capacidad de retención de agua (Muñoz et al., 2012), además el gel que forma crea una barrera física entre los carbohidratos de la semilla y las enzimas digestivas, las cuales degradan el mucílago decreciendo así la conversión de carbohidratos en azúcares mientras se incrementa la sensación de saciedad (Salgado-Cruz et al., 2014; Rubio, 2002). - 18 - 1.1.4.3 Proteínas La proteína contenida en la chía está en el rango del 16-23%, dependiendo de la región geográfica donde el cultivo se desarrolló. Este valor es alto comparado con otros granos y cereales que normalmente tienen menos del 16%. El contenido de aminoácidos limitantes en la proteína de la chía es más complejo que la de otros granos, siendo en los últimos limitada a dos o tres aminoácidos (Ayerza & Coates, 2001). La proteína de chía, obtenida al retirar la grasa y sin mucílago, está constituida por 17.3% de albuminas crudas, 52% de globulinas, 12.7% de prolaminas y 14.5% de glutelinas (Sandoval-Oliveros & Paredes-López, 2013). El perfil de aminoácidos de la chía ha sido ampliamente discutido, ya que a pesar de que varias investigaciones alrededor del mundo aseguran que su proteína es completa, la investigación de Olivos-Lugo, Valdivia-López y Tecante (2010), realizada a la fracción proteica de la chía mexicana, arrojó que dicha fracción presenta una alta concentración de ácido glutámico (123 g/Kg de proteína cruda), arginina (80.6 g/Kg de proteína cruda), y de ácido aspártico (61.3 g/Kg de proteína cruda). Sin embargo, el perfil de aminoácidos esenciales presenta deficiencias con respecto al estándar propuesto por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (FAO/WHO/ONU, 1985) para niños en edad preescolar. Por lo tanto, la chía no es recomendada como única fuente de proteína y es necesaria suplementarla con fuentes ricas en lisina, ya que este es el aminoácido limitante. Sin embargo la investigación de Ting (1990) indica que a diferencia de otras semillas y cereales, la proteína de la chía no presenta aminoácidos limitantes para el estándar de la OMS en adultos, igualmente resalta que el ácido glutámico se encuentra en una gran proporción, y hoy en día este aminoácido ha sido objeto de varios estudios en humanos y animales por su participación en funciones relevantes en el metabolismo del tejido cerebral (Ting et al., 1990; Kelly & Stanley, 2001; Salgado-Cruz et al., 2014). - 19 - 1.1.4.4 Compuestos antioxidantes Entre la diversidad de compuestos presentes en todas las variedades de chía, los antioxidantes son, sin duda, uno de los más importantes. Los antioxidantes en la semilla son compuestos fenólicos y pueden estar en su forma libre o ligados a azúcares por enlaces glucosídicos, lo que incrementa su solubilidad en agua (Valdivia-López & Tecante, 2015). Reyes-Caudillo, Tecante y Valdivia-López (2008) reportan en su estudio un contenido total de compuestos fenólicos de 0.9211±0.040 mg/g de extracto de chía o GAE (Gallic Acid Equivalents) para la semillas proveniente de Jalisco, y 0.8800±0.008 GAE para la de Sinaloa, se puede apreciar que entre ambos valores no existe una diferencia significativa. También encontraron que el extracto analizado de la semilla de chía no contiene al grupo de las antocianinas; y el grupo de los flavonoles es el que se presenta en mayor proporción. En estudios más recientes, Martínez-Cruz y Paredes-López (2014) analizaron los compuestos fenólicos totales, la actividad antioxidante y cuantificaron los ácido fenólicos e isoflavonas por UHPLC (ultrahigh-performance liquid chromatography, por sus siglas en inglés). Los compuestos fenólicos identificados y cuantificados en el extracto de chía se presentan en la tabla III, siendo los más abundantes el ácido rosmárico, el ácido protocatéquico, ácido cafeico, ácido gálico y daidzeína. Adicionalmente, el ácido ferúlico, glicitina, genistina, gliciteína y genisteína también fueron detectados. - 20 - Tabla III. Ácidos fenólicos e isoflavonas (en mg/g de semilla) presentes en la chía (Salvia hispanica L.) Compuesto Promedio Máximo Mínimo Ácido gálico 0.0115±0.0000 0.0116 0.0114 Ácido cafeico 0.0274±0.0011 0.0294 0.0265 Ácido clorogénico ND ND ND Ácido ferúlico T T T Ácido protocatéquico 0.7471±0.0102 0.7593 0.7355 Ácido rosmárico 0.9267±0.0187 0.9546 0.8963 Daidzeína 0.0066±0.0007 0.0084 0.0060 Glicitina 0.0014±0.0007 0.0027 0.0009 Genistina 0.0034±0.0009 0.0045 0.0024 Gliciteína 0.0005±0.0000 0.0006 0.0004 Genisteína 0.0051±0.0003 0.0055 0.0044 Valor ± desviación estándar (n=6), T = trazas, ND = no detectado Fuente: Martínez-Cruz & Paredes-López, 2014. En resumen, la semilla de chía presenta una gran capacidad antioxidante, comparable incluso con el Trolox® y con el antioxidante comercial TBHQ (terbutil hidroquinona) (Reyes-Caudillo et al., 2008); sus compuestos fenólicos pueden disminuir la invasión de células cancerosas, remover las especies reactivas de oxígeno y mejorar los resultados clínicos en determinadas enfermedades (Martínez-Cruz & Paredes-López, 2014; Sargi et al., 2013), y es una novedosa fuente de isoflavonas que pueden ser incorporadas a la dieta humana. 1.1.4.5 Vitaminas y Minerales La chía es una buena fuente de vitamina B (B1, B2 y B3) y vitamina A; comparado con otros cereales, presenta un mayor contenido de niacina que el arroz, el maíz y la soya, y - 21 - un contenido similar de tiamina y riboflavina que el arroz y el maíz (Muñoz et al., 2013; Salgado-Cruz et al., 2014). Además, es una excelente fuente de minerales como el calcio, magnesio, fósforo, hierro, zinc y cobre (Salgado-Cruz et al., 2014; Beltrán-Orozco & Romero, 2003). El hierro en la chía (7.72 mg/100 g semilla) es 6 veces mayor que el contenido en la espinaca, 1.8 veces más que en las lentejas y 2.4 veces más que en el hígado (Muñoz et al., 2013). 1.1.5 Cultivo de chía en México y alrededor del mundo En la actualidad la chía se cultiva comercialmente en México, Bolivia, Argentina, Ecuador, Australia y Guatemala. En Argentina y México es un cultivo de verano-otoño, en Bolivia la chía en un cultivo de otoño-invierno, sembrada después de la cosecha de los otros cultivos. El registro nacional de la SAGARPA registró que en el 2015 la República Mexicana tuvo un total de 13,164.80 hectáreas (Ha) sembradas con chía, cosechando 6,960.94 toneladas y obteniendo un rendimiento de semilla de 0.53 Ton/Ha, a un precio por tonelada de $46,628.32. Esto repercutió en una producción con un valor de 324,576.91 miles de pesos. En la tabla IV se aprecia que el principal productor de chía a nivel mundial desde el año 2014 es Argentina con 47,000 toneladas, seguido de Paraguay, Bolivia y México (Scalise, 2014). Tabla IV. Producción mundial de chía Principales países productores 2014 Hectáreas (Ha) Toneladas (Tn) Argentina 67,120 47,000 Paraguay 100,000 32,000 Bolivia 55,000 27,500 México 20,000 11,000 - 22 - Nicaragua 12,400 8,165 Australia 5,500 3,055 Perú 1,800 2,880 Ecuador 2,200 1,400 Resto 9,000 3,000 Total mundial 273,000 136,000 Fuente: Scalise, 2014. En los países donde la chía no es nativa, como en la Gran Bretaña, el cultivo es a pequeña escala: las semillas se siembran en un invernadero en marzo y abril. La germinación usualmente tarda un lapso de dos semanas. Dichos germinados se trasplantan cuando tienen la altura suficiente para ser colocadas en macetas individuales (Beltrán-Orozco & Romero, 2003). 1.2 Semillas y germinación 1.2.1 Aspectos generales de las semillas La semilla (figura 6) es la primera fase del desarrollo de una nueva planta; desarrollada a partir de un óvulo es la unidad de reproducción sexual de las plantas ysu función es la de dar lugar a un nuevo individuo, perpetuando y multiplicando la especie a la que pertenece (Universidad Politécnica de Valencia, 2003). Es un embrión de planta perfectamente protegido y acompañado de un almacén de alimento, y en la madurez consta de las siguientes partes: el esporófito joven y parcialmente desarrollado llamado embrión (formado por un eje embrionario y uno, dos o varios cotiledones); una cantidad variable, a veces ninguna, de endospermo (de las palabras griegas que significan dentro y semilla), y las capas protectoras, las cubiertas de la semilla o testa, que deriva del tegumento (Esau, 1972; Boesewinke & Bouman, 1995). - 23 - Figura 6. Partes de una semilla de Ricinus communis Fuente: Universidad Politécnica de Valencia, 2003 Las semillas se vuelven impermeables durante la última etapa de maduración, y para que cumpla con su objetivo es necesario que el embrión se transforme en una plántula, que sea capaz de valerse por sí misma y, finalmente convertirse en una planta adulta. Todo ello comprende una serie de procesos metabólicos y morfogenéticos cuyo resultado final es la germinación de las semillas (Bewley et al., 1978). 1.2.2 Germinación en semillas El termino germinación es usado para referirse a una largo número de procesos o eventos consecutivos que causan que una semilla seca en reposo, en respuesta a la hidratación, muestre un incremento en su actividad metabólica general e inicie la formación de una nueva planta a partir del embrión. El punto exacto en que la germinación termina y comienza el crecimiento de la nueva planta es extremadamente difícil de definir, debido a que se identifica como germinación a la emergencia de alguna parte del embrión, es decir la plántula, a través de la cubierta de la semilla, y esto en sí mismo ya es un resultado del crecimiento (Mayer, 1989). Sin embargo muchos autores definen a la germinación como el conjunto de procesos que se producen en la semilla desde que el embrión comienza a crecer hasta que se ha formado una pequeña planta que puede vivir por sí misma, independientemente del alimento almacenado en la semilla (De la Cuadra, 1993). - 24 - 1.2.3 Condiciones de germinación Para que tenga lugar la germinación tienen que reunirse una serie de condiciones, tanto en la semilla como en el ambiente que la rodea. Los factores más importantes que afectan la germinación de las semillas son la disposición de agua, la aireación (presencia de oxígeno), la temperatura y la luz. Debido a que las semillas tienen un bajo contenido de agua (alrededor del 10 al 15%), necesita tomar una cantidad considerable de esta antes de que la germinación pueda ocurrir (Wareing, 1969). El primer paso para que ocurra la germinación es conocido como imbibición (figura 7). Es el periodo durante el cual la semilla absorbe agua y se hincha. El agua que rodea a la semilla pasa a través de las envueltas seminales, penetran en su interior y al llegar al embrión, en cantidad suficiente, éste se activa y comienzan los procesos de respiración, síntesis proteica y movilización de reservas, que terminarán con el desarrollo de la planta. Las propiedades de imbibición de las semillas derivan de los materiales coloidales que contienen, especialmente proteínas y carbohidratos como el almidón (Bewley et al., 1994). El siguiente paso es la digestión y transporte de alimentos, ya que lo primero que necesita el embrión para comenzar a desarrollarse es alimento. Por ello libera enzimas digestivas que disuelven parte de las sustancias de reserva, que son absorbidas desde el tejido almacenador hasta el embrión. Gracias a esta alimentación el embrión puede respirar más rápidamente y crecer (Wareing, 1969). La tercera etapa es la elongación celular, durante la cual las células embrionarias, que son pequeñas antes de la germinación, aumentan de tamaño antes de comenzar a multiplicarse. El embrión utiliza las proteínas, las grasas y los hidratos de carbono, digeridos y absorbidos, para respirar y para alargar sus células. La multiplicación celular no comienza hasta que haya concluido este proceso de alargamiento celular (Simon, 1984). - 25 - La última etapa es la germinación visual, durante la cual la elongación del embrión abulta la semilla hasta que uno de los extremos del eje embrionario rompe las envueltas seminales y aparece claramente a nuestra vista, dando la primera señal palpable de que la semilla está germinando. El extremo del eje embrionario que aparece primero es el lado libre del hipocotilo, al que se llama radícula, que dará lugar a la raíz principal. Muy pronto aparecerá el otro extremo del eje embrionario o epicotilo que formará el primer brote o plántula (Simon, 1984). Figura 7. Etapas de germinación de una semilla Fuente: Depósitos de documentos de la FAO, 2003 Antes se ha mencionado que la semilla necesita una serie de condiciones para que pueda germinar. Estas condiciones o factores se pueden dividir en dos tipos: • Factores intrínsecos: propios de la semilla. -Madurez: se dice que una semilla es madura cuando ha alcanzado su completo desarrollo tanto desde el punto de vista morfológico como fisiológico. La madurez morfológica se suele alcanzar sobre la misma planta. Aunque la semilla sea morfológicamente madura, muchas de ellas pueden seguir siendo incapaces de germinar porque necesitan experimentar una serie de transformaciones fisiológicas; en general, necesitan un reajuste en el equilibrio hormonal de la semilla entre las sustancias inhibidoras y promotoras de la germinación, y en la sensibilidad de sus tejidos para las distintas sustancias activas (Boesewinke & Bouman, 1995). Imbibición Transporte de alimentos Elongación celular Germinación visula - 26 - -Viabilidad de las semillas: la viabilidad de las semillas es el período de tiempo durante el cual las semillas conservan su capacidad para germinar. Es un período variable y depende del tipo de semilla y de las condiciones de almacenamiento (Universidad Politécnica de Valencia, 2003). • Factores extrínsecos: dependen del ambiente. -Agua: una semilla tiene que disponer de agua para poder germinar. El agua es el factor ambiental más limitante para la germinación y ha de estar disponible en una cantidad adecuada, ya que tanto su exceso como su defecto trae consecuencias negativas para la germinación (De la Cuadra, 1993). -Temperatura: respecto a la influencia que la temperatura tiene sobre la germinación, cabe destacar que cada especie presenta una temperatura máxima, por encima de la cual sus semillas no podrán germinar, una temperatura óptima a la cual las semillas germinan mejor y con mayor rapidez, y una temperatura mínima, por debajo de la cual las semillas de esa especie no pueden germinar (De la Cuadra, 1993). -Gases: la mayor parte de las semillas requieren para su germinación un medio suficientemente aireado que permita una adecuada disponibilidad de oxígeno (O2) y dióxido de carbono (CO2). De esta forma el embrión obtiene la energía imprescindible para mantener sus actividades metabólicas (Universidad Politécnica de Valencia, 2003). -Presencia o ausencia de luz: en muchos casos las semillas germinan indiferentemente bajo la luz o en la oscuridad. Sin embargo, muchas semillas sólo germinarán en presencia de luz, mientras que la germinación de otras queda fuertemente inhibida por efecto de la misma (De la Cuadra, 1993). 1.3. Germinados como alimentos funcionales Los germinados o brotes son alimentos caracterizados por tener una mejor calidad nutricia en relación al mismo alimento sin germinar. Presentan características propias de la hortaliza como plántulas suculentas de ciclo vegetativo corto que va de tres a diez días según la especie; al ser consumidos en fresco se evita la alteración de su valor nutricio -27 - por la cocción, como sucede con otros alimentos. Pueden ser cultivados en cualquier época del año, son de fácil producción y de bajo costo (Barrón-Yánez, et al., 2009) En muchos países del mundo el consumo de germinados es muy común; en otros no son tan frecuentes ni se conocen sus propiedades y en algunos se están conociendo recientemente; sin embargo la germinación como fuente de alimentos, es uno de los procesos más antiguos usados desde hace siglos. En China, en el año 3000 a.C., el emperador Shen Nong Ben Cao Jing incentivaba a su pueblo al consumo diario de germinados de legumbres (Ponce de León, 2013). En años recientes, los germinados han surgido en el mundo occidental como una nueva forma de nutrición a través de su consumo. Siendo considerados como vegetales atípicos e inclusive como alimentos funcionales, debido a su valor nutritivo que incluye un alto contenido de aminoácidos, fibra, elementos traza y vitaminas, así como flavonoides y ácidos fenólicos (Pásko et al., 2009). 1.4 Factores Antinutrimentales El término “factores antinutrimentales” se utiliza para calificar a aquellos compuestos que afectan el valor nutricional de algunos alimentos, especialmente de semillas, pues dificultan o inhiben la asimilación de nutrientes que provienen generalmente de origen vegetal (minerales y proteínas) (Elizalde et al., 2009). Estos factores pueden ser clasificados como: 1) inhibidores de enzimas (substancias que inhiben enzimas digestivas como la tripsina, quimotripsina, amilasa y carboxipeptidasa); 2) Antivitamínicos; y 3) Agentes secuestrantes de minerales (cómo los taninos, el ácido fítico o fitato y los oxalatos) (Watson, 1987). 1.4.1 Taninos Los taninos (figura 8) son substancias que actúan como protección química ante los depredadores de la semilla, cuyo rango va desde vertebrados e insectos, hasta hongos y microbios. Los taninos son un grupo complejo y heterogéneo de derivados del fenol, extensamente distribuidos en el cuerpo de las plantas y abundantes de las capas de las - 28 - semillas. Los taninos, como factores antinutrimentales, no tienen una acción directamente tóxica, pero pueden hacer ciertas partes de las plantas menos digeribles ya que dificultan que sean metabolizadas. Otras funciones probables de los taninos son dar protección de la luz, impartir color a las semillas, restringir la germinación obstaculizando el flujo de gas (oxígeno) y retrasar la descomposición de las capas de las semillas en el suelo (Boesewinke & Bouman, 1995). Figura 8. Estructura química de un tanino condensado Fuente: Liener, 1980. 1.4.2 Ácido fítico El ácido fítico (figura 9) y sus sales constituyen la principal forma de almacenamiento de fósforo (P) en semillas de cereales y leguminosas. Sin embargo, en esta forma el P permanece no disponible para el hombre y animales monogástricos, debido a que éstos no están provistos de suficiente actividad de fosfatasas endógenas (fitasas) que sean capaces de liberar el grupo fosfato de la estructura del fitato (Derache, 1990). - 29 - El ácido fítico es un ácido orgánico con actividad antinutricional, debido a su capacidad de formar complejos insolubles con minerales y proteínas convirtiéndolos en no asimilables por el organismo bajo condiciones fisiológicas (Martínez et al., 2002). Paradójicamente, el ácido fítico, a bajas dosis, presenta también efectos positivos sobre la salud como son su acción protectora contra el cáncer, reducción de la formación de cálculos renales y prevención de enfermedades cardiovasculares (Szkudelski, 1997). Figura 9. Estructura química del ácido fítico Fuente: Martínez et al., 2002 1.4.3 Inhibidores de tripsina Los inhibidores de tripsina son sustancias de carácter proteico, que se encuentran en leguminosas. En presencia de una proteasa y un sustrato producen una notoria disminución en la velocidad de la reacción catalizada por la enzima (Quicazán & Caicedo, 2012). Esta acción tiene grandes implicaciones en el valor nutricional de los alimentos que los contienen tanto para el hombre como para los animales; el páncreas, glándula productora de la mayoría de las enzimas digestivas, se afecta notablemente y se evidencia su hipertrofia ante la ingestión continua del alimento con el inhibidor (Liener, 1980). - 30 - 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo general Evaluar el efecto de la germinación de la semilla de chía sobre su calidad nutrimental para determinar si mejora en comparación con el grano. 2.2 Objetivos particulares Para cumplir el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos particulares: 1. Evaluar las condiciones de germinación de la semilla de chía a 25 °C y en ausencia de luz, por 3, 4, 5 y 6 días, mediante el crecimiento de plántula y el índice de conversión. 2. Determinar el efecto del tiempo de germinación de la semilla de chía sobre su calidad nutrimental mediante un análisis químico proximal (AQP), digestibilidad in vitro y contenido de triptófano en la proteína del germinado, así como por un método biológico para determinar la Relación de Eficiencia Proteica (PER) y la digestibilidad in vivo. 3. Evaluar los factores antinutrimentales (taninos, ácido fítico e inhibidores de tripsina) presentes en los germinados y analizar su comportamiento conforme al tiempo de germinación. - 31 - 25° C Ausencia de luz 3, 4, 5, y 6 días 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Cuadro metodológico Objetivo general Germinación Secado y molienda Objetivo particular 1 Médición de plántula Calculo del índice de conversión Objetivo particular 2 AQP Digestibilidad in vitro e in vivo y triptófano Objetivo particular 3 Factores antinutrimentales Resultados Conclusiones Referencias Secado: 75° C, 1 hora Tamizado malla 40 Actividades previas - 32 - 3.2 Material biológico Para la experimentación se trabajó con semillas de chía (Salvia hispanica L.), cosecha 2014 cultivadas en el estado de Puebla. Compradas en la Central de Abastos de la Ciudad de México. 3.3 Actividades previas 3.3.1 Germinación de la semilla Se pesaron 5 g de semillas de chía (Salvia hispanica L.) y se colocaron en cajas plásticas, previamente lavadas y desinfectadas, de 12x19x34.5 cm. Se esparcieron sobre una tela soporte impregnada con una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1%. La germinación de las semillas se llevó a cabo a 25° C y en ausencia de luz, hidratándolas asperjando agua destilada cada 24 horas, se mantuvo por 3, 4, 5 y 6 días. 3.3.2 Obtención de muestra seca El germinado se retiró manualmente de la tela soporte y se colocó en una charola de aluminio. Se deshidrato en horno de convección a 75° C por una hora. Una vez seco se molió en un molino de cuchillas con malla #40 serie Tyler USA. El germinado seco se almacenó en un recipiente de vidrio con tapa a 4° C hasta su uso. 3.3.3 Medición de la plántula Se tomaron 10 plántulas al azar a los cuatro diferentes tiempos de germinación; se midió con una regla de 30 cm la plántula y radícula. Se estableció un promedio del tamaño del germinado en centímetros (cm). - 33 - 3.3.4 Índice de conversión Se determinó el índice de conversión (IC) de semilla-germinado, pesando en una balanza analítica, la cantidad de germinado obtenido a partir de los 5 g de semilla que se colocaron para su germinación (Barrón-Yañez et al., 2009). Este parámetro indica el porcentaje en peso de la semilla que fue transformado en germinado y el cálculo se realiza con la siguiente fórmula: 𝐼𝐼𝐼𝐼 = 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑃𝑃𝑑𝑑 𝑔𝑔𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑑𝑑𝑃𝑃 (𝑔𝑔) 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝑑𝑑𝑑𝑑𝑔𝑔 (𝑔𝑔) 𝑥𝑥100 3.4 Análisis Químico Proximal(AQP) Se realizó el Análisis Químico Proximal (AQP) al germinado deshidratado y molido según los métodos de la AOAC (2002). } 3.4.1 Determinación de humedad por el método de sólidos totales y humedad en harina (925.09, AOAC) La técnica se basa en una determinación gravimétrica en la que se obtiene la diferencia de pesos de una muestra antes y después de secarse en un horno a una temperatura constante de 130 ° C durante una hora. Procedimiento: Pesar de 3 a 5 gramos de muestra en una caja de aluminio (pesa filtro), la cual ha sido previamente puesta a peso contante durante 2 horas (pesado cada hora) a 130° C. Secar la muestra 1 hora en la estufa a 130°C. Retirar de la estufa, dejar enfriar en el desecador y pesar tan pronto como se equilibre con la temperatura ambiente. Repetir el proceso de secado hasta que se llegue a peso constante. La prueba se realizó por triplicado. - 34 - El cálculo del porcentaje de humedad se realizó de acuerdo a la siguiente formula: % 𝐻𝐻𝐻𝐻𝑔𝑔𝑃𝑃𝑑𝑑𝑔𝑔𝑑𝑑 = W2 − W3 𝑊𝑊1 ∗ 100 Donde: W1= Peso de la muestra (g) W2= Peso de la muestra húmeda (g) W3= Peso de la muestra seca (g) 3.4.2 Determinación de porcentaje de proteínas por el método Microkjeldahl (954.01, AOAC) La técnica se basa en la determinación del nitrógeno total por el método Kjeldahl, su principio es determinar la materia nitrogenada total, basándose en la digestión de la muestra en ácido sulfúrico para reducir el nitrógeno orgánico hasta amoniaco, el cual queda en forma de sulfato de amonio. Concluida la digestión se alcaliniza, se destila directamente o por arrastre con vapor para desprender el amoniaco, el cual es atrapado en una solución ácida y titulado con ácido clorhídrico (HCl) 0.1N. Procedimiento: Pesar 0.1 g de muestra e introducirlo en un tubo de digestión Kjeldahl, se agregan 0.2 g de sulfato de cobre pentahidratado (Cu2SO4·5H2O), 1.5 gramos de sulfato de potasio (K2SO4) o sulfato de sodio (Na2SO4) y 2 ml de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Encender la parrilla y colocar los tubos para iniciar la digestión. Accionar la campana para que succione los vapores que se producen. Calentar hasta total destrucción de la materia orgánica, es decir después de 90 minutos, en ese tiempo la muestra debe quedar como un líquido transparente con una coloración azul verdosa. - 35 - En un matraz Erlenmeyer de 125 mL adicionar 50 mL de ácido bórico (H3BO3) al 4% y tres gotas de indicador de fenolftaleína. Encender el equipo de destilación y enjuagarlo con agua destilada, una vez limpio, asegurarse que las llaves de descarga estén cerradas y de llenar con agua destilada la burbuja de cristal, para introducir el calentador y conectarlo. Colocar el matraz en el aparato de destilación, cuidando de introducir la alargadera hasta el fondo de la solución. Poner en la copa superior del equipo la muestra tibia (la cual previamente se colocó a baño maría con 5 mL de agua destilada); abrir la primera llave de descarga y dejar caer la muestra, posteriormente cerrarla. Agregar en la copa 10 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 40% y descargarlo con mucho cuidado para evita que sifonee la solución presente en el matraz Erlenmeyer. Dejar destilar hasta alcanzar un volumen de destilado de 100 mL. Una vez finalizada la destilación lavar el equipo con una solución de ácido acético al 30% por dentro y fuera y enjuagar con agua destilada. Titular el exceso de ácido con una solución de HCl 0.1N. Realizar una prueba en blanco empleando la misma cantidad de catalizador y ácido sulfúrico. Repetir la prueba por triplicado. Para obtener el porcentaje de proteína se utilizó la siguiente fórmula: %𝑁𝑁𝑔𝑔𝑁𝑁𝑔𝑔ó𝑔𝑔𝑃𝑃𝑔𝑔𝑃𝑃 = (mL de HCl) ∗ (Normalidad del HCl) ∗ 0.014 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑔𝑔 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 (𝑔𝑔) ∗ 100 % 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑔𝑔𝑃𝑃𝑁𝑁𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔 = %𝑁𝑁𝑔𝑔𝑁𝑁𝑔𝑔ó𝑔𝑔𝑃𝑃𝑔𝑔𝑃𝑃 ∗ 𝐹𝐹 Donde: F= Factor de conversión (6.25) - 36 - 3.4.3 Determinación de porcentaje de lípidos o extracto etéreo por la técnica de extracción Soxhlet (920.39, AOAC) La determinación se realizó por la técnica de extracción Soxhlet, su principio se basa en la extracción directa con un solvente, donde el mejor agente es el éter de petróleo, finalmente se somete a secado en horno durante 30 minutos, para determinar la grasa total extraída. Procedimiento: Poner a peso constante un matraz bola de fondo plano con perlas o piedras de ebullición en la estufa a 110° C, aproximadamente 2 horas (pesando cada hora). Pesar 3 gramos de muestra libre de humedad sobre papel poroso, enrollarlo y colocarlo en un cartucho, tapar con algodón y colocarlo en el extractor. Conectar el matraz al extractor y éste al refrigerante. Agregar dos cargas de hexano (éter etílico) por el refrigerante y calentar el matraz con parrilla a ebullición suave. Para verificar que se ha extraído toda la grasa, dejar caer una gota de la descarga sobre papel filtro, al evaporarse el hexano (éter) no debe dejar residuo de grasa. Una vez extraída toda la grasa, quitar el cartucho con la muestra desengrasada, seguir calentando hasta la casi total eliminación del éter recuperándolo antes de que se descargue. Quitar el matraz y secar el extracto a 75-80° C por 30 minutos, enfriar en desecador y, una vez alcanzada la temperatura ambiente, pesar. Realizar la prueba por triplicado. Se utilizó la siguiente ecuación para obtener el porcentaje de lípidos: %𝐸𝐸𝑥𝑥𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔𝐸𝐸𝑁𝑁𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑁𝑁é𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃 = W3 − W2 W1 ∗ 100 Donde: W1= Peso la muestra (g) antes de la desecación W2= Peso del matraz sin muestra (g) W3= Peso del matraz con grasa (g) - 37 - 3.4.4 Determinación de porcentaje de cenizas por el método de incineración (923.03, AOAC) Se realizó por el método de incineración, empleando una mufla. Su principio se basa en una determinación gravimétrica. Para su determinación se siguen los siguientes pasos: pesar de 3 a 5 gramos de muestra en un crisol (no pasar la mitad del crisol con la muestra), que ha sido puesto a peso constante durante 2 horas (pesado cada hora) a 600° C. Calcinar la muestra, inicialmente con un mechero en la campana hasta que no se desprendan humos y posteriormente meter a la mufla 2 horas (pesando cada hora) a 530° C. Repetir la operación anterior si es necesario, hasta conseguir unas cenizas blancas o ligeramente grises, homogéneas y que este a peso constante. Enfriar (fuera 8 minutos y posteriormente meter al desecador por 5 minutos, tiempo total de enfriado 13 minutos) y pesar. Realizar la prueba por triplicado. Se utilizó la siguiente fórmula para obtener el porcentaje de cenizas: % 𝐼𝐼𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝐶𝐶𝑔𝑔 = C − A B − A ∗ 100 Donde: A= masa del crisol (g) B= masa del crisol con muestra (g) C= masa del crisol con muestra calcinada (g) 3.4.5 Determinación de fibra por el método de fibra cruda o Weende (989.03, AOAC) El método se basa en tratar la muestra desengrasada, con soluciones de ácido sulfúrico (H2SO4) e hidróxido de sodio (NaOH) de concentraciones conocidas. Separar el residuo por filtración, lavar, secar y pesar el residuo insoluble, determinando posteriormente su pérdida de masa por calcinación a 550°C. - 38 - Procedimiento: Pesar de 1 a 3 gramos de muestra desengrasada y añadir 200 mL de H2SO4 al 1.25%. Llevar a ebullición y mantenerla durante treinta minutos. Transcurridos el tiempo adicionar 200 mL de NaOH al 2.5% y llevar a ebullición durante treinta minutos más. Filtrar con el papel filtro que ha sido colocado a peso constante durante 1 hora (pesado cada 30 minutos) y embudo Büchner en un matraz, lavar con agua destilada hasta alcanzar un pH neutro. Deshidratar lavando con alcohol dos o tres veces. Llevar el papel a la estufa y secarlo a 110° C duranteuna hora. Dejar enfriar en desecador y pesar. Colocar el papel en un crisol a peso constante y calcinar durante una hora a 550° C. Dejar enfriar en desecador y pesar rápidamente. Se utilizaron las siguientes ecuaciones para obtener el porcentaje de fibra: 𝑃𝑃𝑃𝑃1 = 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑝𝑝𝑔𝑔𝑝𝑝𝑃𝑃𝑑𝑑 𝐸𝐸𝑃𝑃𝑔𝑔 𝐹𝐹𝑔𝑔𝐹𝐹𝑔𝑔𝑔𝑔 − 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑝𝑝𝑔𝑔𝑝𝑝𝑃𝑃𝑑𝑑 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑃𝑃2 = 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑔𝑔𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃𝑑𝑑 𝐸𝐸𝑃𝑃𝑔𝑔 𝐸𝐸𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝐶𝐶𝑔𝑔𝑃𝑃 − 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑔𝑔𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃𝑑𝑑 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑑𝑑𝑃𝑃 %𝐹𝐹𝑔𝑔𝐹𝐹𝑔𝑔𝑔𝑔 = 𝑃𝑃𝑃𝑃1 − 𝑃𝑃𝑃𝑃2 𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑔𝑔 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 (𝑔𝑔) ∗ 100 Donde: PT1= Peso de fibra PT2= Peso de fibra incinerada 3.4.6 Determinación de porcentaje de hidratos de carbono La determinación del porcentaje de hidratos de carbono se hace por diferencia, a partir de la siguiente fórmula: %𝐻𝐻𝑔𝑔𝑑𝑑𝑔𝑔𝑔𝑔𝑁𝑁𝑃𝑃𝑃𝑃 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑔𝑔𝑔𝑔𝐹𝐹𝑃𝑃𝑔𝑔𝑃𝑃 = 100− (%ℎ𝐻𝐻𝑔𝑔𝑃𝑃𝑑𝑑𝑔𝑔𝑑𝑑 + %𝑝𝑝𝑔𝑔𝑃𝑃𝑁𝑁𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔𝑃𝑃 + %𝑑𝑑í𝑝𝑝𝑔𝑔𝑑𝑑𝑃𝑃𝑃𝑃 + %𝐸𝐸𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝐶𝐶𝑔𝑔𝑃𝑃 + %𝑓𝑓𝑔𝑔𝐹𝐹𝑔𝑔𝑔𝑔) - 39 - 3.5 Determinación de la calidad de proteína 3.5.1 Digestibilidad in vitro (Hsu et al., 1977) La digestibilidad in vitro se lleva a cabo utilizando un sistema multienzimático (compuesto por tripsina, quimotripsina, peptidasa y proteasa) para determinar la digestibilidad de proteínas. Se encontró que el pH de una proteína en suspensión inmediatamente después de los 20 minutos de digestión tiene una gran correlación con la digestibilidad in vivo de ratas (Hsu et al., 1977). El coeficiente de correlación entre el pH a los 20 minutos y la digestibilidad aparente in vitro es de 0.90, con un margen de error estimado de 2.23. Para la experimentación se determinó la cantidad de nitrógeno (N) total del germinado y se prepararon 10 mL de solución a una concentración de 10 mg N. La solución se ajustó a pH 8 con ácido clorhídrico (HCl) 0.01N y se agitó en un baño de agua caliente a 37° C por 60 minutos. Paralelamente se preparó una solución multienzimática (tripsina, quimiotripsina, peptidasa), se ajustó el pH a 8 y se conservó en hielo hasta su utilización. A la suspensión de la muestra se le agregaron 1 mL de solución multienzimática y se mantuvo la agitación y la temperatura midiendo la caída de pH después de 20 minutos. La ecuación de la regresión obtenida experimentalmente y con la que se calculó en porcentaje de digestibilidad es: %𝐷𝐷 = 234.84 − 22.56(𝑥𝑥) Donde: X= el pH de la suspensión de proteína registrado inmediatamente después de los 20 minutos de digestión con la solución multienzimática. - 40 - 3.5.2 Determinación de triptófano (Rama Roa et al., 1974) La técnica se basa en la cuantificación espectrofotométrica del triptófano a partir de la digestión enzimática de la proteína en la muestra, y de la reacción del residuo del aminoácido con DMAB (p-dimetilaminobenzaldehído) para la formación de un complejo colorido. Se realizó una curva patrón de 0 a 100 µg de triptófano. Posteriormente se pesó 1 g de germinado seco y se agregó a 10 mL de solución de pepsina al 0.3%, se dejó reposar por unos minutos a temperatura ambiente. Se adicionaron 10 mL de NaOH 0.1N y 10 mL de pancreatina al 0.4% y se incubó por 24 horas. Posterior a este tiempo se aforó la solución a 50 mL con agua destilada y después se filtró. Se tomaron 2 mL de esta extracción y se le adicionaron 7.5 mL de HCl concentrado y de DMAB al 0.5%, y 0.5 mL de nitrito de sodio (NaNO2) al 0.2%; se dejó reposar por 15 minutos y se leyó el color formado a 590 nm en el espectrofotómetro. Para el cálculo del contenido de triptófano se utilizaron las siguientes ecuaciones: � 𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑔𝑔𝑇𝑇 1 𝑔𝑔𝑚𝑚 �� 25 𝑔𝑔𝑚𝑚 0.5 𝑔𝑔 � (100) = 𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑔𝑔𝑇𝑇 100 𝑔𝑔 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔� � 𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑔𝑔𝑇𝑇 100 𝑔𝑔 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 � � 100 𝑔𝑔 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑥𝑥 𝑔𝑔 𝑝𝑝𝑔𝑔𝑃𝑃𝑁𝑁𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔 � (100) = 𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑔𝑔𝑇𝑇 100 𝑔𝑔 𝑝𝑝𝑔𝑔𝑃𝑃𝑁𝑁𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔� 3.6 Factores antinutrimentales 3.6.1 Determinación de taninos (ISO 9684, 1988). Se basa en la extracción de los taninos hidrolizables y condensados (fenoles totales) mediante dimetilformamida (DMF) al 75% y la posterior reducción del ión férrico debido a los iones polifenoles, formando un complejo colorido en condiciones alcalinas, el cuál es cuantificado espectrofotométricamente a 525 nm. - 41 - Preparación de la muestra Para realizar la prueba se pesó 1 g de muestra, se le añadió 20 mL de DMF al 75% y se mantuvo en agitación por 1 hora, posteriormente se dejó reposar 15 minutos. Finalizado este tiempo se centrifugó el extracto a 5000 rpm por 20 minutos. Se etiquetaron 2 tubos, uno para la determinación y otro como blanco, a cada uno se le agregó 1 mL del sobrenadante, 5 mL de agua destilada (6 mL para el caso del blanco), 1 mL de citrato férrico y 1 mL de hidróxido de amoniaco. Una vez que se formó el complejo colorido se leyó la absorbancia a 525 nm y se realizaron los cálculos correspondientes para obtener el porcentaje de taninos en la muestra. %𝑃𝑃𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃 = 𝑋𝑋 𝑔𝑔 ∗ 100 Donde: x=valor obtenido (g) m=peso de la muestra (g) 3.6.2 Determinación ácido fítico (Haug y Lantzsch, 1983) El extracto de una muestra se calienta con una solución de ácido férrico para conocer el contenido de hierro libre. La disminución del hierro (determinada colorimétricamente con 2,2-bipiridina) en el sobrenadante es la medida del contenido de ácido fítico. Se pesó 0.1 g de muestra y se le adicionó 20 mL de HCl 0.2N, se agitó la mezcla por 20 minutos y se centrifugó a 5000 rpm por 15 minutos. Se tomaron 0.5 mL del extracto y se colocaron en un tubo de ensayo, se agregó 1 mL de sulfato férrico de amoniaco 0.2%, se tapó el tubo y se calentó a 95±2 °C por 30 minutos. Transcurrido este tiempo se enfrió el tubo y una vez que se encontró a temperatura ambiente se adicionó 2,2- Bipiridina y se agitó. A los 30 segundos exactamente de que se adicionó el reactivo se leyó la absorbancia a 519 nm. Se realizaron los cálculos correspondientes para obtener el porcentaje de ácido fítico en la muestra: - 42 - • Graficar µg de P del ácido fítico/mL Vs. Absorbancia corregida, realizar la regresión lineal y obtener la ecuación de la recta (y=mx + b). • Determinar el porcentaje de ácido fítico: 𝑃𝑃 = 𝑥𝑥 ∗ 𝐸𝐸 𝑃𝑃 %𝐴𝐴𝐸𝐸𝑔𝑔𝑑𝑑𝑃𝑃 𝐹𝐹í𝑁𝑁𝑔𝑔𝐸𝐸𝑃𝑃 = 𝑃𝑃 ∗ 100% ( 𝑀𝑀𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑔𝑑𝑑 𝐻𝐻𝐼𝐼𝑑𝑑 ) Donde: E= Equivalente a 660.08g (1 mol de ácido fítico) T= Equivalente a 185,82g (6 moles de P) P= µg de P del ácido fítico/ml 3.6.3 Determinación de inhibidores de tripsina (Kakade et. al., 1974) La técnica se basa en poner en contacto el extracto acuoso o diluido de una muestra con una solución estándar de tripsina, posteriormente se determina la actividad proteolítica remanente utilizando un sustrato sintético (benzoil-arginina-p-nitroanilide o BAPNA), el cual producirá coloración, que es inversamente proporcional al contenido de inhibidores de tripsina, realizándose la lectura en el espectrofotómetro a una λ= 410 nm. Para la determinación se pesó 1 g de muestra y se adicionó NaOH 0.01N, se ajustó el pH a 9.6 ±0.2. Se transfirió esta mezcla a un vaso de precipitados y se mantuvo en agitación por 30 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se dejó reposar por 30 minutos para obtener un sobrenadante, posteriormente se centrifugó a 5000 rpm por 5 minutos. Se colocaron muestras de 0, 0.6, 1.0, 1.4 y 1.8 mL del extracto anterior en tubos de ensayo y se ajustó el volumen de cada uno a 2.0 mL con agua destilada. Se adicionó solución estándar de tripsina y se agitó; se mantuvo en contactoinhibidor de tripsina- - 43 - tripsina en un baño a 37 °C. Se adicionó BAPNA al primer tubo y pasados 30 segundos al segundo tubo, así se continuó hasta terminar los cinco tubos. Se mantuvo esta reacción por 10 minutos exactamente en el baño. Pasado el tiempo se añadió 1.0 mL de ácido acético al 30% para detener la reacción enzimática. Se leyó la coloración producida en el espectrofotómetro a 410 nm. Se procede a realizar los cálculos correspondientes: • Se grafica en el eje de las x los ml de extracto vs en el eje de las y las Unidades de Tripsina Inhibidas por mililitro (UTI/mL) para calcular la regresión lineal. • La r debe ser mayor a 0.9 y si es así, se sustituye el valor de la ordenada al origen (b) en la siguiente ecuación 𝐵𝐵 × 𝐹𝐹𝑔𝑔𝐸𝐸𝑁𝑁𝑃𝑃𝑔𝑔 × 𝑣𝑣𝑃𝑃𝑑𝑑. 𝑔𝑔𝑓𝑓𝑃𝑃𝑔𝑔𝑃𝑃 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 = 𝑈𝑈𝑃𝑃𝐼𝐼 𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑑𝑑𝑃𝑃 𝑔𝑔𝐻𝐻𝑃𝑃𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑔𝑔 B = Ordenada al origen Factor= Factor de dilución 3.7 Relación de Eficiencia Proteica (REP o PER en inglés) (960.48, AOAC) Se emplearon ratas Wistar macho de 21 días de nacidas, cuyos pesos oscilaban entre 41 y 51 g. Tanto las ratas, como el espacio para la experimentación, fueron proporcionados por el Bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 4, de la Universidad Nacional Autónoma de México. Las 2 dietas experimentales analizadas contenían harina de chía, y germinado seco y molido (5 días) respectivamente. Un lote de ratas fue alimentado con una dieta de caseína como proteína control. La cantidad de proteína se ajustó a 10% para adecuar la composición de la materia prima a ensayar. Las dietas se prepararon de acuerdo a la formulación establecida por la AOAC (1990). - 44 - La Relación de Eficiencia Proteica fue determinado de acuerdo al método 960.48 AOAC (1990). Las ratas fueron pesadas inicialmente y distribuidas homogéneamente de acuerdo al método de la “culebra japonesa” (figura 10), después fueron divididas en lotes de seis ratas, considerando el peso de cada una. Dieta Peso de las ratas (g) Peso total (g) Caseína 51 49 49 45 43 41 278 Harina de chía 51 49 49 45 43 41 278 Germinado de chía 51 49 48 46 43 41 278 Figura 10. Culebra japonesa de las ratas utilizadas durante la experimentación Las ratas fueron colocadas en jaulas individuales. Se mantuvo controlada la temperatura a 24ºC y la humedad relativa a 48% HR, con ciclos de 12 horas de luz y oscuridad. Se les suministro las dietas preparadas y agua suficiente. Cada tercer día se registró el peso ganado y la cantidad de alimento consumido. Al concluir los 28 días del bioensayo se determinó el valor de PER y PER ajustado, en base a las siguientes fórmulas: 𝑃𝑃𝐸𝐸𝑃𝑃 = ∆𝑃𝑃 ∑𝐴𝐴𝐼𝐼 × 𝐹𝐹 𝑃𝑃𝐸𝐸𝑃𝑃 𝑔𝑔𝑎𝑎𝐻𝐻𝑃𝑃𝑁𝑁𝑔𝑔𝑑𝑑𝑃𝑃 = 𝑃𝑃𝐸𝐸𝑃𝑃 𝑃𝑃𝑥𝑥𝑝𝑝 × 𝑃𝑃𝐸𝐸𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑔𝑔𝑃𝑃𝑓𝑓 𝑃𝑃𝐸𝐸𝑃𝑃 𝐸𝐸𝑔𝑔𝑃𝑃𝑃𝑃í𝑔𝑔𝑔𝑔 𝑃𝑃𝑥𝑥𝑝𝑝 - 45 - Donde: ∆P = Incremento de peso (en gramos) ∑AI = Alimento ingerido total (en gramos) F = % de proteína en la dieta/100 PER exp. = Valor PER obtenido en el bioensayo PER Caseína ref. = Valor de la caseína de referencia (2.5) PER Caseína exp. = Valor PER de la caseína obtenido en el bioensayo 3.8 Análisis estadístico Todas las pruebas se realizaron por triplicado y se calculó su promedio, desviación estándar y coeficiente de variación. Para el análisis de los promedios se utilizó la prueba de rango múltiple t-student a un nivel de significancia de 0.05. - 46 - 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1 Crecimiento de plántula e índice de conversión La medición de las plántulas y radículas a los diferentes tiempos de germinación mostró, como se observa en la figura 11, un aumento gradual en su tamaño, directamente proporcional al tiempo de germinación (tabla V). Igual comportamiento tuvo el índice de conversión (IC), el cual hace referencia a la proporción de la semilla que se transformó en germinado; mientras mayor sea este porcentaje indica que se obtiene más cantidad de germinado y por tanto de alimento. Este comportamiento se puede apreciar visualmente en las figuras 12 a 15, donde se muestra el crecimiento de la plántula del germinado conforme pasan los días. Tabla V. Longitud de plántulas e índice de conversión de semillas de chía a diferentes tiempos de germinación Tiempo de germinación (días) Tamaño de la plántula (cm) Índice de conversión (%) 3 2.2 ± 0.2a* 18.13±0.07a 4 3.0 ± 0.2b 25.23±0.01b 5 4.6 ± 0.5c 28.47±0.003c 6 6.2 ± 0.2d 35.03±0.002d *Diferentes letras entre columnas indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05). Se muestran valores promedios ± desviación estándar (n=3); CV < 5%. - 47 - Fue importante determinar si la chía germinaba apropiadamente bajo estas condiciones, debido a que no existen investigaciones previas acerca del germinado de esta semilla y por tanto no contábamos con datos de referencia. Puesto que cada especie presenta 3 días 4 días 5 días 6 días Figura 11. Comparación de tamaño de las plántulas a los diferentes días de germinación Figura 13. Germinados de chía de cuatro días Figura 12. Germinados de chía de tres días Figura 15. Germinados de chía de seis días Figura 14. Germinados de chía de cinco días - 48 - condiciones óptimas de germinación, con este estudio podemos decir que la chía germina eficientemente a 25 °C y en ausencia de luz. 4.2 Análisis Químico Proximal Los resultados obtenidos a partir del análisis químico de las diferentes muestras se presentan en la tabla III. Puede observarse que la humedad es estadísticamente igual (P≤ 0.05) para todos los germinados, lo que significa que las condiciones de secado fueron similares para todas las muestras y no influirá en la determinación de los otros componentes químicos. Tabla VI. Resultados del Análisis Químico Proximal (AQP) de las muestras de germinados de chía de diferentes días Muestra Humedad (%) Proteína (%) Lípidos (%) Cenizas (%) Fibra (%) Carbohidratos (%) Control‡ 6.54 ±0.23a* 20.76±0.45a 35.14±0.31d 3.54±0.12a 31.74±0.61d 2.28a 3 días 6.98±0.15a 22.88±2.17a 25.99±0.08c 5.23±0.5b 9.65±0.13a 35.01c 4 días 7.02±0.11a 22.93±0.53a 23.44±0.25c 5.22±0.00b 9.24±0.06a 38.89c 5 días 7.25±0.12a 25.18±0.87b 21.78±0.19b 5.45±0.04b 18.27±0.24c 28.99b 6 días 7.34±0.08a 25.57±0.99b 18.30±0.18a 5.35±0.12b 14.08±0.21b 36.91d ‡La muestra control siempre hace referencia a la semilla de chía sin germinar. *Diferentes letras entre columnas indican diferencia estadísticamente significativa (P≤0.05). Se muestran valores promedios ± desviación estándar (n=3); CV < 5%. Las proteínas incrementaron su concentración de manera importante, siendo este cambio estadísticamente significativo (P≤ 0.05), con respecto al control, a partir del quinto día de germinación, manteniéndose así el sexto día (Figura 16). Por tanto, a partir del quinto día, se puede decir que, se obtiene un mayor contenido proteico en el geminado en comparación con la semilla de chía. - 49 - El incremento de proteínas en la chía germinada coincide con lo reportado por Mendoza (2014) en su estudio del germinado de amaranto (cuyo análisis también se llevó a cabo en el laboratorio); esto comprueba que el proceso de germinación, en general, incrementa el contenido proteico del germinado en comparación con la semilla. En cuanto a los lípidos totales, se aprecia un descenso en su concentración con respecto al tiempo de germinación (Figura 17). Este comportamiento concuerda con lo reportado
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