Efecto-de-la-N-acetilcistena-sobre-la-bioenergetica-mitocondrial-en-el-dano-renal-inducido-por-acido-folico

•

Outros

Aprendiendo Biologia

23/7/2022

Esta es una vista previa del archivo. Inicie sesión para ver el archivo original

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA

“EFECTO DE LA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE LA BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL EN EL
DAÑO RENAL INDUCIDO POR ÁCIDO FÓLICO”.

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA

PRESENTA:
ANDREA GIZELA GALLEGOS SÁNCHEZ

CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX. 2019

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
Restricciones de uso

DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

JURADO ASIGNADO:

PRESIDENTE: Profesor: J. ELEAZAR MARTINEZ BARAJAS.
VOCAL: Profesor: RAQUEL ORTEGA MUÑOZ.
SECRETARIO: Profesor: JOSE PEDRAZA CHAVERRI.
1er. SUPLENTE: Profesor: CARMEN ADRIANA MENDOZA RODRIGUEZ.
2° SUPLENTE: Profesor: SOL CASTREJON CARRILLO.

ESTE TRABAJO SE REALIZÓ EN EL SEGUNDO PISO DEL EDIFICIO F, LABORATORIO 315, FACULTAD DE
QUÍMICA, CIUDAD UNIVERSITARIA U.N.A.M.

ASESOR DEL TEMA: Dr. José Pedraza Chaverri.

SUPERVISOR TÉCNICO: M. en Ciencias Bioquímicas Omar Emiliano Aparicio Trejo.

M. en Ciencias Bioquímicas Alfredo Briones Herrera.

SUSTENTANTE (S): Andrea Gizela Gallegos Sánchez.

“Porque al fin y al cabo, todo fin también es un principio.”
-Amante de letras.

TABLA DE CONTENIDO
ÍNDICE DE ABREVIATURAS....................................................................................................7
RESUMEN........................................................................................................................9
1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................10
1.1 FISIOLOGÍA RENAL.........................................................................................10
1.2 INSUFICIENCIA RENAL…………………………………….………………………………………………11
1.2.1 PANORAMA ACTUAL DE LA INSUFICIENCIA RENAL EN MÉXICO…………………………….12
1.3 MARCADORES DE DAÑO RENAL………………………………………………………………………..13
1.3.1 CREATININA SÉRICA……………………………………………………………………….…………14
1.3.2 NITRÓGENO UREICO EN SANGRE…………………………………..…………….........………14
1.3.3 HIPERTROFIA RENAL………………………………………………………….……………………..15
1.3.4 MOLECULA-1 DE LESIÓN RENAL (KIM-1)……………………………….………………………15
1.3.5 LIPOCALINA ASOCIADA A LA GELATINASA DE NEUTRÓFILOS (N-GAL)…….………………15
1.3.6 FACTOR NUCLEAR POTENCIADOR DE LAS CADENAS LIGERAS KAPPA DE LAS CÉLULAS B
ACTIVADAS (NF-ΚB)………………………………………………….……………………….…….16
1.3.7 INTERLEUCINA 1 BETA (IL-1β)…………………………………………………..……………….16
2. ANTECEDENTES.....................................................................................................17
2.1 ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Y ANTIOXIDANTES……………...........…………..………..17
2.2 MARCADORES DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA………………………………………………………….18
2.3 LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL Y SU PARTICIPACIÓN EN LA INSUFICIENCIA RENAL AGUDA
......……………………………………………………………………………………………..………….19
2.4 EL MODELO DE DAÑO RENAL POR ÁCIDO FÓLICO.......……………………………………………21
2.5 LA N-ACETILCISTEÍNA Y SU PAPEL EN LA PREVENCIÓN DE LA INSUFICIENCIA RENAL
AGUDA.........…………………………………………………………………………………………..…22
3. JUSTIFICACIÓN…………………….………………………………………………………………………………..22

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA...............................................................................23
5. HIPÓTESIS.......................................................................... ..................................23
6. OBJETIVOS........................................................................................ ...................23
6.1 OBJETIVO GENERAL.......................................................................................23
6.2 OBJETIVOS PARTICULARES...............................................................................23
7. METODOLOGÍA......................................................................................................24
7.1 REACTIVOS..................................................................................................24
7.2 MODELO EXPERIMENTAL.................................................................................25
7.3 MATERIALES Y MÉTODOS…………..……………………………………………………………………26
7.3.1 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LOWRY….…….27
7.3.2 CREATININA Y NITRÓGENO UREICO EN SANGRE.........………………………………………28
7.3.3 MARCADORES DE WESTERN BLOT.......…………………………………………………………29
7.3.4 AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS……………………….….……………………………………30
7.3.5 BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL…………………………………………………………………31
7.3.5.1 RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL………………..…………………………………………32
7.3.5.2 POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL…………………….……………………33
7.3.6 ENZIMAS ANTIOXIDANTES…………………………………….……………………………………34
7.3.6.1 CATALASA........…………………………………..……………………………………....34
7.3.6.2 GLUTATIÓN REDUCTASA.......…………………………………………………………..34
7.3.6.3 GLUTATIÓN PEROXIDASA..........……………………………………………………....35
7.3.6.4 GLUTATIÓN S-TRANSFERASA.........……………………………………………………36
7.3.6.5 SUPERÓXIDO DISMUTASA........………………………………………………………..37
7.3.7 HISTOLOGÍA………………………………….……………………………………………………….38
7.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO....................................................................................39

8. RESULTADOS......................................................................... ................................39
8.1 FUNCIÓN RENAL...........................................................................................39
8.1.1 MARCADORES DE DAÑO RENAL………….……………………………………………………….39
8.1.2 PROTEÍNAS DE INFLAMACIÓN......................................................................44
8.2 HISTOLOGÍA……………………………………….……………………………………………………….46
8.3 BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL.......................................................................48
8.3.1 RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL…………………………………………………………………….48
8.3.2 POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL……………………………………………………49
8.4 ESTRÉS OXIDANTE…………………………………………………………………………………………50
8.4.1 MARCADORES DE ESTRÉS OXIDANTE…………………………………………………………….50
8.4.2 ENZIMAS ANTIOXIDANTES………………………………………………………………………….52
9. DISCUSIÓN..................................................................................................54
10. CONCLUSION...............................................................................................58
11. PERSPECTIVAS……………………………………………………………………………………………..59
12. REFERENCIAS......................................................................... ......................59
13. ANEXO................................................................................. ......................65
13.1 ACTIVIDAD DEL COMPLEJO IV MITOCONDRIAL………………………………………………………65
13.2 SUBUNIDADES DE LOS COMPLEJOS…………………………………………………....……………..65

ÍNDICE DE ABREVIATURAS.
ADP - Adenosín difosfato.
AF - Ácido fólico.
ANOVA - Análisis de varianza estadístico.
ASB - Albúmina sérica bovina.
ATP - Adenosín trifosfato.
BUN - Nitrógeno ureico en sangre (del inglés blood urea nitrogen).
CaCl2 - Cloruro de calcio.
CASP1 - Gen caspasa 1.
CAT - Catalasa.
CCCP - Carbonilo ciaunuro m-clorofenilhidrazona.
CDNB - 2,4 dinitroclorobenceno.
CENETEC - Centro Nacional de Excelencia Tecnológica
en Salud.
CICUAL - Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio.
EDTA - Sal disódica del ácido etilendiaminotetraacetico.
EEM - Error estándar de la media.
ERO - Especies reactivas de oxígeno.
FDA - Administración de Alimentos y Medicamentos (del inglés Food and Drug Administration).
GPx - Glutatión peroxidasa.
GR - Glutatión reductasa.
GSH - Glutatión.
GSSG - Glutatión disulfuro.
GST - Glutatión S transferasa.
G6PDH - Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
HEPES - Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico.
H2O2 - Peróxido de hidrógeno.
H+ - Protones.
H&E - Tinción histológica con hematoxilina y eosina.
ICR - Índice de control respiratorio.
i.g. - Administración intragástrica.
IL-1β - Interleucina 1 beta.
INEGI - Instituto Nacional de Estadística y Geografía.
i.p. - Administración intraperitoneal.
IR - Insuficiencia renal.
IRA - Insuficiencia renal aguda.
IRC - Insuficiencia renal crónica.
KCN - Cianuro de potasio.
KIM-1 - Molécula 1 de lesión renal.
MDA - Malondialdehído.
MgCl2 - Cloruro de manganeso

NAC - N-acetilcisteína.
NADH - Nicotinamida adenina dinucleótido.
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido.
NADP+ - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidado.
NaHCO3 - Bicarbonato de sodio.
Na2HPO4 - Fosfato dibásico de sodio.
Na2H2PO4 - Fosfato monobásico de sodio.
NBT - Nitroazul de tetrazolio.
NF-κB - Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas.
N-GAL - Lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos.
NK - Células asesinas por naturaleza (del inglés Natural Killers).
O2 - Oxígeno molecular.
O2
•- - Anión superóxido
OXPHOS - Sistema de fosforilación oxidativa.
P - Respiración asociada a OXPHOS.
PBS - Amortiguador de fosfatos.
PMG - Piruvato-malato-glutamato.
PVDF - Fluoruro de polivinilideno.
RIPA - Ensayo de Radio inmunoprecipitación (del inglés Radioimmunoprecipitation assay).
SDS - Dodecilsulfato de sodio.
SOD - Superóxido dismutasa.
STE - Sistema de transporte de electrones.
S3 - Respiración en el estado 3.
S4o - Respiración en el estado 4 inducido con oligomicina.
TC - Túbulos colectores.
TCP - Túbulo contorneado proximal.
TCD - Túbulo contorneado distal.
TRP - Túbulo recto proximal.
TMPD - Tetrametil p-fenil diamina.
TNF-α - Factor de necrosis tumoral alfa.
USDRS - Sistema de Datos Renales de Estados Unidos.
WB - Western blot.
4-HNE - 4-Hidroxi-2-nonenal.
Δψm - Potencial de membrana mitocondrial.

RESUMEN.
La insuficiencia renal aguda (IRA) se caracteriza por pérdida de nefronas, así como
alteraciones tanto estructurales como funcionales en el riñón en un intervalo corto de tiempo.
La administración de altas dosis de ácido fólico (AF) (≥ 250 mg/kg) se ha utilizado para estudiar
los mecanismos involucrados en la IRA, de entre los cuales la disfunción mitocondrial juega un
papel fundamental. Por otro lado, se ha demostrado que el uso de antioxidantes es capaz de
preservar la función renal y mitocondrial en diversas patologías. En este sentido la
administración de N-acetilcisteína (NAC), un antioxidante directo, se perfila como una
herramienta útil para prevenir las alteraciones mitocondriales y el desarrollo del daño renal. El
objetivo de este proyecto fue evaluar las alteraciones renales y mitocondriales en el modelo de
IRA inducida por AF a las 48 h, así como valorar el efecto protector de la pre-administración de
la NAC sobre las mismas. Se utilizó un modelo in vivo de ratas macho Wistar, administrando
vía intraperitoneal el AF (300 mg/kg) para inducir la IRA, además del pre-tratamiento (2 y 24 h
antes de la inyección de AF) con el antioxidante NAC (300 mg/kg) vía intragástrica y sus
respectivos controles.
En este trabajo, demostramos por primera vez, que el AF induce a las 48 h un desequilibrio
bioenergético mitocondrial caracterizado por una disminución en los parámetros respiratorios:
estado 3 (S3), en estado 4 inducido con oligomicina (S4o), respiración asociada a la
fosforilación oxidativa (OXPHOS) e índice de control respiratorio, alimentada vía complejo I.
Junto con la reducción del potencial de membrana mitocondrial en S3 y S4o. Estos datos
implican que el AF provoca un desacoplamiento mitocondrial y una disminución de la OXPHOS.
Así, mismo el AF genera el aumento del estrés oxidativo y la disminución en la actividad de las
enzimas antioxidantes en la corteza y la médula del riñón. Todo lo anterior estaría relacionado
al aumento del daño renal, caracterizado histológicamente y con los marcadores creatinina,
nitrógeno ureico en sangre (BUN), molécula 1 de lesión renal (KIM-1) y con la hipertrofia renal.
Por su parte la pre-administración de NAC previno tanto las alteraciones renales como
mitocondriales, pero no así el aumento del estrés oxidante en corteza y médula. Lo que nos
sugiere que el efecto nefroprotector de la NAC está más asociado a la preservación de la
bioenergética mitocondrial a las 48 h en este modelo.

1. INTRODUCCIÓN.
1.1 FISIOLOGÍA RENAL.
Los riñones son órganos pares situados a ambos lados de la columna vertebral por debajo del
diafragma y el hígado (Ira Fox, 2008), los cuales cumplen un papel fundamental en la
homeostasis corporal mediante la conservación de líquidos y electrolitos, así como la
eliminación de los desechos metabólicos. Además, son indispensables para mantener
constante el pH plasmático, ya que regulan el equilibrio acido-básico (Pawlina, 2018).
La nefrona es la unidad funcional del riñón, cada riñón contiene más de un millón de nefronas,
Las cuales se clasifican en 2 tipos, según su posición en el riñón y la longitud de sus asas (Ira
Fox, 2008). Aquellas que se encuentran principalmente en la capa externa del riñón o corteza
renal, reciben el nombre de nefronas corticales, mientras que las que penetran profundamente
a la región interna del riñón o médula, reciben el nombre de nefronas yuxtamedulares
(Silverthorn, 2009).
Cada nefrona, está compuesta por un corpúsculo glomerular y una serie de túbulos adjuntos
(Diagrama 1). El corpúsculo glomerular está conformado por un enramado capilar conocido
como glomérulo encargado principalmente del proceso de filtración del plasma sanguíneo, el
cual a su vez está envuelto por la cápsula de Bowman (Lote, 2014). Por su parte, la porción
tubular consta de: el túbulo contorneado proximal (TCP), el túbulo recto proximal (TRP), el
segmento delgado descendente del asa de Henle, el segmento grueso ascendente del asa de
Henle y un túbulo contorneado distal (TCD) que desemboca a su vez en los túbulos colectores
(TC) (Ira Fox, 2008).
La función renal, tanto excretora como homeostática, comienza cuando la sangre llega al
aparato de filtración en el glomérulo (Pawlina, 2018). Durante el paso por los segmentos
tubulares ocurren dos fenómenos que modifican la composición del filtrado los cuales se
conocen como reabsorción y secreción (Fogo et al., 2014). El líquido filtrado en los glomérulos
pasa de la cápsula de Bowman al TCP, en él se efectúa la mayor parte de la reabsorción de
solutos que necesitan regresar al flujo sanguíneo (como sodio, cloro, glucosa, aminoácidos,
péptidos y bicarbonato). En el TCP se lleva acabo la reabsorción del 60 al 70% del filtrado
(Fogo et al., 2014). El fluido que pasa al segmento delgado descendente del asa de Henle es

isotónico con respecto al plasma, pero al llegar al TCD es hipotónico con respecto al plasma,
implicando que en el asa de Henle se produce el alto gradiente osmótico que permite al agua
ser removida a medida que atraviesan la medula renal. En este segmento se lleva acabo la
reabsorción activa de calcio (Doucet & Katz, 1982).
Finalmente, la región conectora del TCD
desemboca en el TC, en el cual se lleva a cabo el control hormonal de la reabsorción de agua
por medio de la hormona antidiurética (Doucet & Katz, 1982).

Diagrama 1. Estructura básica de la nefrona, la unidad funcional del riñón. Las flechas negras
indican la dirección del flujo sanguíneo mientras que las flechas naranjas el flujo de los fluidos
de los segmentos tubulares. (Obtenido y modificado de: “Estructura de la nefrona”, 2019).

1.2 INSUFICIENCIA RENAL.
La insuficiencia renal (IR) se caracteriza por una pérdida en el número de nefronas funcionales,
así como alteraciones tanto estructurales como funcionales, que inducen la desregulación en la
homeostasis redox y la bioenergética del riñón (Aparicio-Trejo et al., 2017, 2018).

Cuando hay un deterioro repentino de las funciones renales dentro de un intervalo de tiempo
relativamente corto con un incremento de la creatinina sérica mayor o igual de 0.3 mg/dL (≥ a
26.4 µmol/L) se habla de una insuficiencia renal aguda (IRA) (Espinosa-Sevilla et al., 2013). La
cual puede conducir al desarrollo de la insuficiencia renal crónica (IRC), que se caracteriza por
la reducción progresiva en la tasa de filtración glomerular y que engloba el avance progresivo
de los trastornos que afectan a la estructura y a la función renal (Levey & Coresh, 2012).
En la IRA, la capacidad de los riñones de eliminar productos de desecho, de regular el pH y las
concentraciones de los electrolitos se deterioran. La IRA se caracteriza por una elevación de la
concentración sanguínea de productos de desecho como la creatinina. Así mismo, esto genera
una disminución en la capacidad de excretar urea, que se acompaña de una concentración
elevada de H+ en el plasma (acidosis) y una concentración elevada de K+ (Ira Fox, 2008).

1.2.1 PANORAMA ACTUAL DE LA INSUFICIENCIA RENAL EN
MÉXICO.
En el estudio “Epidemiología de la IR en México”, dado a conocer por la Secretaría de Salud en
el 2010, se destaca que cada año se suman, al menos, 40,000 nuevos casos de Insuficiencia
Renal en el país. Sin embargo, debido a una falta de cultura de prevención, este padecimiento
ha tenido un rápido crecimiento en los últimos años (11% anual), llegándose a duplicar la
incidencia de nuevos casos en la población mexicana, como lo establece un estudio
comparativo del Sistema de Datos Renales de Estados Unidos (USDRS). De acuerdo al
mismo, en ningún otro país se registran niveles de incidencia tan altos como en México, en el
cual se reportan arriba de 500 enfermos por cada millón de habitantes (“Enfermedades
renales”, 2019).
De acuerdo a cifras informadas por la Fundación Mexicana del Riñón existen actualmente en
México entre: 8 y 9 millones de personas con IR en etapas tempranas, 109,000 personas con
IRC (estadio 5) y cerca de 60,000 personas con tratamiento sustitutivo de la función renal (ya
sea diálisis peritoneal o hemodiálisis). El Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI)
ha señalado que actualmente la Insuficiencia Renal es la 5a. causa de muerte más importante

entre la población mexicana, ya que anualmente mueren cerca de 12 mil personas por
complicaciones derivadas de la IR (“Enfermedades renales”, 2019).
Además, se recalcó que las entidades con mayor incidencia son: el Estado de México con
1,487 fallecimientos, el Distrito Federal con 948, Jalisco con 920, Puebla con 756, Guanajuato
con 604 y Nuevo León con 392. De continuar el rápido incremento en los niveles de incidencia
de esta enfermedad, para el 2025 existirán alrededor de 212,000 pacientes diagnosticados con
IR, de los cuales morirán 160,000 cada año, de acuerdo a estimaciones realizadas por el
Centro Nacional de Excelencia Tecnológica en Salud (CENETEC). (“Enfermedades renales”,
2019).
Los numerosos factores de riesgo que conlleva la IRA junto con las dificultades para el
tratamiento de este trastorno nos recuerdan la gran importancia que tiene la función renal (Ira
Fox, 2008).

1.3 MARCADORES DE DAÑO RENAL.
Dado que la IRA es una complicación frecuente, además de un factor de riesgo para
posteriores complicaciones, su determinación oportuna permite la implementación de
esquemas y tratamientos que repercuten positivamente en la evolución de esta enfermedad
(Espinosa-Sevilla et al., 2013). Por otro lado, el término biomarcador es utilizado por la
Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para describir un indicador de diagnóstico
que se puede medir y se utiliza para evaluar cualquier riesgo de enfermedad (Espinosa-Sevilla
et al., 2013). Existen diversos biomarcadores medibles en el suero y la orina que permiten la
detección y diagnóstico de la IRA. Aquí se incluyen algunos de los más utilizados y que fueron
empleados en la realización de este proyecto.

1.3.1 CREATININA SÉRICA.
La IRA se caracteriza por el deterioro brusco de las funciones renales, que se caracteriza por
una drástica caída en la tasa de filtración glomerular, un aumento en la creatinina en sangre,
así como la desregulación en la homeostasis ácido-base y osmótica del riñón (Aparicio-Trejo et
al., 2017). La creatinina sérica es el parámetro principal utilizado para el diagnóstico de la IRA.
La creatinina es el resultado de la degradación de la fosfocreatina, componente de los
músculos utilizado como reservorio de energía a partir del cual se puede sintetizar adenosín
trifosfato (ATP). La producción de creatinina depende de diversos factores como el género, la
edad, la ingesta alimenticia y la masa muscular. Sin embargo, los niveles en sangre varían
poco y suelen ser muy estables. La creatinina se elimina a través del riñón por lo que niveles
altos de creatinina con respecto a un valor basal son indicativos de IRA (Spinreact, 2019). Sin
embargo, está sujeto a varias limitaciones, dado que la concentración de creatinina en plasma
depende de la masa muscular y esta a su vez de los siguientes factores: peso, raza, edad,
sexo, fármacos, ingesta de proteínas entre otros (Espinosa-Sevilla et al., 2013).

1.3.2 NITRÓGENO UREICO EN SANGRE.
La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas (aminoácido precursor arginina);
se forma en el hígado a partir de la degradación de los aminoácidos. La urea elevada en
sangre (uremia) puede ser resultado de dietas con exceso de proteínas, enfermedades renales,
insuficiencia cardiaca, hemorragias gástricas, hipovolemia y obstrucciones renales. Se
considera a los niveles altos de Nitrógeno ureico en sangre (BUN) como indicativos de IRA e
IRC en dietas altas en proteínas o deshidratación (Spinreact, 2015).

1.3.3 HIPERTROFIA RENAL.
El daño renal genera el desencadenamiento de la hipertrofia del riñón. La hipertrofia renal es
un mecanismo de compensación a la pérdida de nefronas generada por un daño renal inicial,
por lo tanto el incremento sostenido del tamaño del riñón se asocia a procesos de daño renal
(Jay-Stallons et al., 2014; Anuj-Gupta et al., 2010).

1.3.4 MOLECULA-1 DE LESIÓN RENAL (KIM-1).
La KIM-1 es una proteína transmembrana cuya expresión es mínima en condiciones
normales pero muy elevadas en las células del túbulo proximal después de someter al riñón a
un proceso de daño o isquemia. Dicha proteína, representa un biomarcador prometedor para el
diagnóstico de IRA. El uso de KIM-1 como biomarcador, tiene la gran ventaja de que no se
afecta significativamente por infecciones (Espinosa-Sevilla et al., 2013).

1.3.5 LIPOCALINA ASOCIADA A LA GELATINASA DE
NEUTRÓFILOS (N-GAL).
La N-Gal es una proteína de la familia de las lidocaínas ligada a la gelatinasa de neutrófilos, en
específico de los granulocitos. Esta es liberada principalmente por los neutrófilos activados en
el sitio de infección o daño, por lo que también se emplea como marcador de inflamación. En el
riñón,
N-Gal se libera posteriormente a la isquemia o daño tubular por tóxicos. Por tanto, la
medición de N-Gal en plasma puede servir como marcador de IRA (Espinosa-Sevilla et al.,
2013).

1.3.6 FACTOR NUCLEAR POTENCIADOR DE LAS CADENAS
LIGERAS KAPPA DE LAS CÉLULAS B ACTIVADAS (NF-KB).
El factor de transcripción NF-κB es una proteína que regula múltiples aspectos de las
funciones inmunes innatas y adaptativas, sirve como un mediador fundamental de la
respuesta inflamatoria. El NF-κB induce la expresión de varios genes proinflamatorios, juega
un papel crítico en la regulación de la supervivencia, activación y diferenciación de las
células inmunes innatas y las células T inflamatorias. En consecuencia, la activación de NF-
κB contribuye a los procesos de diversas enfermedades inflamatorias (Ting-Liu et al., 2017).
En las enfermedades renales, los factores inmunes e inflamatorios juegan un papel importante
en la patogénesis y desarrollo de las mismas. En la IR, los niveles de NF-κB y su activación
aumentan de manera posterior a la inducción de lesión renal y se cree que sirve como un
mediador importante del proceso de inflamación y el posterior desarrollo de la fibrosis (Haisong-
Zhang & Shao-Cong, 2015).
Además, el estrés oxidativo característico de la IR junto con el aumento de la expresión de la
nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH) y la inflamación, contribuyen a
una mayor activación de NF-κB en células renales (Gill & Wilcox, 2006).

1.3.7 INTERLEUCINA 1 BETA (IL-1β).
La IL-1β es una citocina proinflamatoria y es expresada por muchas células incluyendo
macrófagos, células NK, monocitos y neutrófilos. Pertenece al grupo de la familia IL-1 que
incluye los genes IL-1a e IL1-RN. El gen caspasa 1 (CASP1) activa proteolíticamente la IL-1β.
Se ha encontrado que la hipersensibilidad inflamatoria es el resultado de la activación de IL-1β
(Giraldo et al., 2008). Dado que la inflamación participa activamente en los mecanismos de
progresión del daño renal, los niveles de IL-1β en plasma se consideran como un biomarcador
de dicha enfermedad.

2. ANTECEDENTES.
2.1 ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO Y ANTIOXIDANTES.
Un radical libre es cualquier especie capaz de existir independientemente y que contiene uno o
más electrones desapareados. Dichos radicales libres son muy reactivos en el cuerpo, y oxidan
(sustraen electrones) a otros átomos o moléculas con el fin de alcanzar su propia estabilidad
(Nelson, 2007). Los radicales libres de importancia biológica son parte de las especies
reactivas de oxigeno (ERO), moléculas altamente reactivas que a su vez son más reactivas que
el oxígeno molecular debido a que contienen oxígeno incompletamente reducido o con una
distribución electrónica diferente, las cuales atacan constantemente al organismo mediante
reacciones bioquímicas de óxido-reducción, que ocurren como parte normal del metabolismo
celular o por factores patológicos (Quintanar-Escorza y Calderón-Salinas, 2009).
Las ERO son producidas en cantidades moderadas en los organismos y pueden ser
neutralizados por el propio sistema antioxidante endógeno. Sin embargo, cuando las ERO que
se producen en exceso y escapan a los sistemas de defensa antioxidante, producen daños
irreversibles a las biomoléculas (proteínas, carbohidratos, ADN y lípidos). Esto conduce a la
pérdida de la función, la localización de las mismas y/o la pérdida de las actividades
enzimáticas, lo que supone una agresión oxidativa sobre el cuerpo, mejor conocido como
estrés oxidante (Ira Fox, 2008).
El estrés oxidante es definido como un desbalance entre las ERO y los sistemas antioxidantes
endógenos enzimáticos y/o no enzimáticos, a favor de los primeros (González-Flecha et al.,
1993). Lo cual se puede producir por un déficit de antioxidantes o por un incremento en la
producción de las ERO o por una combinación de ambos. Los antioxidantes se definen como
moléculas nucleofílicas, que se comportan como compuestos capaces de neutralizar a las ERO
(electrofílicas); es decir ofrecen electrones a las ERO para evitar que estas ataquen a las
macromoléculas (Quintanar-Escorza y Calderón-Salinas, 2009).
El cuerpo se protege a sí mismo frente a dicho estrés por mecanismos de defensa, tanto
enzimáticos como no enzimáticos. Entre las enzimas que ayudan a la destoxificación de dichas
especies encontramos a la superóxido dismutasa (SOD) que cataliza la disimutación del

superóxido a peróxido de hidrógeno (H2O2). La catalasa (CAT) que reduce el H2O2 a H2O. La
glutatión peroxidasa (GPx), enzima dependiente de selenio que cataliza la reducción del H2O2 a
partir del glutatión (GSH) y que es descrita detalladamente más adelante (sección 6.3.6.). Sin
embargo, también existen antioxidantes no enzimáticos, dentro de los cuales el más importante
es el GSH, un tripéptido conformado por glutamato, glicina y cisteína con gran facilidad para
ceder electrones (nucleofílico), debido a su grupo sulfhidrilo (-SH) y su potencial redox
negativo. El GSH puede neutralizar determinados radicales libres; así mismo el GSH es el
principal antioxidante de bajo peso molecular en la célula y la base del mecanismo de defensa
de la mitocondria ante el estrés oxidante (Ira Fox, 2008).
Existe un amplio espectro de enfermedades renales asociadas al estrés oxidante, que se
originan por la sobreproducción generalizada de ERO en fuentes endógenas, de entre las
cuales la mitocondria es consideradas uno de los principales sitios de generación de dichas
especies. Por tal motivo, el uso de los antioxidantes se ha considerado durante mucho tiempo
como posible terapia para una serie de afecciones que implican estrés oxidativo, entre ellas la
IRA (Quinlan et al., 2013).

2.2 MARCADORES DE PEROXIDACIÓN LIPÍDICA.
Algunos de los biomarcadores de estrés oxidante ampliamente utilizados son el
malondialdehido (MDA) y el 4-hidroxi-2- nonenal (4-HNE), los cuales se producen durante la
peroxidación lipídica.
La estructura molecular de los lípidos los hace susceptibles a la oxidación. La oxidación de los
ácidos grasos poliinsaturados de la membrana por ERO produce moléculas como el MDA y 4-
HNE a partir del daño oxidante. En el caso del MDA, varios estudios han revelado un aumento
significativa de los niveles de este marcador en suero en pacientes con IRC sometidos a
hemodiálisis (Modaresi et al., 2015).

2.3 LA DISFUNCION MITOCONDRIAL Y SU PARTICIPACION EN LA
INSUFICIENCIA RENAL AGUDA.
El riñón depende ampliamente del metabolismo mitocondrial (Aparicio-Trejo et al., 2018; Jay-
Stallons et al., 2014) dada su alta demanda energética y su alto consumo de oxigeno por el
sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). Aunado a esto, la mitocondria es una de las
principales fuentes de ERO, las cuales cuando se producen en exceso sobrepasan la
capacidad antioxidante celular generando estrés oxidante, condición que, junto con la
disfunción mitocondrial, participa en la génesis y desarrollo de diversas enfermedades renales
(Zhan et al., 2013).
La mitocondria es un organelo que está limitado por dos membranas, una externa y otra
interna, las cuales están separadas por un espacio intermembranoso. En la membrana interna
de la mitocondria se alberga el sistema de transporte de electrones (STE), y en la matriz se
lleva a cabo la OXPHOS, en la cual se genera un enlace de fosfoanhidrido rico en energía
formándose el ATP a partir de adenosín difosfato (ADP) y fosfato. La membrana mitocondrial
externa es fácilmente permeable a moléculas pequeñas y iones, lo que permite el libre tráfico
por la misma. La membrana mitocondrial interna, por otra parte, es altamente impermeable y
muy selectiva respecto a su permeabilidad, por lo que posee una gran cantidad de
transportadores altamente específicos. Aún más, se caracteriza por varios pliegues conocidos
como crestas en el interior del organelo. Por su parte la matriz mitocondrial en el interior de la
mitocondria posee una densidad electrónica un poco mayor a la del citoplasma vecino (Ham y
Cormarck, 1999).
Las mitocondrias son complejas en composición, forma y función. Dada su naturaleza
complicada, el estrés mitocondrial puede manifestarse en muchas formas como en la privación
de energía celular (reducción de la carga energética, cociente ATP/ADP) o en el aumento de la
producción de ERO, alteración en morfología, en pérdida del potencial de membrana
mitocondrial (ΔΨm) con el resultado correspondiente en la señalización celular, o en un
decremento en la actividad de los grandes complejos mitocondriales, por mencionar algunos
(Shadel & Horvath, 2015).

Puesto que la mitocondria es considerada como una de las principales fuentes endógenas de
producción de ERO en la célula, su función tiende a estudiarse cuando se habla de estrés
oxidante en el riñón. Por otro lado, debido a que la función renal es altamente dependiente de
la producción energética mitocondrial, se cree que las patologías mitocondriales en el riñón
juegan un papel importante en el desarrollo de diversas enfermedades (Trujillo et al., 2014). En
el caso de la IRC, los estudios realizados por Granata et al. (2009) demostraron estrés oxidante
y desregulación respiratoria en células mononucleares de sangre periférica en pacientes con
IRC.
Por otro lado, los resultados obtenidos por Aparicio-Trejo et al. (2018) en un modelo de IRA in
vivo , encontraron además alteraciones mitocondriales en el riñón tanto en la bioenergética
como en el estado redox mitocondrial, el desacoplamiento mitocondrial, la disminución en la
capacidad de la OXPHOS y en el Δψm, los cuales son atribuidos principalmente debido a la
disminución de la actividad de los complejos y la ATP sintasa. Lo cual está directamente
relacionado con el desarrollo y la progresión del daño renal en dicho modelo.
Clínicamente dentro de los segmentos tubulares ricos en mitocondria, los túbulos proximales
son los más vulnerables al daño mitocondrial, como se ha descrito en los modelos
experimentales in vivo de IRA inducidos por cisplatino, isquemia/reperfusion, gentamicina y
maleato. Donde se muestra una correlación entre el daño tubular y alteraciones mitocondriales
como: disminución del Δψm y caída en los niveles de ATP (Hall et al., 2009).

Así mismo, las ERO mitocondriales desencadenan procesos de inflamación por la activación de
factores tales como NF-κB (Ghosh et al., 2009) y la generación de patrones moleculares
asociados al daño, que conllevan al desarrollo de procesos fibroticos, los cuales aumentan el
daño en la nefrona. La importancia de las ERO en la progresión de la IRA, se resalta en los
experimentos en los cuales la terapia con antioxidantes como la melatonina, la niacina, el ácido
retinoico y la curcumina no solo previenen el aumento en el estrés oxidante, sino también el
aumento en la presión arterial sistémica, la hipertrofia, la fibrosis glomerular, la caída en la
reabsorción renal de sodio, atenuando así la progresión de la IRA (An et al., 2009; Taal &
Brenner, 2014; Tapia et al., 2013).

2.4 EL MODELO DE DAÑO RENAL POR ÁCIDO FÓLICO.

El daño renal inducido por Ácido Fólico (AF) es un modelo experimental ampliamente utilizado
para estudiar la IR, ya que recrea la patología reportada en la clínica y es altamente
reproducible.
El AF en la vida diaria se encuentra presente en algunos alimentos de manera natural en forma
de folatos. Los vegetales de hoja verde oscuro como las espinacas, los espárragos verdes, el
brócoli, las acelgas o la lechuga, son los alimentos que mayor concentración de folato o AF.
Además, el AF es un elemento crucial en el desarrollo fetal y la suplementación periconceptual
de folato tiene un fuerte efecto protector contra los defectos del tubo neural, que surgen
durante el desarrollo del cerebro y la medula espinal. Sin embargo, una dosis alta o repetidas
dosis bajas pueden inducir procesos crónicos, como inflamación y fibrosis, haciendo de este
modelo una herramienta valiosa para explorar los mecanismos involucrados en la transición de
la IRA a IRC (Anuj-Gupta et al., 2010; Aparicio-Trejo et al., 2018).
Cuando se administra por vía intraperitoneal (i.p.) a dosis elevadas (≥250 mg/kg), causa IRA
en roedores. El mecanismo de la nefropatía del AF puede deberse a la formación de cristales
luminales a estas dosis, sin embargo, también tiene una toxicidad directa en el epitelio tubular a
dosis altas y propicia la depleción de GSH en los segmentos tubulares. La ingesta diaria de
referencia para humanos adultos proporcionada por la FDA es de 400 µg. Aunque la toxicidad
renal del AF no se ha informado en humanos, se ha utilizado ampliamente como un modelo de
estudio de la IRA, dada sus similitudes con la patología observada en clínica (Jay-Stallons et
al., 2014).
Se ha encontrado además que el AF a las 24 h induce un estado pro-oxidante y alteraciones
mitocondriales, favoreciendo el aumento en la producción de ERO en los segmentos tubulares,
lo que a su vez nos llevara a la pérdida de la función renal (Aparicio-Trejo et al., 2018). Sin
embargo, las alteraciones que afectan a la OXPHOS y, por tanto, a la producción mitocondrial
de ATP a las 48 h posteriores a la administración, así como su implicación en la progresión del
daño renal no se han caracterizado.

2.5 LA N-ACETILCISTEÍNA Y SU PAPEL EN LA PREVENCIÓN DE LA
INSUFICIENCIA RENAL AGUDA.

La N-acetilcisteína (NAC) es un antioxidante directo y donador de grupos sulfhidrilo, que
gracias a su grupo acetilo es permeable a la membrana celular (Sharma et al., 2016) y además
es un inductor de la síntesis del GSH (Amini et al., 2016).
En la clínica se ha demostrado que la administración oral de la NAC disminuye el aumento en
los marcadores de daño renal e inflamación en las nefropatías inducidas por contraste y por
cirugía cardíaca (Amini et al., 2016). Mientras que en los modelos de hiperoxaluria e isquemia,
la NAC previene la pérdida del potencial mitocondrial, el estrés oxidante y los cambios en el
metabolismo energético. Por lo que la NAC se perfila como un poderoso agente capaz de
prevenir la disfunción mitocondrial y renal en la IRA (Shen et al., 2013; Sharma et al., 2016).
La NAC además es capaz de prevenir parcialmente a las 24 h posteriores a la inducción del
daño, la pérdida de la definición de las crestas mitocondriales, las alteraciones en el sistema de
glutationilacion y el aumento del estrés oxidante en la mitocondria y los segmentos tubulares, lo
que se ha asociado a su capacidad de prevenir la pérdida de la función renal en la IRA
(Aparicio-Trejo et al., 2018).

3. JUSTIFICACIÓN.
La relevancia de este proyecto se encuentra en comprender mejor los posibles mecanismos de
protección que pudiera tener la NAC en un modelo de IRA inducido por AF, específicamente
con un seguimiento a las 48 h, evaluando principalmente su papel en los trastornos
mitocondriales. Esto nos permitiría comprender de mejor manera el efecto de la NAC sobre la
mitocondria en este modelo, lo cual podría ser de gran relevancia para el desarrollo de terapias
destinadas a preservar la función renal y mitocondrial en estas en la IRA.

4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
Actualmente se sabe que las alteraciones mitocondriales juegan un papel primordial en la
génesis del daño renal, sin embargo, los mecanismos involucrados en la misma no se conocen
completamente. Por esta razón este proyecto pretende expandir el conocimiento acerca de
dichos mecanismos en un modelo de IRA inducida por AF a 48 h, así como el posible efecto
protector de la pre-administración de NAC sobre los mismos.

5. HIPÓTESIS.
En el modelo de IR inducida por AF se observarán a las 48
h alteraciones en la bioenergética y
en el estado redox mitocondrial, las cuales estarán asociadas a la progresión del daño renal.
Dichas alteraciones serán prevenidas al pre-administrar la NAC, preservándose así también la
función renal.

6. OBJETIVOS.
6.1 OBJETIVO GENERAL.
- Evaluar el efecto protector de la NAC en la bioenergética mitocondrial en la IRA
inducida por AF.

6.2 OBJETIVOS PARTICULARES.
- En el modelo de IRA inducida por AF, caracterizar a las 48 h las alteraciones en:
 Los marcadores de daño renal.
 Los cambios morfológicos en el riñón.
 La bioenergética mitocondrial.
 El estrés oxidante renal.
 Los marcadores de inflamación.
- Evaluar el efecto de la pre-administración de NAC sobre los parámetros
anteriormente mencionados.

7. METODOLOGÍA.
7.1 REACTIVOS.
Los siguientes reactivos se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA): adenosina 5´-
difosfato de sodio (ADP), AF, Amplex-red, antimicina A, L-arginina, carbonilo cianuro m-
clorofenilhidrazona (CCCP), D-manitol, albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos (ASB),
GSH, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH), glutatión reductasa (GR), glutatión-S-
transferasa (GST), ácido glutámico, acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico (HEPES),
cloruro de manganeso hexahidratado (MgCl2), nitroazul de tetrazolio (NBT), sal de potasio de
nicotinamida dinucleótido fosfato oxidado (NADP+) y reducido (NADPH), nicotinamida adenina
dinucleótido (NADH), NAC, PercollR, cianuro de potasio (KCN), rotenona, safranina, fosfato
dibásico de sodio (Na2HPO4), fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4), glutamato de sodio,
malato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), 2,4 dinitroclorobenceno (CDNB), taurina,
tetrametil p-fenil diamina (TMPD), sacarosa, xantina y xantina oxidasa, así como los
anticuerpos primarios contra β-actina y el coctel de inhibidores de proteasas (P3340). El
cloruro de calcio (CaCl2), bicarbonato de sodio (NaHCO₃) y la sal disódica del ácido
etilendiaminotetraacetico (EDTA) dihidratada se obtuvieron de JT Baker Mexico (Edo. México,
México). El coctel de anticuerpos OXPHOS se adquirió de Abcam (Cambridge, MA, EUA). Los
estuches comerciales se compraron de Spinreact (Girona, España) utilizados para medir BUN y
creatinina en plasma. Los anticuerpos contra KIM-1, N-Gal, NF-kB, IL-1β, MDA, 4-
hidroxinonenal (4-HNE) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA). El
marcador de peso molecular DUAL color se compró de Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules,
CA, EUA) y las membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) fueron de Merck Millipore
(Tullagreen Carrigtwohill, County Cork). Finalmente el pentobarbital sódico (SedalphorteMR) se
compro de Salud y Bienestar Animal S.A. (Ciudad de México, México).

7.2 MODELO EXPERIMENTAL.
Como modelo experimental se emplearon 4 grupos de ratas macho Wistar (n=5) de 250 a 300
g de peso (Diagrama 2), las cuales se alimentaron durante todo el protocolo con alimento
estándar para roedores y tuvieron libre acceso al agua. El protocolo experimental fue aprobado
por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio (CICUAL) de
la Facultad de Química, UNAM (FQ/CICUAL/332/18) y se llevó a cabo de acuerdo con las
directrices de la Norma Oficial Mexicana para el uso y cuidado de animales de laboratorio
(NOM-062-ZOO-1999). Para la realización del modelo in vivo las ratas se dividieron
aleatoriamente en 4 grupos:

o Grupo 1. Control o vehículo (CT). Administrado vía intraperitoneal (i.p.) con
solución NaHCO3 300 mM.
o Grupo 2. Ácido fólico (AF). Inyección intraperitoneal (i.p.) de ácido fólico
(300mg/kg) en NaHCO3 300 mM para inducir IR.
o Grupo 3. Ácido Fólico + N-Acetilcisteína (AF + NAC). Pre-tratamiento con
antioxidante NAC (300 mg/kg) vía intragástrica (i.g.) 2 y 24 h antes de la
inyección de AF (inducir IR).
o Grupo 4. N-Acetilcisteína (NAC). Tratamiento sólo con NAC.

Diagrama 2. Esquema del modelo experimental usado, con los 4 grupos de trabajo. Grupo 1 –
Control (CT). Inyección intraperitoneal (i.p.) del vehículo (NaHCO3 300mM). Grupo 2 - Ácido
fólico (AF). Única dosis de ácido fólico 300 mg/ Kg vía i.p. en NaHCO3. Grupo 3 - Ácido Fólico
+ N-Acetilcisteína (AF + NAC). Pre-tratamiento con NAC 300 mg/Kg vía intragástrica (i.g.) 2 y
24 horas (h) antes de la inyección de AF. Grupo 4. N-Acetilcisteína (NAC). Tratamiento solo
con NAC.

7.3 MATERIALES Y MÉTODOS.
Para la administración i.g. de la NAC se empleó una cánula esofágica colocada en una jeringa
de 1 ml, misma que se introdujo por el hocico del animal hasta llegar al estómago. Para esta
maniobra se sujetó a cada rata por el dorso, de las patas y de la cola, para colocarla en

posición vertical y posteriormente, se introdujo cuidadosamente la cánula esofágica en el
hocico de los animales. En cambio, para la administración por vía i.p. del pentobarbital sódico,
del ácido fólico y del NaHCO3, se sujetó a la rata con una mano por el dorso y con la otra mano
se administraron los compuestos mencionados, usando una jeringa de 1 ml, en un ángulo de
45° en la parte inferior del abdomen atravesando la capa muscular hasta llegar a la cavidad
peritoneal.
Al finalizar el tiempo de evolución (48 h), las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico (60
mg/Kg) y se evaluó el grado de efectividad del anestésico mediante la ausencia de reflejos en
las extremidades ante un estímulo de presión. Una vez que el animal no respondía al estímulo
sensorial se realizó una laparotomía usando material quirúrgico estéril y se extrajo la mayor
cantidad posible de sangre (mediante la punción cardiaca una aguja estéril de calibre 18G y
una jeringa con heparina para evitar la coagulación) causando la muerte del animal. El plasma
se obtuvo centrifugando las muestras de sangre a 2,500 x g durante 10 min a 4oC, el
sobrenadante se almaceno a -20°C hasta la determinación de marcadores de daño renal. Se
obtuvieron ambos riñones, el riñón izquierdo se almacenó a -70°C hasta su procesamiento para
el análisis histológico y por Western blot (WB). Del riñón derecho se aislaron las mitocondrias
mediante gradiente de percoll y centrifugaciones diferenciales (como se explica posteriormente,
punto 7.3.4) para realizar los estudios de bioenergética.
Para caracterizar las alteraciones inducidas por el AF y la protección del pre-tratamiento con
NAC a las 48 h se utilizaron marcadores de IRA, que se estandarizaron y seleccionaron de
acuerdo con las necesidades del proyecto, así como ciertas características: precio accesible,
específicos y lo suficientemente sensibles para detectar el daño renal de manera temprana
(IRA).

7.3.1 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO
COLORIMETRICO DE LOWRY.

La concentración de proteínas de las muestras problema se determinó a partir del método
colorimétrico de Lowry (Lowry et al., 1951), en el cual se construye una curva patrón a partir de

una solución patrón de 0, 5, 10, 20 y 40 mg/mL de ASB. La concentración que tienen las
muestras problema se determina por interpolación de los valores de absorbancia en la curva
patrón. Brevemente, se inició con la preparación del reactivo C, a partir de la combinación de
50 mL del reactivo A (20 g de Na2CO3, 4 g de NaOH y 200 mg de tartrato de sodio y potasio en
un litro de agua) con 1 mL del reactivo B i,CuSO4 al 0.5%). Posteriormente se mezclaron en un
tubo eppendorf 500 µL del reactivo C con 100 µL de cada uno de los puntos de la curva patrón
o de las muestras problema, respectivamente. Cada tubo se agitó y dejó reposar 10 minutos a
temperatura ambiente. A continuación, se añadió a cada tubo 50 µL de Fenol-Folin 1 N y se
mezcló por agitación. La mezcla se dejó reposar 10 minutos en la oscuridad. Finalmente, la
absorbancia de cada muestra se
determinó a 600 nm utilizando un lector de microplacas
(Biotek, Synergy HT, Winooski, VT, EUA) la intensidad de la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración de las proteínas totales en la muestra.

7.3.2 CREATININA Y NITRÓGENO UREICO EN SANGRE.

La determinación de los marcadores de daño renal nitrógeno ureico en sangre (BUN) y
creatinina en suero se realizó mediante el uso de estuches comerciales Urea-37 y Creatinine-J,
respectivamente (Spinreact, Girona, España).
Brevemente, el ensayo de la creatinina se basó en la reacción de la creatinina con el picrato en
medio alcalino, la cual forma un complejo rojizo cuya intensidad puede ser seguida a 495 nm y
es proporcional a la concentración de creatinina en la muestra (Spinreact, 2019).

Creatinina + Picrato de sodio Complejo creatinina-picrato

Por su parte la determinación de BUN se basó en la reacción entre la urea presente en la
muestra con o-ftaladehÍdo en medio ácido, originándose un complejo coloreado que puede

cuantificarse espectrofotométricamente a 510 nm. La intensidad de absorbancia es
proporcional a la concentración de urea en la muestra (Spinreact, 2015).

Urea + o-ftaladehido Isoindolina

7.3.3 MARCADORES DE WESTERN BLOT.

Se evaluó por WB los niveles de los marcadores de daño renal KIM-1 en plasma y NGAL tanto
en plasma como en homogeneizado renal, así como las proteínas de inflamación IL-1, NF-kB y
el marcador de estrés oxidante MDA en homogeneizado renal.
Para la preparación de las muestras (homogeneizado renal, mitocondrias o plasma), estas se
resuspendieron en un amortiguador de homogeneización Ensayo de Radio Inmunoprecipitación
(RIPA; Tris-HCl 40 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%,
desoxicolato de sodio al 0,5% y SDS al 0.2%, pH 7,6) adicionado con una dilución 1:200 del
coctel comercial de inhibidores de proteasas P3340 de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Se
ajustaron además las muestras a una misma concentración de proteína (método de
cuantificación de Lowry, sección 6.3.1) y se diluyeron 1:3 v/v en amortiguador Laemmli (Tris-Cl
60 mM, pH = 6.8, SDS al 2%, glicerol 10%, β-mercaptoetanol 5%, azul de bromofenol 0,01%)
con amortiguador RIPA, se desnaturalizaron por ebullición durante 5 minutos. Posteriormente
se sometieron las muestras a electroforesis en geles de SDS poliacrilamida al 10% y 15%
respectivamente, con patrones de peso molecular en el primer carril y utilizando el marcador de
peso molecular DUAL color. Al término, se transfirieron las proteínas a membranas de fluoruro
de polivinilideno (PVDF) por transferencia semi-seca, la unión a proteínas inespecíficas se
bloqueó mediante incubación con leche en polvo sin grasa al 5% en TBST (Tris base 24.2 g, 80
g NaCl con 0,1% de Tween) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron
con TBST (3 lavados de 5 minutos) posteriormente se incubaron durante toda la noche a 4°C
con los anticuerpos primarios apropiados. Al siguiente día se lavaron nuevamente con TBST y
se incubaron durante 2 horas en la oscuridad con el anticuerpo secundario fluorescente

correspondiente. Después de 4 lavados más de 5 min con TBST y uno con PBS (80 g NaCl, 2 g
KCl, 14.4 g Na2HPO4 y 2.4 g KH2PO4), las bandas de proteínas se detectaron por fluorescencia
en un fotodocumentador (Odyssey, LI-COR Biosciences; Lincoln, NE, EUA).
La señal de la banda se cuantificó por densitometría utilizando un software especializado
(Image Studio ™ Lite Software LI-COR Odyssey, LI-COR Biosciences).

7.3.4 AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS.
Las mitocondrias se aislaron por centrifugaciones diferenciales con gradientes de Percoll,
utilizando el método descrito por Granados-Castro et al. (2015); (Diagrama 3). Después de la
eliminación de las cápsulas, la masa renal remanente se enfrío inmediatamente por inmersión
en una solución de medio de aislamiento “A” (D-manitol 225 mM, sacarosa 75 mM, EDTA 1
mM, HEPES 5 mM, ASB al 0.1%, pH = 7.4) a 4°C. El tejido se lavó para eliminar la sangre y se
cortó en pequeñas piezas, las cuales se añadieron a 2 ml de medio de aislamiento “A” en un
homogeneizador y se homogeneizó por 3 golpes. El homogeneizado se centrifugo durante 5
minutos a 2,500 x g a 4°C y el sobrenadante se volvió a centrifugar 10 minutos a 12,000 x g a
4°C. El botón (pellet) resultante se resuspendió en 12% de Percoll con medio de aislamiento
“A”. Dicha solución se colocó cuidadosamente sobre una cama de 1.5 mL de Percoll al 24%
con el medio de aislamiento “A”, generándose 2 fases, para después centrifugarse a 15,000 x g
durante 15 min. Finalmente, el botón se resuspendió en medio de aislamiento sin ASB (medio
“B”) y se centrifugó de nuevo a 12,000 x g durante 5 min como lavado. El botón resultante se
resuspendió en 180 μl de medio de aislamiento B y la proteína se cuantifico por el método de
Lowry (sección 7.3.1).

Diagrama 3. Metodología empleada para el aislamiento de mitocondrias por centrifugaciones
diferenciales con gradientes de Percoll.

7.3.5 BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL.
La bioenergética mitocondrial se determinó en el equipo de respirometría de alta resolución
Oxígrafo-2k (OROBOROS Instruments, Innsbruck, Austria) evaluando los parámetros
respiratorios: índice de control respiratorio (ICR), la respiración en el estado 3 (S3), en el
estado 4o (S4o), la respiración asociada a la OXPHOS (P), así como el potencial de membrana
en S3 y S4o alimentada por malato-glutamato-piruvato (vía complejo I).

7.3.5.1 RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL.
Los aislados mitocondriales (200 μg de proteína total) se cargaron en la cámara a temperatura
constante de 30°C con 2 mL de medio de respiración para mitocondrias aisladas MIR05 (EGTA
o EDTA 0.5 mM, MgCl2 6H2O 3 mM, ácido lactobiónico 60 mM, taurina 20 mM, K2HPO4 10 mM,
HEPES 20 mM, D-sacarosa 110 mM, 1 g/L de ASB libre de ácidos grasos y pH= 7.4). El
transporte de electrones se inició con la lanzadera malato-aspartato que alimenta al complejo I
(CI), es decir una mezcla de piruvato sódico 5 µM, malato 2 µM y glutamato 10 µM. El estado 3
(S3) de la respiración se estimuló por la adición de ADP 2.5 µM. Posteriormente se bloquea la
OXPHOS con oligomicina 2.5 µM (S4o), para la determinación de la respiración residual se
inhibió al CI y al CIII con la adición de rotenona 0.5 µM y antimicina 2.5 µM, respectivamente.
Para evaluar la actividad del complejo IV (CIV), este se alimentó de manera directa con una
mezcla de 2 µM ascorbato más 0.5 µM N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD), la actividad
inespecífica se determinó por la adición de cianuro 1.0 µM, la cual fue sustraída de la actividad
total (Diagrama 4) (Palmeira & Moreno, 2012)
Las velocidades de respiración se expresaron en pico mol por segundo por miligramo de
proteína [pmol/(s*mg)] de proteína. El ICR se definió como el cociente S3 / S4o y P como la
resta S3 - S4o. Todos los valores informados fueron normalizados por el contenido total de
proteínas (método de cuantificación de Lowry, punto 6.3.1).

Diagrama 4. Ejemplo de Respirometría de alta resolución (HRR) alimentada vía complejo I. La
línea azul es la concentración de oxígeno en el medio y la línea roja representa la velocidad de
consumo de oxígeno en función del tiempo. S1= Estado 1, S2= Estado 2, S3= Estado 3,
S4=Estado 4, mit= preparaciones mitocondriales, Oligo= Oligomicina, Antim= Antimicina, Rot=

Rotenona, Asc= Ascorbato, TMPD= N'-tetrametil-p-fenilendiamina, ACT CIV= Actividad del
Complejo IV y KCN= Cianuro.
7.3.5.2 POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL.
La evaluación de los cambios en el potencial de la membrana mitocondrial (ΔΨm) se realizó de
manera indirecta utilizando los cambios del colorante catiónico safranina O (2 µM) en medio
MiR05. Los
cambios en ΔΨm en los diferentes estados respiratorios se midieron agregando los
sustratos respectivos como se informó anteriormente (ver sección 7.3.5.1).
El potencial en S3 se obtuvo mediante la adición de saturante de ADP 2.5 mM y en S4o por la
adición de oligomicina 2.5 μM. Finalmente, se agregó rotenona 0.5 μM más antimicina 2.5 μM
para disipar completamente el ΔΨm y corregir por las interacciones no específicas. Se
emplearon curvas de calibración de safranina para asegurar la linealidad del ensayo. Los
resultados se expresaron como los cambios en concentración de safranina O (ΔμM de Saf O)
en S3 o S4o, y los resultados se normalizaron por miligramo de proteína (ΔμM de Saf O / mg
de proteína) (Ortega-Domínguez et al., 2017) El potencial de membrana obtenido del CIV
(después de la adición de Asc+TMPD) no será reportado ya que no tiene sentido fisiológico

Diagrama 5. Ejemplo de Potencial de Membrana mitocondrial alimentada vía complejo I. La
línea negra representa los cambios en la concentración medible de safranina. ΔψS2= potencial
de la membrana mitocondrial en estado 2, ΔψS3= potencial de la membrana mitocondrial en
estado 3, ΔψS4= potencial de la membrana mitocondrial en estado 4, Oligo= Oligomicina,
Antim= Antimicina, Rot= Rotenona, Asc= Ascorbato, TMPD= N'-tetrametil-p-fenilendiamina y
KCN= Cianuro.

7.3.6 ENZIMAS ANTIOXIDANTES.
7.3.6.1 CATALASA.

La actividad de CAT se realizó por medio del método basado en el seguimiento de
desaparición de H2O2 (Esquema 1), el cual se basa en la disminución de la absorbancia del
H2O2 debido a su degradación por la catalasa presente en la muestra, de acuerdo al método de
Aebi (1982). Se mezclaron 725 uℓ de H2O2 30 mM (pH 7.0) con 25 uℓ de muestra, se leyó la
absorbancia a 240 nm cada 15 seg durante 30 seg, los datos se expresan como la constante
de primer orden (k) sobre los mg de proteína utilizados.

Esquema 1. Esquema utilizado para determinar la actividad de la enzima catalasa en
homogeizados. Se evaluó la desaparición de la absorbancia (DO) a 240 nm al adicionar la
muestra como una medida directa de la actividad de esta enzima.

7.3.6.2 GLUTATIÓN REDUCTASA.

La evaluación de actividad de la GR se realizó mediante la medición de la desaparición de
NADPH a 340 nm usando glutatión disulfuro (GSSG) como sustrato (Esquema 2). De acuerdo
al método reportado por Carlberg y Mannervik (1975), se midió la desaparición de NADPH a
340 nm de una mezcla de reacción en amortiguador de fosfatos 0.1 M, pH 7.6, EDTA 0.5 mM,
GSSG 1.25 mM y NADPH 0.1 mM. Se leyó la absorbancia a 340 nm cada minuto por 3

minutos. Los datos se expresaron como U/mg de proteína (donde U o unidad es la cantidad de
enzima que descompone 1 ᵤmol de NADPH/min).

Esquema 2. Esquema utilizado para determinar la actividad de la enzima glutatión reductasa
(GR) en homogeneizados. La GR utiliza el NADPH para reducir glutatión disulfuro (GSSG) a
glutatión (GSH), por tanto la desaparición de la absorbancia a 340 nm del NADPH se considera
como una medida de la actividad de la GR en la muestra.

7.3.6.3 GLUTATIÓN PEROXIDASA.

La actividad de la GPx se mide de manera indirecta por una reacción acoplada con GR de
acuerdo al método de Lawrence y Burk (1976), el cual se basa en la disminución de la
absorbancia a 340 nm debido al consumo de NADPH (Esquema 3).
Se mezclaron 0.1 ml de muestra, 0.8 ml de mezcla de reacción (EDTA 1 mM, azida de sodio 1
mM, NADPH 0.2 mM, glutatión reducido 1 mM y glutatión reductasa 1 U/ml) y 0.1 ml de H2O2
2.5 mM. Se leyó la absorbancia a 340 nm cada minuto por 3 minutos. Los datos se expresaron
como U/mg de proteína (U= 1 unidad que corresponde a la cantidad de enzima que
descompone 1 mol de NADPH/min).

Esquema 3. Esquema utilizado para determinar la actividad de la enzima glutatión peroxidasa
(GPx) en homogeneizados. La GPx reduce al H2O2 al oxidar el glutatión (GSH) a glutatión
disulfuro (GSSG), mientras que la glutatión reductasa (GR) reduce al GSSG a GSH en una
reacción acoplada al NADPH, por lo que la desaparición de la absorbancia a 340 nm del
NADPH se considera como una medida de la actividad de la GPx en la muestra.

7.3.6.4 GLUTATIÓN S-TRANSFERASA.

La actividad de la GST se determinó a partir del aumento en la absorbancia a 340 nm del
aducto formado por el GSH y el 1-cloro-2,4 (CDNB). De acuerdo al método de Habig et al.
(1974) se mezclaron 0.02 ml de la muestra con 0.98 ml de GSH 1 mM y clorodinitrobenceno 1
mM en amortiguador de fosfatos 50 mM pH 6.5 y se leyó la absorbancia a 340 nm cada minuto
durante 3 minutos (Esquema 4). Los datos se expresaron como umoles de CDNB conjugado
con GSH por minuto por miligramo de proteína (GSH/min/mg) usando un coeficiente de
extinción molar del aducto de 9.6 x103/M/cm.

Esquema 4. La glutatión S-transferasa (GST) cataliza la reacción de conjugación entre el GSH
y el 1-cloro-2,4 dinitrobenceno (CDNB), el aducto resultante absorbe a 340 nm, por lo que se
considera el aumento de la absorbancia a esta λ como una medida de la actividad de la GST
en la muestra.

7.3.6.5 SUPERÓXIDO DISMUTASA.

La actividad de la SOD se determinó espectrofotométricamente a 560 nm utilizando nitroazul de
tetrazolio (NBT) como indicador (Esquema 5). Para esto se preparó una mezcla de reacción
con 9 mL de xantina 0.3 mM, 4.5 mL de NBT 150 μM, 4.5 mL de EDTA 0.6 mM y 2.25 mL de
Na2CO3 400 mM. Las muestras se adicionaron a 332 μL de mezcla de reacción y la cinética se
inició por adición de 30 μL XO (5 mg/mL en NH4SO2 2 M), se dejó incubar por 15 minutos, se
adicionaron 132 μL de CuCl2 para detener la reacción y se determinó la absorbancia a 560 nm,
lo mismo se realizó con un control positivo sin muestra. Se definió una unidad de SOD (U)
como la cantidad de enzima que evita la oxidación de 1 mol de NBT por minuto, los resultados
se expresaron como U/mg proteína usados.

Esquema 5. La xantina oxidasa utiliza xantina para producir superóxido, el cual a su vez oxida
al nitroazul de tetrazolio (NBT) para producir formazán, compuesto que absorbe a 560 nm. La
actividad de la SOD en la muestra evita la producción de formazán, al abatir los niveles de
superóxido, por lo que disminuye los incrementos en la absorbancia a 560 nm, lo que se
considera como una medida de la actividad de la SOD.

7.3.7 HISTOLOGÍA.
Los cambios en la morfología de las nefronas se evaluaron histológicamente por tinción de
hematoxilina y eosina (H&E). La H&E se utiliza principalmente para evidenciar las alteraciones
estructurales en el parénquima renal, específicamente en la corteza (Pawlina, 2018).
El estudio histológico se realizó con tres riñones por grupo, inmediatamente después de retirar
el riñón se fijó por inmersión en solución de formaldehído al 10% (fijador), disuelto en solución
salina amortiguadora de fosfatos (PBS). Después de un día de fijación, secciones renales se
deshidrataron con soluciones alcohólicas de concentración progresiva y luego se embebieron
en parafina con el fin de permitir su corte. Se obtuvieron secciones de 5 µm de ancho y se
tiñeron con hematoxilina / eosina para la evaluación por histología. Para colorear o teñir los
cortes histológicos, la parafina debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos
deben rehidratarse mediante el uso de una serie de soluciones de alcohol de concentración
decreciente. Para posteriormente obtener un preparado permanente en un portaobjetos y poder
ser observadas directamente en el microscopio.

7.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Los resultados se expresan como media ± error estándar de la media (EEM). Los datos se
analizaron con el software GraphPad Prism versión 5 (GraphPad Software Inc., EUA) usando la
prueba de análisis de varianza (ANOVA) seguida de la prueba de comparaciones
múltiples de
Tukey. Las diferencias se considerarán significativas con valores de p≤ 0.05.

8. RESULTADOS.
8.1 FUNCIÓN RENAL.
8.1.1 MARCADORES DE DAÑO RENAL.
Para determinar la validez de nuestro modelo, se inició con la determinación de los marcadores
de daño renal: BUN y creatinina en plasma. Como se observa en las figuras 1 y 2, el grupo con
AF mostró un aumento significativo en los niveles de creatinina y BUN con respecto al control.
Por su parte, el pre-tratamiento con NAC previno el aumento en ambos marcadores de daño
renal (Figs. 1 y 2).

FIGURA 1. Determinación de creatinina en plasma. Los datos se presentan como
la media ± EEM, n= 6. Se realizó un análisis de varianza de una vía con una
prueba de Tukey subsecuente. *p<0.05, **p<0.01.

FIGURA 2. Determinación de nitrógeno ureico en sangre (BUN); Los datos se
presentan como la media ± EEM, n= 6. Se realizó un análisis de varianza de una
vía con una prueba de Tukey subsecuente. **p<0.01, ***p<0.001.

El daño renal a su vez genera el desencadenamiento de la hipertrofia del riñón
para evaluar si la misma está presente a las 48 h, se determinó el peso de cada
riñón en relación con el peso del animal. Como se observa en la Figura 3, se

presentó un aumento significativo en los pesos de los riñones del grupo tratado
con AF con respecto al control. Y a su vez se observa que en el grupo con pre-
tratamiento de NAC se previene dicha hipertrofia (Fig. 3).

FIGURA 3. Pesos relativos de riñón. Los datos se presentan como la media ± EEM, n= 6. Se
realizó un análisis de varianza de una vía con una prueba de Tukey subsecuente. *p<0.05,
***p<0.001.

Lo siguiente fue la determinación por WB de los marcadores de daño renal. En el caso de KIM-
1 en homogeneizado renal, se encontró un aumento significativo en el grupo con AF,
corroborando la presencia del daño renal. Dicho marcador disminuyó significativamente con el
pre-tratamiento con NAC (Fig. 4).

Molécula 1 de lesión renal (KIM-1) en homogeneizado renal.
A)

FIGURA 4. Marcador de daño renal: molécula 1 de lesión renal (KIM-1) en
homogeneizado renal por WB (A) y su cuantificación por densitometría (B). Se utilizó
actina como control de carga. Los datos se presentan como la media ± EEM, n=3. Se
realizó un análisis de varianza de una vía con una prueba de Tukey subsecuente.
*p<0.05, ***p<0.001.

En cambio, en el marcador N-Gal en homogeneizado renal y en plasma no reveló
diferencias significativas entre los diferentes grupos (Figs. 5 y 6).

Lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (N-Gal) en homogeneizado renal.
A)

FIGURA 5. Marcador de daño renal lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (N-GaL)
en homogeneizado renal evaluado por WB (A) y su cuantificación por densitometría (B). Se
utilizó actina como control de carga. Los datos se presentan como la media ± EEM, n= 3. Se
realizó un análisis de varianza de una vía con una prueba de Tukey subsecuente.

Lipocalina asociada a la gelatinasa de neutrófilos (N-Gal) en plasma.
A)

FIGURA 6. Marcador de daño renal: lipocalina asociada a la gelatinasa de
neutrófilos (NGAL) en plasma evaluado por WB (A) y su cuantificación por
densitometría (B). Se utilizó el mismo volumen de plasma como control de carga.
Los datos se presentan como la media ± EEM, n=3. Se realizó un análisis de
varianza de una vía con una prueba de Tukey subsecuente.

8.1.2 PROTEÍNAS DE INFLAMACIÓN.

Con el objetivo de determinar la presencia de procesos inflamatorios en el modelo
de daño renal inducido por AF a las 48 h se procedio a evaluar por WB en
homogeneizado renal los niveles de las proteinas de inflamacion: NF-κB e IL-1β.
No se observaron diferencia significativas en ninguno de los grupos en el caso de

NF-κB, pero en el caso de IL-1β se observó un aumento significativo en el grupo
con AF (Figura 7).

Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células
B activadas (NF-κB) e Interleucina-1 (IL-1β) en homogeneizado renal.

FIGURA 7. Proteínas de inflamación factor nuclear potenciador de las cadenas
ligeras kappa de las células B activadas (NF-ĸB) e interleucina-1 (IL-1β) en
homogeneizado renal evaluado por WB (A) y su cuantificación por densitometría
(B y C). Se utilizó actina como control de carga. Los datos se presentan como la
media ± EEM, n=6. Se realizó un análisis de varianza de una vía con una prueba
de Tukey subsecuente. ***p<0.001.

8.2 HISTOLOGÍA.

Para determinar la presencia de daño estructural en el riñón, se realizó la tinción
histológica con eosina y hematoxilina (H&E) en los riñones de los 4 grupos (Fig.
8). En el grupo tratado con AF se observaron mayores espacios intersticiales en la
parénquima renal ocupados por sustancia rosa pálida (sugiere posible inicio de
inflamación) a diferencia del grupo control con morfología normal (Fig. 8A),
aludiendo a la pérdida de nefronas y por lo tanto, la muerte de células tubulares
(Fig. 8B), además también se presenta un diferente acomodo de los túbulos
contorneados proximales podría decirse un tanto desorganizados con un gran
número de vacuolas alrededor del epitelio y dicho epitelio puede observarse más
delgado de lo normal, así como eritrocitos en medio de los túbulos sugiriendo

posibles hemorragias. En cambio, en el grupo con el pre-tratamiento se pueden
observar una menor cantidad de espacios intersticiales focalizados en ciertas
regiones sugiriendo que hubo una prevención de la pérdida de nefronas (Fig. 8C).

Figura 8. Micrografías representativas de cada uno de los grupos
experimentales. (A) Control. Apariencia histológica normal renal de una
rata. (B) AF. Rata tratada con AF, extenso daño tubular que se hizo
evidente por amplios espacios intersticiales (asteriscos *) así como
diferente morfología de los túbulos (equis X) con respecto al control. (C)
NAC+AF. Rata con pre-tratamiento de NAC, se observa una menor
cantidad de espacio intersticial en regiones focalizadas (flechas ↑). (D)
NAC. Rata tratada únicamente con NAC con morfología normal. Todas las
micrografías se tomaron a un aumento de 10x.

8.3 BIOENERGÉTICA MITOCONDRIAL.
8.3.1 RESPIRACIÓN MITOCONDRIAL.
Se procedió a determinar las alteraciones en la bioenergética mitocondrial,
evaluando los parámetros respiratorios: ICR, S3, S4o y P cuando la respiración es
alimentada con piruvato-malato-glutamato (vía complejo I).
El grupo tratado con AF presentó una disminución en el S3, S4o, en el ICR y en la
P con respecto al grupo control, mismas que se previnieron de manera
significativa con la pre-administración de NAC en todos los casos, excepto en el
S4o (Fig. 9).

FIGURA 9. Determinación de los parámetros mitocondriales: respiración en
estado 3 (S3), respiración en estado 4 inducido con oligomicina (S4o), respiración
asociada a la OXPHOS (P) e índice de control respiratorio (ICR) usando piruvato-

malato-glutamato como sustrato (PMG). Los datos se presentan como la media ±
EEM. n= 4-6. Se realizó un análisis de varianza de una vía con una prueba de
Tukey subsecuente. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

Adicionalmente se evaluó la actividad del complejo IV mitocondrial, pero no se
encontraron cambios significativos entre los diferentes grupos (Anexo I: 13.1.
Figura suplementaria 1).

8.3.2 POTENCIAL DE MEMBRANA MITOCONDRIAL.

Para determinar si los cambios en los estados repiratorios se relacionaban
a cambios en el Δψm, se evaluaron las variaciones en el estado 3 y 4o
alimentado de igual manera por piruvato-malato
glutamato (vía complejo I).
La estimación indirecta del Δψm, reveló una disminución significativa en el
S4o y una tendencia a disminuir en el S3, en el grupo tratado con AF con
respecto al grupo control. A su vez el pre-tratamiento con NAC previno la
disminución en el Δψm para ambos casos (S3 y S4o) (Fig. 10).

FIGURA 10. Determinación de las variaciones en el potencial de membrana
mitocondrial (Δψm) usando safranina como sonda y utilizando piruvato-
malato-glutamato como sustrato (PMG). Los valores se presentan como los
cambios en la concentración medible de safranina (ΔμM de Safranina) en
los estados S3 y S4o de la respiración mitocondrial. Los datos se presentan
como la media ± EEM. n= 4-6. Se realizó un análisis de varianza de una
vía con una prueba de Tukey subsecuente. *p<0.05, ***p<0.001.

Se evaluó además por WB en homogeneizados los cambios en los niveles de las
subunidades de los complejos de la OXPHOS (Anexo I: 13.2. Figura
suplementaria 2). En la cual se pudo observar una disminución en el caso de la
subunidad del CI en el grupo con AF.

8.4 ESTRÉS OXIDANTE.
8.4.1 MARCADORES DE ESTRÉS OXIDANTE.

Para la evaluación del estrés oxidante mitocondrial se procedió a determinar en
mitocondrias aisladas los niveles del marcador de estrés oxidante malondialdehído
(MDA) por WB. En este caso se preparó un gel de menor tamaño, es decir se

agregó la mitad del volumen utilizado normalmente para el gel separador (2 mL)
esto con el fin de concentrar la señal al tratarse de un barrido. Se observó
aumento significativo en los niveles de MDA en el grupo administrado con AF con
respecto al control, misma que se previno con el pre-tratamiento con NAC (Fig.
11).

Malondialdehído (MDA) en homogeneizado renal.

FIGURA 11. Niveles de malondialdehído (MDA) en homogeneizado renal
evaluado por WB y su cuantificación por densitometría. Se utilizó actina como
control de carga. Los datos se presentan como la media ± EEM, n=6. Se realizó un
análisis de varianza de una vía con una prueba de Tukey subsecuente.

8.4.2 ENZIMAS ANTIOXIDANTES.

Se determino la actividad de las enzimas antioxidantes GPx, GR, GST,
SOD y CAT en la corteza y la médula del riñón.
En la corteza renal hubo una clara caída en las actividades enzimáticas del
grupo tratado con AF en todos los casos excepto en la SOD. Sin embargo,
no se observó una recuperación significativa de dichas actividades con la
administración del pre-tratamiento de NAC (Fig. 12).

Figura 12. Actividades de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), glutatión
reductasa (GR), glutatión transferasa (GST), superóxido dismutasa (SOD) y
catalasa (CAT) en corteza renal. Se realizó un análisis de varianza de una vía con
una prueba de Turkey subsecuente. n=3. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.

A su vez en la medula renal se observa una disminución de la actividad de las
enzimas antioxidantes GR, CAT del grupo con AF, y una tendencia a disminuir en
las enzimas restantes. De igual manera que en la corteza renal no se observó una
recuperación tras la administración del pre-tratamiento con NAC (Fig. 13).

Figura 13. Actividades de las enzimas glutatión peroxidasa (GPx), glutatión
reductasa (GR), glutatión transferasa (GST), superóxido dismutasa (SOD) y
catalasa (CAT) en médula renal. Se realizó un análisis de varianza de una vía con
una prueba de Tukey subsecuente. n=3. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

9. DISCUSIÓN.
La determinación de los marcadores de daño renal BUN (Fig. 2) y creatinina (Fig.
1) en plasma, así como los niveles de la proteína KIM-1 en homogeneizado renal
(Fig. 4), nos ayudaron a valorar la presencia de daño renal en nuestro modelo.
Como se ha mencionado anteriormente, en términos generales en clínica un
aumento de la creatinina y el BUN en sangre se utilizan para diagnosticar la IRA
(Espinosa-Sevilla et al., 2013). El grupo tratado con AF presentó un aumento

significativo en los niveles de creatinina y BUN con respecto al control,
corroborando así la presencia del daño renal, aunado a esto el aumento en los
niveles de KIM-1 junto con la evaluación histológica nos indica el daño en el túbulo
proximal.
El incremento progresivo observado en los pesos de los riñones (Fig. 3), podría
explicarse principalmente como un mecanismo de compensación por pérdida de
nefronas funcionales, es decir una hipertrofia compensatoria. Eso concuerda con
lo que se ha descrito anteriormente (Anuj-Gupta et al., 2010; Aparicio-Trejo et al.,
2018), en el cual las nefronas restantes sufren un incremento compensatorio en
tamaño en un intento por recobrar la capacidad de filtración glomerular. Estas
alteraciones junto con el aumento del flujo sanguíneo llevan a una mayor presión
sobre las nefronas restantes, lo que genera mayores daños a las barreras de
filtración, además desencadena junto con el aumento del estrés oxidante procesos
de inflamación, de fibrosis y la pérdida progresiva de la función renal generando
así la progresión hacia la IRC.
Por otra parte como se ha descrito anteriormente, el mecanismo de la nefropatía
del AF se debe en parte a la formación de cristales luminales (Jay-Stallons et al.,
2014; Anuj-Gupta et al., 2010), lo que explicaría de igual manera el aumento
observado en los pesos obtenidos del riñón total. Por otro lado, en el grupo tratado
con AF se observó por medio de tinción histológica H&E (Fig. 8) un extenso daño
tubular, que se hizo evidente por amplios espacios intersticiales en la parénquima
renal, vacuolas alrededor del epitelio, pérdida del borde cepillo además de una
morfología diferente de los túbulos. Esto confirma la presencia del daño renal en la
corteza. Aunado a esto, se ha descrito que el túbulo proximal y el túbulo distal son
más susceptibles al daño por AF, debido principalmente a la pobre solubilidad del
folato, el cual precipita en forma de cristales en dichos segmentos, como resultado
del proceso de acidificación tubular, los cual se han asociado con la posterior
muerte celular de las células tubulares (Anuj-Gupta et al., 2010; Aparicio-Trejo et
al., 2018).

Por otro lado, en el caso de N-Gal tanto en plasma como en homogeneizado renal,
no se observó diferencias significativas entre ninguno de los grupos (Figs. 5 y 6).
Esto podría explicarse dado que N-Gal está relacionado principalmente a
nefropatías por infecciones o procesos de inflamación, siendo un marcador no tan
especifico y sensible en la predicción de la IRA obstructiva (Espinosa-Sevilla et
al., 2013).
Por su parte, la NAC previno el aumento en los marcadores de daño renal tanto
BUN, creatinina y KIM-1, además del aumento en la masa renal (hipertrofia) de
manera significativa y las alteraciones histológicas observadas. Esto confirma el
efecto protector de la función renal con dicho pre-tratamiento, específicamente la
protección en el túbulo proximal.
Por otro lado, la administración de AF se ha asociado al aumento del proceso
inflamatorio desde las primeras horas y a la fibrosis en la fase avanzada (Ortiz et
al., 2015; Aparicio-Trejo et al., 2018). Por tal motivo se procedió a evaluar la
presencia de inflamación a las 48 h por WB, a partir de los niveles de las proteínas
de inflamación IL-1β y NF-ĸB en homogeneizado renal. Se observó un aumento
significativo en el caso de la IL-1β, sugiriéndonos que efectivamente hay un
proceso inflamatorio. Sin embargo, dado que no se observó un aumento en los
niveles de NF-ĸB (ver Fig. 7), deducimos que el proceso fibrotico en este tiempo
no se encuentra presente de manera significativa.
Por otro lado, dado que el pre-tratamiento con la NAC no previene el aumento en
los niveles de IL-1β, esto sugiere que la NAC no previene a este tiempo

Entonces, ¿te gustó este material?

Ayude a animar a otros estudiantes a mejorar el contenido

¿Te gustó este material? ¡Compartir! 🧡