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Aprendiendo Biologia

23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO

FACULTAD DE CIENCIAS

EFECTO DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA EN
LA VIABILIDAD DE CÉLULAS TRONCALES
MESENQUIMALES DERIVADAS DE TEJIDO
ADIPOSO

T E S I S

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
B I Ó L O G A
P R E S E N T A :

BINISA JIMÉNEZ LÓPEZ

ASESOR:
DR. ROBERTO SÁNCHEZ SÁNCHEZ
2017

usuario
Texto escrito a máquina
CIUDAD UNIVERSITARIA, CDMX

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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DERECHOS RESERVADOS ©
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México).
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Jiménez López Binisa.
5519534953
Universidad Nacional Autónoma de México.
Facultad de Ciencias.
Biología.
412059962

Tutor.
Dr. Roberto Sánchez Sánchez.

Sinodales

Dra. María Cristina Velasquillo Martínez.

Dr. David Garciadiego Cázarez.

Dr. Roberto Sánchez Sánchez.

M. en C. Yaaziel Melgarejo Ramírez.

Biól. Ana María Brena Molina.

Trabajo escrito.

Efecto de las nanopartículas de plata en la viabilidad de células troncales
mesenquimales derivadas de tejido adiposo.

55 p

2017.

Este trabajo se realizó en el laboratorio de Biotecnología del Centro Nacional
de Investigación y Atención a Quemados del Instituto Nacional de
Rehabilitación.

Este proyecto fue financiado por el fondo CONACYT S0008-2015-2 No. 262103
cuyo responsable es el Doctor Roberto Sánchez Sánchez y por el proyecto
OIEA 18278/R2.

Se agradece al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por la
donación de piel porcina radioesterilizada bajo la colaboración establecida
con la Dra. María Esther Martínez Pardo.

Se agradece a Dr. Fidel Martínez Gutiérrez y al Dr. Gabriel Martínez Castañón
de la Universidad Nacional Autónoma de San Luis Potosí.

A mis padres.

ÍNDICE.
I. Abreviaturas………………………………………………………………………...07
II. Introducción……………………………………………………………………..….09
II.1. La piel……………………………………………………………………………09
II.2. Lesiones en la Piel…………………………………………………………....12
II.3. Reparación de las lesiones de la piel…………………………………......13
II.4. Piel Porcina Radioesterilizada (PPR)………………………………………17
II.5. Células Troncales Mesenquimales…………………………………….......18
II.6. Complicaciones por bacterias y hongos……………………………….....20
II.7. Características generales de las nanopartículas de plata (AgNPs)….21
III. Hipótesis………………………………………………………………………….….23
IV. Objetivos………………………………………………………………………….….24
V. Justificación………………………………………………………………………...25
VI. Metodología………………………………………………………………………....26
VI.1. Extracción de células troncales mesenquimales de tejido
adiposo…………………………………………………………………………..26
VI.2. Generación de andamios de Piel Porcina Radioesterilizada
impregnada con nanopartículas de plata…………………………………28
VI.3. Cultivo celular de MSC sobre PPR impregnada con
nanopartículas de plata a distintas concentraciones…………………..29
VI.4. Determinación de la viabilidad de las células troncales
mesenquimales cultivadas sobre apósitos de PPR impregnadas con
AgNPs medida por calceína…………………………………………………31
6

VI.5. Efecto de las AgNPs en la proliferación de las MSC cultivadas
sobre los apósitos de PPR………………………………………………….32
VII. Resultados………………………………………………………………………….34
VIII. Discusión……………………………………………………………………………43
IX. Conclusión………………………………………………………………………….48
X. Perspectivas………………………………………………………………………..49
XI. Bibliografía………………………………………………………………………….50

I. ABREVIATURAS.
 AgNPs. Nanopartículas de Plata.
 Ag. Molécula de plata
 CK. Citoqueratina.
 CD. Cluster de diferenciación.
 ECM. Matriz extracelular.
 FGF. Factor de Crecimiento de Fibroblastos.
 GAGs. Glicosaminoglicanos
 KDa. Kilo daltones.
 MSC. Células Troncales Mesenquimales
 PDGF. Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas.
 PPR. Piel Porcina Radioesterilizada.
 RPM. Revoluciones por minuto.
 SFB. Suero fetal bovino.
 TGF-β. Factor de Crecimiento Transformante β
 TNF-α. Factor de Necrosis Tumoral α.

II. INTRODUCCIÓN
II.1. La piel
La piel es un órgano complejo considerado como el más grande del cuerpo humano
tiene una superficie aproximada de 2 m2, ésta formada por diferentes capas y tipos
celulares que en su conjunto brindan una barrera entre el medio ambiente y el
cuerpo. Protege al organismo de daños ocasionados por la radiación UV, agentes
microbianos patógenos así como previene la pérdida de fluidos corporales y ayuda
a la termorregulación (Varkey, Ding et al. 2015). La piel suele tener grosores
distintos según la parte del cuerpo en la cual se localice.

Figura 1. Esquema representativo de la piel.

Es posible observar la representación de las capas que constituyen a la piel, epidermis, dermis
e hipodermis, así como la lámina basal y la vascularización del órgano. (MacNeil S, 2007)
9

Anatomía

Las capas que conforman la piel se pueden identificar de adentro hacia afuera en el
siguiente orden: hipodermis en la parte más profunda, la cual es seguida por la
dermis, lámina basal y la capa externa llamada epidermis.
La epidermis está constituida principalmente por queratinocitos, la cual se
encuentra en constante regeneración. La epidermis se divide en cinco capas, la
capa inferior o basal está a cargo de la proliferación de los queratinocitos que
alcanzan la superficie a los 30 días, se endurecen progresivamente y finalmente se
desprenden del cuerpo como escamas muertas (Metcalfe and Ferguson 2007).
Las capas epidérmicas son identificadas a través de citoqueratinas características
de cada población de queratinocitos de las cuales la CK5 y la CK14 se encuentran
en queratinocitos basales de la epidermis humana y la CK10 presente en los
queratinocitos en estratos ya diferenciados, los estratos de la epidermis están
organizados de adentro hacia afuera de la siguiente manera:
 Estrato basal (stratum basale): en este estrato los queratinocitos se
encuentran en constante división celular, también se encuentran otros tipos
celulares como los melanocitos y células de Merkel. Los melanocitos
sintetizan la melanina la cual es el pigmento responsable de la coloración de
la piel. Las células de Merkel se asocian con las fibras nerviosas y la
sensibilidad a estímulos externos (Varkey, Ding et al. 2015).
10

 Estrato espinoso (stratum spinosum): los queratinocitos están unidos a
manera de red mediante desmosomas. En esta capa se encuentran las
células de Langerhans que forman parte del sistema inmunológico.
 Estrato granuloso (strato granulosum): los queratinocitos presentes en este
estrato contienen los gránulos de queratohialina, causantes de la
queratinización progresiva.
 Estrato lúcido (stratum lucidum): este estrato se halla sólo en las partes más
gruesas de la epidermis por ejemplo en las palmas de las manos y las plantas
de los pies. En este estrato los bordes o núcleos de las células ya no son
reconocibles. Estrato córneo (stratum corneum): En este estrato las células muertas
resultantes de los queratinocitos se agrupan junto con sustancias muertas de
la piel para desprenderse en forma de escamas córneas. La capa córnea
permite el paso del agua y sustancias solubles en un rango de tolerancia muy
pequeño. El paso de las células del extremo inferior de la capa córnea hasta
llegar a la superficie y desprenderse dura dos semanas.
Entre la epidermis y la dermis se encuentra la lámina basal, esta se encuentra
compuesta por proteínas de matriz extracelular como: laminina, nidógeno,
proteoglicanos, colágena tipo IV y VII, colágena XVIII, y en menor medida por
colágena tipo I y III, Tenascina y fribilina-1 (Timpl and Brown 1996, Aumailley and
Rousselle 1999). En la lámina basal, la colágena tipo IV, laminina-5 y nidógeno
forman una red que tiene la función de formar una barrera entre la epidermis y la
dermis.
11

Los queratinocitos y fibroblastos contribuyen a la formación de esta membrana basal
además juega un papel importante en la función y maduración de la piel regulando
el crecimiento de queratinocitos así como su diferenciación (Fleischmajer, Kuhn et
al. 1997, Smola, Stark et al. 1998).
La capa que se encuentra debajo de la lámina basal es la dermis. La capa dérmica
se encuentra altamente vascularizada y provee de integridad estructural. En el
centro de la dermis los fibroblastos organizan una red tridimensional entre las
distintas fibras proteicas como la colágena tipo I, III y elastina que proporciona
soporte a la epidermis y asegura el mantenimiento de las propiedades mecánicas
de la piel, por consecuencia la dermis confiere a la piel resistencia dotada por la
colágena y elasticidad gracias a la elastina. La dermis también funciona como una
reserva hídrica a través de la matriz de proteoglicanos (Sorrell, Baber et al. 2008) y
se encuentra vascularizada suministrando energía y nutrientes a la piel razón por la
cual desempeña un papel crucial en la cicatrización y la termorregulación de la piel.
La dermis se compone principalmente de fibroblastos, estas células sintetizan fibras
de colágena, fibras de elastina y glicoproteínas de estructura. La destrucción de
estas fibras se lleva a cabo automáticamente a medida que el organismo envejece;
la colágena tipo I y la colágena tipo III son las principales proteínas estructurales
que constituyen el tejido conjuntivo y sirven de sostén a los tejidos de su entorno.
La elastina cuenta con la particularidad de tensarse y relajarse, lo que confiere a los
tejidos la elasticidad y la flexibilidad. La matriz extracelular (ECM) es el medio donde
viven todas las fibras conjuntivas. La secreción de la ECM está regulada
principalmente por la vía de dos macromoléculas: los glicosaminoglicanos (GAGs)
12

que están predominantemente ligados a proteínas que forman proteoglicanos y por
proteínas fibrosas (Ashkenas, Muschler et al. 1996, Hay 2005).
La capa que se encuentra en la parte profunda de la piel es la hipodermis, esta
capa se encuentra altamente vascularizada y está formada por tejido adiposo
especializado en la reserva de grasas, las células presentes en esta capa son los
adipocitos y las células troncales mesenquimales (MSC). El grosor de la
hipodermis varía según las zonas del cuerpo y el estado nutricional del individuo. La
grasa de la hipodermis es la reserva energética a largo plazo (Metcalfe and
Ferguson 2007). La capa de grasa subcutánea actúa como aislante térmico,
ayudando a conservar el calor corporal.
II.2. Lesiones en la piel.
Las lesiones en la piel provocan una discontinuidad en las capas que conforman
este órgano, esta ruptura llega a generar un desequilibrio de las condiciones
normales homeostáticas y permite el ingreso de patógenos a nuestro organismo.
Las lesiones en la piel suelen tener distintos orígenes como enfermedades
genéticas, úlceras por presión, úlceras diabéticas, traumatismos por calor como las
quemaduras, entre otros.
Las quemaduras son el resultado de un traumatismo físico o químico produciendo
desde una leve afectación en la piel hasta la destrucción total de los tejidos, estas
se clasifican en cuatro grupos generales como lo podemos observar en la figura 2.
(Evers, Bhavsar et al. 2010):
13

• Epidérmicas o primer grado (tipo I) caracterizadas por la destrucción de la
capa superficial de la piel.
• Dérmicas superficiales o segundo grado superficial (tipo II a) que afectan a
la capa superficial de la dermis.
• Dérmicas profundas o segundo grado profundo (tipo II b) que afectan a las
capas profundas de la dermis.
• Subdérmicas superficiales o tercer grado (tipo III) estas suelen no sentirse
por la completa destrucción de las terminaciones nerviosas y siempre son
subsidiarias de tratamiento quirúrgico precoz, constituyen las lesiones más
difíciles de reparar debido a que afecta tanto a la epidermis como a la dermis.

II.3. Reparación de lesiones de piel.
Posterior a un traumatismo el organismo desencadena una serie de señalizaciones
para reparar la zona afectada, la recuperación de una lesión en la piel es dividida
Figura 2. Esquema de quemaduras de primer, segundo y tercer grado.

(Healthwise, incorporated. 2017)
14

en cuatro etapas: hemostasis, inflamación, proliferación y remodelación. La etapa
de hemostasis ocurre por la vía de las fibrinas y a través de un tapón de plaquetas
las cuales activan la cascada de coagulación. El daño en las células endoteliales
expone al colágeno y este estimula la activación, adhesión y agregación de las
plaquetas. Las plaquetas producen factores quimiotácticos que incluyen Factores
de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF) y Factor de Crecimiento
Transformante-β (TGF- β); estos factores de crecimiento atraen macrófago,
neutrófilos, fibroblastos, células endoteliales y células de músculo blando (Kirsner
RS, 2008) los cuales son esenciales para la etapa inflamatoria y proliferativa. La
fibrina derivada del fibrinógeno derivado de plaquetas, actúa como una matriz para
la llegada de macrófagos y fibroblastos (Budzynski 1986).
La fase inflamatoria comienza cuando los neutrófilos se adhieren al endotelio
minutos después del trauma. Los neutrófilos utilizan la elastasa y colagenasa para
facilitar la migración dentro del espacio extracelular donde fagocitan bacterias,
degradan proteínas de matriz y atraen adicionalmente a más neutrófilos y
macrófagos (McDaniel, Roy et al. 2013). Los macrófagos son las células
inflamatorias de mayor importancia ya que actúan en el proceso de recuperación
(Mahdavian Delavary, van der Veer et al. 2011) además fagocitan microorganismos
patógenos, degradan los restos en la herida y estimulan la formación de tejido de
granulación y la angiogénesis. Los factores de crecimiento como lo son PDGF, TGF-
β, el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), la interleucina-1β, la interleucina-6
y el TNF-α (Shah, Omar et al. 2012), actúan sobre la proliferación de los macrófagos,
el TGF-β destaca dentro del grupo de estos factores de crecimiento ya que tiene
15

una importancia particular la cual es estimular a los macrófagos e influencia la
función de los fibroblastos, la quimiotaxis y la deposición de colágeno.
La fase de proliferación comprende las etapas de fibroplastia, granulación,
epitelización y angiogénesis la cual comienza 24 horas después de la realización de
la herida. De manera temprana, la matriz de fibrina permite a los queratinocitos
estimulados por TGF-β migrar del borde al interior de la herida (Zhang and Fu 2008,
Shah, Omar et al. 2012). Al mismo tiempo el factor de crecimiento vascular
endotelial (EVGF) regula mediante la baja tensión de oxígeno la angiogénesis
(Przybylski 2009, Shah, Omar et al. 2012). Las células del endotelio son reclutadas
y estimuladas a proliferar por el factor de crecimiento vascular endotelial, el cualinduce la migración de las células de músculo blando (Kirsner RS, 2008.,
Grosskreutz, Anand-Apte et al. 1999).
Para la reparación de las heridas los fibroblastos tienden a migrar en un lapso de
48 a 72 horas, además de migrar, proliferan y sintetizan matriz extracelular regulado
por el Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), factor de crecimiento
de fibroblastos (FGF), entre otros (Bainbridge 2013).
Los fibroblastos producen proteínas estructurales incluidas colágeno, elastina,
proteínas de matriz extracelular y metaloproteínas de matriz (MMPs). Las MMPs,
degradan el tapón de fibrina inicial y facilitan el movimiento de fibroblastos
(Bainbridge 2013). El colágeno es encontrado en un lapso que va de 48 a 72 horas
después de la herida y es secretada de 5 a 7 días post-herida. El colágeno tipo III
es inicialmente el más sintetizado y por ende la matriz es distinta a la original en
16

donde predomina colágena tipo I, esta síntesis de colágena tipo III está estimulada
por Factor de Crecimiento transformante β (TGF-β) (Kirsner RS, 2008). Los
glicosaminoglicanos y los proteoglicanos, son componentes de la matriz extracelular
dotándola de fuerza, soporte y densidad (Kirsner RS, 2008).
Macroscópicamente, la recuperación de la herida depende de múltiples factores
entre los cuales se deben considerar el tamaño de la herida, profundidad,
localización, la edad de los pacientes y la presencia de enfermedades sistémicas
(Morton and Phillips 2016). A nivel molecular, la recuperación de las heridas muestra
bajos niveles de bacterias, citocinas inflamatorias, proteasas y especies reactivas
de oxígeno. La poca recuperación de las heridas se puede deber a la reducción en
la oxigenación, inflamación crónica, senescencia de los fibroblastos, niveles críticos
de citocinas, factores de crecimiento y la colonización de la herida por bacterias e
infecciones (Mast and Schultz 1996).
Los avances tecnológicos en la fabricación de biomateriales y en el cultivo de
células han permitido la producción de sustitutos cutáneos que han sido una
alternativa terapéutica para la recuperación de las lesiones en la piel. Existen en el
mercado matrices acelulares como Integra® y Matriderm® las cuales solo pueden
ser usadas en quemaduras de primer grado y segundo grado superficial dado que
el paciente aún mantiene células que pueden reparar la herida. Epicel® y
Dermagraft® se componen de queratinocitos o fibroblastos (principales
componentes de epidermis y dermis). Epifast® es la única compañía mexicana que
ofrece un producto hecho a base a queratinocitos por lo que al igual que las marcas
anteriores, no es posible utilizarlo en quemaduras profundas. Karioskin® y Apligraf®
17

son empresas que desarrollan sustitutos dermoepidérmicos por lo que contienen
tanto fibroblastos como queratinocitos. Las compañías que comercializan estos
productos son en su mayoría extranjeras, lo que hace que sus costos sean elevados
y resulten poco accesibles para la mayoría de los pacientes en México (Dieckmann
C. et al. 2010; Jones I. et al. 2002; Bottcher-Haberzeth S. et al. 2010)
II.4. Piel Porcina Radioesterilizada (PPR)
Dentro de las coberturas que se utilizan para tratar a los pacientes quemados se
encuentra la Piel Porcina Radioesterilizada (PPR). Este apósito biológico permite la
recuperación de la piel en pacientes con quemaduras superficiales ya que reduce
la sensación de dolor, disminuye la pérdida de calor y electrolitos, evita la
deshidratación, impide que la herida se infecte con microorganismos, acelera la
epitelización y mejora la movilidad del paciente. La piel porcina también ofrece una
superficie idónea para el crecimiento y migración celular; por lo que hoy en día se
sigue utilizando como una cobertura temporal en pacientes con quemaduras
(Armour, Fish et al. 2006). Estas características se deben a su alto contenido en
glicosaminoglicanos y la presencia de factores de crecimiento como el FGF, los
cuales además de inducir la adhesión celular también son promotores de
proliferación (Reing, Brown et al. 2010). A pesar de ser xenogénica, el tratamiento
de esta matriz con radiación para esterilización ha demostrado ser segura para su
uso en lesiones cutáneas. Lo anterior permite tener una disponibilidad amplia de
material y a un bajo costo.
18

La radioesterilización de piel de cerdo es un procedimiento que se lleva a cabo en
México en el Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ) dentro del
Banco de Tejidos Radioesterilizados (BTR), los tejidos de este banco se encuentran
certificados para la aplicación clínica bajo la norma ISO 9001:2000 (Martinez-Pardo
and Mariano-Magana 2007).
II.5. Células Troncales Mesenquimales.
Las células Troncales Mesenquimales (MSC) son un conjunto heterogéneo de
células troncales estromales que tienen la habilidad de auto-renovarse y ser
multipotenciales, gracias a lo cual pueden diferenciarse en células de linajes
mesodérmicos y en células de otros linajes como células de tejido adiposo
(adipocitos), células de tejido óseo (osteocitos), células de cartílago (condrocitos),
células neuronales, células epiteliales, miocitos, entre otras (Pittenger, Mackay et
al. 1999, Jiang, Jahagirdar et al. 2002, Lee, Kuo et al. 2004), gracias a lo cual es
posible localizarlas en una amplia gama de tejidos.
Además de su potencial de diferenciación, las células troncales mesenquimales se
identifican por la expresión de marcadores de superficie celular como: CD13,
CD44, CD73, CD90, CD105 y por la ausencia de proteínas de superficie
hematopoyéticas como: CD34, CD45 (Tolar, Nauta et al. 2007, Chen, Wang et al.
2012).
Estudios demuestran que las células troncales mesenquimales migran hacia zonas
dañadas y se diferencian en células funcionales de tejido específicos (Nedeau,
Bauer et al. 2008, Alimperti, You et al. 2014, Shi, Lv et al. 2015). Estas células
19

también crean un microambiente en la zona afectada secretando citocinas, factores
de crecimiento y otras moléculas parácrinas para acelerar la regeneración del tejido
en dichas zonas (Granero-Molto, Myers et al. 2011, Kalinina, Sysoeva et al. 2011,
Liang, Ding et al. 2014, Linero and Chaparro 2014, Ulivi, Tasso et al. 2014).
Las Células Troncales Mesenquimales han sido sugeridas para estimular la
vascularización de las lesiones en la piel, de esta manera se incrementa el
suministro de oxígeno y ayudan al reclutamiento de células del sistema
inmunológico acelerando la regeneración epitelial (Agay, Scherthan et al. 2010).
Estudios sugieren que las propiedades regulatorias de las células del sistema
inmunológico por parte de las células troncales mesenquimales llegan a contribuir
en la recuperación de heridas en la piel incrementando el número de moléculas anti-
inflamatorias; en la piel, las células troncales mesenquimales incrementan los
niveles de interleucina-10 y reduce los niveles de moléculas pro-inflamatorias, como
interleucina-1β (Horton, Hudak et al. 2013), estas células también son capaces de
evitar la diferenciación de fibroblastos a miofibroblastos (responsables de la
formación de cicatrices) y tienen la facultad de diferenciarse a fibroblastos dérmicos
y queratinocitos (componentes principales de dermis y epidermis) (Du, Roh et al.
2010, Chavez-Munoz, Nguyen et al. 2013). Existe una gran cantidad de trabajos
que demuestran los beneficios de las MSC en la reparación tisular mediante
diferentes mecanismos, por lo que en la actualidad se implementan diversos
protocolos de investigación en humanos donde estas células han logrado reparar
lesiones dérmicas severas. (Falanga et al. 2007; Yoshikawa et al. 2008).

II.6. Complicaciones por bacterias y hongos.Las infecciones en las heridas suelen ser recurrentes y los rangos de contaminación
abarcan desde el punto en el cual las bacterias no se multiplican hasta el punto de
generar infecciones sistémicas. El biofilm es un problema significativo en las heridas
crónicas, está formado por una comunidad de bacterias que secretan una matriz la
cual tiene una función protectora ante la respuesta inmunológica del hospedero y
dificulta ser eliminado (Morton and Phillips 2016). En la actualidad los tratamientos
para la eliminación bacteriana están basados en fármacos y la resistencia a los
fármacos concierne en gran manera a la salud pública. El uso recurrente de los
tratamientos con antibióticos desarrolla nuevas resistencias, adicionalmente, el
costo de los tratamientos farmacéuticos incrementa a la par del número de
tratamientos fallidos y el alto espectro de terapias está asociada con el incremento
en el número de hospitalizaciones por día (Torres-Sangiao, Holban et al. 2016).
Debido a la falta de nuevas alternativas para el tratamiento de enfermedades
infecciosas muchos tipos de nanopartículas antimicrobianas y nanoacarreadores
para antibióticos han sido estudiadas como una alternativa eficiente para el
tratamiento de enfermedades infecciosas, incluyendo la resistencia bacteriana a
antibióticos (Huh and Kwon 2011).
Los agentes antimicrobianos inhiben el crecimiento de un amplio rango de microbios
como bacterias y hongos (Rudramurthy, Swamy et al. 2016). Como respuesta ante
la resistencia que las bacterias y hongos llegan a presentar se han desarrollados
nuevos tratamientos como lo son los tratamientos en los cuales se utilizan
nanopartículas.
21

II.7. Características generales de las nanopartículas de plata (AgNPs).
Los avances en la nanotecnología han permitido la síntesis de moléculas orgánicas
e inorgánicas de tamaño nanométrico con el potencial de ser aplicada en la industria
alimentaria, médica y terapéutica. El desarrollo de agentes antimicrobianos de
escala nanométrica es una estrategia alternativa contra la resistencia
antimicrobiana (Akhtar, Swamy et al. 2015).
El mecanismo antimicrobiano de la plata (Ag+) está relacionada con la interferencia
de la cadena de transporte de electrones y la transferencia de energía en la
membrana, debido a que la plata tiene afinidad por los grupos sulfúricos presentes
en las enzimas de la pared celular (Lemire, Harrison et al. 2013, Franci, Falanga et
al. 2015). La plata también inhibe la replicación del DNA e interfiere en la cadena
respiratoria en hongos y bacterias (Franci, Falanga et al. 2015). Las AgNPs son un
buen recurso como agente antimicrobial además de poseer cualidades
antioxidantes, anti-inflamatorias y anticancerígenas (Akhtar, Swamy et al. 2015,
Keat, Aziz et al. 2015, Swamy, Akhtar et al. 2015).
Los iones de plata tienen una alta afinidad por los grupos fosfato y sulfúricos, lo cual
explica la actividad antimicrobiana. Los iones de plata liberados en forma de
nanopartículas reaccionan con las proteínas que contienen azufre, principalmente
en la superficie de la célula, y con los ácidos nucleicos que contienen fosfatos. Es
así como se producen las especies reactivas de oxigeno (ROS) dentro de la célula,
llevándola eventualmente a la muerte (Fu, Xia et al., Reidy, Haase et al. 2013,
Franci, Falanga et al. 2015). El daño en los ácidos nucleicos y las alteraciones en la
22

pared celular de las bacterias son considerados como las razones fundamentales
que causan la muerte celular bacteriana (Fu, Xia et al., Haider and Kang 2015).
El tamaño y la forma de las nanopartículas tienen un papel significativo en la
actividad antimicrobiana. Las AgNPs con un diámetro ≤ 10 nm puede atravesar los
poros de la pared celular llevando a la muerte al microorganismos (Prabhu and
Poulose 2012, Franci, Falanga et al. 2015, Kumara Swamy, Sudipta et al. 2015,
Swamy, Akhtar et al. 2015).
Las nanopartículas de plata fueron obtenidas mediante la mezcla de una solución
de AgNO3 a 0.01M. Posterior a la síntesis, la dispersión fue obtenida mediante una
membrana de diálisis de 12 KDa de peso molecular por 48 horas y fueron
caracterizadas mediante el análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS) y por
microscopia electrónica de transmisión. Las formas presentes en las AgNPs suelen
ser variadas, se constató que las AgNPs presentaban una forma esférica y
semiesférica y una distribución estándar en el tamaño (Velázquez-Velázquez, J. L.
et al. 2015)
Ante este panorama, el presente trabajo tiene como objetivo utilizar la piel porcina
radioesterilzada e impregnada con AgNPs como un andamio para el cultivo de
células troncales mesenquimales. Este compuesto podría utilizarse como un apósito
que además de evitar la pérdida de fluidos también inhiba el crecimiento bacteriano
y promueva la reparación de las heridas de piel.

III. HIPÓTESIS
Distintas evidencias indican que a mayor concentración de nanopartículas de plata
éstas aumentan su toxicidad, por lo que se espera que la Piel Porcina
Radioesterilizada (PPR) impregnada a bajas concentraciones de AgNPs permita
una mayor sobrevivencia de las células troncales mesenquimales comparada con
altas concentraciones de AgNPs.

IV. OBJETIVOS
Generales
Evaluar el efecto de las nanopartículas de plata impregnadas en la piel porcina
radioesterilizada ante la cual no se afecte la viabilidad y proliferación de las células
troncales mesenquimales.

Particulares
 Determinar la viabilidad de las células troncales mensenquimales sobre
apósitos biológicos de PPR impregnadas a concentraciones de 125ppm,
250ppm, 500ppm y 1000ppm de AgNPs.
 Determinar la proliferación de las células troncales mensenquimales sobre
apósitos biológicos de PPR impregnadas a concentraciones de 125ppm,
250ppm, 500ppm y 1000ppm de AgNPs.

V. JUSTIFICACIÓN
El índice de infecciones en quemaduras es muy alto y conlleva a distintas
complicaciones para su tratamiento. La innovación de un sustituto biológico de piel
que contenga células con capacidades regenerativas, un soporte que funcione
como cobertura y que además contengan nanopartículas de plata que evitan la
infección de la herida se vuelve de gran importancia para acelerar la recuperación
de las personas afectadas por quemaduras y disminuir la mortalidad, lo cual resulta
de gran trascendencia tanto médica como económica. Sin embargo, se requiere
garantizar la seguridad del uso de este tipo de terapias, por lo tanto, es determinante
conocer la concentración de nanopartículas de plata a la cual las células troncales
mesenquimales mantienen a más del 85% la viabilidad y proliferación, lo que
ayudará en la reparación de heridas de la piel.

VI. METODOLOGÍA
Las células troncales mesenquimales (MSC) utilizadas fueron obtenidas en el
transcurso del año 2016 a partir de tejido adiposo, este tejido se obtuvo de
lipoaspirados en pacientes, con previa firma de consentimiento informado por parte
del donador.
VI.1 Extracción de MSC de tejido adiposo.
Las muestras de tejido adiposo que fueron procesadas se encontraban en un
contenedor con medio de transporte el cual es compuesto de medio DMEM-F12 y
10 % de Antibiótico – Antimicótico (Gibco® by life technologies™) compuesta por
penicilina, estreptomicina y anfotericina B Fungizone®.
Dentro de la campana de flujo laminar clase II Thermo scientific 1300 series A2 se
colocó una caja Petri de vidrio estéril e instrumental estéril a utilizar al igual que la
muestra de tejido adiposo a tratar. La muestra se retiró del contenedor con ayuda
de unas pinzas de disección y se colocó en la caja Petri como se observa en la
figura 3-A. El tejido adiposo se colocó en tubos (Corning®) de 50 mL a un volumen
de 20 mL de tejido adiposo con 20 mL de PBS 1XpH 7.4 (Gibco® by life
technologies™) suplementado con 10% de Antibiótico-Antimicótico (100X, Gibco®
by life technologies™) y se realizaron tres lavados durante 5 minutos cada uno
figura 3-B, posteriormente se disgregó con bisturí hasta dejar pequeños fragmentos
en una caja de Petrí lo cual se observa en la figura 3-C, los fragmentos se colocaron
nuevamente en tubos (Corning®) de 50 mL y se le agregó una solución de
colagenas tipo II (Worthington) a una concentración de 10 mg/mL en medio DMEM
27

F-12 (Gibco® by life technologies™), la muestra con colagenasa fue puesta en
incubación por aproximadamente 60 minutos a una temperatura de 37°C a una
agitación de 250 rpm.
Posterior a la incubación se le añadió la misma cantidad de medio DMEM F-12
suplementado con SFB 10% (Gibco® by life technologies™), 1% de antibiótico-
antimicótico (100X, Gibco® by life technologies™), 1% de glutamato (GlutaMAX™-
I, 100X, Gibco® by life technologies™) y 1% de piruvato de sodio (Sodium Pyruvate,
100mM, Gibco® by life technologies™). La muestra se dejó a temperatura ambiente
hasta observar claramente dos fases una fase acuosa y otra grasa y con una pipeta
se retiró la fase acuosa (figura 3-D), la cual fue pasada por un filtro de 70 µm (Cell
Strainer, FALCON®, a Corning brand). La muestra fue centrifugada a 1500 rpm
durante 5 minutos, el sobrenadante fue retirado (figura 3-E) y el pellet resuspendido
con medio DMEM F-12 suplementado con SFB 10% (Gibco® by life technologies™),
1% de antibiótico-antimicótico (100X, Gibco® by life technologies™), 1% de
glutamato (GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by life technologies™) y 1% de piruvato
de sodio (Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco® by life technologies™) como se
observa en la figura 3-F. Se realizó el conteo celular en cámara de Neubauer. Las
células fueron sembradas a una densidad de 10 000 células por cm2 en frascos de
cultivo (Corning®) con medio DMEM F-12 suplementado (figura 3-H) y se dejaron
incubar a 37 °C con 5.0% de CO2 hasta llegar a confluencia (figura 3-I).

VI.2. Generación de andamios de Piel Porcina Radioesterilizada impregnada
con nanopartículas de plata en andamios de PPR.
La Piel Porcina Radioesterilizada (PPR) fue proporcionada por el Banco de Tejidos
Radioesterilizados del Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares, la cual fue
obtenida de cerdos sanos para posteriormente ser liofilizada e irradiada a 25 kGy.
Figura 3. Extracción de células troncales mesenquimales.

En la imagen se puede observar el método de extracción de células troncales
mesenquimales. A) muestra de tejido adiposo; B) lavados con PBS 1X; C) disgregación
mecánica del tejido adiposo; D) retiro de fase acuosa posterior a la disgregación con
colagenasa tipo II; E) pellet obtenido posterior a la centrifugación; F) resuspención del pellet
para conteo en cámara de neubauer; G) siembra de las células obtenidas en frascos de
cultivo; H) rotulación de los frascos de cultivo; I) incubación de las células extraídas hasta
confluencia a 37°C con 5.0% CO2.

El apósito biológico fue cortado en círculos de un diámetro de 6 mm, posteriormente
se realizaron las diluciones requeridas a partir de un stock de AgNPs de 1000 ppm
proporcionado por el Dr. Fidel Martínez Gutiérrez y el Dr. Gabriel Martínez Castañón
de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí y agua desionizada para obtener
las concentraciones requeridas de nanoparticulas plata las cuales fueron 1000 ppm
o el stock de AgNPs al 100%, 500 ppm formada por 50% del stock de AgNPs y 50%
de agua desionizada; 250 ppm formada por 25% del stock de AgNPs y 75% de agua
desionizada y 125 ppm formada por 12.5% del stock de AgNPs y 87.5% de agua
deionizada.
Los apósitos fueron colocados en tubos de 15 mL (Corning®) con las distintas
concentraciones de nanopartículas de plata, los tubos con las diluciones y los
apósitos de plata fueron sonicados durante 15 min y posteriormente se dejaron
incubar por 72 horas a 250 rpm, posterior a la incubación los apósitos fueron
puestos en un desecador para retirarles el exceso de agua.
VI.3. Cultivo celular de MSC sobre PPR impregnada con nanopartículas de
plata a distintas concentraciones.
Las MSC que fueron extraídas de tejido adiposo humano fueron cultivadas con
medio DMEM F-12 suplementado con SFB 10% (Gibco® by life technologies™), 1%
de antibiótico-antimicótico (100X, Gibco® by life technologies™), 1% de glutamato
(GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by life technologies™) y 1% de piruvato de sodio
(Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco® by life technologies™) por un tiempo
aproximado de 15 días hasta tener una confluencia del 90% en cada frasco de
30

cultivo (Corning®) T75. Las células fueron desprendidas del frasco de cultivo a
través del uso de tripsina-EDTA al 0.25% (Trypsin-EDTA 1X, Gibco® by life
technologies™) y PBS 1X pH 7.4 (Gibco® by life technologies™).
El medio de cultivo es retirado del frasco y se le adicionó PBS 1X pH 7.4 (Gibco®
by life technologies™) y se realizan dos lavados, posterior a los lavados se adicionó
tripsina-EDTA 0.25% diluida 1:4 en PBS 1X. Las células con tripsina-EDTA y PBS
1X fueron incubadas a 37 °C por 5 minutos, una vez que las células se encuentran
desprendidas se adicionó la misma cantidad de medio DMEM F-12 suplementado
con SFB 10% (Gibco® by life technologies™), 1% de antibiótico-antimicótico (100X,
Gibco® by life technologies™), 1% de glutamato (GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by
life technologies™) y 1% de piruvato de sodio (Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco®
by life technologies™) que se añadió de tripsina-EDTA y PBS 1X para la inactivación
de la enzima.
Las células en suspensión fueron centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos, el
sobrenadante fue retiró y se resuspendió el pellet con un volumen de 3 mL de medio
aproximadamente y se procedió a realizar el conteo celular en la cámara de
Neubauer.
De la suspensión se tomaron un total de 30 000 células para ser sembradas en cada
apósito biológico por triplicado en platos de 24 pozos como se observa en la figura
4. Para la siembra de 18 condiciones experimentales se tomaron 540 000 células
las cuales se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y
se resuspendió el pellet en un volumen de 180 µL, para sembrarlas se tomaron y
31

colocaron 10 µL de la suspensión en el centro del apósito y se dejaron incubar por
60 minutos a 37 °C, posteriormente se le adicionó medio DMEM F-12 suplementado
y se dejó incubar a 37 °C con 5.0% de CO2.

VI.4. Determinación de la viabilidad de las células troncales mesenquimales
cultivadas sobre apósitos de PPR impregnadas con AgNPs medida por
calceína.
Las células troncales mesenquimales fueron sembradas e incubadas sobre los
apósitos biológicos impregnadas a distintas concentraciones de AgNPs durante 72
horas con medio DMEM F12 suplementado con SFB 10% (Gibco® by life
Figura 4. Método de cultivo de las células troncales mesenquimales sobre el
apósito biológico de piel porcina radioesterilizada impregnada a distintas
concentraciones de nanopartículas de plata.

Se logra observar como los apósitos fueron colocados en el centro de los pozos según
las concentraciones deseadas, posterior a ello las células troncales mesenquimales
fueron sembradas e incubadas a 37 °C con 5% de CO2.
32

technologies™), 1% de antibiótico-antimicótico (100X, Gibco® by life
technologies™), 1% de glutamato (GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by life
technologies™) y 1% de piruvato de sodio (Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco® by
life technologies™) a una temperatura de 37 °C.
El medio DMEM F-12 suplementado fue retirado y se realizó un lavado con PBS 1X
pH 7.4 (Gibco® by life technologies™), se adicionó al medio DMEM F-12
suplementado 0.3 µL/mL de la solución a 4 mM de calceína (Calcein, AM. solution
in DMSO, molecular probes, by life technologies™) y 0.3 µL/mLde la solución a 2
mM de Homodimero de Etidio (ethidium homodimer -1, EthD-1, solution in 1:4
DMSO/H2O, molecular probes, by life technologies™) para obtener la
concentración deseada de calceína y Homodimero de Etidio.
Los apósitos biológicos con células se dejaron incubar con calceína y Homodimero
de etidio durante 60 minutos, posterior al tiempo de incubación se procedió al
registro fotográfico en el microscopio confocal LSM 780 y ZEN 2010 Carl Zeiss.
Se realizaron tres repeticiones del método, cada repetición por triplicado,
posteriormente se realizó el conteo de las células presentes por medio del programa
Image J y se realizaron pruebas estadísticas.
VI.5. Efecto de las AgNPs en la proliferación de las MSC cultivadas sobre los
apósitos de PPR
Las células troncales mesenquimales fueron sembradas e incubadas sobre los
apósitos biológicos impregnadas a distintas concentraciones de AgNPs con medio
DMEM F12 suplementado con SFB 10% (Gibco® by life technologies™), 1% de
33

antibiótico-antimicótico (100X, Gibco® by life technologies™), 1% de glutamato
(GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by life technologies™) y 1% de piruvato de sodio
(Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco® by life technologies™) a una temperatura de 37
°C.
Los apósitos biológicos fueron colocados en tubos de 1.5 mL (Ependorf), a cada
tubo con apósitos biológicos se les adicionó tripsina-EDTA a 0.25% diluida a 1:4 en
PBS 1X, en un volumen de 250 µL por tubo posteriormente a los apósitos biológicos
con células troncales mesenquimales a los que se les adicionó tripsina-EDTA y PBS
1X fueron incubadas a 37 °C por 10 minutos, una vez que las células se encontraban
desprendidas se adicionó la misma cantidad de medio DMEM F-12 suplementado
con SFB 10% (Gibco® by life technologies™), 1% de antibiótico-antimicótico (100X,
Gibco® by life technologies™), 1% de glutamato (GlutaMAX™-I, 100X, Gibco® by
life technologies™) y 1% de piruvato de sodio (Sodium Pyruvate, 100mM, Gibco®
by life technologies™) que se añadió de tripsina-EDTA y PBS 1X para la inactivación
de la enzima, en este caso se adicionó 250 µL del medio dando un volumen final de
500 µL.
Los tubos con apósitos biológicos fueron agitados en un vortex durante 5 s, las
células en suspensión fueron centrifugadas a 1500 rpm durante 5 minutos,
posteriormente se procedió a realizar el conteo celular con una cámara de Neubauer
y se obtuvo la desviación estándar con los resultados obtenidos. Los conteos
celulares se realizaron durante cinco días con los datos obtenidos se realizó una
curva de proliferación y se realizaron tres repeticiones del método cada repetición
por triplicado.
34

VII. RESULTADOS
Extracción de células troncales mesenquimales de tejido adiposo.
La extracción de células troncales mesenquimales del tejido adiposo, resulta como
una alternativa ante la falta de piel sana en personas que han sufrido daños por
quemaduras de más del 80% de la superficie corporal y que tienen zonas donadoras
para realizarles autoinjertos. El método de extracción utilizado ha sido
estandarizado en el Instituto Nacional de Rehabilitación y mostrado en el apartado
de metodología del presente trabajo (figura 3).
A partir de 20 g de tejido adiposo se obtuvieron aproximadamente 30 000 células
troncales mesenquimales las cuales estuvieron en incubación durante 24 horas.
Después de la incubación se realizaron dos lavados con PBS 1X para retirar los
excedentes de las células hematopoyéticas eritrocitos principalmente y células de
otros linajes presentes en el tejido adiposo las cuales se encuentran en mayores
porcentajes como se observa en la figura 5-A. De la población de células que se
logró extraer se observó que un número reducido de células troncales
mesenquimales se adhirió a la superficie de cultivo 24 horas después de la
extracción lo cual podemos observar en la figura 5-B, la adhesión a la caja de cultivo
es una de las características de las MSC. Cuatro días posteriores a la extracción,
las células troncales mesenquimales empezaron a proliferar y mostraron una
morfología similar a la morfología de los fibroblastos figura 5-C. En la misma imagen
es posible observar que las células troncales mesenquimales que se adhirieron a la
35

superficie de cultivo lograron proliferar hasta ocupar aproximadamente el 90 % de
la superficie disponible como se observa en la figura 5-D.

Las células extraídas del linaje adiposo fueron analizadas por citometría de flujo y
demostraron la presencia de los marcadores de superficie CD90, CD105 y CD73
para células mesenquimales en porcentajes mayores al 70% (Figura 6), y
mostraron porcentajes inferiores al 0.5% para CD34 y CD45 los cuales son
Figura 5. Células troncales mesenquimales extraídas de tejido adiposo.

A) Posterior a la extracción y siembra en cajas de cultivo se logra observar que la mayoría de
las células presentes corresponde a células hematopoyéticas, eritrocitos principalmente. B) Es
posible observar la adhesión de células troncales mesenquimales. C) Se observa una
morfología similar a la de los fibroblastos cuatro días después de la extracción. D) Se observa
la confluencia presente en la caja de cultivo 15 días posteriores a la extracción.

marcadores de células hematopoyéticas (Figura 7), por lo tanto se tiene la certeza
de que las células que fueron extraídas fueron MSC, como es descrito en la
literatura ya que cumplen con la cualidad de adherencia, morfología similar a la de
un fibroblasto y porcentajes considerable para marcadores de superficie CD105,
CD90 y CD73.

Figura 6. Citometría de flujo de células troncales mesenquimales marcadas con
anticuerpos positivos CD73, CD90 y CD105.

En los histogramas del lado derecho, los marcadores CD90, CD73 y CD105, son
marcadores de superficie para MSC. Se analizaron 10 000 eventos, los cuales arrojaron
que la población celular analizada tuvo una respuesta del 100% al marcador CD73, un
90% a CD90 y un 68% a CD105, así como en las gráficas de puntos se puede observar
que las células analizadas se encuentran doblemente marcadas dando un porcentaje
doble positivo para CD90 y CD105 de 94%, y para CD90 y CD73 de 95% confirmando
que son células troncales mesenquimales.

Generación de andamios de Piel Porcina Radioesterilizada impregnada con
nanopartículas de plata.
La piel porcina radioesterilizada fue impregnada a distintas concentraciones de
nanopartículas de plata para poder evaluar la viabilidad y proliferación de las células
troncales mesenquimales sobre dichos andamios y así obtener la concentración a
Figura 7. Citometría de flujo de células troncales mesenquimales marcadas con
anticuerpos negativos CD14, CD34 y CD45.

Las células troncales mesenquimales no tienen marcadores de superficie de células
hematopoyética las cuales son CD45, CD34 y CD14, por ello el porcentaje obtenido que
se muestra en los histogramas es menor al 0.5% para los tres casos, y como se muestra
en las gráficas de puntos las células están presentes en la zona que representa a los
marcajes dobles negativos.
38

la cual estas tienen un desarrollo estándar. El uso de nanopartículas de plata en
andamios de piel porcina radioesterilizada proporciona protección ante distintos
patógenos como lo son las bacterias y los hongos.

Al impregnar los apósitos de piel porcina radioesterilizada con nanopartículas de
plata tomaron una coloración en tonos marrón la cual iba en aumento con forme
aumentaba la concentración de nanopartículas de plata hasta llegar a un color negro
a 1000 ppm, el apósito se observó delgado y débil en comparación con el control
sin nanopartículas de plata como lo podemos observar en la figura 8.
Figura 8. Piel Porcina Radioesterilizada impregnada con nanoparticulas de plata.

Como se observa la PPR impregnada con nanopartículas de platasufre cambios
morfológicos en cuanto a color y espesor, con forme aumenta la concentración de
nanoparticulas de plata la PPR toma un color obscuro y brilloso.
39

Determinación de la viabilidad de las células troncales mesenquimales
cultivadas sobre apósitos de PPR impregnadas con AgNPs evaluada por
calceína.
Las células troncales mesenquimales extraídas de tejido adiposo son viables en
cultivo in vitro, la viabilidad fue evaluada mediante el método descrito en el kit de
LIVE/DEAD ® Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells cuyo principio está
basado en que las células vivas y con la maquinaria requerida para proliferar y
migrar, cuentan con esterasas intracelulares capaces de hidrolizar el acetoximetil
liberando a la calceína la cual emite fluorescencia que es observada en la longitud
de onda de 480 a 560 nm interpretado como color verde y en contraparte, las
células muertas o dañadas emiten una fluorescencia observada en la longitud de
onda de 620 a 780 nm interpretado como color rojo, debido a que las células que
presentan una membrana plasmática dañada permiten el paso del EthD-1 el cual
se adhiere a los ácidos nucleicos y permiten la excitación de fluorocromo.
Para realizar la cuantificación de las células vivas y muertas se utilizó el programa
Image J como se observa en la figura 9, la viabilidad de las células disminuyó
conforme aumenta la concentración de plata, dichas diferencias son significativas.
Fue posible observar que el porcentaje de viabilidad en las células mesenquimales
disminuyó conforme aumentaba la concentración de AgNPs impregnadas en los
apósitos biológicos de piel porcina radioesterilizada.

Pozo PPR 125 ppm 250 ppm 500 ppm 1000 ppm
Células vivas 100% 100% 90% 82% 80% 74%
Células muertas 0% 0% 10% 18% 20% 26%

Tabla 1. Promedio de porcentaje de viabilidad de las MSC sobre PPR impregnada
con AgNPs
Figura 9. Efecto de las AgNPs sobre la Viabilidad de las células troncales
mesenquimales.

La viabilidad que las MSC presentan en el apósito biológico de PPR impregnada con
AgNPs, disminuye conforme aumenta la concentración de AgNPs. Como se observa en
la imagen el número de células vivas disminuye conforme aumenta la concentración de
AgNPs impregnadas en el apósito, lo cual conlleva a que el apósito impregnado con
AgNPs en una concentración de 1000 ppm presente un porcentaje de células vivas del
74% y un porcentaje de células muertas del 26% basado en el número total de células
cuantificadas por el programa Image J presentes en el control. Las diferencias presentes
entre el apósito de PPR impregnada con AgNPs son significativas los tratamientos
p<0.05, ANOVA, Tukey. En las imágenes empalmadas es posible observar un cambio
en la morfología similar a los fibroblastos en el control a circular en la concentración de
1000 ppm.
41

Efecto de las AgNPs en la proliferación de las MSC cultivadas sobre los
apósitos de PPR.
La proliferación de las células troncales mesenquimales sobre piel porcina
radioesterilizada fue cuantificada mediante el conteo diario de las células presentes
en los apósitos impregnados con AgNPs, cada día las células fueron desprendidas
del apósito biológico mediante el método de tripsinización, cada conteo fue realizado
por triplicado y se realizó desviación estándar.
Los resultados obtenidos son mostrados en la gráfica 1, en la cual se logra observar
que las células troncales mesenquimales sembradas sobre los apósitos de PPR sin
plata tuvieron una proliferación considerada como normal por el aumento en el
número de las células, en cuanto a los tratamientos analizados se observó una
disminución en el número de células vivas presentes desde el día uno de conteo en
las cuatro condiciones; en los tratamientos de PPR impregnada con 125 ppm y 250
ppm fue posible observar un aumento del 50% en el número células vivas presentes
al segundo día, lo cual indicó que las células se encontraban en proliferación y se
habían acoplado a las condiciones del microambiente que las rodeaba; en cuanto a
las células presentes en el apósito de PPR impregnada con 500 ppm se observó la
presencia del 9% de células vivas con respecto a las células sembradas y no se
observó un aumento en el número de ellas en los días posteriores; en el apósito de
PPR impregnada con 1000 ppm, no se observó la presencia de células vivas desde
el primer día, lo cual indicó que las células troncales mesenquimales murieron al
estar en contacto con esa concentración de AgNPs.
42

Grafica 1. Efecto de las AgNPs impregnadas en apósitos de PPR en la
proliferación de las células troncales mesenquimales.

Como se muestra en la gráfica, las nanopartículas de plata afectan la proliferación de
las células troncales mesenquimales, las células sobre el apósito de piel porcina
radioesterilizada sin plata tienen una proliferación que va en aumento lo cual se
considera como normal. Los apósitos biológicos impregnados con nanopartículas de
plata muestran una disminución en el número celular desde el primer día, pero las células
presentes en los apósitos con bajas concentraciones como 125 ppm permiten la
proliferación de las células troncales mesenquimales dando un aumento en el número
celular, lo cual se observa también en el apósito con 250 ppm, mientras que en los
apósitos con 500 ppm y 1000 ppm la población celular decayó sin recuperación.
43

VIII. DISCUSIÓN.
La búsqueda de terapias que aceleren la recuperación de pacientes que han sufrido
traumatismos como quemaduras y disminuyan los riesgos de mortalidad ha tomado
una gran importancia en el sector científico, en el sector de clínico y en el sector
económico, ante esta necesidad un gran número de investigaciones han arrojado
como una solución el uso de células troncales mesenquimales (Agay, Scherthan et
al. 2010).
Las células troncales mesenquimales son una población celular que ha
desencadenado gran interés científico gracias a su capacidad de auto-replicación y
diferenciación en múltiples linajes celulares como osteocitos, condrocitos,
fibroblastos, células neuronales y adipocitos, aunado a estas características, las
células troncales mesenquimales pueden ser aisladas de distintas fuentes como la
medula ósea y el tejido adiposo (L. Funderburgh 2010), el último representa una
gran ventaja debido a su fácil obtención en pacientes que han sufrido quemaduras
de segundo grado profundo y tercer grado de más del 80 % de la superficie corporal
representa una alternativa viable para la obtención de células troncales
mesenquimales que permitan la diferenciación de fibroblastos y estos a su vez
sinteticen el microambiente necesario para acelerar la recuperación (Du, Roh et al.
2010, Chavez-Munoz, Nguyen et al. 2013).
Los protocolos de extracción de estas células han sido ampliamente investigados,
en nuestro país, el protocolo utilizado en el Instituto Nacional de Rehabilitación ha
demostrado que el número de células troncales mesenquimales que logran
adherirse es baja, pero tienen una proliferación acelerada lo cual representa una
44

gran ventaja ya que disminuye el tiempo en el cual las células llegan a confluencia
(figura 4-D) y permite que las células puedan ser utilizadas en menor tiempo; las
células que son extraídas mediante este protocolo han sido analizadas mediante
citometría de flujo, lo cual confirma que las células utilizadas son células troncales
mesenquimales ya que presentan marcadores de superficie CD73 y CD90 en
porcentajes mayores o aproximados al 90 %, en el caso del marcador CD105 estas
células demostraron tener un porcentaje menor al 70 % pero este bajo porcentaje
es ratificado mediante el análisis de doble marcaje en el cual se demuestra que las
células muestran dobles marcajes para CD105 y CD90, con lo cual demostramos
que las células presentes son células troncales mesenquimales(Tolar, Nauta et al.
2007, Chen, Wang et al. 2012). Demostrando que las células extraídas son MSC se
tiene la certeza de que las células que se cultivaran secretaran factores de
señalización como la interleucina-10 que ayudará a disminuir la inflamación así
como la respuesta inmunológica evitando complicaciones sistémicas (Horton,
Hudak et al. 2013).
En la actualidad se han desarrollado distintos tipos de andamios en los cuales las
células suelen tener las condiciones para poder proliferar. La piel porcina
radioesterilizada es un andamio que ha sido ampliamente utilizado en los últimos
años, este andamio funciona como soporte y como matriz de forma adecuada en la
cual las células pueden proliferar (Armour, Fish et al. 2006), además tiene como
ventaja ser de bajo costo en comparación con otros sustitutos biológicos y de gran
disponibilidad; la piel porcina radioesterilizada funciona como una barrera entre la
herida y el medio ambiente, evita la perdida de agua y la entrada de algunos
45

microorganismos, pero esto no es suficiente para evitar contaminaciones por
bacterias y hongos, las cuales al ser tratadas mediante distintos tipos de fármacos
llegan a presentar resistencia y complican la recuperación de las heridas, por lo cual
se ha implementado el uso de nanopartículas de plata las cuales a bajas
concentraciones inhiben el crecimiento de bacterias y hongos (Rudramurthy,
Swamy et al. 2016) al desestabilizar la membrana celular por su afinidad a grupos
fosfato y sulfhídricos, los cuales son componentes indispensables para la
supervivencia (Lemire, Harrison et al. 2013, Franci, Falanga et al. 2015) en adición
a ello la plata inhibe la replicación del DNA e interfiere en la cadena respiratoria en
hongos y bacterias (Franci, Falanga et al. 2015) aumentando el estado antiséptico
de los apósitos, las AgNPs permiten la supervivencia de las células troncales
mesenquimales, las cuales logran tener una viabilidad y una proliferación que
podemos considerar normal a una concentración de 125 ppm.
La viabilidad de las células troncales mesenquimales sobre el apósito de piel porcina
radioesterilizada impregnada a distintas concentraciones de plata tiene una
diferencia significativa entre cada uno de los tratamientos, siendo la concentración
de 125 ppm la adecuada ya que al comparar la viabilidad contra el control, las
células tienen una disminución del 10 % en su viabilidad lo cual representa una
disminución aceptable considerando los cambios en el microambiente, si estos
valores son comparados con la viabilidad expresada por las células troncales
mesenquimales sobre el apósito de piel porcina radioesterilizada impregnada con
500 ppm y 1000 ppm se tiene una pérdida considerable aunado a que la morfología
46

que las células presentan no es considerada normal o similar a fibroblastos sino que
se observan en forma circular como se observa en la figura 9.
Aunque el porcentaje de viabilidad es del 90% en la concentración de 125 ppm y
del 82% en la concentración de 250 ppm como se observa en la tabla 1, el número
de células disminuye lo que indica que las células no se adhieren o mueren al poco
tiempo afectadas por las altas concentraciones de AgNPs y se desprenden tal como
se observa en la figura 9 en donde podemos de igual forma observar que la
viabilidad disminuye conforme aumenta la concentración de AgNPs observando en
1000 ppm la presencia de MSC en forma circular y un número alto de células
muertas.
En cuanto a la proliferación las células troncales mesenquimales sobre el andamio
de piel porcina radioesterilizada impregnada con AgNPs se observa en la gráfica 1
una disminución en el número de células vivas en comparación con el control de
PPR sin AgNPs, esto posiblemente debido a la fase de adaptación celular al nuevo
ambiente al que están expuestas. En el segundo día de conteo el número celular
aumentó en un 50% del número celular que se tuvo en el día 1 en los tratamientos
de 125 ppm y 250 ppm, lo cual demuestra que las células troncales mesenquimales
comienzan a recuperarse, esto se habían adaptado al nuevo ambiente en el que
se encontraban y contaban con la capacidad de proliferar y poblar una superficie de
adherencia. En cuanto a las células presentes en los apósitos biológicos de piel
porcina radioesterilizada impregnadas con 500 ppm y 1000 ppm no se logró ver un
aumento en el número celular lo cual nos demuestra que la plata en altas
concentraciones afecta las condiciones celulares que permiten la proliferación
47

adecuada, posiblemente esto se deba a que la plata al encontrarse en altas
concentraciones llega a desestabilizar la membrana celular de las células e interfiere
con los nucleótidos del DNA (Franci, Falanga et al. 2015), lo cual afecta a la
viabilidad y la proliferación esto puede presentarse debido a que las células no
logran adherirse a los andamios impregnados con altas concentraciones de
nanopartículas de plata desde el momento de la siembra por alteraciones
morfológicas en la PPR causadas por el tratamiento con AgNPs.

IX. CONCLUSIÓN
La concentración de 125 ppm de nanopartículas de plata impregnada en los
apósitos de piel porcina radioesterilizada permite de manera in vitro que las células
troncales mesenquimales presenten una viabilidad del 90% y una proliferación
similar a la normal además de dotar de resistencia ante contaminaciones por
patógenos como bacterias y hongos asegurando la supervivencia de las células
troncales mesenquimales y disminuyendo riesgos al organismos en el que deseen
ser utilizados.
Esto representa una contribución a la investigación científica ya que puede derivar
en nuevos tratamientos ante quemaduras disminuyendo los riesgos de infecciones.

X. PERSPECTIVAS.
Dentro de las perspectivas a futuro del trabajo realizado se espera tener el registro
de la migración de las células troncales mesenquimales cultivadas sobre los
apósitos de piel porcina radioesterilizada impregnadas con nanopartículas de plata
a distintas concentraciones, se tiene el conocimiento que las MSC tienen una
migración similar a la normal a 125 ppm la cual no ha sido observada a
concentraciones mayores, probar la actividad antimicrobiana a menores
concentraciones de AgNPs así como la viabilidad, proliferación y migración de MSC,
estos registros reforzarán los antecedentes para poder proponer un proyecto en el
cual el andamio generado sea probado in vivo para poder determinar si en un futuro
este tratamiento puede ser utilizado en pacientes que han sufrido quemaduras y son
atendidos en el Instituto Nacional de Rehabilitación Luis Guillermo Ibarra Ibarra.

XI. BIBLIOGRAFÍAS

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Portada
Índice
I. Abreviaturas
II. Introducción
III. Hipótesis
IV. Objetivos
V. Justificación
VI. Metodología
VII. Resultados
VIII. Discusión
IX. Conclusión
X. Perspectivas
XI. Bibliografía

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