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23/7/2022

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Biología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
EFECTO DEL SULFORAFANO EN LA MUERTE
CELULAR INDUCIDA POR CISPLATINO EN CULTIVO DE
CÉLULAS RENALES.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUIMICA DE ALIMENTOS
PRESENTA:
MARIEL CALDERÓN OLIVER
MÉXICO, D.F. 2009

UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL

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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro,
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el
respectivo titular de los Derechos de Autor.

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 2
JURADO ASIGNADO:
PRESIDENTE: M. en C. Lucía Cornejo Barrera
VOCAL: Dr. José Pedraza Chaverri
SECRETARIO: Dra. María Elena Ibarra Rubio
1er. SUPLENTE: Dr. Francisco Ruiz Terán
2° SUPLENTE: Dra. Perla Deyanira Maldonado Jiménez
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA:
LABORATORIO 209, EDIFICIO F, SEGUNDO PISO. DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA.
FACULTAD DE QUIMICA. UNAM
ESTA TESIS FUE FINANCIADA EN PARTE POR CONACYT PROYECTO # 102442
ASESOR
DR. JOSÉ PEDRAZA CHAVERRI
SUPERVISOR TÉCNICO
DRA. YOLANDA IRASEMA CHIRINO LÓPEZ
SUSTENTANTE
MARIEL CALDERÓN OLIVER
Mariel Calderón Oliver
2009 Página 3
A mi mama Silvia.
Por su apoyo físico y emocional en todo momento.
Por estar siempre ahí, a mi lado.
Por luchar juntas.
Por la confianza.
Por darme la vida y compartir momentos inolvidables.
TE QUIERO MUCHO!!!!.
Mariel Calderón Oliver
2009 Página 4
AGRADECIMIENTOS:
A la UNAM y a la facultad de química por ser mi segunda casa a lo largo de
este tiempo, por todas las facilidades que me dio para completar mi formación
profesional.
A mi hermano David y mi amigo Jorge Omar por ser mis cómplices de toda la
vida y por estar ahí siempre que los necesito.
A mis amigos de primer semestre Gabriela, Roberto Alejandro y Nancy por ser
las primeras amistades de valor durante mi estancia en la facultad, así como un
gran apoyo personal y académico durante estos cinco años de arduo trabajo y
estudio. Son unos grandes amigos y personas!!!.
A mis amigos de carrera y/o facultad, en especial Itzia, Ireri, Betty, Cinthya,
Alexis, Ania, Grecia, Zaine, Luis Humberto, Viridiana, Luis Alberto; a cada uno
de ustedes gracias por su tiempo, consejos y apoyo, por estar a mi lado
siempre que los necesite, por las largas tardes de pláticas y las noches de
desvelo, por experimentar conmigo cosas nuevas e interesantes y en cierta
manera contribuir en una parte de mi carácter. Es un placer haberlos
conocido!!!.
A mis compañeros del laboratorio 209 por la ayuda y los consejos en la
elaboración de esta tesis. A Laura, Omar, Jazmín, Mabel, Enrique, Arelly y en
especial a Eduardo Molina por todo el apoyo técnico, tiempo y por los todos los
momentos padres que pasamos juntos!!!. Lab. 209 son un gran equipo de ATP,
NADPH y NADH.
Al Dr. José Pedraza e Irasema por brindarme la oportunidad de formar parte de
su equipo de investigación y por la paciencia en la elaboración de este trabajo.
A la M. en C. Lucía Cornejo, Dra. Ma. Elena Ibarra, Dr. Francisco Ruíz y Dra.
Perla Maldonado, por ser parte de mi jurado revisor, por su orientación y
redacción de la tesis.
Al personal docente de la facultad por contribuir a su manera y modo en mi
formación como química de alimentos.
A Dios y a la vida por dejarme llegar tan lejos, por forjar lo que soy ahora.
Esta tesis simboliza el cierre de una etapa exitosa y de las más hermosas de
mi vida. Una etapa en donde viví nuevas experiencias. Donde aprendí mucho,
no solo como perseguir a un electrón o predecir una reacción química, sino que
aprendí el valor de una amistad, de una sonrisa, de un fracaso, el significado
de un desvelo, de amar a alguien como nunca, de vivir intensamente, de luchar
por un sueño que parecía imposible y lejano. Cada uno de ustedes participo a
su manera en muchas de éstas agradables experiencias. Gracias por compartir
parte de su camino con el mío.
Por mi raza hablará el espíritu....GOOYA GOOYA.....!!!!

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 5
EFECTO DEL SULFORAFANO EN LA MUERTE CELULAR INDUCID A POR
CISPLATINO EN CULTIVO DE CÉLULAS RENALES.

CONTENIDO Página
ABREVIATURAS ................................................................................................ 6
1. RESUMEN ..................................................................................................... 8
2. INTRODUCCIÓN ........................................................................................... 9
2.1 Cisplatino (cis-diaminodicloroplatino II)..................................................... 9
2.1.1 Mecanismo de acción ....................................................................... 10
2.2 Estrés oxidante ....................................................................................... 11
2.3 Evidencias de la participación del estrés oxidante en la nefrotoxicidad
inducida por cisplatino .................................................................................. 13
2.4 Sulforafano ............................................................................................ 15
2.5 Funciones antioxidantes del sulforafano ................................................. 16
2.5.1 Mecanismo de acción del sulforafano como antioxidante (inductor de
enzimas citoprotectoras) ........................................................................... 16
2.5.2 Evidencia del sulforafano como antioxidante ................................... 17
3. JUSTIFICACION .......................................................................................... 19
4. HIPÓTESIS .................................................................................................. 19
5. OBJETIVOS ................................................................................................. 19
5.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................ 19
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 19
6. MATERIALES Y METODOLOGÍA ................................................................ 20
6.1 Diagrama de trabajo ............................................................................... 20
6.2 Reactivos ................................................................................................ 21
6.3 Cultivo de células .................................................................................... 21
6.4 Determinación de la viabilidad celular .................................................... 22
6.4.1 Método de MTT ................................................................................ 22
6.5 Evaluación del efecto del sulforafano en la viabilidad celular ................. 22
6.6 Evaluación del efecto de cisplatino en la viabilidad celular ..................... 23
6.7 Evaluación del efecto del sulforafano sobre la toxicidad inducida por
cisplatino ....................................................................................................... 23
6.8 Análisis estadístico ................................................................................. 23
7. RESULTADOS ............................................................................................. 24
7.1 Evaluación del efecto del sulforafano en la viabilidad celular ................. 24
7.2 Evaluación del efectode cisplatino en la viabilidad celular ..................... 24
7.3 Evaluación del efecto del sulforafano sobre la toxicidad inducida por
cisplatino ....................................................................................................... 27
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS .................................................................. 29
9. CONCLUSIÓN ............................................................................................. 31
10. PERSPECTIVAS ........................................................................................ 31
11. REFERENCIAS .......................................................................................... 32

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 6

ABREVIATURAS
ANOVA Análisis de varianza
CI50 Concentración inhibitoria al 50%
ERO Especies reactivas de oxígeno.
LLCPK1 Células epiteliales de túbulo proximal renal de cerdo.
O2•− Radical anión superóxido
OH• Radical hidroxilo
GSH Glutatión reducido
GSSG Glutatión oxidado
NADPH Nicotinamida-adenina dinucleótido fosfato
GPx Glutatión peroxidasa
GRS Glutatión reductasa
GST Glutatión S-transferasa
RO2• Radical peroxilo
RO• Radical alcoxilo
H2O2 Peróxido de hidrógeno
1O2 Oxígeno singulete
O3 Ozono
ONOO− Anión peroxinitrito
SOD Superoxido dismutasa
HO-1 Hemo oxigenasa 1
NQO1 NAD(P)H quinona oxidoreductasa
Nrf2 Siglas en inglés de “NF-E2-related factor-2”
Keap1

Siglas en inglés del sensor químico “Kelch-like ECH-
associated protein 1”
ARE Siglas en ingles de la secuencia de activación de

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 7
transcripción “Antioxidant response elements”
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
DMSO Dimetil sulfóxido
PBS Solución amortiguadora de fosfatos
SFB Suero fetal bovino
DMEM Medio de cultivo Dulbecco’s Modified Eagle
LDH Lactato deshidrogenasa
SDH Succinato deshidrogenasa
EEM Error estándar de la media

Mariel Calderón Oliver
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1. RESUMEN
El sulforafano es un isotiocianato que resulta de la hidrólisis del glucosinolato
llamado glucorafanina, el cual está presente en los vegetales de la familia
Cruciferae particularmente del género Brassica como el brócoli. Se ha
demostrado tanto en modelos in vivo como in vitro que el sulforafano es un
antioxidante indirecto, es decir, que activa la transcripción de genes de
respuesta al estrés oxidante, las cuales destoxifican especies reactivas de
oxígeno (ERO). Las ERO pueden ocasionar daños en el ADN, proteínas y,
lípidos de membrana.
El cisplatino es un fármaco que se usa en el tratamiento de diferentes tipos de
cáncer, pero su principal efecto secundario es la nefrotoxicidad, la cual está
asociada a la producción de ERO. Por lo tanto, si el sulforafano presenta
capacidad antioxidante, podría prevenir el daño celular y la producción de ERO
inducidas por cisplatino. Con base en lo anterior se consideró como objetivo
principal de este trabajo, estudiar el efecto del sulforafano sobre la toxicidad
inducida por cisplatino en células epiteliales de túbulo proximal de cerdo (LLC-
PK1). Para alcanzar dicho objetivo, se evaluó el efecto tóxico tanto del
cisplatino como del sulforafano en células LLC-PK1 determinando la viabilidad
celular mediante el método de reducción de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-
il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Posteriormente se evaluó el efecto del sulforafano
sobre la toxicidad inducida por cisplatino, para lo cual las células se
preincubaron con sulforafano a diferentes concentraciones seguido de la
exposición de las células a cisplatino, midiendo la reducción de MTT.
El cisplatino disminuyó la viabilidad celular de forma dependiente de la
concentración y del tiempo de exposición, siendo 40 μM durante 24 horas la
concentración en la que el cisplatino disminuye la viabilidad en un 50%. Por
otra parte, el sulforafano per se no altera la viabilidad celular cuando las células
se exponen a concentraciones menores a 10 μM y protegió contra la muerte
celular inducida por cisplatino de manera dependiente de la concentración. El
mayor efecto protector se observó cuando las células se preincubaron con
sulforafano a una concentración de 0.8 μM durante 24 horas.

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 9
2. INTRODUCCIÓN
2.1 Cisplatino (cis-diaminodicloroplatino II)
El cisplatino es un compuesto inorgánico de coordinación formado por un
átomo de platino rodeado por 2 átomos de cloro y 2 de amonio en posición cis
(Fig. 1) (Ali y Al Moundhri et al., 2006). El cisplatino se sintetizó en 1845 por
Michel Peryone en Turín, Italia y fue hasta 1892, en Zurich, Suiza, cuando
Alfred Werner determinó su configuración (Daugaard y Abildgaard, 1989). Este
compuesto forma parte de la familia de fármacos antineoplásicos debido a su
actividad citotóxica, la cual se reportó por primera vez en 1969 por Barnett
Rosenberg en la Universidad de Michigan (Rosenberg et al., 1969).
Pt
NH3NH3
ClCl

Figura 1. Estructura química del cisplatino.
Como antineoplásico es ampliamente utilizado para el tratamiento de tumores
sólidos de vejiga, testículo, ovario, pulmón, esófago, cuello y cabeza (Lebwohl
y Canetta, 1998). Sin embargo, la nefrotoxicidad es el efecto secundario más
importante y se presenta en aproximadamente 25-30% de los pacientes que
reciben el tratamiento (Daugaard y Abildgaard, 1989).
Los daños en el funcionamiento renal por cisplatino se manifiestan por
cambios en el volumen de orina, depuración de creatinina, incremento en la
lipoperoxidación y formación de especies reactivas de oxígeno (ERO), como el
radical anión superóxido (O2●−) y el radical hidroxilo (OH●). Las ERO producidas
por el cisplatino ocasionan daño celular, desnaturalización de proteínas y del
ADN (Kim et al., 1997; Mora et al., 2003). El cisplatino disminuye la
concentración de glutatión reducido (GSH) y de nicotinamida-adenina
dinucleótido fosfato (NADPH), así como la disminución en la actividad de
enzimas antioxidantes como glutatión peroxidasa (GPx) y glutatión reductasa
(GRS) (Kuhlmann et al., 1997; Santos et al., 2007); lo que sugiere que la

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 10
toxicidad inducida por cisplatino está asociada con el estrés oxidante (Chirino y
Pedraza-Chaverri, 2009).
El cisplatino induce daño en la mitocondria, detiene el ciclo celular en la fase
G2; inhibe la actividad de los complejos I, II, III y IV de la fosforilación oxidativa
provocando una disminución en la síntesis de ATP. Como consecuencia del
daño a túbulos proximales en riñón causado por la acumulación de cisplatino,
la reabsorción de electrolitos como el sodio disminuye y aumenta la excreción
de agua. Además, el cisplatino puede causar apoptosis, inflamación, necrosis y
muerte celular (Boulikas y Vougiouka, 2003; Jo et al., 2005; Taguchi et al.,
2005).
2.1.1 Mecanismo de acción
El cisplatino entra en la células por medio de transportadores de cationes
orgánicos hOCT2 (Kuo et al., 2007; Hall et al., 2007; Kelland, 2007). La
molécula de cisplatino pierde los cloruros y son reemplazados por moléculas de
agua generando una estructura con carga positiva capaz de reaccionar con el
nitrógeno de la posición 7 de la guanina en el ADN (Fig.2). También pueden
formarse enlaces cruzados entre el platino y guaninas adyacentes (Jamieson y
Lippard, 1999). El cisplatino puede reaccionar con proteínas formando enlaces
cruzados tanto intracatenarios como intercatenarios. Los aductos formados
entre el cisplatino y la guanina inhiben la replicación y la transcripción del ADN
(Kelland, 2007).
Figura 2. Formación de aductos del cisplatino con el ADN (Kelland, 2007).

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2009 Página 11
La nefrotoxicidad es un evento secundario a la acumulación de cisplatino en los
riñones, específicamente en los segmentos S3 de los túbulos proximales
(Daugaard y Abidgaard, 1989). El mecanismo por el cual el cisplatino produce
nefrotoxicidad está asociado al estrés oxidante y nitrante (Xiao et al., 2003; Ali
y Al Moundhri, 2006; Chirino et al., 2004; Chirino y Pedraza-Chaverri, 2009).
2.2 Estrés oxidante
El estrés oxidante se puede definir como un desequilibrio entre las defensas
antioxidantes y la producción de ERO (Betteridge, 2000) las cuales se forman
a partir de la adición sucesiva de electrones a la molécula de oxígeno
produciendo especies parcialmente reducidas de este compuesto (Cárdenas-
Rodríguez y Pedraza-Chaverri, 2006)(Fig. 3).
O2
e-
O2
.- H2O2 OH
. H2O
Dioxígeno Anión
superóxido
Peróxido
de
hidrógeno
Radical
hidroxilo
Agua
e- e- e-
2H+
+
OH-
2H+

Figura 3. Formación de ERO
Lo anterior se debe a un aumento en la producción de ERO o bien, una
disminución en los sistemas antioxidantes o de reparación, o una combinación
de estos factores (Cárdenas-Rodríguez y Pedraza-Chaverri, 2006). La
expresión “especies reactivas de oxígeno” es un término colectivo que
involucra no sólo los radicales libres derivados del oxígeno (O2•−, OH•, peroxilo
RO2•, alcoxilo RO•), sino también a los no radicales derivados de la reducción
molecular del oxígeno y que además son muy reactivos como el peróxido de
hidrógeno (H2O2), oxígeno singulete (1O2), ozono (O3) y anión peroxinitrito
(ONOO−). En la tabla 1, se explica la formación de algunas ERO producidas
por cisplatino y sus características.
El estrés oxidante provoca la fragmentación del ADN, daño oxidante en bases
nitrogenadas del ADN; lipoperoxidación generando moléculas citotóxicas como
malondialdehído. Además altera la fluidez en la membrana celular y pérdida en

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 12
la capacidad catalítica de proteínas por rompimiento de los enlaces peptídicos
y por oxidación de residuos de proteínas.
TABLA 1. Características de algunas ERO producidas por cisplatino.

Por otro lado un antioxidante es una sustancia que retarda, previene o remueve
el daño oxidante a una molécula blanco, éstos pueden ser proteínas que
abaten la disponibilidad de agentes prooxidantes por ejemplo la ferritina y
transferrina; enzimas antioxidantes como SOD, catalasa y GPx; proteínas que
protegen biomoléculas y agentes de bajo peso molecular que atrapan ERO
como glutatión, α-tocoferol, bilirrubina y vitamina C (Tabla 2).

Especie
reactiva de
oxígeno
Formación Características
Anión
superoxido
(O2•−)
Reducción univalente del oxígeno
(cuando el oxígeno acepta un
electrón). Las enzimas que
catalizan esta reacción son
NADPH oxidasa y xantina
oxidasa.
Es inestable. Participa en
la descarga respiratoria
de las células fagocíticas
activadas por contacto
con partículas extrañas
en la respuesta
inmunológica y tiene la
capacidad de reaccionar
con lípidos (Halliwell y
Gutteridge, 1999).
Peróxido de
hidrógeno
(H2O2)
Se forma por la enzima
superóxido dismutasa (SOD) al
catalizar la reacción de reducción
de O2•−.
Es un oxidante
importante en las células
de los organismos
aerobios y es lipofílico
(Eberhardt, 2001).
Radical
hidroxilo
(OH•)
Reducción univalente del oxígeno.
Reacción de Haber-Weiss entre
O2•− y H2O2. Reacción de Fenton
donde interviene el hierro.
Especie oxidante muy
dañina. Alta reactividad y
vida media corta. Tiene
la capacidad de
reaccionar con ADN,
proteínas y lípidos
(Halliwell y Gutteridge,
1999).

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 13
TABLA 2. Algunos agentes antioxidantes (Halliwell y Gutteridge, 1999).
Agente antioxidante Reacción que realiza
Superóxido dismutasa (SOD) Conversión de O2•− a H2O2.
Glutatión peroxidasa (GPx) Reducción de peróxidos empleando
dos moléculas GSH, obteniendo agua
y glutatión oxidado (GSSG)
Glutatión reductasa (GRS) Reducción de GSSG a GSH
Glutatión S-transferasa (GST) La conjugación de GSH con una gran
cantidad de compuestos orgánicos.
Reducción de hidroperóxidos de
lípidos.
Hemo oxigenasa (HO-1) Degradación del grupo hemo
proveniente de las hemoproteínas
produciendo biliverdina (antioxidante),
monóxido de carbono y hierro.
Vitamina C Acepta electrones y reacciona con el
O2•− y el OH•.
Vitamina A Reacciona con el 1O2 y el OH•.
Vitamina E Interrumpe la lipoperoxidación en la
fase de propagación.

2.3 Evidencias de la participación del estrés oxidante en la
nefrotoxicidad inducida por cisplatino
El cisplatino forma ERO por diferentes mecanismos, uno de ellos es la
disminución en la actividad de enzimas antioxidantes como GPx, GST y SOD
(Chirino y Pedraza-Chaverri, 2009) lo que contribuye al aumento del estrés
oxidante. Otro mecanismo de formación de ERO por el cisplatino es el
reportado por Baliga y colaboradores (1998) donde demostraron que al
exponer células LLC-PK1 con cisplatino (670 μM) se observaba un aumento de
la concentración hierro en el medio, el cual cataliza la reacción de Fenton para
la formación de OH•, sin embargo, cuando utilizaron sustancias atrapadoras de

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 14
OH• como dimetil sulfóxido, manitol y ácido benzoico, se disminuyó la
concentración de éste radical y por lo tanto la toxicidad en las células.
Asimismo se ha demostrado que el cisplatino genera O2•− y que éste efecto se
puede inhibir utilizando algunos antioxidantes como vitamina C o aumentando
la actividad de SOD (Masuda et al., 1994).
En otros estudios realizados in vivo se ha determinado que el cisplatino
administrado a ratas macho adultas de la cepa Sprague-Dawley en dosis 7
mg/kg vía intraperitoneal, induce daño renal, que se manifestó por un
incremento en la concentración creatinina y de nitrógeno de urea en sangre
(Atessahin et al., 2005). Además este mismo grupo de investigación reportaron
un aumento en la concentración de malondialdehído (un marcador de
lipoperoxidación) y una disminución en la concentración de las enzimas
antioxidantes como GPx y catalasa, las cuales se determinaron por medio de
reacciones acopladas a la desaparición de NADPH y por la descomposición de
H2O2, respectivamente. El efecto nefrotóxico del cisplatino se aminoró en ratas
tratadas previamente con el antioxidante natural licopeno (4 mg/kg) (Atessahin
et al., 2005). En este estudio se observó histológicamente que el cisplatino
ocasionó necrosis en el túbulo proximal de las células (Atessahin et al., 2005).
Este mismo efecto se describió por Matsushima y colaboradores (1998) donde
se administró cisplatino 5 mg/kg vía intravenosa en ratas macho Sprague-
Dawley, en las que se observó daño tubular renal mismo que disminuyó
cuando se les trató con dimetiltiourea, un atrapador de OH• (500 mg/kg
intraperitoneal, 1 hora antes del cisplatino y 125 mg/kg cada 2 horas despuésdel cisplatino) o con SOD lecitinizada (3,000 U/kg por día, vía intravenosa)
concluyendo que las ERO juegan un papel importante en el daño renal inducido
por cisplatino.
Otro ejemplo en la disminución de la nefrotoxicidad de cisplatino mediante el
uso de enzimas, es utilizando catalasa (100 U/mL), la cual se aplicó dos veces
por 15 minutos en células terminales del túbulo proximal (S3), la cual disminuyó
la producción de H2O2 (Tsutsumishita et al., 1998).
Se ha reportado en muchos experimentos in vitro que algunos antioxidantes y
compuestos atrapadores de ERO previenen la toxicidad inducida por cisplatino

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 15
demostrando que ERO como O2•−, H2O2 y OH• están involucrados en su
toxicidad y en las alteraciones celulares.
También se han informado otros casos en los que algunos antioxidantes
naturales como jugo de tomate con jugo de uvas, xanthorrhizol, flavonoides,
goma arábica, capsaicina, vitaminas C, vitamina E y licopeno (Cetin et al.,
2006; Kim et al., 2005, Totta et al., 2004, Al-Majed et al., 2003, Shimeda et al.,
2005, Kadikoylu et al., 2004, Naziroglu et al., 2004, Greggi et al., 2000,
Atessahin et al., 2005) han reducido o inhibido la nefrotoxicidad del cisplatino,
ya que éstos disminuyen la lipoperoxidación y la producción de ERO.
2.4 Sulforafano
El sulforafano es un isotiocianato que resulta de la hidrólisis enzimática del
glucosinolato llamado glucorafanina, la cual está presente en los vegetales de
la familia Cruciferae especialmente los pertenecientes al género Brassica como
el brócoli. Los glucosinolatos se encuentran a lo largo de toda la planta
incluyendo raíz, tallo, hojas y semillas. La reacción de hidrólisis es catalizada
por la enzima endógena mirosinasa también llamada β-D-tioglucosidasa, la
cual se activa por la ruptura de la planta durante la postcosecha,
procesamiento y/o masticación. Esta reacción puede dar varios productos
dependiendo del pH (Fig. 4), sin embargo a pH neutro el isotiocianato es el
producto mayoritario (Fahey et al., 1999, Shapiro et al., 2001). Es importante
destacar que en roedores y humanos, en la ausencia de mirosinasa, la
glucorafanina se convierte a sulforafano por acción de la flora intestinal
(Shapiro et al., 1998).
El sulforafano se encuentra en brócoli fresco en concentraciones de 11.20-43.1
mg/100g (Galgano et al., 2007, Matusheski et al., 2001, Howard et al., 1997),
pero su concentración antes de consumirse varía dependiendo del tiempo y
método de cocción ya que un aumento en la cocción (9-15 min) trae como
consecuencia la pérdida del 18-59% de glucosinolatos (McNaughton y Marks,
2003) ocasionando la disminución en el contenido de sulforafano.

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 16
N
OSO3-
S
CH3
O
S
O
OH
OH
OH
OH
O
OHOH
OH
OH
OH
+
Glucorafanina
(glucosinolato) D-glucosa
N
S
CH3
O
C
S
+ HSO4-
Sulforafano
(isotiocianato)
Mirosinasa
H2O, pH 7

Figura 4. Reacción de hidrólisis de la glucorafanina. Formación del sulforafano.

2.5 Funciones antioxidantes del sulforafano
El sulforafano es un antioxidante indirecto, ya que el grupo isotiocianato no
participa en reacciones de óxido-reducción en condiciones fisiológicas (Barton
y Ollins, 1979). Se ha demostrado que la administración de sulforafano
aumenta la capacidad antioxidante para disminuir el estrés oxidante en cultivos
celulares (Fahey y Talalay, 1999). El sulforafano es un potente inductor de
enzimas antioxidantes al incrementar la concentración GSH (Zhang y Talalay,
1994) y por estimular elementos de respuesta antioxidante (ARE por sus siglas
en inglés) así como enzimas de respuesta al estrés oxidante como glutatión
transferasas, NAD(P)H: oxido quinona reductasa (NQO1) y HO-1; las cuales
destoxifican carcinógenos potenciales como ERO (Yoon et al., 2008, Dinkova-
Kostova y Talalay, 2008).
2.5.1 Mecanismo de acción del sulforafano como antioxidante
(inductor de enzimas citoprotectoras)
El efecto citoprotector del sulforafano se debe a que disocia el complejo Keap1-
Nrf2 (Kelch-like ECH-associated protein 1 y NF-E2-related factor-2). Al
disociarse este complejo, Nrf2 se trasloca al núcleo (Zhang, 2006) y se une al
promotor ARE (antioxidant response elements) induciendo así la transcripción
de genes citoprotectores (Fig. 5) (Motohashi y Yamamoto., 2004, Kobayashi y
Yamamoto., 2006).

Mariel Calderón Oliver
2009 Página 17

Figura 5. Mecanismo de inducción de genes citoprotectores debido al sulforafano (Dinkova-
Kostova y Talalay, 2008).

El mecanismo de inducción de genes citoprotectores por el sulforafano
anteriormente descrito se ha reportado en estudios tanto in vivo como in vitro.
Yoon y colaboradores (2008) encontraron que el pretratamiento con sulforafano
(20 μM por 12 horas) de las células HK2 (células epiteliales del túbulo renal)
protegió a esta línea celular del daño por hipoxia-reoxigenación. Esta
protección se asoció con la inducción de enzimas antioxidantes como NQO1,
GRS, GPx y HO-1, debido al incremento de la translocación nuclear de Nrf2 y
una disminución de los niveles de Keap1 en citoplasma. En este mismo trabajo
se encontró que la administración de sulforafano (500 μg/kg vía intravenosa)
fue capaz de proteger del daño renal a ratas sometidas a isquemia reperfusión,
el cual produce un aumento de ERO. Lo obtenido sugiere que el sulforafano se
puede usar como coadyuvante para prevenir el daño renal producido durante la
isquemia-reperfusión (el cual se da durante el trasplante de riñón).
2.5.2 Evidencia del sulforafano como antioxidante
El sulforafano es un potente inductor in vitro de la enzima NQO1, GST, UDP-
glucuroniltransferasa, y HO-1 en varias líneas celulares como HepG2
(hematoma de hígado humano), Hepa1c1c7 (hematoma de hígado de ratón)
(Juge et al., 2007) ya que cuando las células Hepa1c1c7 se exponen a
concentraciones crecientes de sulforafano por 24 horas, se observa un
incremento de tres veces en la actividad de NQO1 con respecto al control
(Matusheski y Jeffery. 2001), dicho efecto se observa también en células de

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próstata humana (McMahon et al., 2003), y en células de vejiga (Zhang et al.,
2006). Se ha informado que el efecto del sulforafano en la actividad de enzimas
como GST, NQO1 y GRS varía dependiendo del tiempo, la concentración y la
línea celular empleada (Jiang et al., 2003). También se ha demostrado que la
inducción de enzimas antioxidantes debidas al sulforafano se da en altas y en
bajas concentraciones, ya que ratas a las que se les administró dosis elevadas
de sulforafano (más de 1000 μmol/kg/día por 4-5 días) presentaron un aumento
en la actividad de enzimas antioxidantes en tejidos como hígado, pulmón,
glándula mamaria, páncreas, estómago, intestino delgado y colon (Gerhauser
et al., 1997; Zhang et al., 1992., Matusheski y Jeffery. 2001, Posner et al.,
1994; Keck et al., 2002); aunque también dosis más bajas (40 μmol/kg/día)
aumentaron significativamente la actividad de NQO1, GST total en próstata y
vejiga en ratas (Jones y Brooks, 2006; Zhang et al., 2006). Lo que significa que
el sulforafano al inducir la transcripción de enzimas antioxidantes disminuye el
estrés oxidante en las células.
También se ha demostrado que el sulforafano induce la expresión y la actividad
enzimática de GPx en células epitelialesde adenocarcinoma colorectal
humanas Caco-2 (Banning et al., 2005). En estudios en humanos se ha
encontrado que el alto consumo de vegetales del género Brassica aumenta la
actividad enzimática de GST en plasma sanguíneo y por lo tanto disminuye el
riesgo de padecer cáncer de hígado y de intestino (Bougaards et al., 1994;
Petri et al., 2003).

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3. JUSTIFICACION
Se ha demostrado que el sulforafano es un antioxidante indirecto pues al
inducir la transcripción de genes de repuesta antioxidante es capaz de
disminuir el estrés oxidante y el daño celular en varios modelos de estudio. Por
otro lado, la generación de ERO forma parte del mecanismo por medio del cual
el cisplatino ejerce sus efectos nefrotóxicos, por lo que la disminución en la
formación de ERO podría prevenir, al menos en parte, el daño celular. Por lo
anterior se espera que un tratamiento con sulforafano prevenga la toxicidad
inducida por cisplatino.
4. HIPÓTESIS
El sulforafano prevendrá la disminución de la viabilidad celular causada por la
exposición de células renales de túbulo proximal a cisplatino.
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar el efecto protector del sulforafano en la toxicidad inducida por
cisplatino en células epiteliales de túbulo proximal de cerdo (LLC-PK1).
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Realizar una curva concentración-respuesta para evaluar la toxicidad del
sulforafano en células LLC-PK1. Determinar las concentraciones de
sulforafano a las cuales no se observe citotoxicidad en las células LLC-PK1.
Realizar una curva concentración-respuesta para encontrar la concentración
a la cual el cisplatino produce el 50% de muerte celular (CI50).
Determinar el tiempo y la concentración de preincubación del sulforafano en
las células LLC-PK1 para estudiar si el sulforafano tiene efecto citoprotector
sobre la toxicidad inducida por cisplatino.

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6. MATERIALES Y METODOLOGÍA
6.1 Diagrama de trabajo

Cultivo de células LLCPK-1
Evaluación de la toxicidad del
sulforafano. Curva concentración-
respuesta.
Evaluación de la toxicidad del
cisplatino. Curva concentración-
respuesta. Determinación de IC50.
Viabilidad
(Reducción de
MTT)
Evaluación del efecto del sulforafano
sobre la toxicidad inducida por cisplatino
mediante reducción de MTT
Interpretación de resultados y conclusión sobre el
efecto del sulforafano sobre la toxicidad de cisplatino

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6.2 Reactivos
El cisplatino (cis-diaminodicloroplatino II Pt(NH3)2Cl2) cat. no. P4394-1G lote
087K1349, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio, y el dimetil sulfóxido
(DMSO) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
El sulforafano cat. no. S8044, lote 26815401 se adquirió de LKT laboratorios
(St. Paul, MN).
Las células epiteliales de túbulo proximal renal de cerdo (LLC-PK1) se
adquirieron de American Type Culture Collection (ATCC) CAT. CRL-6509.
El medio Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM), la tripsina TrypLE Express, el
suero fetal bovino (SFB), el antibiótico/antimicótico (10,000 U/mL de penicilina
G y 10,000 μG/mL de sulfato de estreptomicina en 0.85% de sol. salina) se
adquirieron de GIBCO (México D.F.).
El fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4), el fosfato de sodio monobásico
(NaH2PO4), el cloruro de sodio (NaCl) empleados en la solución buffer; así
como el ácido clorhídrico y 2-isopropanol empleados para la técnica de MTT,
se adquirieron de JT Baker (Xanostoc, Edo. de Mex.).
6.3 Cultivo de células
Las células LLC-PK1 se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de SFB y
1% de antibiótico/antimicótico y se mantuvieron a 37°C en una atmósfera de O2
con 5% de CO2 en una incubadora RMI30005-9-ABA (Revco Termo Electron
Corporation). Las células LLC-PK1 se subcultivaron tres veces por semana
para lo cual se removió el medio y se les adicionó 2.5 mL de tripsina (Tryple
Express) después se centrifugaron a 200xg por 3 minutos (centrífuga Megafuge
1.0-Heraus). Se eliminó el sobrenadante y se adicionó 1mL de DMEM con SFB
al 10% para resuspender las células (Kawai et al., 2006).
Para el crecimiento de células se adicionaron 4 mL de DMEM con SFB al 10%
y se cultivaron en cajas de 75 cm2. Cuando se sembraron células para
experimento, se contaron las células en una Cámara de Neubauer y
posteriormente se sembraron las células en placas de cultivo a una densidad
de 40,000 células/cm2 por pozo. A las 24 horas cuando las células alcanzaron
confluencia se eliminó el medio y se inició en tratamiento experimental.

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2009 Página 22
6.4 Determinación de la viabilidad celular
6.4.1 Método de MTT
Este método es una modificación del procedimiento descrito por Mosmann
(1983). El método se basa en la reducción de una sal de tetrazolio, bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), por enzimas
deshidrogenasas mitocondriales principalmente succinato deshidrogenasa
(SDH) y lactato deshidrogenasa (LDH) (Berriged y Tan, 1993) obteniendo
formazán (la forma reducida del MTT) que se identifica por ser un precipitado
color púrpura. (Fig. 6).
N
N
H
N
+
N
N
S
CH3
CH3
Br-
LDH
o SDH
N
N
N
NH
N
S
CH3
CH3
FormazánMTT

Figura 6. Reducción de MTT a formazán por medio de enzimas deshidrogenasas como lactato
deshidrogenasa y succinato deshidrogenasa.
Después del tratamiento, a las células se les adicionó MTT en una
concentración de 0.125 mg/mL disuelto en DMEM. Las células se incubaron
durante una hora a 37°C. Pasado ese tiempo, se retiró el medio de cultivo y el
formazán se disolvió con isopropanol ácido. La absorbancia se determinó a 570
nm. Los datos se expresaron como el porcentaje de la reducción del MTT
haciendo referencia a las células sin tratar o control.
6.5 Evaluación del efecto del sulforafano en la viabilidad celular
Se realizó un estudio de toxicidad usando diferentes concentraciones de
sulforafano (5-100 μM). Se preparó una solución stock de sulforafano 0.1 M en
DMSO y a partir de ésta se realizaron diluciones en medio DMEM. La viabilidad
celular se determinó 24 horas después del tratamiento con sulforafano (Shinkai
et al., 2006). Adicionalmente se determinó que la concentración de DMSO
usada (menor a 0.01%) no afecta la viabilidad celular.

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2009 Página 23
6.6 Evaluación del efecto de cisplatino en la viabilidad celular
Se realizó un estudio de concentración-respuesta para lo cual se emplearon
concentraciones de cisplatino de 0-50 μM. El cisplatino se preparó en PBS a
una concentración stock de 0.01M. La viabilidad celular se determinó a las 24
horas después de la exposición a cisplatino (Shino et al., 2006).
Para observar el efecto del tiempo sobre la toxicidad inducida por cisplatino en
las células LLC-PK1, se realizó el tratamiento anteriormente descrito, variando
los tiempos de incubación (1, 3, 6 y 24 horas).
6.7 Evaluación del efecto del sulforafano sobre la toxicidad
inducida por cisplatino
Las células se preincubaron con diferentes concentraciones de sulforafano (0-
1 μM durante 24 horas) y después se trataron con 40 μM de cisplatino durante
24 horas. Transcurrido el tiempo se determinóla viabilidad celular.
6.8 Análisis estadístico
Los datos se expresaron como el promedio ± error estándar de la media (EEM)
y se compararon mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una sola vía,
seguido de una prueba de comparaciones múltiples Dunnet. Para ello se
empleó el software estadístico PRISM3 (Graphphad Sofware, Inc. California).
Las diferencias p<0.05 y p< 0.001 se consideraron estadísticamente
significativas.

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7. RESULTADOS
7.1 Evaluación del efecto del sulforafano en la viabilidad celular
La evaluación del efecto del sulforafano sobre la viabilidad de las LLC-PK1 se
realizó como una prueba de toxicidad. El sulforafano no afecta la viabilidad de
las células LLC-PK1 hasta una concentración de 10µM cuando se les incuba
durante 24 horas. Sin embargo, concentraciones superiores a 10 µM de
sulforafano se observa que disminuye la viabilidad celular significativamente
(p<0.001). (Fig. 7).

Figura 7. Evaluación del efecto del sulforafano en la viabilidad celular. Las células se incubaron
con sulforafano durante 24 horas. Cada valor representa promedio ± EEM, n=3-6. *p<0.001 vs
control.
Con lo anterior se observa que el sulforafano es tóxico para las células LLC-
PK1en concentraciones mayores a 20 µM cuando se incuban durante 24 horas
con sulforafano. Debido a lo anterior, en experimentos posteriores se
emplearon concentraciones por debajo de 20 μM, de ésta manera se asegura
que el antioxidante no induzca daño celular.
7.2 Evaluación del efecto de cisplatino en la viabilidad celular
Se realizó una curva de concentración-respuesta del cisplatino sobre la
viabilidad de las células LLC-PK1. Tomando en cuenta estudios publicados
previamente, que indican que la incubación de cisplatino en células LLC-PK1

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durante 24 horas en concentraciones de 30-50 μM disminuye la viabilidad
celular (Shino et al., 2003; Kim et al., 2006), por lo que se evaluaron
concentraciones de cisplatino de 0-50 μM a diferentes tiempos de incubación.
Se observa que la muerte celular por cisplatino es dependiente del tiempo y de
la concentración de cisplatino (Fig. 8 y 9).

Figura 8. Evaluación del efecto del cisplatino en la viabilidad celular. Las células se incubaron
con cisplatino durante 24 horas. Cada valor representa promedio ± EEM, n=4-7. *p<0.001 vs
control.

Figura 9. Efecto de diferentes concentraciones de cisplatino a diferentes tiempos de
incubación. Cada valor representa promedio ± EEM, n=6.

De acuerdo a lo observado en las figuras 8 y 9, para experimentos posteriores
se empleó la concentración de 40 μM de cisplatino durante 24 horas de

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incubación, ya que ésta fue la concentración y el tiempo a la que se observa
50% de muerte celular.
De las evaluaciones anteriores se tomaron micrografías representativas en
campo claro, las cuales se muestran a continuación (Fig. 10).

Figura 10. Efecto del cisplatino y del sulforafano a diferentes tiempos y concentraciones.
Células no adheridas ( ).

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7.3 Evaluación del efecto del sulforafano sobre la toxicidad
inducida por cisplatino
Las células se preincubaron con concentraciones de 0-1 μM de sulforafano
durante 24 horas y posteriormente se expusieron a 24 horas con cisplatino 40
μM; transcurrido ese tiempo se determino viabilidad por MTT.
Se observa que el sulforafano previene del daño inducido por cisplatino de
manera dependiente de la concentración, siendo significativa con p<0.001 y p<
0.01 con respecto al tratamiento con cisplatino. En la tabla 3 se encuentran los
porcentajes de protección del sulforafano determinados mediante la técnica de
viabilidad por MTT.

Figura 11. Evaluación del efecto del sulforafano sobre la toxicidad inducida por cisplatino. Las
células se preincubaron con diferentes concentraciones de sulforafano durante 24 horas.
Posteriormente se les incubo con 40 μM de cisplatino durante 24 horas. Cada valor representa
promedio ± EEM, n=4-7. *p<0.001 vs Control, ** p<0.01 y # p<0.001 vs cisplatino.

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Tabla 3. Porcentaje de protección del sulforafano (preincubación).
Concentración de sulforafano (μM) % de protección
0.1 28.24 ± 3.4
0.3 49.09 ± 1.6
0.5 61.01± 2.4
0.8 81.13 ± 4.8
1 74.27 ± 4.6

El efecto de protección del sulforafano también se evaluó microscópicamente
(Fig. 12).

Figura 12. Efecto del sulforafano sobre la toxicidad de cisplatino. Las células se preincubaron
durante 24 horas con diferentes concentraciones de sulforafano, después se incubaron con
cisplatino 40µM durante 24 horas. Células no adheridas ( ).

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8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El cisplatino es un agente antineoplásico ampliamente usado debido a su
efectividad contra una gran variedad de tumores sólidos. Sin embargo, la
nefrotoxicidad es el principal efecto secundario, lo que ha limitado su uso
(Davis et al., 2001). El mecanismo por el cual el cisplatino induce nefrotoxicidad
no está completamente descrito, pero existen evidencias que sustentan la
participación de ERO en el daño. Actualmente se sabe que el cisplatino es
nefrotóxico debido a que se acumula en el riñón al entrar a la células del túbulo
proximal a través de transportadores de cationes orgánicos conocidos como
hOCT2 (Ciarimboli et al., 2005). La formación de ERO por el cisplatino es, en
parte, debida a la disminución en la actividad de enzimas antioxidantes como
SOD, GPx y GR, las cuales catalizan reacciones de disminución en la
reactividad de las ERO. El cisplatino disminuye la actividad de los complejos I-
IV en la mitocondria lo que provoca una disfunción en éste organelo y por lo
tanto la producción de ERO como H2O2, OH•, O2-. La formación de ERO en las
células se observa en las primeras etapas del daño celular, provocando
modificaciones en aminoácidos, proteínas, lípidos y muerte celular.
Weiner yJacobs (1983) reportaron que el segmento S3 del túbulo proximal
renal que se encuentra en la corteza renal, es donde se produce el mayor daño
inducido por cisplatino. Por lo tanto en este estudio se utilizaron las células
LLC-PK1 para evaluar la toxicidad de cisplatino, ya que tienen características
de túbulo proximal renal.
En este estudio se realizó una evaluación de concentración respuesta del
cisplatino en las células LLC-PK1 encontrando que el cisplatino produce una
disminución en la viabilidad celular, la cual es dependiente de la concentración
y del tiempo de exposición (Fig. 8 y 9). Esto se ha demostrado anteriormente
por varios investigadores como Shino y colaboradores (2003) y por Kim y
colaboradores (2006) en la misma línea celular donde a diferentes
concentraciones y tiempo de exposición con cisplatino la viabilidad celular
disminuye, demostrando también que esta disminución está asociada a la
producción de ERO como OH•.

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Se han propuesto diferentes estrategias para disminuir la toxicidad del
cisplatino, como el consumo de vitaminas (Naziroglu et al., 2004) y de
alimentos que contengan antioxidantes como el resveratrol presente en la uva
(Cetin et al., 2006). Por lo tanto, es muy atractiva la idea de desarrollar nuevas
estrategias que disminuyan el estrés oxidante ocasionado por cisplatino u otros
compuestos, mediante el consumo de alimentos de la dieta. Estudios
epidemiológicos han demostrado que los vegetales del género Brassica como
el brócoli tienen un papel protector contra muchos tipos de cáncer (Van Poppel
et al., 1999), ya que contienen glucosinolatos que al ser hidrolizados originan
productos que inducen la activación de los elementos de respuesta
antioxidante (Van Poppel et al., 1999) como la inducción en la transcripción de
genes que codifican para enzimas que disminuyen ERO, y por lo tanto podrían
disminuir la toxicidad del cisplatino. Tal es el caso del sulforafano, un
isotiacianato que resulta de la hidrólisis enzimática de la glucorafanina (Fahey
et al., 1999). La glucorafanina está presente principalmente en el brócoli
(Kushad et al., 1999). Se ha demostrado que el sulforafano además de inducir
la transcripción de enzimas antioxidantes presenta otros mecanismos de acción
como la inhibición del citocromo P450, activación de vías apoptoticas, inhibición
de vías inflamatorias y la supresión del ciclo celular (Higdon et al., 2007,
Fimognari and Hrelia, 2007, Juge et al., 2007), sin embargo, a altas
concentraciones ocasiona muerte celular, efecto que se observó cuando las
células LLC-PK1 se incubaron con sulforafano a concentraciones mayores a 20
µM (Fig. 7). En este trabajo se demostró que el sulforafano disminuye la
toxicidad inducida por cisplatino de manera significativa (p< 0.05), ya que se
encontró una protección del 81.13% cuando las células se preincubaron con
0.8 µM de sulforafano (tabla 3). Se sabe que el sulforafano es un inductor de la
vía Nrf2, la cual activa la transcripción de genes de respuesta antioxidante que
se traducen en enzimas como HO-1, GPX, NQO-1 y GR (Yoon et al., 2008), las
cuales catalizan reacciones de descomposición y eliminación de ERO.
Probablemente éste sea parte del mecanismo por el cual el sulforafano
previene la disminución en la viabilidad celular de las células LLC-PK1 cuando
son expuestas a cisplatino.

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9. CONCLUSIÓN
El sulforafano protege de manera dependiente de la concentración a las
células LLC-PK1 del daño inducido por cisplatino.
10. PERSPECTIVAS
Investigar el mecanismo por el cual el sulforafano protege a las células
LLC-PK1 de la toxicidadinducida por cisplatino midiendo la expresión de
enzimas de respuesta a estrés oxidante.
Estudiar si este efecto de protección del sulforafano sobre la toxicidad
por cisplatino es por la disminución de especies reactivas de oxígeno.

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2009 Página 32
11. REFERENCIAS
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italica) sprouts. J. Agric. Food Chem. 54(25): 9370-9376.

Portada
Indice
1. Resumen
2. Introducción
3. Justificación
6. Materiales y Métodos
7. Resultados
8. Discusión de Resultados
9. Conclusión
11. Referencias