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1 UNIIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN EFECTO EN LA INHIBICIÓN DE LA PROLIFERACIÓN, DE LOS COMPUESTOS DERIVADOS DEL FENOL LQM 319 Y LQM 402, SINTETIZADOS EN LA FES- CUATITLÁN, SOBRE LÍNEAS CELULARES TRANSFORMADAS. T E S I S QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: QUÍMICO FARMACEÚTICO BIÓLOGO P R E S E N T A: MIGUEL ANGEL QUILLO DUARTE A S E S O R: M.C. OSCAR ZUÑIGA LEMUS CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO DE MÉX. 2011. UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 3 Agradecimientos. Lo que se construye sin Dios, fracasará (salmo (126)). Postrado a vuestros pies humildemente Vengo a pediros, Dulce Jesús mío, Poderoso repetir constantemente; Sagrado Corazón de Jesús, en vos confío. Sí la confianza es prueba de ternura, Ésta prueba de Amor daros ansío, Aún cuando esté sumergido en la amargura: Sagrado Corazón de Jesús, en vos confío. En las horas más tristes de mi vida, Cuando todos me dejen ¡oh Dios mío! Y el alma este por penas combatida: Sagrado Corazón de Jesús, en vos confío. Aunque sienta venir la desconfianza Y que vos me mirares con desvío. No será confundida mi esperanza Sagrado Corazón de Jesús, en vos confío. Sí he contraído con vos Divina Alianza Y os he dado mi amor y albedrío 4 ¿Cómo ha de ser frustrada mi esperanza?: Sagrado Corazón de Jesús en vos confío. Siento una confianza de tal suerte, Que sin temor ¡oh Dios mío! Espero repetir hasta mi muerte: Sagrado Corazón de Jesús en vos confío. “EN TODO MOMENTO Y TODA OCASIÒN DAR GRACIAS A DIOS”. A mis padres: Irene Duarte y Ramón Quillo por su apoyo y sus consejos constantes de cada día, no hay mejor herencia que me dejan que ser profesionista. A mis hermanos: Ma. Guadalupe, José Pablo, Juan Gabriel por trazarme el camino que debo seguir, en especial a Maricarmen que soy yo quien le debe marcar su camino y por ser mi tesoro junto con mi mamá en mi corazón. A los Doctores: Roberto, Paty y Sandra por hacerme sentir como en casa durante mi estancia en el laboratorio 9 de la unidad multidisciplinaria de Campo 4. A mi Asesor Oscar y su esposa Verónica por su tutoría y la realización de este escrito. A los profesores que creyeron en mí durante mi formación académica y me brindaron su amistad: Ivett, Eva María, Francisco López, Elizabeth, Alma, Frigida y Marío Arturo. A mis Amigos: Juan Manuel, Juan Salas, Hermes, Francisco, Marlen, Yadira, Luis Miguel, Ulises, Juliana, Flor, Antonio que compartimos varios momentos en la facultad y a todos los de la generación 29 que su paso por la Fes NUNCA SE OLVIDARÁ. I INDICE GENERAL. Página Índice de Tablas IV Índice de Figuras V INTRODUCCION. I. Definición del cáncer 1 I.2. Clasificación del cáncer 2 I.3. Factores de riesgo 3 I .4. Cáncer en México 5 II. EL ESTRÉS OXIDATIVO 8 II.1. Estrés Oxidante 9 II.2. Radicales libres 10 II.3. Efecto nocivo de los Radicales Libres 12 II.4. Mecanismo de Defensa Antioxidante 13 III. CICLO CELULAR Y CANCER 15 III.1. Ciclo celular 15 III.2. Regulación del ciclo celular 17 III.3. Apoptosis 22 III.4. Efectos del cáncer en el ciclo celular 23 III.5 .Control del Ciclo Celular y Terapia Contra el Cáncer 25 IV. Tratamientos 27 IV.1. Cirugía 27 II IV.2. Radioterapia 28 IV.2.1. Tipos de Radioterapia 28 IV.3. Quimioterapia 31 IV.4. Terapia hormonal y biológica 35 V. Compuestos morfolÍnicos derivados del fenol 37 V.1. Síntesis del compuesto 38 V.2. Solubilidad del compuesto 37 V.3. Estudios realizados a los compuestos tiomorfolÍnicos 37 VI. Estudios Preclínicos de Nuevos Fármacos 39 VI.1. Estudios Preclínicos 39 VI.2. Estudios Clínicos 42 VII. NANOPARTÍCULAS 43 VII.1. DEFINICIÓN 43 VII.2. Clasificacion de NanopartÍculas 46 VII.3. Propiedades de las NanopartÍculas 47 VII.4. Diseño de Nanopartículas 48 VIII. Objetivos 49 IX. Hipótesis 49 X. Justificación 50 XI. Metodologia 51 XI.1. Cultivos celulares 51 III XI.2. Preparación de Nanopartículas 51 XI.3. Exposición al compuesto 51 XI.4. Viabilidad celular 52 XI.5. Análisis estadístico 52 XII. Resultados 52 XIII. Análisis De Resultados 60 XIV. Conclusiones 62 XV. Perspectivas 63 XVI. BIBLIOGRAFÍA 65 XVII. CIBERGRAFÍA 68 IV ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1. Distribución porcentual de muertes por causa de Tumores malignos en función de las edades 7 Tabla 2. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acción 13 Tabla 3. Clasificación de los antioxidantes, según su origen 14 Tabla 4. Clasificación de los Fármacos Antineoplásicos 32 Tabla 5. Formulación típica usada en estudios pre-clínicos de acuerdo a la FDA 53 V ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Porcentaje de defunciones generales y por sexo causadas por tumores malignos. De 1995-2005 5 Figura 2. Distribución porcentual de las principales causas de defunción por tumores malignos según el sexo hasta el 2005. 6 Figura 3. Esquema del Ciclo Celular. 16 Figura 4. Complejo cdk-ciclina. 18 Figura 5. Esquema representativo de las ciclinas participantes en el ciclo celular. 19 Figura 6. Puntos de control del ciclo celular. 20 Figura 7. Compuesto de Changrolina, dividido en tres regiones Importantes. 37 Figura 8. Sistemas nanoscópicos 44 Figura 9. Representación esquemática de una Nanopartícula sólida Lipídica. 45 Figura 10. Representación esquematica de las Nanoesfera (NE) y Nanocápsula (NC) 46 Figura 11. Efecto del compuesto Tiomorfolínico LQM 319 disuelto en HCL sobre células D54. 54 VI Figura 12. Efecto del compuesto Tiomorfolínico LQM 319 disuelto en DMSO células HeLa y células D54 después de 24 Horas. 55 Figura 13. Exposicion de las células D54 a hidralazina, LQM 319, blanco de nanoparticulas y LQM 402. 57 Figura 14. Exposicion de las células Vero a hidralazina, LQM 319, blanco de nanoparticulas y LQM 402. 58 Figura 15. Exposicion de las células Hela a hidralazina, LQM 319, blanco de nanoparticulas y LQM 402. 59 1 I. CANCER I.1. DEFINICIÓN. El interés por el estudio del cáncer ha aumentado en el último siglo debido al control relativo de las enfermedades infecciosas,al mejoramiento sanitario, a la vacunación y al uso de antibióticos 1. El cáncer constituye un grupo de enfermedades crónico degenerativas, provocadas por factores genéticos heredados o externos. (OMS) El instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos (NCI) define al cáncer como, un nombre dado a las enfermedades en las que hay células anormales que se multiplican sin control y pueden invadir tejidos. El cuerpo está compuesto de muchos tipos de células. Estas células crecen y se dividen para producir nuevas células conforme el cuerpo las necesita. Cuando las células envejecen, mueren y estas son reemplazadas por células nuevas. Pero a veces, este proceso ordenado de división de células se descontrola, células nuevas se siguen formando aun cuando el cuerpo no las necesita. Cuando esto pasa, las células viejas no mueren cuando deberían morir. Estas células que no son necesarias pueden formar una masa, la cual se le conoce como tumor (NCI). Una célula cancerosa es una célula cuyo crecimiento y división ya no están controlados. Este conjunto de células se acumula y consecutivamente forma un tumor. Además éstas células cancerosas pierden su especialización, es decir, se desdiferencian y migran a través de torrente sanguíneo y sistema linfático por metástasis2. La alta incidencia de cáncer, como una función de la longevidad celular, sugiere que múltiples alteraciones génicas se requieren para el proceso de tumorogenesis. Se ha sugerido que las células cancerosas presentan mutaciones que inducen inestabilidad genómica y, por lo tanto, aceleran la tasa de mutaciones del genoma. Algunas de estas mutaciones afectan a genes que codifican componentes de los 2 mecanismos de control del ciclo celular (puntos de control), los cuales determinan el orden de los eventos en dicho ciclo, así como la fidelidad e integridad de los sistemas de replicación y reparación del DNA3. I.2. CLASIFICACIÓN DEL CÁNCER. Los tumores de acuerdo a las características que presentan pueden clasificarse en dos grupos: a) Los tumores benignos no son cancerosos. Generalmente se pueden extraer (extirpar). En la mayoría de los casos, estos tumores no vuelven a crecer. Las células de los tumores benignos no se diseminan o riegan a otros tejidos o partes del cuerpo. b) Los tumores malignos son cancerosos. Las células en estos tumores pueden invadir el tejido a su alrededor y diseminarse a otros órganos del cuerpo. Cuando el cáncer se disemina de una parte del cuerpo a otra, se llama metástasis. Los principales tipos de cáncer de acuerdo a su origen celular son: 1.- Carcinoma- cáncer que comienza en la piel o en los tejidos que revisten o cubren los órganos internos. 2.- Sarcoma- cáncer que se origina en el hueso, cartílago, grasa, musculo, vasos sanguíneos u otro tejido conectivo o de soporte. 3.- Leucemias- cáncer que comienza en el tejido que forma la sangre como la medula ósea y causa un gran número de células sanguíneas anormales que se producen y pasan a la sangre. 4.- Linfomas y Mielomas- canceres que empiezan en las células del sistema inmune. 5.- Canceres del sistema nervioso central (Gliomas)- canceres que empiezan en los tejidos del cerebro y medula espinal. (NCI) 3 I.3. FACTORES DE RIESGO. El cáncer es causado por alteraciones en los genes que controlan el crecimiento y la muerte normal de las células. Ciertos estilos de vida y factores ambientales pueden convertir algunos genes normales en genes que permiten el aumento del cáncer. Los cambios genéticos que conducen al cáncer son el resultado del uso del tabaco, la dieta, la exposición a los rayos ultravioleta (UV) del sol o la exposición a carcinógenos (substancias que causan cáncer) en el lugar de trabajo o en el ambiente. Algunas alteraciones genéticas son heredadas (del padre, la madre, o de ambos padres). Sin embargo, el haber heredado una alteración en un gen no siempre significa que la persona desarrollara la enfermedad; sólo significa que las posibilidades de padecer cáncer son mayores4. La OMS señala que el tabaquismo, el sobrepeso, el tipo de alimentación, el sedentarismo, el alcoholismo, la presencia de enfermedades de transmisión sexual, la contaminación ambiental, entre otros, son factores que favorecen el desarrollo de la enfermedad. Los virus del papiloma humano (VPH) serotipos 16 y 18, hepatitis B y C (HepB y HepC) y el de la inmunodeficiencia humana (VIH) aumenta el riesgo de algunos tipos de cáncer, el cáncer en sí no es contagioso. Organización Mundial de la Salud (2009). Cáncer. Nota descriptiva N°297, Julio de 2008. Aunque no existe alguna forma garantizada de prevenir el cáncer, la gente puede reducir las posibilidades de padecer cáncer al: -No usar productos de tabaco. -Consumir alimentos con menos grasa y comer más verduras, frutas y grano integral. -Hacer ejercicio con regularidad y mantener un peso estable y saludable. -Evitar los rayos dañinos del sol, usar protector solar y ropa que protege la piel. 4 -Consultar al médico sobre los posibles beneficios de los medicamentos que se ha comprobado reducen el riesgo de que se presenten algunos tipos de cáncer. Aunque pueden evitarse muchos factores de riesgo, algunos, como las mutaciones heredadas, no se pueden evitar. Es también importante recordar que no todas las personas padecerán la enfermedad de hecho, la mayoría no la padecen. Las personas que tienen una mayor probabilidad de verse afectadas por el cáncer pueden ayudar a protegerse evitando los factores de riesgo siempre que sea posible y examinándose regularmente para que, si se presenta el cáncer, se pueda detectar y tratar a tiempo. (http://www.cancer.gov/espanol/) El cáncer puede causar una variedad de síntomas. Los posibles signos dependiendo al tipo de cáncer pueden ser los siguientes: - Engrosamiento o bulto del seno o en cualquier otra parte del cuerpo. - Lunar nuevo o un cambio obvio de una verruga o de un lunar ya existente. - Llaga que no sana. - Tos o ronquera persistente. - Cambios en los hábitos del intestino o vejiga. - Indigestión que no se quita o dificultad al pasar alimentos. - Cambio de peso sin razón aparente. - Hemorragia o secreción no acostumbradas, por mencionar algunos. Cuando surgen estos síntomas u otros, no siempre son causados por cáncer. Pueden ser causados por infecciones, tumores benignos u otros problemas. Es importante consultar con el médico acerca de estos síntomas o cualquier otro cambio físico. Sólo un médico puede hacer el diagnóstico. La persona que tiene 5 estos síntomas u otros no debe esperar a sentir dolor. El cáncer al principio generalmente no causa dolor. (http://www.cancer.gov/espanol/) I.4. CÁNCER EN MÉXICO. A nivel mundial, el cáncer es la segunda causa de mortalidad, sólo después de las enfermedades cardiovasculares, se le atribuyen 7.9 millones de defunciones en el 2007. La Organización Mundial de la Salud (OMS), estima que alrededor de 84 millones de personas morirán a causa de esta enfermedad entre 2005 y 2015 si no se toma ninguna medida. (NCI 2007). En el 2005, los tumores malignos fueron la tercera causa de muerte en México, 63,128 personas fallecieron por éstos, el volumen representa 12.7 % del total de las defunciones registradas. • Las defunciones por tumores malignos representaron 11.3 % del total de fallecimientos en los varones y 14.5 %, en las mujeres. • En las mujeres, 13.3 % de las defunciones por tumores malignos corresponden al del cuello del útero (cérvicouterino) y 13.1 % más al de mama; el de hígado y vías biliares intrahepáticas ocasionó 7.9 % de las muertes. (Figura 1). Figura 1. Porcentaje de defunciones generales y por sexo causadas por tumores malignos. De 1997-2005 INEGI. 6 En los varones, las tres principales causas de muertepor tumores malignos en el año corresponden a los de: tráquea, bronquios y pulmón (15.6 %), próstata (15.5 %) y estómago (9.1 %). (Figura 2.) Figura 2. Distribución porcentual de las principales causas de defunción por tumores malignos según sexo hasta el 2005. INEGI. De acuerdo con el volumen de su población, cuatro entidades representan 36 de cada 100 fallecimientos por tumores de tipo maligno: el Distrito Federal (10.7 %), estado de México (10.6 %), Veracruz de Ignacio de la Llave (7.8 %) y Jalisco (7.3 %). 7 Tabla 1. Distribución porcentual de muertes por causa de tumores malignos en función de edades reportado por el INEGI. Edad Porcentaje de mortalidad a causa de tumores malignos. Menores de 1 año. 91 %. De 1-4 años. 7.7 % donde la leucemia representó 52 de cada 100 defunciones. De 5-14 años 15.8 % donde la leucemia causó el 55.8 % de defunciones de este grupo. De 15-24 años. 8.4 % donde la leucemia provocó el 37.3 %. En varones representó el 6.8 % y en mujeres el 12.1 % de defunciones. De 25-34 años. 8.8 % de los decesos, de los cuales en hombres el 5.7 %, la leucemia 21.4 % y 12.4 % el tumor maligno de testículo, ocasionando 34 de cada 100 de los decesos de esta edad. En las mujeres 17.2 % de los decesos son causados por el cáncer de mama 31.7 % de cáncer cérvico-uterino siendo la primer causa de fallecimientos. De 35-44 años. 13.7 % donde los hombres, la leucemia, el tumor de estómago, de tráquea, bronquios y pulmón en conjunto causan el 32.8 % de los decesos de este grupo. En las mujeres el 15.7 % de los decesos, el 46.8 % fueron ocasionados 8 por cáncer de mama y cérvico-uterino en este grupo. De 45 a 65 años El cáncer es la segunda causa de muerte en este grupo de edades el 12.6 %, en el caso de las mujeres a causa de tumores malignos o por algún otro tipo de cáncer es el 24.4 %. Mayores de 65 años Representa la segunda causa de muerte en los hombres el 14.2 %, donde de cada 23 de 100 fallecimientos son ocasionados por cáncer de próstata y 18 de cada 100 por el tráquea, bronquios y pulmón. En las mujeres el 11.8 % a causa del cáncer de hígado y vías biliares intrahepáticas, así también 3 de cada 10 fallecimientos fueron ocasionados por cáncer de cuello y estomago. La tabla 1 muestra el porcentaje representativo de las muertes causadas por el cáncer donde se puede observar que la mayor incidencia se da en las mujeres que presentan cáncer de mama o cérvico uterino y en los hombres cáncer de pulmón, cáncer de estómago y leucemia.(http: //www.inegi.gob.mx/) II. ESTRÉS OXIDATIVO. El estrés oxidativo se define como una condición en la que la velocidad de generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) excede la capacidad de 9 protección de ellas, lo que determina un incremento en el daño oxidativo a las biomoléculas. Mostrándose un desequilibrio entre los sistemas prooxidantes y antioxidantes5. Los adelantos científicos y específicamente en la medicina son grandes, en los últimos 30 años viene desarrollándose cada día un interés mayor por los problemas relacionados con el estrés oxidativo, los radicales libres, las especies reactivas del oxígeno y los antioxidantes, todo esto dado por la importancia que poseen en la bioquímica, la biología y la medicina. Las ciencias médicas están dando un paso de avance significativo en el conocimiento de muy variadas enfermedades, en su fisiopatología, su tratamiento y más importante aún, en su prevención. Existen varios trabajos en los cuales se demuestra la relación existente entre el estrés oxidativo y algunas enfermedades, Boyd y Guire realizaron un estudio en 450 mujeres, de las cuales 37 tenían el diagnóstico de displasia mamaria y encontraron elevación de los niveles de lípidos peroxidados. El Linxian General Population Study realizado en una población china de 30 000 personas mostró una reducción significativa del cáncer de estómago en aquellos que ingirieron suplementos de antioxidantes. El estudio MONICA de la OMS mostró una correlación inversa entre los niveles de vitamina E y la mortalidad por infarto del miocardio en 16 ciudades europeas. El Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS) agrupó a 2 000 pacientes con enfermedad coronaria comprobada por coronariografía, que fueron divididos en 2 grupos: a uno se le administró un placebo y al otro 800 UI de vitamina E; después de un seguimiento , se observó una disminución de la mortalidad por infarto del miocardio en el grupo tratado6. II.1 ESTRÉS OXIDANTE. De manera habitual, el oxígeno se encuentra en su forma más estable (O2), con los electrones que forman el enlace (pi), antienlazante con el mismo espín, es decir, en lo que se conoce como estado triplete, así el oxígeno es poco reactivo, con una velocidad de reacción baja a temperatura fisiológica; sin embargo por 10 reacciones puramente químicas, por acciones enzimáticas o por efecto de las radiaciones ionizantes, se pueden producir una serie de especies químicas o sustancias prooxidantes (moléculas o radicales libres altamente reactivos) que son capaces de dar lugar a múltiples reacciones con otros compuestos presentes en el organismo, y que llegan a producir daño celular. Por lo anteriormente expuesto se comprende que, si bien el oxígeno es imprescindible para el metabolismo y las funciones del organismo, no se deben olvidar los muchos efectos tóxicos que posee. El daño o estrés oxidante se ha definido como la exposición de la materia viva a diversas fuentes que producen una ruptura del equilibrio intracelular oxidante que debe existir entre las sustancias o factores prooxidantes y los mecanismos antioxidantes encargados de eliminar dichas especies químicas, ya sea por un déficit de estas defensas o por un incremento exagerado de la producción de especies reactivas del oxígeno. Todo esto trae como consecuencia alteraciones de la relación estructura-función en cualquier órgano, sistema o grupo celular especializado; por lo tanto se reconoce como mecanismo general de daño celular, asociado con la fisiopatología primaria o la evolución de un número creciente de entidades y síndromes de interés médico-social, involucrado en la génesis y en las consecuencias de dichos eventos6. II.2. RADICALES LIBRES. Desde el punto de vista químico, los radicales libres son todas aquellas especies químicas, cargadas o no, que en su estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo que les da una configuración espacial responsable de una gran inestabilidad, señalizado por el punto situado a la derecha del símbolo. Poseen una estructura birradicálica, son muy reactivos, tienen una vida media demasiado corta, por lo que actúan cercano al sitio en que se forman. Pueden estar presentes en todas partes del cuerpo, se producen por diferentes mecanismos entre los que se encuentran la cadena respiratoria mitocondrial, la cadena de transporte de electrones a nivel microsomal, en los 11 cloroplastos y las reacciones de oxidación, por lo que producen daño celular (oxidativo) al interactuar con las principales biomoléculas del organismo. Los radicales libres se generan a nivel intracelular y extracelular. Entre las células relacionadas con la producción de radicales libres del oxígeno tenemos los neutrófilos, monocitos, macrófagos, eosinófilos y las células endoteliales. Las enzimas oxidantes involucradas son la xantina-oxidasa, la indolamindioxigenasa, la triptofano-dioxigenasa, la mieloperoxidasa, la galactosa oxidasa, la ciclooxigenasa, la lipoxigenasa, la monoamino-oxidasa y la NADPH oxidasa. Adicionalmente entre las sustancias y agentes es ampliamente conocida la relación de los productos cíclicos de naturaleza redox como son; el paraquat, diquat, alloxano, estreptozozina y doxorubicina, entreotros, con los radicales libres. También se producen radicales libres por la administración de paracetamol, tetracloruro de carbono y furosemida; por último no se puede olvidar agentes como el humo de cigarro, las radiaciones ionizantes, la luz solar, el shock térmico y las sustancias que oxidan el glutatión (GSH) como fuentes de radicales libres. Sin embargo, tienen una función fisiológica en el organismo como la de participar en la fagocitosis, favorecen la síntesis de colágeno y la síntesis de prostaglandinas, activan enzimas de la membrana celular, disminuyen la síntesis de catecolaminas por las glándulas suprarrenales, modifican la biomembrana, favorecen la quimiotaxis, apoptosis, ciclo celular, diferenciación y están involucrados en la transcripción génica. Las principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son: Radical hidroxilo (HO)+. Peróxido de hidrógeno (H2O2). Anión superóxido (O2). Oxígeno singlete (1O2). Oxígeno nítrico (NO). Peróxido (ROO). Semiquinona (Q). 12 Ozono (O3). Existen algunas circunstancias en que también se producen radicales libres como son: Dieta hipocalórica. Dieta insuficiente en antioxidantes. Procesos inflamatorios y traumatismos. Fenómenos de isquemia y reperfusión7. II.3. EFECTO NOCIVO DE LOS RADICALES LIBRES. El daño celular producido por las especies reactivas del oxígeno ocurre sobre diferentes macromoléculas: Lípidos. Es aquí donde se produce el daño mayor en un proceso que se conoce como peroxidación lipídica, afecta a las estructuras ricas en ácidos grasos poliinsaturados, ya que se altera la permeabilidad de la membrana celular y puede causar muerte celular. La peroxidación lipídica representa una forma de daño en tejidos que puede ser desencadenado por el oxígeno, el oxígeno singlete, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo. Los ácidos grasos insaturados son componentes esenciales de las membranas celulares, por lo que se cree son importantes para su funcionamiento normal; sin embargo, son vulnerables al ataque oxidativo iniciado por los radicales libres del oxígeno. Proteínas. Hay oxidación de un grupo de aminoácidos como fenilalanina, tirosina, histidina y metionina, además se forman entrecruzamientos de cadenas peptídicas, y por último hay formación de grupos carbonilos. Ácido desoxirribonucleico (DNA). Ocurren fenómenos de mutaciones y carcinogénesis, hay pérdida de expresión o síntesis de una proteína por daño a un gen específico, modificaciones oxidativas de las bases, fragmentaciones, interacciones estables DNA-proteínas, reordenamientos cromosómicos y desmetilación de citosinas del DNA que activan genes. 13 El daño se puede realizar por la alteración, inactivación o pérdida de algunos genes supresores de tumores que pueden conducir a la iniciación, progresión o ambas a la carcinogénesis. Los genes supresores de tumores pueden ser modificados por un simple cambio en una base crítica de la secuencia del DNA7. II.4 MECANISMOS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE. El sistema de defensa antioxidante está constituido por un grupo de sustancias que al estar presente en concentraciones bajas con respecto al sustrato oxidable, retrasan o previenen significativamente la oxidación de este. Como sustrato oxidable se pueden considerar casi todas las moléculas orgánicas o inorgánicas que se encuentran en las células vivas, como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y las moléculas de DNA. Los antioxidantes exógenos actúan como moléculas suicidas, ya que se oxidan al neutralizar al radical libre, por lo que la reposición de ellos debe ser continua, mediante la ingestión de los nutrientes que los contienen, en un determinado microambiente -membrana plasmática, citosol, núcleo o líquido extracelular llamado ejercicio extenuante. (tabla 2)7. Tabla 2. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acción. (Chessman and Slater, 1993). Intracelular Membrana Extracelular Superóxido dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina Catalasa Beta carotenos Transferinas Peroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferinas DT-deafarasa Albúminas GSH Haptoglobinas Proteínas que ligan metales Vitamina C Sistemas proteolíticos Ácido úrico Vitamina C Vitamina E 14 Los antioxidantes actúan como eliminadores, con el objetivo de mantener el equilibrio prooxidante/antioxidante a favor de estos últimos (tabla 3). Tabla 3. Clasificación de los antioxidantes, según su origen. (Chessman and Slater, 1993). Origen Acción 1. Exógenos Vitamina E - Neutraliza el oxígeno singlete - Captura radicales libres hidroxilo - Captura O2 - Neutraliza peróxidos Vitamina C - Neutraliza el oxígeno singlete - Captura radicales libres de hidroxilo - Captura O2 - Regenera la forma oxidada de la vitamina E Betacarotenos Neutraliza el oxígeno singlete Flavonoides, Licopenos Agentes quelantes de los metales de transición como Fe, Se, Zn a nivel celular. 2. Endógenos Enzimáticos Cofactor Superóxido dismutasa (SOD) Cobre, sodio, manganeso Catalasa (CAT) Hierro Glutatión peroxidasa (GPS) Selenio 3. No enzimáticos Glutatión Barreras fisiológicas que enfrenta el oxígeno a su paso desde el aire hasta las células Coenzima Q 15 Ácido Tioctico Transportadores de metales (transferrina y ceruloplasmina) III. CICLO CELULAR Y CANCER. Las células cancerosas difieren de las células normales en muchas características, incluyendo la pérdida de la capacidad de diferenciación, el aumento de invasividad y la disminución de la sensibilidad a los fármacos citotóxicos. Estas características son resultado de la proliferación celular descontrolada y del proceso de evolución de la célula normal hacia una célula con un potencial de desarrollar un tumor. Se ha identificado que las células cancerosas presentan mutaciones que inducen inestabilidad genómica y, por lo tanto, aceleran la tasa de mutaciones del genoma. Algunas de estas mutaciones afectan a genes que codifican para componentes de los mecanismos de control del ciclo celular (puntos de control), los cuales determinan el orden de los eventos en dicho ciclo, así como la fidelidad e integridad de los sistemas de replicación y reparación del DNA. Además, aunque no está claro cuál es el origen génico de muchas enfermedades (anemia de Fanconi, ataxia telangiectasia, etc.), éstas se caracterizan por un aumento en la sensibilidad ante agentes que dañan al DNA, una alta frecuencia de rearreglos génicos modificados como una alta predisposición al desarrollo de cáncer. III.1. CICLO CELULAR. De acuerdo a la teoría celular establecida por el biólogo alemán Rudolf Virchoff en el siglo XIX, “las células sólo provienen de células”. Las células existentes se dividen a través de una serie ordenada de pasos denominados ciclo celular; la célula aumenta su tamaño, el número de componentes intracelulares (proteínas y organelos), duplica su material genético y finalmente se divide. 16 Figura 3. Esquema del Ciclo Celular. Tomada de http://www.biologia.arizona.edu El ciclo celular se divide en dos fases: 1) Interfase, se divide en: • Fase de síntesis (S): En esta etapa la célula duplica su material genético para pasarle una copia completa del genoma a cada una de sus células hijas. • Fase G1 y G2 (intervalo): Entre la fase S y M de cada ciclo hay dos fases denominadas intervalo en las cuales la célula está muy activa metabólicamente, lo cual le permite incrementar su tamaño (aumentando el número de proteínas y organelos), de lo contrario las células se harían más pequeñas con cada división. 2) Fase M. Mitosis (M): En esta fase se reparte a las células hijas el material genético duplicado, a través de la segregaciónde los cromosomas. La fase M, para su estudio se divide en: 17 • Profase: En esta etapa los cromosomas (constituidos de dos cromátidas hermanas) se condensan en el núcleo, mientras en el citoplasma se comienza a ensamblar el huso mitótico. • Metafase: Comienza con el desensamble de la envoltura nuclear, de esta manera los cromosomas se pueden unir al huso mitótico (mediante los cinetocoros). Una vez unidos los cromosomas estos se alinean en el ecuador de la célula. • Anafase: Se produce la separación de las cromátidas hermanas, las cuales dan lugar a dos cromosomas hijos, los cuales migran hacia polos opuestos de la célula. • Telofase: Aquí ambos juegos de cromosomas llegan a los polos de la célula y adoptan una estructura menos densa, posteriormente se forma nuevamente la envoltura nuclear. Al finalizar esta fase, la división del citoplasma y sus contenidos comienza con la formación de un anillo contráctil. • Citocinesis: Finalmente se divide la célula mediante el anillo contráctil de actina y miosina, produciendo dos células hijas cada una con un juego completo de cromosomas. Cuando ya no se requieren más células, estas entran en un estado denominado G0, en el cual abandonan el ciclo celular y entran en un periodo de latencia, lo cual no significa que entren en reposo, ya que éstas células presentan un metabolismo activo, pues si estas células reciben el estímulo adecuado abandonan el estado G0 y entran al G1. Algunas poblaciones celulares altamente especializadas como las fibras musculares o neuronas al entrar en estado G0 abandonan indefinidamente el ciclo celular. (http://www.biologia.arizona.edu) III .2. REGULACIÓN DEL CICLO CELULAR. 18 El conjunto de procesos que ocurren durante el ciclo celular llevan un orden y supervisión estrictos. Señales provenientes del medio y algunos controladores dentro de la célula, se encargan de dirigir el proceso de ésta a través de las distintas fases del ciclo celular. Entonces hablamos de que hay una regulación extracelular y una regulación intracelular. Regulación intracelular. El control interno del ciclo celular está a cargo de proteínas, cuyas acciones podrían resumirse en series de activaciones e inhibiciones de otras proteínas, que son indispensables durante las fases del ciclo. Los principales reguladores son dos: las proteínas que permiten el progreso del ciclo, los complejos cdk-ciclina (Figura 4) y las proteínas que las inhiben, dos pequeñas familias de proteínas, las CIP y las INK4. Los complejos cdk-ciclina están compuestos por dos tipos de proteínas, las cdk (cinasa dependiente de ciclina) y las ciclinas que pasan por un ciclo de síntesis y degradación8. CICLIINA CDK. Figura 4. Complejo cdk-ciclina. (Alberts et al. 2002). 19 Se conocen 6 distintas combinaciones de cdk-ciclina que actúan en tiempos específicos durante el ciclo (Figura 5). Figura 5. Esquema representativo de las ciclinas participantes en el ciclo celular. (Lodish et al. 2003). Las proteínas INK4 y CIP, y algunos factores de transcripción (como p53) tienen la función de controlar la proliferación celular. La mutación de los genes que las codifican causa la pérdida de control sobre el ciclo celular y la incapacidad para detenerlo. Por su acción normal, a los genes que codifican estas proteínas se les denominaron “genes supresores”. El paso ordenado por cada una de las fases del ciclo celular, está regulado como ya se mencionó por los complejos cdk-ciclina y sus inhibidores, existen además puntos de control del ciclo celular, se han postulado cuatro puntos que controlan a la célula y al medio extracelular para dar lugar o restringir las acciones propias de 20 cada una de las fases del ciclo. Estos cuatro puntos son un punto de restricción y tres puntos de control8. Puntos de control. Los puntos de control son pequeñas zonas donde se evalúan distintas características del medio y de la célula misma, la célula debe estar sana y el medio debe ser lo suficientemente bueno para continuar con el ciclo celular. Pero además de ello, los controladores implicados en estos puntos tienen la capacidad de “llamar” a otros a reparar, cuando por ejemplo el material genético está dañado, o a terminar distintos procesos. El primer punto de control, se encuentra justo después del punto de restricción, aún en G1 (Fig. 6). En general podríamos decir que el primer control se encarga de revisar las condiciones del medio, buscando factores externos que induzcan el progreso del ciclo celular, revisar que la célula haya crecido lo suficiente y que el material genético esté intacto. Los encargados de la inhibición en este punto de control es un factor de transcripción y una CIP: p53 y p21, en ese orden. p53 es uno de los más conocidos supresores de tumores, usualmente se encuentra en la célula pero es muy inestable en condiciones normales porque se encuentra unido a otra proteína llamada Mdm2, que funciona como un “marcador” para que p53 se degrade. Pero, si existe una lesión en el DNA, distintas enzimas se activan, éstas ayudan a “separar” p53 de su “marcador”, una mayor concentración de p53 estimula la síntesis de p21 (CIP) que se une a cdk2 y ciclina E, inhibiendo la acción del complejo (Figura 6). La célula entonces no puede entrar a fase S9. 21 Figura 6. Puntos de control del ciclo celular (Nelson y Cox 2000). El segundo punto de control se encuentra al final de G2. Los complejos cdk1- ciclina A y ciclina B permiten el paso a través de este punto. En conjunto la actividad de estos dos complejos se denominó Factor Promotor de la Mitosis (MPF). Se encarga de revisar, que el material genético se encuentre duplicado completamente, que el material genético no tenga errores y que el medio extracelular sea adecuado. Se sabe que una vez activado el complejo cdk-ciclina, éste se encarga de llevar a cabo tareas indispensables durante las primeras subfases de la mitosis. En resumen, los complejos cdk1-ciclina A y ciclina B, se encargan de inducir el ensamble del huso mitótico y en parte de asegurarse de que los cromosomas se unan a éste. Se encarga además, de iniciar la condensación del material genético, activando un grupo de proteínas conocidas como condensinas, de desensamblar la envoltura nuclear fosforilando las láminas nucleares, de armar nuevamente el citoesqueleto celular y de la reorganización del aparato de Golgi y el retículo endoplasmático. En este punto actúa también p53, detecta daños en el ADN y desencadena a la activación de CIP p21 encargada de la inhibición de cualquier complejo cdk 1,2, 4 y 6-ciclina. 22 Tercer punto de control. Este último punto de control se encuentra en la fase M, entre la metafase y la anafase. Se encarga de revisar que todos los cromosomas se encuentren unidos al huso mitótico. Si detecta que uno de los cinetocoros no se encuentra unido, manda una señal negativa al sistema de control bloqueando la activación de proteínas implicadas en la separación de las cromátidas hermanas. Inhibiendo la liberación de la separasa e impidiendo que las cromátides hermanas se separen hasta que la señal desaparezca9. III.3. APOPTOSIS. Las células en un organismo forman una comunidad organizada, donde el número de células en esta comunidad está estrictamente regulado; si una célula ya no es requerida esta muere o se “suicida” por apoptosis. Este fenómeno es bastante común tanto en organismos en desarrollo, como en adultos, por lo general las células que mueren por apoptosis son células viejas, (a diferencia de las células que mueren por necrosis); pero en realidad es un proceso necesario para la homeostasisy la morfogénesis; por ejemplo los dedos se separan por apoptosis del tejido que hay entre ellos en el primordio de la mano. El proceso intracelular de la apoptosis depende de una familia de proteasas llamadas caspasas que cortan a la proteína blanco o diana en residuos de aspartato. Las caspasas se encuentran en las células en forma inactiva (procaspasas) las cuales son activadas por un corte proteolítico, estas a su vez activan otras procaspasas en una cascada de amplificación. Las caspasas cortan proteínas clave en la célula, como laminina que al romperse desintegra la membrana nuclear y degradan a la enzima que inactiva a la DNAsa ocasionando la degradación del material genético. 23 La entrada al proceso de apoptosis, al igual que la entrada a un nuevo ciclo celular es un “todo o nada”, donde una célula que ha iniciado este proceso no puede detenerse. El mecanismo propuesto de la activación de estas procaspasas gira alrededor de proteínas adaptadoras que juntan múltiples caspasas en un agregado, en este agregado las caspasas se activan entre sí mediante una pequeña actividad de proteasa basal; en unos momentos estas caspasas activas desencadenan la cascada de activación amplificando la señal de muerte. Las señales de muerte pueden originarse a dos niveles: en algunas células se puede inducir apoptosis presentando el ligando de Fas en su membrana, el cual se une a un receptor de muerte (Fas) en la superficie celular de la célula blanco, el agregado de Fas y su ligando recluta a los adaptadores que unen y activan a la procaspasa 8. La célula también en respuesta a daño o estrés puede activar la apoptosis, por ejemplo un daño severo al DNA puede inducirla mediante p53, que activa la transcripción de genes que codifican para proteínas que promueven la liberación del citocromo C de la mitocondria, en el citoplasma se une al factor promotor de la apoptosis, el cual agrega y activa a la procaspasa 98. III.4 EFECTOS DEL CÁNCER EN EL CICLO CELULAR. El cáncer es una enfermedad dónde la regulación del ciclo celular sale mal y el crecimiento normal y comportamiento de la célula se pierden. Existen diversas mutaciones que conducen al desarrollo de la enfermedad, entre ellas, la mutación de p53 es la más frecuente, investigaciones recientes sugieren a p27 como una de las proteínas responsables de cáncer de mama, ya que se ha visto que regula la entrada a la fase S y cuando los niveles de la proteína disminuyen se convierte en un factor de riesgo para el desarrollo de este tipo de cáncer. (http://www.biologia.arizona.edu) Alteraciones en el proceso de interrupción del ciclo celular permiten que células con genomas modificados evolucionen a células cancerosas. Tales circunstancias podrían incluir: la senescencia celular, en donde los telómeros (secuencias repetidas que están en los extremos de los cromosomas) se pierden o llegan a ser 24 cortos y se forman los cromosomas dicéntricos inestables; la muerte celular por apoptosis, donde las nucleasas que degradan al DNA están alteradas y la naturaleza de la respuesta inmune del hospedero, donde se requiere el rearregló de genes de inmunoglobulinas o del receptor de antígenos de linfocitos T, entre otros casos. No obstante, las células tienen la capacidad de detener la progresión del ciclo celular en una fase específica, cuando el daño es inducido por agentes extrínsecos que inhiben la replicación del DNA. Los genes que codifican para proteínas que participan en esta detención y que establecen la dependencia del ciclo celular son los que constituyen los puntos de control del ciclo, regulando los procesos de replicación, activación transcripcional, progresión del ciclo celular y apoptosis. Existen evidencias que sugieren que alteraciones en p53 y en los puntos de control producen inestabilidad genómica y sobrevivencia inapropiada de células dañadas, que contribuyen a la evolución de células normales a células malignas. Entre estos hallazgos se pueden mencionar: a) el hecho de que p53 se encuentra mutado en muchos tipos de cánceres, lo que sugiere que anormalidades en los puntos de control de la fase G1 a la fase S son importantes en el desarrollo del tumor ; b) las aneuploidias y las amplificaciones de genes son comunes en células mutadas en p53, lo que sugiere que la pérdida de la función de p53 está asociad a la inestabilidad genómica; c) los productos de genes virales relacionados con cáncer (SV40, VPH y adenovirus) alteran la función de varias proteínas celulares incluyendo a p53 y Retinoblastoma (Rb), y pueden afectar la función de los puntos de control que operan en el paso de la fase G1 a la fase S del ciclo celular. El complejo entre la proteína transformante del virus de papiloma humano E6 y p53 conduce a una rápida degradación de p53 mediante proteólisis dependiente de ubiquitina, y por lo tanto, se pierde la interrupción del ciclo celular inducido por p53; d) los pacientes con ataxia telangiectasia tienen inestabilidad genómica, alta incidencia de linfomas linfoblásticos y presentan alteraciones en genes que se requieren para la inducción óptima de p53 en la fase S después de la irradiación, y e) en adenocarcinomas de epitelio esofaríngeo se ha sugerido una función de los mecanismos que controlan el paso de la fase G1 a la fase S dependiente de p53. 25 Además, la expresión anormal de las ciclinas D, E y A, en asociación con varias CDK alteradas, en células deficientes de la función de p53, sugiere un mecanismo adicional de la pérdida de los puntos de control durante la transición de la fase G1 a la fase S en el proceso del desarrollo del tumor. En algunos tejidos y bajo ciertas condiciones fisiológicas, la inducción de p53 por daño al DNA causa muerte celular por apoptosis, en lugar de interrupción del ciclo celular en la fase G1. En estas instancias, la pérdida de la capacidad para que las células mueran por apoptosis puede contribuir a la inestabilidad genómica y a la formación tumoral, en consecuencia, a la pérdida del mecanismo de eliminación de células con daño génico. Esto ocurre tempranamente en la progresión del cáncer y permite la inestabilidad genómica con la sobrevivencia de células dañadas, o bien, ocurre tardíamente en el desarrollo del tumor y contribuye a la sobrevivencia de las células en situaciones fisiológicas inapropiadas. La selección negativa en el tejido tímico ocurre por apoptosis, y alteraciones en este mecanismo contribuyen al desarrollo de linfomas linfoblásticos. El proceso de apoptosis puede estar regulado por genes que controlan la progresión del ciclo celular, lo que puede resultar un aumento de la inestabilidad genómica y de la sobrevivencia de células transformadas. En las situaciones donde existe daño genético se induce a p21 a través de la forma activa de p53. Entre las funciones de p21 se encuentra la disociación de los complejos CDK-ciclina y en consecuencia se interrumpe el ciclo celular. La formación de los complejos CDK2-E activos disocia a los complejos pRB-E2F liberando a E2F, lo cual influye en la activación transcipcional y en la progresión del ciclo celular. Como puede apreciarse, existe una estrecha asociación entre el proceso de activación celular y los puntos de control del ciclo celular. Los puntos de control en la transición de la fase G1 a la fase S y de la fase G 2 a la fase M son importantes en la protección de las células de fuentes exógenas de daño al DNA. Sin embargo, este daño puede ser causado por procesos celulares intrínsecos como el rearreglo 26 de genes durante el desarrollo, la senescencia celular y la muerte celular por apoptosis. Cuando el daño es generado por procesos intrínsecos, los puntos de control sobre la proliferación celular son importantes en la prevención de la evolución de las células normales a cancerosas10 Y (http://profesorjano.files.wordpress.com/).III.5 CONTROL DEL CICLO CELULAR Y TERÁPIA CONTRA EL CÁNCER. En términos generales, en las estrategias creadas contra el desarrollo del cáncer, el efecto que produce la mayoría de los agentes antineoplásicos es daño al DNA, al aparato mitótico, a las topoisomerasas, o inhiben la síntesis o incorporación de precursores del DNA. El éxito de estos agentes en la muerte selectiva de las células cancerosas varía principalmente en función del tipo de cáncer. Algunos cánceres son sensibles a estos agentes y son curables (leucemia linfoblástica aguda y cánceres de células germinales), mientras que otros son relativamente resistentes y no son curables (carcinoma de colon). Esta variabilidad de respuestas refleja la especificidad celular ante los agentes anticancerígenos. En consecuencia, los puntos de control del ciclo celular representan una buena opción para la aplicación de los agentes quimioterapéuticos10 Y 11. En este contexto, varias propiedades importantes de los puntos de control del ciclo celular merecen cierta consideración. 1. Como ya se mencionó, los puntos de control son sistemas de transducción de señal que implica la expansión de la señal y cada uno de los pasos en la transducción de la señal a su blanco es considerado un posible blanco en el tratamiento de la enfermedad. 2. La mayoría de los genes de los puntos de control son esenciales en células normales, ya que ellos codifican para componentes de la maquinaria del ciclo celular que emiten o suprimen señales, o porque participan en más de una función celular. Para las vías no esenciales, los agentes terapéuticos que están dirigidos http://profesorjano.files.wordpress.com/ 27 hacia los puntos de control sólo serán detectados por su sinergismo con otros agentes que dañen a la célula. 3. Los puntos de control aseguran la integridad de la replicación y segregación genómica. La reparación del daño espontáneo del ADN requiere del correcto funcionamiento de los puntos de control para que las células mantengan esta integridad en la replicación del genoma. Por lo tanto, la restauración de los puntos de control que están alterados podría retardar la evolución de la célula normal a célula cancerosa, de igual manera que en ausencia de fuentes exógenas que dañan al DNA. 4. Los sistemas de transducción de señal exhiben adaptación. Si los puntos de control están dañados, las células prosiguen el ciclo celular aun cuando la alteración no haya sido reparada. Las alteraciones génicas que aumentan la habilidad de las células para adaptarse podrían acelerar la evolución del proceso neoplásico. Además, la inhibición de los componentes involucrados en la adaptación sugiere blancos terapéuticos para reparar los puntos de control alterados, como un mecanismo que retardaría la evolución de las células normales a células precancerosas. 5. La activación de los puntos de control induce una variedad de respuestas celulares. Por ejemplo, la expresión anormal de p53 en células que entran a la fase S con el DNA dañado es más nociva, por el hecho de que estas células no sufren muerte por apoptosis. La función de los puntos de control en la apoptosis está influida por el tipo celular y por la naturaleza de las señales de proliferación, o bien, por el daño al cual las células responden. La restauración de los puntos de control podría inducir la respuesta de muerte celular por apoptosis de las células cancerosas y aumentar la sensibilidad a los agentes que dañan el DNA. De hecho, al aplicar terapia génica con p53 normal a células de cáncer cervicouterino, se induce el proceso de apoptosis. Por lo tanto, los componentes de la respuesta apoptótica podrían ser usados como blancos terapéuticos, si la apoptosis pudiera ser activada en ausencia del daño al DNA. Esto podría ser posible para probar la 28 especificidad de cierto tipo de células cancerosas, ya que no todas las células responden a las mismas señales apoptóticas10, 12 Y 13. IV. TRATAMIENTOS. El cáncer puede tratarse con cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal, con terapia biológica o bien con una combinación entre ellos. IV. I. CIRUGÍA. La cirugía es un procedimiento para extirpar el cáncer. Los efectos secundarios de la cirugía dependen de muchos factores, inclusive del tamaño y lugar del tumor, el tipo de operación y el estado general de salud del paciente. Los pacientes tienen dolor después de la cirugía, pero este dolor se puede controlar con medicamentos. También es común que los pacientes se sientan cansados o débiles por un tiempo después de la cirugía. IV.2. RADIOTERAPIA. La Radioterapia, también llamada tratamiento de radiaciones, es uno de los tratamientos principales contra el cáncer y se basa en aplicar partículas u ondas de alta energía en a una parte específica del cuerpo donde se encuentra un tumor de cáncer o células cancerosas. Estas ondas o partículas pueden ser rayos X, rayos de electrones o protones gamma. Las células cancerosas se multiplican más rápido que las demás células del cuerpo. Cuando se aplican las radiaciones, la energía afecta directamente la información genética de las células cancerosas, y las destruye o las daña para evitar que sigan creciendo o que se dividan para formar nuevas células. Así se puede reducir el tamaño de un tumor, se evita que el cáncer se siga propagando y eventualmente pueden desaparecer las células cancerosas del cuerpo. Las radiaciones se aplican localmente, es decir, donde se encuentran las células cancerosas. Sin embargo, es probable que algunas células normales se vean 29 afectadas, pero afortunadamente éstas tienen la capacidad de recuperarse. Y para evitar afectar las células normales más de lo necesario, las radiaciones se aplican en dosis controladas, a sesiones sugeridas y el resto del cuerpo está protegido. (http://www.vidaysalud.com/) IV.2.1 TIPOS DE RADIOTERAPIA. Radioterapia de haz externo. El tipo de radioterapia que más se utiliza aplica rayos X con alta potencia o electrones de una máquina externa al cuerpo o fuera de este. La máquina utilizada con más frecuencia se conoce como acelerador lineal o, a veces, “linac”. La radioterapia de haz externo permite tratar grandes áreas del cuerpo, si es necesario. Radioterapia conformacional tridimensional (3D-CRT). Este tratamiento nuevo utiliza computadoras especiales para generar imágenes tridimensionales detalladas del cáncer. La radiación aplicada con mayor precisión permite el uso de dosis más elevadas y, a la vez, reduce el daño al tejido sano. Los estudios han demostrado que la 3D-CRT puede disminuir el riesgo de complicaciones. No se ha demostrado el impacto beneficioso sobre la supervivencia. Terapia con haz de protones. Este tipo de radioterapia de haz externo utiliza protones en lugar de rayos X para tratar ciertos tipos de cáncer. Los protones son elementos de los átomos y tienen energía suficiente para destruir las células cancerosas cuando se aplican en dirección a un sitio en particular del cuerpo afectado por el cáncer. La energía de los protones tiene sólo un efecto sumamente localizado, de manera que las células normales delante y detrás del tumor prácticamente no resultan dañadas. Aunque el tratamiento con protones es aún una alternativa reciente, promete una aplicación de mayor radiación al cáncer, a la vez que reduce el daño al tejido circundante sano. Dado que este tratamiento requiere equipos muy especializados, actualmente sólo está disponible en escasos centros médicos. 30 Terapia con haz de neutrones. La efectividad de la terapia con haz de neutrones significa que, en comparación con la radioterapia convencional, se necesita menos de la mitad de las sesiones de radiación. Esto hace que la terapia con haz de neutrones sea especialmente útil para el tratamiento de ciertos tumores cerebrales no quirúrgicosde crecimiento rápido. Radioterapia estereostática. La radiación estereostática permite aplicar una gran dosis de radiación precisa en una pequeña área del tumor. Dada la exactitud inherente a este tipo de tratamiento, el paciente debe permanecer muy quieto. Para evitar que el paciente se mueva, pueden hacerse soportes para la cabeza o moldes individuales para el cuerpo. Aunque a menudo se aplica como un único tratamiento, puede que sea necesaria la radioterapia fraccionada, en la que los pacientes reciben varios tratamientos. Radioterapia interna. También conocida como braquiterapia, que significa terapia a corta distancia, la radioterapia interna implica la aplicación de material radioactivo en el cáncer propiamente dicho o en el tejido circundante. Estos implantes pueden ser permanentes o temporales (durar varios minutos o algunos días). Los dispositivos sellados que contienen las fuentes radioactivas pueden presentarse en forma de un alambre delgado o catéteres, cintas o cápsulas (semillas). Es posible que la radioterapia interna exija la estancia hospitalaria. Las fuentes selladas aplican la mayor parte de la radiación alrededor del área del implante; sin embargo, parte de esta radiación puede emitirse (enviarse) desde su cuerpo. Aunque no todo su cuerpo se vuelve radioactivo, se deben tomar algunas precauciones para proteger al personal del hospital y a los visitantes de la exposición a la radiación. Radioterapia intraoperatoria (IORT). Es posible aplicar la radioterapia directamente en el tumor durante la cirugía, ya sea como radioterapia de haz externo o radioterapia interna. Esta técnica permite que el cirujano retire del medio el tejido normal antes de la aplicación de radioterapia, y es especialmente útil cuando hay órganos vitales normales ubicados peligrosamente cerca del tumor. 31 Radioterapia sistémica. La radioterapia sistémica utiliza materiales radioactivos, como el yodo 131 o el estroncio 89, que pueden tomarse por boca o inyectarse en el cuerpo y utilizarse para el tratamiento del cáncer de glándula tiroides. El cuerpo puede eliminar estos materiales radioactivos a través de la saliva, el sudor y la orina, lo que hace que estos líquidos sean radioactivos. Deben tomarse medidas de protección adicionales para proteger a las personas que están en estrecho contacto con el paciente. Radioinmunoterapia. Se ha descubierto la existencia de proteínas llamadas anticuerpos que pueden unirse (adherirse) a algunos tipos de células cancerosas, aunque sin unirse a las células normales del cuerpo. Las investigaciones recientes hacen uso de esos anticuerpos al crearlos en grandes cantidades en el laboratorio y unirles físicamente moléculas radioactivas para producir anticuerpos radiomarcados. Cuando se los inyecta en el cuerpo, estos anticuerpos radiomarcados aplican dosis de radiación directamente en el tumor. Dado que los anticuerpos originales provienen de células del sistema inmunológico, este tratamiento se conoce como radioinmunoterapia. Ejemplo: ibritumomab tiuxetan (Zevalin), tositumomab (Bexxar) Radiosensibilizadores y radioprotectores. Ejemplo de radiosensibilizadores: fluorouracilo (5-FU), cisplatino Platinol) Ejemplo de un radioprotector: amifostina (Ethyol). Los tratamientos de radiación no causan dolor. Los efectos secundarios son ordinariamente temporales y la mayoría pueden tratarse y controlarse. Es posible que los pacientes se sientan muy cansados, especialmente en las últimas semanas del tratamiento. La radioterapia puede causar también la disminución del número de glóbulos blancos en la sangre. Con radiación externa, es también común perder el pelo temporalmente en el área tratada y que la piel se ponga roja, reseca, sensible y con comezón. 32 (http://www.cancer.net/) IV.3. QUIMIOTERAPIA. La quimioterapia es el uso de fármacos para destruir células cancerosas en todo el cuerpo. Las células sanas también pueden ser dañadas, especialmente las que se dividen rápidamente. El médico puede usar un fármaco o una combinación de fármacos. Los efectos secundarios de la quimioterapia dependen principalmente de los fármacos y de la dosis que recibe el paciente. La pérdida de pelo es un efecto secundario común de la quimioterapia; sin embargo, no todos los fármacos contra el cáncer causan pérdida de pelo. Los fármacos anticancerosos pueden también causar fatiga temporal, pérdida del apetito, nauseas y vómitos, diarrea, o llagas en la boca y labios. Los fármacos para impedir o reducir las nauseas y vómitos pueden ayudar con algunos de estos efectos secundarios. Las células normales generalmente se recuperan cuando ha terminado la quimioterapia, por lo que la mayoría de los efectos secundarios desaparecen gradualmente después de que termina el tratamiento. En la actualidad se emplea una gran cantidad de fármacos distintos en la quimioterapia. Se eligen en función del tipo de cáncer, su localización, sus efectos antineoplásicos, sus efectos secundarios, etc. Suelen administrarse en combinación para lograr una mayor eficacia. También suelen emplearse en lo que se conoce como “ciclos” o “cursos”, es decir, se administran uno o varios fármacos durante uno o más días y se intercalan periodos de descanso entre varios ciclos de tratamiento, en la tabla 4 se encuentran enlistados los antineoplásicos de acuerdo a su clasificación, estos son los fármacos que actualmente existen en el mercado. Tabla 4. Clasificación de los Fármacos antineoplásicos. www.medicina21.com/ Agentes de Ejemplos. 33 Alquilación Mostasas Nitrogenadas. Mecloretamina,Coclofosfamida e Ifosfamida,Melfalán (L- sarcolisina),Clorambucil. Etileniminas y metilmelaminas. Hexametilmelanina, Tiotepa. Alquilsulfonatos. Busulfán,Nitrosoureas,Carmustina (BCNU),Lomustina (CCNU),Semustina (metil-CCNU), Estreptozocina(estreptozotocina), Triazenos Dacarbazina(DTIC). Antimetabolitos Análogos de ácido fólico. Metotrexato(Ametopteina). Análogos de pirimidina. Fluorouracilo(5-fluorouracilo;5 FU),Floxuridina,Citarabina(arabinósido de citosina. Análogos de purina e inhibidores similares Mercaptopurina,Tioguanina,Penstatina. Productos Naturales. Alcaloides de Vinca. Vinblastina(VLB),Vincristina. Epipodofilotoxinas Etopósido,Tenipósido. Antibióticos. Dactinomicina(actinomicina),Daunorrubicina(daunomicina ;rubidomicina),Doxorrubicina,Bleomicina,Plicamicina(mitr amicina),Mitomicina(mitomicina C). Enzimas. L-Asparaginasa. Modificadores de respuesta biológica. Interferón alfa. Agentes diversos. Platinos complejos por coordinación Cisplatino,carboplatino. Antracendiona. Mitoxantrona. Urea sustitutiva. Hidroxiurea. 34 Derivados de metilhidralazina. Procarbazina(N-metilhidralazina). Supresor de corteza suprarrenal. Mitotano,Amigoglutetimida. Hormonas y Antagonistas. Corticosteroides suprarrenales. Prednisona. Progestágenos Caproato de hidroxiprogesterona,Acetato de medroxiprogesterona,Acetato de megestrol. Estrógenos. Dietilestilbestrol,Etinilestradiol. Antiestrógeno. Tamoxifeno. Andrógenos. Propinatode testosterona,Fluoximesterona. Antiandrógeno Flutamida. Análogo de hormona liberadora de gonadotropina Leuprolida. - Los agentes alquilantes como busulfán, cisplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina, melfalán se emplean en el tratamiento de leucemia crónica, el linfoma no Hodgkin, la enfermedad de Hodgkin, el mieloma múltiple, cánceres de pulmón, mama y ovario. -Las Nitrosureas como carmustina, lomustina se emplean contra tumores cerebrales, linfomas no Hodgkin, mieloma múltiple y melanoma maligno. - Antimetabolitos (5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina, fludarabina). En leucemia crónica, cáncer de mama, ovario y del tracto gastrointestinal. 35 - Antibióticos antitumorales(bleomicina, dactinomicina, daunorrubicina, dosorrubicina, idarrubicina). Indicados en una gran variedad de tumores. - Inhibidores de la mitosis o división celular (paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina, vinorelbina). En numerosos tipos de tumores. - Hormonas asteroideas (prednisona, dexametasona). En leucemias, linfomas y mieloma múltiple, así como en otros tipos de cáncer. - Hormonas sexuales (estrógenos, antiestrógenos, progestágenos y andrógenos). En el cáncer de mama, próstata y endometrio. (www.medicina21.com/) IV.4 TERAPIA HORMONAL Y BIOLOGICA. La terapia hormonal se usa para tratar ciertos cánceres que dependen de hormonas para su crecimiento. La terapia hormonal impide que las células cancerosas utilicen las hormonas que necesitan para crecer. Este tratamiento puede incluir el uso de fármacos que detienen la producción de ciertas hormonas o que cambian la forma cómo funcionan las hormonas. Otro tipo de terapia hormonal es la cirugía para extirpar los órganos que producen hormonas. Por ejemplo, los ovarios pueden ser extirpados para tratar el cáncer de seno. Los testículos pueden ser extirpados para tratar el cáncer de próstata. La terapia hormonal puede causar un número de efectos secundarios. Los pacientes pueden sentirse cansados o retener líquidos, subir de peso, tener bochornos o sofocos, nauseas y vómitos, cambios de apetito y, en algunos casos, coágulos de sangre. La terapia hormonal puede causar también osteoporosis en mujeres premenopáusicas. Dependiendo del tipo de terapia hormonal que se use, 36 estos efectos secundarios pueden ser temporales, durar mucho tiempo o ser permanentes. La terapia biológica utiliza directa o indirectamente el sistema inmune del cuerpo para combatir la enfermedad y puede aminorar algunos de los efectos secundarios del tratamiento contra el cáncer. Los anticuerpos monoclonales, el interferón, la interleucina-2 y los factores estimulantes de colonias son algunos tipos de terapia biológica. Los efectos secundarios causados por la terapia biológica varían con el tratamiento específico. En general, estos tratamientos tienden a causar síntomas parecidos a los de la gripe, como escalofríos, fiebre, dolor de músculos, debilidad, pérdida de apetito, nauseas, vómitos y diarrea. Los pacientes pueden también sangrar o magullarse con facilidad, tener erupciones de la piel o inflamación. Estos problemas pueden ser graves, pero desaparecen cuando termina el tratamiento. (http://www.cancer.gov/clinicaltrials). El conocimiento de nuevas fármacos que inhiben o activan puntos de control permite la designación de estrategias terapéuticas eficientes. Para los cánceres localizados, la inhibición de un punto de control no tiene efecto en las células que simultáneamente no se expusieron a agentes que dañan el ADN, por lo que la radiación local de los cánceres o la acción de agentes citotóxicos facilitará el uso de tales compuestos. Una característica que puede distinguir a los cánceres que son curados con quimioterapia es la capacidad de sanar por un rápido proceso de apoptosis, en respuesta a agentes citotóxicos. Algunos de los genes que regulan la progresión del ciclo celular de la fase G1 a la fase S están involucrados en el control de la apoptosis. Además, la muerte celular por apoptosis ocurre como un balance del control positivo y negativo de las señales de proliferación, lo cual sugiere una participación entre genes que controlan el proceso de apoptosis y el ciclo celular. Estos genes son posibles blancos para la manipulación de la sobrevivencia celular después de la exposición a agentes citotóxicos. http://www.cancer.gov/clinicaltrials 37 Nuevos productos génicos o productos de genes sobrexpresados en cánceres específicos proveen otros blancos potenciales para la terapia contra el cáncer. Si la inestabilidad genómica es una de las condiciones para el desarrollo del cáncer, la reducción de esta inestabilidad ayudaría a prevenirlo. Por ejemplo: p53 es la proteína de control del ciclo celular mejor caracterizada, relacionada con la inestabilidad genética. Mutaciones en p53 parecen ocurrir en etapas tempranas de ciertos cánceres y pueden estar presentes en displasias, pero no en lesiones malignas del epitelio bronquial. La exposición de tales células a agentes que dañan el DNA puede explicar el aumento en la frecuencia de aberraciones genéticas. La prevención del daño al DNA evitaría tales aberraciones. No todo el daño al DNA es causado por agentes exógenos; también se presenta intracelularmente por daño oxidativo que conduce a la célula de normal a maligna. Por lo tanto, la prevención del daño oxidativo posiblemente sería efectiva en el desarrollo del cáncer para retardar o evitar la transformación maligna10. V. COMPUESTOS MORFOLINICOS DERIVADOS DEL FENOL. En 1979 Liangquan mientras examinaban las propiedades antimalariales de derivados de la febribugina notaron al realizar pruebas clínicas que un compuesto, la changrolina (Figura 7), era efectiva como un agente antiarrítmico14. Figura 7. Compuesto de Changrolina, dividido en tres regiones importantes. 38 La molécula de la changrolina puede dividirse en tres regiones (1) región heteroatómica que contiene la quinazolina, (2) región aromática con el bis (pirrolidimilmetil) fenol, (3) región enlazante entre las dos regiones. En 1983 Scout y sus colaboradores. Mostraron gran interés en la changrolina, ya que su estructura era diferente a los productos existentes en el mercado. Así, retomaron la investigación de 1976 de Liangquan y sus colaboradores, modificando cada región en orden para determinar las regiones de la changrolina que son necesarias para que la sustancia en cuestión muestre actividad antiarrítmica14. En 1985 Scout y colaboradores continuaron con las modificaciones de la changrolina. Encontraron que la región 1, la quinazolina, podía ser reemplazada por una variedad de anillos heteroatómicos sin que ello disminuya la actividad mientras que en la región 2 se sustituye la pirrolidina por piperdinas. Se observó que la región 3, que une a las dos primeras, tiene una mayor actividad y una menor toxicidad cuando contiene un grupo carbonilo, incluyendo grupos cetona, amida y urea 15. En 2005 el Laboratorio de Química Medicinal (LQM) de la FES Cuautitlán de la UNAM, dirigido por Enrique Ángeles retoma la investigación de Scout y sintetiza una nueva serie de compuestos piperidínicos , se pretende que estas moléculas presenten actividad biológica como antihipertensivos y menor toxicidad, ya que se realizó el modelaje molecular de los derivados piperidínicos encontrándose que estos compuestos tienen propiedades fisicoquímicas similares a la changrolina y sus derivados 16. V.1. SÍNTESIS DEL COMPUESTO. El compuesto LQM 319 se sintetizo en el Laboratorio de Química Medicinal de la FES CUAUTITLAN C-1 por medio de la reacción estequiométrica entre la tiomorfolina terbutilfenol y el formaldehido utilizando una lámpara de IR como fuente de energía obteniéndose el 2, 6 –bis(tiomorfolinometil)4-terbutilfenol 17. 39 V.2 SOLUBILIDAD DEL COMPUESTO. La solubilidad se define como la concentración de soluto que hay en una solución cuando existe un equilibrio entre el soluto puro y la solución en la cual se encuentre dicho soluto. En concentraciones bajas es difícil determinar de manera analítica, el grado de solubilidad que posee el soluto, en cambio en concentraciones altas no existe problema para determinar la solubilidad del soluto18. El conocimiento de la solubilidad de un fármaco en agua es crítico, ya que de ello depende el desarrollo de la formulación de un producto farmacéutico, un método de análisis y evaluación de la distribución del fármaco en caso de no ser soluble en agua buscar un vehículo adecuado para no tener problemas deliberación-absorción-distribución del fármaco en el organismo 19. V.3. ESTUDIOS REALIZADOS A LOS COMPUESTOS TIOMORFOLÍNICOS. El grupo del Laboratorio de Química Medicinal modeló computacionalmente y luego sintetizó una serie de compuestos morfolínicos y tiomorfolínicos, los cuales teóricamente deberían poseer actividad antiarrítmica. En estudios previos se ha demostrado que estos derivados presentan una actividad biológica, la actividad sobre el ritmo cardiaco de los compuestos sintetizados LQM 301, 304, 305, 308, 309, 310, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 328, 329, y 337 se comparó entre si y su uso propanolol (antiarrítmico clase II) como control positivo, estos estudios se realizaron en el laboratorio de Farmacología del miocardio a cargo de Luisa Martínez en FES-Cuautitlán usando ratas Wistar machos hipertensas, en todos los casos los compuestos mostraron mayor efecto que el control positivo siendo el que presentaba un efecto mayor el LQM 319 . VI. ESTUDIOS PRECLÍNICOS DE NUEVOS FÁRMACOS. 40 Antes de administrar una nueva sustancia con interés farmacéutico a humanos, un candidato a convertirse en fármaco, se llevan a cabo estudios toxicológicos y de seguridad para establecer su perfil farmacológico, mediante ensayos de laboratorio y en animales de experimentación. VI.1.ESTUDIOS PRECLÍNICOS. “Primera línea de defensa”. Para indicar que el medicamento ha sido probado de manera segura en los humanos y su eficacia en algunas enfermedades. Objetivos de los estudios Preclínicos. - Desarrollo y predicción de la Farmacología Humana. - Desarrollo y predicción de la Toxicología Humana. - Predicción farmacocinética del nuevo producto en humanos. - Desarrollo de nuevas formulaciones y formas farmacéuticas. - Farmacología y Toxicología en animales. Se plantean los siguientes criterios: Determinación de la eficacia del nuevo prospecto a fármaco in vitro, in situ e in vivo. En función de la naturaleza química del compuesto establecer objetivos acerca de las posibles acciones farmacológicas que pudiera presentar dicho compuesto. Determinación de las propiedades farmacocinéticas que presente el compuesto durante su administración liberación, absorción, distribución, biotransformación (Metabolismo) y excreción. Pruebas determinantes de toxicidad. 41 Los estudios preclínicos in vitro se realizan en medios de cultivo celulares, tejidos u órganos, para determinar su mecanismo de acción específico en base a la función del nuevo compuesto a la cual fue diseñado. Los estudios preclínicos in vivo se realizan en modelos animales para determinar la eficacia y toxicidad del nuevo compuesto a partir de una dosis específica. La desventaja de estos estudios es que son caros y no son rutinarios. Los objetivos primordiales de los estudios preclínicos consisten en determinar si los protocolos propuestos son razonablemente seguros para iniciar con los estudios clínicos en los humanos y comenzar con la fase I de los estudios clínicos conociendo previamente la dósis terapéutica, la toxicología en función de lo visto con los animales, para establecer y determinar controles de seguridad básicos necesarios para proteger a los voluntarios sanos y a los pacientes. La prueba de toxicidad aguda se realiza a una sola dósis o dósis múltiples en un lapso de 24 horas con el objetivo de determinar cuál es la dosis letal 50, es decir, a que dósis en función al peso corporal, del compuesto existe el 50% de muertes de una población de animales en estudio (DL50) y se realizan estudios histopatológicos. La prueba de toxicidad crónica se hace para determinar el 10% de las muertes de una población de animales en estudio (DL10) y determinar que órganos pueden ser afectados por el nuevo compuesto. La toxicidad reproductiva se evalúa con el fin de analizar los efectos que pudiera producir el nuevo compuesto durante la reproducción, el parto y posibles defectos de nacimiento, generalmente este estudio se realiza en ratas, se divide en tres fases: Fase I. Estudio general de fertilidad y reproducción. Fase II. Estudio de teratogénesis. Fase III. Perinatal/Estudio postnatal. 42 Pruebas de Mutagenicidad, mediante la prueba de AMES se determina el punto de mutación genética, la determinación de linfomas se realiza mediante la mutación de timidina K, presencia de alteraciones cromosómicas, pruebas in vitro de linfocitos humanos, en micronúcleos de ratón y la prueba de dósis letal en roedores. Los estudios de carcinogenicidad se utilizan solamente cuando el nuevo compuesto está destinado al uso prolongado en humanos. Se realiza durante 2 años, en 2 diferentes especies, de preferencia la mayor parte de la vida del animal. Las limitaciones de los estudios preclínicos son, caros demasiado lentos, la extrapolación de los datos de animales a humanos no es confiable, efectos adversos diferentes en cada especie y poco probable de detectarlos. Los estudios en animales no son útiles cuando existen diferencias en la farmacocinética que presenta el nuevo compuesto, y por lo tanto presentar repuestas diferentes a la esperada, a lo cual conlleva a que los estudios se realicen especies que tengan similares características, anatómicas, fisiológicas y genéticas, para validar el modelo adecuado similar y sea reproducible en humanos. La FDA propone los siguientes lineamientos antes de que el compuesto sea evaluado en humanos. 1) Composición y fuente de obtención del nuevo fármaco. 2) Lugar y datos donde se fabrica. 3) Todos los datos arrojados durante los estudios preclínicos. 4) Protocolos de estudio para la Fase Clínica. 5) Nombres de las personas que van a integrar el equipo de trabajo durante los estudios clínicos. VI. 2. ESTUDIOS CLÍNICOS 43 *Los estudios en fase I son el primer paso en la investigación de un nuevo método en humanos. En estos estudios, los investigadores determinan qué dosis se considera segura, cómo se debe administrar el nuevo fármaco (por vía oral, inyectado en una vena o en un músculo), y con qué frecuencia. Los investigadores vigilan muy de cerca cualquier efecto secundario peligroso. Los estudios en fase I incluyen generalmente un número pequeño de pacientes y se realizan en sólo unas pocas localidades. La dosis del tratamiento nuevo o técnica nueva se aumenta poco a poco. Se determina que la dosis mayor con un nivel aceptable de efectos secundarios es apropiada para seguir haciendo pruebas. Los estudios en fase II investigan la seguridad y la efectividad de un fármaco o intervención, y evalúan cómo afecta al cuerpo humano. Los estudios en fase II generalmente se enfocan en un tipo de cáncer en particular e incluyen menos de 100 pacientes. Los estudios en fase III comparan un fármaco nuevo o una nueva intervención (o un nuevo uso de lo que se considera ya aceptado) con el tratamiento aceptado en uso. Los participantes son asignados al azar al grupo del tratamiento aceptado o al grupo del tratamiento nuevo, generalmente por medio de una computadora. Este método, llamado distribución aleatoria, ayuda a mantener la imparcialidad y asegura que las decisiones humanas u otros factores no afecten los resultados del estudio. En la mayoría de los casos, los estudios pasan a las pruebas en fase III sólo después de haber mostrado ser prometedores en las fases I y II. Los estudios en fase III pueden incluir a un gran número de personas en todo el país. Los estudios en fase IV se realizan para evaluar más a fondo la seguridad y la efectividad del tratamiento a largo plazo. Casi siempre se realizan después de que el tratamiento haya sido aprobado para uso estándar. Varios cientos o miles de personas pueden tomar parte en un estudio en fase IV. Estos estudios son menos comunes que los de fase I, II ó III. Después de que termina el estudio, los investigadores examinan cuidadosamente
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