Elaboracion-y-caracterizacion-de-una-formulacion-de-inmunoliposomas-cargados-con-cis-diaminodicloroplatinoII-cisplatino

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MEXICO 
 
 
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO EN CIENCIAS QUÍMIC AS 
 
 
 
“ELABORACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA FORMULACIÓN DE 
INMUNOLIPOSOMAS CARGADOS CON CIS-DIAMINODICLOROPLATINO (II) 
(CISPLATINO)” 
 
 
 
TESIS 
 
PARA OPTAR POR EL GRADO DE 
 
 
DOCTOR EN CIENCIAS 
 
 
 
PRESENTA 
 
M. en C. HÉCTOR VÁZQUEZ BECERRA 
 
 
 
TUTOR 
 
DR. LUIS A. MEDINA VELÁZQUEZ 
 
INSTITUTO DE FÍSICA, UNAM 
 
 
 
CIUDAD DE MÉXICO, MÉXICO. ENERO DE 2017. 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página ii 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se desarrolló en el laboratorio de Física Médica 
de la Unidad de Investigación Biomédica en Cáncer INCan –IFUNAM, 
dentro del Instituto Nacional de Cancerología de la Ciudad de 
México, México. Bajo la dirección del Dr. Luis Alberto Medina 
Velázquez, contando con el apoyo económico de un beca otorgada 
por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). 
Número de Becario: 206999. 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página iii 
 
PUBLICACIÓN, ESTANCIA Y CONGRESOS 
 
Vázquez-Becerra H , Pérez-Cárdenas E, Muñiz-Hernández S, Izquierdo-Sánchez V, 
Medina LA. “Characterization and in vitro evaluation of nimotuzumab conjugated with 
cisplatin-loaded liposomes”. Journal of Liposome Research. Jul 21:1-9 (2016). DOI: 
10.1080/08982104.2016.1207665. 
 
Estancia 
 
Instituto Finlay, Departamento de Investigaciones y Desarrollo. La Habana, Cuba; 
Enero 2012. 
 
Presentaciones Orales 
 
“Development & characterization of immunoliposomes loaded with cisplatin”. 
QuimiUNAM, UNAM, México; 2013. 
 
“Elaboración y caracterización de una formulación de inmunoliposomas cargados con 
cisplatino”. 2º Congreso de Posgrado, UNAM, México; 2012. 
 
Presentación de Póster en Congresos 
 
 “Elaboración y caracterización de una formulación de inmunoliposomas anti-EGFR 
cargados con cisplatino” (Premio al 2º lugar). 4ª Reunión anual de Investigación en 
Cáncer. Instituto Nacional de Cancerología, México; 2015. 
 
“Elaboración, caracterización y evaluación citotóxica de una formulación de 
inmunoliposomas cargados con cisplatino”. 2ª Reunión anual de Investigación en 
Cáncer. Instituto Nacional de Cancerología, México; 2011. 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página iv 
 
AGRADECIMIENTOS ESPECIALES 
 
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT , No. 206999) por la 
beca doctoral otorgada. 
 
Al Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e In novación 
Tecnológica , PAPIIT-UNAM (proyectos IN-225014 e IN-209916) por las becas 
para la realización de esta investigación. 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y al Posgrado en 
Ciencias Químicas , por albergarme en ellos y brindarme la oportunidad de 
adquirir conocimientos científicos, valores humanos, técnicas y el deseo de 
aprender más y mejor cada día. 
 
Al Instituto Nacional de Cancerología (INCan), a su personal y particularmente 
a la Subdirección de Investigación Básica y el Laboratorio de Física Médica por 
todo el apoyo humano, científico y material, ofrecido durante la realización de 
este trabajo. 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página v 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Dr. Luis A. Medina Velázquez por su tutoría y soporte académico para la 
realización de este proyecto. 
 
A los miembros del Comité Tutoral: 
Dr. Jesús Gracia Fadrique y Dr. David Quintanar Guerrero. 
Por sus observaciones y sugerencias en el planteamiento, desarrollo y 
conclusión del presente trabajo. 
 
A los co-autores del artículo, producto de esta investigación: Dr. Enrique Pérez 
Cárdenas, Dra. Saé Muñiz Hernández y M. en C. Vanessa Izquierdo Sánchez. 
Por sus aportaciones y trabajo científico, gracias al cual fue posible dicha 
publicación. 
 
A los miembros del Jurado: Dra. Lena Ruíz Azuara. 
Dr. David Quintanar Guerrero. Dra. María Josefa Bernard Bernard. 
Dr. Pablo Gustavo Damián Matsumura. Dra. Alejandra Hernández Santoyo. 
Por los comentarios, correcciones y aportes para la mejora de esta tesis. 
 
Al Dr. Alejandro Alagón Cano, la Dra.Patricia García López y la Dra. Gilmara 
Pimentel por sus contribuciones académicas y observaciones a este proyecto. 
 
Al Instituto Finlay (La Habana, Cuba) y al Técnico superior en Investigación 
Oscar Otero Alfaro, por las facilidades y apoyo para llevar a cabo una estancia 
de investigación así como para la realización de experimentos. 
 
Al Instituto de Biotecnología-UNAM y al Biólogo Felipe Olvera Rodríguez, por las 
facilidades otorgadas y la asesoría para la realización de experimentos. 
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ÍNDICE 
1. RESUMEN. ............................................................................................................... 1 
2. LISTA DE ABREVIATURAS. .................................................................................... 2 
3. INTRODUCCIÓN. ..................................................................................................... 4 
4. ANTECEDENTES. .................................................................................................... 6 
4.1. Cáncer, un problema de salud pública. .............................................................. 6 
4.2. Tratamiento del cáncer. ..................................................................................... 9 
4.3. Cisplatino. ........................................................................................................ 11 
4.4. Liposomas como vectores de transporte y liberación de fármacos. Mecanismos 
pasivos de entrega. .................................................................................................... 12 
4.5. Dianas o blancos moleculares. ........................................................................ 14 
4.6. EGFR, su implicación en el desarrollo del cáncer. ........................................... 15 
4.7. Anticuerpos monoclonales anti-EGFR. ............................................................ 17 
4.8. Nimotuzumab. .................................................................................................. 18 
4.9. Inmunoliposomas (ILs). .................................................................................... 20 
5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. .................................................................... 23 
6. HIPÓTESIS............................................................................................................. 23 
7. OBJETIVO GENERAL. ........................................................................................... 24 
7.1. Objetivos específicos. ......................................................................................24 
8. MATERIALES. ........................................................................................................ 25 
9. METODOLOGÍA. .................................................................................................... 26 
9.1. Preparación de inmunoliposomas (ILs). ........................................................... 26 
9.1.1. Preparación de liposomas cargados con cisplatino. .................................. 26 
9.1.2. Remoción del fármaco no encapsulado. ................................................... 26 
9.1.3. Marcaje de Nimotuzumab. ......................................................................... 27 
9.1.4. Derivatización del mAb. ............................................................................. 28 
9.1.5. Deacetilación de grupos –SH. ................................................................... 29 
9.1.6. Purificación de mAb derivatizado. ............................................................. 30 
9.1.7. Conjugación de mAb a liposomas. ............................................................ 30 
9.1.8. Purificación de ILs. .................................................................................... 31 
9.2. Determinación de la concentración de anticuerpo. .......................................... 32 
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9.2.1. Ensayo Bradford para cuantificación de proteínas. ................................... 32 
9.2.2. Ensayo BCA para cuantificación de proteínas. .......................................... 33 
9.3. Determinación de la concentración de grupos sulfhidrilo en el mAb. ............... 34 
9.4. Caracterización de liposomas. ......................................................................... 35 
9.4.1. Determinación del tamaño de partícula. .................................................... 35 
9.4.2. Potencial zeta (ξ). ...................................................................................... 35 
9.4.3. Concentración de fosfolípidos. .................................................................. 36 
9.4.4. Concentración de CDDP encapsulado. ..................................................... 37 
9.5. Estabilidad de encapsulación de CDDP en liposomas. .................................... 38 
9.6. Ensayos de afinidad in vitro. ............................................................................ 39 
9.7. Líneas celulares. .............................................................................................. 40 
9.8. Análisis de la expresión de EGFR. ................................................................... 41 
9.9. Unión e internalización celular de ILs. .............................................................. 42 
9.10. Análisis estadístico. ...................................................................................... 43 
10. RESULTADOS. ................................................................................................... 44 
10.1. Marcaje y derivatización de nimotuzumab y funcionalización de liposomas. 44 
10.2. Purificación de ILs. ........................................................................................ 46 
10.3. Caracterización de liposomas-CDDP e ILs-CDDP. ....................................... 47 
10.4. Perfil de liberación de CDDP. ....................................................................... 48 
10.5. Ensayos ELISA. ............................................................................................ 49 
10.6. Expresión de EGFR, unión a células e internalización de ILs. ...................... 50 
11. DISCUSIÓN DE RESULTADOS. ........................................................................ 53 
12. CONCLUSIONES. ............................................................................................... 56 
13. REFERENCIAS. .................................................................................................. 57 
 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página ix 
 
ABSTRACT 
 
In spite of the proven advantages of liposomal formulations versus conventional drugs 
in cancer treatment and other diseases, these systems are still unspecific, which limits 
its therapeutic effectiveness. In some cancer types, like carcinomas, the overexpression 
of certain receptors has given rise to the design of directed therapy systems based on 
such molecules. 
 
This work reports the conjugation of the monoclonal humanized antibody nimotuzumab, 
directed against the epidermal growth factor receptor (EGFR) and pegylated liposomes 
charged with the antineoplastic drug cisplatin. The in vitro evaluation of the system 
affinity to cancerous cells is also reported. The conjugation was developed by 
derivatization of nimotuzumab with N-succinimidyl S-acetiltioacetate (SATA), followed 
by the covalent union with the maleimide groups present in the terminal positions of the 
chains of PEG-mal; 1,2-diasteroyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamine-N-[maleimide 
(polyethylene glycol)-2000], a phospholipid found in the membrane of liposomes. 
Using techniques like confocal laser scanning microscopy and ELISA immunoassays 
the affinity of the immunoliposomes to their EGFR antigen was evaluated in the human 
cell lines of epidermoid carcinoma (A-431) and a normal lung fibroblast cell line (MRC-
5). 
Results showed that the implemented procedures in this work didn't affect the capacity 
of the nimotuzumab-immunoliposomes system to recognize the tumor cells based on 
the overexpression of EGFR. 
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1. RESUMEN. 
 
A pesar de las ventajas que han demostrado las formulaciones liposomales frente a los 
fármacos convencionales en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades, estos 
sistemas siguen siendo inespecíficos, situación que limita su eficacia terapéutica. En el 
caso de algunos tipos de cáncer como carcinomas, la sobreexpresión de ciertos 
receptores ha dado lugar al diseño de sistemas de terapia dirigida basada en dichas 
moléculas. 
 
En este trabajo se reporta la conjugación del anticuerpo monoclonal humanizado 
nimotuzumab, dirigido contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y, 
liposomas pegilados cargados con el fármaco antineoplásico cisplatino, así como la 
evaluación in vitro de la afinidad del sistema por células cancerosas. La conjugación 
fue desarrollada mediante la derivatización de nimotuzumab con N-succinimidil S-
acetiltioacetato (SATA) seguida de la unión covalente con los grupos maleimido 
presentes en los posiciones terminales de las cadenas del PEG-mal; 1,2-diasteroil-sn-
glicero-3-fosfoetanolamina–N-[maleimido (polietilenglicol)-2000], fosfolípido localizado 
en la membrana de los liposomas. 
 
Mediante técnicas como microscopía confocal láser de barrido e inmuno ensayos 
tipo ELISA se evaluó la afinidad de los inmunoliposomas por su antígeno: el EGFR, en 
líneas humanas de carcinoma epidermoide (A-431) y una línea normal de fibroblastos 
de pulmón (MRC-5). 
 
Los resultados mostraron que los procedimientos implementados en este trabajo no 
afectaron la capacidad del sistema nimotuzumab-inmunoliposomas, para ejercer un 
reconocimiento de las células tumorales basado en la sobre expresión del EGFR. 
 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 2 
 
2. LISTA DE ABREVIATURAS. 
 
1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina–N-[maleimido (polietilenglicol)-2000] 
(Sal de amonio) (PEG-mal) 
1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina–N-[metoxi (polietilenglicol)-2000] 
(Sal de amonio) (m-PEG) 
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina–N-[lisamina rodamina B sulfonil] 
(Sal de amonio) (Rhod) 
Ácido 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico)(DTNB) 
Ácido bicinconínico (BCA) 
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 
American Type Culture Collection (ATCC) 
Análisis de varianza (ANOVA) 
Anticuerpo monoclonal (mAb) 
Cis-diaminodicloroplatino (II), Cisplatino, (CDDP) 
Colesterol (Chol), 
Desviación estándar (DE) 
Dulbecco’s Modified Essential Medium-F12 (DMEM-F12) 
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) 
Eficiencia de carga (LE) 
Eficiencia de encapsulación (EE) 
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) 
Federal Drug Association (FDA) 
Inmunoglobulina G (IgG) 
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Inmunoliposomas (ILs) 
Instituto Nacional de Estadística y Geografía (INEGI) 
Isómero I del isotiocianato de fluoresceína (FITC) 
L-α-fosfatidilcolina hidrogenada de soya (HSPC), 
N, N-dietilditiocarbamato (DDTC) 
N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA) 
Organización Mundial de la Salud (OMS) 
Polifluoruro de vinilideno (PVDF) 
Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) 
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 
Suero fetal bovino (SFB) 
 
 
 
 
 
 
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3. INTRODUCCIÓN. 
 
Una de las principales limitantes en el uso de los fármacos quimioterapéuticos y de 
algunos acarreadores de fármacos, como los liposomas, es la falta de especificidad por 
células tumorales. El uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) unidos a liposomas 
cargados con fármacos ofrece una aproximación de direccionamiento específico contra 
células cancerosas, con gran potencial para incrementar las aplicaciones terapéuticas 
de los liposomas. De hecho, la conjugación de los mAbs con liposomas (sistemas 
conocidos como inmunoliposomas) ha sido propuesta como la siguiente generación de 
los sistemas liberadores de fármacos (1-5) en los que se combinan un acarreador 
(liposoma) estable y robusto, con un mAb capaz de proveer alta afinidad por un 
receptor bien definido, con lo que es posible transportar de manera específica uno o 
más fármacos hasta las células blanco. 
 
Durante las últimas dos décadas, diversas formulaciones de inmunoliposomas (ILs) han 
sido desarrolladas y ampliamente estudiadas; sin embargo, el desarrollo de las 
investigaciones en este rubro ha estado limitado a ensayos pre-clínicos (6-13) y, 
después de todos estos años, ninguna formulación de inmunoliposomas ha sido 
aprobada para su uso en pacientes. Esta situación podría explicarse como una 
consecuencia de la aparición de reacciones inmunogénicas asociadas al uso de 
anticuerpos monoclonales obtenidos a partir de roedores. Afortunadamente y gracias a 
la producción de mAbs de tipo quimérico y humanizado dichas limitantes 
inmunogénicas han sido resueltas (14, 15), dando inicio a una nueva generación de ILs 
para la práctica oncológica. 
 
Por otra parte y gracias a diversas investigaciones, antígenos ubicados en la 
membrana de las células tumorales, que se encuentran ausentes o sub-expresados en 
células normales, se han establecido como los principales blancos o dianas de los 
inmunoliposomas. Por ejemplo, el receptor del factor de crecimiento epidérmico 
(EGFR) exhibe una marcada expresión en células tumorales provenientes de diferentes 
órganos o tejidos; dicha sobre-expresión ha sido correlacionada con un mal pronóstico 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
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y rápida progresión de la enfermedad. El EGFR ha sido propuesto como un buen 
blanco o diana molecular para los inmunoliposomas (3, 8, 9, 16, 17); y recientemente, 
diversos investigadores han reportado el uso de mAbs quiméricos anti-EGFR 
(cetuximab, panitumumab, etc.) para la preparación de ILs que han sido evaluados en 
estudios de nivel pre-clínico e incluso ensayos clínicos (8, 9, 18). 
 
Un nuevo mAb humanizado anti-EGFR, denominado nimotuzumab (CIMAher, CIMAB 
S.A., La Habana, Cuba), ha demostrado tener una actividad antitumoral similar a la de 
cetuximab y panitumumab, pese al hecho de que los fragmentos monovalentes F(ab’) 
de nimotuzumab poseen 10 veces menos afinidad por los dominios extracelulares de 
EGFR, que los dominios F(ab’) de cetuximab. Se ha reportado que nimotuzumab 
requiere unirse con ambos “brazos” o extremos F(ab’) para alcanzar un acoplamiento 
estable a la superficie celular, lo cual le permite unirse preferentemente a células con 
alta expresión de EGFR, esto es: mayor unión a células tumorales respecto a las 
células normales, que expresan niveles basales de EGFR (19-21). Esta unión 
característica de nimotuzumab podría favorecer un incremento de la especificidad con 
la que inmunoliposomas liberan fármacos en células tumorales con sobre-expresión de 
EGFR. 
 
En este trabajo, se reporta un procedimiento para la conjugación del anticuerpo 
monoclonal nimotuzumab con liposomas que contienen una carga de cisplatino, así 
como la evaluación in vitro de su habilidad para diferenciar células sanas de células 
cancerosas, que poseen alta densidad del receptor de EGF. 
 
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4. ANTECEDENTES. 
 
4.1. Cáncer, un problema de salud pública. 
 
El cáncer constituye un conjunto amplio de enfermedades que consisten en un 
sistema renegado de crecimiento que se origina dentro del biosistema de un paciente. 
De manera normal, las células humanas crecen y se dividen para formar nuevas 
células a medida que el cuerpo las necesita. Cuando las células normales envejecen o 
se dañan, mueren dentro de un periodo de tiempo programado, y células nuevas las 
remplazan. Sin embargo, en el cáncer, este proceso ordenado se descontrola. A 
medida que las células se hacen más y más anormales, las células viejas o dañadas 
sobreviven cuando deberían morir, y células nuevas se forman cuando no son 
necesarias. Estas células adicionales pueden dividirse sin interrupción y pueden 
formar masas de tejidos (ver Figura 1 ) denominadas “tumores” o “neoplasias”, que en 
su expansión destruyen, dañan y/o sustituyen a los tejidos normales (22). 
 
 
Figura 1. Representación de un tejido normal y una masa tumoral. Células normales se muestran 
con una distribución y apariencia uniformes, mientras que las células cancerosas 
presentan una distribución desordenada y una morfología alterada que dista de la forma 
original de la estirpe celular representada. 
 
Células cancerosas Células normales 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 7 
 
Se han identificado al menos 100 tipos diferentes de cáncer según el tejido en el que 
se ha originado, pero todos comparten una característica en común: el crecimiento 
descontrolado de las células que progresa hacia la expansión sin límites (23). El 
cáncer puede originarse casi en cualquier parte del cuerpo. De manera general, los 
tipos de cáncer se clasifican en: carcinomas, sarcomas, linfomas y leucemias. Las 
células cancerosas poseen la capacidad de invadir el tejido a su alrededor y 
diseminarse a otros órganos del cuerpo mediante dos mecanismos: invasión y 
metástasis (Figura 2 ). La metástasis es la habilidad de las células cancerosas para 
penetrar en los vasos linfáticos y sanguíneos, y posteriormente invadir tejidos 
normales en otras partes del cuerpo (22, 24). 
 
 
Figura 2. Formas de propagación del cáncer. Arriba a la izquierda, invasión de tejidos normales 
vecinos. Arriba a la derecha, migración de células a través de los vasos sanguíneos. 
Abajo a la izquierda, ingreso de células cancerosas a tejido normal distante mediante 
un defecto en las paredes capilares. Abajo a la derecha, ejemplo de tumor primario en 
intestino y metástasis en hígado. 
Células 
cancerosas 
escapande 
los vasos 
sanguíneos a 
través de los 
espacios 
capilares 
Células normales Invasión del tumor a 
otros tejidos 
Célula 
cancerosa 
migrando a 
través de vasos 
sanguíneos 
Membrana 
basal 
Células cancerosas 
irrumpen a través de 
la membrana 
Células cancerosas 
pueden separarse y 
propagarse a otro 
sitio 
Células 
normales 
en tejido 
distante 
 
Cáncer primario 
en el intestino y 
metástasis en 
hígado 
 
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En los últimos años, el cáncer se ha establecido como un problema de salud pública 
de gran importancia dada su alta incidencia y su inminente porcentaje de mortalidad. 
Según los reportes más recientes de la Organización Mundial de la Salud (OMS), en el 
año 2012 se suscitaron 14 millones de nuevos casos de cáncer y aproximadamente 
8.2 millones de muertes estuvieron relacionadas con este padecimiento (25-27), 
representando el 13% del total de defunciones en ese año. Se estima que en el año 
2020 el cáncer podría matar a 10.3 millones de personas y que el aumento de casos 
podría ser hasta del 50% en los próximos 20 años (28). 
 
En México, el Instituto Nacional de Estadística y Geografía reportó que en el año 
2013, del total de defunciones de la población de 20 años y más, 13.6% se debieron a 
algún tumor y de éstas, 93.6% a tumores malignos (29); así mismo, las diferentes 
neoplasias representaron 48.8% de las muertes en varones y 51.2% en mujeres 
 
Los tipos de cáncer diagnosticados con mayor frecuencia en hombres fueron los de 
pulmón, próstata, colon y recto, estómago e hígado. Mientras que en mujeres, las 
neoplasias de mama, colon y recto, pulmón, cuello uterino y estómago fueron las de 
mayor incidencia (27) (ver Figura 3 ). La información anterior indica que los 
carcinomas son el tipo de cáncer con mayor morbilidad (cerca del 85% del total de 
casos) y mortalidad registrada en adultos (26, 27). 
 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
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Figura 3. Porcentaje de morbilidad hospitalaria en población de 20 años y más por principales 
tumores malignos según sexo. Según el reporte del INEGI (México) del año 2013. (29). 
 
4.2. Tratamiento contra el cáncer. 
 
Actualmente, la terapia contra el cáncer, especialmente para el tratamiento de los 
carcinomas involucra mayoritariamente procedimientos invasivos que presentan 
limitantes importantes. Los tratamientos convencionales pueden incluir cirugía, 
radioterapia, quimioterapia; además de, inmunoterapia, terapias biológicas dirigidas y 
terapias hormonales, estas últimas usadas sobre todo como estrategias 
complementarias (30). 
 
La cirugía es utilizada, en aquellos casos en que el cáncer parece estar restringido 
(localizado) a una zona específica, pudiéndose tratar de una cirugía para extirpar 
únicamente el tumor, o bien, una intervención quirúrgica de mayor impacto que incluya 
la remoción de tejido aledaño que pudiera contener células transformadas. Este tipo de 
terapia ofrece un buen pronóstico, siempre y cuando la neoplasia no se haya 
propagado a otras zonas del cuerpo, es decir, cuando no existe un proceso 
metastásico. 
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La radioterapia posee una aplicación más amplia, al ser utilizada no sólo en neoplasias 
localizadas sino también en tumores que muestran resistencia a la quimioterapia y en 
aquellos sitios en los que se sospecha existe una metástasis en desarrollo. El efecto de 
la radiación recae, no sólo en células cancerosas, sino también en células normales, 
impactando directamente en el proceso de división/replicación celular y causando 
efectos secundarios importantes. En la clínica, la radioterapia se usa de manera aislada 
o adyuvante con cirugía y/o quimioterapia y más del 50% de los pacientes con cáncer 
reciben tratamiento de radiación en alguna ocasión durante su atención hospitalaria. 
 
La quimioterapia es uno de los tratamientos mayormente aplicados para los diferentes 
tipos de cáncer y, en términos generales, consiste en la administración de sustancias 
con actividad farmacológica cuya objetivo es inducir la apoptosis o generar algún daño 
importante, en las células cancerosas, que impida su replicación (23). Los fármacos 
utilizados presentan mecanismos muy diversos para llevar a cabo su función e 
igualmente, los efectos secundarios producidos por dichas sustancias así como la 
tolerancia mostrada por los pacientes ante estos es muy variable. A pesar de ello y de 
los avances en las últimas décadas en cuanto a nuevas alternativas de tratamiento se 
refiere (31, 32), la estrategia estándar sigue siendo la quimioterapia (30, 33) basada 
en fármacos como cisplatino, antraciclinas, derivados del taxol, etc. 
 
Cabe señalar que si bien la quimioterapia ha tenido éxito en el tratamiento de muchos 
de los tumores malignos, esta terapia es causante de efectos como toxicidad 
sistémica, inmunosupresión, debilitamiento funcional y daño cosmético. Estos efectos 
afectan en gran medida a los pacientes y son debidos a la falta de especificidad y a la 
distribución sistémica indiscriminada de los fármacos antineoplásicos administrados. 
En este sentido, el cis-diaminodicloroplatino(II) (cisplatino), es probablemente uno de 
los fármacos más utilizados para tratar varios tipos de cáncer, dada su gran eficacia, 
alcanzando porcentajes de remisión de la enfermedad de hasta el 90% en ciertos 
casos (34). No obstante, la terapia basada en cisplatino está limitada por la resistencia 
intrínseca y adquirida de las células tumorales hacia el fármaco así como por los 
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efectos secundarios severos en tejidos específicos (por ejemplo en el riñón) (34, 35). 
Más del 60% de pacientes tratados con cisplatino desarrollan pérdida irreversible de la 
capacidad auditiva (35-37) y más del 70% experimentan deficiencia renal aguda(38). 
 
4.3. Cisplatino. 
 
Desde su aprobación por la FDA en 1978, el cisplatino (CDDP) o cis-
diaminodicloroplatino(II) se convirtió en uno de los fármacos de uso más recurrente en 
la quimioterapia. El CDDP es un complejo metálico de coordinación con geometría 
plana cuadrada y poca solubilidad en agua (34), tiene un peso molecular de 301.1 
g/mol y es estable en condiciones normales de temperatura y presión (39). Fue 
sintetizado por primera vez por M. Peyrone en 1844 y su estructura química fue 
elucidada hasta 1893 por Alfred Werner. En 1965, Rosenberg y colaboradores 
observaron que al hacer pasar una corriente eléctrica entre dos electrodos de platino, 
se inhibía el crecimiento de Escherichia coli debido a la formación de compuestos de 
platino inorgánico, siempre que hubiera iones amonio y cloruro presentes en el medio 
(40). Poco después se comprobó que el CDDP era el compuesto responsable de esta 
actividad generándose gran interés en el uso de esta clase de moléculas en el 
tratamiento del cáncer (41). El cisplatino ha sido aprobado para el tratamiento de 
diferentes tipos de cáncer incluyendo sarcomas, carcinomas, cáncer de tejidos blandos, 
de hueso, músculos y vasos sanguíneos (42). 
 
Como ya ha sido mencionado, aunque el uso de este agente de quimioterapia ha 
permitido un mejor pronóstico, existen problemáticas importantes a resolver, por 
ejemplo: la resistencia al fármaco, desarrollada por las células de manera inmediata o 
después de cierto tiempo de tratamiento; efectos secundarios considerables y baja 
eficiencia terapéutica originada por su inespecificidad (43). Como alternativa y a fin de 
mejorar las características de biodistribución y parámetros farmacocinéticos, así como 
disminuir los principales efectos secundarios del CDDP (nefrotoxicidad,cefalea, 
ototoxicidad, etc.), diferentes transportadores y sistemas de liberación de dimensiones 
nanométricas, como los liposomas, han sido utilizados (44-46). Los liposomas han 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 12 
 
demostrado su capacidad como acarreadores eficientes de una gran variedad de 
fármacos anticancerosos y, en los últimos años, los esfuerzos en el desarrollo de 
suspensiones liposomales de CDDP han dado lugar a una gran cantidad de 
formulaciones con resultados alentadores en cuanto a baja toxicidad se refiere (47, 48). 
En contra parte, ninguna de estas formulaciones mostró un incremento sustancial en la 
eficiencia terapéutica, probablemente debido a que los liposomas no son por sí 
mismos, sistemas dirigidos, o bien; porque a pesar de alcanzar el sitio blanco, no 
lograron liberar eficientemente su carga terapéutica al interior de las células. 
 
4.4. Liposomas como vectores de transporte y liberación de fármacos. Mecanismos 
pasivos de entrega. 
 
En las últimas décadas se han desarrollado una gran cantidad de investigaciones para 
llevar a cabo el transporte de fármacos, agentes de imagen y/o diagnóstico mediante 
nanosistemas. La fuerza impulsora de muchas de estas investigaciones fue el 
descubrimiento del mecanismo de retención y permeabilidad incrementadas en los 
sitios tumorales, conocido como efecto EPR por sus siglas en inglés (Enhanced 
Permeability and Retention) y descrito por primera vez por Maeda y colaboradores 
(49). Según este modelo, los medicamentos modificados con vehículos 
macromoleculares o encapsulados en nanovehículos, son capaces de retrasar la 
depuración, incrementando el tiempo de vida media plasmática y pudiendo difundir 
pasivamente a través del tejido tumoral debido al estado híper-permeable del tumor 
asociado a la vasculatura, además de permanecer retenidos en el tejido tumoral 
debido a la falta de un sistema linfático (50-52). Los vehículos nanométricos como los 
liposomas (50 – 200 nm) quedan entonces retenidos (Figura 4 ), pudiendo actuar 
como depósitos de liberación del fármaco y, dependiendo de su composición, la carga 
eléctrica superficial y otros factores, también pueden llegar a ser internalizados en las 
células tumorales a través de procesos pasivos mediados por la membrana celular 
(53). Haciendo uso de este mecanismo se desarrollaron dos de las formulaciones 
liposomales más relevantes en el tratamiento del cáncer: Doxil®, formulación 
liposomal de doxorrubicina aprobada en 1995 por la U.S. Food & Drug Aministration 
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(FDA) y Abraxane®, paclitaxel formulado en nanopartículas de albúmina, aprobado 
por la FDA en 2006) (54, 55). A la fecha, los mecanismos pasivos de EPR siguen 
siendo un parámetro de diseño crítico para la entrega de fármacos a tumores. 
 
Aunque el mecanismo EPR facilita la acumulación de carga terapéutica en el lecho 
tumoral, éste no garantiza que la acumulación no suceda en tejidos sanos ni que la 
carga de los liposomas ingrese a las células tumorales, debido a que la internalización 
celular es dependiente de los procesos de membrana mediados por factores espacio-
temporales (53). Estos procesos no se pueden producir de una manera controlada y 
consistente y, con el tiempo, puede existir una acumulación de vehículos dentro del 
estroma tumoral resultando en un gradiente inverso de permeación. Debido a estas 
posibilidades se ha estudiado la incorporación de mecanismos adicionales para 
facilitar la internalización. Una de las estrategias más prometedoras es el 
favorecimiento de la endocitosis mediada por receptores (56). Las células tumorales 
se caracterizan por regular una variedad de receptores en su superficie, así como por 
la unión de ligandos innatos a estos receptores, promoviéndose una multitud de 
cascadas de señalización que favorecen la proliferación y el crecimiento del tumor, la 
angiogénesis, la supervivencia en diferentes niveles de oxígeno y condiciones de pH, 
resistencia a la apoptosis y la metástasis (57). Por lo tanto, nanovehículos dirigidos 
mediante la modificación de su superficie, con ligandos específicos de tales 
receptores, proporcionan una manera de explotar los mecanismos de endocitosis 
mediada por los receptores activos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 4. A la izquierda, liposoma pegilado con una carga de fármaco. A la derecha, efecto de 
permeabilidad y retención incrementadas o efecto EPR por sus siglas en inglés (Enhanced 
Permeability and Retention). En la figura se ejemplifica el ingreso de liposomas u otro 
nanosistema a la zona tumoral a través de las fenestraciones o defectos en la vasculatura, 
así como su retención debida al drenaje linfático deficiente. 
 
4.5. Dianas o blancos moleculares. 
 
Los nanosistemas direccionados, pueden favorecer el depósito de principios activos 
en el sitio de la enfermedad a través de una interacción entre un ligando conjugado 
(normalmente a su superficie) y las dianas o receptores expresados por las células 
blanco (58). La conjugación entre el ligando y una molécula de fármaco puede llevarse 
a cabo con o sin un “enlazador” que a su vez puede o no tener algún papel en la 
identificación del receptor (59). El término “receptor”, en este caso, se usa para 
generalizar todos aquellas proteínas con dominios extramembranales a las que se 
pueden unir distintos ligandos, incluyendo mAbs y sus fragmentos, proteínas o 
glicoproteínas, péptidos, canales iónicos, ligandos de ácidos nucleicos (como 
aptámeros), moléculas pequeñas y azúcares (60). Por tanto, los fármacos cargados 
en un nanoacarreador direccionado, podrían llegar a ser liberados selectivamente en 
las células blanco o bien, en la propia vasculatura de un tumor (61). 
 
Cadenas de 
polietilenglicol 
(PEG) 
Fármaco hidrosoluble. Zona 
acuosa. 
Bicapa lipídica. 
Zona hidrofoba 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 15 
 
Entre las dianas moleculares que han sido aprovechadas para el diseño de esta clase 
de sistemas se encuentran blancos que no poseen un efecto terapéutico per se, pero 
que brindan la oportunidad de dirigir un sistema, bajo ciertas condiciones, basados en 
la sobre expresión que estos muestran en ciertas células. Tal es el caso de los 
receptores de folato, transferrina, lipoproteínas de baja densidad, CD44 (clúster de 
diferenciación 44), asialoglicoproteínas (receptores de galactosa) y lectina (62). 
 
Junto con la progresión de los tumores, nuevos vasos sanguíneos son formados y 
más nutrientes son requeridos, dando lugar a que algunos receptores se expresen de 
novo o bien, que se sobre expresen en la superficie de las células para aceptar y/o 
liberar dichos nutrientes. A estos receptores los llamaremos blancos terapéuticos (62), 
ya que mediante el bloqueo de estos receptores, la enfermedad puede incluso llegar a 
ser curada. Es decir, la interacción de estos receptores con los ligandos no sólo 
incrementa la selectividad y afinidad entre el nanosistema y las células, sino también 
produce un efecto terapéutico. Entre los receptores más importantes se encuentran el 
del Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular (VEGF), aminopeptidasa (CD13), 
integrinas, somatostatina, y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). 
El EGFR ha sido bastamente estudiado hacia los últimos años al manifestar dos 
características indispensables para que una molécula se convierta en una buena 
diana terapéutica: expresión o sobre expresión diferenciada respecto a células 
normales, y poseer una relación causal y/o de pronóstico con la enfermedad. 
 
4.6. EGFR, su implicaciónen el desarrollo del cáncer. 
 
El nivel de expresión de EGFR en células cancerosas puede ser uno o más órdenes 
de magnitud superior al nivel mostrado por células normales. Esta diferencia es aún 
más evidente en una variedad de tumores epiteliales (carcinomas), en donde su 
contribución a la transformación maligna y su asociación a un mal pronóstico han sido 
demostradas (63-65). En los fibroblastos (células normales), por ejemplo, la expresión 
de EGFR va de los 40,000 a los 100,000 receptores por célula (66, 67) mientras que 
en la mayoría de los tumores sólidos, incluyendo cánceres de mama, ovario, colon, 
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cabeza y cuello, así como cáncer de pulmón de células no pequeñas, el EGFR se 
sobre expresa por encima de los 2x106 receptores por célula (68). 
 
El EGFR pertenece a la familia de receptores con actividad tirosina-cinasa ErbB, 
cuenta con un dominio ubicado en la membrana celular (Figura 5 ), y diversos estudios 
han demostrado su papel preponderante en la regulación de la proliferación, 
supervivencia y diferenciación celular; puede ser activado de manera aberrante por 
mecanismos como la sobre-expresión del mismo receptor, mutación, dimerización 
ligando dependiente, o bien, activación ligando-independiente. Es por ello que la 
inhibición del EGFR y su cascada de transducción, mediante su bloqueo, se han 
convertido en objetivos primordiales de la terapia contra el cáncer (69). De esta forma, 
diversos ligandos exógenos, incluyendo inhibidores de la tirosina-cinasa, toxinas, 
fragmentos de unión y anticuerpos monoclonales han sido identificados y explotados 
para tratar de alcanzar este objetivo. Los anticuerpos monoclonales, por ejemplo, son 
capaces de unirse a una región específica de un antígeno (receptor, en este caso) 
denominada epítope y han sido utilizados en esta tarea logrando inhibir procesos de 
activación como la dimerización y la autofosforilación (65, 70, 71). 
 
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Figura 5. A) La región extracelular de EGFR comprende cuatro dominios: I – IV. Los dominios I y III 
comparten aproximadamente un 37% de la secuencia de aminoácidos, mientras que los 
dominios II y IV son ricos en cistina. El lóbulo N-terminal del dominio cinasa aparece en 
morado y el lóbulo C-terminal en azul. (B) Diagramas de cinta representativos. Los 
dominios I y III adoptan un doblez de β-hélice mientras que los dominios II y IV adoptan 
estructuras extendidas que comprenden una serie de módulos unidos por puentes 
disulfuro. C) Factor de crecimiento epidérmico (rojo) y su receptor (azul). La forma inactiva 
(izquierda) dimeriza cuando se une a la hormona (derecha). La membrana celular se 
muestra esquemáticamente en gris (72). 
 
4.7. Anticuerpos monoclonales anti-EGFR. 
 
Diversos anticuerpos monoclonales (mAbs) como Cetuximab (C225), Panitumumab y 
otros, han demostrado su eficiencia como inhibidores del EGFR (73); sin embargo, la 
mayoría de estos mAbs, son responsables de un típica toxicidad en la piel, que es 
desarrollada en el 90% de los pacientes tratados y es descrita como un “rash” de tipo 
acneiforme que en más del 38% de los pacientes alcanza grados 3-4 (74, 75); aunado 
a ello, también se han reportado efectos de cardiotoxicidad aumentada, cuando 
algunos de estos anticuerpos monoclonales se combinan con fármacos 
antineoplásicos. 
A) B) C) 
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En el caso particular del mAb Nimotuzumab, reportes recientes han demostrado que a 
la par de inhibir la proliferación de células cancerosas y aumentar la apoptosis de las 
mismas al interior de tumores sólidos, el uso de este mAb no genera efectos 
secundarios que pudieran comprometer la eficiencia de la terapia (76). Esto se debe a 
que este mAb necesita que ambos extremos F(ab’) (ver Figura 6 ) se acoplen al 
antígeno (77), es decir, sus receptores deben ser cercanos y muy abundantes en la 
superficie de la célula; esta característica solo se observa en células tumorales, lo que 
podría significar la posibilidad de diferenciar células sanas o con poca expresión de 
EGFR y células cancerosas que presenten sobre-expresión del receptor. 
 
 
Figura 6. Representación en cintas (izquierda) y modelo espacial (derecha) de la estructura 
general de un anticuerpo (Protein Data Bank: 1IGY). Un anticuerpo puede ser dividido en tres grandes 
fragmentos: dos F(ab)’ y un Fc. Cada F(ab)’ contiene una cadena ligera (L, en color verde) completa 
(dominios variable y constante, VL y CL) y los primeros dos dominios (variable y constante, VH y CH1) 
de una de las cadenas pesadas (H, en azul). El fragmento Fc está formado por los otros dos dominios 
constantes de las dos cadenas pesadas (CH2 y CH3), con una cadena de carbohidratos (en color 
naranja) unida a cada uno de los dominios CH2. La especificidad de los mAbs está determinada por los 
dominios N-terminales de las cadenas ligera y pesada, conocidos como Fv (78, 79). 
 
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4.8. Nimotuzumab. 
 
Nimotuzumab o h-R3 (TheraCIM, CIMher, Theraloc) es un mAb humanizado de 150 
kDa que fue obtenido al insertar las regiones determinantes de la complementariedad 
(CDRs), del anticuerpo monoclonal murino ior-egf/r3 a una plataforma humana. Este 
mAb es capaz de reconocer el dominio externo de EGFR con alta especificidad (80, 
81). Un modelo computacional reportado por Talavera y colaboradores en el año 
2009, mostró una buena complementariedad tanto geométrica (0.78) como química 
entre este anticuerpo y la región extracelular del EGFR (eEGFR), con un alto número 
de puentes de hidrógeno y fuertes contactos hidrofóbicos (71, 78). La superficie de 
interacción determinada entre ambas proteínas fue de 1584 Å2; es decir, poco menor 
que la reportada para Cetuximab/EGFR (1770 Å2 (82) lo cual correlaciona con la 
mayor afinidad del Cetuximab. 
 
La mayor cantidad de contactos del Nimotuzumab con el eEGFR, ocurre a través de la 
cadena pesada del anticuerpo. La CDR3 del dominio de la región variable de la 
cadena pesada es el lazo que más contribuye a esta interacción, siguiéndole los 
CDRs L2, L1 y H1, por ese orden. Nimotuzumab reconoce un epítope en el dominio III 
del eEGFR que está compuesto por 20 aminoácidos, que se ubican hacia la parte C-
terminal de este dominio (Figura 7 ). 
 
Figura 6. (A) Representación de la estructura del complejo nimotuzumab/EGFR. Las cadenas 
pesadas y ligeras de nimotuzumab se muestran en cian y magenta mientras que eEGFR 
aparece en verde. La estructura del epítope se muestra en amarillo y las regiones 
(A) (B) 
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determinantes de la complementariedad de las cadenas pesada y ligera son representadas 
en azul y rojo respectivamente. (B) Superficie de interacción. Los residuos de las cadenas 
laterales en dicha superficie se muestran como líneas continuas y los enlaces de 
hidrógeno se muestran como líneas amarillas discontinuas (83). Los residuos y las 
cadenas conservan el mismo color que en (A). 
 
Finalmente y contrario a la mayoría de los fármacos y/o moléculas dirigidas contra 
EGFR, nimotuzumab no ha mostrado efectos secundarios severos en la clínica; por 
ejemplo, a la fecha no han sido reportadas irritaciones severas o cardiopatías (84). 
Desde sus inicios, nimotuzumab mostró resultados muy alentadores en gliomas, 
cáncer de tronco cerebral, cáncer de pulmón de células no pequeñas, etc. (85). En los 
últimos años, este mAb anti-EGFR se ha consolidado como una herramienta 
terapéutica en diferentes clases decarcinomas (86-90) y su uso en combinación con 
fármacos como cisplatino ha resultado muy favorable (86). 
También, se ha comprobado la posibilidad de unir este anticuerpo a otras moléculas 
para fines de diagnóstico o incluso terapia (91-94) sin que la afinidad por su antígeno 
(EGFR) sea afectada, lo que plantea la posibilidad de incluirlo en sistemas conjugados 
como los inmunoliposomas. 
 
4.9. Inmunoliposomas (ILs). 
 
Los inmunoliposomas (ILs) combinan un acarreador estable y robusto (liposoma) con 
un ligando (mAb) que proporciona afinidad por un blanco específico (3), llevando una 
carga del fármaco o fármacos encapsulados hacia las células diana (tumor), 
proporcionando mayor eficacia y baja toxicidad en tejidos normales. Esta clase de 
sistemas presentan varias ventajas respecto a otras estrategias de 
inmunoconjugados, por ejemplo, en contraste con las inmunotoxinas, los agentes 
liposomales pueden ser diseñados para alcanzar tiempos extensos de circulación en 
torrente sanguíneo con efectos mínimos de inmunogenicidad. Los ILs también pueden 
favorecer la liberación de altas concentraciones de potentes fármacos antitumorales a 
lo largo de periodos extensos de tiempo, evitando la toxicidad por ingesta masiva de 
un principio activo y disminuyendo la citotoxicidad en tejidos sanos que poseen baja 
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expresión del antígeno que constituye el objetivo o blanco de la terapia (95). En este 
sentido, gran parte de la investigación científica se ha enfocado en el desarrollo de 
“terapias dirigidas” que permitan la erradicación del tumor sin afectar los órganos o 
tejidos sanos (96, 97). 
 
Con el arribo de las tecnologías de “nanomedicina” los agentes terapéuticos han 
podido ser empaquetados dentro de vehículos o nanosistemas para posteriormente 
ser inyectados por vía intravenosa acumulándose, preferentemente, dentro de los 
tumores. A través de la permeabilidad pasiva que consiste en aprovechar el libre paso 
de los nanosistemas a través de las fenestraciones o defectos existentes en las 
paredes de los vasos sanguíneos que alimentan al tumor, o bien, mediante 
mecanismos de internalización activos que consisten en proporcionar a los 
nanosistemas una fuerza impulsora como la conjugación con moléculas capaces de 
reconocer blancos tumorales, cargas superficiales, diferenciales de pH, etc. Algunas 
de estas tecnologías han avanzado hasta aplicaciones clínicas y otros se encuentran 
actualmente en ensayos pre-clínicos (96-99). Uno de los enfoques más prometedores 
en la terapia dirigida contra el cáncer es justamente la utilización del receptor EGFR, 
con lo que se busca mejorar la entrega de agentes terapéuticos y de diagnóstico en 
las células tumorales que lo sobre-expresan. Aunque son muchas las alternativas para 
alcanzar el “targeting” o direccionamiento específico, el uso de anticuerpos 
monoclonales ha resultado una de las más eficientes cuando se trata de liposomas 
cargados con fármacos dirigidos contra tumores, brindando la oportunidad de 
incrementar las aplicaciones terapéuticas de los liposomas. Los sistemas que 
conjugan mAbs con liposomas son llamados inmunoliposomas (ILs) (ver Figura 8 ) y 
se han propuesto como la siguiente generación de los sistemas de liberación de 
fármacos (1-4). 
 
Durante las últimas dos décadas, diversas formulaciones de ILs han sido desarrolladas 
y ampliamente estudiadas (6), (7-13); sin embargo, el desarrollo de estas 
investigaciones ha estado limitado a pruebas preclínicas y después de todos estos 
años, hasta la fecha, ninguna formulación ha sido aprobada para su uso en la clínica. 
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Por todo lo anterior, resulta evidente la necesidad de desarrollar sistemas que cuenten 
con las cualidades descritas para los inmunoliposomas al mismo tiempo que muestren 
especificidad por los sitios tumorales y que a su vez no representen un factor de 
toxicidad. Dando por resultado, a largo plazo, el que las formulaciones de ILs puedan 
ser aprobadas para su uso en pacientes. 
 
 
 
Figura 8. Representación de la estructura de un inmunoliposoma. El liposoma está constituido por 
una bicapa fosfolipídica que envuelve un centro acuoso en el que puede ser atrapado 
algún agente con actividad farmacológica. La vesícula liposomal es cubierta por una 
capa estérica de polietilenglicol (PEG) que a su vez puede servir de enlazador con un 
anticuerpo monoclonal o cualquier molécula capaz de reconocer blancos específicos. 
 
 
Anticuerpo monoclonal 
conjugado mediante PEG 
Fármaco cargado al interior del liposoma Membrana del liposoma 
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5. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 
 
A pesar de que una formulación liposomal reduce notablemente los efectos 
secundarios asociados al fármaco o agente activo que transporta, el sistema sigue 
siendo inespecífico, situación que limita su efectividad terapéutica, sobre todo en 
el caso de metástasis. En este trabajo se plantea desarrollar conjugados 
anticuerpo-liposoma (inmunoliposomas) que resulten en una mayor especificidad 
por células cancerosas que sobre-expresan EGFR. 
 
 
 
6. HIPÓTESIS. 
 
El acoplamiento del anticuerpo monoclonal Nimotuzumab a liposomas cargados 
con cisplatino incrementará la especificidad del sistema liposomal por células que 
sobre-expresan el receptor EGFR, sin afectar las características fisicoquímicas ni 
la estabilidad del sistema liposomal-cisplatino. 
 
 
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7. OBJETIVO GENERAL. 
 
Desarrollar, caracterizar y evaluar la especificidad de immunoliposomes anti-
EGFR cargados con cis-diaminodicloroplatino (II) y unidos al anticuerpo 
monoclonal Nimotuzumab en un modelo in vitro. 
 
7.1. Objetivos específicos. 
 
• Desarrollar de un procedimiento para la modificación y acoplamiento del 
mAb a liposomas. 
• Preparar y caracterizar de ILs que contengan una carga de cisplatino. 
• Evaluar in vitro la unión y/o internalización de ILs en células en función de la 
expresión del receptor EGFR. 
 
 
 
 
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8. MATERIALES. 
 
El anticuerpo monoclonal nimotuzumab fue donado por el Centro de Inmunología 
Molecular (CIM, La Habana, Cuba). Los anticuerpos policlonales: anti-EGFR (SC-03) y 
anti-actina (SC-1615); así como los anticuerpos secundarios: anti-IgG de conejo (SC-
2004) y anti-IgG de cabra (SC-2922), estos últimos acoplados a la peroxidasa de 
rábano, fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, Estados Unidos). 
 
Los compuestos: L-α-fosfatidilcolina hidrogenada de soya (HSPC), colesterol (Chol), 
1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina –N-[metoxi(polietilen glicol)-2000] (sal de 
amonio) (mPEG), 1,2-diasteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina –N-[maleimido(polietilen 
glicol)-2000] (sal de amonio) (PEG-maleimido) y 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-
fosfoetanolamina –N-[lisamina rodamina B sulfonil (sal de amonio) (Rhod) fueron 
adquiridos de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, Estados Unidos). 
 
 El isómero I del isotiocianato de fluoresceína (FITC), la acrilamida, bis-acrilamida, 
sefarosa CL-4B, N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA), el ácido 
etilendiaminotetraacético (EDTA), el ácido 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzoico) (DTNB) o 
reactivo de Ellman, dimetilformamida (DMF) y cis-diaminodicloroplatino(II) (Cisplatino, 
CDDP) fueron obtenidos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos). 
 
Columnas cromatográficas tipo PD-10 (sephadex G-25), fueron adquiridas de GE 
Healthcare (Little Chalfont, Reino Unido). Los solventesacetonitrilo, cloroformo y 
metanol fueron grado HPLC y fueron obtenidos de Honeywell (Morris Plans, NJ, 
Estados Unidos). 
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM), Dulbeco’s Modified Essential Medium-
F12 (DMEM-F12), suero fetal bovino (SFB) y la solución de penicilina-streptomicina 
fueron adquiridos de GIBCO®, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, Estados 
Unidos). Todas las sales y soluciones amortiguadoras usadas fueron grado analítico. 
 
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9. METODOLOGÍA. 
 
9.1. Preparación de inmunoliposomas (ILs). 
 
9.1.1. Preparación de liposomas cargados con cisplatino. 
 
Liposomas-CDDP fueron preparados usando una modificación (100) del método de 
evaporación fase reversa previamente reportado por Szoka y Papahadjopoulos (101). 
Brevemente, HSPC, Chol, mPEG, PEG-mal y Rhod en una proporción molar 
59.9:35:3:2:0.1, fueron mezclados y disueltos en una mezcla cloroformo/metanol (2:1, 
v/v). La mezcla de fosfolípidos fue goteada lentamente a una solución saturada de 
cisplatino en agua bidestilada estéril (8 mg/mL), previamente calentada a 70°C. Tras 
la formación de una emulsión, la mezcla fue colocada en un matraz bola y el solvente 
orgánico fue removido en un rotavapor (Heidolph, Schwabach, Alemania) a 150 rpm, 
70°C bajo presión negativa. La suspensión fue sometida a ultrasonicación durante 1 h 
(Sonicador Modelo 2510, Branson Ultrasonics Co., Ltd., Shanghai, China) a fin de 
reducir el tamaño de las vesículas formadas. Liposomas blanco (sin carga de 
cisplatino) fueron elaborados siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. 
 
9.1.2. Remoción del fármaco no encapsulado. 
 
El fármaco precipitado y/o no encapsulado fue eliminado mediante un proceso de 
diálisis (2x 2 h), llevado a cabo bajo condiciones de temperatura ambiente y agitación 
vigorosa. Para tal propósito se utilizó una membrana de celulosa con tamaño de poro 
de 3500 Da (Spectrum Labs Inc., Rancho Domínguez, CA, Estados Unidos) y una 
solución de NaCl al 0.9% en agua, como medio receptor. 
 
 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 27 
 
9.1.3. Marcaje de Nimotuzumab. 
 
 A fin de obtener un anticuerpo fluorescente, el mAb Nimotuzumab fue marcado con el 
isómero I de isotiocianato de fluoresceína (FITC) usando una relación molar 10:1, 
FITC/mAb. Para ello, 2.0 mg de FITC (F7250, Sigma Aldrich, Estados Unidos) fueron 
reconstituidos con 2 mL de una solución amortiguadora 0.1 M carbonato-bicarbonato 
(pH 9.5) preparada en fresco con agua desionizada obtenida de un sistema de 
purificación Milli-Q®, direct-8 (Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania). Una vez que la 
mezcla fue homogenizada, se preparó una dilución 1:2 y de esta segunda solución se 
tomó el volumen necesario para el marcaje de la cantidad deseada de mAb, cuya 
concentración inicial debió ser de 5 mg/mL en una solución amortiguadora de fosfatos 
(PBS 1x, pH 7.4), o bien, en agua inyectable. Se agregaron 100 µL de una solución 
amortiguadora carbonato-bicarbonato 1 M por cada 900 µL de mAb a marcar, a fin de 
alcanzar una concentración 0.1 M de esta solución. El anticuerpo y la solución de 
FITC fueron agregados a un recipiente ámbar y la reacción transcurrió durante 2 h a 
temperatura ambiente y con agitación moderada. El esquema general de reacción se 
muestra a continuación en la Figura 9 . 
 
Figura 9. Marcaje con el isotiocianato de fluoresceína (FITC). La reacción de conjugación ocurre 
mediante el ataque del par electrónico de los grupos amino, que se encuentran libres en 
el anticuerpo, al carbono del grupo tiocianato (NCS), formando un enlace tiourea estable. 
 
El conjugado FITC/mAb fue purificado mediante cromatografía de exclusión molecular 
(1000-5000 Da) usando una columna PD-10 (sephadex-G25, GE, Estados Unidos) y 
PBS 1x, como fase móvil; fracciones de 1 mL fueron colectadas y la absorbancia de 
éstas a una λ de 280 nm (longitud característica para proteínas) fue determinada en 
 mAb 
 mAb 
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un bioespectrofotómetro (BioPhotometer UV/vis, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). A 
fin de asegurar la eficiencia de las siguientes reacciones, únicamente fracciones con 
A280>0.4 fueron usadas y la proporción molar final FITC/mAb (F/P) fue determinada de 
acuerdo con la siguiente ecuación (102): 
 
����� �� �
2.77�
���

��� � �0.35�
����
 
 
En donde A495 es la absorbancia de FITC. Únicamente fracciones con un cociente F/P 
(FITC/Proteína) entre 1 y 4 fueron consideradas para la reacción de derivatización. Lo 
anterior, a fin de evitar efectos como sobre-marcaje de la proteína, el cual podría 
resultar en una incrementada unión inespecífica y disminución del rendimiento 
cuántico debido a un efecto de auto-extinción del fluoróforo (102, 103). 
La siguiente ecuación fue usada para calcular la concentración de proteína en el 
conjugado fluoresceína-IgG: 
 
�����������ó�	"�	#$% &'$'() �

��� � �0.35�
����
1.4 
 
Las fracciones seleccionadas fueron mezcladas y luego concentradas mediante filtros 
de ultracentrifugación Amicon® (Merck, Millipore, Billerica, MA, Estados Unidos) con 
un tamaño de poro de 30 KDa (30 min, 4000 rpm, 4 °C) hasta alcanzar una 
concentración ≥ 5 mg/mL de mAb. 
 
9.1.4. Derivatización del mAb. 
 
Con el objetivo de lograr la conjugación de nimotuzumab con los liposomas, se 
evaluaron diferentes proporciones molares de N-succinimidil S-acetiltioacetato (SATA 
A9043, Sigma Aldirch, Estados Unidos) respecto al mAb (10:1, 25:1 y 50:1). Después 
de varios ensayos se determinó que la relación 25:1 permitía la unión eficiente con los 
grupos maleimidos del mPEG de los liposomas sin afectar los sitios de reconocimiento 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 29 
 
del anticuerpo monoclonal. Dicha relación fue utilizada para adicionar nuevos grupos 
sulfhidrilo en las moléculas del mAb. Autores como Majappa y colaboradores (104) 
también han reportado que esta proporción resulta en la derivatización óptima de 
mAbs, minimizando la pérdida de afinidad del anticuerpo por su antígeno. Para este 
propósito, el reactivo SATA se disolvió en N,N-dimetilformamida (DMF) a una 
concentración de 10 mg/mL y fue adicionado lentamente a la solución del conjugado 
FITC/mAb. La reacción se completó después de agitar la mezcla a temperatura 
ambiente durante 40 min. En la Figura 10 , se muestra el esquema general de esta 
reacción. 
 
 
Figura 10. Reacción de derivatización del anticuerpo monoclonal con SATA. La reacción ocurre 
mediante la interacción del par electrónico del nitrógeno de aminas primarias presentes en 
el anticuerpo con el carbonilo del grupo éster de SATA. Tras la salida de la N-
hidroxisuccinimida (–NHS), el anticuerpo monoclonal adquiere un nuevo grupo sulfhidrilo 
que queda protegido con el grupo acetato. 
 
9.1.5. Desacetilación de grupos tiol (–SH). 
 
Para llevar a cabo la unión entre las moléculas de nimotuzumab y los grupos 
maleimido de los liposomas “pegilados”, se llevó a cabo la desacetilación o 
desprotección de los grupos sulfhidrilo introducidos mediante SATA. Para ello, la 
hidroxilamina-HCl se preparó a una concentración de 50 mg/mL en una solución 
amortiguadora de conjugación (fosfato de sodio 100 mM, 10mM de EDTA, pH 7.6). 
Posteriormente, el volumen necesario (100 µL por cada mL de mAb) de la solución fue 
Proteína con 
aminas 
primarias 
N-succinimidil S-acetiltioacetato 
(SATA) 
Proteína con 
sulfhidrilo protegido 
Grupo saliente –NHS 
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adicionado a la solución de SATA/mAb y se dejó reaccionar por 2 horas a temperatura 
ambiente.El esquema de esta reacción se puede observar en la Figura 11 . 
 
 
Figura 11. Reacción de desacetilación del grupo sulfhidrilo por tratamiento con hidroxilamina. El par 
electrónico del N de la hidroxilamina ataca al carbón del grupo acetato, produciéndose una 
N-hidroxi-acetamida que es removida mediante la columna de exclusión molecular y 
dejando al grupo sulfhidrilo desprotegido y listo para reaccionar. 
 
9.1.6. Purificación de mAb derivatizado. 
 
Para purificar el mAb derivatizado, la mezcla de reacción fue introducida a una 
columna cromatográfica de exclusión molecular PD-10 (sephadex G-25), pre-
equilibrada con 6x5 mL de la solución de conjugación, usando como fase móvil la 
solución. Fracciones de 1 ml fueron colectadas y la absorbancia a 280 nm fue 
evaluada en cada una. Las fracciones más importantes (Abs280 ≥ 0.4) fueron reunidas 
en una sola y la concentración final fue determinada, debiendo ser en todos los casos 
≥ 2.5 mg/mL. La conjugación con los liposomas se llevó a cabo de manera inmediata a 
fin de evitar la formación de puentes disulfuro (90) entre los nuevos grupos sulfhidrilo. 
 
9.1.7. Conjugación de mAb a liposomas. 
 
El nimotuzumab derivatizado se unió covalentemente a los grupos maleimido de las 
cadenas de PEG-mal de los liposomas previamente formados. Para ello, volúmenes 
NH2OH•HCl 
Proteína modificada 
con SATA 
N-hidroxi-acetamida 
Proteína con nuevo 
grupo sulfhidrilo 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 31 
 
iguales del mAb y de la suspensión liposomal (con o sin CDDP) fueron incubados a 
temperatura ambiente por 2.5 h en un recipiente ámbar. La Figura 12 muestra el 
esquema de esta reacción. 
 
 
 
Figura 12. Reacción de conjugación entre PEG-mal y un grupo sulfhidrilo adicionado a la molécula del 
mAb nimotuzumab. La reacción ocurre mediante el ataque nucleofílico del par electrónico 
del azufre del grupo tiol a uno de los carbonos del doble enlace del grupo maleimido, tras la 
deslocalización de los electrones pi del doble enlace, uno de los carbonos se protona y el 
azufre queda unido al anillo. 
 
9.1.8. Purificación de ILs. 
 
El anticuerpo y liposomas no unidos entre sí, se separaron de los inmunoconjugados 
(ILs) mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna (10 x 1800 
mm, D x H) empacada con sefarosa CL-4B y una fase móvil constituida de 100% de 
PBS 1x, pH 7.4. Fracciones de 3 mL fueron colectadas cada 5 min y la concentración 
del mAb en cada una de ellas se determinó mediante espectrofotometría (Abs λ = 280 
nm); la concentración de fosfolípidos en las mismas fracciones fue determinada a 
través de un ensayo de Stewart (105). Las fracciones con mayor cantidad de 
anticuerpo y fosfolípidos se mezclaron y concentraron en filtros de ultracentrifugación 
Amicon® (Merck-Millipore, Darmstadt, Alemania) con tamaño de poro de 30 kDa, 
hasta alcanzar el volumen original de la muestra colocada en la columna. 
 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 32 
 
9.2. Determinación de la concentración de anticuerpo. 
 
La concentración de proteína (mAb) se determinó por diferentes métodos, absorbancia 
a λ=280nm, técnicas colorimétricas de Bradford y ácido bicinconínico (BCA). 
 
9.2.1. Ensayo Bradford para cuantificación de proteínas. 
 
Se realizaron ensayos tipo Bradford, basados en la unión de un colorante (azul de 
Comassie (Brilliant Blue R, Cat. B6529, Sigma-Aldrich, San Luis, MO, Estados Unidos) 
a las proteínas. Dicho colorante existe en dos formas al estar presente en un medio 
ácido, una que brinda una coloración azul y otra anaranjada. 
Teniendo en cuenta que el método es sensible en un intervalo que va de 1 a 15 µg, se 
preparó una curva patrón de 6 puntos a partir de un estándar de albúmina sérica 
bovina (BSA, 1mg/mL, Sigma Aldrich, Estados Unidos), según se describe en la tabla 
siguiente: 
 
 
Diluciones 1:10 o 1:20 de las muestras en agua desionizada fueron preparadas para 
las cuantificaciones y 10 µL de dichas diluciones fueron aplicados por triplicados en 
todos los casos. Del mismo modo, 10 µL de cada punto de la curva fue aplicado por 
triplicado en placas de 96 pozos. Posteriormente, 200 µL del reactivo de Bradford fue 
[c], 
µg/µL 
Vol. Total 
preparado, µL 
Vol. Stock 
(1mg/mL), µL 
H20 
desionizada, µL 
Reactivo de 
Bradford, µL 
0 200 0 200 200 
0.1 200 20 180 200 
0.2 200 40 160 200 
0.3 200 60 140 200 
0.4 200 80 120 200 
0.5 200 100 100 200 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 33 
 
adicionado a cada pozo, dejándolo actuar por 20 minutos antes de leer la absorbancia 
a una λ de 595nm. 
 
9.2.2. Ensayo BCA para cuantificación de proteínas. 
 
Se realizaron ensayos basados en la capacidad del ácido bicinconínico para formar un 
complejo púrpura intenso con iones Cu1+ en medio alcalino, de tal manera que fue 
posible cuantificar el ión cuproso producido a partir de la reacción entre las proteínas, 
particularmente el mAb en este caso, con Cu2+ en un medio alcalino (106) 
aprovechando la estabilidad del cromóforo. 
Al igual que en el método de Bradford, fue necesario preparar una curva de referencia 
basada en concentraciones conocidas de BSA: 
 
µg de 
BSA 
Vol. stock 
(1mg/mL), µL 
H20 
desionizada, µL 
Vol. / 
pozo, µL 
Solución de 
trabajo, µL 
0 0 1000 100 100 
1 10 990 100 100 
2 20 980 100 100 
3 30 970 100 100 
4 40 960 100 100 
5 50 950 100 100 
 
La solución de trabajo se preparó con 1 mL del reactivo QA (Cat. M3810, Sigma 
Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos), que corresponde a una solución de 
carbonato, tartato y bicarbonato de sodio en NaOH 0.2 M con pH 11.25; 1 mL del 
reactivo QB (CatM3685, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, Estados Unidos), que consistió 
en una solución de BCA al 4% (w/v) con pH 8.540 y 40 µL de una solución de sulfato 
de Cu (107) pentahidratado al 4% (QC, Cat. C2284, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, 
Estados Unidos). Las muestras fueron analizadas por triplicado (100 µL/pozo) en 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 34 
 
placas de 96 pozos. Una vez agregada la solución de trabajo las placas se incubaron 
durante 1 hora a 60 °C y la absorbancia a una λ de 570 nm fue determinada. 
 
9.3. Determinación de la concentración de grupos sulfhidrilo en el mAb. 
 
Un ensayo de Ellman (108) (109) fue utilizado para determinar la concentración de 
grupos sulfhidrilos activos en el anticuerpo sin derivatizar, derivatizado y en los 
sistemas conjugados nimotuzumab-liposoma. 
Se preparó una curva patrón con concentraciones conocidas de hidrocloruro 
monohidratado de cisteína (Cat. 44889, Thermo Scientific, San Diego, CA), de 0.25 a 
1.0 mM, para cuantificar el número de –SH. Brevemente, 50 µL de una solución 
(4mg/mL) del reactivo de Ellman (ácido 5,5’-ditiobis (2-nitrobenzoico)) y 2.5 mL de 
solución de reacción (PBS 1x 0.1 M, 1 mM EDTA) fueron mezclados con 250 µL del 
mAb derivatizado o del nimotuzumab unido a liposomas; las muestras fueron 
incubadas por 15 min a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 412 nm. 
 
Estándar 
Vol. de solución de 
reacción , mL 
Cantidad de cisteína 
(P.M. =175.6) 
Concentración 
final, mM 
A 100 26.34 1.5 mM 
B 5 25 mL del estándar A 1.25 mM 
C 10 20 mL del estándar A 1.0 mM 
D 15 15 mL del estándar A 0.75 mM 
E 20 10 mL del estándar A 0.5 mM 
F 25 5 mL del estándar A 0.25 mM 
G 30 0 mL 0.0 mM 
 
 
 
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9.4. Caracterización de liposomas. 
 
9.4.1. Determinación del tamaño de partícula. 
 
Microscopía de transmisión electrónica (TEM), usando un equipo JEM -2010 (Jeol Co., 
Tokyo, Japón) dotadode un rayo de electrones de 200 kV, fue usada para evaluar las 
características de tamaño y morfología de las vesículas liposomales. Para ello, una 
gota de una dilución 1:10 o 1:20 (en agua destilada) de cada muestra, fue colocada 
sobre una malla de cobre recubierta con una película de carbono (400-mesh), y se 
dejó secar por 5 min. Posteriormente, la muestra fue teñida con una solución de 
acetato de uranilo al 2%, se dejó secar nuevamente antes de ser observada al 
microscopio. La determinación del tamaño de los liposomas se realizó a partir de las 
microscopías, usando el programa Image J de 64-bits (Java 1.6.0_24) (NIH, Bethesda, 
MD, Estados Unidos), midiendo el diámetro en 30-50 imágenes de ILs y/o liposomas y 
calculando el diámetro promedio. 
 
El tamaño también fue evaluado con la técnica de dispersión dinámica de luz (DLS) 
usando un equipo Z-Sizer 90plus (Brookhaven Instruments Co., Holtsville, NY, 
Estados Unidos), que permitió establecer el diámetro hidrodinámico así como el índice 
de polidispersión (PDI). El PDI mide la homogeneidad de una muestra considerando 
los radios hidrodinámicos. Un valor de 0.0 determina una homogeneidad completa de 
la muestra mientras que un valor de 1.0 establece una muestra totalmente 
heterogénea. Como valor estándar o de referencia se utilizaron esferas de poliestireno 
con un tamaño promedio de 92 ± 3.7 nm (Thermo Scientific, San Diego, CA) y todas 
las mediciones se realizaron a 25 °C. 
 
9.4.2. Potencial zeta (ξ). 
 
El potencial zeta de las suspensiones de liposomas e ILs se determinó utilizando un 
equipo Z-Sizer (Brookhaven, Instruments Co., Holtsville, NY, Estados Unidos); Este 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 36 
 
parámetro se utiliza como una aproximación de la estabilidad que dichas 
suspensiones podrían mostrar en condiciones de almacenaje. Como valor de 
referencia, el potencial zeta de una solución estándar de Ni, fue medido y comparado 
con los valores reportados (-53 ± 4 mV). Todas las mediciones se realizaron a 25 °C. 
 
9.4.3. Concentración de fosfolípidos. 
 
La concentración de fosfolípidos fue determinada mediante el método colorimétrico de 
Stewart (105). Para ello, una alícuota de 20 µL de cada suspensión liposomal fue 
colocada en un microtubo de 2 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), secada en una 
centrífuga con vacío (DNA 120, Thermo, Milford, MA, Estados Unidos) a temperatura 
ambiente, reconstituida con 750 µL de cloroformo y agitada vigorosamente (Vortex 
Genie, Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY, Estados Unidos) hasta homogenizarla. 
Enseguida, un volumen idéntico (750 µL) de ferrotiocianato de amonio (NH4FeSCN) 
fue adicionado, las muestras fueron agitadas nuevamente y luego centrifugadas a 
3000 rpm y 4 °C, durante 3 minutos (Centrifuga 5702R rotor #A- 38, Eppendorf, 
Hamburgo, Alemania). La fase acuosa se retiró y la absorbancia de la fase 
clorofórmica fue determinada a 488 nm en un espectrómetro DU®530 (Beckman 
CoulterTM, Brea, CA, Estados Unidos). Para llevar a cabo la cuantificación de la 
concentración de fosfolípidos a partir de la absorbancia, se utilizó una curva estándar. 
Para tal propósito se preparó una primera solución patrón con una concentración de 2 
mg/mL de HSPC en cloroformo y luego una dilución 1:10 para obtener una solución de 
0.2 mg/mL. De esta solución se prepararon los puntos de la curva que se indican a 
continuación: 
 
Volumen de 
Stock, µL 
Volumen de 
Cloroformo , µL 
Volumen de 
NH4FeSCN, µL 
Concentración 
de HSPC, mg/mL 
0 750 750 0 
75 675 750 0.02 
150 600 750 0.04 
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M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 37 
 
225 525 750 0.06 
300 450 750 0.08 
 
9.4.4. Concentración de CDDP encapsulado. 
 
La concentración de cisplatino encapsulado se determinó mediante cromatografía 
líquida de alta resolución (HPLC), siguiendo un método reportado previamente (110, 
111). A partir de una alícuota de 20 µL de CDDP-liposomas o CDDP-ILs, el CDDP fue 
extraído agregando 100 µL de acetonitrilo, la mezcla fue agitada vigorosamente y 
luego centrifugada a 10,000 rpm y 4°C (Centrífuga Mikro 220R rotor #A-4-38, Hettich, 
Tuttlingen, Alemania). El sobrenadante fue extraído, transferido a un nuevo tubo y 
secado con N2 gaseoso. La muestra fue resuspendida en solución salina isotónica 
(0.9%) y se le agregó NiCl2 a una concentración de 50µg/Ml, como estándar interno. 
También fueron adicionados 10 µL del agente derivatizante N,N-dietilditiocarbamato 
(DDTC), preparado al momento, al 10% en una solución de NaOH 0.1 M. La mezcla 
fue agitada vigorosamente por algunos minutos y luego incubada a 37°C, 500 rpm 
durante 30 minutos (Thermomixer compact, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). 
Posteriormente, las muestras fueron mezcladas con 80 µL de cloroformo, agitadas 
vigorosamente por 1 min. Las dos fases fueron separadas por centrifugación a 10,000 
rpm (Centrífuga Mikro 220R rotor #A-4-38, Hettich, Tuttlingen, Alemania) por 10 min; 
20 µL de la fase clorofórmica fueron inyectados a un equipo cromatográfico Waters 
Alliance 2695 acoplado a un detector UV-2489 establecido en una λ de 254 nm 
(Waters Instruments Co., Milford, MA, Estados Unidos), con una columna Symmetry 
C-18 (Waters Instruments Co., Milford, MA, Estados Unidos) y una fase móvil que 
consistió en una mezcla agua/metanol/acetonitrilo en una relación 28:40:32 (v/v/v), 
con una flujo de 1.8 mL/min. 
 
Para la cuantificación fue necesario preparar una curva de referencia que contó con 
los siguientes puntos: 
 
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Concentración, 
µg/mL 
Vol. de liposomas 
blanco, µL 
Vol. stock, µL Vol. H2O 
desionizada, µL 
0 5 --- 95 
1 5 10 (Stock 10µg/mL) 85 
5 5 5 (Stock 100µg/mL) 90 
10 5 10 (Stock 100µg/mL) 85 
 
Las eficiencias de encapsulación y carga de CDDP fueron calculadas con las 
siguientes ecuaciones: 
 
,,�%� � �����"�"	"�	�..�	��	��/�0�'�0�����"�"	�������	"�	�..� 1 100 
 
(,�%� � �����������ó�	"�	�..�	�'$/'(������������ó�	"�	�í/�"�0	�'$/'(� 1 100 
 
9.5. Estabilidad de encapsulación de CDDP en liposomas. 
 
El perfil de liberación de CDDP a partir de liposomas e ILs fue evaluado en suero 
sanguíneo de voluntarios humanos a 37 °C durante 72 h usando celdas de 
transferencia vertical (celdas de difusión de Franz). Una dilución 1:2 de CDDP-
liposomas o CDPP-ILS en suero humano fue colocado al interior del compartimento 
denominado cámara donadora; una membrana de policarbonato con un tamaño de 
poro de 50 nm (Millipore Co., Cork, Irlanda) fue usada para separar las cámaras 
donadora y receptora. A tiempos predeterminados (0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 y 72 h), el 
medio receptor (solución salina 0.9%) fue removido completamente y sustituido por un 
volumen idéntico de medio fresco. Una alícuota fue guardada a -20 °C, hasta su 
cuantificación por HPLC. 
 
El porcentaje de CDDP liberado a cada tiempo fue calculado con la siguiente 
ecuación: 
Posgrado en Ciencias Químicas, UNAM. Tesis de Doctorado, 2017. 
M. en C. Héctor Vázquez Becerra. Página 39 
 
 
�..�	��4���"�	�%� � '5'�
1 100	 
 
En donde mt es la masa de CDDP en la cámara receptora a cada tiempo y m0 es la 
masa inicial colocada en la cámara donadora. 
 
9.6. Ensayos de afinidad in vitro. 
 
Se realizaron ensayos tipo ELISA indirecto para evaluar la afinidad del mAb por su 
antígeno EGFR. En esta variante de ELISA, el sistema de detección emplea dos 
anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el 
primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de 
señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario. Para 
nuestros propósitos, el antígeno se fijó a una concentración establecida y se confrontó 
con curvas