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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
EL PAPEL DE LAS CINASAS MAPK SakA Y MpkC EN LA REGULACIÓN DE LA
VIABILIDAD, LA LATENCIA Y EL CICLO CELULAR EN EL HONGO Aspergillus
nidulans
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS
P R E S E N T A
Rafael Jaimes Arroyo
TUTOR DE TESIS: Dr. Jesús Aguirre Linares,
Instituto de Fisiología Celular UNAM.
COMITÉ TUTOR: Dra. Rosa Estela Navarro González,
Instituto de Fisiología Celular UNAM.
Dr. Miguel Angel Cevallos Gaos,
Centro de Ciencias Genómicas UNAM.
MÉXICO, CD.MX. ABRIL, 2016
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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II
III
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE FISIOLOGÍA CELULAR
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL
EL PAPEL DE LAS CINASAS MAPK SakA Y MpkC EN LA REGULACIÓN DE LA
VIABILIDAD, LA LATENCIA Y EL CICLO CELULAR EN EL HONGO Aspergillus
nidulans
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS
P R E S E N T A
Rafael Jaimes Arroyo
TUTOR DE TESIS: Dr. Jesús Aguirre Linares,
Instituto de Fisiología Celular UNAM.
COMITÉ TUTOR: Dra. Rosa Estela Navarro González,
Instituto de Fisiología Celular UNAM.
Dr. Miguel Angel Cevallos Gaos,
Centro de Ciencias Genómicas UNAM.
MÉXICO, CD.MX. ABRIL, 2016
IV
U~M .
POSG~O ~t. ~ ;j
Ciencia Biológica
Dr. Isidro Ávila Martínez
Director General de Administración Escolar, UNAM
Presente
COORDINACiÓN
Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Subcomité de Biologfa Experimental y
Biomedicina en su sesión ordinaria, celebrada el dla 15 de febrero de 2016, se aprobó el siguiente
jurado para el examen de grado de DOCTOR EN CIENCIAS del alumno, JAIMES ARROYO
RAFAEL con número de cuenta 301291866 con la tesis "El papel de las cinasas MAPK SakA y
MpkC en la regulación de la viabilidad, latencia y el ciclo celular en el hongo Aspergilus
nidulans", realizada bajo la dirección del DR. JESUS AGUIRRE LINARES.
PRESIDENTE: OR. LUIS FELI PE JIMÉNEZ GARCfA
VOCAL: OR. ROBERTO CORIA ORTEGA
SECRETARIO: OR. MIGUEL ÁNGEL CEVALLOS GAOS
SUPLENTE: OR. LUIS SERVIN GONZÁLEZ
SUPLENTE: ORA. ROSA NAVARRO GONZALEZ
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
"POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU"
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., a 05 de abril de 2016
fJ1:ci1 ka ~'
DRA. MARIA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA
COORDINADORA DEL PROGRAMA
c.c.p. Expediente del (la) interesado (a)
COORDINACiÓN
Unidad dc Posgrado • Coordinación del Po grado en Ciencia Biológica Edificio D, ler. Piso, Circuito de Po 'grados CJ. UnÍ\ crsilaria
Delegación Coyoacán .P. 045\ O México. D.F. Te\. 5623 7002 http://pcbiol.pogrado.unam.l11x
Dr. Isidro Ávila Martínez
Director General de Administración Escolar, UNAM
Presente
COORDINACiÓN
Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Subcomité de Biologfa Experimental y
Biomedicina en su sesión ordinaria, celebrada el dla 15 de febrero de 2016, se aprobó el siguiente
jurado para el examen de grado de DOCTOR EN CIENCIAS del alumno, JAIMES ARROYO
RAFAEL con número de cuenta 301291866 con la tesis "El papel de las cinasas MAPK SakA y
MpkC en la regulación de la viabilidad, latencia y el ciclo celular en el hongo Aspergilus
nidulans", realizada bajo la dirección del DR. JESUS AGUIRRE LINARES.
PRESIDENTE: OR. LUIS FELI PE JIMÉNEZ GARCIA
VOCAL: OR. ROBERTO CORIA ORTEGA
SECRETARIO: OR. MIGUEL ANGEL CEVALLOS GAOS
SUPLENTE: OR. LUIS SERVIN GONZÁLEZ
SUPLENTE: ORA. ROSA NAVARRO GONZALEZ
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE
"POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU"
Ciudad Universitaria, Cd. Mx., a 05 de abril de 2016
~:ckQCn~'
ORA. MARIA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA
COORDINADORA DEL PROGRAMA
e.e.p. Expediente del (la) interesado (a)
Unidad de Posgrado • Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio O, 1 ero Pi o. Circuito de Posgrados ('d. ni\ cr~jtari¡¡
Delegación Coyoacán c.P. 04510 México, D.F. Te/. 5623 7002 http://pcbiol.posgrado.unam.l11x
I
AGRADECIMIENTOS OFICIALES
Agradezco al Posgrado en Ciencias Biológicas UNAM
Este proyecto fue financiado por el CONACyT (CB-2010-01-153256), PAPIIT-UNAM,
(IN207913), DGF-CONACyT (75306) y Deutsche For-schungsgemeinschaft (DFG
Mexican-German research unit 1334).
Agradezco al CONACyT por el apoyo de una beca doctoral con registro de becario 229044.
Esta tesis se realizó bajo la asesoría del Dr. Jesús Aguirre Linares en el laboratorio 107-
Oriente, en el Instituto de Fisiología Celular de la UNAM.
El comité tutoral que asesoró este trabajo estuvo formado por:
Dra. Rosa Estela Navarro González, Departamento de Biología Celular y del Desarrollo,
Instituto de Fisiología Celular, UNAM
Dr. Miguel Ángel Cevallos Gaos, Programa de Genómica Evolutiva, Centro de Ciencias
Genómicas, UNAM
Dr. Jesús Aguirre Linares, Departamento de Biología Celular y del Desarrollo, Instituto de
Fisiología Celular, UNAM.
Agradezco ampliamente al Dr. Fernando Lara Rojas por su apoyo técnico y su asesoría
durante la realización de este trabajo.
Agradezco a la M. en C Ernestina Ubaldo, por su apoyo en el procesamiento de material
para microscopía electrónica.
Se reconoce el apoyo técnico de la Bióloga Olivia Sánchez González.
II
AGRADECIEMIENTOS PERSONALES
A mi madre y mis hermanos que siempre estuvieron ahí en las buenas y en las malas.
Al Dr. Jesús Aguirre Linares por recibirme en el laboratorio a su cargo y darme la libertad
de expresarme a través de la ciencia. Muchas gracias el apoyo recibido, los consejos y la
fraternidad que va más allá de un asesor.
Muchas gracias a mis compañeros de laboratorio, entre lecciones, felicitaciones y regaños,
los alumnos se convierten en colegas y los colegas en amigos: A Tadeo de Jesús un
estudiante brillante, noble, ameno y un amigo para toda la vida. José Antonio contreras, un
amigo fiel con una actitud férrea. Fabián Márquez un amigo sincero, un estudiante
trabajador y apasionado cuyas pláticas con café siempre atesoraré. Fernando Lara un gran
maestro e increíble persona con innegable madera de científico y un gran amigo. Y por
supuesto los jóvenes Ana Karen, Minerva, Ariann y Emilio que siempre dieron vida al
laboratorio.
A mis grandes maestros de vida: mi madre Nancy Edith Arroyo Olvera, mis hermanos
Norma y Oscar Jaimes Arroyo, el Dr. Gerardo Heberth Vázquez Nin,el Dr Luis Felipe
Jiménez García, la Dra. María Luisa Escobar, el Dr. Jesús Aguirre Linares, Moisés, Trini;
Pedrito, Juanito, Calixta, Alta Gracia, Teresita, Gabinito, Evangelina, Zara y Serapia, sin
ustedes, simplemente no sería lo que soy ahora.
A todos aquellos que se hayan topado conmigo en este camino y esté olvidando, ya el
tiempo me dará la oportunidad de agradecer.
III
DEDICATORIA
A mi madre que ha vivido para ver a sus hijos crecer
A mi hermana cuyo amor incondicional la caracteriza
A la memoria de mi hermano Oscar cuyo afecto y sacrificios lo convirtieron en un padre
orgulloso para mí
A mi Padre Santo que con su luz me llena y guía mi camino
“ Un científico en su laboratorio, no es sólo un técnico: es también un niño colocado ante
fenómenos naturales que le impresionan como un cuento de hadas…”
Marie Curie
IV
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS 1
RESUMEN 2
ABSTRACT 3
INTRODUCCIÓN 4
1. Las Especies Reactivas del Oxígeno (ERO) 4
1.1 Aspectos generales 4
1.2 Mecanismos antioxidantes y pro-oxidantes 6
2. Las ERO en la señalización celular 8
2.1 Las cinasas MAP (Mitogen Activated Protein Kinases) 8
2.2 Las Mnks (MAP kinase signal-integrating kinases) 10
3. Respuesta al estrés mediada por SAPK en hongos 12
3.1 Las SAPK en levaduras 13
3.2 Las SAPK en hongos filamentosos 16
4. Aspergillus nidulans como modelo de estudio 21
4.1 Ciclo de vida A. nidulans 22
OBJETIVO GENERAL 25
OBJETIVOS PARTICULARES 25
RESULTADOS 26
DISCUSIÓN 51
CONCLUSIÓNES 62
PERSPECTIVAS 63
APENDICE 1: Resultados publicados 64
APENDICE 2: Protocolos 93
REFERENCIAS 102
1
LISTA DE ABREVIATURAS
ERO: Especies Reactivas del Oxígeno
SAPK: Stress Activated Protein Kinase
FT: Factor Transcripcional
Mnk: MAP kinase-signal integrating kinase
O2: Oxígeno molecular
O2 • –: Anión superóxido
MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase
PRX: Peroxirredoxina
H2O2: Peróxido de hidrógeno
t-BOOH: Tertbutil-hidroperóxido
HK: Cinasa de Histidina
GFP: Proteína verde fluorescente
mRFP: Proteína monomérica roja fluorescente
MM: Medio Mínimo
2
RESUMEN
Los hongos filamentosos, como muchos otros organismos eucariontes, emplean cinasas
especializadas activadas por mitógenos o MAPK (Mitogen-activated protein kinases) para
transmitir señales del entorno. Las MAPK especializadas en transmitir las señalas de estrés
se les llama SAPKS (Stress Activated Protein Kinases) y pertenecen a la familia
Hog1/P38/JNK. En el hongo filamentoso Aspergillus nidulans la SAPK SakA y el factor
transcripcional AtfA forman una vía central que regula la respuesta antioxidante y el
desarrollo. En el presente trabajo caracterizamos un nuevo componente de la vía SakA, la
cinasa tipo Mnk (MAP kinase-signal integrating kinase) SrkA y atribuimos nuevas
funciones a la poco estudiada SAPK MpkC. Las mutantes ∆sakA y ∆srkA muestran un
fenotipo sexual incrementado. Las mutantes ∆mpkC y ∆srkA, a diferencia de la mutante
∆sakA, no son sensibles al estrés oxidativo. Por el contrario, la deleción de mpkC y srkA
suprimen parcialmente la sensibilidad al estrés de las cepas mutantes ∆sakA. Notablemente,
una mutante triple en estos genes es más resistente al estrés oxidativo que una cepa
silvestre. Además, la deleción de srkA y/o mpkC promueven una esporulación asexual
(conidiación) exacerbada con respecto a una cepa silvestre y una germinación de las
esporas más rápida. Ambos eventos se suprimen al deletar a sakA en estas cepas. Al igual
que SakA, SrkA se concentra en el núcleo en condiciones de estrés. Sin embargo, ambas
proteínas se encuentran siempre unidas en el citoplasma, aún en ausencia de estrés y el
patrón de localización de SrkA depende totalmente de SakA. Encontramos que el H2O2
altera drásticamente la morfología mitocondrial, posiblemente induciendo la fisión de las
mismas y la acumulación de SrkA en las mitocondrias, de manera dependiente de la
presencia de SakA. Empleando la co-precipitación de proteínas etiquetadas SakA::S-tag y
SrkA::S-tag y estudios de purificación, acoplados a espectrometría de masas, encontramos
que SakA interactúa con SrkA, la SAPK MpkC, la fosfatasa PTPA, y otras proteínas
relacionadas con la regulación de ciclo celular, la respuesta al daño del ADN y la función
mitocondrial. Nuestros resultados contribuyen a comprender cómo los organismos
mantienen un estado de homeostasis REDOX mediante la vía de SakA-MpkC-SrkA,
generando señales antioxidantes o promoviendo eventos pro-oxidantes según el contexto
fisiológico para regresar al organismo un estado de oxido-reducción basal.
3
ABSTRACT
Filamentous fungi, and other eukaryote organisms use specialized Mitogen Activated
Kinases (MAPK) to transduce environmental signals. The MAPKs specialized in
transducing stress signals are called Stress Activated Protein Kinases (SAPKs) and they
belong to be Hog1/p28/JNK family. In Aspergillus nidulans, the SAPK SakA and the
transcriptional factor AtfA are central components of the antioxidant response and are also
involved in regulation of development. In this work, we characterized a new SakA pathway
component, the Mnk SrkA protein kinase, and identified new functions to little studied
SAPK MpkC. ∆sakA and ∆srkA mutant strains show a derepressed sexual development.
Unlike the ∆sakA mutants ∆mpkC and ∆srkA are not sensitive to oxidative stress. In fact the
deletion of any of these genes partially suppresses the sensitivity to oxidative stress in
∆sakA genetic background. Moreover, a triplemutant in the tree genes is more resistant to
oxidative stress than a wild strain. On the other hand, single or double deletion of mpkC
and srkA genes results in exacerbated asexual sporulation (conidiation) and faster spore
germination respect to a wild type strain, both phenotypes being suppressed by sakA
deletion. We found that H2O2 induces a drastic morphological change in mitochondria,
consistent with a fission process and that SrkA mitochondrial accumulation depends on the
presence of SakA. Using co-precipitation of SakA::S-tag and SrkA::S-tag protein fusions,
purification assays coupled with mass spec, we found that SakA interacts with SakA,
MpkC, the phosphatase PtpA and other set of proteins implicated in the control of cell
cycle, the DNA damage response and mitochondrial function. Our resuls provide new
knowledege about the mechanisms by wich organisms mantain a REDOX steady state. The
SakA-MpkC-SrkA pathway, providing the cell witn the capabilities to trigger the
antioxidant response or promove pro-oxidant prosess, depending of the physiological
context to get the organism into a oxido-reduction basal state.
4
INTRODUCCIÓN
1. Las Especies Reactivas del Oxígeno (ERO)
1.1 Aspectos generales
El 21% del la atmósfera terrestre es oxígeno molecular (O2). Prácticamente todo el O2 es
producto de procesos biológicos, a través de la oxidación del agua que lleva a cabo el
fotosistema II de las plantas, las algas y las cianobacterias con la energía de la luz solar.
Todos los organismos aerobios emplean el O2 como aceptor final de la cadena respiratoria
para producir energía en forma de ATP. Aproximadamente el 80% del ATP que utilizamos
se forma en las mitocondrias, en donde se consume entre el 85 y el 90% del O2 (Hansberg,
2002). El hecho de que los organismos aerobios necesiten del O2 para sobrevivir opaca sus
propiedades tóxicas y mutagénicas. De hecho, los organismos aerobios mantienen un
estado de resiliencia con este gas gracias a que han desarrollado sistemas antioxidantes
(Halliwell y Gutteridge, 2007). A partir del O2 pueden generarse especies reactivas del
oxígeno (ERO) como subproducto de la cadena respiratoria, otros procesos metabólicos,
algunas reacciones catalizadas por metales pesados y/o por la exposición a radiaciones UV.
Las ERO son más reactivas que el O2 en su estado basal, debido a que contienen uno o mas
electrones no pareados. Se pueden generar tanto por la excitación del O2, de la que se
forman el oxígeno atómico (O), el oxígeno en singulete (1O2) y el ozono (O3) como también
por su reducción parcial, dando lugar al anión superóxido (O2•–), el peróxido de hidrógeno
(H2O2) y el radical hidroxilo (HO•) (Halliwell, 1989; Toda et al., 1996).
Cuando se produce un incremento en la concentración intracelular de las ERO, como
consecuencia de un aumento en su generación o la disminución en la capacidad para
eliminarlas, la célula entra en un estado fisiológico denominado: estrés oxidativo (Sies,
1991), el cual tiene efectos tóxicos a través de reacciones con diversas moléculas y
componentes celulares, tales como, los ácidos nucleicos, los lípidos y las proteínas entre
otros (Halliwell, 1989, 2006).
5
El H2O2 reacciona con los metales en transición unidos al ADN generando HO.. El HO.
puede atacar tanto a las purinas como a las pirimidinas, así como a la desoxirribosa, además
de generar rupturas de cadena sencilla y doble en el ADN (Sedelnikova et al., 2010). El 1O2
es más selectivo y generalmente produce, sobre todo 8–hidroxiguanina (Marnett y
Plastaras, 2001).
Los ácidos grasos poliinsaturados son más lábiles a la oxidación que los saturados y los
monoinsaturados porque los metilenos entre dos dobles ligaduras pueden perder fácilmente
un hidrógeno (hidrógeno alílico). Las ERO que pueden robar estos hidrógenos son el HO. y
el HO2.. Una vez generado el radical carbono en un ácido graso, éste reacciona con el O2
para formar un radical peróxilo. El radical peróxilo puede robar un hidrógeno alílico a otro
metileno con lo cual se propaga la reacción (Halliwell, 1999).
El HO. reacciona con cualquier aminoácido en el sitio donde éste se forma, que
generalmente son los sitios en donde se encuentra un metal de transición como en los que
se encuentran dentro de los grupos hemo (Aguirre y Hansberg, 1986). El O2 reacciona con
los aminoácidos triptófano, tirosina, histidina, lisina, metionina y cisteína (Dean et al.,
1997). Los daños producidos por el HO. y el 1O2 son irreversibles y en términos generales
marcan las proteínas para su degradación (Hansberg 2002).
El H2O2 puede reaccionar con residuos de cisteína de pKa bajo, lo cual permite el ataque
nucleofílico, produciendo ácido sulfénico, sulfínico o sulfónico, dependiendo del grado de
oxidación, o formar puentes disulfuro intra o intermoleculares con otras cisteínas (Imlay,
2003). Los grupos tiol de diversas proteínas se oxidan de manera reversible cambiando su
actividad. Este es el caso de cinasas, fosfatasas, peroxiredoxinas, SUMO ligasas y factores
transcripcionales (D'Autreaux y Toledano, 2007; Dansen et al., 2009; Veal et al., 2004;
Winterbourn y Hampton, 2008). Esto demuestra un papel de las ERO en la regulación de
bio-moléculas, no relacionado con el de daño tal y como exploraremos más adelante.
6
1.2 Mecanismos antioxidantes y pro-oxidantes
La homeostasis oxido/reducción o redox en los sistemas vivientes, depende de un balance
entre los sistemas antioxidantes y los oxidantes de tal manera que los antioxidantes
mantienen bajos los niveles de oxidantes (ERO) permitiendo a éstos ser útiles en variadas
funciones biológicas, sin generar algún daño a la célula (Halliwell, 2006).
Un antioxidante se define como “cualquier sustancia que cuando está presente en bajas
concentraciones, en comparación con un sustrato oxidable, retarda o inhibe
significantemente la oxidación de ese sustrato” (Halliwell y Gutteridge, 1986). Existen
compuestos antioxidantes tanto enzimáticos como no enzimáticos. Los antioxidantes no
enzimáticos actúan interceptando los oxidantes y desactivándolos al reaccionar
directamente con éstos. Una importante fuente de antioxidantes no enzimáticos está
presente en la dieta (Rice-Evans y Miller, 1996; Rock et al., 1996; Sies y Stahl, 1995), tales
como el ascorbato (vitamina C), los tocoferoles (vitamina E) y los carotenoides. La
vitamina C reacciona con el anión superóxido, el H2O2, el OH y el 1O2. El término vitamina
E es una descripción genérica de todos los tocoles y derivados del tocotrienol que exhiben
actividad biológica de α -tocoferol (Kamal-Eldin y Appelqvist, 1996; Parker, 1989). La
vitamina E inhibe la peroxidación de los lípidos, por lo tanto previene el daño en las
membranas y la modificación de lipoproteínas (Sies, 1997). Los carotenos son colorantes
naturales con una pronunciada actividad antioxidante que desecha eficientemente el 1O2 y
el OH (Olson y Krinsky, 1995; Stahl y Sies, 1997). El glutatión es un tripéptido de glu–
cys–gly (GSH) sintetizado en la célula, directamente relacionado con la respuesta
antioxidante. El glutatión es el tiol más abundante en el citosol y sirve como cofactor de
varias enzimas desintoxicantes y también puede eliminar ERO al oxidarse a GSSG
(Mullineaux y Creissen, 1997).
Entre las enzimas con actividad antioxidante se encuentran las superóxido dismutasas
(SOD), las catalasas (CAT) y las peroxidasas (PX), como la glutatión peroxidasa (GPx) y
las peroxirredoxinas (Prx). La SOD cataliza una reacción que dismuta el O2- en H2O2 y O2.
Todos los miembros de la familia de las SOD emplean metales de transición en sus sitios
7
activos. Las bacterias emplean Fe-SOD y Mn-SOD mientras que los mamíferos utilizan
distintas formas citoplasmáticas y extracelulares de Cu-SOD, Zn-SOD y la Mn-SOD
mitocondrial (Davies, 2000). El producto principalde la SOD es el H2O2 el cual, es fácil de
desechar, principalmente a través de las catalasas mediante la reacción: 2H2O2 → 2H2O +
O2. Las catalasas son homotetrámeros con un grupo hemo que forma parte de su sitio
activo, se encuentran típicamente en los peroxisomas, donde se genera H2O2 durante los
procesos de ß-oxidación (Imlay, 2003), pero también se encuentran en otros
compartimentos celulares. Las peroxidasas al igual que las catalasas son hemoenzimas que
también descomponen H2O2, así como peróxidos orgánicos a través de la oxidación de
sustratos específicos. Por ejemplo, la glutatión peroxidasa que utiliza el poder reductor del
glutatión (Davies, 2000).
Las peroxirredoxinas (PRX) son enzimas que catalizan la descomposición del H2O2, los
peroxinitritos y los peróxidos orgánicos, así como también la reducción de residuos de
cisteínas oxidadas en las proteínas (Davies, 2000; Rhee et al., 2003). Su mecanismo de
reacción es por la oxidación de una cisteína a ácido sulfénico (-SOH) en su sitio catalítico.
Esta oxidación permite una reacción de condensación con otra cisteína, que da lugar a la
formación de un puente disulfuro inter o intramolecular. Las tioredoxinas, las
glutaredoxinas o el glutatión pueden servir como donadores de electrones para reducir a las
PRX (D'Autreaux y Toledano, 2007; Wood et al., 2003).
Como se mencionó desde un principio, la producción de ERO dentro de la célula se da
principalmente por procesos metabólicos, de los cuales sobresale la respiración. El O2.- es
un subproducto de la cadena respiratoria, que ocurre en la membrana mitocondrial en los
complejos I (NADH deshidrogenasa) y III (ubiquinona-citocromo C reductasa), y se
produce cuando hay fugas de electrones que no reducen el O2 hasta H2O (Halliwell, 1989;
Murphy, 2009). También se puede formar O2•– por acción de algunas enzimas como la
xantina oxidasa, la NADPH oxidasa o el citocromo P450 (Cano-Dominguez et al., 2008;
Halliwell, 1989; Lambeth, 2004). El delicado equilibro entre la producción de ERO, su
manejo y su eliminación, depende en gran medida del monitoreo de las mismas a través de
cascadas de señalización que a su vez ejecutan diversas funciones celulares utilizando a las
8
propias ERO como segundos mensajeros, a continuación profundizaremos en estos
procesos, iniciando por comprender cómo funcionan dichas cascadas.
2. Las ERO en la señalización celular
2.1 Las cinasas MAP (Mitogen-Activated Protein Kinases)
La familia de cinasas activadas por mitógenos o MAPK (Mitogen-Activated Protein
Kinases), está compuesta de cinasas que convierten los estímulos extracelulares en señales
de fosforilación y que generan una amplia gama de respuestas celulares, tales como la
regulación de la expresión genética, la división celular, el metabolismo, la movilidad, la
supervivencia, la apoptosis y la diferenciación (Aguirre y Lambeth, 2010; Cargnello y
Roux, 2011; Gustin et al., 1998; Herskowitz, 1995; Treisman, 1996).
Cada vía MAPK, está compuesta de tres niveles de proteínas cinasas evolutivamente
conservadas que se fosforilan secuencialmente una a otra: la propia MAP cinasa (MAPK),
una cinasa MAP cinasa (MAPKK) y una cinasa MAPKK (MAPKKK) (Fig. 1). El proceso
de activación de la vía comienza con la fosforilación de la MAPKKK por otra proteína
que recibe una señal proveniente de un estímulo externo o interno. A continuación, la
MAPKKK fosforila a la MAPKK en una serina y una treonina localizadas en un sitio
conservado en el amino terminal del dominio de cinasa. Una vez activa, la MAPKK
fosforila a la MAPK, en sitios conservados de serina y treonina (a veces tirosina). Este
sitio de fosforilación está localizado en el asa de activación en el dominio catalítico. La
doble fosforilación en la treonina y la tirosina se necesita para la activación de la MAPK.
Ya activada, la MAPK se transporta al núcleo, en donde fosforila residuos de
serina/treonina seguidos de residuos de prolina en sus proteínas blanco (Schwartz y
Madhani, 2004), aunque también puede fosforilar algunas proteínas en el citosol.
9
Figura 1. Vías de señalización mediadas por MAPK en S. cerevisiae. La MAPKKK de cada vía es sustrato de
fosforilación de componentes río arriba de cada ruta en respuesta a un estímulo. La MAPKKK fosforila a la MAPKK y
esta a su vez a la MAPK. Los residuos fosforilables de serina, treonina y tirosina están conservados en la mayoría de las
cinasas. Cada cascada posee una única MAPK, que dispara una respuesta distinta. Aunque también existen mecanismos
de “cross-talk”, río arriba de las MAPK.
En la levadura Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) se han caracterizado 5 vías
MAPK (Figura 1) (Gustin et al., 1998; Hunter y Plowman, 1997) que se han asociado con
respuestas a estímulos específicos (Herskowitz, 1995). La vía de Fus3p controla la
respuesta a feromonas de apareamiento sexual; la MAPK Smk1p se requiere para el
desarrollo meiótico; Kss1p regula el crecimiento filamentoso (Madhani et al., 1997). La
vía de la cinasa Mpk1p, también conocida como Slt2p, se activa por estrés hipotónico y
regula la arquitectura de la pared celular (Jung y Levin, 1999). Finalmente la vía de Hog1
se necesita para la respuesta al estrés osmótico principalmente, aunque también se activa
por otros tipos de estrés entre ellos el oxidativo (Smith y Nilar, 2010) (Figs. 1 y 3).
Por otro lado, la levadura Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) cuenta con tres vías
MAPK. La vía Pmk1/Spm1 está relacionada con el modelaje de la pared celular y la
citocinesis (Toda et al., 1996; Zaitsevskaya-Carter y Cooper, 1997); la vía Spk1 controla
la señalización en respuesta a feromonas (Errede y Levin, 1993), y finalmente la vía
Sty1/Spc1, la cual se activa por distintos tipos de estrés (Shiozaki y Russell, 1995).
10
En los mamíferos, se han caracterizado 14 MAPK, entre ellas ERK1/2 (Extracellular
Signal-Regulated Kinases) que juegan un papel central en la regulación en la proliferación
celular (Meloche y Pouyssegur, 2007), ERK5 que regula la supervivencia celular y la
proliferación (Mulloy et al., 2003). Mientras que se desconocen las funciones de ERK3,
se sabe que ERK4 participa en la proliferación celular (Klinger et al., 2009), la progresión
del ciclo celular (Julien et al., 2003) y la diferenciación celular (Coulombe et al., 2003).
ERK7 participa en la regulación de la proliferación celular (Abe et al., 1999) y NLK
(Nemo-Like Kinase) en la respuesta a estrógenos y glucocorticoides (Henrich et al., 2003;
Saelzler et al., 2006).
Por último, están las MAPK que responden al estrés. JNK 1, 2 y 3 (c-Jun amino N-
terminal kinase) juegan un papel importante en el control de la proliferación celular
(Sabapathy et al., 2004; Sabapathy y Wagner, 2004) y la inducción de la apoptosis
(Dhanasekaran y Reddy, 2008). P38 y sus isoformas α, β, γ y δ, juegan un papel crítico en
las respuestas inmune e inflamatorias (Cuadrado y Nebreda, 2010), regulando
negativamente la transición de G1/S y G2/M por diversos mecanismos, incluyendo la
regulación negativa de ciclinas y la regulación positiva de inhibidores de CDKs (Ciclin
Dependent Kinases) (Thornton y Rincon, 2009). También se ha asociado a p38 con la
inducción de la apoptosis como una respuesta al estrés celular (Cuadrado y Nebreda,
2010).
Dentro de las MAPK existe una subfamilia especializada en percibir y responder a los
distintos tipos de estrés del entorno, son denominadas como SAPK (Stress-Activated
Protein Kinases). Esta categoría abarca a Hog1, Sty1, p38 y JNK (Smith y Nilar, 2010) y
entre sus variados blancos para contender con el estrés, existe una familia de cinasas
caracterizadas por ser sus mayores efectores (Buxade et al., 2008; Gaestel, 2006).
2.2 Las Mnks (MAP kinase-signal integrating kinases)
Entre los principales blancos de las MAPK se encuentra una superfamilia de cinasas
denominadas como Mnks(MAP kinase-signal integrating kinases), también conocidas
11
como MAPKAP (MAP Kinase-Activated Protein Kinases) (Fukunaga y Hunter, 1997;
Waskiewicz et al., 1997). Descritas en mamíferos (Caenepeel et al., 2004; Manning et al.,
2002b), levaduras, hongos filamentosos, gusanos y moscas (Manning et al., 2002a), se
han definido distintas subfamilias de estas cinasas como efectores río abajo de las MAPK
y las SAPK. Basándose en el sitio catalítico de cinasa, todas estas proteínas pertenecen a
la súper familia de cinasas de serina/treonina dependientes de Ca+/calmodulina (Buxade et
al., 2008; Cargnello y Roux, 2011; Gaestel, 2006).
Basándose en sus distintas regiones conservadas, se han establecido 4 subfamilias de estas
proteínas. Dos subfamilias que poseen dos dominios catalíticos ribosomales S6 en
tándem: la subfamilia RSK (Ribosome S6 catalitic domine Kinase) (también conocida
como MAPKAP1 A-D) y la subfamilia MSK (Mitogen and Stress activated Kinase). Las
RSKs se activan exclusivamente por ERK y las MSKs se activan tanto por ERK como por
p38 (Soloaga et al., 2003). La tercer subfamilia es MNK, formada por MNK1 y 2
contienen un dominio catalítico activado por las vías de ERK y p38. Finalmente, la
subfamilia MK compuesta por MK2, MK3 y MK5. MK2 está relacionada con la
regulación del ciclo celular en los puntos de control de CDC-25 y p-53 (Abraham, 2005;
Bettencourt-Dias et al., 2004; Manke et al., 2005). MK3 se relaciona con el remodelaje de
la cromatina (Voncken et al., 2005), y la activación de MK5 se relaciona con el desarrollo
(Schumacher et al., 2004; Seternes et al., 2004).
El dominio regulatorio ubicado en el C-terminal de MK2 está conservado en los gusanos,
en las moscas y en los mamíferos, mientras que el la región amino terminal rica en prolina
sólo se encuentra en vertebrados (Gaestel, 2006). MK5 se encuentra en todos los
vertebrados, mientras que MK3 sólo aves y mamíferos. Los erizos de mar poseen además
una cinasa denominada MK4 estructuralmente homóloga a MK2 (Komatsu et al., 1997).
En las levaduras existen homólogos de las MK, (Dahlkvist et al., 1995; Manning et al.,
2002a). En S. pombe Spc1/Sty1 fosforila la cinasa Srk1, cuya activación inhibe la
progresión del ciclo celular promoviendo la relocalización de Cdc25 del núcleo al
citoplasma (Lopez-Aviles et al., 2008). Srk1 tiene un papel regulatorio en la meiosis ya
que las mutantes deficientes en Srk1 entran en meiosis más rápido que las cepas
silvestres, y la sobre expresión de Srk1 inhibe el arresto celular en G1 inducido por
12
privación de nitrógeno (Smith et al., 2002).
En S. cerevisiae, Hog1 fosforila a la cinasas Rck1 y Rck2 (ortólogas de Srk1) en respuesta
al estrés osmótico y al oxidativo (Bilsland et al., 2004; Teige et al., 2001). Las mutantes
deficientes de Rck2 son sensibles al estrés oxidativo pero no al estrés osmótico (Bilsland
et al., 2004). La deleción del gen rck2 suprime la letalidad causada por la sobre-activación
de la vía de Hog1 (Teige et al., 2001) lo cual sugiere que Rck2 es mediador de la
detención del ciclo celular en condiciones de estrés. En condiciones de estrés, Rck2
fosforila el factor de elongación EF2, atenuando de manera transitoria la síntesis proteica.
Rck1 interactúa con el factor transcripcional Yap2 y el transportador de calcio Zrc1
(Bilsland et al., 2004; Swaminathan y Sunnerhagen, 2005). En el hongo patógeno
Candida albicans las mutantes ∆caRck2p no son sensibles al estrés osmótico, pero
pierden estabilidad en la pared celular y su virulencia está atenuada (Li et al., 2010).
Una vez descrito cómo funcionan las SAPK a través sus principales proteínas blanco, las
Mnk, podemos ahondar en los procesos en que actúan en respuesta a distintos tipos de
estrés.
3. Las respuestas al estrés mediada por SAPK en los hongos
Debido a su plasticidad y su fácil manipulación como modelo experimental, los hongos
son idóneos para el estudio de las SAPK. Gracias a estos modelos se ha generado
suficiente evidencia que señala la intrincada relación entre la transducción de señales de
estrés y el disparo de distintos eventos fisiológicos, entre ellos un programa
transcripcional que lleva a los organismos a tomar distintas decisiones durante el
desarrollo, el control de ciclo celular y la muerte (Aguirre et al., 2005; Kawasaki et al.,
2002; Skromne et al., 1995)
A pesar de su alto grado de conservación (Nikolaou et al., 2009), los mecanismos que se
han desarrollado para transmitir las señales de estrés mediante la vía de las SAPK han
divergido de manera significativa (Smith y Nilar, 2010). En los hongos, la vía de las
13
SAPK está acoplada un sistema de fosforelevo similar al descrito en las bacterias
(Mizuno, 1997; Santos y Shiozaki, 2001), el cual consta en una o más cinasas sensoras
tipo HK (Hybrid sensor Kinases), una proteína fosfotransmisora HPt (Histidine-
containing Phosphotransfer protein) y dos proteínas reguladoras de la respuesta (RR)
(Santos y Shiozaki, 2001). Ante un cierto estímulo, las HK se autofosforilan en un residuo
de histidina en su domino transmisor. A continuación, ese grupo fosfato se transfiere un
resido de ácido aspártico del dominio receptor de la misma proteína. Posteriormente, el
fosfato se transfiere a la Hpt, la cual a su vez lo transfiere a uno o a los dos RR (Parkinson
y Kofoid, 1992).
En los hongos, la relación entre las señales de estrés y el desarrollo se ha estudiado
principalmente con respecto al estrés oxidativo (Aguirre y Lambeth, 2010; Aguirre et al.,
2005; Hansberg y Aguirre, 1990; Hernandez-Garcia et al., 2010). La hipótesis de que la
diferenciación celular es una respuesta a un estado hiperoxidante, se basó inicialmente en
la detección de proteínas oxidadas tales como la glutamina sintetasa, la glutamato
deshidogenasa y otras proteínas no identificadas, así como en la oxidación del NAD(P)H
y el glutatión durante la diferenciación asexual del hongo Neurospora crassa. De acuerdo
con esta idea, los estados de crecimiento y diferenciación, corresponden a distintos
estados estables en los que los niveles de ERO se encuentran en equilibrio entre su
producción y su eliminación. El rompimiento de estos estados es lo que regula las
transiciones entre el crecimiento y la diferenciación (Aguirre et al., 2005; Cano-
Dominguez et al., 2008; Hansberg y Aguirre, 1990).
3.1 Las SAPK en levaduras
En S. pombe, la vía de la SAPK Sty1 (también llamada Spc1) detecta y responde a una
gama variada de estímulos externos (figura 3) (Buck et al., 2001; Ikner y Shiozaki, 2005;
Nguyen et al., 2000; Quinn et al., 2002). Esta vía se activa por el estrés osmótico (Millar
et al., 1995), el oxidativo, por choque térmico (Degols et al., 1996), baja temperatura
(Soto et al., 2002), limitación de nitrógeno (Shiozaki y Russell, 1996) o de carbono
(Morigasaki et al., 2008), por radiación con luz UV (Degols y Russell, 1997), presencia
de metilglioxal (Takatsume et al., 2006), de arsenito de sodio (Rodriguez-Gabriel y
14
Russell, 2005) y estrés por presión (George et al., 2007).
S. pombe contiene tres HK llamadas Mak1, Mak2 y Mak3, una HPt llamada Mpr1 y dos
RR llamados Mcs4 y Prr1. Las HK Mak2 y Mak3 transmiten señales de estrés oxidativo a
través de Mcs4, hacia la MAPK Spc1/Sty1 mediante la activación de la MAPKKK
Wis4/Win1, que a su vez fosforila y activa la MAPKK Wis1, la cual finalmente fosforila
y activa a Spc1/Sty1 (Buck et al., 2001). Una vez activada, Spc1/Sty1 fosforila al factor
transcripcional Atf1 (Gaits et al., 1998; Shiozaki y Russell, 1996; Wilkinson et al., 1996),
homólogo de ATF2 en humanos. Atf1 es mediador de la mayor parte de las respuestas
reguladas por Spc1/Sty1 (Chen et al., 2003) (Figura 3). Spc1/Sty1, se requiere para
inducir la mayoría de los genes de la respuesta antioxidante, incluido el gen de catalasa
ctt1 (Buck et al., 2001). Cepas deficientes en Spc1/Sty1 muestranun retraso en G2, el
cual se exacerba en condiciones de alta osmolaridad (Shiozaki y Russell, 1995), así como
un retraso en el inicio de la mitosis (Millar et al., 1995). Spc1/Sty1 fosforila a la cinasa
Srk1, la cual regula la entrada a la fase M, fosforilando e inhibiendo a la fosfatasa Cdc25
durante el ciclo celular (Lopez-Aviles et al., 2005). En respuesta al estrés osmótico, Sty1
fosforila a Srk1 induciendo su activación. Inmediatamente después de activarse, Srk1 se
disocia de Sty1 e inhibe la progresión del ciclo celular promoviendo la relocalización de
Cdc25 hacia el citoplasma. Por otro lado, la misma fosforilación que activa Srk1 la vuelve
inestable y es degradada posteriormente, mientras Sty1 activa genes de respuesta al estrés
(Lopez-Aviles et al., 2008).
La MAPK Hog1 (High osmolarity glicerol) de la levadura S. cerevisiae, inicialmente se
describió por ser esencial en condiciones de alta osmolaridad (Brewster et al., 1993).
Posteriormente se ha encontrado que Hog1 responde a una variedad más amplia de
estímulos, como el estrés causado por alta temperatura (Winkler et al., 2002), frío,
(Hayashi y Maeda, 2006; Panadero et al., 2006), presencia de ácido cítrico (Lawrence et
al., 2004), de arsenito de sodio (Thorsen et al., 2006), de metilglioxal (Maeta et al., 2005)
o de ácidos débiles (Mollapour y Piper, 2006).
En condiciones de baja osmolaridad, la HK Sln1 de S. cerevisiae se mantiene activa y se
autofosforila en un residuo de histidina localizado en su dominio transmisor de fosfato.
15
Posteriormente el grupo fosfato se transfiere al ácido aspártico presente en su dominio
receptor, y de ahí, el grupo fosfato pasa al residuo de histidina de la proteína Ypd1.
Finalmente el fosfato se transfiere de Ypd1 al ácido aspártico del dominio receptor de los
RR Ssk1 y Skn7. En condiciones de osmolaridad alta, Sln1 se inactiva y se interrumpe
fosforelevo a través de Ypd1 y Ssk1. A continuación Ssk1 desfosforilada se acumula y
esto ocasiona que la MAPKKK Ssk2/22 cambie su conformación, llevándola a la
autofosforilación en su sitio catalítico (Posas y Saito, 1997, 1998). Ssk2/22 fosforila y
activa a la MAPKK Pbs2, la cual a su vez fosforila y activa a la MAPK Hog1 (Thorsen et
al., 2006) (Figura 3). La vía de Hog1 cuenta con un segundo sistema de activación que
converge en la activación de Pbs2 y que proviene de Sho1. En condiciones de estrés
osmótico, las cinasas Ste20/Cla4 activan a el complejo Ste11/Ste50. A continuación Ste11
fosforila a Pbs2 siguiendo la vía río abajo (Tatebayashi et al., 2006).
A través de Hog1, se modula un arresto transitorio del ciclo celular en distintas fases
(figura 2), para permitir a las células adaptarse antes de continuar con etapas esenciales
del ciclo celular (Alexander et al., 2001; Yaakov et al., 2003; Escoté etal., 2004; Zapater
etal., 2005; Clotet et al., 2006; Clotet and Posas, 2007; Yaakov et al., 2009). En respuesta
al estrés oxidativo, Hog1 evita la entrada prematura a la fase S reprimiendo las ciclinas de
G1 Cln1 y Cln2, así como estabilizando y favoreciendo la acumulación del inhibidor de
ciclinas de la fase S Sic1(Escote et al., 2004; Zapater et al., 2005). La activación de Hog1
impide la entrada prematura a la fase M, regulando la ciclina principal de G2, Clb2 así
como la acumulación del inhibidor de la CDK de G2, Swe1p (Clotet y Posas, 2007).
Ya iniciada la fase S, Hog1 retrasa su progresión (figura 2) al demorar la fosforilación de
la sub-unidad Dpb2 de la ADN polimerasa, retrasando así la replicación (Yaakov et al.,
2009). Además, Yaakov y colaboradores mediante ensayos de co-inmunoprecipitación
identificaron otros componentes del complejo de replicación del ADN que interactúan con
Hog1 como, Mcm4 , Cdc45, Psf2 y Cdc7. Sin embargo, el mismo grupo realizó ensayos
de fosforilación de Hog1 con más de 25 proteínas involucradas en la replicación y
ninguna se identificó como blanco de fosforilación de Hog1 (Yaakov et al., 2003). Pero
no habría que descartar que la simple interacción de Hog1 con alguno o varios
componentes de dicha maquinaria pudiese regular su función.
16
En estado quiescente, las células deficientes en Hog1 muestran un retraso en la
reiniciación del ciclo celular (Figura 2). Además, cepas con una versión de Hog1 cuya
fosforilación es inhibible, muestran el mismo fenotipo de retraso en G0 en presencia del
inhibidor de Hog1. Estos resultados sugieren que la activación de Hog1 también modula
el reinicio del ciclo celular de levaduras en estado quiescente o G0 (Escote et al., 2011).
Figura 2. Arresto transitorio del ciclo celular mediado por Hog1. En respuesta al estrés osmótico y durante la salida
de G0 a G1, Hog1 se fosforila y actúa sobre diversos substratos deteniendo el ciclo celular en distintos puntos y
permitiendo que las células se adapten a las nuevas condiciones, antes de continuar con su ciclo (ver texto).
Es claro que las levaduras captan ciertos estímulos, que a través de las vía de las MAPK
desencadenan patrones transcripcionales específicos y permiten a las células confrontar
situaciones adversas, regulando el freno y el avance del ciclo celular. Esto implica que
podemos entender el freno-avance del ciclo celular como una respuesta a señales de
estrés.
3.2 Las SAPK en los hongos filamentosos
En comparación con las levaduras, la mayoría de los hongos filamentosos cuentan con
ciclos de vida mucho más complejos y muestran estructuras multicelulares durante su
17
desarrollo ya sea sexual o asexual. Existen hongos filamentosos reconocidos como
excelentes modelos de estudio, como Aspergillus nidulans, Neurospora crassa y hongos
de interés comercial como Aspergillus niger o Aspergillus oryzae o de interés clínico
como Aspergillus fumigatus y Aspergillus flavus. El estudio del desarrollo como una
respuesta a señales de estrés a través de las SAPK y sus principales efectores las Mnk en
los hongos filamentosos puede proporcionarnos una mejor comprensión del desarrollo en
organismos multicelulares. Además, la generación de este tipo de conocimiento puede ser
útil para desarrollar blancos terapéuticos para especies patógenas, o para la producción de
enzimas a gran escala en especies de interés industrial.
A. nidulans muestra una esporulación asexual (conidiación) provocada por señales
externas como la exposición al aire (Adams et al., 1998; Clutterbuck, 1969; Timberlake y
Clutterbuck, 1994), la presencia de señales generadas por el mismo organismo (Lee y
Adams, 1996; Marquez-Fernandez et al., 2007; Seo et al., 2003; Soid-Raggi et al., 2006) y
la privación de nutrientes (Skromne et al., 1995).
Los componentes de las vías descritas para las SAPK de S. pombe y S. cerevisiae, son
similares a los presentes en hongos filamentosos. A. nidulans cuenta con 15 proteínas
HKs, una proteína Hpt, YpdA y los dos RR SrrA y SskA (Figura 3). De las 15 HK, se han
estudiado TcsA, TcsB, FhpA y NikA (Furukawa et al., 2005; Vargas-Perez et al., 2007).
Las cepas mutantes carentes de TcsA presentan defectos en la producción de esporas o
conidiación, sin embargo, estos defectos se corrigen creciendo las cepas en condiciones de
alta osmolaridad o después de su propagación sucesiva, lo cual sugiere que otra HK con
una función redundante podría estar supliendo las funciones de TcsA (Virginia et al.,
2000). FphA presenta un dominio PAS, una secuencia de localización nuclear, un
dominio GAF y un dominio de fitocromo (fotorreceptor de la luz roja) (Purschwitz et al.,
2009). Se ha propuesto que FphA, junto con los fotorreceptores LreA y LreB, homólogos
al complejo receptor de luz azul en N. crassa WC-1/LreA y WC-2/LreB, forman parte de
un complejo fotorreceptor que regulado por la luz dispara señales de desarrollo y
metabolismo secundario (Bayram et al., 2008; Calvo et al., 2002; Purschwitz et al., 2009;
Sarikaya Bayram et al., 2010). Medianteensayos de co-inmunoprecipitación y bi-
fluorescencia molecular se ha demostrado la interacción entre FphA, LreB y VeA,
18
represor de la conidiación y activador del desarrollo sexual en presencia de la luz
(Purschwitz et al., 2009). Estos datos relacionan a FphA con la respuesta a la luz y la
regulación del desarrollo.
La HK NikA actúa río arriba de los RR SrrA y SskA (Figura 3) para transmitir las señales
ocasionadas por fungicidas del tipo fludioxonil, para regular la esporulación asexual y la
viabilidad de las conidiosporas pero no para la transmisión de señales de estrés osmótico u
oxidativo (Hagiwara et al., 2007; Vargas-Perez et al., 2007). SrrA y SskA participan en
respuesta al estrés osmótico, pero los mutantes deficientes en SskA son más sensibles a
este tipo de estrés, y en bajas concentraciones de H2O2 solo SrrA se requiere para la
resistencia y para la inducción de la catalasa B (CatB). Ambos RR se requieren
individualmente para la sensibilidad al fludioxonil, la resistencia al calcofluor, la
esporulación normal y la viabilidad de las conidiosporas. Los defectos en la conidiación
en cepas deficientes de ambos RRs parecen estar relacionados con una baja expresión del
gen brlA (Vargas-Perez et al., 2007).
SskA media la activación de SakA, la MAPK ortóloga de Hog1 y Spc1 (Figura 3). Las
mutantes deficientes en SakA no son sensibles a alta osmolaridad, pero muestran un
desarrollo sexual prematuro y las conidiosporas son sensibles al estrés calórico y
oxidativo y notablemente tienen una viabilidad disminuida . SakA se fosforila de manera
transitoria durante la conidiación sugiriendo que juega un papel importante para la
señalización del estrés, la represión del desarrollo sexual, y la supervivencia de las células
en estado quiescente (esporas) (Kawasaki et al., 2002). Furukawa y colaboradores
expresaron los genes relacionados con la vía de SakA de A. nidulans en S. cerevisiae. La
expresión de ypdA y pbsB en cepas ∆ypd1 y ∆pbs2 respectivamente complementa las
funciones de sus contrapartes en la vía de Hog1, dato que indica el grado de conservación
de estas cinasas (Furukawa et al., 2005). SakA interacciona en el núcleo con el factor
transcripcional AtfA y regula la expresión de los genes de catalasa catA y catB, en
respuesta al estrés oxidativo (Lara-Rojas et al., 2011). SakA también se acumula en los
conidios de manera dependiente de AtfA, se fosforila durante el desarrollo de los conidios
y se desfosforila durante la germinación de las esporas. Cuando SakA se mantiene
fosforilada (activa) de manera constitutiva, se inhibe la germinación, la formación del
19
tubo germinal y la división nuclear. Estos datos indican que el estado de fosforilación de
SakA regula la transición entre la latencia (espora) y el crecimiento (germinación) y esto
está conservado en N. crassa y posiblemente en otros hongos (Lara-Rojas et al., 2011). En
efecto se ha examinado la fosforilación de OS-2, ortóloga de SakA en N. crassa, y se
observó que OS-2 se encuentra fosforilada en las esporas y dicha fosforilación decrece
gradualmente durante la germinación (Lara-Rojas et al., 2011). Sin embargo, aún se
desconocen los mecanismos mediante los cuales el grado de fosforilación de SakA regula
la funcionalidad de las esporas, la inactividad/actividad celular y/o el ciclo celular.
Figura 3. Las vías de señalización mediadas por SAPK en S. cerevisiae, S.pombe y A. nidulans. Cada vía SAPK, está
compuesta de tres niveles de proteínas cinasas: la propia SAPK, una cinasa MAP cinasa (MAPKK) y una cinasa MAPKK
(MAPKKK). La MAPKKK fosforila y por lo tanto activa la MAPKK, la cual posteriormente fosforila a la SAPK (Hog1,
Spc1/Sty1 o SakA y posiblemente MpkC). Esta fosforilación activa a la cinasa y su translocación nuclear. Una vez en el
núcleo la SAPK se une y fosforila sustratos como tales como el factor transcripcional Atf1 o AtfA (óvalos vino) y otros
sustratos desconocidos, posibles reguladores del ciclo celular y el desarrollo. Río arriba, cada vía está acoplada aun
20
sistema de fosforrelevo o de dos componentes (ver texto). En respuesta al estrés, las cinasas sensoras (óvalos grises)
fosforilan a las proteínas reguladores de la respuesta (óvalos azules), una de las cuales esta acoplada a la cascada SAPK.
Se ha reportado una segunda SAPK al mismo nivel de la vía de SakA, denominada
MpkC, la cual está presente sólo en los hongos del género Aspergillus (Fig. 3). Sin
embargo, no se ha reportado un fenotipo evidente en cepas deficientes en MpkC. De
hecho MpkC sólo se detecta cuando se sobrexpresa desde un promotor heterólogo, ya que
normalmente esta MAPK no se detecta en ensayos tipo Western blot y se desconoce su
función (Furukawa et al., 2005; Kawasaki et al., 2002) La deleción de mpkC no genera
ningún fenotipo evidente (Reyes et al., 2006). En A. fumigatus los mutantes deficientes en
MpkC son viables y muestran conidiación, germinación y crecimiento vegetativo
normales. Sin embargo las mutantes carentes de MpkC no pueden crecer en medios con
sorbitol o manitol como fuentes únicas de carbono, lo cual implica que MpkC podría
participar en la señalización de la fuente de carbono. Además, se han comparado los
niveles de mRNA de mpkC con los de sakA en condiciones de estrés osmótico, oxidativo
y cambio de glucosa a sorbitol como recurso de carbono. El cambio en los niveles de
mRNA de ambas cinasas son distintos en cada condición, lo cual implica que estas
cinasas podrían estar respondiendo a diferentes estímulos, y que sus funciones podrían no
ser redundantes (Reyes et al., 2006). Por otro lado la deleción de otra MAPK, MpkB en A.
nidulans causa fallas en la formación de las estructuras sexuales o cleistotecios, un
crecimiento lento de las hifas y conidióforos aberrantes (Jun et al., 2011).
En resumen, las mutantes afectadas en la vía de las SAPK muestran no solamente una
sensibilidad a distintos tipos de estrés, si no que también suelen estar afectadas en
aspectos del desarrollo que están relacionados con la esporulación, la latencia y en
algunos casos con la diferenciación sexual. Proponemos que las células responden a
señales externas y/o internas de estrés, dichas señales son transmitidas por las SAPK
disparando dos tipos de respuestas, (1) la activación de genes para contender contra el
propio estrés y (2) la regulación ciclo celular y el desarrollo. En el presente trabajo
pretendemos describir los mecanismos a través de los cuáles se dan estas respuestas por
medio de 2 cinasas que son potenciales blanco de SakA; la SAPK MpkC y la Mnk SrkA
en el hongo filamentoso A. nidulans.
21
4. Arpergillus nidulans como modelo de estudio
El hongo filamentoso Aspergillus nidulans es un hongo homotálico de la familia
Aspergillaceae (orden Eurotiales, clase Eurotiomycetes) del phylum Ascomycota
(Houbraken y Samson, 2011). Los hongos miembros de la familia Aspergillaceae, son
principalmente saprobios y habitan en los suelos. Algunas especies tienen un impacto
positivo en algunas actividades humanas, al utilizarse durante los diferentes procesos de
fermentación para la producción de alimentos, antibióticos, ácidos orgánicos y enzimas.
Entre las especies de importancia industrial podemos encontrar a A. niger, A. oryzae, A.
sojae, Penicillium chrysogenum, P. roqueforti y P. Camberti. (Houbraken et al., 2014).
Por otra parte especies como A. fumigatus, A. parasiticus y A. flavus, son patógenos
oportunistas en personas inmunosuprimidas (Haas, 2011) y a su vez contaminan reservas
de semillas y alimentos ya que producen toxinas; como las aflatoxinas, que son potentes
agentes carcinógenos (Moretti et al., 2013).
A. nidulans posee un ciclo sexual bien caracterizado y un sistema genético bien
establecido (Galagan et al., 2005). La investigación en A. nidulans ha contribuido en el
entendimiento de un amplio rango de procesos biológicos, incluyendodescubrimientos
fundamentales como la recombinación genética (Pontecorvo y Kafer, 1958), el
descubrimiento del ciclo parasexual (Pontecorvo et al., 1953) el desarrollo de las esporas
(Adams et al., 1988; Clutterbuck, 1969; Mirabito et al., 1989; Timberlake, 1990), el ciclo
celular (Oakley y Morris, 1981; Osmani y Mirabito, 2004; Osmani et al., 1988; Xiang et
al., 1999), la polaridad celular (Momany et al., 2002), la reparación del ADN (Goldman y
Kafer, 2004), el metabolismo y su control (Brambl, 2004), el metabolismo secundario (Yu
y Keller, 2005), la señalización (Hicks et al., 1997) y el control del pH (Arst y Penalva,
2003; Penalva y Arst, 2004).
A. nidulans posee 8 cromosomas, así como un detallado mapa genético (Clutterbuck,
1969). Su genoma es relativamente pequeño (30 Mb) y se encuentra disponible a través
del Aspergillus Genome Database (http://www.aspgd.org).
Como modelo de estudio, la levadura de la cerveza S. cerevisiae no es representativa de
los hongos filamentosos, ya que es un organismo unicelular que sufrió una duplicación
22
genómica ancestral. En cambio, A. nidulans es un organismo pluricelular con el doble de
genes con respecto a dicha levadura, crece como hifas filamentosas vegetativas haploides
a partir de esporas asexuales (conidias uninucleadas, ciclo asexual) o sexuales (ascosporas
binucleadas, ciclo sexual). Además, las hifas vegetativas haploides provenientes de dos
individuos pueden fusionarse para formar un heterocarión, y los núcleos a su vez pueden
fusionarse posteriormente dentro de un homocarión o de un heterocarión para formar
núcleos diploides.
4.1 Ciclo de vida de A. nidulans
A. nidulans es homotálico y presenta ciclos de desarrollo asexual y sexual (Fig. 4). El
desarrollo asexual (conidiación) en A. nidulans se caracteriza por la formación de una
estructura especializada llamada conidióforo que surge cuando el micelio, que es una red
interconectada y multinucleada de células filamentosas o hifas, se expone a señales
medioambientales como al aire (Fig. 4) (Adams et al., 1998; Clutterbuck, 1969;
Timberlake y Clutterbuck, 1994), la privación de nutrientes (Skromne et al., 1995) o la
presencia de señales químicas propias (Lee y Adams, 1996; Marquez-Fernandez et al.,
2007; Seo et al., 2003; Soid-Raggi et al., 2006; Tsitsigiannis y Keller, 2007). En las hifas
expuestas al aire, la conidiación inicia con el surgimiento de un compartimento celular o
célula pie, delimitado por dos septos, del cual se origina una hifa aérea especializada que
corresponde a la célula tallo. Después de un crecimiento específico, la punta de la célula
tallo se hincha para formar la vesícula, en donde se llevan a cabo múltiples divisiones
nucleares (Adams et al., 1998) y a partir de las cuales se desarrollan múltiples gemaciones
uninucleadas para así formar las métulas (Adams et al., 1998; Clutterbuck, 1969;
Etxebeste et al., 2010). En el extremo apical de la métula se producen otras gemaciones,
para producir dos células uninucleadas conocidas como fiálides, de las cuales se producen
las esporas asexuales o conidios, mediante repetidas divisiones mitóticas. En este proceso,
uno de los núcleos formados entra en la espora en desarrollo, mientras que el otro
permanece en la fiálide para dividirse nuevamente (Clutterbuck, 1969; Timberlake y
Clutterbuck, 1994). Por el contrario, el núcleo que ingresa a la espora se detiene en la fase
23
G1 del ciclo celular (Bergen y Morris, 1983).
Figura 4. Ciclo de vida de Aspergillus nidulans. A. nidulans puede crecer como hongo filamentoso (crecimiento
vegetativo). La exposición a la luz favorece el desarrollo asexual resultando en la formación de esporas asexuales o
conidiosporas (en verde), producidas por estructuras especializadas llamadas conidióforos. La privación de la luz
favorece el desarrollo sexual y requiere el complejo VelB-VeA-LaeA. Esto lleva al desarrollo de los cuerpos fructíferos
o cleistotecios (en morado) asistidos de las células Hülle (en gris claro). Los círculos blancos representan los núcleos de
las células haploides del hongo (ver texto). Modificado de Bayram et al., 2010.
El desarrollo sexual comienza generalmente después de la conidiación y en condiciones
de aeración restringida. Este desarrollo se caracteriza por la formación de cuerpos
fructíferos o cleistotecios, que son estructuras multicelulares, pigmentadas y redondas. El
cleistotecio está rodeado por una red de hifas vegetativas, además de unas células en
forma globosa de pared gruesa conocidas como células Hülle (Hermann et al., 1983), cuya
función se asocia a la maduración del cleistotecio (Fig. 4). En A. nidulans la aparición de
24
las células de Hülle es la primera manifestación morfológica del ciclo sexual, a diferencia
de otros miembros del género Aspergillus, no posee anteridios, ni ascogonias definidos.
Sin embargo, una célula funcional equivalente a una hifa ascogóena se fusiona con una
célula equivalente a un anteridio. De esta fusión se formarán las esporas sexuales. El
resultado es una hifa dicarionte en la cual los 2 núcleos se dividen sincrónicamente,
formándose miles de células dicarióticas dentro del cleistotecio (Martinelli, 1994). La
fusión nuclear ocurre en la hifa dicariótica dando lugar a un asca. El asca contiene 4
núcleos meióticos, cada uno de estos se divide mitóticamente para dar origen a 4 pares de
ascosporas uninucleadas. El núcleo dentro de cada ascospora realiza una sola división
mitótica, esto da como resultado 8 ascosporas maduras binucleadas (Casselton y Zolan,
2002; Martinelli, 1994).
A. nidulans presenta además un ciclo parasexual (Fig. 4). Durante este fase se puede
formar micelio homocariótico (con un solo tipo de núcleo) o heterocariótico (con núcleos
genéticamente diferentes). Los núcleos en un heterocarión se pueden fusionar y formar un
diploide. En un heterocarión se pueden llevar a cabo pruebas de complementación
genética y dominancia. Sin embargo, es preferible aislar diploides para obtener una
proporción exacta de 1 a 1 entre los 2 alelos (Martinelli, 1994).
Al igual que los diferentes tipos de esporas, las esporas de los hongos son estructuras de
dispersión, caracterizadas por ser células con vida latente y resistentes a múltiples
condiciones de estrés ambiental. Durante la germinación de las conidiosporas
uninucleadas de A. nidulans, la cual ocurre en presencia de agua y nutrientes, se observa
primero una hinchazón y un crecimiento isotrópico, seguido de la formación del tubo
germinal. Junto con estos cambios morfológicos, las esporas se vuelven metabólicamente
activas y reinician el ciclo de división nuclear. De hecho la formación del tubo germinal
está acoplada a la primera división nuclear (Harris, 1999).
25
OBJETIVO GENERAL
Determinar los mecanismos mediante los cuales las cinasas SakA, MpkC y SrkA regulan
la respuesta al estrés y el desarrollo.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Demostrar si hay alguna relación genética entre las cinasas SakA, SrkA y MpkC
estudiando los fenotipos de mutantes sencillas, dobles y triples para estas cinasas
en el desarrollo, el estrés oxidativo y otros tipos de estrés.
2. Determinar los patrones de localización de SrkA en respuesta al estrés oxidativo en
comparación de los reportados para SakA, por medio de la generación de fusiones
de SrkA con la proteína verde fluorescente (GFP).
3. Establecer si existe una interacción física entre SakA, SrkA y MpkC en respuesta al
estrés oxidativo.
4. De haber interacción entre SakA y SrkA, se establecerá si la fosforilación de SakA
afecta su unión con SrkA y su patrón de localización.
5. Determinar los patrones de interacción entre SakA, SrkA y otras proteínas, en
respuesta al estrés oxidativo e inferir en qué procesos celulares pueden estar
participando.
26
RESULTADOS
La respuesta al estrésoxidativo es mediada por SakA y regulada por MpkC y SrkA.
Nuestros resultados demuestran que SrkA es parte de la vía de SakA contribuyendo con la
homeostasis redox celular (Jaimes-Arroyo et al., 2015), además datos previos del
laboratorio muestran que la deleción del gen mpkC también rescata parcialmente la
resistencia al estrés oxidativo en un fondo mutante ∆sakA (Lara-Rojas 2012). Por lo tanto
se procedió a comparar el efecto de ambas deleciones y saber si están contribuyendo a la
regulación de la respuesta al estrés oxidativo a través de la misma vía o por vías diferentes.
Se inocularon esporas de cepas mutantes, sencillas y dobles de los genes, sakA, mpkC, srkA
y atfA en presencia de los agentes oxidantes peróxido de hidrógeno inorgánico (H2O2),
peróxido de hidrógeno orgánico o terbutilhidroperóxido (t-BOOH), menadiona,
metilglioxal y paraquat (Pq). Al igual que la mutante ∆srkA la mutante ∆mpkC no muestra
ningún fenotipo evidente por exposición a dichos agentes oxidantes (Fig. 5)
Figura 5. La deleción de los genes mpkC y srkA no afectan la sensibilidad al estrés oxidativo. Se inocularon 1x104
esporas de las cepas CLK43 (WT), TOL1 (∆sakA), CFL10 (∆mpkC), CRJ2 (∆srkA) y TFL∆atfA-02 (∆atfA) en el centro
de cajas Petri conteniendo medio mínimo más los suplentes requeridos, y medio mínimo conteniendo en A con peróxido
de hidrógeno inorgánico (H2O2) terbutilhidroperóxido (t-BOOH), menadiona metilglioxal y páraquat (Pq), a las
concentraciones indicadas y se incubaron a 37 ºC por 4 días. Las figuras 5, 6 y 7 muestran a un solo experimento
representativo, el cual se realizo 3 veces con tres repeticiones para cada condición experimental.
27
Como se puede observar en la figura 6, la doble mutante ∆sakA ∆srkA muestra el fenómeno
de rescate parcial de la resistencia al estrés oxidativo por H2O2, t-BOOH y menadiona en el
fondo genético ∆sakA, pero sólo a bajas concentraciones, (Jaimes-Arroyo et al., 2015). Por
otro lado, la doble mutante ∆sakA ∆mpkC recupera parcialmente la resistencia al H2O2 pero
a una mayor concentración (6mM) y a bajas concentraciones de t-BOOH y menadiona. En
conclusión, el efecto de rescate de la resistencia al estrés oxidativo de una mutante ∆sakA
es ligeramente mayor cuando se elimina MpkC que cuando se elimina SrkA.
Las cepas ∆atfA (Fig. 5) también son sensibles al estrés oxidativo (Lara-Rojas et al., 2011).
La deleción de los genes de srkA y mpkC también suprimen parcialmente la sensibilidad al
estrés oxidativo en un fondo genético ∆atfA, es decir que las cepas mutantes dobles ∆mpkC
∆atfA y ∆srkA ∆atfA recuperan parcialmente la resistencia al estrés oxidativo (Fig. 6)
producido por H2O2 a bajas concentraciones (4.5 mM). La mutante ∆mpkC ∆atfA crece
ligeramente a altas concentraciones de t-BOOH (1mM) y menadiona mientras que ∆srkA
∆atfA sólo a crece a bajas concentraciones de ambos agentes oxidantes. La doble deleción
∆mpkC ∆srkA no muestra resistencia adicional a ningún agente oxidante (Fig. 6). Estos
datos sugieren que tanto MpkC como SrkA juegan un papel contrario a la respuesta
producida por la vía SakA-AtfA durante la respuesta antioxidante, y que además estas
funciones de MpkC y SrkA podrían actuar de manera independiente. Esto sugiere que la
eliminación simultanea de ambas proteínas podría tener efectos aditivos en un fondo
mutante ∆sakA y ∆atfA, en cuanto al rescate de la resistencia al estrés oxidativo.
28
Figura 6. La falta de SrkA o MpkC recupera parcialmente la resistencia al estrés oxidativo de las mutantes ∆sakA y
∆atfA. Continuación del experimento en la figura 5. Se inocularon 1x104 esporas de las cepas CFL12 CRJ5 (∆sakA
∆srkA), CRJ10 (∆sakA ∆AtfA), CRJ11 (∆mpkC ∆srkA), CRJ12 (∆mpkC ∆atfA) y CRJ13 (∆srkA ∆atfA) en el centro de
cajas Petri conteniendo medio mínimo más los suplentes requeridos bajo las mismas condiciones que en la figura 5. Las
figuras 5, 6 y 7 corresponden a un solo experimento, el cual se realizo 3 veces con tres repeticiones para cada condición
experimental.
Para explorar esta idea, se generaron mutantes triples ∆sakA ∆mpkC ∆srkA, ∆sakA ∆mpkC
∆atfA y ∆sakA ∆srkA ∆atfA. Como indica la figura 7, la mutante triple ∆sakA ∆mpkC ∆srkA
es más resistente al H2O2 y ligeramente más resistente a la menadiona en comparación con
la cepa silvestre (Fig. 5). La mutante triple ∆sakA ∆mpkC ∆atfA muestra una sensibilidad
similar al H2O2 a las cepas ∆sakA o ∆atfA (Figura 5). Sin embargo, puede crecer a bajas
concentraciones de t-BOOH y menadiona. Finalmente, la mutante ∆sakA ∆srkA ∆atfA
puede crecer a bajas concentraciones de H2O2 y es resistente a t-BOOH y menadiona. Estos
datos indican que tanto MpkC como SrkA contribuyen a la regulación de la respuesta
antioxidante generada por la vía SakA-AtfA, pero a través de procesos distintos. Cabe
destacar que los datos de interactoma (Jaimes-Arroyo et al., 2015) demuestran que tanto
MpkC como SrkA interactúan con SakA después de la exposición al H2O2 y la interacción
de SrkA con SakA es constitutiva e independiente de la exposición a agentes oxidantes (ver
Apéndice 1).
29
Figura 7. La deleción simultanea de los genes mpkC y srkA tienen un efecto aditivo al rescatar la resistencia al estrés
oxidativo de una mutante ∆sakA. Se inocularon 1x104 esporas de las cepas CRJ14 (∆sakA ∆srkA ∆mpkC), CRJ15 (∆sakA
∆mpkC ∆atfA) y CRJ16 (∆sakA ∆srkA ∆atfA) en el centro de cajas Petri conteniendo medio mínimo más los suplentes
requeridos, bajo las mismas condiciones que los experimentos en las figuras 5 y 6. Las figuras 5, 6 y 7 corresponden a un
solo experimento, el cual se realizo 3 veces con tres repeticiones para cada condición experimental.
La hipersensibilidad al estrés oxidativo en cepas ∆sakA y ∆atfA es característica de las
esporas. El micelio por el contrario, es relativamente resistente a este estrés (Fig. 8) lo cual
indica que la vía SakA-AtfA juega papeles diferentes en las esporas, las cuales pasan de un
estado latente a un estado creciente (micelio) (Lara-Rojas et al., 2011). Para probar la
influencia de SrkA y MpkC en estos fenómenos, se expuso el micelio de las mutantes
sencillas, dobles y triples para los genes sakA, mpkC, srkA, y atfA al H2O2 y el t-BOOH. La
figura 8 muestra que el micelio de todas las cepas mutantes son resistentes al H2O2 hasta
8mM. Todas las cepas pueden crecer hasta 0.8 mM de t-BOOH excepto las triples mutantes
∆sakA ∆srkA ∆mpkC y ∆sakA ∆srkA ∆atfA. Estos datos señalan que la regulación de la vía
de SakA dada por MpkC y/o SrkA también difiere en un estado de latencia (esporas),
versus un estado de crecimiento vegetativo (micelio).
30
Figura 8. Durante el crecimiento micelial, la deleción de mpkC y srkA no afecta los fenotipos de las mutantes ∆sakA y
∆atfA. Se inocularon 1x104 esporas de las cepas CLK43 (WT), TOL1 (∆sakA), CFL10 (∆mpkC), CRJ2 (∆srkA),
TFL∆atfA-02 (∆atfA), CFL12 (∆sakA ∆mpkC), CRJ5 (∆sakA ∆srkA), CRJ10 (∆sakA ∆AtfA), CRJ11 (∆mpkC ∆srkA),
CRJ12 (∆mpkC ∆atfA), CRJ13 (∆srkA ∆atfA), CRJ14 (∆sakA ∆srkA ∆mpkC), CRJ15 (∆sakA ∆mpkC ∆atfA) y CRJ16
(∆sakA ∆srkA ∆atfA) en el centro de cajas Petri conteniendo medio mínimo más los suplentes requeridos, a 37º C por 5
días. A continuación el micelio joven de la orilla en colonia, fue extraído e inoculado en medio mínimo más los
suplementos requeridos mas peróxido de hidrógeno inorgánico (H2O2) y terbutilhidroperóxido (t-BOOH) a las
concentraciones indicadas y se incubaron a 37 ºC por 4 días.
31
La deleción del gen srkA altera la actividad de catalasa en un fondo mutante ∆sakA.
Parte de la hipersensibilidad al H2O2 que se observa en las esporas mutantes en los genes
sakA o atfA se puede deber a que éstas muestran una disminución en la actividad de
catalasa A (Lara-Rojas et al., 2011), la cual es específica de las esporas(Navarro et al.,
1996). Por otro lado, la actividad catalasa B es específica del crecimiento micelial
(Kawasaki et al., 1997). Datos previos del laboratorio demuestran que la deleción de mpkC
recupera parcialmente la actividad de catalasa A en esporas. Dados los fenotipos
coincidentes en las mutantes dobles ∆sakA ∆mpkC y ∆sakA ∆srkA, además del efecto
aditivo en la mutante triple ∆sakA ∆mpkC ∆srkA se procedió a valorar la actividad de
catalasa en esporas mutantes sencillas y dobles ∆sakA y ∆srkA. La cepa ∆sakA tiene una
actividad de catalasa A menor a la cepa silvestre (Fig. 9A), mientras que la cepa ∆srkA
muestra una actividad ligeramente mayor de catalasa A. La doble mutante ∆sakA ∆srkA
recupera parcialmente la actividad de catalasa A además de mostrar una ligera actividad de
catalasa B. Estos datos fueron corroborados al cuantificar la actividad enzimática específica
de catalasa por µg de proteína total de cada cepa (Fig. 9B). Estos resultados, sugieren que
parte de la hipersensibilidad de las esporas ∆sakA al H2O2, se relaciona con la falta de
actividad de catalasa A (Lara-Rojas et al., 2011).
Figura 9. La mutante ∆sakA ∆srkA recupera parcialmente la actividad de catalasa en las esporas. A. Se corrieron 30
microgramos de extracto proteico de esporas intactas de las cepas CLK43 (WT), TOL1 (∆sakA) y CRJ5 (∆sakA ∆srkA) en
un gel nativo de poliacrilamida para determinar la actividad de catalasa (Navarro et al., 1996). B. La actividad de catalasa
directa fue determinada midiendo la producción de átomos de oxígeno por minuto (ngat O/min) con un oxímetro de la
reacción entre 10 microgramos de los extractos proteicos y H2O2 10 mM . Esta reacción fue iniciada inyectado 10 ug de
extractos proteicos en una cámara sellada conteniendo 2 ml de buffer de fosfatos 50 mM a un pH de 7.2 y H2O2 10 mM.
A B
32
El H2O2 induce la fragmentación mitocondrial y la relocalización de SrkA,
dependiente de la presencia de SakA.
En respuesta al estrés, SakA es fosforilada y se acumula en el núcleo (Lara-Rojas et al.,
2011). Para explorar más a fondo las interacciones entre SakA y SrkA, se determinó la
localización de SrkA con y sin estrés oxidativo. Con este propósito se generaron cepas en
las cuáles el gen srkA se reemplazó por un alelo funcional con la construcción srkA::GFP
en fondos genéticos silvestre (WT) y ∆sakA. Además se introdujo la construcción
H2A::RFP en estas cepas para marcar los núcleos. Como se puede observar en la figura
10A, sin H2O2 SrkA::GFP se encuentra excluida del núcleo y localizada homogéneamente
en el citosol. El tratamiento con H2O2 30 mM resulta en una acumulación de SakA::GFP en
los núcleos. En ausencia de SakA (SrkA::GFP/∆sakA) y de H2O2, el patrón de localización
citoplasmático de SrkA::GFP cambia de ser homogéneo a un patrón tubular. Notablemente
en este caso, el tratamiento con H2O2 no resulta en la acumulación nuclear de SrkA::GFP,
en cambio la proteína se distribuye en estructuras redondas a lo largo de las hifas. Estos
resultados indican que SrkA se transloca hacia los núcleos en respuesta al estrés oxidativo y
que su localización nuclear o citoplasmática se determina por la presencia de SakA.
SakA se activa durante el desarrollo sexual, por lo que se determinó la localización de SrkA
en conidias intactas. Como se puede observar en la figura 10B, en un fondo silvestre,
SrkA::GFP aparece en un patrón no homogéneo y en parte co-localiza con la señal de
H2A::RFP. En un fondo genético ∆sakA, SrkA::GFP no se encuentra en el núcleo, en
cambio la proteína parece estar localizada principalmente en la membrana plasmática.
33
Figura 10. La localización nuclear de SrkA depende de SakA. Se inocularon esporas (A)Se inocularon conidios de las
cepas TRJ7 (WT), TRJ5 (SrkA::GFP), and TRJ6 (SrkA::GFP/ sakA por 12 horas en medio mínimo mas suplementos a
37OC y luego fueron expuestas a H2O2 30 mM por 30 minutos y observadas in vivo (B) Conidias intactas de las cepas
TRJ7 (WT), TRJ5 (SrkA::GFP), and TRJ6 (SrkA::GFP/ sakA)fueron montadas en cubre objetos y observadas. La
imágenes fueron tomadas usando un microscopio Zeiss confocal spinning disc.
A
B
34
Un cambio similar al de la señal de SrkA::GFP/∆sakA en micelio, de una red filamentosa a
unidades con forma de puntos, ocurre en las mitocondrias durante el envejecimiento de
Podospora anserina y S. cerevisiae en donde un decremento en el fenómeno de fisión
mitocondrial se vincula con la extensión de la vida media (Scheckhuber el al., 2007). Esto
nos llevó a probar si el H2O2 puede inducir la fisión mitocondrial en A. nidulans y si SrkA
puede localizarse parcialmente en las mitocondrias, utilizando Mito-Tracker Red® para
teñir mitocondrias en células vivas tratadas con o sin con H2O2. En la figura 11 se observa
que efectivamente, a 30 minutos de tratamiento en una cepa silvestre (WT), el H2O2 induce
cambios drásticos en la morfología mitocondrial causado por un fragmentación, un
fenómeno muy similar se observa en las cepas con la construcción SrkA::GFP,
particularmente cuando SakA no está presente. Como se observa en la figura 11 (panel
inferior), el H2O2 provoca un patrón muy similar de fragmentación tanto en SrkA::GFP
como en las mitocondrias las cuales colocalizan en muchas pero no en todas las áreas.
35
Figura 11. El H2O2 induce fragmentación mitocondrial y la relocalización mitocondrial de SrkA. Se inoculó micelio
de las cepas CLK43 (WT), TRJ1 (SrkA::GFP) y CRJ3 (SrkA::GFP/ sakA) durante 12 horas en medio sólido, se tiñó con
Mitotracker durante 5 minutos y se le trató o no con H2O2 30 mM por 30 minutos. Las observaciones se realizaron in vivo
utilizando microscopía de epifluorescencia. Las fechas indican algunas regiones en donde el Mitotracker y la señal de
SrkA::GFP colocalizan. Barra = 10 µm.
36
Para aprender más acerca de la cinética la fragmentación de la fragmentación mitocondrial
inducida por el H2O2, se llevó a cabo un análisis tipo time course. Como se puede ver en la
figura 12, en ausencia de H2O2 el patrón reticulado de las mitocondrias se mantiene durante
el curso del tiempo. En contraste, el H2O2 induce la fragmentación mitocondrial desde los 5
minutos, lo cual se hace más evidente después de 15 minutos. No se observó que se
recobrara la morfología reticulada de las mitocondrias después de 2 horas, sugiriendo que
es un proceso irreversible al menos bajo estas condiciones experimentales. Estos resultados
indican que el H2O2 induce la fragmentación mitocondrial y la relocalización de SrkA en
las mitocondrias, particularmente cuando SakA no está presente. Esto es consistente el
hecho de que SrkA tiene una señal de localización mitocondrial altamente conservada en
los hongos filamentosos (Fig. S1 Apendice1). Como la fragmentación suele estar
relacionada con procesos de mitofagia autofagia y/o apoptosis, será necesaria una
investigación mayor para determinar la posible relación de SakA y SrkA con estos
procesos.
Figura 12. Time curse de la fragmentación
mitocondrial inducida por el tratamiento
de H2O2. Se tiñeron las mitocondrias de una
cepa silvestre CLK43 con Mitotracker y se
trataron con H2O2 30 mM (derecha) o no
(izquierda), se tomaron fotografías de la
misma hifa cada 5 minutos en el
microscopio de epifluorescencia. Las
cabezas de fecha marcan la fragmentación
temprana de las mitocondrias.
37
SakA y SrkA interactúan físicamente, independientemente de la fosforilación de
SakA.
Los resultados anteriores sugieren que sin estrés, SakA interactúa con SrkA fuera del
núcleo, cuando SakA no está fosforilada, y que la activación de SakA resulta en la
translocaciónMás contenidos de este tema
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