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Aprendiendo Biologia
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOMEDICINA
EL PAPEL DE LA SEÑALIZACIÓN DE INDIAN HEDGEHOG DURANTE LA
REGENERACIÓN DE LA FALANGE DISTAL EN EL RATÓN NEONATO CD-1
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
RETANA FLORES ELIZABETH ANGÉLICA
TUTORA: DRA. MARÍA CRISTINA VELASQUILLO MARTÍNEZ
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM
COMITÉ TUTOR: DRA. PATRICIA RIVAS MANZANO
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM.
DR. DAVID GARCIADIEGO CÁZARES
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM
MÉXICO, CD. MX., DICIEMBRE, 2016
UNAM – Dirección General de Bibliotecas
Tesis Digitales
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
FACULTAD DE MEDICINA
BIOMEDICINA
EL PAPEL DE LA SEÑALIZACIÓN DE INDIAN HEDGEHOG DURANTE LA
REGENERACIÓN DE LA FALANGE DISTAL EN EL RATÓN NEONATO CD-1
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
RETANA FLORES ELIZABETH ANGÉLICA
TUTORA: DRA. MARÍA CRISTINA VELASQUILLO MARTÍNEZ
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM
COMITÉ TUTOR: DRA. PATRICIA RIVAS MANZANO
FACULTAD DE CIENCIAS, UNAM.
DR. DAVID GARCIADIEGO CÁZARES
FACULTAD DE MEDICINA, UNAM
MÉXICO, CD. MX., DICIEMBRE, 2016
UN MM
POSG DOy
Lic. Ivonne Ramírez Wence
Directora General de Administración Escolar, UNAM
Presente
COORDINACiÓN
Me permito informar a usted que el Subcomité de Biologia Experimenta l y Biomedicina del
Posgrado en Ciencias Biológicas, en su sesión ordinaria del dia 17 de octubre de 2016, aprobó el
jurado para la presentación del examen para obtener el grado de MAESTRA EN CIENCIAS
BIOLÓGICAS de la alumna RETANA FLORES ELlZABETH ANGÉLICA con número de cuenta
305148621 , con la tesis titulada " EL PAPEL DE LA SEÑALIZACiÓN DE INDIAN HEDGEHOG
DURANTE LA REGENERACiÓN DE LA FALANGE DISTAL EN EL RATÓN NEONATO CD-l " ,
realizada bajo la dirección de la DRA. MARíA CRISTINA VELASQUILLO MARTíNEZ:
Pres idente:
Vocal :
Secretario:
Suplente:
Suplente:
ORA. VERÓNICA HAYDÉE LUGO MARTíNEZ
DR ROBERTO SÁNCHEZ SÁNCHEZ
DR. DAVID GARCIADIEGO CÁZARES
ORA. VERÓNICA DíAZ HERNÁNDEZ
DRA. PATRICIA RIVAS MANZANO
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMEN T E
" POR MI RAZA HABLARÁ EL EspíRITU"
Cd . Universitaria, Cd, Mx., a 10 de noviembre de 2016
M-MCw~'
DRA. MARíA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA
COORDINADORA DEL PROGRAMA COOROIN"CION
Unidad de Posgrado • Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológicas Edificio B, I er. Piso, Circuito de Posgrados Cd. Universitaria
f)plpU'::. .... iñn rn'\/n~,.&n r P 11,1.c;¡If'll\¡fpv;,..n f) ¡:' T ", ¡ "1::11 7('u"'" ht-tn · /I ....... h;"'1 ......... <'nr.,. ~ '" "n"""'" ...... v
AGRADECIMIENTOS
Al Programa de Posgrado en Ciencias Biológicas, de la Universidad Nacional
Autónoma de México.
Al CONACyT por otorgarme la Beca para realización de los estudios de Maestría.
Al financiamiento brindado por los proyectos:
- Coordinación de la señalización de las integrinas y las bmp durante la formación de las articulaciones del
esqueleto y su relación en los procesos condrodegenerativos de la osteoartrosis. CONACyT Ciencia Básica
84683.
- El papel de las integrinas y BMP en los procesos que controlan la formación del esqueleto y el
mantenimiento del cartílago articular. INR 05/09
- Desarrollo de un Diagnóstico Molecular en pacientes con Osteoartritis utilizando la Vía de Señalización
Ihh/PTHrP, para su detección temprana en pacientes jóvenes. INR 42/14.
A los miembros del Comité Tutor integrado por la Dra. Patricia Rivas Manzano y
por el Dr. David Garciadiego, por sus observaciones y críticas a este proyecto.
AGRADECIMIENTOS A TÍTULO PERSONAL
Agradezco al Dr. David Garciadiego por la comprensión, apoyo y confianza que me
otorgó al dejarme desarrollar este proyecto.
Especialmente a la Dra. Haydée Lugo Martínez por todas las enseñanzas, por
brindarme la inspiración para concluir este proyecto y por todo el apoyo durante la
realización del mismo.
A la Dra. María Elena Contreras Figueroa por su disposición y apoyo excepcional en
la realización de la parte experimental, el trabajo fue siempre grato.
A la Dra. Verónica Díaz Hernández por las facilidades y apoyo en la realización de
ensayos y análisis de imágenes en el laboratorio de Embriología en la Facultad de Medicina.
A todo el personal del laboratorio de Ingeniería de Tejidos, Terapia Celular y
Medicina Regenerativa y a la Unidad de Biotecnología del Instituto Nacional de
Rehabilitación, en especial al Mtro. Valentín Martínez y al Dr. Roberto Sánchez, por
brindarme las herramientas para realizar este proyecto.
Asimismo, al Dr. Edgar Krötzsch y al Dr. René Abarca del Laboratorio de Tejido
Conjuntivo del Instituto Nacional de Rehabilitación por las facilidades otorgadas para la
captura de imágenes.
A mi mamá, a mi papá, a mis hermanos David y Guadalupe por siempre estar a mi
lado y formarme como persona, por ser mi sostén en los momentos más difíciles y por todo
el amor durante estos años.
Con cariño para el Dr. Juan Báez Reyes, a su esposa Noemi Gelista y a sus hijas
Vanesa y Aranza por mostrarme siempre su apoyo incondicional y brindarme su calidez,
siento gran cercanía con ustedes y lo agradezco demasiado.
A Haydée, gracias por hacerme ver la ciencia de otro modo, por ser mi inspiración
como como investigadora y como mujer. Por ayudarme durante tantas horas de trabajo en el
laboratorio, por tus revisiones, por tus consejos, por todo tu apoyo.
A mi amorcita Auri, por ser mi amiga, mi confidente y cómplice en muchas aventuras
durante todos estos años y seguramente por muchos más que compartiremos.
Con amor para mis bitchos Israel, Pavel, Mavisho y Esteban que, después de casi
diez años seguimos siendo amigos que, pese a la distancia y a las múltiples ocupaciones de
cada uno, sabemos que estaremos ahí para superar cualquier adversidad, para celebrar cada
uno de nuestros logros y por qué no, para seguir divirtiéndonos. Son un pilar en mi vida.
A Laura, que en los últimos años hemos estrechado más los lazos de amistad y que,
aunque somos distintas, nos comprendemos y apoyamos en todo momento, también aprecio
las experiencias tan bonitas que hemos vivido y espero no sean las únicas.
A Sele, porque hemos vuelto a compartir bellos momentos como en la prepa y a pesar
de no vernos por tantos años, la amistad perdura.
Para Lizbeth y a Merillén, mis eternas amigas, saben que las adoro y que siempre
serán parte importante en mi vida, agradezco que me den el empujoncito para salir adelante.
A Angel, gracias por llegar a mi vida, por tu cariño, apoyo y compresión, sin ti
hubiera sido todo muy gris durante la escritura de esta tesis. Eres una persona muy
importante para mí.
A María Elena por el gran equipo que hicimos que resultó eneste gran trabajo y en
una bonita amistad, gracias por esas charlas tan amenas.
Con cariño para el Robert, a Yaaziel, Val, René y Alex quienes me brindan su amistad
y apoyo en el laboratorio haciendo de ese lugar algo más ameno para el trabajo.
Hilda, mi chava, gracias por enseñarme tantas cosas y por ser mi amiga, te extraño
mucho.
A Marco por las excelentes platicas de ciencia, por preocuparte por mí y por tu
constante ayuda.
Omar, gracias por tu amistad, por tu apoyo en histo y por ser un Cui glotón.
Emiliano, por tu amistad, por alentarme para siempre dar lo máximo.
A Emanuel por tus sabios consejos, aunque siempre termino cometiendo los mismos
errores.
A todos los que han sido mis alumnos, he aprendido mucho de ellos y me estimulan
a ser una mejor profesionista.
A la Universidad Nacional Autónoma de México, a la Escuela Nacional Preparatoria
1 “Gabino Barreda” y a la Facultad de Ciencias, porque he aprendido tanto en esta casa de
estudios, me hizo la estudiante y la profesionista que ahora soy.
o ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS. .......................................................................................................... i
RESUMEN ....................................................................................................................... 1
ABSTRACT ...................................................................................................................... 3
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 5
1. El proceso de la regeneración ........................................................................................ 5
Regeneración homeostática ............................................................................................. 6
Regeneración facultativa .................................................................................................. 8
Regeneración en invertebrados ........................................................................................... 11
La Hidra como modelo de regeneración ......................................................................... 11
Regeneración en la planaria ............................................................................................ 12
Regeneración en vertebrados .............................................................................................. 13
Regeneración en mamíferos ............................................................................................ 16
ANTECEDENTES ............................................................................................................ 18
1. La regeneración de la falange distal ............................................................................. 18
Regeneración en embriones y fetos de ratón. ............................................................... 21
Regeneración en ratones neonatos. .............................................................................. 23
Regeneración en organismos adultos. ........................................................................... 27
2. El desarrollo de la falange. ........................................................................................... 30
Mecanismos de osificación ............................................................................................ 33
Osificación intramembranosa .............................................................................................. 33
Osificación endocondral ....................................................................................................... 34
3. El papel de la señalización Ihh durante la osificación endocondral. .............................. 38
Vía canónica de señalización de Hedgehog. ................................................................... 41
Inhibición de la vía de señalización Hedgehog. .............................................................. 47
OBJETIVO GENERAL. ..................................................................................................... 50
Objetivos particulares. ........................................................................................................... 50
METODOLOGÍA. ........................................................................................................... 51
Material biológico. ................................................................................................................. 51
Desarrollo experimental. ....................................................................................................... 51
Obtención de muestras. ............................................................................................................ 54
Análisis histológico. ................................................................................................................... 54
Tinción de Herovici. ................................................................................................................... 55
Inmunohistoquímica. ................................................................................................................ 56
Análisis de imagen .................................................................................................................... 57
RESULTADOS ................................................................................................................ 58
Condiciones experimentales iniciales ........................................................................................ 61
La ciclopamina no altera la histología de la falange durante los primeros días post-amputación
.................................................................................................................................................. 62
La ciclopamina retrasa la regeneración de la falange e inhibe el crecimiento longitudinal de la
falange ...................................................................................................................................... 64
La ciclopamina bloquea la señalización de la vía de Ihh en los primeros días posteriores a la
amputación ............................................................................................................................... 69
La ciclopamina induce la activación de la vía de señalización de Ihh en distinto tipo celular
durante la regeneración ............................................................................................................ 72
La ciclopamina induce la reparación del hueso mediante un proceso de osificación directa ... 75
La ciclopamina modifica la estructura final de la falange porque induce cambios en la
expresión de las MMPs ............................................................................................................. 78
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 81
CONCLUSIONES ............................................................................................................ 92
PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 94
LITERATURA CITADA ..................................................................................................... 96
i
o LISTA DE FIGURAS.
Figura 1. Etapas de la regeneración de la extremidad en salamandras.). .......... 15
Figura 2. Estructuras de la punta del dedo del ratón a los 10 después del
nacimiento ....................................................................................................... 18
Figura 3. La regeneración de la punta del dedo de la falange distal del ratón
depende del nivel de la amputación. .............................................................. 20Figura 4. Regeneración en ratones neonatos.. .................................................... 25
Figura 5. Regeneración en ratones adultos.. ....................................................... 29
Figura 6. Expresión de transcritos específicos de cartílago y de hueso en el inicio
de la osificación de la falange terminal.. ......................................................... 31
Figura 7. Osificación endocondral en un hueso largo. ......................................... 36
Figura 8. Retroalimentación negativa entre IHH y PTHrP.. ................................. 40
Figura 9. Vía de señalización de Hh. .................................................................... 46
Figura 10. Condiciones experimentales iniciales. ................................................ 53
Figura 11. Desarrollo de la falange distal después del nacimiento. ..................... 59
Figura 12. Falange distal a los 3 dpn. . ................................................................ 60
Figura 13. Condiciones experimentales iniciales.. ............................................... 61
Figura 14. Primeras etapas del proceso regenerativo.. ........................................ 63
Figura 15. La ciclopamina induce retraso en el proceso de osificación además de
cambios estructurales en la falange.. .............................................................. 67
Figura 16. La ciclopamina impide la restauración de la morfología normal de la
falange distal.. ................................................................................................. 68
ii
Figura 17. La ciclopamina inhibe la señalización de Ihh en primeros días
posteriores a la amputación.. .......................................................................... 71
Figura 18. La ciclopamina induce la expresión de la señalización Ihh en otros
tipos celulares.. ............................................................................................... 74
Figura 19. La ciclopamina induce la reparación del hueso mediante osificación
directa.. ........................................................................................................... 77
Figura 20. La ciclopamina induce la reparación del hueso mediante osificación
directa.. ........................................................................................................... 80
Figura 21. Modelos de regeneración y reparación de la falange distal. ............... 91
1
o RESUMEN
La regeneración de la falange distal se ha reportado en humanos y en roedores por
lo que el ratón se ha utilizado como el principal modelo de estudio para mamíferos.
La regeneración depende principalmente de dos factores: 1) el nivel de amputación
de la falange, el cual debe ser distal y 2) la edad, la regeneración de la falange es
inversamente proporcional a la edad del individuo. Así, la regeneración de la falange
distal de embriones es completa y depende de la expresión de msx1 y bmp-4. En el
caso de los adultos la “regeneración” que ocurre mediante la formación directa de
hueso, es incompleta y no depende de la expresión de msx1. En ratones neonatos,
tras la amputación de la mitad de la punta del dígito, aún existen células
progenitoras de linaje restringido que contribuyen a la regeneración. Sin embargo,
aún no se conoce qué señales activan la regeneración de la falange las cuales
logran restituir completamente su forma y función. La única placa de crecimiento
presente en la falange distal expresa indian hedgehog (Ihh) aún varios días después
de nacido el ratón, y se ha observado que este gen aumenta su expresión en los
días posteriores a la amputación de la falange. Adicionalmente, se conoce que la
falange crece mediante osificación endocondral por lo que Ihh podría estar
participando activamente en el proceso regenerativo al dirigir la tasa de proliferación
y maduración de los condrocitos.
2
El presente trabajo pretende contribuir a dilucidar los mecanismos
involucrados en la regeneración de la falange distal. Para ello, utilizamos el modelo
de regeneración postamputación de ratones neonatos CD1, en el cual
comprobamos que durante la respuesta regenerativa se reactivan los mecanismos
que participan en la osificación endocondral dirigida por Ihh. Esto se realizó
mediante la inhibición de la señalización de la vía hedgehog con el uso de
ciclopamina, ésta la aplicamos en las falanges amputadas y observamos que la
regeneración no ocurre, la falange resultante es más corta y consta de hueso en
forma de callo óseo. El hueso que se formó no es resultado de la calcificación del
molde de cartílago sino de la formación aposicional de hueso como la que ocurre
en el hueso cortical. La inhibición de hedgehog ocasionó el desbalance en la síntesis
y degradación de la matriz extracelular como lo deducimos a partir de la expresión
de la Metaloproteasa de matriz 13 (MMP13) y colágena, la formación de cartílago
fue casi nula como lo comprobamos por la expresión de Ihh y de la proteína
relacionada a la hormona paratiroidea (PTHrP), mientras que la expresión de Runx-
2 se incrementó.
Este hallazgo nos sugiere que en etapas neonatas Ihh es una molécula clave
para la regeneración del cartílago de la falange distal, lo cual es necesario para la
regeneración completa del dígito. La perspectiva de este trabajo es realizar ensayos
aplicando Ihh en una amputación proximal con el objetivo de promover la respuesta
regenerativa y conocer más acerca del papel de Ihh en este proceso.
3
ABSTRACT
The digit tip regeneration has been reported in humans and mice, thus, the
mouse has been used as the main model study. Regeneration depends mainly on
two factors: 1) the level amputation in the phalanx, which must be distal and 2) the
age, since it has been reported that regeneration is inversely proportional to the age
of the individual. In embryos, complete fingertip regeneration depends of msx1 and
bmp-4 expression. In adults the "regeneration" occurs by direct bone deposition, but
it is incomplete and does not depend on the expression of msx1. In neonatal mice,
after a half digit tip amputation, the remaining lineage-restricted progenitor cells
contribute to regeneration. However, it is still unknown which signals activate the
regeneration of the phalanx and which of them fail to fully restore form and function.
The single growth plate present at the distal phalanx express indian hedgehog (Ihh)
several days after birth in mouse, and the Ihh expression increases in the days
following the phalanx amputation. Additionally, it is known that the phalanx grows by
endochondral ossification so Ihh could be actively involved in the regenerative
process by directing the rate of proliferation and maturation of chondrocytes.
Our work aims at contributing to elucidate the mechanisms involved in the
regeneration of the distal phalanx. In our work, we use the model of post amputation
regeneration of neonatal mice CD1, in which we probe that during the regenerative
response, the mechanisms involved in endochondral ossification are reactivated and
directed by Ihh. This was done by the inhibition of the hedgehog signaling pathway
4
using Cyclopamine. When cyclopamine is applied in amputee’s phalanges, the
regeneration does not occur, resulting in shorter phalange and shaped bone callus.
Thus, the bone is formed without previous cartilage rode formation, so it produces
appositional bone (direct bone formation) like for the cortical bone. Furthermore, the
inhibition of hedgehog causes an imbalance in the synthesis and degradation of
extracellular matrix, as deduced from the expression matrix metalloproteinase 13 of
(MMP13) and collagen, so the null cartilage formation is detected by the no
expression of Ihh and Parathyroid hormone relatedprotein (PTHrP) while the
expression of Runx-2 increases.
These finding suggest that in neonatal stages, Ihh is a key molecule for
regeneration of cartilage fingertip, which is necessary for the complete regeneration
of the fingertip. The prospect of this work is to apply hedgehog on proximal
amputations of the distal phalanx to promote a rescue of the regenerative capacity
and learn about the role of Ihh on this process.
5
o INTRODUCCIÓN
1. El proceso de la regeneración
El proceso de regeneración ha despertado una gran fascinación desde tiempos muy
remotos, incluso ha sido objeto de historias mitológicas. No obstante, fue hasta el
siglo XVIII cuando se realizaron los primeros registros de la capacidad regenerativa
de algunos animales. En 1712 Reamur describió la regeneración en insectos y
crustáceos. En 1774 Trembly realizó estudios de regeneración con la hidra mientras
que Bonnet lo hizo en anélidos. Sin embargo, el más reconocido es el biólogo
naturalista Lázaro Spallanzani quien en 1778 en su libro Prodromo describió la
regeneración de la cola de las ranas y las extremidades de la salamandra
(Dinsmore, 1991).
Estas primeras observaciones establecieron las bases para los estudios
sobre la regeneración, desde entonces la investigación en este campo de la biología
no ha cesado, aunque su mayor desarrollo ha sido en las últimas décadas. Diversos
estudios y experimentos han servido para cambiar la perspectiva de la biología del
desarrollo, en la actualidad se conocen detalles a nivel genético, celular, tisular e
incluso a nivel sistémico de los mecanismos implicados en el proceso de
regeneración como la reparación de heridas, la información posicional y la
diferenciación celular (Maginnis, 2006).
6
Toda la información obtenida a partir de estos estudios, nos ha permitido
definir la regeneración como un proceso de reemplazo de las partes del cuerpo
perdidas o dañadas que permite restaurar tanto la estructura como la función
original (Poss, 2010).
A nivel funcional la regeneración se puede clasificar a en dos tipos: la primera
es llamada regeneración homeostática, la cual ocurre cuando se sustituyen las
células de los tejidos que se pierden continuamente debido a la muerte o al
envejecimiento celular. El segundo tipo es la regeneración facultativa o inducida por
daño, ésta ocurre después de un trauma, una amputación o una ablación (Poss,
2010).
Regeneración homeostática
Durante la etapa de desarrollo embrionario y fetal las células se encuentran
en constante actividad: proliferan, se diferencian y se organizan para formar los
tejidos y los órganos. En la mayoría de los organismos, esta actividad celular
disminuye al nacimiento del individuo y se detiene casi por completo al llegar a la
edad adulta. En esta etapa adulta todos los tejidos y órganos se encuentran
completamente desarrollados, sin embargo hay algunas células que mantienen su
actividad ya que se encargan de proliferar y reemplazar a las células que se
perdieron por apoptosis o necrosis debido al envejecimiento y al estrés interno y
externo al que constantemente está sometido el organismo. Este proceso se
denomina regeneración homeostática (Lindahl, 2008).
7
La regeneración homeostática entonces, permite el mantenimiento de los
tejidos adultos a lo largo de la vida del organismo. Para cumplir esta función las
células deben ser capaces de autorrenovarse y dar lugar a los diferentes tipos
celulares del tejido adulto, creando un balance entre la proliferación y la muerte
celular. Ésta es la forma más simple de regeneración ya que se realiza mediante la
proliferación de las células troncales progenitoras presentes en todos los órganos
(Jones y Wagers, 2008).
Algunos ejemplos representativos de este tipo de regeneración son: el
reemplazo de las células sanguíneas, la renovación del epitelio intestinal y del
epitelio de la piel o epidermis (Lindahl, 2008). En este último caso sabemos que la
epidermis se renueva constantemente gracias a las células troncales residentes
sobre la lámina basal, éstas células proliferan mediante divisiones simétricas y
asimétricas promoviendo tanto la autorrenovación como la diferenciación a
queratinocitos. Conforme las células troncales de la epidermis cambian de nicho se
van diferenciando y dejan de expresar ciertos marcadores de células no
diferenciadas como la Queratina 5 para comenzar a expresar Queratina 10, una
proteína marcadora de diferenciación epidérmica capaz de formar una red
intrincada que se une a los filamentos intermedios promoviendo una unión tipo
desmosoma más fuerte, esta red se vuelve más compacta conforme las células se
van diferenciando a queratinocitos. Al final del proceso de diferenciación y después
de haber cumplido su función, los queratinocitos mueren y dejan una capa (estrato
córneo) que proveerá resistencia contra el estrés mecánico y servirá como barrera
de protección contra la entrada de agentes extraños y la pérdida de agua. Este
8
proceso de diferenciación se completa aproximadamente cada 2 semanas y
persiste a lo largo de la vida del individuo (Banplain y Fuchs, 2006). Así pues, este
tipo de regeneración homeostática la realizan todos los animales para mantener la
renovación de sus órganos y tejidos. Sin embargo, esta capacidad de regeneración
después de sufrir un daño tisular (trauma, amputación o ablación) se encuentra
distribuida inequitativamente dentro del reino animal (Reidden et al., 2005).
Regeneración facultativa
La regeneración facultativa describe los mecanismos que son activados por
fuertes estímulos físicos y químicos como la amputación, las lesiones o los traumas.
Estos estímulos promueven que las células progenitoras que se encuentran cerca
del sitio de la herida proliferen rápidamente para reemplazar los tejidos dañados,
muertos o perdidos (Jones y Wagers, 2008). Dado que no todos los animales son
capaces de regenerar el total de las partes de su cuerpo y no todos los tejidos del
individuo pueden ser reparados de la misma manera, se ha descrito que la
regeneración facultativa se puede llevar a cabo mediante tres mecanismos:
morfalaxis, epimorfosis y regeneración compensatoria (Tsonis, 2000a).
La regeneración mediante morfalaxis implica un drástico remodelado o
restructuración de los tejidos preexistentes en el individuo, de tal forma que parte
de los tejidos viejos se rediferencian en aquellos que se han perdido formando así
un organismo completo sin que exista un proceso proliferativo, es decir, sin la
formación de un blastema propiamente dicho en el fragmento no dañado. Las hidras
9
recurren a este mecanismo para llevar a cabo los procesos de regeneración (Gilbert,
2013).
Denominamos epimorfosis a la restauración morfológica y funcional de una
estructura anatómica perdida en un organismo adulto mediante la formación de un
blastema. En la regeneración epimórfica la formación del blastema de regeneración
está compuesto por células progenitoras que proliferan y contienen la información
morfogenética requerida para reemplazar las estructuras perdidas. Podemos definir
al blastema como una masa de células progenitoras de linaje restringido en estado
proliferativo que darán lugar a los tejidos de la estructura a regenerar. El ejemplo
epimórfico característico es la regeneración de las extremidades de la salamandra
(Stoick-Cooper et al., 2007).
Durante la regeneración compensatoria, las células remanentes proliferan y
restauran la masa que fue perdida en el tejido manteniendo sus funciones
diferenciadas. Este tipo de regeneración es característica del hígado en los
mamíferos (Wolpert, 2010).
Los mecanismos regenerativos son distintos en todo el reino animal, se ha
observado que la capacidad regenerativa disminuye conforme los organismosse
sitúan en peldaños más altos dentro de la escala filogenética (Alvarado y Tsonis,
2006). Haciendo evidente que algunos metazoos perdieron la capacidad de
regenerar partes dañadas del organismo debiendo contentarse solo con repararlas.
Existen diversas hipótesis para explicar esta relación inversa, una de ellas es la
hipótesis adaptativa, la cual postula que los organismos susceptibles a
10
depredadores son los que deben mantener esta capacidad ya que recurren a
procesos como la autotomía, es decir, la autoamputación de extremidades como la
cola, para escapar y lograr sobrevivir a los ataques (Bely, 2010). Sin embargo, la
hipótesis más recurrida menciona que la pérdida de capacidad regenerativa es
debida a la complejidad estructural de los organismos superiores en la escala
filogenética y la dificultad de restaurar esas formas tan elaboradas (Elder, 1979).
Adicionalmente, se ha planteado que la regeneración es consecuencia de la
capacidad que tiene el organismos para acceder a su programa de desarrollo,
pudiendo ser reutilizado automáticamente cuando una estructura anatómica se
pierde (Bely, 2010).
A pesar de que la capacidad regenerativa se va restringiendo en los
organismos más complejos, hay etapas en los mecanismos regenerativos que
ocurren de manera similar en todos los organismos como la formación de un epitelio
en el sitio de la herida y la activación de vías de señalización celular específicas,
esto permite suponer que existe una homología en los mecanismos de regeneración
(Bely y Nyberg, 2010), por lo que podemos hacer relaciones e inferencias a partir
de un organismo modelo.
Diversos son los animales que han sido empleados como modelos para
estudiar los mecanismos de regeneración, entre ellos se encuentran los
invertebrados como la hidra o la planaria que son capaces de regenerar incluso un
organismo enteros completo a partir de pequeños fragmentos del individuo. Con
respecto a los vertebrados, los estudios se han desarrollado sobre todo en el pez
11
cebra y en anfibios como la salamandra. En estos modelos se ha observado la
capacidad de regeneración de las extremidades, la cola, la córnea, la retina y
algunos órganos internos como el corazón, además de reparar el músculo
esquelético, el sistema nervioso periférico y el sistema nervioso central (Stoick-
Cooper et al., 2007).
Regeneración en invertebrados
Dos de los invertebrados modelo más utilizados para estudiar la regeneración
de grandes regiones o estructuras anatómicas complejas son las planarias de agua
dulce de la familia Planariidae y los cnidarios del género Hydra. Poseen una gran
capacidad para regenerar la mayor parte de sus estructuras sin embargo, como
veremos a continuación, los mecanismos de regeneración que participan en estos
procesos de regeneración son distintos (Alvarado y Tsonis, 2006).
La Hidra como modelo de regeneración
Hidra vulagris es un cnidario que está organizado en un eje oral-aboral y su
cuerpo se divide en un pie, una columna y la cabeza. Se compone de dos capas
germinales, el ectodermo y el endodermo, separado por la mesoglea, que es una
matriz extracelular en donde residen las células troncales (Galliot, 1997). Dentro de
las primeras horas después de la decapitación experimental, la regeneración
procede sin una aparente proliferación. Se ha observado que se restauran los
valores de posición espacial a lo largo del eje corporal, lo que causa que las células
12
de la columna se sometan a una determinación y diferenciación para reemplazar la
cabeza que fue perdida, es decir, regenera mediante morfalaxis (Wolpert, 1971).
Las investigaciones hechas en este organismo han servido para conocer detalles
acerca de cómo se regula la polaridad celular y cómo esta polaridad contribuye al
proceso de regeneración. Asimismo, se han descrito algunas vías de señalización
que están implicadas en el proceso regenerativo (Meinhardt, 2002).
Regeneración en la planaria
Las dos especies de planaria Schmidtea mediterranea y Dugesia japonica
han servido como modelos del proceso regenerativo ya que son capaces de
regenerar diversas estructuras como la cola, los extremos posterior y anterior e
incluso, de manera sorprendente, poseen la capacidad de generar un organismo
completo y funcional a partir de pequeños fragmentos de un animal. La planaria
recurre al proceso de regeneración epimórfica ya que involucra la formación de un
blastema, que se desarrolla a partir de la proliferación de células somáticas
preexistentes llamadas neoblastos (Alvarado y Tsonis, 2006). De la misma manera
se ha observado que también recurre a la regeneración por morfalaxis cuando
después de la formación del blastema remodela los tejidos preexistentes
restaurando la simetría y la proporción anatómica, por lo cual que se plantea que
ambos mecanismos son necesarios para llevará cabo una regeneración exitosa
(Reddien y Alvarado, 2004).
13
Regeneración en vertebrados
Como se mencionó anteriormente, la capacidad regenerativa es mayor en los
invertebrados que en los vertebrados, sin embargo, hay organismos vertebrados
que son capaces de regenerar una gran porción de algunas de sus partes
corporales. Por ejemplo, la pérdida de tejidos o células de órganos internos como el
corazón, el cerebro y el riñón de algunos animales vertebrados resulta en una
respuesta regenerativa (Tanaka y Reddien, 2011).
Los mecanismos implicados en la respuesta regenerativa de los vertebrados
han sido objeto de estudio de muchos grupos de investigación en los últimos años.
Los organismos que han servido como principales modelo para estos estudios son:
el pez cebra, la salamandra y el ratón.
Regeneración en el pez cebra
El estudio del proceso regenerativo en el modelo del pez cebra Danio rerio
tiene muchas ventajas ya que además de exhibir valiosas capacidades
regenerativas, es un organismo fácil de mantener y reproducir en el laboratorio. El
tiempo de desarrollo embrionario es corto y se han podido producir numerosos
mutantes, incluyendo algunos que afectan la regeneración (Woods et al., 2005).
14
La estructura anatómica que más ha sido estudiada en el pez cebra es la
aleta caudal la cual es una estructura inervada que consiste en segmentos óseos
que forman radios los cuales están rodeados por fibroblastos que a su vez están
rodeados por una epidermis (Akimenko et al., 2003). En este modelo se ha
observado que el proceso de regeneración inicia con el establecimiento de un
epitelio que recubre la herida de la aleta caudal seguido de la formación de un
blastema. En estudios recientes de marcaje y destino celular, se demostró que las
células que forman el blastema son de linaje restringido, es decir, las células solo
restaurarán partes del tejido del que provinen (Tu y Johnson, 2011).
Regeneración en los anfibios
Entre los anfibios, el tritón es el que posee mayor capacidad regenerativa,
como adulto puede regenerar algunos órganos incluyendo extremidades, la cola,
partes del cerebro, médula espinal, retina, branquias y el corazón (Tsonis, 2000).
Sin embargo, son difíciles de mantener y criar bajo condiciones de laboratorio,
además no son accesibles a la genética tradicional, por lo que se ha empleado una
especie de salamandra, estrechamente relacionada, que también regenera
extremidades, cola y médula espinal. Esta salamandra es el Ambystoma
mexicanum, mejor conocido como ajolote, el cual tienen una característica muy
peculiar, presenta neotenia, es decir, exhibe características juveniles siendo un
organismo adulto (Alvarado y Tsonis, 2006).
15
En el ajolote, el mecanismo regenerativo que se presenta es la epimorfosis.
La amputación de la extremidad en cualquier plano entre el hombro y la mano
desencadena inmediatamente la formación de un coáguloy en las siguientes 6 a 12
horas las células epidérmicas migran para cubrir la superficie de la herida y formar
un epitelio (Fig. 1a) (Gilbert, 2013). Posteriormente se forma un blastema
compuesto por un grupo heterogéneo de células progenitoras de linaje restringido
(Fig. 1b). Esta población celular de progenitores heterogéneos será la responsable
de regenerar todas las estructuras perdidas de la extremidad pero cada tipo celular
dará lugar solamente a las estructuras de las cuales provinieron dichos
progenitores (Fig. 1c) (Kragl et al., 2009).
Figura 1. Etapas de la regeneración de la extremidad en A. mexicanum. a. Después de una amputación
completa de la extremidad, primeramente, se forma una epidermis para recubrir la herida. b. Posteriormente
se forma el blastema con una población celular heterogénea de linaje específico. c. Las células del blastema
sólo serán capaces de regenerar el tejido del que provenían. Al finalizar el proceso regenerativo, se restituyen
todas las funciones anatómicas y funciones de las estructuras perdidas. (Modificada Poss, Nature Rev, 2010).
16
Regeneración en mamíferos
Los mamíferos son los organismos que poseen una menor capacidad
regenerativa con respecto a los anfibios y a los peces, incluso han desarrollado un
mecanismo alterno para responder biológicamente ante un daño, este mecanismo
se conoce como reparación (Stocum, 1996).
El proceso de reparación normalmente está acompañado de la migración de
fibroblastos al sitio de la herida, donde la colágena y la matriz extracelular son
depositadas rápidamente de una manera desorganizada, lo que resulta en la
formación de una cicatriz (Clark et al., 1998).
Dado que los mamíferos desarrollan estrategias más rápidas para compensar
un daño, se ha visto que son muy pocas las estructuras que pueden regenerar
facultativamente, entre ellas, el músculo esquelético, estructuras del sistema
nervioso periférico y el hígado (Stoick-Cooper et al., 2007).
El hígado es el órgano que tienen una gran capacidad regenerativa, este
proceso se ha descrito en muchos animales, incluidos los humanos. Después de
una hepatectomía, se desencadenan cascadas de señalización que promueven la
proliferación de todos los tipos celulares que quedaron remanentes en los lóbulos
hepáticos para reemplazar el tejido pedido. Se ha observado que se reactivan
señales que tienen funciones importantes durante el desarrollo embrionario por
17
ejemplo, el factor de crecimiento epitelial (EGF) y el factor de crecimiento de los
hepatocitos (HGF) además de otras señales características de tejidos adultos como
el componente C5 del sistema del complemento (Michalopoulos, 2007). La
proliferación de las células ocurre sin aparente desdiferenciación, se ha
considerado sólo que las células ovales pueden tener un papel de células troncales
ya que expresan marcadores de los dos principales tipos de células en el hígado:
hepatocitos y células de los conductos biliares, sin embargo su papel durante la
regeneración aun no queda claro (Fausto y Campbell, 2003).
Como se observa, la regeneración del hígado representa un mecanismo
compensatorio, sólo algunas partes de los mamíferos pueden regenerar mediante
mecanismos parecidos a otros vertebrados como los peces o los anfibios, es decir
con la formación de un blastema o una estructura tipo blastema. Un ejemplo de ello
son las orejas, en donde se ha visto que en conejos y algunas cepas de roedores
como la MRL/MpJ, después de una escisión de 2 mm de diámetro hecha en el
cartílago de la oreja es capaz de regenerarlo en un lapso de 30 días. El mecanismo
al que se recurre involucra la reepitelización de los extremos de la lesión, la
formación de una estructura tipo blastema y en los días posteriores, el cierre de la
lesión mediante la unión de los epitelios, la regeneración de un nuevo cartílago, de
glándulas sebáceas y de folículos pilosos (Rajnoch et al., 2003).
18
o ANTECEDENTES
1. La regeneración de la falange distal
Otra estructura que pueden regenerar los mamíferos es la punta del dedo, pero
este proceso representa un modelo más complejo, ya que no sólo implica el
crecimiento y la restauración de un solo tipo tisular, sino que involucra la
organización de múltiples tejidos (Reginelli et al., 2005). Como se observa en la
figura 2, la punta del dedo es una estructura que tiene características morfológicas
únicas como la uña y los tejidos que la forman, entre ellos la matriz y el lecho
ungueal. También está presente un cojinete compuesto por la epidermis, la dermis
y las glándulas sudoríparas ecrinas; finalmente, también encontramos tejido
cartilaginoso y óseo rodeado por tejido conectivo laxo (Muller, 1999).
Figura 2. Estructuras y tejidos de la punta del dedo del ratón a los 10 días después del nacimiento: a. Hueso
de la falange. b. Tejido conjuntivo. c. Matriz de la uña. d. Lecho ungueal. e. Uña. f. Epidermis. g. Dermis. h.
Glándulas sudoríparas ecrinas.
19
Debido a esta organización compleja y a la presencia de varios tejidos en la
punta del dedo es que el proceso de regeneración necesita de interacciones tejido-
específico y célula-célula para que se lleve a cabo de forma exitosa. Asimismo es
importante conocer los patrones estructurales y la proliferación celular que
participan en dicho proceso (Reginelli et al., 2005).
Este fenómeno de regeneración en los mamíferos despertó gran interés debido
a que fue descrito primero en humanos. Diversos reportes clínicos de pacientes
indican que si una lesión por amputación de la punta del dedo se maneja con
métodos conservadores, es decir, si se evita el uso de procedimientos quirúrgicos,
se restaura el contorno del digito, la huella digital, la sensibilidad y la función del
dedo con una mínima cicatriz. Sin embargo, aún no es claro mediante qué
mecanismos se lleva a cabo la elongación del hueso (Vidal y Dickson, 1993).
La regeneración de la falange distal no es un proceso exclusivo en los
humanos, se ha demostrado que ocurre bajo condiciones experimentales usando
modelos animales, esto ha permitido conocer a detalle todos los procesos
involucrados en la regeneración de la punta del dedo (Muller, 1999). Diversos
estudios se han realizado en ratones, la cepa más empleada es la CD1 ya que
muestra una alta capacidad regenerativa. Estos estudios han permitido plantear que
la regeneración de la punta del dedo depende principalmente de dos factores: el
nivel de amputación y la edad del individuo (Han et al., 2008).
20
En cuanto al nivel de la amputación se sabe que en los embriones correlaciona
con el gen Msx1, si se amputa la zona donde se expresa este gen, la regeneración
no ocurre (Reginelli et al., 1995). En neonatos y adultos la respuesta regenerativa
se restringe a niveles distales con respecto al lecho ungueal, sin embargo, se ha
reportado que puede ocurrir aún sin la presencia de esta estructura, por lo que esta
matriz no determina la respuesta regenerativa (Zhao y Neufeld, 1995). Así pues,
se ha descrito de manera general que cuando se corta aproximadamente el 50%
del tamaño de la tercera falange y este corte distal no incluye la placa de
crecimiento, la falange amputada presenta una capacidad de regeneración (Fig. 3.
A, D y G). Contrariamente, cuando una amputación más proximal incluye la placa
de crecimiento es decir una amputación que remueve entre el 63 y el 75% de la
falange, la capacidad regenerativa se pierde (Fig. 3. B, E y H) (Han et al., 2008).
Figura 3. La regeneración de la punta del dedo de la falange distal del ratón depende del nivel de la
amputación. A, B, C, D y E tinción de Azul de Alciano-Alizarina roja. F, G y H tinción de Mallory. En A, D y G se
muestra una amputación distal,la cual se regenera con éxito. Mientras que después de una amputación
proximal como se muestra en B, E y H. no hay regeneración. C y F son controles no amputados. Tomada de Han
et al, Dev. Bio. 2008.
21
Otro de los factores para que ocurra una regeneración exitosa es la edad de
los individuos, se ha demostrado que la capacidad de regeneración es inversamente
proporcional a la edad, de tal manera que los individuos en estadios embrionarios o
neonatos, tienen una mayor capacidad regenerativa que los organismos adultos
(Muneoka y Sassoon, 1992). A pesar de que el proceso de regeneración ocurre en
embriones, en neonatos y en adultos, la información generada hasta ahora parece
indicar que se llevan a cabo mecanismos de regeneración distintos.
Regeneración en embriones y fetos de ratón.
Se ha observado que en estadios embrionarios y fetales la punta del dedo
del ratón desencadena una rápida y exitosa respuesta regenerativa tanto en
modelos in vivo (dentro de la cavidad uterina) como en condiciones in vitro en un
modelo de cultivo de órganos (Reginelli et al., 1995).
Existen estudios in vivo que indican que cuando la amputación se realiza a
los E14.5 la respuesta regenerativa inicia con la formación de un epitelio para cubrir
la zona de amputación, posteriormente se forma un blastema de regeneración 2
días después de la extirpación (2 dpa) y al final se desencadenan los procesos que
eventualmente darán como resultado la regeneración del digito. Este proceso se
completa cuatro días después (4 dpa) por lo que al nacimiento de las crías en E18.5,
el digito amputado se encuentra completamente restaurado lográndose una
apariencia normal (Han et al., 2003).
22
Como se mencionó anteriormente la capacidad de regeneración, incluso en
los embriones, depende del nivel de amputación de la falange. Esto se ha
relacionado con la expresión del gen Msx1 ya que se ha observado que en
amputaciones proximales que incluyen la zona de expresión de Msx1, resultan en
un fenotipo trunco debido a la falta de crecimiento longitudinal de la falange, dando
como resultado una regeneración no exitosa. La importancia de este gen se puso
de manifiesto en un estudio con ratones mutantes para los genes Msx1 y Msx2. En
este estudio se observó que los ratones que no expresaban Msx1 no
desencadenaban una respuesta regenerativa, mientras que los que no expresaban
Msx2 mantenían su capacidad de regeneración (Reginelli et al., 1995).
En ratones silvestres cuando la amputación se hizo en posición distal, alejada
de la zona de expresión de Msx1, se observó el inicio de una respuesta regenerativa
y durante este proceso se expresaron otros genes como Bmp4, Ihh, los cuales
también son actores importantes durante la formación de la extremidad y la
osificación endocondral durante el desarrollo. Se observó que la proteína MSX1
provoca una disminución en la expresión del gen Bmp4, por lo que se infiere
trabajan juntos para iniciar la respuesta regenerativa. La proteína BMP4 también es
indispensable para que se desencadene una respuesta regenerativa, esto se
comprobó al aplicar exógenamente la proteína morfogenética del hueso tipo 4
(BMP4) en ratones mutantes para Msx1, lo cual dio como resultado la inducción de
la regeneración. Por otro lado, se demostró que en ratones silvestres al inhibir la
expresión de BMP4 mediante el uso de NOGGINA se perdía la capacidad de
regeneración de la falange (Han et al., 2003).
23
Regeneración en ratones neonatos.
Cuando se realiza una amputación distal de la falange en ratones neonatos
de 3 días, (Fig. 4A) se observa el inicio de la respuesta regenerativa, sin embargo,
ésta no es completamente exitosa. El hueso regenerado exhibe una anatomía
correcta pero nunca logra alcanza la longitud normal de una falange no amputada
(Han et al., 2008). Esta respuesta regenerativa se ha dividido en tres etapas
(Muneoka et al., 2008).
La primer etapa, llamada de reparación, involucra la formación de un coágulo
seguido de la migración de queratinocitos de la epidermis remanente, lo que dará
lugar a la formación de un epitelio a lo largo del sitio de la amputación, proceso que
tarda aproximadamente cuatro días en completarse (Fig. 4B) (Lehoczky et al.,
2011). Durante esta etapa también se ha visto que parte del hueso que quedó
expuesto tras la amputación, es remodelado por la acción de los osteoclastos,
quedando una porción remanente que se eliminará junto con el coágulo al ser
desplazado una vez que ocurre la formación del epitelio, que es el siguiente paso
para continuar con la respuesta regenerativa (Muneoka et al., 2008).
Durante la segunda etapa que ocurre aproximadamente en los 6 días
posteriores a la amputación (6 dpa) se ha descrito que unas poblaciones de células
en proliferación se acumulan distalmente y se encuentran en contacto directo con
el hueso amputado, a este acúmulo celular se le ha descrito como característica de
una regeneración de tipo-blastema (Fig. 4C) (Han et al., 2008).
24
La tercera y última fase de la regeneración involucra la rediferenciación de
las estructuras que se van a regenerar, como es el caso del hueso, del tejido
conectivo y de la uña. En los ratones neonatos se ha reportado que esta tercera
etapa ocurre entre los 7 y 14 dpa mediante la deposición directa de hueso, es decir,
sin la aparente expresión de algún marcador de osificación endocondral (Han et al.,
2008).
En cuanto al origen del blastema y al proceso de diferenciación se han
planteado diversas hipótesis. Se había pensado que estas células eran células
troncales multipotentes provenientes de tejidos preexistentes, como ocurre en la
planaria, o bien eran el resultado de la desdiferenciación de los tejidos maduros
como se postulaba ocurría en la regeneración de las extremidades de anfibios
(Fischman, 1961). También existen teorías más recientes que apoyan la idea de
que son células multipotentes, capaces de transdiferenciarse en todos los tipos
celulares las responsables de la regeneración, tal y como sucede en los ajolotes
(Echeverri y Tanaka, 2002). Sin embargo, se ha observado que las células del
blastema pueden recordar su origen y diferenciarse sólo a los tejidos de los cuales
provienen, es decir se comportan como células progenitoras de linaje restringido
(Lehoczky et al., 2011).
Experimentos recientes con ratones transgénicos modificados con un gen
reportero inducible, confirman esta teoría, Estos ratones recibieron el estímulo al
momento del nacimiento, posteriormente fueron amputados el día 3 y se observó la
descendencia de las células marcadas con el gen reportero y su contribución a la
25
formación del blastema y restauración de los tejidos. Fue así que se encontró por
ejemplo que los queratinocitos krt14+ sólo participan en la regeneración del epitelio,
ya que no se encontraron células marcadas krt14+ en otros tejidos como el hueso,
el tejido conjuntivo o el coágulo (Fig. 4D). En cuanto al marcador de osteoblastos
sp7+, se observó que, si bien las células que lo expresaron durante la regeneración
se encontraron en la zona del blastema, al final del proceso de regeneración sólo
contribuyeron a la formación del hueso y del pericondrio de la falange (Fig. 4E).
También cuando se analizó la expresión de msx1, se observó que no se encontraba
presente en el blastema pero que las células preexistentes, marcadas msx1+
presentes en el lecho ungueal podrían contribuir a señalizar o producir factores
paracrinos necesarios para que ocurriera la regeneración (Fig. 4F) (Lehoczky et al.,
2011).
Figura 4. Regeneración en ratones neonatos. A-C. Tinción de Mallory. A. Se observa el plano de amputación (línea
punteada) a los 3 días después del nacimiento, es decir cero días postamputación (0 DPA). B. La formación del epitelio seobserva en el día 4 posterior a la amputación (flecha) (4 DPA). C. Formación del blastema de regeneración (flecha). D-E.
Expresión de genes reporteros durante la formación del blastema y la rediferenciación (tinción azul con X-gal). D. Células
krt14+ que forman sólo el epitelio, E. Células sp7+ que se ha reportado sólo contribuyen a la regeneración del hueso y del
periostio. F. La expresión de msx1 no se observa en el blastema pero si en el tejido conjuntivo debajo de la uña. Modificada
de Han et al, Dev. Bio, 2008 y Lehoczky et al., PNAS, 2011.
26
Al igual que sucede en los fetos de ratón, se ha visto que las BMPs son
indispensables para que ocurra la regeneración en ratones neonatos. En estudios
recientes se ha reportado que la señalización de BMP es requerida para una
regeneración exitosa y que la regeneración proximal del dígito puede ser inducida
mediante la administración exógena de perlas de heparina embebidas con BMP2 y
BMP7. Esto quedó demostrado al realizar una amputación proximal en ratones
neonatos e inmediatamente después de la formación del epitelio implantar perlas
embebidas con BMP7. Los resultados de este experimento mostraron que la
administración exógena de BMP7 promovía la formación del blastema, la
proliferación celular y la expresión de Msx1 en el tejido expuesto al tratamiento. En
cuanto a la rediferenciación, se observó la activación de genes que participan
durante la osificación endocondral como Indian hedgehog (Ihh), colágena 2 alfa 1
(Col2a1), colágena 10 alfa 1 (Col10a1) y Osteocalcina, estos hallazgos permitieron
concluir que las BMPs pueden inducir una reactivación del programa de desarrollo
en la punta del dedo, en donde la regeneración es exitosa ya que se restablece la
morfología y el tamaño de modo muy similar a la longitud de la falange original (Yu
et al., 2010).
27
Regeneración en organismos adultos.
En ratones adultos se ha reportado que el nivel de amputación determinará
qué tipo de respuesta se desencadenará ante el daño. En amputaciones proximales
solo se forma una epidermis y no hay crecimiento del hueso. De manera contraria,
en amputaciones distales parece ser que recurren a un mecanismo de reparación
más que un proceso de regeneración, esto se sustenta en las observaciones
realizadas por Muller en donde describe que ocurre la formación directa de hueso
pero que éste tiene una anatomía más engrosada que la normal (Muller, 1999).
En los ratones adultos, la primera fase de la reparación que incluye la
formación del coágulo y del epitelio que recubre la herida, es distinta a las demás,
se presenta muy prolongada y se caracteriza por un tiempo variable y lento del cierre
de la herida. Durante esta primera etapa, se forma un coágulo que sella el sitio de
la herida y se observa el reclutamiento de células inflamatorias. Posteriormente se
empieza a regenerar el epitelio hasta llegar al borde lateral del hueso amputado, por
lo que una parte de la lesión queda expuesta (Fig. 5A). Otra característica relevante
de este proceso de reparación es que hay una fuerte actividad de los osteoclastos
que se encargan de la degradación distal del muñón del hueso, así que hasta que
se completa la erosión que elimina aproximadamente el 50% del volumen del hueso,
el epitelio es capaz de lograr el cierre total de la herida (Fernando et al., 2011).
28
La segunda fase o formación del blastema, ocurre una vez que el epitelio
cerró completamente el sitio de la herida. El blastema se forma aproximadamente a
los 12 dpa justo en la región donde el hueso fue erosionado, de tal forma que el
blastema queda en contacto directo con la médula ósea y el tejido conjuntivo
adyacente (Fig. 5B). Se ha observado que la proliferación en esta zona del tipo-
blastema se incrementa aproximadamente ocho veces y hasta cuatro veces en la
médula ósea, por lo que se ha sugerido que las células troncales de la médula ósea
podrían estar participando en la formación del blastema y por lo tanto en la
reparación de la falange (Fernando et al, 2011).
En adultos, la formación del hueso para la reparación de la falange distal
ocurre mediante un proceso de osificación intramembranosa. Se sabe que
aproximadamente a los 17 dpa las células que se encuentran en la zona tipo-
blastema se diferencian directamente a hueso y que este fenómeno ocurre en
dirección proximal a distal. Así, se observa que se comienza a depositar una capa
de hueso trabecular contigua al muñón del hueso y la médula ósea (Fig. 5C). Este
depósito o molde de hueso trabecular incrementa su densidad con el tiempo, se ha
observado que incluso a los 28 dpa el hueso trabecular continúa depositándose
hasta finalmente alcanzar su longitud original. La única diferencia remarcable
después de este proceso de reparación es que la forma de la falange no
corresponde totalmente a la forma que tenía antes de la amputación ya que el hueso
reparado exhibe un volumen significativamente mayor al de los dígitos no
amputados (Fig. 5D) (Fernando et al, 2011).
29
Figura 5. Reparación de la punta del dedo en ratones adultos. La formación del epitelio que cubre la herida
y su unión con el muñón del hueso es señalada con flechas, se forma a los 7 dpa (A), el hueso del muñón se
empieza a degradar para dar paso a la formación del blastema a los 12 dpa (B). La rediferenciación comienza
a los 17 dpa y ocurre por osificación directa (C). A los 28 dpa la punta del dedo tiene la morfología del hueso
no amputado, pero éste es más ancho (D). Control de 8 a 10 semanas de edad (E). Tomada de Fernando et al,
Dev Bio. 2011.
De manera similar a como ocurre la respuesta regenerativa en ratones
neonatos, se sabe que se forma una estructura tipo-blastema y que éstas células
son de linaje restringido. En diversos estudios con ratones transgénicos se ha
observado que después de una amputación las células epidérmicas marcadas con
Queratina 14 (Krt14) sólo contribuyen a la regeneración de los tejidos ectodérmicos
como la epidermis, la placa de la uña, los folículos pilosos y las porciones secretoras
de las glándulas sudoríparas. Por otro lado, también se sabe que los tejidos
mesodérmicos marcados con Prx1, sólo contribuyen a la formación de tejidos como
el hueso y la dermis. De la misma manera las células marcadas con VE-cadherina
contribuyen únicamente a la regeneración del endotelio y el tejido cartílago/hueso
marcado con Sox9 posteriormente se observó en el tejido óseo regenerado aunque
también se presentaron algunas células epidérmicas positivas para Sox9 debido a
que es un marcador característico para las células troncales de la piel (Rinkevich et
al., 2011).
30
2. El desarrollo de la falange.
Las diferencias que se observan en el proceso regenerativo de la punta del
dedo en ratones de distintas edades se podrían explicar por el hecho de que la
regeneración depende de la capacidad del individuo para acceder a su programa
de desarrollo, siendo más fácil para los fetos y neonatos acceder de forma exitosa
a él que para un organismo adulto que ya ha completado su crecimiento.
Con respecto al desarrollo de la falange distal en ratones de la cepa CD1, se
ha observado que el proceso de osificación inicia en el día de gestación 17.5 (E17.5)
en el cual se caracteriza por la expresión de marcadores condrogénicos como la
Col II y el marcador de condrocitos prehipertróficos Ihh (Fig. 6 A y C). Si observamos
un día después (E18.5) podemos notar que estos mismos marcadores presentan
una expresión diferencial restringida a la región proximal y ausente en la región
distal (Fig. 6. B y D). Por otro lado, marcadores osteogénicos como la Col I y
marcadores de condrocitos hipertróficos como la Col X, se expresan débilmente al
día E17.5 (Fig. 6 E, G) y para el día E18.5 observamos que se expresan fuertemente
en la partedistal de la falange (Fig. 6. F y H). Después del nacimiento, la falange
continua el proceso de osificación que inició durante el desarrollo y conserva su
única placa de crecimiento la cual se cierra hasta el día 21 después del nacimiento
(Han et al., 2008).
31
Durante el desarrollo de la falange distal se distinguen tres eventos para el
proceso de osificación: la osificación de la matriz del cartílago, la deposición directa
de hueso en la punta y finalmente, la deposición de hueso verdadero en toda la
falange. Dicho proceso de osificación se inicia distalmente y se expande hacia la
base de la falange. De esta forma, el primer evento se caracteriza por la
organización de las células en la única placa de crecimiento que existe dentro del
molde de cartílago. Los condrocitos comienzan a organizarse en hileras paralelas y
se van desplazando hacia la base de la falange conforme avanza el proceso.
Simultáneamente, el centro de osificación distal sigue funcionando e induce la
formación directa de hueso debajo del periostio, esto forma un anillo que poco a
Figura 6. Expresión de transcritos específicos de cartílago (A-D) y de hueso (E-H) durante los días E17.5 y
E18.5 al principio de la osificación de la falange distal. (A y B) Expesión de colágena 2 (Col II), dentro de la
matriz secreatada por los condrocitos en proliferación. (C y D) Expresión de Indian hedgehog (Ihh) producido
por los condrocitos prehipertróficos. (E y F) Expresión de la Col X producido por condrocitos hipertróficos. (G
y H) Expresión colagéna I (Col I) indicador de la presencia de una matriz osificada. Tomada de Han et al, Dev.
Bio. 2008.
32
poco envuelve al molde de cartílago y que conforme avanza el proceso de
osificación también se va extendiendo hacia la base de la falange. El extremo distal
o la punta de la falange corresponde morfológicamente al centro de la diáfisis en los
huesos largos.
El tercer evento en el desarrollo del hueso está marcado por la irrupción e
invasión en el molde de cartílago de los vasos sanguíneos y los osteoblastos, justo
en la región distal donde el cartílago se comenzó a calcificar. El avance de la
osificación sobre la diáfisis y la gradual resorción del hueso primario sigue la misma
dirección de distal a proximal. Al final de este proceso, el hueso comienza a
aumentar su volumen mediante la adición de hueso nuevo en la superficie justo por
debajo del periostio, haciéndose esta capa cada vez más profunda y cubriendo casi
por completo el molde de cartílago. En la falange madura, solo se observa un hueso
cortical o verdadero el cual es constantemente resorbido y renovado para mantener
la homeóstasis del tejido.
Dada la expresión de los marcadores de osificación y el patrón mediante el
cual se va osificando la falange, se puede decir que a pesar de que la falange distal
sólo tiene una placa de crecimiento y por lo tanto un solo centro de osificación,
también se forma mediante osificación endocondral como todos los huesos largos
y no mediante una osificación intramembranosa (Casanova y Sanz-Ezquerro,
2007).
33
Mecanismos de osificación
Se sabe que los huesos pueden desarrollarse mediante dos mecanismos: la
osificación intramembranosa que involucra la diferenciación del tejido mesenquimal
directamente en hueso; y la osificación endocondral en la que las células
mesenquimales se diferencian a cartílago que posteriormente es reemplazado por
hueso (Gilbert, 2013).
Osificación intramembranosa
El proceso de osificación intramembranosa es característico de los huesos
del cráneo. Durante este proceso las células mesequimales derivadas de la cresta
neural proliferan y se condensan en nódulos compactos. Algunas de estas células
se desarrollan dentro de capilares, otras se diferencian a osteoblastos que son
células comprometidas y precursoras de hueso (Gilbert, 2013).
Los osteoblastos comienzan a secretar una matriz rica en colágena y
proteoglucanos (osteoide) capaz de incorporar sales de calcio, es a través de este
mecanismo que el osteoide se calcifica. En algunos casos los osteoblastos quedan
separados de la matriz calcificada por una capa de osteoide que ellos mismos
secretan, en otros casos los osteoblastos son atrapados dentro de la matriz
calcificada y se diferencian a osteocitos (Gilbert, 2013).
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Conforme la calcificación procede, se forman las espículas óseas producto
de la insipiente osificación que se van extendiendo, estas espículas comienzan a
ser rodeadas por las células mesenquimales que forman el periostio, posteriormente
las células de la capa interna del periostio se diferencian a osteoblastos y empiezan
a secretar osteoide que se deposita paralelamente a las espículas ya existentes, es
mediante este mecanismo que se forman varias capas de hueso (Gilbert, 2013).
Las moléculas que participan en este proceso son algunos miembros de la
familia de las BMPs y la activación del factor de transcripción RUNX2, antes llamado
CBFA1. Se ha descrito que BMP2, BMP4 y BMP7 son capaces de activar a Runx2
lo que induce a las células mesequimales de la creta neural para diferenciarse
directamente a osteoblastos. La proteína RUNX2 parece activar genes que
codifican para la OSTEOCALCINA, la OSTEOPONTINA y otras proteínas
específicas que conforman la matriz extracelular del hueso (Gilbert, 2013).
Osificación endocondral
La osificación endocondral es característica de los huesos largos, involucra la
formación de cartílago a partir de agregados de células mesenquimales y el
subsecuente reemplazo de este cartílago por tejido óseo (Horton, 1990).
El proceso inicia cuando las células mesenquimales se comprometen a un
linaje cartilaginoso. Este compromiso se lleva a cabo por la acción de factores
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paracrinos que inducen a las células mesodérmicas vecinas a expresar dos factores
de transcripción: PAX1 que induce a las células mesenquimales para formar
cartílago (Fig. 7a) y SCLERAXIS, necesario en la formación de tendones y
ligamentos. Las células que empiezan a expresar estos dos factores se condensan
inmediatamente en nódulos compactos y se diferencian a condrocitos, fenotipo
inducido por SOX9 (Fig. 7b). Después, los condrocitos proliferan y a medida que se
dividen comienzan a secretar una matriz extracelular (MEC) rica en colágena tipo II
(COL II) (Fig. 7c) (Gilbert, 2013). Conforme el proceso avanza, los condrocitos que
se encuentran en el centro de la condensación adquieren una forma ovalada y se
denominan condrocitos hipertróficos los cuales ahora empiezan a secretar una MEC
rica no solo en colágena II, también en colágena tipo IX, colágena tipo XI y
proteoglucanos enriquecidos con sulfato de condroitina y agrecano, además de
inducir la producción de moléculas como Indian Hedgehog (IHH) (Fig. 7d) (Horton,
1993).
El proceso sigue avanzando y cuando los condrocitos alcanzan la hipertrofia
envían, a través de la producción del Factor de Crecimiento Vascular Endotelial
(VEGF), la señal para que ocurra la invasión por los vasos sanguíneos. Al mismo
tiempo, se genera una atracción de condroclastos, los cuales provienen del linaje
de los macrófagos capaces de secretar numerosas vesículas pequeñas que
contienen enzimas como las metaloproteasas (MMPs), la adenosintrifosfatasa y la
catepsina B las cuales son capaces de degradar la matriz cartilaginosa e iniciar el
proceso de osificación de la matriz extracelular (MEC) (Sires et al, 1995).
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Los condrocitos hipertróficos también estimulan a las células del pericondrio
que se encuentran más próximas a ellos, esta estimulación dada por la expresión
de Runx2 resulta en la diferenciación de las células del pericondrio a osteoblastos.
Una vez diferenciados, los osteoblastos secretan una matriz rica en COL I (Inada et
al., 1999). Una vez que los condrocitoshipertróficos cumplen estas funciones
mueren por apoptosis y la matriz extracelular que secretaron servirá como andamio
o molde para que los osteoblastos lo invadan junto con los vasos sanguíneos
creando una verdadera matriz ósea (Noonan, 1998).
Figura 7. Osificación endocondral en un hueso largo. a. Los condrocitos se condensan a lo largo del molde.
b. Los condrocitos (c) adquieren una forma ovalada y comienzan a producir una MEC rica en Col II (c). c.
Algunos condrocitos dejan de proliferar y se hipertrofian (h). d. Los condrocitos hipertróficos inducen la
invasión de los vasos sanguíneos al molde de cartílago y la diferenciación de las células del periostio a
osteoblastos formándose así el collar óseo (bc). Modificada de Henry M. Kronenberg. Nature. 2003.
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Se ha observado que una de las moléculas que es indispensable para la correcta
formación de los huesos es IHH. Por ejemplo, durante el desarrollo en ratones con
una mutación condicional de ihh en las células que expresan colágena tipo II
(Col2a1Cre: Ihhd/ihhd) se observa que el resultado son huesos cortos, con
malformaciones y con un retraso en su crecimiento. Al realizar el análisis mediante
hibridación in situ encontraron que hubo una disminución en la proliferación de los
condrocitos y un retraso en la hipertrofia debido a la falta de expresión de col X y
osteopontina. Adicionalmente, observaron la ausencia de expresión de marcadores
de osificación como runx2. Como se puede observar entonces, Ihh es un elemento
clave, no solo regula la proliferación y diferenciación de los condrocitos sino que
promueve la diferenciación de los osteoblastos, sólo si está presente durante el
proceso de osificación endocondral se lleva a cabo correctamente. (Razzaque et
al., 2005).
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3. El papel de la señalización Ihh durante la osificación
endocondral.
La osificación endocondral como se mencionó anteriormente, involucra una
serie de señales y moléculas que participan en el proceso, sin embargo, se ha
considerado que IHH es el “regulador maestro” del desarrollo del hueso ya que se
encarga de coordinar la proliferación y diferenciación de los condrocitos, así como
la diferenciación de los osteoblastos (St-Jacques et al, 1999).
IHH es una proteína que funciona como ligando, el cual una vez que es
secretado posee una acción paracrina. Se dice IHH actúa como morfógeno, es
decir, induce respuestas celulares diferentes dependiendo del tipo de células que
responden, la dosis que reciben y el tiempo de exposición a dicha señal (Varjosalo
y Taipale, 2008).
Sin embargo, la acción de IHH durante la osificación endocondral no es
independiente, esta acción se encuentra regulada por el péptido relacionado a la
hormona paratiroidea (PTHrP). PTHrP es una proteína que actúa como un factor
paracrino, es secretado durante el desarrollo fetal por los condrocitos proliferantes
(en estadios tempranos) cercanos a la región articular. Su principal función es
mantener a los condrocitos en estado proliferativo y prevenir la hipertrofia. Así, las
interacciones entre IHH y PTHrP controlan la decisión que tomarán los condrocitos
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de dejar el estado proliferativo a través de una retroalimentación negativa, es decir,
cuando los condrocitos no son suficientemente estimulados por PTHrP, dejan de
proliferar y sintetizan IHH. Los receptores de PTHrP llamados PPR se encuentran
en los condrocitos proliferantes, cuando PTHrP se encuentra unido a su receptor
induce la proliferación de los condrocitos. A su vez, cuando IHH se une a su receptor
PATCHED (PTC) que se encuentra en las células condrogénicas del pericondrio,
puede estimular la producción de PTHrP (Fig. 8) (Vortkamp y Kronenberg, 2015).
Cuando los condrocitos prehipertróficos dejan de expresar Ihh continúan su
maduración hacia la hipertrofia. Esto promueve la expresión de marcadores de
hipertrofia como son la colágena 10 A1 (COL10A1) y VEGF, este último, induce la
invasión de los vasos sanguíneos al molde de cartílago. Al mismo tiempo en las
células del pericondrio/periostio se activa la expresión de factores de transcripción
como RUNX2 y RUNX3, esta activación induce la diferenciación de las células
osteogénicas que se encuentran en la porción externa del periostio a osteoblastos
(Fig. 8). También se ha observado que RUNX2 activa al promotor de Ihh
estimulando su expresión, es así como RUNX2 contribuye al sistema de
retroalimentación negativa entre PTHrP e IHH, manteniendo el balance apropiado
entre proliferación e hipertrofia (Yoshida et al, 2004).
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Pericondrio
Figura 8. Retroalimentación negativa entre IHH y PTHrP. IHH es secretado por los condrocitos
prehipertróficos (color rojo). IHH se une a su receptor Patch de las células del pericondrio, promoviendo así la
secreción de PTHrP. PTHrP se une a su receptor PPR en los condrocitos proliferantes (Color naranja circulares)
para mantener y estimular su proliferación. Conforme la proliferación aumenta las células comienzan a
alejarse de la zona de proliferación abandonando el ciclo celular, como consecuencia aumentan de tamaño,
es en este momento que se les da el nombre de condrocitos prehipertróficos (Color naranja, aplanados).
Cuando dejan de expresar IHH se convierten en hipertróficos y van a inducir la formación de hueso además
generan señales para que las células del pericondrio se diferencien a osteoblastos. Modificada de Henry M.
Kronenberg. Nature. 2003.
Para entender cómo es que IHH ejerce toda esta actividad en los condrocitos,
es necesario remitirnos a la vía de señalización, que inicia desde su modificación
post-traduccional, secreción, unión al receptor, a las cascadas de fosforilación que
desencadena y por último a la activación de sus genes blanco.
Condrocitos en
proliferación
Condrocitos
prehipertróficos
Condrocitos
hipertróficos
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Vía canónica de señalización de Hedgehog.
El gen hedgehog fue descrito por primera vez en Drosophila, donde se
observó que la forma mutante para hedgehog resultaba en la desorganización de
las espículas y dentículos localizados sobre el cuerpo de la larva, fenotipo parecido
a las espinas sobre el cuerpo de un erizo, es por ello que lo denominaron Hedgehog
(Nüsslein-Volhard et al., 1980).
La familia hedgehog incluye a Indian Hedgehog (Ihh), Desert hedgehog (Dhh)
y Sonic hedgehog (Shh), se sabe que los tres funcionan como reguladores del
desarrollo embrionario y se encuentran altamente conservados en la escala
filogenética desde la Drosophila hasta los humanos. En los mamíferos hedgehog
induce la simetría bilateral en el cuerpo y la correcta formación de las extremidades,
el esqueleto, los músculos, la piel, los ojos, los pulmones, los dientes, el sistema
nervioso y los intestinos, asimismo se sabe que participa en los procesos de
diferenciación de los espermatozoides y el cartílago (Ingham y MacMahon, 2001).
En los vertebrados, los condrocitos que responden a HEDGEHOG (HH),
tienen un cilio primario, el cual es una proyección de la membrana plasmática que
censa las señales mecánicas y químicas actuando como un centro de actividad que
controla la polaridad y diferenciación celular. Es en el cilio primario donde se
produce toda la actividad de la señalización de HH (Khaliullina et al., 2009). Los
componentes de la vía Hedgehog son: el ligando maduro de Hedgehog (HH), la
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proteína PTC que actúa como receptor, la proteína Smoothened (SMO), el complejo
proteico conformado por SUFU, FUSED y GLI un factor de transcripción.
La vía canónica de Hedgehog es iniciada por la unión del ligando maduro HH
a su receptor PTC, (Rohatgi et al., 2007). Así, tras la unión de HH se induce la
translocación de PTC
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