Estudio-computacional-del-receptor-CX3CR1-como-posible-blanco-terapeutico-para-el-tratamiento-de-la-enfermedad-de-Alzheimer

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas 
 
 
 
Estudio computacional del receptor CX3CR1 como posible blanco terapéutico para 
el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Maestro en Ciencias 
 
 
PRESENTA: 
Guillermo David Goode Romero 
 
 
Laura Domínguez Dueñas 
Facultad de Química, UNAM 
 
Marcelino Arciniega Castro 
Instituto de Fisiología Celular, UNAM 
Rogelio Rodríguez Sotres 
Facultad de Química, UNAM 
 
 
 
 
 
 
Ciudad de México. Julio de 2019 
 
 
 
 
 
MIEMBROS DEL JURADO 
 
 
 
 
PRESIDENTE COSTAS BASÍN MIGUEL ANTONIO 
VOCAL GONZÁLEZ ANDRADE MARTÍN 
VOCAL GARCÍA HERNÁNDEZ ENRIQUE 
VOCAL PASTOR COLÓN CARMEN NINA 
SECRETARIO SOSA PEINADO ALEJANDRO 
 
 
 
 
TUTOR 
 
____________________ 
DOMÍNGUEZ DUEÑAS LAURA 
 
 
 
SUSTENTANTE 
 
____________________ 
GOODE ROMERO GUILLERMO DAVID 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
 
AGRADEZCO A LA UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POR LA FORMACIÓN 
MULTIDISCIPLINARIA RECIBIDA. 
 
A LA FACULTAD DE QUÍMICA Y A MI TUTORA DRA. LAURA DOMÍNGUEZ POR LA DISPOSICIÓN 
PLENA, LAS FACILIDADES Y EL APOYO PARA REALIZAR ESTE PROYECTO. 
 
A LOS INTEGRANTES DEL CUBÍCULO F230; Q.F.B. ALEJANDRO ÁLVAREZ HERNÁNDEZ, 
VÍCTOR H. CALVO JIMÉNEZ, Q. DULCE C. GUZMÁN OCAMPO, HUMBERTO T. HERNÁNDEZ 
TRUJILLO, Y DE MANERA MUY ESPECIAL AL DR. RODRIGO AGUAYO ORTIZ POR TODOS LOS 
COMENTARIOS Y SUGERENCIAS PARA LA MEJORA CONTINUA DEL PROYECTO Y DEL 
DESEMPEÑO EN EL GRUPO DE TRABAJO. 
 
AL DR. MARCELINO ARCINIEGA CASTRO Y DR. ROGELIO RODRÍGUEZ SOTRES POR LAS 
OBSERVACIONES Y SUGERENCIAS. 
 
A MI MADRE G. SUSANA Y A MI PADRE GUILLERMO POR EL APOYO Y LA CONVIVENCIA 
DESDE EL INICIO. 
 
A MIS AMIGOS M. RUBÉN SALINAS ESPINOZA, A ISC. EDUARDO E. RODRÍGUEZ GARCÍA Y 
A MAT. FERNANDO R. RODRÍGUEZ CRUZ POR SU VALIOSA AMISTAD Y COMPAÑÍA. 
 
AL Q.A. HÉCTOR E. RODRÍGUEZ SOLLANO POR LOS RETOS PERSONALES QUE, SIN SU 
PRESENCIA, NO HUBIERA LLEGADO A LOGRAR. 
 
A LA DIRECCIÓN GENERAL DE CÓMPUTO Y TECNOLOGÍAS DE LA INFORMACIÓN POR EL 
ACCESO A LA SUPERCOMPUTADORA HP CLUSTER PLATFORM 3000SL (MIZTLI). 
 
Y AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA (CONACYT) POR LA BECA OTORGADA 
(NO. 631327/482735). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DURANTE LA MAESTRÍA SE REALIZÓ LA PUBLICACIÓN “RELACIONES CUANTITATIVAS ESTRUCTURA 
ACTIVIDAD/PROPIEDAD EN DOS DIMENSIONES EMPLEANDO EL PROGRAMA R” EN LA REVISTA EDUCACIÓN 
QUÍMICA, EN COAUTORÍA CON RODRIGO AGUAYO-ORTIZ Y LAURA DOMÍNGUEZ. 
 
 
 
uimica 
RELACIONES CUANTITATIVAS ESTRUCTURA-
ACTIVIDAD/PROPIEDAD EN DOS DIMENSIONES 
EMPLEANDO EL PROGRAMA R 
Resumen 
Las relaciones cuantitativas est ructura-actividad (QSAR) y estructura-propiedad 
(QSPR) son modelos matemáticos aplicados a la predicción de actividades biológicas 
o propiedades de un grupo de compuestos. Estos modelos son generados y va lidados 
por aná lisis estadístico a parti r de un grupo de moléculas con una actividad biológica o 
propiedad conocida. En este trabajo se expl ica la metodología general para rea lizar un 
aná lisis QSAR!QSPR uti lizando e l lenguaje de programación de R, ana lizando como caso 
de estudio la predicción del transporte a través de la barrera hematoencefá lica. 
Palabras clave: QSARjQSPR, RSt udio, Barrera hematoencefálica 
TWO-DIMENSIONAL QUANTlTATIVE STRUCTURE-
ACTIVITY/PROPERTY RELATIONSHIPS USING R 
SOFTWARE 
Abstract 
Quantitative structure-activity/property re lationships (QSAR!Q5PR) are mat hematical 
models applied to the pred iction of biological activities or properties of a se ries of 
compounds. These models are generated and validated by statistical analysis from a 
group of molecules with a known biological activ ity or property. This paper des<:ribes the 
genera l methodology to perform a QSAR!QSPR st udy using the R software, employing 
experimental information of the transport th rough t he blood-brain barrie r as a case of 
study. 
Keywords: QSARjQSPR, RSt udio, Blood-brain barrier 
Auto res: Guillermo Goode-Romero', Rodrigo Aguayo-Ortiz' , and Laura Oomínguez" 
Focultad de 
Química, 
Departamento 
de Fisicoq uímica, 
Universidad 
Nacional 
Autónoma de 
México, Mexico. 
'Autor para 
correspondeooa: 
lau radd@Unam.mx 
ÍNDICE 
 
5 
ÍNDICE 
 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 7 
I.1 RESUMEN 13 
I.2. INTRODUCCIÓN 14 
II. ANTECEDENTES 15 
II.1. GENERALIDADES 15 
II.2. NEUROINFLAMACIÓN 15 
II.3. CÉLULAS GLIALES 16 
II.3.1. ASTROCITOS 16 
II.3.2. NG-2 Y OLIGODENDROCITOS 16 
II.3.3. MICROGLÍA 17 
II.4. ORIGEN HEMATOPOYÉTICO DE LA MICROGLÍA 17 
II.4.1. ACTIVIDAD DE LA MICROGLÍA 17 
II.5. CITOCINAS Y QUIMIOCINAS 18 
II.5.1. QUIMIOCINAS 18 
II.5.2. FRACTALKINA 18 
II.5.2.1. EL RECEPTOR DE FRACTALKINA: CX3CR1 19 
II.6. RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G (GPCR) 20 
II.6.1. CLASES DE GPCRS 20 
II.7. PROTEÍNAS G 22 
II.7.1. PROTEINAS Gi/0 23 
II.8. ACTIVACIÓN DE LAS PROTEÍNAS G HETEROTRIMÉRICAS 23 
II.8.1. MODELO DE GILMAN DE ACTIVACIÓN DE LAS PROTEÍNAS G HETEROTRIMÉRICAS 23 
II.8.2. MODELO DE BOUVIER DE ACTIVACIÓN DE LAS PROTEÍNAS G HETEROTRIMÉRICAS 24 
ÍNDICE 
 
6 
III. JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 25 
IV. METODOLOGÍA 26 
IV.1. SISTEMAS DE ESTUDIO 26 
IV.2. SISTEMAS EN MEMBRANAS DE POPC 27 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 29 
V.1 SISTEMAS DEL RECEPTOR DE REFERENCIA CCR5 29 
V.2. SISTEMAS DEL RECEPTOR DE PRUEBA CX3CR1 36 
V.2.1. MODELOS CX3CR1 MULTITEMPLADO, ACTIVO, TRANSITIVO Y ESTATIVO 38 
V.2.2. MODELO MULTITEMPLADO CON ANTAGONISTAS PRESUNTIVOS 43 
V.2.3. MODELO MULTITEMPLADO CON AGONISTAS PRESUNTIVOS 47 
V.3. ANÁLISIS DE LOS ESTADOS FUNCIONALES DE CX3CR1 Y LOS EFECTOS DE LOS LIGANDOS 50 
V.3.1. PATRONES DE ESTADO FUNCIONAL 50 
V.4. MODELOS DE RECEPTOR-PROTEÍNA Gi 53 
V.4.1. SUBUNIDAD CX3CR1 DEL COMPLEJO 53 
V.4.2. HETEROTRÍMERO Gi 55 
VI. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 57 
VII. REFERENCIAS 58 
VIII. ANEXO I: RESULTADOS SUPLEMENTARIOS 63 
IX. ANEXO II: INFORMACIÓN COMPLEMENTARIA 77 
X. ANEXO III: FUNDAMENTOS TEÓRICOS 82 
 
 
 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
7 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
Letras griegas minúsculas utilizadas 
α Alfa 
β Beta 
γ Gamma 
ε Épsilon 
θ Theta 
μ Mu 
ξ Xi 
π Pi 
ρ Ro 
σ Sigma 
τ Tau 
φ Fi 
χ Ji 
ψ Psi 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
8 
Aminoácidos 
Abreviaturas Símbolos Nombre Estructura predominante a pH=7 
Ala A Alanina 
 
 
Arg R Arginina 
 
 
Asn N Asparagina 
 
 
Asp D Ácido aspártico 
 
 
Cys C Cisteína 
 
 
Phe F Fenilalanina 
 
 
Gly G Glicina 
 
 
Gln Q Glutamina 
 
 
Glu E Ácido glutámico 
 
 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
9 
His H Histidina 
 
 
Ile I Isoleucina 
 
 
Leu L Leucina 
 
 
Lys K Lisina 
 
 
Met M Metionina 
 
 
Pro P Prolina 
 
 
Ser S Serina 
 
 
Tyr Y Tirosina 
 
 
Thr T Treonina 
 
 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
10 
Trp W Triptófano 
 
 
Val V Valina 
 
 
Abreviatura o acrónimo Significado 
AFKN Aglicofractalkina, aglicona de CX3CL1 soluble 
BHE Barrera hematoencefálica 
CCR5 Receptor 5 de quimiocina con motivo CC; CD195; correceptor 
de fusión de HIV-1 
CHARMM Campo de fuerza CHARMM (del ingles Chemistry at Harvard 
Macromolecular Mechanics) 
CX3CL1 Ligando 1 con motivo CX3C; fractalkina, neurotactina 
CX3CR1 Receptor 1 de quimiocina con motivo CX3C; V28; GPR13 
EM Minimización de energía potencial (del inglés Energy 
Minimization) 
FF Campo de fuerza (del inglés Force Field) 
FKN Fractalkina, CX3CL1 
GDP Guanosina-5’-difosfato 
GPCR Receptor acoplado a proteína G (del inglés G protein-coupled 
receptor) 
GTP Guanosina-5’-trifosfato 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
11 
MD Dinámica molecular (del inglés Molecular Dynamics) 
MRV Maraviroc; ligando antagonista del receptor CCR5 
NPT Colectivo o ensamble isomolar-isobárico-isotérmico 
NTT Neurotactina,fractalkina, CX3CL1 
NVT Colectivo o ensamble isomolar-isocórico-isotérmico (canónico) 
PDB Base de datos de estructuras experimentales (Protein data 
bank) 
POPC (2S)-3-Palmitoil-2-Oleílfosfatidilcolina, un fosfolípido 
membranal del tipo lecitina 
R* Receptor en estado activo 
R Receptor en estado basal o pasivo 
R∅ Receptor en estado estativo 
R‡ Receptor en estado transitivo, confórmero intermedio 
Ras Proteína G monomérica; subfamilia de GTPasas pequeñas 
(acrónimo de Rat sarcoma) 
QMEAN Análisis cualitativo de energía del modelo (del inglés 
Qualitative Model Energy Analysis) 
QSAR Relaciones cuantitativas estructura-actividad (del inglés 
Quantitative Structure-Activity Relationships) 
QSPR Relaciones cuantitativas estructura-propiedad (del inglés 
Quantitative Structure-Property Relationships) 
UniProt Base de datos de proteínas (Universal Protein Resource) 
ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y UNIDADES 
12 
Magnitudes y unidades 
Å Ångström (1 Å = 0.1 nm = 10-10 m) 
d Distancia 
fs Femtosegundo 
nt Número de pasos de tiempo 
nm Nanómetro 
ns Nanosegundo 
RMSD Raíz cuadrada de la desviación cuadrática media; raíz del 
segundo momento ponderado por masas atómicas, centrado en la 
condición inicial en este estudio 
RMSF Raíz cuadrada de la fluctuación cuadrática media; raíz del 
segundo momento bivariado ponderado por masas atómicas, 
centrado en la condición inicial en este estudio 
rg Radio de giro 
T Temperatura 
t Tiempo 
φ Ángulo diedro formado por CA-C-N-CA 
χi Ángulos diedros de cadenas laterales 
ψ Ángulo diedro formado por N-CA-C-N 
 
 
 
RESUMEN E INTRODUCCIÓN 
13 
I.1. RESUMEN 
 
La enfermedad de Alzheimer (EA) es una patología compleja con características 
neurodegenerativas y neuroinflamatorias. Se ha demostrado que los mecanismos involucrados en 
la respuesta inmunológica en el sistema nervioso central (SNC) tienen una relevancia importante 
en el inicio y el transcurso de la EA. Las células microgliales residentes en el SNC desempeñan un 
papel fundamental en la neuroinflamación. El receptor de fractalkina, CX3CR1, es un elemento 
clave en la activación de una respuesta proinflamatoria o de supervivencia neuronal ante las 
anormalidades propias de la EA. Estudiar el receptor CX3CR1 con técnicas computacionales 
permite complementar y entender sus características estructurales y dinámicas; para comprender 
mejor los mecanismos implicados en la EA, así como un punto de partida para el planteamiento de 
nuevos enfoques de estudio que conduzcan a una eventual propuesta de moléculas con actividad 
moduladora sobre este receptor, y de esta manera modificar el transcurso de la característica 
neuroinflamatoria de la EA. Para este trabajo de tesis se recopiló la información disponible para 
realizar un estudio computacional consistente en modelado y validación de la estructura terciaria, 
simulación de dinámica molecular clásica del receptor en sistemas membranales diversos, y 
análisis geométrico de confórmeros y rotámeros; con las características necesarias para proponer 
un mecanismo básico de funcionamiento del receptor CX3CR1, así como sus interacciones con los 
ligandos conocidos por su actividad experimental. Asimismo, se aplicaron herramientas 
computacionales para validar y confirmar los resultados expuestos, y concluir satisfactoriamente 
sobre las características funcionales del receptor CX3CR1, así como proponer perspectivas en el 
estudio de este sistema y lograr el conocimiento molecular de la EA con las técnicas disponibles. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN E INTRODUCCIÓN 
14 
I.2. INTRODUCCIÓN 
 
Las herramientas computacionales han mostrado ser una buena aproximación para el estudio de 
los sistemas macromoleculares con detalle atómico. La simulación de dinámica molecular (MD por 
sus siglas en inglés) es un grupo de metodologías que aplican las leyes de la mecánica molecular 
y la termodinámica estadística, mediante métodos inicialmente desarrollados de manera teórica y 
algoritmos que simplifican los cálculos computacionales. La simulación de dinámica molecular 
resuelve las ecuaciones de movimiento de la mecánica clásica a través de pasos de tiempo, así 
como los cálculos respectivos de fuerzas y energía potencial. La resolución de estas ecuaciones 
permite conocer las posiciones de cada partícula del sistema para el paso de tiempo siguiente, por 
lo que para la asignación de velocidades se recurre a una función de densidad de probabilidad de 
velocidades, para posteriormente calcular las aceleraciones, tanto del paso en proceso como del 
paso siguiente, a través de diversos algoritmos sencillos. Asimismo, el sistema molecular simulado 
se considera cerrado, con la propiedad de intercambiar energía con el exterior en un baño virtual 
de temperatura, para alcanzar un estado de equilibrio térmico. La presión dentro del sistema se 
calcula mediante modificaciones a las ecuaciones clásicas, y adicionalmente estos parámetros 
termodinámicos están sujetos a la evaluación de algoritmos que disminuyen la desviación de los 
valores alcanzados (para mayor detalle, ver el Anexo III: Fundamentos teóricos). De esta manera, 
se puede conocer el comportamiento aproximado del sistema molecular a través del tiempo 
simulado, y se pueden conocer detalles aproximados de desplazamientos de componentes del 
sistema, interacciones entre partículas y cambios conformacionales de segmentos mayores. 
 
Para este trabajo, el receptor CX3CR1 es el principal objeto de estudio mediante técnicas 
computacionales. Sin embargo, para tener una referencia comparativa sólida, se estudió 
inicialmente el receptor CCR5, el receptor con mayor similitud a CX3CR1 y con información 
disponible a nivel atómico. A partir del estudio de CCR5, también se caracterizó la influencia de 
ligandos, para integrar los resultados y proponer mecanismos y características para el receptor 
principal CX3CR1. Adicionalmente, para el diseño de los sistemas con ligandos peptídicos se 
recurrió a la estructura del receptor US28 en complejo con el ligando principal de CX3CR1, para 
plantear un punto de partida basado en evidencia experimental (las generalidades de los 
receptores CCR5 y US28 se exponen en el Anexo II: Información complementaria).
ANTECEDENTES 
15 
II. ANTECEDENTES 
II.1. Generalidades 
La EA es la causa principal de demencia en personas mayores a nivel mundial.1,2 Es una 
enfermedad neurodegenerativa caracterizada clínicamente por pérdida progresiva de memoria y de 
las funciones cognitivas. Los depósitos de los péptidos amiloides β1-42 (Aβ42) en el parénquima 
encefálico y en los vasos sanguíneos, así como la hiperfosforilación de la proteína asociada a 
microtúbulos tau (MAPT), inestabilidad microtubular y neuroinflamación son las características 
fisiopatológicas distintivas de la enfermedad.1,3,4 Los péptidos neurotóxicos Aβ40 y Aβ42 son 
producto de la escisión de la proteína transmembranal APP (proteína precursora de amiloide, por 
sus siglas en inglés) por la acción del complejo enzimático de la γ-secretasa, con presenilina (PS, 
PSEN) como subunidad catalítica. Estos péptidos amiloides se acumulan formando oligómeros 
solubles abundantes en hojas β, y posteriormente se agregan en placas insolubles en el espacio 
extracelular. La angiopatía cerebral amiloidea, presente en el 80% de los casos de EA, se debe a 
la deposición de oligómeros amiloides. Los oligómeros solubles Aβ son causantes de 
neuroinflamación que está estrechamente relacionada con la EA.2 
II.2. Neuroinflamación 
La inflamación es una respuesta en un tejido cuando se presenta un daño, y puede ser aguda o 
crónica. La inflamación aguda se caracteriza por una reacción inmediata ante un agente agresor, y 
consiste básicamente en una respuesta defensiva y posteriormente en el restablecimiento de la 
homeostasis local. La inflamación crónica, en cambio, se presenta cuando el estímulo nocivo es 
persistente.La inflamación periférica se manifiesta principalmente por infiltrados leucocitarios y 
producción de agentes de señalización y regulación. Las células polimorfonucleares, de las cuales 
los neutrófilos son las más abundantes, son reclutadas al sitio de daño en eventos agudos y las 
células mononucleares como macrófagos, linfocitos y células plasmáticas componen la respuesta 
inflamatoria celular crónica. 
Las respuestas desencadenadas por la neuroinflamación están reconocidas como factores 
determinantes en el desarrollo y evolución de las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la 
EA. De manera análoga a la periferia, en el sistema nervioso central (SNC) la inflamación puede 
ser aguda o crónica. La inflamación aguda, conocida previamente como gliosis reactiva, se 
presenta en eventos traumáticos, isquémicos o infecciosos. La inflamación crónica o 
neuroinflamación, en cambio, tiene características divergentes con su contraparte periférica.5 Las 
células gliales presentes en el sistema nervioso desarrollan las funciones de presentación 
antigénica, modulación de la inflamación, reclutamiento de células periféricas, inducción de 
apoptosis, etc. 
 
 
 
ANTECEDENTES 
16 
II.3. Células gliales 
Los astrocitos, oligodendrocitos, 
glías NG-2 y microglías, conocidas 
en conjunto como células gliales 
(Figura 2.1), constituyen una fracción 
importante del SNC de mamíferos, 
además de las neuronas. 
Consideradas inicialmente como 
células de soporte, de “pegamento”, 
no funcionales, son objeto de 
extensa investigación. 
 
Figura 2.1. Células del SNC. Interacciones de las neuronas con 
astrocitos, oligodendrocitos y microglías. Los ependimocitos son células 
epiteliales de los sistemas ventriculares (Modificado de McGraw-Hill 
Companies, Inc.). 
II.3.1. Astrocitos 
Los astrocitos representan la fracción más abundante de las células gliales encefálicas en un 
individuo adulto. Entre sus numerosas funciones descritas, destacan el mantenimiento 
homeostático de iones, agua, nutrientes y desechos, participación cosináptica y contribución en la 
estructura de la barrera hematoencefálica (BHE).6 La ablación astrocítica selectiva en ratas sanas 
usando α-L-aminoadipato, análogo del L-glutamato, ocasionó principalmente reactividad glial 
reversible.7 En cambio, la supresión de la expresión de proteínas exclusivas astrocíticas resultó en 
degeneración neuronal, degeneración axonal y parálisis8–11 y en un subtipo de astrocitos 
cerebelares causó problemas severos de coordinación motora, similares a los producidos por 
disfunción cerebelar. 
 
II.3.2. NG-2 y oligodendrocitos 
Los oligodendrocitos y las células NG-2, sus precursoras, se consideran una población glial 
independiente debido a sus características, como son los marcadores receptor α del factor de 
crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) y el proteoglicano 4 de condroitina sulfato (CSPG4 o 
NG2) para los precursores, y los factores de transcripción Olig1, Olig2, Olig3 y SOX10, así como la 
proteína específica de oligodendocito (OSP), proteína básica de mielina (MBP) y la glicoproteína 
oligodendrocítica de mielina (MOG) para las células maduras.6,12 Las células NG-2 se han 
identificado como parte fundamental del mantenimiento de los oligodendrocitos mielinizantes a 
través de la vida adulta.13–16 Las células NG-2 presentan alta proliferación, de manera análoga a 
las células troncales, y son capaces de participar en sinapsis neuronales.13,17 La depleción de 
células NG-2 con citarabina, irradiación X y silenciamiento genético produjo disminución de la 
señalización de leptina y deterioro del metabolismo energético.18 El bloqueo de la diferenciación de 
NG-2 a oligodendrocitos genera deterioro del aprendizaje motor y fallas axonales.19,20 
 
 
ANTECEDENTES 
17 
II.3.3. Microglía 
Las células microgliales o microglías son las células efectoras inmunológicas de origen 
mesodérmico en el encéfalo, con los marcadores proteína transmembranal 119 (TMEM119), 
CD11b-CD45, CX3CR1, entre otros.21 Las microglías se infiltran en el tejido neural durante la 
embriogénesis, y durante el período posnatal desempeñan un papel fundamental en la maduración 
neuronal. Posterior a la infiltración, se diferencían de una forma ameboide a una morfología 
ramificada única, estacionaria, que cambia cuando son expuestas a estímulos nocivos. Esta 
morfología ramificada no es un estado dormante, ya que estas células presentan períodos 
intermitentes de motilidad y pausa. En respuesta a estímulos asociados a daño y patógenos 
(DAMPs: patrones moleculares asociados a daño; PAMPs: patrones moleculares asociados a 
patógenos), las microglías experimentan una rápida activación dirigiendo sus movimientos de 
respuesta al microambiente hacia la migración al sitio del insulto.22 
Las microglías activadas liberan al entorno numerosos factores neurotróficos y citocinas capaces 
de modificar la homeostasis neuronal. Asimismo, expresan una amplia variedad de receptores y 
moléculas de señalización como respuestas a la actividad neuronal, como el receptor de glutamato 
AMPAR, purinérgicos P2RX4 y P2Y6, receptor del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) 
TNFR1/CD120a, receptor del mediador inflamatorio interleucina 1 (IL-1R), complejo principal de 
histocompatibilidad tipo II (MHC-II), y receptores de quimiocinas. Adicionalmente son capaces de 
producir factor de crecimiento nervioso NGF, factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) y 
neurotrofina 3.22 
 
II.4. Origen hematopoyético de la microglía 
Las microglías son un tipo de células fagocíticas, macrófagos residentes del SNC que provienen 
de células progenitoras mieloides residentes en la médula ósea, y constituyen un linaje diferente al 
de las células fagocíticas mononucleares. Los monocitos, otro linaje mieloide, son células 
leucocitarias circulantes que forman parte del sistema fagocítico mononuclear. 
 
II.4.1. Actividad de la microglía 
En un individuo adulto sano, la autorrenovación microglial es suficiente para mantener la 
homeostasis del SNC. En condiciones fisiológicas, las microglías contribuyen a la plasticidad 
neuronal y la función sináptica, controlando su maduración y conectividad. Durante el desarrollo, 
las microglías remueven las células y cuerpos apoptóticos que resultan en esta etapa, y también 
contribuyen a la muerte neuronal. La apoptosis neuronal también está presente en adultos. En el 
caso de los pacientes con EA, las células troncales neurales se encuentran disminuidas,22 lo que 
deteriora la autorrenovación microglial. 
 
 
 
ANTECEDENTES 
18 
II.5. Citocinas y quimiocinas 
Las citocinas son mediadores celulares de naturaleza polipeptídica que regulan la homeostasis 
de los tejidos a través de acciones locales o por reclutamiento de sistemas externos. La expresión 
y actividad de las citocinas se incrementa en condiciones de estrés tisular, incluyendo crecimiento 
rápido, desregulación debida a inflamación crónica y neoplasias, infecciones y eventos 
traumáticos. En este grupo heterogéneo de mediadores están incluidas interleucinas, factores de 
necrosis tumoral, interferones, factores estimulantes de colonias, factores de crecimiento, 
neurotrofinas, neuropoyetinas y quimiocinas. Las citocinas en el SNC pueden ser de producción 
basal o en condiciones de daño, como la producción de IL-1β, IL-2 e IL-6 en la EA.23 
 
II.5.1. Quimiocinas 
Las quimiocinas son un tipo de citocinas implicadas en la quimiotaxia y activación leucocitarias. 
Las quimiocinas han sido clasificadas con base en la posición relativa de sus residuos de cisteína 
(Cys, C) en el extremo amino terminal. Las α- y β-quimiocinas, con cuatro residuos de cisteína, 
constituyen la familia más extensa. Las α-quimiocinas contienen un motivo CXC, donde X es un 
residuo aminoacilo variable, y las β-quimiocinas presentan el motivo CC, de residuos adyacentes. 
La linfotactina y la fractalkina, que no se incluyen enlos grupos anteriores, contienen sólo dos 
residuos de C y otras características distintivas. 
 
II.5.2. Fractalkina 
La fractalkina es una δ-quimiocina24 membranal que presenta el motivo CXXXC, o CX3C; 
específicamente la secuencia CNITC, unido a un dominio tipo mucina altamente glicosilado, 
anclado en la membrana plasmática. La fractalkina recibió este nombre debido a la analogía de su 
descubrimiento con un acercamiento a la rama C de la superfamilia de quimiocinas con un fractal, 
al revelar un patrón autorreferencial de complejidad.25 A esta quimiocina también se denomina 
CX3CL1, por ser el ligando con el motivo CX3C. La unión a un dominio tipo mucina sólo es 
compartida con CXCL16. La fractalkina es expresada en la periferia por células NK (natural killer 
cells, de linaje hematopoyético) y por grupos restringidos de neuronas.26 La escisión del dominio 
extracelular de la fractalkina por la metaloproteinasa ADAM10 (del inglés a disintegrin and 
metalloproteinase type 10), un tipo de enzima α-secretasa, produce polipéptidos solubles de 
tamaño variable, y bajo condiciones inflamatorias, el corte también es promovido por 
ADAM17/TACE (Figura 2.2). 
ANTECEDENTES 
19 
La fractalkina posee un dominio 
citoplasmático muy corto, y parece no 
interactuar con correceptores. En 
ratas seniles, la isoforma soluble de 
fractalkina se encuentra disminuida en 
la corteza y el hipocampo debido a la 
pérdida neuronal existente. La forma 
soluble tiene relación con el grado de 
tauopatía, o alteración patológica del 
metabolismo de MAPT; mientras que 
la forma membranal parece 
incrementar la patología amiloidea.27 
 
Figura 2.2. CX3CR1 y CX3CL1 en el SNC. Esquematización general 
de la fractalkina, su interacción con CX3CR1 y sus variantes solubles 
generadas por las enzimas ADAM. (Modificado de Wolf, et al. 2017).26 
II.5.2.1. El receptor de fractalkina: CX3CR1 
El receptor de fractalkina es un receptor acoplado a proteína G (GPCR por sus siglas en inglés), 
y se denomina CX3CR1. El CX3CR1 se expresa en linfocitos, monocitos, células NK y células 
gliales, de expresión particularmente alta en microglías.26 
 
En modelos animales de EA se ha estudiado la influencia de CX3CR1, incluyendo los modelos 
transgénicos para hTau (Tau silvestre humana) y APP/PSEN1 mutantes. En el primer caso, los 
ratones transgénicos hTau, carentes del gen CX3CR1 (CX3CR1-/-) presentan hiperfosforilación de 
tau (p-MAPT) asociada a una alta producción microglial de IL-1β. En modelos mixtos hTau-
APP/PSEN1-CX3CR1-/-, la deficiencia del receptor se manifestó con una reducción de las placas 
amiloideas. En microglías cultivadas, la exposición a Aβ42 induce la depleción de la actividad de 
CX3CR1, producción de IL-6 y TNF-α. Además, la activación microglial incrementa la fagocitosis de 
las placas amiloides, aunque con un riesgo potencial de secreción de citocinas proinflamatorias 
relacionadas con un incremento de la tauopatía. 
Adicionalmente la deficiencia de CX3CR1 en los modelos transgénicos mixtos previene la pérdida 
neuronal.28 En los modelos APP/PSEN1 deficientes del ligando CX3CL1 membranal se presenta 
mayor p-MAPT a pesar de la disminución de la densidad amiloidea. La sobreexpresión de la 
isoforma soluble (sCX3CL1) en el modelo transgénico Tg4510 mediante vectores adenovirales 
reduce la tauopatía y previene la neurodegeneración. 
Los roedores a los que se les infundió Aβ42 en la corteza mediante un lentivirus, así como 
modelos de ratón con demencia frontotemporal exhibieron una alta activación de la caspasa 3 y 
una secreción incrementada de la citocina proinflamatoria TNF-α y depósitos de p-MAPT. 
Además de las implicaciones de CX3CR1 en la EA, algunas mutaciones en este receptor se han 
asociado con progresiones distintivas en la EA de inicio tardío. Con estos hallazgos experimentales 
se relaciona al receptor CX3CR1, un tipo de receptor acoplado a proteína G (GPCR), con la EA. 
 
ANTECEDENTES 
20 
II.6. Receptores acoplados a proteínas G (GPCR) 
Los receptores membranales heptahelicoidales acoplados a proteínas de unión a nucleótidos de 
guanina (GPCRs) constituyen un grupo amplio de proteínas celulares transmembranales 
involucradas en la transducción de señales de primeros mensajeros extracelulares y son de gran 
interés farmacéutico.29,30 
La geometría de los GPCRs (Figura 2.3) está conservada en la mayoría de los receptores 
descritos, especialmente en las siete hélices transmembranales (TMs) y la hélice yuxtamembranal 
(YXT). Las variaciones principales tienen lugar en las asas extra e intracelulares (ECLs e ICLs 
respectivamente), así como en los dominios amino (NT) y carboxilo terminal (CT).31 
Por su diversidad, los GPCRs se clasifican en clases, basadas en la estructura primaria.32,33 
 
 
 
Figura 2.3. Geometría 
general de un GPCR. A. 
Dominios geométricos 
principales. B. 
Identificadores de los 
dominios principales. En 
línea discontinua se 
representan los segmentos 
interhelicoidales (Modificado 
de Latorraca, 201731). 
 
II.6.1. Clases de GPCRs 
Los GPCRs descritos pertenecen a las clases A, B1, B2, C, F, gustativos y otros (Tabla 2.1).32 
Dentro de cada clase, los receptores poseen similitud estructural alta. 
 
Tabla 2.1. Clases de GPCR basadas en alineamientos de sus estructuras primarias. 
Clase Receptor típico Subtipos principales 
A Rodopsina Receptores de proteínas, algunos polipéptidos, sensoriales, esteroidales, 
aminérgicos, alicarboxílicos, lipídicos, nucleotídicos. 
B1 Receptor de 
secretina 
Receptores de calcitonina, factor liberador de corticotropina, glucagon, 
parathormona y péptido intestinal vasoactivo. 
B2 Receptores de 
adhesión 
ADGRs 
C Receptores de 
glutamato 
Receptores sensibles a calcio, aminoacílicos, gustativos tipo 1. 
F Receptores 
frizzled 
FZDs 
Gustativos 
tipo 2 
Receptores 
TAS2 
TAS2Rs (de gusto amargo) 
ANTECEDENTES 
21 
El receptor de fractalkina CX3CR1 (Figura 2.4) está clasificado como receptor tipo A debido a su 
similitud estructural con la rodopsina.32 
 
Figura 2.4. Estructura primaria del receptor de fractalkina CX3CR1, con la distribución de residuos de aminoácidos en los 
motivos transmembranales (TM1 a TM7), la hélice yuxtamembranal (YXT) y los terminales amino (NT) y carboxilo (CT).32 
 
La respuesta de los GPCRs ante los estímulos se basa principalmente en los cambios de estado 
funcional que pueden experimentar. Se conocen al menos seis estados funcionales de los GPCRs, 
cuatro estados de tendencia a no señalizar y dos de tendencia a señalizar (Figura 2.5). Un estado 
funcional inactivo corresponde con un receptor incapaz de señalizar con los sistemas transductores 
intracelulares, como las proteínas G. Un estado estativo constituye una funcionalidad quiescente, 
generalmente sin actividad y con una restricción al cambio de estado. Un estado basal o pasivo 
describe los receptores que en ausencia de ligandos pueden adoptar otros estados funcionales de 
manera espontánea. Cuando un GPCR es capaz de adoptar estados activos y señalizar en 
ausencia de ligandos activadores o agonistas, se dice que es un receptor con actividad constitutiva 
o intrínseca. A este tipo de receptores se les puede anular su función constitutiva mediante la 
interacción con agentes agonistas inversos, y dirigirlos a un estado inactivo. Cuando un GPCR no 
posee actividad intrínseca, donde el cambio de estado basal a activo no está favorecido, el estado 
estativo y el estado inactivo pueden coincidir. En cuanto a los estados capaces de señalizar, se 
encuentran los estados transitivos que incluyen todos aquellos cambios que experimenta el 
receptor en una activación incipiente, es un estado intermedio o metaestado. Es en el estado 
transitivo donde se han encontrado las interacciones determinantes con los transductores, 
principalmente las proteínas G. Un receptor que se ha activado, unido al transductor 
correspondiente, presenta unestado funcional activo, que se propaga y se convierte en el 
respectivo estado activo de las proteínas transductoras. Finalmente, cuando ha tenido lugar la 
señalización intracelular, el receptor sufre una modificación que anula su actividad, mediante 
interacciones con nuevas proteínas o modificaciones covalentes, para entrar a un estado de 
desactivación permanente. 
ANTECEDENTES 
22 
La geometría de los GPCRs permite la formación de una cavidad interhelicoidal que atraviesa la 
membrana de un lado al otro, y se ha encontrado el paso de moléculas de agua y el ingreso de un 
ion sodio.34 Durante el proceso de activación funcional, se describió la interrupción del paso de 
moléculas de agua a través del poro interhelicoidal.35 El cambio de estado también involucra una 
tétrada de residuos de aminoácidos interactuantes, conocida como compuerta iónica, la cual puede 
presentarse en un estado de oclusión del poro, o cerrado, cuando uno o dos residuos básicos 
interactúan con uno o dos ácidos; o un estado de apertura del poro, por ruptura de las 
interacciones iónicas.36 
 
Figura 2.5. Esquematización de los estados funcionales de los GPCRs, con la nomenclatura utilizada. 
 
II.7. Proteínas G 
Las proteínas de unión a nucleótidos de guanina constituyen una familia de GTPasas 
monoméricas o pequeñas y heterotriméricas. Las proteínas G monoméricas están implicadas de 
manera importante en la señalización de estímulos extracelulares dirigidos principalmente al 
citoesqueleto, al tráfico de vesículas y al crecimiento y diferenciación celular. Las proteínas 
heterotriméricas están compuestas por subunidades denominadas α, β y γ, que son las proteínas 
transductoras de los complejos membranales GPCR-proteína G.37 
 
Las subunidades Gα poseen N- y/o S-acilaciones en el extremo amino y dos dominios 
principales de actividad, el dominio alfa-helicoidal (αAH) y el dominio tipo Ras (αRas, por la 
proteína G monomérica Ras, descrita por primera vez en un sarcoma de rata).38,39 Los dominios 
αAH y αRas están unidos por dos asas conectoras, y forman una cavidad de alojamiento para el 
ANTECEDENTES 
23 
nucleótido de guanina. Cuando el nucleótido alojado es Mg[GTP], la proteína se encuentra en un 
estado activo, y cuando éste se hidroliza por la tríada catalítica formada por los residuos Ser47, 
R178 y D200, inducida por la acción de activadores de proteínas GTPasas (GTPase-activating 
proteins, GAPs); la subunidad se inactiva y se detiene el proceso de señalización. 
 
Las subunidades Gβ tienen una estructura secundaria conocida como propela beta, un motivo 
poligonal regular de láminas beta. 
 
Las subunidades γ presentan una prenilación en el dominio carboxilo terminal que la mantiene 
adyacente a la membrana, e interactúa directamente con la subunidad Gβ. 
Una característica distintiva entre las subunidades Gα de diferentes clases es la sensibilidad a 
toxinas bacterianas con actividad de ADP-ribosiltransferasa directa (toxina Pertussis, PTX de 
Bordetella pertussis) o indirecta (toxina del cólera (CTX), y toxinas termolábiles (LTs) de 
Escherichia coli y Bacillus cereus).37 
 
El receptor CX3CR1 transduce en gran medida mediante proteínas Gi. 
 
II.7.1. Proteínas Gi/0 
Las proteínas de clase Gi/0, al ser activadas, bloquean la producción del segundo mensajero 
AMP cíclico (cAMP) mediante la interacción de la subunidad Gαi-Mg[GTP] con la enzima 
transmembranal adenilato ciclasa. El heterodímero βγ a su vez interactúa con varias enzimas 
membranales como proteínas cinasas C (PKCs, Figura 2.6). 
 
II.8. Activación de las proteínas G heterotriméricas 
La activación de las proteínas G mediante el GPCR activo asociado se debe a un cambio 
conformacional propagado desde el receptor, desencadenado por el ligando, hasta el segmento 
ICL2, que adquiere conformación helicoidal,38 y propagado a las subunidades de la proteína G. 
Este cambio conformacional final favorece el recambio de GDP unido a la subunidad α, por 
Mg[GTP], que induce la interacción de la proteína G con sus respectivas proteínas diana. La 
capacidad de activación de las proteínas G se conoce como GEF (guanine nucleotide exchange 
factor), por lo que al receptor membranal activo asociado se le considera un GEF. 
 
II.8.1. Modelo de Gilman de activación de las proteínas G heterotriméricas 
El modelo de Gilman propone que la activación de la proteína G induce la disociación del 
complejo Gαβγ- en la subunidad Gα-Mg[GTP] y el heterodímero Gβγ40 (Figura 2.7). 
 
 
 
ANTECEDENTES 
24 
II.8.2. Modelo de Bouvier de activación de las proteínas G heterotriméricas 
El modelo del grupo de Bouvier propone que la activación de la proteína G favorece un cambio 
conformacional no disociativo41 seguido de la apertura de la cavidad del nucleótido, por 
distanciamiento de los dominios αAH y αRas, permitiendo el intercambio de los nucleótidos de 
guanina (Figura 2.8). 
 
Figura 2.6. Transducción de la señal de un agonista a través de un GPCR acoplado a una proteían Gi. Al activarse el 
GPCR (color gris) y posteriormente la proteína Gi, la subunidad Gαi activa (color café) inhibe la actividad de la enzima 
adenilato ciclasa (AC), que cataliza la transformación de ATP a AMP cíclico (cAMP). Este efecto disminuye la concentración 
de cAMP en el citopalsma. Por otra parte, las subunidades Gβγ activas (color rosa) pueden inducir la actividad de la 
proteína cinasa C (PKC). Esta activación permite la fosforilación por PKC de múltiples sustratos. 
 
 
 
 
Figura 2.7. Modelo de Gilman de activación de las proteínas 
G.40,42 El estado inicial también se denomina basal o pasivo. 
Figura 2.8. Modelo del grupo de Bouvier41 de activación 
de las proteínas G. 
 
Estos dos modelos experimentales de activación proponen características claramente 
diferenciadas en las subunidades de las proteínas G. Una parte de este trabajo se centró en el 
estudio del complejo CX3CR1-Gi, y se consideraron los mecanismos de los dos modelos de 
activación de proteínas G para identificar algunas señales o indicadores de estos comportamientos 
en los estudios computacionales que involucran esta proteína. 
 
JUSTIFICACIÓN, HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 
25 
III.1. JUSTIFICACIÓN 
 
El receptor CX3CR1 es miembro de la superfamilia más grande de proteínas blanco de 
numerosos fármacos, y su influencia definitoria en el desarrollo y progresión de la neuroinflamación 
ha sido sustentada por una cantidad creciente de evidencia experimental ex vivo e in vivo. Por otra 
parte, las metodologías computacionales de dinámica molecular han demostrado ser una 
aproximación sólida y confiable para estudiar el comportamiento de los sistemas biológicos a 
escala atomística. Por estos motivos, el estudio dinámico y conformacional de este receptor con las 
capacidades disponibles de cómputo lo convierte en un sistema atractivo para contribuir al 
conocimiento molecular de la enfermedad de Alzheimer. 
 
III.2. HIPÓTESIS 
 
El receptor CX3CR1 como miembro de la clase A de GPCRs, comparte patrones generales con los 
integrantes de esta clase, referentes a cambios conformacionales y funcionales que permitirán 
caracterizarlo estructural y dinámicamente. Su estudio con agentes con actividades agonista y 
antagonista, así como con la proteína Gi, facilitará la dilucidación de los aspectos conformacionales 
más relevantes. 
 
III.3. OBJETIVOS 
 
1. Conocer la estabilidad dinámica del receptor CX3CR1 en un modelo de sistema 
membranal. 
2. Caracterizar los tres estados funcionales descritos para este receptor. 
3. Identificar sus interacciones con ligandos bioactivos. 
4. Proponer moléculas pequeñas como posibles ligandos del receptor. 
 
METODOLOGÍA 
 
26 
IV. METODOLOGÍA 
El procedimiento general que se siguió para el estudio del receptor CX3CR1 se esquematiza en la Figura 4.1. 
 
Figura 4.1. Procedimiento general para el estudio computacional de CX3CR1. 
IV.1. Sistemas de estudio 
Los sistemasde receptores modelados y simulados se muestran en la Tabla 4.1. El receptor CCR5 se utilizó 
como referencia del receptor CX3CR1 debido a su alta similitud estructural, y por ser el miembro con mayor 
información a nivel molecular (ver Anexo II). Se modelaron tres sistemas del receptor CCR5 a partir de su 
estructura depositada en el Protein Data Bank,43 once sistemas del receptor de prueba CX3CR1 en diferentes 
condiciones, y finalmente cuatro sistemas de CX3CR1 en complejo con el heterotrímero Gi (ver Anexo II). 
 
Tabla 4.1. Sistemas de receptores simulados y sus funciones principales. 
Sistema Detalles 
CCR5-MRV El receptor CCR5 se cristalizó en su estado estativo (PDB: 4MBS), que fungió como 
referencia para el análisis del ligando maraviroc (MRV) como antagonista (ver Anexo II). 
CCR5-mrv El receptor CCR5 con la variante desprotonada del antagonista (mrv) permitió caracterizar 
los cambios en la dinámica ante esta modificación. 
CCR5 El aporreceptor CCR5 permitió conocer los cambios relativos al receptor estativo. 
CX3CR1 Receptor de prueba, de interés principal por su función en las microglías. 
CX3CR1* Modelo activo del receptor de prueba CX3CR1 (GPCR database). 
CX3CR1‡ Modelo transitivo o intermedio del receptor de prueba CX3CR1 (GPCR database). 
CX3CR1∅ Modelo estativo del receptor de prueba CX3CR1 (GPCR database). 
CX3CR1-MRV Receptor de prueba con ligando maraviroc, posicionado como en la estructura de 
referencia (PDB: 4MBS). 
CX3CR1-E6130 Receptor de prueba con el antagonista experimental E6130, en correspondencia de 
grupos funcionales con la estructura de referencia (PDB: 4MBS). 
CX3CR1-AZD8797 Receptor de prueba con el antagonista AZD8797, posicionado según sus interacciones. 
CX3CR1-LG1 Receptor de prueba con el ligando propuesto LG1. 
CX3CR1-AFKN Receptor de prueba con la variante aglicona de fractalkina (AFKN; PDB: 4XT1). 
CX3CR1-FKNG2 Receptor de prueba con la variante glicosilada G2 de fractalkina (ver Anexo II). 
CX3CR1-FKNG2S2 Receptor de prueba con la variante glicosilada G2S2 de fractalkina, de la cual se conoce 
su actividad agonista (ver Anexo II). 
G-CX3CR1 Receptor de prueba, asociado a proteína Gi (PDB: 3SN6 y 5KDO; ver Anexo II). 
G-CX3CR1-MRV Receptor de prueba, asociado a proteína Gi y unido a maraviroc. 
G-CX3CR1-AFKN Receptor de prueba, asociado a proteína Gi y unido a la aglicona de fractalkina (AFKN). 
 
METODOLOGÍA 
 
27 
IV.2. Sistemas en membranas de POPC (1O-palmitoíl-2O-oleílfosfatidilcolina) 
 
Los pasos de la metodología (ver Anexos II y III) para cada sistema de receptor se describen en la Tabla 4.2. 
 
 
Tabla 4.2. Metodología general aplicada a los sistemas de receptor. 
 
Proceso Descripción 
Orientación Rototraslación del receptor a través del eje z. 
Modelados particulares Modelados, alineamientos de FKN, maraviroc y proteína Gi a partir de estructuras 
experimentales. 
Modelado de membrana Construcción de los modelos membranales con POPC (ver el Anexo II). 
Solvatación Solvatación y adición de iones sodio y cloruro hasta concentración 0.15 M 
Minimización de energía 
potencial (EM) 
Por optimización geométrica con el algoritmo Steepest Descent (ver Anexo III). 
Equilibrio NVT Dos equilibrios con restricciones de posición decrecientes. 
Equilibrio NPT Tres equilibrios con restricciones de posición decrecientes. 
Producción de dinámica 
molecular (MD) 
Con tiempo de simulación de 400 ns. 
Análisis de 
desplazamientos y 
conformaciones 
Cálculo de RMSD, RMSF, radio de giro, distancias mínimas, estructura secundaria, 
correlación cruzada e información mutua torsionales. 
Análisis de componentes 
principales 
Para los movimientos principales de los receptores, y en su caso, para la 
subunidad Gα. 
Análisis de densidad de 
moléculas de agua 
Caracterización de la cantidad de moléculas de agua que interactúan con los 
receptores en posiciones específicas. 
 
Se orientaron los modelos de GPCR con el servidor Orientations of Proteins in Membranes (OPM) database,44 
para el posicionamiento del modelo membranal, y posteriormente se utilizó el servidor CHARMM-GUI45,46 para 
preparar cada sistema con el modelo de membrana,47,48 la solvatación con el modelo de agua TIP3 y la adición 
aleatoria de iones Na+ y Cl- en el bulto acuoso hasta 0.15 M, una concentración equivalente a la que se 
encuentran las membranas plasmáticas biológicas. 
 
Los ligandos no peptídicos maraviroc, AZD8797, E6130, y el propuesto LG1, se parametrizaron con el campo 
de fuerza CHARMM36 en el servidor CHARMM-GUI, y los diecisiete sistemas (Tabla 4.1) se simularon 400 ns 
con el programa GROMACS 5.0.7.49 
 
Los glicanos en los ligandos peptídicos se modelaron en el servidor CHARMM-GUI, a partir de la información de 
la base de datos Glycan Fragment DB (GFDB).50 
 
A partir de las trayectorias de 400 ns se calcularon valores de la raíz de la desviación cuadrática media (RMSD) 
respecto a la estructura inicial para la cadena principal de las hélices transmembranales (TMs), la raíz de la 
fluctuación cuadrática media (RMSF) respecto a la estructura inicial, para las cadenas laterales de los 
aminoácidos, radio de giro para toda la región transmembranal, estructura secundaria, distancias mínimas entre 
METODOLOGÍA 
 
28 
residuos interactuantes, particularmente la tétrada de residuos conocida como compuerta iónica y el sitio de 
unión ortostérico, y análisis de componentes principales, con el fin de identificar los modos principales y 
fluctuaciones esenciales de los receptores. Estos cálculos se realizaron empleando GROMACS 5.0.7. Los 
ángulos de inclinación de las hélices transmembranales respecto al vector ortogonal a la membrana, los 
ángulos diedros φ, ψ y χs de los residuos de aminoácidos para cálculos estadísticos, y la cantidad de moléculas 
de agua al interior del receptor, con MDAnalysis.51,52 La correlación cruzada torsional con la paquetería Bio3d 
de R53–55 y la información mutua torsional a partir de los valores de diedros, para la detección de movimientos 
concertados a distancia, con el código de MutInf.56 Adicionalmente se analizaron las cavidades formadas en el 
receptor y en la membrana circundante con trj_cavity,57 en particular la cavidad extracelular de unión a ligando, 
tomando como base las interacciones del receptor de referencia CCR5 con el ligando maraviroc en la estructura 
de PDB con clave 4MBS.58 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
29 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
En las simulaciones MD de los sistemas de CCR5 y CX3CR1 se estudiaron las estructuras secundarias, 
desplazamientos de segmentos o grupos de residuos, análisis de componentes principales, análisis de 
distancias y moléculas de agua, y propagación de información mutua torsional. 
 
V.1 Sistemas del receptor de referencia CCR5. 
Los sistemas de referencia constituidos por el receptor CCR5 se simularon en tres condiciones a partir de la 
estructura experimental en estado estativo con el antagonista maraviroc (Figura 5.1). Este estado 
conformacional es característico cuando el ligando no induce activación ni inactivación, sino un estado de 
bloqueo ante otros ligandos. 
 
 
Figura 5.1. Sistemas de referencia con el receptor CCR5. Las conformaciones provienen del análisis de agrupamiento de distribución 
exponencial, con ΔRMSD=0.15 Å. (A) Sistema CCR5∅ con ligando maraviroc protonado (MRV), del cual se simularon dos réplicas. (B) 
Sistema CCR5∅ con ligando maraviroc desprotonado (mrv) con una réplica. La relevancia del estado de protonación impacta de manera 
fundamental en las interacciones con la proteína, así como en los cálculos sobre el subsistema que representa el ligando. (C) Sistema 
CCR5∅ sin ligando o aporreceptor, con dos réplicas. (D) Estructuras del antagonista maraviroc en los dos estados de protonación más 
probables, mrv y MRV. 
 
En el sistema CCR5∅-MRV, el análisis de estructura secundaria mostró que el receptor adoptó una 
conformación poco ordenada en el segmento estructuralICL2, en oposición a la conformación α-helicoidal que 
adquirió el receptor en el sistema sin ligando, misma que se presentó de manera muy favorecida en el sistema 
CCR5∅-mrv. Esta conformación helicoidal en ICL2 se espera en receptores que se encuentran en un estado 
activo (unido a agonista) o basal (con actividad intrínseca no nula), pero no estativo.38 Otro hallazgo fue el 
plegamiento β de ECL2, el asa extracelular más extensa, en el sistema CCR5∅-MRV, debida principalmente a la 
proximidad de este segmento con el ligando. En cambio, en el aporreceptor no se observó este plegamiento, 
siendo más estable una estructura tipo hélice 3-10 (Figura 5.2, A-C). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
30 
El ligando experimentó desplazamientos distintivos en los sistemas CCR5∅-MRV y CCR5∅-mrv, en la 
proximidad de la tétrada de residuos Y371.39, W862.60, Y2516.51 y E2837.39 correspondiente al sitio de unión 
ortostérico (ver anexo II para la nomenclatura de Ballesteros-Weinstein). La presencia del grupo amino terciario 
protonable en MRV favorece la interacción de éste con la cadena lateral de E2837.39, como está reportado en la 
estructura experimental.58 La especie desprotonada del ligando promueve el distanciamiento del carboxilo del 
residuo E2837.39 (Figura 5.2, D-F). Esta tétrada mostró desplazamientos mayores en el receptor unido a mrv, lo 
que sugiere la tendencia a un desequilibrio dinámico. 
Los valores de la raíz cuadrada de las fluctuaciones cuadráticas media, centradas en la estructura inicial 
(RMSF) de las cadenas laterales de los receptores, comparados con el aporreceptor, tienen diferencias 
notables en determinadas regiones, que es evidente con los valores de ΔRMSF (Figura 5.2, G); como es 
evidente en el segmento ICL2 de CCR5∅-MRV. Esta amplia fluctuación corresponde con la estructura 
secundaria desordenada del asa, típica de una conformación estativa. En contraste, los valores de ΔRMSF son 
considerablemente menores en el segmento ICL2 del aporreceptor debido a su plegamiento helicoidal en 
CCR5∅, más favorecido en ausencia del antagonista. El maraviroc protonado presentó escasa movilidad a 
través del tiempo de simulación, como se observa en el gráfico de la raíz de la media cuadrática, o RMS 
centrado en el origen; RMS0 (Figura 5.2, H), que está determinada principalmente por los grupos rotables; de 
manera característica los grupos fenilo e isopropilo. 
Al analizar los movimientos colectivos de los sistemas, el receptor en el sistema CCR5∅-MRV mostró 
restricciones en su movilidad global y el aporreceptor CCR5∅ tuvo mayor número de grados de libertad 
disponibles para los desplazamientos (Figura 5.3 A). El sistema CCR5∅-MRV tuvo mayor movilidad relativa en 
la región extracelular que en la región intracelular; siendo ésta última la que establece contacto estrecho con las 
proteínas de señalización, como se observa en los modos principales de la cadena principal (Figura 5.3 B y C; 
de izquierda a derecha) con los modos asociados al primero, segundo y tercer autovectores respectivamente. 
En estos sistemas de CCR5 la movilidad extracelular está estrechamente influida por la presencia del MRV. Los 
sistemas CCR5∅-mrv y CCR5∅ mostraron una movilidad considerablemente mayor en las respectivas regiones 
intracelulares, como se espera en receptores no estativos. En cuanto a los movimientos de las cadenas 
laterales, en las regiones extracelulares (flechas color rojo) se observan valores mayores que en las regiones 
intracelulares (flechas color azul) en el espacio esencial bidimensional (Figura 5.3D). Los sistemas tuvieron 
comportamientos notablemente distintos al comparar los valores de RMSF esenciales en los sistemas con 
ligando CCR5∅-MRV y CCR5∅, lo que demuestra las diferencias que establecen la presencia del ligando y la 
estatividad relativa del sistema CCR5∅-MRV. La excepción la constituye el inicio del dominio C terminal (CT), 
dada su naturaleza espacialmente desordenada. Las regiones de mayores desplazamientos que se observaron 
en los modos principales facilitaron las fluctuaciones de las cadenas laterales. 
La distancia de separación entre el residuo R1263.50 ubicado en la hélice TM3 y parte del motivo conservado 
DRY, y Y2977.53 en la hélice TM7 y constituyente del motivo NPXXY y de una compuerta iónica atípica, puede 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
31 
sugerir el estado funcional del receptor.59 Una distancia suficientemente pequeña para la formación de una 
interacción no covalente entre un protón en el grupo guanidinio de la arginina y el átomo de oxígeno del 
hidroxilo fenólico de la tirosina permite la proximidad de las hélices TMs, favoreciendo una estructura central 
compacta (ver Anexo I: Resultados suplementarios). Si la distancia entre R1263.50 y Y2977.53 es mayor, se 
permite el alejamiento de las hélices TM3 y TM7, favoreciendo la formación del poro o canal de agua en el 
centro del receptor.35 En el sistema CCR5∅-MRV esta distancia tuvo una magnitud de tendencia constante 
desde la conformación inicial; que aunque no fue lo suficientemente pequeña para la interacción ion-dipolo, se 
caracterizó por permanecer relativamente invariante a lo largo de la simulación, permaneciendo en un estado 
mecánicamente estático. En el sistema CCR5∅ en cambio, esta distancia disminuyó respecto a la conformación 
inicial, y se mantuvo de esta forma la mayor parte del tiempo de simulación. Dado que la compuerta iónica en 
CCR5 no establece interacciones ion-ion sino ion-dipolo, esta variación de distancia entre estos residuos, y por 
ende entre TM3 y TM7 es relativamente más débil, y se espera en un estado basal o pasivo de un receptor con 
actividad constitutiva o intrínseca, ya que le permite adoptar espontáneamente varios estados funcionales en la 
ausencia de un ligando, como se conoce para el receptor CCR5.36 
Debido a las discrepancias del sistema con maraviroc desprotonado respecto a la información disponible 
sobre los GPCRs, y a la evidencia experimental del estado protonado de este ligando en el receptor, con pKa 
en medio acuoso de 7.3 (ver Anexo I), el sistema CCR5∅-mrv se descartó para los análisis posteriores; ya que 
la observación de este estado no es viable fuera de una simulación computacional, y muestra que el estado de 
protonación del ligando es de importancia fundamental para el estudio de este receptor y sus interacciones con 
el maraviroc. 
Al interior del poro intramembranal, los residuos R1263.50, Y2145.58, R2356.35 y Y2977.53 constituyen la 
compuerta iónica relacionada con el paso de moléculas de agua a través del GPCR35 (Figura 5.4). En el 
sistema CCR5∅-MRV, las distancias entre estos residuos se mantuvieron relativamente constantes; con 
distancias menores entre R1263.50-Y2145.58 y R2356.35- Y2977.53 que sugiere una interacción entre el grupo 
guanidinio de los residuos de arginina y el fenol del residuo de tirosina de estos pares. La distancia R2356.35-
Y2977.53 no indica interacciones; y en particular la distancia aproximada de 1 nm entre los residuos R1263.50-
Y2977.53 permite describir al poro en un estado quiescente en esta región. En contraste para el aporreceptor 
CCR5∅, tres de las distancias entre estos residuos variaron a lo largo de la simulación. La distancia R1263.50-
Y2977.53 disminuyó hacia los 100 ns de simulación, y se alejaron los pares R1263.50 y Y2145.58 para permitir la 
interacción principal y conducir a un cierre de la compuerta del poro. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
32 
 
Figura 5.2. Sistemas de referencia con el receptor CCR5∅, con maraviroc protonado (MRV), maraviroc desprotonado (mrv) y sin ligando, 
respectivamente. (A, B, C). Estructuras secundarias de CCR5∅ a través de los 400 ns de simulación. Se identifican del lado derecho los 
segmentos geométricos y en la parte inferior los motivos estructurales en código de colores. (D, E, F). Sitio de unión ortostérico del ligando 
de referencia que incluye la tétrada Y371.39, W862.60, Y2516.51y E2837.39, mostrando seis configuraciones tomadas de la trayectoria. (G). 
Valores de ΔRMSF de cadenas laterales del receptor a través del tiempo, respecto al sistema CCR5∅. (H). Valores de RMS0 del maraviroc 
protonado en su sitio de unión, donde la línea marcada central corresponde a los valores suavizados, y el contorno claro representa los 
valores precisos de RMS0. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
33 
 
Figura 5.3. Análisis de componentes principales de los receptores CCR5∅-MRV y CCR5∅. (A) Proyecciones de las trayectorias euclidianas 
de CCR5∅-MRV y CCR5∅ en la matriz de autovectores del mismo aporreceptor. El degradado de color indica el tiempo; inicio (oscuro), 
término (claro). (B) Valores de RMSF esencial para las cadenas laterales del receptor en los dos sistemas. Las flechas color rojo señalan 
los segmentos en contacto con el entorno extracelular y las flechas color azul a los segmentos en el entorno intracelular. (C) Modos 
principales del sistema CCR5∅-MRV para los autovectores 1 a 3 (de izquierda a derecha; 29%, 11% y 6% de la varianza) respectivamente. 
(D) Modos principales del aporreceptor CCR5∅ para los autovectores 1 a 3 (27%, 12% y 7% de la varianza) respectivamente; calculados de 
100 ns a 400 ns de la simulación. (E) Desplazamientos esenciales mayores de CCR5∅-MRV (arriba) y CCR5∅ (abajo) señalados con 
flechas de color en relación con el tiempo. Es notable el movimiento de mayor varianza, o movimiento hipercedástico, en la región 
intracelular de TM5 y TM6 y en la hélice yuxtamembranal (YXT) en el sistema del aporreceptor. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
34 
 
Figura 5.4. Compuerta iónica. (A). Distancias mínimas entre R1263.50, Y2145.58, R2356.35 y Y2977.53 en los sistemas de CCR5, conocida 
como compuerta iónica, a través del tiempo de simulación. El sistema CCR5∅-mrvH se caracterizó por un comportamiento mecánicamente 
estático y el sistema CCR5∅ por un acercamiento notable de los residuos R1263.50-Y2977.53 al separarse R1263.50 y Y2145.58. Superposición 
de las TMs a partir de las estructuras helicoidales medias, (B) vista inferior o intracelular y (C) vista superior o extracelular. (D) 
Representación de cuadrilátero escalada de la compuerta iónica a los 300 ns de simulación. 
 
Estos hallazgos muestran que el sistema CCR5∅-mrvH permaneció relativamente estático, o antagonizado 
en la simulación, y el sistema CCR5∅ experimentó una relativa oclusión del poro, interpretada desde la 
comparación de las distancias interhelicoidales relativas (Figura 5.4.B y C) y las distancias mínimas entre los 
residuos a los 300 ns de simulación (Figura 5.4D); en congruencia con los resultados de Yuan, et al.35 Para 
corroborar el estado del poro, se analizaron las trayectorias de moléculas de agua al interior del canal 
dividiéndolo en cuatro secciones longitudinales. Se generó una región extracelular donde se localiza el residuo 
E2837.39 interactuante con ligando, una segunda región media-extracelular hidrofóbica, una tercera región 
media-intracelular donde se ubica un residuo ácido conservado60 y que se ha descrito con capacidad de 
coordinar un ion sodio,34 el residuo D762.50 para CCR5; y la región intracelular donde se encuentra la compuerta 
iónica previamente descrita y la región que permite la unión con los heterotrímeros de la proteína G (Figura 
5.5A). La densidad de agua en el entorno de los receptores mostró mayor cantidad del solvente en CCR5∅-
MRV respecto a CCR5∅ (Figura 5.5, B y C), lo cual se cuantificó al contar las moléculas de agua en las cuatro 
secciones, donde el sistema estativo CCR5∅-MRV mostró numerosos intervalos de tiempo con un flujo acuoso 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
35 
continuo (Figura 5.5.D), que puede relacionarse con la apertura del poro. El aporreceptor experimentó bloqueos 
parciales y totales al flujo acuoso particularmente en la región S3, y una solvatación y residencia abundante en 
la región 4 (Figura 5.5.E), en concordancia con los hallazgos obtenidos para la compuerta iónica. 
 
Figura 5.5. Poro interhelicoidal para el receptor CCR5. (A). Regiones S1, S2, S3 y S4 consideradas para el 
análisis de moléculas a través del receptor en los sistemas de receptor-ligando y aporreceptor. (B y C) Densidad 
media de agua calculada para CCR5∅-MRV y CCR5∅ respectivamente. (D y E) Análisis cuantitativo de 
moléculas de agua en el poro del receptor en las cuatro regiones definidas, en escala de color de 0 a 60 
moléculas para CCR5∅-MRV y para CCR5∅ respectivamente. 
 
La energía de unión estimada del maraviroc protonado se calculó mediante el muestreo umbeliforme (del 
inglés Umbrella Sampling, ver Anexo III) y el método de análisis por histogramas ponderados (WHAM por sus 
siglas en inglés). Del potencial de fuerza media asociado al jalón para el ligando en el sistema CCR5∅-MRV 
(Figura 5.6), al analizar el segmento con las pendientes mínimas se obtiene un valor medio estimado de energía 
de unión de 35.71 ± 0.04 kcal/mol. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
36 
 
Figura 5.6. Potencial de fuerza media para la disociación del maraviroc del receptor CCR5 en el sistema 
CCR5∅-MRV (línea color morado). El segmento final del a curva con pendientes mínimas (n=24 pares 
ordenados de datos) se señala en color negro, y el valor medio estimado de 35.7 kcal/mol con un error estándar 
de la media de 0.04 kcal/mol en color rojo. 
 
El estudio de los tres sistemas del receptor CCR5 permitió caracterizar algunos aspectos relevantes de dos 
de sus estados funcionales; el estado estativo ante la presencia del antagonista maraviroc, y un estado en 
ausencia de ligando, con tendencia al cambio, y que corresponde con un colectivo de conformaciones 
transicionales para salir del estado estativo, con relación probable con una actividad intrínseca de CCR5. 
 
V.2. Sistemas del receptor de prueba CX3CR1 
El estudio del receptor CX3CR1 se abordó de tres maneras distintas: Se compararon los hallazgos del 
modelo multitemplado, construido por enhebrado (ver Anexos I y II) con los modelos activo, transitivo y estativo 
esperados (Figura 5.7), de acuerdo al conocimiento de conformaciones experimentales de los GPCRs.32 
Posteriormente los hallazgos del modelo multitemplado en complejos independientes con los ligandos 
evaluados (Tabla 5.1) se compararon con los modelos de los tres estados funcionales, y finalmente una 
comparación global (Figura 5.8). 
 
Figura 5.7. Esquema del modelo multitemplado (CX3CR1) y los tres estados funcionales del receptor (estativo CX3CR1∅, transitivo 
CX3CR1‡ y activo CX3CR1*). 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
37 
Tabla 5.1. Ligandos evaluados en el modelo multitemplado CX3CR1. 
Antagonista presuntivo Agonista presuntivo (Dominio de quimiocina) 
 
 
 
Maraviroc (MRV) 
CX3CR1-MRV 
 
 
 
 
 
 
Aglicofractalkinad 
CX3CR1-AFKN 
 
 
 
Aglicona 
 
 
 
E6130a 
CX3CR1-E61 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fractalkina, variante 1e 
CX3CR1-FKNG2 
 
 
 
 
 
 
AZD8797b 
CX3CR1-AZD 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fractalkina, variante 2e 
CX3CR1-FKNG2S2 
 
 
 
 
 
Ligando 1 (LG1)c 
CX3CR1-LG1 
 
 
 
Código de glicanos: 
 
Notas: a. El ligando E6130 tiene actividad experimental como antagonista ortostérico.61 b. El ligando AZD8797 
es un antagonista alostérico.62 c. El ligando 1 se propuso a partir de la información obtenida de las interacciones 
de los sistemas CCR5∅-MRV y CX3CR1-MRV. d. Se consideró la aglicofractalkina, la aglicona del dominio de 
quimiocina de CX3CL1 (CDC por sus siglas en inglés), como punto de partida en las simulaciones con 
agonistas debido a que se conoce a nivel molecular la interacción de un GPCR con este complejo.63 (Ver 
Anexos I y II). e. Debido a la variación de los carbohidratos biantenales complejos,64,65 se evaluaron las 
glicoformas G2 y G2S2 (Ver Anexo II). 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
38 
 
 
Figura 5.8. Esquema de los diferentes sistemas del receptor CX3CR1, abreviado como R (ver Tabla de abreviaturaso acrónimos). Los 
colores agrupan los sistemas con base en sus características esperadas. Estativo (verde), activo (azul), transitivo (amarillo) y basal (rosa). 
 
V.2.1. Modelos CX3CR1 multitemplado, activo, transitivo y estativo 
Como se menciona en sección IV, el modelo principal de CX3CR1 se obtuvo a partir de la información 
experimental de receptores con mayor similitud en estructura primaria, por lo que la comparación con los 
estados esperados activo, transitivo y estativo fue necesaria para determinar las características generales de 
este modelo multitemplado. 
De las estructuras secundarias a través del tiempo para los sistemas, el modelo multitemplado CX3CR1 
presentó inicialmente el plegamiento beta en ECL2 dadas las estructuras base para su modelado. Este 
segmento se desestabilizó hacia los 150 ns de simulación debido a la ausencia de ligando (Figura 5.9A). El 
plegamiento helicoidal de ICL2 se estabilizó en el modelo activo CX3CR1* en todo el intervalo (Figura 5.9B), y 
en CX3CR1‡ este segmento tuvo un orden relativo (Figura 5.9C) en comparación con CX3CR1∅ (Figura 5.9D). 
La modificación torsional debida a las rupturas de helicidad en TM2 en CX3CR1 y CX3CR1* fue leve 
comparada con CX3CR1‡ y CX3CR1∅. Los valores de RMSF para las cadenas laterales resaltan la diferencia 
de estados, en particular la fluctuación baja del segmento ECL3 del modelo transitivo y la movilidad mayor en 
ICL2 en el modelo estativo (Figura 5.9E). Los residuos equivalentes en el sitio de unión ortostérico constituido 
por Y381.39, W872.60, F1133.36, R1914.54, Y2476.51, E2797.39 y F2837.43 tuvieron una alta fluctuación en los modelos 
multitemplado y transitivo, teniendo cierta estabilidad dinámica en los modelos activo y estativo (Figura 5.9 F-I). 
Ante la ausencia de ligandos, los residuos Y2476.51 y E2797.39 formaron una interacción prevaleciente en 
CX3CR1 y CX3CR1∅, infrecuente, alrededor de 10% del tiempo de simulación para CX3CR1* y ocasional en 
CX3CR1‡. 
En el análisis de componentes principales los estados CX3CR1 y CX3CR1∅ se sitúan próximos en el 
espacio esencial, en concordancia con la naturaleza del modelado; y el estado CX3CR1* se presentó 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
39 
inaccesible para estos dos sistemas en el tiempo de simulación de 400 ns (Figura 5.10A). Los valores de RMSF 
esenciales para cadenas laterales del dominio transmembranal son muy pequeños para CX3CR1 y mayores 
para los tres modelos funcionales (Figura 5.10B), que puede representar la influencia de los modelos estativos 
en el modelado de CX3CR1. Se distinguen los valores menores en TM4, TM5 y YXT para el modelo activo, los 
valores mayores en TM1, TM2 y TM3 en el modelo transitivo y en TM6 y TM7 para el modelo estativo. Los 
modos principales de los cuatro sistemas revelaron desplazamientos clave para caracterizar el estado, en 
particular el amplio movimiento de la región intracelular de TM6 (ICL3-TM6) en CX3CR1* debido probablemente 
a una transición fuera del estado activo; así como una traslación frontal de YXT, mientras que en CX3CR1∅ el 
movimiento de vaivén de TM1 y TM2 y un giro endomembranal de YXT hacia atrás. El modelo transitivo 
presentó flexiones pronunciadas en las hélices TM5 y TM6, y el modelo multitemplado conservó la estatividad 
inferida a partir de las fluctuaciones del sitio ortostérico y los valores de RMSF esenciales (Figura 5.10, C-I). 
La ausencia del ligando en estos sistemas limitó en cierta medida la comparación detallada entre los tres 
estados funcionales, ya que permite una posible convergencia de conformaciones. 
La compuerta iónica en los modelos CX3CR1 tuvo una diferencia importante entre CX3CR1* y los otros tres 
modelos, debido al cierre del poro acuoso a través de la interacción R1273.50-Y2937.53, mientras que la mayor 
distancia R1273.50-Y2937.53 se presentó en CX3CR1∅, y en el modelo multitemplado fue disminuyendo 
gradualmente esta apertura al favorecer la interacción R1273.50-Y2115.58 (Figura 5.11A). El cierre del poro 
acuoso para el modelo activo concordó con el aporreceptor de referencia CCR5. Sin embargo, estos sistemas 
no son totalmente comparables y el comportamiento del estado activo CX3CR1 se replanteó en los sistemas 
con ligandos agonistas. Las diferencias en las posiciones de los extremos intracelulares de TM5 y TM6 en los 
cuatro modelos sugieren que es una característica distintiva del estado funcional. Los diagramas bivariados de 
RMSD del dominio transmembranal (TMD) respecto a la distancia entre las regiones ICL1-TM2 e ICL3-TM6 
(Figura 5.11D) permitieron la segregación de los modelos multitemplado y transitivo; pero en CX3CR‡ y 
CX3CR1∅ se identificó un aparente cambio de estado. Además, se confirma la compacidad relativa del poro en 
los modelos multitemplado y activo respecto a los otros dos. Al analizar los histogramas bivariados de los 
ángulos diedros χ1 y χ2 de Y2937.53, se observa que predominan tres rotámeros, dos de ellos compartidos en los 
modelos multitempaldo y activo, con la cadena lateral hacia el poro y hacia TM7, y sólo uno en el modelo 
estativo. La moda histográfica en el modelo transitivo es intermedia entre CX3CR1* y CX3CR1∅, mientras que 
el modelo multitemplado mostró una bimodalidad importante y distintiva (Figura 5.11E). 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
40 
 
Figura 5.9. Análisis de estructura secundaria y sitio ortostérico para el receptor en modelo multitemplado (CX3CR1), activo (CX3CR1*), 
transitivo (CX3CR1‡) y estativo (CX3CR1∅) respectivamente. (A, B, C y D) Estructuras secundarias a través del tiempo para los cuatro 
modelos. (E) Valores de RMSF de cadenas laterales de los tres sistemas. (F, G, H e I) Residuos del sitio de unión equivalente del 
maraviroc: Y381.39, W872.60, F1133.36, R1914.54, Y2476.51, E2797.39 y F2837.43 para los cuatro modelos. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
41 
 
Figura 5.10. Análisis de componentes principales para el receptor CX3CR1, modelos multitemplado, activo, transitivo y estativo. (A) 
Proyecciones de las trayectorias euclidianas en la matriz de autovectores del modelo multitemplado, mostrando las diferencias de 
locaciones esenciales accesibles para cada estado. (B) Valores de RMSF esencial de las cadenas laterales del dominio transmembranal 
para los modelos CX3CR1, CX3CR1*, CX3CR1‡ y CX3CR1∅. Modos principales de (C) CX3CR1, (D) CX3CR1*, (E) CX3CR1‡ y (F) 
CX3CR1∅. (G, H, I, J) Movimientos esenciales mayores en CX3CR1, CX3CR1*, CX3CR1‡ y CX3CR1∅, señalados con flechas. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
42 
 
Figura 5.11. (A) Distancias de interacción de la compuerta iónica. En CX3CR1 y CX3CR1∅ los pares K2316.35-Y2937.53 y K2316.35-Y2115.58 
establecieron contactos cercanos, manteniendo la compuerta Y2937.53-R1273.50 abierta al menos en los primeros 100 ns de simulación. En 
CX3CR1* los pares K2316.35-Y2937.53 y K2316.35-Y2115.58 se mantuvieron con interacciones menores, permitiendo el cierre de la compuerta 
Y2937.53-R1273.50. Superposición de las hélices (B) con vista superior o extracelular y (C) inferior o intracelular. (D) Histogramas bivariados 
para las distancia del extremo intracelular de TM2 (ICL1-TM2) y el extremo intracelular de TM6 (ICL3-TM6) con el valor de RMSD del 
dominio transmembranal (TMD). Con una flecha en el diagrama del modelo multitemplado, se propone la trayectoria de estas variables en 
los tres cambios de estado. (E) Histogramas bivariados para la ocurrencia de los ángulo diedros χ1 y χ2 de Y293
7.53 en los tres sistemas. 
Para CX3CR1, la distribución es bivariada, con los dos pares predominantes con el grupo lateral hacia el poro y hacia la TM7. 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
43 
V.2.2. Modelo multitemplado con antagonistas presuntivos 
Para los sistemas de CX3CR1 con ligandos presuntamente antagonistas (Figura 5.12), la característica 
común en los cuatro sistemas fue la estabilización del motivo beta plegado en ECL2 por la presencia del 
ligando, como se observó en los sistemasde referencia de CCR5. Un hallazgo notable en el sistema con el 
ligando E6130 fue el desplegamiento del extremo extracelular de TM1 en ocho residuos, que no se propagó 
hacia el dominio intramemembranal. El plegamiento helicoidal en ICL2 se desfavoreció en los 400 ns de 
simulación para los sistemas con los antagonistas E6130 y AZD8797, y predominó en el sistema con maraviroc 
(Figura 5.12A). Este segmento intracelular se plegó hacia la mitad de la simulación, lo que puede implicar al 
menos dos eventos. Dado que un estado funcional es un colectivo de conformaciones,66 el plegamiento 
helicoidal puede responder a la conversión hacia otros confórmeros del colectivo estativo, o a un cambio de 
estado funcional. Adicionalmente, se presentó una extensión helicoidal en la región ECL2-TM5 hacia el final de 
la simulación en los sistemas con AZD8797 y LG1. El sistema con E6130 ocasionó una ruptura helicoidal en 
TM7 cercana al sitio ortostérico (Figura 5.12B). El ligando AZD8797 indujo una considerable ruptura helicoidal 
en TM5 (Figura 5.12C), distante del sitio alostérico que está formado por los residuos D772.50; el residuo 
conservado de interacción con el catión sodio; W2446.48, H2857.45, N2897.49, P2907.50 y Y2937.53; cuatro de ellos 
implicados en la formación del complejo con sodio, el residuo conservado P2907.50 y la tirosina que integra la 
compuerta iónica. En el sistema con LG1, la hélice TM6 extendió el plegamiento helicoidal hacia ECL3 (Figura 
5.12D); mientras que en los otros tres sistemas este segmento tuvo mayor variabilidad en el plegamiento. 
En el análisis de componentes principales de la cadena principal transmembranal se agruparon los cuatro 
sistemas con ligandos en locaciones muy similares, respecto al modelo multitemplado (Figura 5-13A), donde el 
sistema con E6130 tuvo un mayor distanciamiento del modelo multitemplado, y el sistema con LG1 dirigiéndose 
hacia la locación del modelo transitivo. Los modos principales del dominio TMD mostraron resultados opuestos 
para los desplazamientos de la hélice YXT para los sistemas con MRV y LG1; de descenso hacia la interfase 
intracelular, y de ascenso intramembranal, respectivamente (Figura 5-13, B-E). Adicionalmente la flexión de las 
hélices TM5 y TM6 es equiparable a la flexión obtenida con el modelo transitivo CX3CR1‡. El probable cambio 
de estado de CX3CR1-LG1 hacia la activación se podría confirmar con un tiempo de simulación más 
prolongado, ya que los cambios de estado en los GPCRs se ha reportado en escalas de tiempo de simulación 
de microsegundos.35,38 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
44 
 
Figura 5.12. Análisis de estructura secundaria y del sitio de unión para los estados estativos. Estructura secundaria a través del tiempo para 
(A) CX3XR1-MRV, (B) CX3CR1-E6130, (C) CX3CR1-AZD8797 y (D) CX3CR1-LG1. (E-H) Sitio de unión de los ligandos, respectivamente. 
(I) Diferencia de RMSF para las cadenas laterales de los sistemas respecto al modelo multitemplado CX3CR1. (J) Valores de RMSD a 
través del tiempo de la cadena principal de los residuos del sitio alostérico; W2446.48, H2857.45, N2897.49, P2907.50 y Y2937.53. (K) Vista frontal 
del sitio alostérico con el ligando AZD8797. 
 
Al analizar la compuerta iónica en los cuatro sistemas, la interacción principal de R1273.50-Y2937.53 fue más 
estrecha en los sistemas con maraviroc y LG1, en oposición con la diferencia de desplazamientos principales de 
la hélice YXT (Figura 5.14A). En general, los sistemas tuvieron una tendencia estativa, con dos excepciones; el 
distanciamiento de K2316.35-Y2115.58 en el sistema CX3CR1-E6130, y de K2316.35-Y2937.53 en el sistema 
CX3CR1-LG1. Las regiones intracelulares de las hélices TM5 y TM7 tuvieron la máxima separación media en el 
sistema con LG1 (Figura 5.14 B y C), con tendencia aparente al estado transitivo. Los dos sistemas con los 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
45 
antagonistas E6130 y AZD8797 no difieren notablemente en sus confórmeros medios (Figura 5.14D), por lo que 
la trayectoria de los dos sistemas estativos podría converger aun teniendo dos tipos distintos de antagonistas. 
Al evaluar las variables para analizar el cambio de estado, los cuatro sistemas manifestaron un aumento en la 
distancia de separación de las hélices y el RMSD transmembranal, favoreciendo la apertura del poro 
intrahelicoidal, siendo mayor el incremento en los sistemas con E6130 y LG1 (Figura 5-14E). Las distribuciones 
de los diedros χ1 y χ2 son semejantes en los sistemas CX3CR1, CX3CR1-E6130 y CX3CR1-LG1; mientras que 
en el sistema con AZD8797 las rotaciones en el sitio alostérico se encuentran fuertemente restringidos. Estas 
distribuciones son multimodales, predominando la mayor variación de χ2 respecto a χ1; 0° < χ2 < 360° y χ2< 
135°. El sistema CX3CR1-E6130 con cuatro modas leptocúrticas, es decir, con alta frecuencia, presentó cuatro 
rotámeros predominantes que constituyen cuatro confórmeros del colectivo estativo para este sistema. En el 
caso de los sistemas CX3CR1-LG1 y CX3CR1-MRV, las modas alrededor de (120°, 345°) son mesocúrticas 
respecto al sistema con E6130; y en el segundo el rotámero asociado es prácticamente inaccesible para el 
sistema (Figura 5.14F). 
 
 
Figura 5.13. Análisis de componentes principales de los sistemas con antagonistas presuntivos. (A) Proyecciones de las trayectorias de la 
cadena principal de los sistemas CX3CR1-MRV, CX3CR1-E6130, CX3CR1-AZD8797 y CX3CR1-LG1 sobre la matriz de autovectores del 
modelo multitemplado. Modos principales de los sistemas (B) CX3CR1-MRV, (C) CX3CR1-E6130, (D) CX3CR1-AZD8797 y (E) CX3CR1-
LG1. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
46 
 
Figura 5.14. Distancias de los residuos en la compuerta iónica. (A) Interacciones entre los cuatro residuos. (B) Vista inferior y (C) vista 
superior de la superposición de los cinco dominios TMD. (D) Comparación de los dos sistemas con el antagonista ortostérico E6130 y el 
antagonista alostérico AZD8797. (E) Histogramas bivariados de RMSD del dominio TMD y la distancia ICL1-TM2 e ICL3-TM6. Al analizar 
estas distribuciones a través del tiempo, los cuatro sistemas con ligando aumentaron los valores de ambas variables. (F) Histogramas para 
los ángulos diedros χ1 y χ2 de Y293
7.53. Los tres sistemas con ligandos ortostéricos se comportaron de manera similar en sus distribuciones, 
y el sistema con AZD8797 fue distinto debido a su ubicación en el receptor. 
 
En el cálculo de la energía libre estimada de disociación del maraviroc, el jalón del ligando se situó en 
configuraciones muy inestables, y que convergieron a una locación similar al sistema inicial, lo que ocasionó la 
no intersección de los histogramas (Ver anexo I), y una estimación de energía libre de aproximadamente 10 
kcal/mol, que no es comparable con la estimación de energía libre del sistema de referencia CCR5-MRV (Figura 
5.15). Este comportamiento de caídas en el gráfico de PMF se debe fundamentalmente a la interacción del 
dominio amino terminal NT con el ligando durante su jalón por la coordenada de reacción, lo que dificultó 
sustancialmente la estimación insesgada. En el sistema de referencia CCR5-MRV, el dominio NT está ausente 
desde la estructura experimental y no se presentó este fenómeno. El resultado de PMF y la estimación de la 
asíntota que representa la energía libre de disociación se puede precisar con un aumento del tamaño de la caja 
de simulación y un extensivo muestreo umbeliforme, lo que implica un costo computacional elevado, y equiparar 
al omitir el dominio NT de CX3CR1. 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
47 
 
Figura 5.15. Potencial de fuerza media para el maraviroc en CX3CR1. 
 
V.2.3. Modelo multitemplado con agonistas presuntivos 
El agonista endógeno en su forma soluble sCX3CL1, se comparó inicialmente con el sistema testigo US28-
AFKN, del receptor viral US28 (ver Anexo I para resultados de este sistema testigo); y posteriormente se 
analizaron los sistemas de receptor-aglicona de