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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS Estudio de la expresión de α-latrotoxina recombinante de Latrodectus mactans en Escherichia coli T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGO P R E S E N T A : Nuria Isabel Rubio Morales FACULTAD DE CIENCIAS UNAM DIRECTOR DE TESIS: Dr. Roberto Pablo Stock Silberman 2013 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. 2 3 La presente tesis se realizó bajo la dirección del Dr. Roberto Stock Silberman en el departamento de Medicina Molecular y Bioprocesos del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) con el apoyo de Laboratorios Silanes a través de los convenios de suscritos con el laboratorio. 1 A mis padres, los cuatro, por forjar lo que soy, cada uno a su manera. A mis amigos, gracias por hacer del camino un paseo. 2 3 Agradecimientos A los miembros del jurado, por tomarse el tiempo de revisar y corregir esta tesis: Dr. Jean-Louis Charli Dr. Alejandro Alagón Dr. Roberto Stock Dra. Claudia Segal Quím. Viviana Escobar A mi tutor, el Dr. Roberto Stock. Por toda la dedicación que pones en tus estudiantes, por todo lo que he aprendido trabajando con vos y por todo lo que has intentado enseñarme que no he aprendido todavía. Al Dr. Alejandro Alagón. Por incluirme como uno de sus estudiantes. Por siempre tener un momento para compartir ideas, consejos, anécdotas... A la M. en C. Blanca Ramos Cerrillo. Por enseñarme “las manos” del trabajo en el laboratorio, por las largas discusiones de los resultados de mi trabajo y por estar ahí en los lapsos de crisis experimental total. Al Biól. Irving Archundia. Gracias por tu ayuda con el trabajo experimental, por ayudarme a inyectar ratones; por compartir conmigo tu mesa, tus pipetas, tu computadora, tus ratones y tu tiempo. A la M. en C. Mabel Rodríguez González. Por ayudarme a desarrollar la estrategia ganadora de clonación y sobre todo, por apoyarme en todo momento. Sin usted no hubiera sobrevivido a la αLTX. A todos mis compañeros de laboratorio. Por el gusto de compartir pasillos y disfrutar juntos los éxitos y frustraciones de la ciencia. A Angélica Linares, Ricardo Mondragón, Daniel Gama y Olegaria Benítez. Gracias por su apoyo durante mi estancia en el laboratorio. A la Unidad de Síntesis del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Por los oligonucleótidos y la secuenciación de los plásmidos. 4 5 Índice SIGLAS Y ABREVIATURAS RESUMEN I. INTRODUCCIÓN 1 1.1. GENERALIDADES 1 1.2. ARAÑAS DEL GÉNERO LATRODECTUS 2 1.3. LATRODECTISMO Y ANTIVENENOS 5 1.4. VENENO DE LATRODECTUS SPP 6 1.5. ALFA-LATROTOXINA 7 1.5.1. CARACTERÍSTICAS Y ESTRUCTURA 7 1.5.2. ACTIVIDAD BIOLÓGICA 8 1.5.3. MECANISMO DE ACCIÓN 9 1.6. EXPRESIÓN HETERÓLOGA EN E. COLI 11 1.6.1. SISTEMA PGEX 11 1.6.2. SISTEMA PMAL 12 II. ANTECEDENTES 14 III. JUSTIFICACIÓN 15 IV. OBJETIVOS 16 OBJETIVO GENERAL 16 OBJETIVOS PARTICULARES 16 V. MATERIALES Y MÉTODOS 17 5.1. MATERIALES 17 5.1.1. REACTIVOS 17 5.1.2. CEPAS BACTERIANAS Y MEDIOS DE CULTIVO 17 5.1.3. SOLUCIONES Y AMORTIGUADORES 18 5.1.4. BIOLOGÍA MOLECULAR 19 5.1.5. KITS 21 5.2. METODOLOGÍA 22 5.2.1. EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN E. COLI 22 5.2.2. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS SOLUBLES 23 5.2.3. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD 24 5.2.4. PURIFICACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-GST 25 5.2.5. ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS (SDS-PAGE) 25 5.2.6. WESTERN BLOT 26 5.2.7. ANÁLISIS DE IMÁGENES 26 5.2.8. BIOLOGÍA MOLECULAR 26 5.2.9. CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES PMALP1GKLTX Y PMALC2GKLTX 28 6 VI. RESULTADOS 31 6.1. EXPRESIÓN DE αLTX COMO GST-LTX 31 6.1.1. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GST 31 6.1.2. ENSAYOS DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE GST-LTX 32 6.2. EXPRESIÓN DE αLTX COMO MBP-LTX 44 6.2.1. CONSTRUCCIÓN DE LOS VECTORES PMALP1GKLTX Y PMALC2GKLTX 44 6.2.2. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE MBP 49 6.2.3. ENSAYOS DE EXPRESIÓN DE MBP-LTX 53 6.2.4. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE MBP-LTX 57 6.2.5. OBTENCIÓN DE αLTX 60 6.2.6. ENSAYOS DE TOXICIDAD EN RATÓN 63 VII. DISCUSIÓN 65 VIII. CONCLUSIONES 74 IX. PERSPECTIVAS 75 X. REFERENCIAS CITADAS 76 ANEXO 1 79 7 Siglas y abreviaturas αLTX Alfa-latrotoxina A280 Absorbancia a 280nm BSA Albúmina sérica bovina CB Column buffer DL50 Dosis letal media DNA Ácido desoxirribonucléico cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario DO600 Densidad óptica a 600nm EDTA Ácido etilendiaminotetra-acético EtBr Bromuro de etidio FPLC Fast Performance Liquid Cromatography g Unidades de gravedad, fuerza centrífuga relativa GSH Glutatión reducido GST Glutatión-S-transferasa hpi horas post-inducción IgG Inmunoglobulinas tipo G IPTG isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido kDa kilodaltones MBP Maltose binding protein MCS Sitio de multiclonaje pb pares de bases PBS Phosphate buffered saline PCR Reacción en cadena de la polimerasa psi libra-fuerza por pulgada cuadrada RNA Ácido ribonucleico mRNA Ácido ribonucleico mensajero tRNA Ácido ribonucleico de transferencia rpm revoluciones por minuto SDS Dodecil sulfato de sodio SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico TAE Tris Acetato EDTA WB Western blot 8 9 Resumen La mordedura de las arañas conocidas como viudas, pertenecientes al género Latrodectus, causa un padecimiento conocido como latrodectismo. Dentro de los componentes del veneno, se ha demostrado que únicamente la α-latrotoxina (αLTX) es la causante del envenenamiento en vertebrados. La αLTX es una proteína de alto peso molecular (130kDa) que se une a receptores específicos en las membranas presinápticas estimulando una liberación masiva de neurotransmisores. La producción de esta proteína recombinante resulta de interés por su utilidad en el estudio de la fisiología neuronal y por su posible aplicación como inmunógeno en la fabricación de antivenenos. En el laboratorio secuenció el gen que codifica para la αLTX de L. mactans y se realizaron ensayos de expresión de fragmentos en E. coli (Prud’homme, 2004) y de la proteína completa en el sistema baculovirus- células de insecto (Rodríguez, 2008), sin embargo, el rendimiento y grado de pureza obtenidos resultaron insuficientes. Considerando la producción exitosa de la αLTX de L. tredecimguttatus en E. coli como una proteína de fusión a GST (glutatión S-transferasa) (Li et al., 2005); en el presente trabajo se exploraron diversas condiciones para obtener la proteína recombinante de la especie L. mactans utilizando el mismo sistema. Se realizaron numerosos ensayos de expresión y purificación de la proteína de fusión GST-LTX, realizandovariaciones en la cepa, concentración de IPTG, método de lisis, amortiguador, etc. Sin embargo, el rendimiento de las purificaciones fue muy pobre y la proteína inestable y poco soluble por lo que no fue posible replicar los resultados obtenidos por Li et al. (2005). Debido a los problemas de producción de GST-LTX, se subclonó el cDNA de la αLTX de L. mactans en los vectores pMAL-p5x y pMAL-c5x que generan proteínas fusionadas a MBP (maltose binding protein). Se realizaron pruebas de expresión en ambos vectores pero la proteína sólo pudo expresarse en el vector citoplásmico. Utilizando este sistema pudieron obtenerse aproximadamente 500µg/l de cultivo de la proteína de fusión MBP-LTX con un porcentaje de pureza alrededor del 15%. Se realizaron algunas pruebas de digestión de la proteína de fusión con Factor Xa para obtener αLTX donde se determinó que la concentración del sustrato es determinante en la eficiencia de corte de la enzima y se exploraron algunas condiciones para mejorar el procesamiento proteolítico de la MBP-LTX. Se realizó un ensayo preliminar de toxicidad en ratón y se demostró que la αLTX recombinante producida en E. coli es capaz de producir un envenenamiento similar al que produce la toxina nativa, sin embargo, la producción de la proteína aún no es suficientemente eficaz por lo que su implementación a mayor escala requerirá optimizar el proceso. 10 1 I. Introducción 1.1. Generalidades El phylum Arthropoda es el más diverso y exitoso del Reino Animal, quizás debido a la gran variedad de interacciones biológicas y a una explotación extraordinaria de muy diversos nichos, posiblemente favorecida por la especialización de sus apéndices articulados. También es uno de los phyla mejor estudiados por su importancia en ámbitos de la vida humana como la medicina o la agricultura, entre otros. Los integrantes de este phylum se caracterizan por presentar un exoesqueleto formado por una cutícula de quitina la cual los protege del medio, aunque también limita su crecimiento por lo que estos animales crecen mediante ecdisis o mudas. Según Brusca & Brusca (2005), Arthropoda contiene 5 subphyla: Trilobitomorpha, Crustacea, Myriapoda, Hexapoda y Cheliceromorpha. El subphylum Cheliceromorpha contiene a los artrópodos que carecen de antenas y mandíbulas y que presentan sólo 2 tagmas (unidad anatómico-funcional derivada de la fusión de segmentos): prosoma o cefalotórax y opistosoma o abdomen. El prosoma presenta 6 pares de apéndices (quelíceros, pedipalpos y cuatro pares de patas), mientras que el opistosoma carece de apéndices aunque puede finalizar en un telson en algunos grupos. Por su parte, este subphylum comprende 4 clases, entre las cuales se encuentra la clase Arachnida cuyos integrantes son fundamentalmente terrestres (exceptuando algunas arañas semiacuáticas), solitarios, de hábitos nocturnos y en su mayoría depredadores con digestión parcialmente externa (Fernández-Álamo & Rivas, 2007). Dentro de la clase Arachnida, el más numeroso con más de 43 000 especies, es el Orden Araneae que contiene a todas las arañas (Platnick, 2012). Las arañas son similares al resto de los arácnidos en su organización corporal pero presentan características distintivas como la capacidad de producir seda mediante las glándulas sercígenas ubicadas en la parte posterior del opistosoma. Al poseer digestión parcialmente externa, las arañas requieren inyectar enzimas digestivas en sus presas, para lo cual poseen glándulas en los quelíceros que secretan un veneno capaz de paralizar y pre-digerir a sus presas. Los venenos se definen como secreciones consistentes de mezclas de sustancias biológicamente activas e inactivas, que son inoculados a otros organismos mediante un sistema especializado de inyección (colmillos, aguijones, etc). Los venenos pueden conferir ventajas competitivas en términos de captura de alimento o defensa, por lo que existen en todos los reinos y en una gran variedad de seres vivos como eubacterias, plantas, cnidarios, artrópodos, moluscos y otros invertebrados, así como varios taxa de vertebrados. Sin embargo dentro de estos grupos, se reconoce a las arañas como el grupo de depredadores más exitoso y aquel que cuenta con la mayor diversidad de toxinas (Sollod et al., 2005). 2 Las toxinas de los venenos de arañas, en general son pequeños péptidos que pueden ser clasificados en tres grupos: a) citolíticos (2-4 kDa), b) neurotóxicos (5-9 kDa), y c) polipéptidos largos (>9 kDa) cuya función en general se desconoce, aunque se sabe que algunos tienen actividad enzimática. Sollod et al. (2005) consideran que existen algunas excepciones a esta clasificación como las esfingomielinasas D (35 kDa) de arañas de la familia Sicariidae y las latrotoxinas provenientes de miembros del género Latrodectus que tienen una masa molecular de alrededor de 100 kDa. 1.2. Arañas del género Latrodectus El género Latrodectus se encuentra dentro de la familia Theridiidae, la cual se identifica por la presencia de colulo (espineretes vestigiales) y de peines tarsales; también se distinguen por presentar coloración intensa y por la morfología de los palpos de los machos (Levi & Randolph, 1975). Las arañas del género (Fig. 1A) se definen por la presencia de un colulo grande, ausencia de dientes quelicerales, arreglo ocular con dos hileras de cuatro ojos laterales ampliamente separados y la estructura de los órganos sexuales masculinos (Hogue, 1993; Garb et al., 2004). A B Phylum Arthropoda Subphylum Cheliceromorpha Clase Chelicerata Subclase Arachnida Orden Araneae Suborden Opisthothelae Superfamilia Araneomorphae Familia Theridiidae Género Latrodectus Figura 1. Arañas del género Latrodectus. A) Posición taxonómica de las viudas (Latrodectus spp). B) Ejemplares macho y hembra de Latrodectus mactans Fuente: Brusca & Brusca, 2005. Imagen: UASLP, 2010 El abdomen en las hembras mide entre 8 y 15mm, es globoso y presenta patrones de coloración llamativos por lo que se considera aposemática. Ésta puede variar del negro al café-rojizo, rojo intenso o incluso blanco y en general están adornadas por patrones de líneas o puntos de colores que igualmente varían en la gama de los rojos, amarillos y blancos. Los machos tienen un tamaño corporal 4 o 5 veces menor al de las hembras 3 (aunque las patas tienen prácticamente la misma longitud) y presentan una coloración menos llamativa. Estas arañas pueden distinguirse por una marca con forma de reloj de arena de color anaranjado o rojo en la parte ventral del abdomen, aunque esta marca no se observa en todas las especies ni en todos los ejemplares. En particular, las hembras de Latrodectus mactans son de color negro lustroso y el reloj de arena es de color rojo. Los machos son más pequeños y de color gris o café y la marca puede ser amarilla, blanca o incluso estar ausente (Fig. 1B) (Hogue, 1993). Existen varios nombres comunes para estas arañas según la región como araña capulina, po-ko-moo o tzintlatlauquih (México), araña del lino o cuyucha (Argentina), araña de poto colorado (Chile), lucacha (Perú), cul rouge (Indias Occidentales) o casampulga (Centro América), aunque en general, a las arañas de este género se les conoce como viudas debido al hábito de las hembras de devorar a los machos durante o después de la cópula (Hogue, 1993; Garb et al., 2004; UASLP, 2010). Aunque presentan otras formas de canibalismo (e.g. canibalismo entre crías), el canibalismo sexual ha sido muy estudiado por la variedad de conductas reproductivas a las que ha dado lugar. De acuerdo a la especie de Latrodectus estas conductas pueden incluir despliegues reproductivos por parte de la hembra, vibraciones abdominales en los machos odanzas por parte de ambos sexos e incluso en algunas especies como L. hasselti o L. geometricus, los machos ofrecen el abdomen en un sacrificio nupcial conocido como “sommersault” (Ross & Smith, 1979; Garb et al., 2004; Segoli et al., 2007). Las Latrodectus spp. son de hábitos nocturnos y tímidos por lo que tejen telas finas y amorfas en lugares estrechos, obscuros, frescos y secos; habitualmente en grietas en el suelo, madera u otros restos. Estas arañas son predadores generalistas que se alimentan de insectos, crustáceos, otros arácnidos y algunos vertebrados pequeños como pueden ser lagartijas, geckos o quizá hasta ratones. Sus enemigos naturales incluyen avispas depredadoras (Sphecidae), avispas de las arañas (Pompilidae) y parasitoides como avispas calcidoideas (Desantisca, Eurytomidae) y moscas de la familia Chloropidae (Pseudogurax) (Hogue, 1993; Garb et al., 2004). A pesar de que el género parece estar bien delimitado, la taxonomía al interior del mismo no es muy estable. Inicialmente se utilizaron caracteres morfológicos como coloración somática, forma y color de los patrones abdominales, largo y abundancia de las setas, etc., pero estos caracteres parecen tener una variación continua intra e interespecífica por lo que no permiten una clasificación consistente. Posteriormente, Levi (1959) propuso una clasificación basada en la morfología de los órganos copuladores de los machos, la cual ha sido revisada por él y por otros autores (Kaston, 1970; Levi, 1983; Lotz, 1994) tomando en cuenta otros caracteres como la forma de los receptáculos seminales, hábitos alimenticios, morfología de las ootecas, distribución, etc., señalando el fuerte grado de polimorfismo intraespecífico. Por su parte, Garb et al. (2004) plantearon una hipótesis filogenética para el género basada en la subunidad I de la citocromo C oxidasa mitocondrial (COI), 4 donde se muestra que Latrodectus forma un clado monofilético independiente de los géneros Steatoda y Robertus. Además, señalan la formación de dos grandes clados monofiléticos de Latrodectus: 1) clado geometricus, que incluye a L. geometricus y L. rhodesiensis (África del Sur) y 2) clado mactans, que incluye al resto de las especies; aunque también hallaron conflictos en la separación de especies dentro de este clado y remarcan las limitaciones de este tipo de estudios para resolver la taxonomía del género (Garb et al., 2004). Actualmente, se reconocen 31 especies dentro del género, las cuales se distribuyen en todos los continentes (excepto Antártida), incluso existen especies propias de Australia, Nueva Zelanda, Japón y Madagascar (Fig. 2). La mayor diversidad se encuentra en América (Sudamérica, 7 especies; Norteamérica, 5 especies), Medio Oriente (7 especies) y el sur de África (6 especies). Estas arañas pueden ser sinantrópicas, algunas especies se adaptan a ambientes urbanos mientras que otras sólo se observan en zonas rurales. Debido a esta característica, algunas especies han expandido su distribución muy probablemente como polizones en bienes importados. En particular, L. geometricus ha alcanzado una distribución prácticamente global que parece ser reciente y estar relacionada con movimientos humanos (Garb et al., 2004). A pesar de la amplia distribución del género, la mayor parte de los envenenamientos reportados son causados por unas pocas especies: L. mactans, L. variolus, L. hesperus, L. tredecimguttatus, L. hasselti, L. indistinctus y L. menavodi. Figura 2. Distribución de las especies de Latrodectus. La distribución de L. geometricus se indica mediante puntos negros, los círculos indican las localidades donde se considera que esta especie ha sido introducida. Fuente: Modificado de Garb et al. (2004) 5 1.3. Latrodectismo y antivenenos La mordedura de viuda negra provoca un padecimiento conocido como latrodectismo, el cual es un síndrome clínico que se caracteriza por intenso dolor, primero local y luego generalizado, acompañado por piloerección, linfagnitis, diaforesis, oliguria, hipertensión, taquicardia, ansiedad, vómito, fasciculación y tremor muscular, rigidez abdominal, facies latrodectismica, pavor mortis, etc. El cuadro clínico parece ser similar para todas las especies de Latrodectus, sin embargo, la severidad del envenenamiento puede variar de acuerdo a la especie y tamaño de la araña, así como de otros factores (Maretić, 1983; Graudins et al., 2001). La mortalidad por latrodectismo es baja (<1%) y generalmente ocurre en niños o ancianos; no obstante, este síndrome tiene una morbilidad importante, ya que la convalecencia puede durar desde días a semanas y en casos graves puede durar hasta meses por lo que es un problema de salud importante en varios países como México, E.U.A., Argentina, Chile, Australia, entre otros (Daly et al., 2001; Grisolia et al., 2005, Isbister et al., 2008). No hay muchos datos estadísticos al respecto, pero los esfuerzos realizados permiten recuperar algunos números. En el reporte anual de la Asociación Estadounidense de Centros de Control de Envenenamientos se reportan 2,757 mordeduras de viuda negra en los 66 centros que abarcan casi la totalidad del territorio estadounidense (Litovitz, 1998). En México, de acuerdo a datos del Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) y la Secretaría de Salud (SSA), se calcula que entre el 4.3 y el 11% de los envenenamientos por animales ponzoñosos son causados por arañas. Por ejemplo, en la Cruz Roja de León, Guanajuato se reportó un promedio de 65 envenenamientos anuales por viuda negra entre los años 1998 y 2001 (Sotelo Cruz et al., 2005; UASLP, 2010). El tratamiento generalmente brindado en casos de latrodectismo en los centros de salud se restringe a analgésicos y relajantes musculares y en zonas rurales, a remedios poco ortodoxos. En E.U.A., el tratamiento principal consiste en opioides y benzodiazepinas aunque sólo son efectivas en el 70% de los pacientes. También se suele administrar calcio intravenoso, metocarbamol y dantroleno, aunque han demostrado ser ineficaces (Daly et al., 2001). El único tratamiento etiológico que existe hasta el momento para tratar envenenamientos son los antivenenos. En el caso del latrodectismo, existen algunos antivenenos disponibles comercialmente: en Australia se cuenta con el RBS-AV (Red-back spider antivenom; Commonwealth Serum Laboratories Ltd., Parkville, Victoria, Australia) derivado de anticuerpos equinos contra L. hasselti purificados, que ha mostrado buenos resultados administrado intramuscular e intravenosamente con un bajo porcentaje de reacciones alérgicas (0.54% de 2,144 casos analizados) (Graudins et al., 2001). 6 Por su parte, en E.U.A. existe Antivenin® (Merck), derivado de anticuerpos equinos contra L. mactans, aunque sólo se aplica en caso de que el paciente no responda a los analgésicos y relajantes, ya que, en algunos casos se han presentado reacciones alérgicas e incluso se ha asociado un fallecimiento a la administración de este antiveneno (Graudins et al., 2001; Daly et al., 2001). En México, desde 1999, se comercializa el antiveneno Aracmyn® producido por el Instituto Bioclon en colaboración con el Instituto de Biotecnología (IBt, UNAM), el cual consiste en fragmentos F(ab’)2 purificados a partir de IgG policlonales de caballo producidas por inmunización con el veneno de L. mactans obtenido mediante estimulación eléctrica, el cual ha demostrado ser efectivo, sin reacciones adversas importantes y se usa regularmente en el tratamiento del latrodectismo (Prud’homme, 2004; Rodríguez, 2008). 1.4. Veneno de Latrodectus spp El veneno de las arañas se produce en el cefalotórax en las glándulas quelicerales, que son estructuras complejas compuestas por varias regiones que secretan productos distintos. En el caso de Latrodectus, se observan tres o cuatro tipos celulares distintos conformando una glándula acinarsimple con un epitelio secretor compuesto por células columnares (Moon & Tillinghast, 1996). El veneno de las viudas se produce por secreción apócrina y consiste en una mezcla compleja de múltiples componentes, muchos de ellos con una toxicidad poco aparente (lisozimas, fosfatasas, etc.) y otros cuya actividad se desconoce por completo (Moon & Tillinghast, 1996; Duan et al., 2006). Sin embargo, en el veneno de Latrodectus se han caracterizado varias proteínas de alto peso molecular con actividad neurotóxica que son las que producen casi la totalidad de los efectos del envenenamiento; cinco de ellas con actividad en insectos denominadas latroinsectotoxinas (α-, β-, γ-, δ- y ε-LIT); una latrocrustatotoxina (α-LCT), activa en crustáceos y la alfa-latrotoxina (αLTX) que es tóxica para vertebrados (Rohou et al., 2007). La composición del veneno de Latrodectus analizada por SDS-PAGE muestra patrones similares, aunque no idénticos para las distintas especies. Además se observan variaciones en el perfil electroforético del veneno relacionadas con la técnica de extracción utilizada (Graudins et al., 2001, Duan et al., 2006). Así mismo, las dosis letales medias (DL50) determinadas en ratónes presentan variaciones según la especie y a la técnica de extracción de veneno. Por ejemplo, las DL50 determinadas utilizando homogenizado total de glándula son 0.59mg/kg para L. tredecimguttatus y 1.3mg/kg para L. mactans (Daly et al., 2001), mientras que al extraer el contenido de la glándula de L. tredecimguttatus con una aguja se obtuvo una dosis letal de 0.39mg/kg (Duan et al., 2006). Comparativamente, por estimulación eléctrica, la DL50 de L. hesperus se calculó en 0.64mg/kg y de L. mactans en 0.26mg/kg. En estas preparaciones se estimó un contenido del 10% p/v de proteína y que alrededor del 10% era αLTX (Daly et al., 2001). 7 Con respecto a la αLTX, se ha calculado la DL50 de esta proteína purificada de veneno de L. tredecimguttatus en 0.02mg/kg (Graudins et al., 2001), sin embargo, puede haber variaciones de acuerdo a la especie y a la eficiencia de la purificación por lo que Ushkaryov et al. (2004) consideran un rango de 0.02- 0.04mg/kg. Utilizando métodos proteómicos, Duan et al. (2006) estiman que el total de latrotoxinas representa entre el 7.3 y el 10.9% de la cantidad total de proteína del veneno, por lo que las diferencias en la estimación de la dosis letal pueden estar relacionadas con la variabilidad en la proporción αLTX con respecto al total de proteína y con la contaminación por otras proteínas celulares o digestivas de acuerdo al método de extracción. 1.5. Alfa-latrotoxina 1.5.1. Características y estructura Las latrotoxinas son una familia de proteínas que van desde 110 hasta 140kDa con similitudes tanto funcionales como estructurales. Todas ellas generan un fuerte incremento en la secreción de neurotransmisores, sin embargo, la αLTX es la única de ellas que ha demostrado actividad en neuronas de vertebrados, por lo que es la mejor conocida y la de mayor interés en los campos de la medicina y la neurofisiología (Volynski et al., 1999; Ushkaryov, 2002; Rohou et al., 2007). En lo que se refiere a su biosíntesis, de acuerdo a los trabajos realizados en L. tredecimguttatus, el gen que codifica para la αLTX consta de 5,408pb con un marco abierto de lectura de 4,203pb sin intrones que codifica para una proteína de 1,401 residuos de aminoácidos (Kiyatkin et al., 1990). Esto genera un precursor de 159kDa compuesto por cuatro dominios: I) un péptido señal (residuos 1-20); II) un dominio N-terminal (residuos 21-470) que se considera importante para la inserción de la toxina en la membrana y que además presenta tres cisteínas que se cree son el sitio de unión a los receptores; III) un “dominio anquirina” (residuos 471-1180) compuesto por alrededor de 20 repeticiones tipo anquirina (una proteína de citoesqueleto), que se especula podría ser importante para la conducción de calcio y formación de tetrámeros, y IV) un dominio C terminal (residuos 1,181-1,381). Esta pro-toxina es inactiva, pero se piensa que es madurada mediante cortes proteolíticos con una enzima tipo furina (como es el caso de otras toxinas, e.g. toxina Shiga o la toxina α de Clostridium septicum) que retira los dominios I y IV, produciendo una proteína madura de aproximadamente 130kDa (Fig. 3.A) (Volyknski et al., 1999; Li et al., 2005; Rohou et al., 2007). 8 Por otra parte, basándose en modelos de estructura tridimensional generados mediante criomicroscopía electrónica y análisis estadísticos de imagen, se ha propuesto que la estructura monomérica de la αLTX madura consiste en tres dominios: cabeza, formada por la parte carboxilo-terminal que se conecta al cuerpo que presenta forma de “L” y el ala, formada por el extremo amino-terminal (Fig. 3A). Con esta misma metodología, también se determinó que la forma estable de la αLTX es dimérica y que además puede sufrir tetramerización facilitada por Ca2+ o Mg2+. De acuerdo a algunos autores, la tetramerización es un factor importante en el mecanismo de acción de la toxina, siendo el tetrámero una molécula anfifílica con un poro central de alrededor de 20Å por donde podrían circular iones y pequeños neurotransmisores citoplasmáticos (Fig. 3B). (Petrenko, 1993; Ashton et al., 2000; Ushkaryov, 2002; Nicholson et al., 2006; Rohou et al., 2007). A B Figura 3. Modelos de la estructura de la alfa-latrotoxina. A) Esquema de la protoxina, procesamiento proteolítico y estructura tridimensional de la αLTX. B) Modelos de oligomerización e inserción en la membrana. Fuente: Modificado de Ushkaryov (2002) 1.5.2. Actividad biológica La αLTX se une a las terminales presinápticas induciendo entrada de calcio, lo cual provoca liberación de neurotransmisores, resultando en la activación de sistemas como el colinérgico y simpatomimético, siendo las sinapsis neuromusculares particularmente notorias en la sintomatología (Singletary et al., 2005; Nicholson et al., 2006). In vivo, se ha observado que la αLTX afecta tanto neuronas sensoriales como motoras, provocando la descarga de neurotransmisores, mientras que in vitro se ha demostrado que tiene efecto sobre todos los tipos neuronales estudiados y también sobre células endócrinas (Ushkaryov, 2002). 9 En células nerviosas, la αLTX estimula la secreción de todas las vesículas disponibles en el botón presináptico, sin importar el tipo de neurotransmisor. Este hecho sugiere que esta proteína actúa sobre los mecanismos de la maquinaria neurosecretora y no sobre algún transmisor en particular (De Potter et al., 1991; Ushkaryov, 2002). 1.5.3. Mecanismo de acción A pesar de que sus efectos se conocen desde hace alrededor de cuatro décadas aún no se comprende por completo el funcionamiento de la αLTX. Se han propuesto varios mecanismos autónomos para el funcionamiento de la αLTX, tanto dependientes como independientes de la presencia de calcio extracelular, basados en la formación de poros y la activación de receptores de la membrana presináptica (Ushkaryov et al., 2004). En la figura 4 se muestra un resumen de dichos mecanismos a manera de esquema. Figura 4. Mecanismos de acción propuestos para la α-latrotoxina (LTX) Fuente: Modificado de Ushkaryov et al. (2004) Los mecanismos dependientes de calcio ocurren tanto en células nerviosas como endócrinas y, en términos generales, consisten en la unión de la toxina a receptores particulares que se encuentran en la membrana presináptica (o en la membrana de la célula endócrina), los cuales presentan una alta afinidad por la proteína. Posteriormente, la porción N-terminal se inserta en la membrana y en presencia de cationes divalentes (Ca2+ ó Mg2+) forma multímeros (2X y 4X) que generan canales catiónicos no selectivos, y es este movimiento iónico (presumiblemente la entrada de Ca2+)el que desencadena la fusión vesicular y la exocitosis (Li et al., 2005; Nicholson et al., 2006). 10 En ausencia de Ca2+ extracelular, la toxina sigue siendo capaz de estimular la fusión de vesículas, aunque más lentamente que en presencia de calcio. El mecanismo independiente de calcio se comprende mucho menos y los resultados experimentales pueden ser confusos, por ejemplo, se desconoce por qué la αLTX puede inducir exocitosis de neuronas en ausencia de Ca2+, pero no así de células endócrinas (Montecucco, 1998; Li et al. 2005). Tanto la selectividad phylum-específica mostrada por las distintas latrotoxinas, como la selectividad a ciertos tipos celulares, apunta a que la acción de estas toxinas está determinada por su unión a receptores específicos. Aunque el mecanismo no está claro aún, se piensa que los receptores no forman parte del canal o poro, pero facilitan notablemente la inserción de la toxina en la membrana. Hasta ahora se han descubierto tres receptores, estructural y funcionalmente muy distintos que, aunque no son indispensables para la formación de los canales catiónicos, facilitan la unión y polimerización de la αLTX: 1) neurexina 1α; 2) CIRL (Ca2+- independent receptor of α-latrotoxin), también llamada latrofilina (CL ó LPH) y 3) tirosina fosfatasa de proteínas σ (PTPσ) (Petrenko, 1993; Matsushita et al., 1999; Ushkaryov et al., 2004; Li et al., 2005). Las neurexinas son una familia de receptores con un único dominio transmembranal característicos de neuronas diferenciadas, cuya unión a la αLTX es calcio-dependiente. Las latrofilinas (CLs) son receptores acoplados a proteínas G, con los cuales la unión de la toxina es independiente de calcio. Se han descrito tres CLs: CL1 que se encuentra en el cerebro y células endócrinas, CL2 que se encuentra distribuida en los tejidos, mientras que CL3 es específica de tejido cerebral; únicamente la CL1 es capaz de unir αLTX (Matsushita et al., 1999). Finalmente, la PTPσ es el último de los receptores descubiertos y, al igual que la latrofilina, puede unirse a la αLTX aún en ausencia de calcio. Se desconocen detalles sobre su papel en el envenenamiento, pero se ha definido como un agente minoritario por su baja abundancia en las purificaciones de receptores por afinidad a αLTX (Ushkaryov, 2002; Ushkaryov et al., 2004; Li et al., 2005; Nicholson et al., 2006). Con respecto a los receptores, también se ha propuesto que pueden estar involucrados en la liberación de neurotransmisores, iniciando una cascada de señalización intracelular activada por la αLTX, la cual sería independiente de la formación de poros, pero podría estar relacionada con liberación de calcio intracelular. Este efecto ha sido estudiado utilizando αLTXN4C, una mutante de αLTX que es incapaz de formar poros tetraméricos, pero que puede unirse a los receptores y se ha observado que la presencia de esta proteína aumenta la frecuencia de mini corrientes post-sinápticas evocadas (mEPSCs) y de corrientes espontáneas. En particular con la latrofilina, al ser un receptor acoplado a proteína G, se cree que su unión con la toxina podría activar a Gαq/11 y ésta a su vez a la fosfolipasa C (PLC), estimulando una hidrólisis Ca2+-dependiente de fosfoinosítidos (Ushkaryov et al., 2004). 11 1.6. Expresión heteróloga en E. coli La expresión heteróloga de proteínas en sistemas bacterianos resulta muy atractiva debido a su rápido crecimiento en sustratos poco costosos. Además, la genética de estos organismos suele estar mejor caracterizada que la de otros organismos modelo y existen en el mercado una gran cantidad de vectores de clonación, cepas, mutantes, etc. La especie bacteriana más comúnmente utilizada para producción heteróloga de proteínas es la bacteria gram-negativa Escherichia coli, probablemente debido a que se conoce relativamente bien su genética y se encuentra bien establecida en casi todos los laboratorios del mundo (Terpe, 2006). Para la producción de proteínas exógenas en bacterias se requiere un vector génico (generalmente plásmidos) con un promotor fuerte, inducible y estrictamente regulado (i.e. con un nivel de expresión basal bajo). Se han descrito muchos promotores para E. coli, entre los más utilizados se encuentran los promotores derivados del operón lac. Todos estos promotores pueden inducirse con el sustrato no hidrolizable isopropil-β- D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (Terpe, 2006). El promotor lac en su estado nativo prácticamente no se utiliza para obtener altos niveles de expresión, sino que se utilizan promotores sintéticos como el Ptac que consiste en la región -35 del promotor trp y la región -10 del promotor lac, lo cual genera un nivel de expresión al menos cinco veces mayor (Terpe, 2006). 1.6.1. Sistema pGEX El sistema pGEX es un sistema diseñado para la expresión y purificación de proteínas fusionadas a una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST). La GST es una proteína de 26kDa que puede ser expresada en E. coli con estructura cristalográfica y actividad enzimática comparable a la proteína nativa. Los vectores de expresión pGEX cuentan con el promotor Ptac que permite altos niveles de expresión y el gen lacIq para mantener bajos niveles de expresión en ausencia del inductor. Estos plásmidos están diseñados para expresar un gen de interés fusionado a la secuencia de GST de Schistosoma japonicum, la cual puede retirarse después de la purificación utilizando una proteasa específica, cuyo sitio de reconocimiento precede al sitio de multiclonaje (MCS). En la figura 5 se muestra un esquema de los vectores pGEX y el MCS del vector pGEX-4T-1 que contiene la secuencia de reconocimiento de la trombina (Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser). 12 Con este sistema, por cromatrografía de afinidad pueden purificarse proteínas de fusión a GST mediante glutatión reducido (GSH) inmovilizado en una matriz de agarosa y eluirse utilizando 10mM GSH. Figura 5. Esquema de los vectores pGEX y sitio de multiclonaje (MCS) del vector pGEX-4T-1 Fuente: pGEX vectors, GST Gene Fusion System (GE Healthcare) 1.6.2. Sistema pMAL El sistema pMAL provee un método de purificación utilizando la proteína de unión a maltosa (MBP, maltose binding protein). Los vectores pMAL permiten fusionar el gen de interés con la secuencia malE que codifica para MBP. Estos vectores tienen un promotor Ptac de manera que son inducibles con IPTG y presentan el gen lacIq que expresa el represor Lac para mantener bajos niveles de expresión en ausencia del inductor (Riggs, 2000). Existe una amplia variedad de vectores pMAL. En general, los vectores pMAL-c carecen del péptido señal en la secuencia malE lo cual genera expresión citoplásmica de la proteína resultando en un mayor nivel de producción. Los vectores pMAL-p contienen la secuencia malE junto con el péptido señal, lo que permite su exportación a periplasma y aunque el nivel de producción es menor, puede favorecerse el correcto plegamiento de proteínas con puentes disulfuro. 13 Estos vectores cuentan con un sitio de corte para una proteasa específica que permite separar la proteína de interés de la MBP después de su purificación. En particular, los vectores pMAL-c5X y pMAL-p5X (Fig. 6) contienen el sitio de corte para Factor Xa (Ile-Glu-Gly-Arg) después del sitio de multiclonaje (MCS) (Riggs, 2000). La purificación de proteínas de fusión a MBP puede realizarse en un sólo paso mediante cromatografía de afinidad usando una matriz de amilosa para unir la proteína y extrayéndola con maltosa en el eluyente. Figura 6. Esquema de los vectores pMAL-c5X y pMAL-p5X Fuente: pMAL Protein Fusion & Purification System Instruction Manual (NEB) 14 II. Antecedentes La mayor parte de los estudios sobre el veneno de Latrodectus han sido realizados por el grupo del Dr. E. Grishin en el Insituto de Química Bioorgánica (AcademiaRusa de Ciencias), utilizando la especie L. tredecimguttatus. Este grupo ha estudiado tanto el veneno como las toxinas que lo componen, particularmente las diversas latrotoxinas. Lograron detectar, secuenciar y clonar el gen que corresponde a la αLTX (Kiyatkin et al., 1990). Asimismo, este grupo logró expresar αLTX recombinante activa mediante el sistema células de insecto-baculovirus, demostrando además, que la recombinante poseía propiedades biológicas semejantes a la toxina nativa (letalidad en ratones, estimulación de la liberación de neurotransmisores y unión específica a neurexina Ia y latrofilina). Sin embargo, el proceso de purificación permitió únicamente un porcentaje de pureza del 40-50% (Volyinski et al., 1999). Por otra parte, en el laboratorio del Dr. Roberto Stock, tomando como referencia la secuencia obtenida por Kiyatkin (1990) se logró clonar y secuenciar el dominio amino-terminal de la αLTX de L. mactans (Prud’homme, 2001). También se obtuvo la secuencia completa del gen de la αLTX de L. mactans y lograron expresarse diversos fragmentos de la proteína en E. coli aunque todos ellos fueron insolubles (Prud’homme, 2004). Posteriormente, logró producirse αLTX recombinante activa utilizando baculovirus-células de insecto y purificando por FPLC (Fast Performance Liquid Cromatography), sin embargo, el rendimiento y porcentaje de pureza obtenidos fueron pobres (<10%) (Rodríguez, 2008). Por su parte, Li et al. (2005) lograron, utilizando la cepa cepa Origami B de E. coli y el sistema pGEX, obtener αLTX de L. tredecimguttatus como una proteína de fusión (GST-α-LTX) y digiriendo esta proteína consiguieron αLTX activa con propiedades semejantes a las de la toxina nativa. Considerando este sistema, en el laboratorio se generó una construcción que contenía la secuencia de la αLTX de L. mactans en un vector pGEX, sin embargo, la digestión con trombina no era posible, quizás por un impedimento estérico, así que se añadió un espaciador de glicinas (glicine kink, gk) entre la GST y la LTX, generando el vector pGEX-4T-GK-αLTX. Utilizando esta nueva construcción fue posible digerir con trombina y obtener una muy pequeña cantidad de αLTX activa (Stock, com. pers.). A pesar de haber conseguido expresar αLTX de L. mactans replicando el sistema utilizado por Li et al. (2005), es necesario aumentar la cantidad de proteína recombinante obtenida por lo que se explorarán algunos de los factores que afectan la producción de proteína en el sistema heterólogo E. coli como las condiciones de expresión, extracción y purificación para optimizar las condiciones de producción de la misma. 15 III. Justificación La producción de αLTX activa, pura y en cantidades suficientes resulta valiosa para el campo de la neurofisiología y dentro de la biotecnología aplicada como inmunógeno para la producción de antivenenos. El mecanismo mediante el cual se lleva a cabo la comunicación neuronal es un fenómeno complejo y por lo mismo, resulta complicado de comprender en su totalidad. Una de las aproximaciones más productivas para el estudio del funcionamiento neuronal ha sido el uso de neurotoxinas ya que pueden facilitar la disección de los mecanismos que subyacen los distintos tipos de sinapsis y caracterizar a las moléculas que participan (Montecucco, 1998). La αLTX, por sus peculiares efectos, ha sido muy útil en el establecimiento de la teoría vesicular de liberación de neurotransmisores y en el descubrimiento de receptores específicos de membranas presinápticas como neurexinas y latrofilinas. Sin embargo, por sus características y su funcionamiento, a pesar del esfuerzo invertido en el estudio de αLTX y sus propiedades, aún quedan muchas preguntas por responder y los mecanismos planteados son incompletos y algunas veces contradictorios. La realización de estudios de esta índole requiere cantidades suficientes de proteína activa con un alto porcentaje de pureza y obtenerla a partir de extracción de glándulas u ordeña es costoso y complicado; además, su separación del resto de los componentes del veneno ha resultado ser laboriosa, poco eficiente y con un grado importante de contaminación por lo que resulta de interés su producción como proteína recombinante (Petrenko, 1993; Montecucco, 1998; Ushkaryov et al., 2004; Rohou et al., 2007). Por otra parte, la producción de αLTX recombinante sería un recurso que permitiría reducir tanto los costos de producción, como los riesgos que conlleva la ordeña de arañas, utilizando la proteína como inmunógeno sustituto en la producción del faboterápico Aracmyn® (Rodríguez, 2008). Siendo la αLTX la única causante del envenenamiento en humanos, el antiveneno podría generarse inmunizando los caballos de producción con la proteína recombinante como se ha realizado en el caso del antiveneno anti-Loxosceles (Loxmyn®). Asimismo, se ha observado que existe reconocimiento para-específico de un antiveneno generado contra una especie hacia otras especies de Latrodectus y parece ser que L. mactans es una de las especies con la toxicidad más alta y con mayor importancia médica, en particular en América del Norte. Siendo así, la obtención de αLTX recombinante de L. mactans, permitiría obtener ventajas competitivas importantes para el antiveneno Aracmyn®, en especial considerando las reacciones adversas del Antivenin® (Merck). 16 Por ello, en el presente trabajo se pretende encontrar las condiciones que permitan obtener αLTX recombinante activa de L. mactans utilizando E. coli, modificando algunas de las variables que afectan la expresión de proteína, la extracción y tomando en cuenta intentos previos, se pondrá particular énfasis en la optimización de las condiciones de purificación de la misma. IV. Objetivos Objetivo general • Producción y purificación de αLTX recombinante activa mediante expresión heteróloga en E. coli. Objetivos particulares • Caracterización de la expresión y purificación de αLTX en el sistema pGEX a partir de la proteína de fusión GST-LTX. • Construcción de los vectores basados en el sistema pMAL para la expresión de αLTX como proteína de fusión MBP-LTX. • Determinación de las condiciones de expresión y purificación tanto de la proteína de fusión como de la αLTX madura producida en los vectores pMAL. 17 V. Materiales y métodos 5.1. Materiales 5.1.1. Reactivos Tabla 1. Reactivos comerciales utilizados Reactivo Marca comercial IPTG (Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido) Fermentas ® Sefarosa 4B (Cyanogen Bromide-activated Sepharose 4B) Sigma Aldrich ® GST•Bind resin Novagen® Glutathione Sepharose 4B GE® BCIP:NBT (Bromo-Chloro-Indolyl Phosphate:Nitro Blue Tetrazolium) Zymed ® complete Mini, EDTA-free® Roche ® SYPRO® Ruby Protein Gel Stain Molecular probes™ 5.1.2. Cepas bacterianas y medios de cultivo Tabla 2. Cepas de E. coli (BL21) utilizadas Cepa Marca comercial Genotipo Origami B ™ Novagen® F– ompT hsdSB (rB – mB –) gal dcm lacY1 aphC gor522::Tn10 trxB (KanR, TetR) NEB Express ® New England Biolabs® fhuA2 [lon] ompT gal sulA11 R(mcr-73::miniTn10--TetS)2 [dcm] R(zgb- 210::Tn10--TetS) endA1 Δ(mcrC-mrr)114::IS10. OverExpess ™ C41 Lucigen® F– ompT hsdSB (rB – mB –) gal dcm (DE3) OverExpess ™ C43 Lucigen® F– ompT hsdSB (rB – mB –) gal dcm (DE3) XL1-Blue Stratagene® recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] XL2-Blue Stratagene® recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)] Rosetta-gami™ B Novagen® F– ompT hsdSB (rB – mB –) gal dcm lacY1 aphC gor522::Tn10 trxB pLacIRARE (CamR, KanR, TetR) Tabla 3. Medios de cultivo Medio Composición LB (Lysogeny broth) 1% p/v triptona (10g/l) 0.5% p/v extracto de levadura (5g/l) 0.5% p/v NaCl (5g/l) RB (Rich broth) 2% p/v triptona (20g/l) 0.5% p/v extracto de levadura (5g/l) 10mM NaCl(0.584g/l) 0.2% p/v glucosa (2g/l) SOC (Super optimal broth with catabolite repression) 2% p/v triptona (20g/l) 0.5% p/v extracto de levadura (5g/l) 8.6mM NaCl (0.5g/l) 2.5mM KCl (0.186g/l) 10mM MgCl2 (0.952g/l) o 20mM MgSO4 (2.408g/l) 20mM glucosa (3.603g/l) 18 5.1.3. Soluciones y amortiguadores Tabla 4. Soluciones y amortiguadores Amortiguador Composición PBS (Phosphate buffered saline) 137mM NaCl 2.7mM KCl 10mM Na2HPO4 2mM KH2PO4 pH 8 PSS (Physiological saline solution) 145mM NaCl 5.6mM KCl 2.2mM CaCl2 0.5mM MgCl2 5.6mM glucosa 15mM HEPES pH 7.4 CB (Column buffer) 20mM Tris/HCl 200mM NaCl 1mM EDTA Azul de Coomassie 50% metanol 10% ácido acético 0.2% azul de Coomasie R250 Solución de destinción 10% metanol 10% ácido acético Buffer de transferencia 39 mM glicina 48 mM Tris-base 0.037% SDS 20% metanol CAPS 10 mM CAPS 10% metanol pH 11 TBST (Tris Buffered Saline Tween 20) 10 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 0.05% Tween 20 pH 7.5 Buffer TB (Transformation Buffer) 10 mM PIPES-ácido 15 mM CaCl2-2H2O 250 mM KCl 55 mM MnCl2-4H2O pH 6.7 TFBI 30 mM KOAc 100 mM RbCl 10 mM CaCl2 50 mM MnCl2 15% p/v glicerol pH 5.8 TFBII 10 mM MOPS ó PIPES 75 mM CaCl2 10 mM RbCl 15% p/v glicerol pH 6.5 Buffer TAE EtBr 40mM Tris 20mM HAc 1mM EDTA 0.00002% EtBr 19 5.1.4. Biología molecular 5.1.4.1. Vectores En el presente trabajo se utilizaron los vectores comerciales pMAL-p5x y pMAL-c5x de NEB y varios vectores que habian sido previamente generados en el laboratorio durante el trabajo con la αLTX (Tabla 5). Para obtener los perfiles de restricción y realizar el diseño de los vectores de expresión se utilizó el software Gene Construction Kit (GCK 2.0, Textco) Este software se utilizó para mapear los plásmidos (gráficamente y por secuencia), verificar que la secuencia de αLTX se encontrara en fase con el marco de lectura abierta de la MBP (malE) y para generar simulaciones de geles en donde se observase el patrón de bandeo esperado del corte con determinadas enzimas. Tabla 5. Vectores plasmídicos utilizados para la subclonación de αLTX en los vectores pMAL Vector Mapa Descripción pMelBacA-LTX Vector para expresión en células de insecto generado en el laboratorio a partir del pMelBacA (Invitrogen). Contiene la secuencia αLTX (rojo) corriente abajo de la secuencia que codifica para el péptido señal de la melitina (verde). (Rodríguez, 2008) Se utilizaron los sitios BamHI y EcoRI para escindir la primera parte de la secuencia de αLTX. PCR2.1TOPO-5Xenl2 Vector generado en el laboratorio a partir del pCR2.1-TOPO (Invitrogen) que contiene los últimos 743 codones del dominio anquirina de la αLTX (rojo). (Rodríguez, 2008) Se utilizaron los sitios EcoRI que flanquean el frangmento de αLTX para realizar la subclonación. pGEX-4T-GK-αLTX Vector de expresión generado en el laboratorio a partir del pGEX-4T-1. Contiene un espacidaor de glicina (azul) y la secuencia αLTX (rojo) corriente abajo de la secuencia que codifica para GST (verde). De este vector se tomó el fragmento BamHI/NdeI que contiene el espaciador de glicinas para insertarlo en los vectores pMAL. 20 5.1.4.2. Enzimas Las enzimas de restricción, la Taq DNA polimerasa y la T4 DNA ligasa que se utilizaron son de la marca New England Biolabs (NEB). En las defosforilaciones se utilizó la fosfatasa alcalina (AP) de Roche y la Antarctic phosphatase de NEB. 5.1.4.3. Oligonucleótidos Para comprobar la presencia de inserto en las clonas provenientes de las ligaciones se realizaron reacciones de PCR utilizando los iniciadores 5’V y 3’VI para pMAL:pMelBac y 5’XI y 3’XII para pMALMB:TOPO. Los vectores pMALP1gkLTX y pMALC2gkLTX fueron secuenciados por el método de dideoxinucléotidos terminadores de la síntesis de cadena (Sanger et al., 1977) en la Unidad de Síntesis del Instituto de Biotecnología para verificar que la secuencia de αLTX coincidiera con la reportada por Prud’homme (2004) (Anexo 1). Los oligonucleótidos utilizados tanto en las PCRs como en la secuenciación se muestran en la Tabla 6, mientras que su ubicación dentro del gen de la αLTX se muestra en el Anexo 1. Los oligonucleótidos pMAL 5’I y pMAL 3’I fueron sintetizados en la Unidad de Síntesis del Instituto de Biotecnología para este trabajo. El oligonucleótido pMAL 5’I hibrida al final de la secuencia de MBP mientras que el pMAL 3’I hibrida en el vector alrededor de 100 bases corriente abajo del MCS. Tabla 6. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados en la secuenciación de αLTX y ensayos de PCR Nombre Secuencia (5’ – 3’) pMAL 5' I GGT CGT CAG ACT GTC GAT 5’ V CCC GGA TCC GAA GGA GAA GAA TTA ACT 5' VIII TTT GGA TCC ACC GTT ACC CAT GTT GCT TC 5' IX TTT GGA TCC ACA TAT ATC TCG GTT ATG TTT 5' new CCT GTT TTC AGA AAA TTT GAC 5' XI AAC CAA ATC AGT ATT GAT 3' IV TTT TCT CTA CCA GTT TAG T 3' VI GGG GTC GAC TTA AAT GAA ATT TGA TAG GTA TGG TGT 3' XII AGT ATC AGT TTT GCT TCC 3' XV GGG GTC GAC TTA GTT AAG GGG AGT GTC GGA ATT pMAL 3' I CCA CGT TCA AAT CCG CTC 21 5.1.5. Kits Tabla 7. Kits utilizados Kit Marca comercial Uso pMAL Protein Fusion & Purification System™ New England Biolabs ® Construcción de los vectores de expresión de MBP-LTX, purificación y procesamiento de MBP-LTX. High Pure Plasmid Isolation Kit Roche® Purificación de plásmidos en pequeña escala (mini-prep). Plasmid Midiprep Kit Biorad® Purificación de plásmidos en mediana escala (midi-prep). High Pure PCR Product Purification Kit Roche ® Purificación de fragmentos de DNA a partir de geles de agarosa. 22 5.2. Metodología 5.2.1. Expresión de proteínas recombinantes en E. coli Sistema pGEX Los cultivos se llevaron a cabo inoculando medio LB (100 µg/ml ampicilina) con la cepa Origami B™ transformada con el plásmido correspondiente, incubando hasta alcanzar la densidad óptica (DO600) recomendada (1.6 para pGEX-4T-1 y 0.8 para pGEX-4T-GK-LTX) y tomando una muestra de cultivo (sin inducir, s/ind) para luego inducir con IPTG. Los cultivos de pGEX-4T-1 se indujeron con 1mM IPTG durante toda la noche a 20ºC en agitación constante. Los cultivos de pGEX-4T-GK-LTX se indujeron con cantidades variables de IPTG con tiempos de inducción generalmente de 15h a 25ºC. Pasado el tiempo de inducción, se cosecharon los cultivos, tomando nuevamente una muestra (cultivo inducido, ind) y monitoreando la DO600. Se cosechó la pastilla celular centrifugando a 12,800g durante 10min a 4ºC. Las pastillas celulares fueron resuspendidas en PBS pH 7.4 + 1% Triton X-100 en el caso de pGEX-4T-1 y en el buffer correspondiente de acuerdo a la prueba que se estuviera haciendo con pGEX-4T-GK-LTX. Sistema pMAL Para la expresión de proteína en el sistema pMAL se inocularon matraces de medio RB (Rich broth) con la cepa NEB Express® transformada con el plásmido correspondiente (i.e. pMAL-p5x, pMAL-c5x, pMALP1LTX, pMALC2LTX, pMALP1gkLTX o pMALC2gkLTX) y se incubó hasta una DO600 ≈ 0.5, tomando una muestra de cultivo (cultivo sin inducir, s/ind) para luego inducir con concentraciones variables de IPTG. Los cultivos se cosecharon después de tiempos de inducción variables de acuerdo a la concentración y temperatura de inducción (cultivo inducido, ind). Se centrifugaron a 4,000g por 20min y resuspendieron en 25ml de buffer de columna (column buffer, CB) por litro de cultivo. El sedimento resuspendido se congeló a -20ºC al menos durante 12h y se dejaron descongelar en hielo para proceder a la lisis y extracción. 23 5.2.2. Extracción de proteínas solubles Para la extracción de proteínas recombinantes de los cultivos celulares con las construcciones de expresión de αLTX se utilizaron dos métodos: sonicación y cavitación en prensa de French. Extracción de proteínas por sonicación Para lisarlos cultivos del sistema pGEX, las células bacterianas fueron colocadas en un baño de hielo para luego sonicar (200W) con 6 pulsos de 30seg con 1min de reposo entre cada pulso. El lisado se centrifugó a 14,000rpm durante 25min a 4ºC, se recuperó el sobrenadante (SN) y se tomó una muestra del pellet. Para el sistema pMAL, de acuerdo a las recomendaciones del proveedor, se colocó la pastilla bacteriana en un baño de hielo y se realizaron ocho pulsos de sonicación (200W) de 15s por 30s de descanso (2min totales). El lisado luego se centrifugó a 11,500rpm por 35min, se colectó el sobrenadante (extracto crudo, EC) y se tomó una muestra del pellet. El extracto crudo se congeló a -20ºC durante al menos 12h. Para su purificación se descongeló en hielo y se diluyó 1:6 con CB (extracto crudo diluido, ECD) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Extracción de proteínas por cavitación en prensa de French Para lisar en la prensa de French, las pastillas bacterianas del sistema pGEX fueron lavadas resuspendiendo en PBS pH 8, centrifugadas a 2,000g y resuspendidas en PBS suplementado con inhibidores de proteasas (complete Mini, EDTA-free®, Roche). La pastilla celular se resuspendió en 3 ó 30ml según el volumen de cultivo (50ml de cultivo en 3ml de PBS, 250-500ml en 30ml). Para la celda de 3ml, la presión utilizada fue de 900psi y para la de 30ml fue de 1200psi. En las extracciones se sometió al precipitado a 3 rondas de compresión/descompresión, para luego centrifugar a 13,400rpm por 10min a 4ºC tomando muestras tanto del sobrenadante (SF3) como del sedimento (PF3). El sedimento volvió a resuspenderse en el volumen previamente utilizado y sometido a 3 pases más en la prensa, después de centrifugar nuevamente en las mismas condiciones se tomaron muestras de sobrenadante (SF6) y sedimentos intermedios (PF6) o del sedimento final (pellet), uniendo después los sobrenadantes (sobrenadante completo, C). Para lisar en la prensa de French las pastillas bacterianas del sistema pMAL, éstas se dejaron descongelar y se ajustó el volumen a 30ml con PBS pH 8. En las extracciones se sometió al precipitado a 3 rondas de compresión a 1200psi para luego centrifugar a 17,000g por 25min a 4ºC tomando muestras tanto del sobrenadante (S) como del pellet. 24 Extracción de proteínas del periplasma bacteriano Para extraer las proteínas del periplasma en el sistema pMAL, se cosechó el cultivo inducido centrifugando a 4,000g por 20min. La pastilla celular se resuspendió en 400ml de Tris/HCl 30mM pH 8 + 20% sacarosa, se añadió EDTA hasta alcanzar 1mM y se incubó por 10min a temperatura ambiente agitando suavemente. Posteriormente, se centrifugó a 8,000g por 20min a 4ºC, se desechó el sobrenadante y el precipitado fue resuspendido en 400ml de MgSO4 5mM frío por litro de cultivo, agitando suavemente por 10min en un baño de hielo. Se centrifugó nuevamente en las mismas condiciones, se recuperó el sobrenadante llamado fluido del choque osmótico (osmotic shock fluid, OSF) y se tomó una muestra del pellet. Al OSF se le agregaron 8ml de 1M Tris/HCl pH 7.4 por litro de cultivo y se cargó en la columna para su purificación. 5.2.3. Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad Sistema pGEX Para la purificación por afinidad, se utilizó 1ml de resina GST•Bind resin (Novagen®) o Glutathione Sepharose 4B (GE®) recirculando el sobrenadante de cultivo (C) cinco veces por la columna (recirculante, R), se lavó la resina con PBS pH 7.4 (W1 y W2), para posteriormente eluir 10 fracciones, las primeras cinco con un minuto de reposo en la columna y las siguientes 5 sin reposo (Fr 1-5: 0.5ml y Fr 6-10: 1ml). El eluyente utilizado fue glutatión (GSH) 10mM en Tris/HCl 50mM + NaCl 75mM para pGEX-4T-1 y GSH 50mM en PBS pH 8 precalentado a 37ºC para pGEX-4T-GK-LTX. Se tomaron muestras de resina previo a la purificación (resina previa, Rp), antes de la elución para verificar la unión de la proteína a la resina (resina acoplada, Ra) y otra posterior a la elución (resina desacoplada, Rd) para comprobar si la elución de la proteína fue completa. Sistema pMAL Para la purificación de proteína proveniente del sistema pMAL, se utilizó resina acoplada a amilosa provista en el kit (Amylose resin, NEB). La resina fue lavada con 5 volúmenes de CB antes de cargar el fluido del choque osmótico (OSF) o el extracto crudo diluído (ECD) y éstos se hicieron recircular 3 veces por la columna (recirculante, R). Se lavó la columna con 12 volúmenes de CB, tomando muestras del primer (W1) y último lavado (W2). Para la elución se utilizó 10mM maltosa en CB y se eluyeron 10 fracciones (Fr 1-10), las primeras cinco (300 ó 400µl) con un minuto de reposo y las siguientes cinco, con el doble de volumen, sin reposo. Se tomaron muestras de resina, antes (resina previa, Rp), durante (resina acoplada, Ra) y después de la purificación (resina desacoplada, Rd). Finalmente, se regeneró la resina lavando con agua, 0.1% SDS y CB, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. 25 5.2.4. Purificación de anticuerpos anti-GST Se contaba con un conejo New Zeland White (NZW) inmunizado con GST. Al término del esquema el conejo se sangró a blanco para purificar los anticuerpos producidos contra GST, obteniendo 188g de sangre y 80ml de suero, de los cuales se tomaron 10ml para purificación de anticuerpos. La GST purificada se dializó contra NaHCO3 100mM + NaCl 150mM pH 8.5. Para acoplar la GST dializada a la sefarosa 4B, se hidrataron 350mg de resina con HCl 1mM. Posteriormente, la resina se lavó con HCl y con NaHCO3 100mM + NaCl 150mM pH 8.5 y se incubó por 2h con ≈1mg de GST en 5ml de NaHCO3 a temperatura ambiente y en agitación constante. Se alcanzó un máximo de acoplamiento de ≈85%. Se lavó la resina con Tris/HCl 0.1M pH 8 + NaCl 150mM y se almacenó a 4ºC en este mismo buffer agregando 0.02% azida de sodio. Para la purificación de anticuerpos anti-GST, se lavó la resina con Tris/HCl 0.1M pH 8 NaCl 150mM para retirar la azida de sodio y se pasó el suero por la columna recirculando 5 veces, se lavó nuevamente la resina y se eluyeron 23 fracciones con 500µl HAc 0.1M incorporando tubos con 500µl de Tris/HCl 1M pH 8 para neutralizar el pH. Se tomó la A280 de las fracciones y se observó la formación de dos picos representando dos grupos de anticuerpos con diferente afinidad: pool 1 (Frs 3-10) y pool 2 (Frs 11-17) y cada uno fue dializado contra PBS pH 7.4 y cuantificado por el método del ácido binciconínico (bicinchoninic acid assay, BCA). 5.2.5. Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) Los geles de poliacrilamida para electroforesis de proteínas (Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) fueron preparados al 10% para las muestras provenientes del sistema pGEX y muestras de MBP, y 8% para MBP-LTX corriendo a 100V, voltaje constante. El marcador de peso molecular (MPM) utilizado fue el Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175kDa) de New England Biolabs Inc. La tinción de los geles se realizó con Azul de Coomassie R-250 por al menos una hora en agitación orbital, para luego desteñir en solución de destinción al menos 4h. En todos los geles, las muestras de lisado bacteriano fueron ajustadas de acuerdo a la densidad óptica para normalizar la carga de manera que la cantidad de proteína observada fuese independiente de las diferencias en la cantidad de células. Se igualó la DO600 de todas las muestras a la densidad más baja de las contenidas en cada gel, ajustando proporcionalmente el volúmen de cada muestra con agua destilada. 26 5.2.6. Western blot Los Western blots (WB) fueron realizados a partir de SDS-PAGE llevada a cabo bajo las condiciones previamente descritas. Para los WB con transferencia semi-húmeda se utilizaron membranas de nitrocelulosa (Biorad®), transfiriendo 90min a 400mA corriente constante, humedeciendocon buffer de transferencia, mientras que para los WB con transferencia húmeda se utilizaron membranas de Inmobilon-P (Millipore®), transfiriendo 150min a 260mA corriente constante en amortiguador CAPS frío. Las membranas se bloquearon con 0.05% leche descremada y se lavaron con TBST. Como primer anticuerpo, en el sistema pGEX se utilizó el pool 1 de anticuerpos de conejo anti-GST purificados, en una dilución 1:1000 en TBST; mientras que en el sistema pMAL se utilizaron los anticuerpos policlonales de conejo anti-MBP provistos en el kit en una dilución 1: 10,000 en TBST. Como segundo anticuerpo, se utilizó cabra anti-conejo acoplado a fosfatasa alcalina (Goat Anti-rabbit, Zymax ®) en una dilución 1: 2,000 en TBST. Se reveló utilizando el sustrato BCIP:NBT (Roche®) y se detuvo la reacción con EDTA 5 mM. 5.2.7. Análisis de imágenes Las modificaciones al contraste, brillo y color de las imágenes fueron realizadas utilizando el programa Adobe® Photoshop® CS4. Las estimaciones de porcentaje de pureza y cantidad de proteína fueron realizadas mediante el análisis de los geles de SDS-PAGE y las membranas de Western blot con el software ImageJ 1.45m (Ferreira & Rasband, 2011). 5.2.8. Biología molecular 5.2.8.1. Electroforesis de ADN La separación electroforética de ácidos nucleicos tanto para purificación de bandas como para análisis de restricción se llevó a cabo en geles de agarosa al 0.8 ó 1% en buffer TAE (EtBr). 5.2.8.2. Preparación de células competentes Las células competentes de la cepa XL1-Blue se prepararon por el método de calcio que consiste en inocular un matraz de LB + 2 mM MgCl2 e incubar hasta una DO600 de 0.6, incubar en hielo entre 10 y 15 min y manteniendo todo el material a 4ºC, centrifugar a 6,500rpm por 10 min., resuspender en buffer TB, centrifugar en las mismas condiciones y resuspender suavemente en TB frío (20 ml por cada litro de cultivo). Se añadió dimetilsulfóxido (DMSO), poco a poco y con agitación manual suave hasta una concentración final de ≈7%. Se prepararon alícuotas, se congelan con hielo seco/etanol y se almacenan a -80ºC. 27 Por recomendación del proveedor, las células competentes de la cepa NEB Express fueron preparadas por el protocolo de cloruro de rubidio. Se inoculó medio LB sumplementado con MgSO4 20 mM y se incubó hasta una DO600 de 0.4- 0.6, se centrifugó a 5,000 rpm, 5 min. a 4ºC y resuspendió en TFBI frío (400ml/litro de cultivo). Se centrifugó nuevamente y se resuspendió en TFBII frío (40ml/litro de cultivo), se incubó en hielo aproximadamente 30 min y las alícuotas se congelaron en hielo seco/etanol para luego almacenarlas a -80ºC. 5.2.8.3. Digestión y defosforilación de ácidos nucleicos Las digestiones fueron realizadas durante una hora a 37ºC con los amortiguadores y suplementos (BSA) recomendados por el proveedor y las defosforilaciones también fueron realizadas siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. 5.2.8.4. Ligación de fragmentos de DNA Las ligaciones se llevaron a cabo utilizando T4 DNA ligasa (NEB), se utilizaron distintas proporciones molares vector:inserto (en general 1:3, 1:5 y 1:7) y se ligaron durante 3h a temperatura ambiente y/o durante toda la noche a 16ºC. 5.2.8.5. Transformación Las ligaciones y los controles pertinentes fueron transformados en XL1-Blue o XL2-Blue con un choque térmico de 30s a 42ºC, recuperadas una hora en medio SOC a 37ºC y sembradas en placas de LB agar (100µg/ml ampicilina) para su selección. 5.2.8.6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Se utilizaron reacciones de PCR (Polymerase Chain Reaction) para analizar las colonias provenientes de las ligaciones y verificar si contenían el inserto esperado. Las reacciones de PCR consistieron en una etapa inicial de 2 min de desnaturalización a 94ºC; 30 ciclos de amplificación con una fase de desnaturalización de 1min a 94ºC, 2 min de hibridación, 2min de elongación a 72ºC; y una fase final de elongación de 10 min a 72ºC. Para el analisis de las clonas provenientes de la ligación pMAL:pMelBac se realizaron PCRs de colonia utilizando los oligonucleótidos 5’V y 3’IV con una temperatura de hibridación de 55ºC, mientras que para verificar las clonas resultado de la ligación pMALMB:TOPO se emplearon el 5’XI y el 3’XII hibridando a 41ºC. 28 5.2.9. Construcción de los vectores pMALP1gkLTX y pMALC2gkLTX 5.2.9.1. Modificación al sitio de multiclonaje En los vectores con los que se contaba en el laboratorio, la secuencia de αLTX se encontraba flanqueada por los sitios de restricción BamHI/SalI, pero en el sitio de multiclonaje (MCS) de los vectores pMAL-5x (Fig. 7A) estos sitios se encuentran en el orden inverso, por lo cual no podían ser utilizados para subclonar el gen. Se decidió utilizar el sitio BamHI para integrar la secuencia de LTX al vector, pero para evitar la adición de residuos de aminoácidos correspondientes al MCS en la toxina final, se decidió hacer una modificación al MCS digiriendo con XmnI/EcoRV y autoligando el vector (Fig. 7B) para generar los vectores pMALP1 (derivado de pMAL-p5x) (Fig. 7C). y pMALC2 (derivado de pMAL-c5x) (Fig. 7D). La modificación al MCS fue revisada por análisis de restricción (BamHI, SalI, BglII y EcoRV) y por secuenciación. A B ATC GAG GGA AGG ATC GTC GAC GGA TCC GAA TTC CCT GCA GGT TAG CTC CCT TCC TAG CAG CTG CCT AGG CTT AAG GGA CGT CCA I E G R I V D G S E F P A G SalI BamHI EcoRI Sitio de corte del Factor Xa XmnI/EcoRV C 300 pMALP1 (5722 bp) EcoRI PstI ApaI BglII SalI BamHI D Figura 7. Modificación realizada al sitio de multiclonaje (MCS) de los vectores pMAL-c5X y pMAL-p5X A) Mapa del sitio de multiclonaje original. B) Sitio de multiclonaje modificado, en azul se marca la región de reconocimiento del Factor Xa. C) Plásmido pMALP1, derivado de pMAL-p5x. D) Plásmido pMALC2, derivado de pMAL-c5x. Fuente: pMAL Protein Fusion & Purification System Instruction Manual (NEB), las imágenes de las modificaciones fueron generadas utilizando el Gene Construction Kit, v2.0. 300 pMALC2 (5647 bp) SalI BamHI EcoRI PstI HindIII ApaI BglII 29 5.2.9.2. Estrategia de clonación del cDNA de αLTX en los vectores pMAL Figura 8. Estrategia utilizada par a clonar el cDNA de la LTX en los vectores pMAL En el esquema se muestran la LTX o fragmentos de ella ( LTX) en rojo; en azul, la MBP; en verde, la GST y en morado, el espaciador de glicinas (gk). 30 Se probaron distintas estrategias para clonar la secuencia de LTX en los vectores pMAL en un sólo paso de clonación, sin embargo, no se obtuvieron clonas que contuvieran el inserto, por lo que se decidió clonar la αLTX en partes, utilizando tres plásmidos donadores, generados previamente en el laboratorio (Tabla 5). La estrategia utilizada consiste en tres pasos de clonación (Fig. 8): I) purificar la primera parte de la secuencia de LTX a partir del vector pMelBacA-LTX y subclonarla en los vectores pMAL (pMALP1 y pMALC2) utilizando los sitios BamHI/EcoRI, generando los vectores pMALP1MB y pMALC2MB II) clonar la segunda parte de la secuencia de latrotoxina extrayéndola del vector PCR2.1TOPO-5’Xenl2 e insertándola en los vectores pMALMB utilizando el sitio EcoRI, generando los vectores pMALP1LTX y pMALC2LTX III) insertar el espaciador de glicinas (glicine kink, gk) reemplazando el fragmento BamHI/NdeI de los vectores pMAL-LTX por el segmento BamHI/NdeI de pGEX-4T-GK-LTX que contiene el espaciador, generando los vectores pMALP1gkLTX y pMALC2gkLTX. 31 VI. Resultados Los resultados del presente trabajo se dividen en dos secciones principales. La primera describe los ensayos de expresión y purificación de αLTX recombinante utilizando el sistema pGEX, mediante la construcción pGEX-4T-GK-αLTX que expresa la proteína de fusión GST-LTX. La segunda, comprende eltrabajo realizado con los vectores pMAL (pMAL-p5x y pMAL-c5x), describe la obtención de dos construcciones de expresión de MBP-LTX (pMALP1gkLTX y pMALC2gkLTX) y las pruebas de expresión y purificación de proteína recombinante realizadas con éstas. 6.1. Expresión de αLTX como GST-LTX 6.1.1. Expresión y purificación de GST Con el propósito de poner a punto el funcionamiento del sistema y observar el comportamiento de sus elementos en condiciones basales, se realizó un ensayo de expresión y purificación de la proteína etiqueta GST. Para llevar a cabo este ensayo, se utilizó un cultivo de la cepa Origami B transformada con el plásmido pGEX-4T-1 tomando las muestras correspondientes. Se analizaron mediante SDS-PAGE las muestras provenientes del cultivo y la purificación (Fig. 9A), asi como las fracciones obtenidas (Fig. 9B). 32 En la figura 9, podemos observar la inducción de GST por IPTG (Fig. 9A, s/ind e ind). Con respecto a la extracción, puede verse un poco de GST que permanece en los residuos celulares (pellet), pero la mayor parte puede ser extraída por sonicación y se encuentra en el sobrenadante (SN). La purificación muestra que la resina previa, al haber sido utilizada anteriormente aún conserva un poco de proteína (Rp) y posterior a la elución, una pequeña cantidad de GST continúa unida a la resina (Rd). Además, puede advertirse que la cantidad de proteína disponible excedió la capacidad de la resina utilizada por lo que mucha GST se perdió en el recirculante (R), sin embargo, en las fracciones se encuentra una cantidad apreciable de proteína, siendo las Frs 1-5 las más enriquecidas. Estas fracciones se mezclaron y dializaron contra Tris/HCl 50mM pH 7.5. La concentración de proteína se determinó por un el método del ácido bicinconínico (BCA) resultando en 1.3mg/ml (aprox. 3.9mg de proteína total). Este experimento demuestra que la GST se produce en la cepa Origami B en cantidades apreciables y que la GST puede ser purificada por afinidad exitosamente. 6.1.2. Ensayos de expresión y purificación de GST-LTX Se realizaron varios ensayos probando distintas condiciones para buscar en cuales se obtenía una mejor producción de GST-LTX. Las variables exploradas corresponden a tres categorías: expresión, extracción y purificación. 6.1.2.1. Expresión de GST-LTX Contando con la información sobre la optimización de temperatura, densidad óptica y tiempo de inducción optimizados en el laboratorio (Ramos-Cerrillo, com. pers.), se realizaron algunas pruebas de expresión variando la cepa de E. coli y la concentración de inductor para buscar las condiciones en las cuales la expresión de GST-LTX fuera mayor. Cepas de E. coli Se probaron 4 cepas distintas de E. coli transformadas con el plásmido pGEX-4T-GK-LTX: Origami B, C41, C43 y NEB Express. Una vez alcanzada una DO600 ≈0.8 se tomaron muestras (s/ind), se indujeron todos los cultivos y 15 horas post inducción (hpi) se tomó una muestra de cada cultivo (ind). Las muestras se ajustaron de acuerdo a la densidad óptica y se analizaron por WB (Fig. 10). 33 De acuerdo al WB, en todas las cepas se presenta un patrón similar: una banda distinguible en el peso que corresponde a la GST-LTX y una serie de bandas de pesos moleculares inferiores que son reconocidas por los anticuerpos anti-GST, por lo que consisten en formas incompletas de la proteína de fusión. La producción de GST-LTX de las cepas Origami B y C41 es similar, sin embargo, Origami B presenta una menor proporción de subproductos con respecto a la cepa C41. La presencia de GST en los subproductos resultará en su unión a la columna de afinidad de manera que co-purificaran con la fusión completa, contaminándola, por lo cual se decidió continuar los experimentos utilizando la cepa Origami B. Concentración de IPTG Se hicieron pruebas de inducción con distintas concentraciones de IPTG: 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5 y 1mM. Se indujo con cada una de las concentraciones por 15h a 25ºC y se tomó una muestra de cada cultivo, las cuales se analizaron mediante WB con transferencia semi-húmeda ajustando la densidad óptica. En las condiciones probadas, las concentraciones que muestran una mayor producción de GST-LTX son 0.5mM y 1mM. Estas concentraciones presentan un rendimiento similar por lo que se decidió utilizar 0.5mM para experimentos posteriores. 34 6.1.2.2. Extracción de proteínas solubles Lisis por sonicación Para obtener GST-LTX se prepararó un cultivo para lisis por sonicación y purificación por afinidad. Se analizaron las muestras de cultivo, las muestras correspondientes a la cromatografía y las primeras 5 fracciones mediante WB con transferencia semi-húmeda (Fig. 11). Con base en las muestras analizadas en la figura 11A, puede apreciarse que la mayor parte de la proteína de fusión producida permanece retenida en el pellet. Además, la GST-LTX parece no unirse fácilmente a la resina ya que el sobrenadante previo (SN) y posterior a la purificación (R) parecen tener una cantidad similar de proteína de fusión y en los lavados continúa observándose salida de proteína de la resina (W1 y W2). Además, la proteína de fusión que logra unirse a la resina (Rp y Ra) no puede eluirse en las condiciones probadas y permanece en su mayoría unida a la resina (Rd). El rendimiento de la purificación es pobre (Fig. 11B) ya que sólo las Fr 3-4 presentan proteína de fusión completa y están enriquecidas con productos de bajo peso molecular. 35 Lisis por cavitación en prensa de French Debido al mal rendimiento obtenido en la extracción por sonicación y de acuerdo a lo realizado por Li et al. (2005), se decidió lisar por cavitación utilizando una prensa de French. Se realizaron tres rondas de tres pases cada una, tomando muestras del sobrenadante (SF) y pellet (PF) para monitorear la extracción de proteína. Las muestras fueron analizadas mediante Western blot (Fig. 12). En el WB (Fig. 12) puede observarse que aún extrayendo con prensa de French, una buena parte de la GST-LTX permanece en los restos celulares (PF) aunque sucesivos pases permiten extraer un poco más de proteína (SF6 y SF9). La diferencia entre la cantidad de proteína extraída en 6 o 9 pases por la prensa no parece ser notoria y en cada ronda se diluye la proteína de manera importante, por lo que se decidió mantener dos rondas de 3 pases con una centrifugación intermedia para un total de 6 pases en la prensa de French. Congelación de la pastilla bacteriana Se ha reportado que la congelación de las pastillas celulares favorece la extracción de proteína (Novagen, 2004) por lo que se decidió hacer un experimento comparativo purificando proteína de un cultivo cuyo sedimento fue congelado con otro que no lo fue. Se inocularon dos cultivos idénticos, tomando las muestras correspondientes, uno de ellos se congeló a -80ºC (c/C), y el otro se lisó y purificó inmediatamente después de su cosecha (s/C). La lisis se realizó con dos series de 3 pases a 1,200psi, tomando muestras intermedias de sobrenadante (SF3) y precipitado (PF3), muestras del sobrenadante completo (C) y del sedimento final (pellet). Se purificaron por afinidad en columnas independientes utilizando Glutathione Sepharose 4B (GE®), tomando muestras de resina durante la purificación (previa, Rp; acoplada, Ra; desacoplada, Rd) (Fig. 13). 36 En términos de la extracción y cromatografía (Fig. 13, A1 y B1) se observa un patrón similar. Sin embargo, las fracciones provenientes del cultivo congelado presentan bandas discernibles de GST-LTX en la mayoría de las fracciones analizadas (Fig. 13, B2), mientras que las del cultivo sin congelar presentan bandas muy tenues únicamente en las fracciones 5-7 (Fig. 13, A2). Por lo tanto, se tomó la decisión de congelar los cultivos
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