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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas
Estudio de la función de Zimp7 en la restricción del organizador dorsal y la formación del
mesodermo del pez cebra (Danio rerio)
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: 
Doctor en Ciencias 
PRESENTA:
Biol. José Roberto Moreno Ayala
TUTOR PRINCIPAL
Dra. Hilda Lomelí Buyoli. IBt, UNAM
MIEMBROS DEL COMITÉ TUTOR
Dra. Martha Vázquez. IBt, UNAM
Dra. Diana Escalante. IFC, UNAM
Dra. Celina García. IBt, UNAM
Dr. Gustavo Pedraza Alva. IBt, UNAM
Dr. Ismael Secundino. IBt, UNAM
MÉXICO, D.F. JUNIO 2015
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
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El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Genética del
Desarrollo Embrionario de Vertebrados del Departamento de
Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular del IBt, UNAM, bajo
la dirección de la Dra. Hilda Lomelí Buyoli, con el apoyo de
DGAPA/UNAM, proyectos IN204712 y IN202815, y del CONACyT,
proyecto 236466.
Para la realización de los estudios de Doctorado, se obtuvo la
beca número 310526 otorgada por el CONACyT.
β
Agradecimientos
Al Instituto de Biotecnología de la UNAM, por darme la oportunidad de cursar mis
estudios de posgrado y permitirme pertenecer a esta institución tan prestigiada y honorable. 
A mi tutora, la Dra. Hilda Lomelí Buyoli, por brindarme la oportunidad de trabajar y
aprender en su laboratorio desde mis estudios de licenciatura. Su apoyo, consejo y guía,
tanto a nivel profesional como personal, han sido invaluables y claves para la realización de
este trabajo y para mi formación profesional.
A la Dra. Denhí Schnabel y al Dr. Enrique Salas, por iniciar el uso del pez cebra en el
laboratorio, su participación en este trabajo desde sus inicios y su aporte en los resultados
finales.
A todos los integrantes del laboratorio, por sus consejos y críticas durante los seminarios de
grupo. En especial, a la M. en C. Dulce Pacheco por su apoyo con el mantenimiento de los
animales.
A mi comité tutoral del doctorado, integrado por el Dr. Mario Zurita y el Dr. Fernando
López Casillas, por el tiempo dedicado a todas las sesiones de análisis del proyecto y sus
aporte crítico para su realización del mismo.
A la comunidad del IBt, en especial a las Unidades Docencia, de Secuenciación y de
Síntesis de Oligonucleótidos por su excelente servicio.
Al Dr. Erenesto Maldonado y su laboratorio por compartir protocolos de cuidado de
alevines y la línea híbrida de pez cebra que se utilizó durante el proyecto.
A los siguientes investigadores plásmidos para síntesis de ribosondas y ARNm: Mary C.
Mullins, Arne C. Lekven, David Kimelman, Igor Dawid, Scott Dougan, Steve Harvey,
iii
Rebecca Bourdine, Andreas Fritz y Anming Meng. Especialmente al Dr. Lee Kapp por
compartir un protocolo clave para hibridaciones in situ. 
A mis amigos: Steph, Monse, Marieli, Emma, Francisco, Héctor y Jorge, por la compañia,
ánimo e innumerables risas que me brindaron estos años. Muy especialmente quiero
agradecer a Laura y a Takuya por su apoyo incondicional durante los últimos meses de mi
estancia en Cuernavaca. Su generosidad y empatía son sólo reflejo de la enorme calidad
humana que poseen. Estoy en deuda con ellos.
A mis amigos que, a pesar de la distancia, al reencontrarnos siempre es como si el tiempo
no transcurriera: Fernando, Alfredo, Tomás, Juan Carlos, Poncho, Juan y Dámaris.
iv
Dedicatoria
A mis padres Amparo y Roberto, quienes siempre han sido un ejemplo de
congruencia y dedicación, y han puesto un enorme empeño en respaldar mis
decisiones. Siempre con comprensión y cariño.
A mi familia, especialmente a mis abuelos Amparo y Francisco, que son
como segundos padres para mí. 
A mis hermanos, Alaíde y Alexis, quienes con su buen humor y nobleza han
estado siempre presentes.
A Nancy, por ser la mejor persona que conozco, mi persona favorita. Por
permitirme compartir la vida a su lado, llena de amor y criaturas felinas.
v
"...the great beauty of embryo development, the bit that human beings find
so hard to grasp, is that it is a totally decentralised process. Since every cell
in the body carries a complete copy of the genome, no cell need wait for
instructions from authority; every cell can act on its own information and the
signals it receives from its neighbours. We do not organise societies that
way: we are obsessed with dragging as many decisions as possible to the
centre to be taken by governments. Perhaps we should try."
Matt Ridley
ii
INDICE DE CONTENIDO
Página
ÍNDICE DE FIGURAS iv
ÍNDICE DE ABREVIATURAS vi
RESUMEN viii
I. INTRODUCCIÓN 1
1.1 La embriología de los vertebrados 1
1.2 Embriogénesis del pez cebra 4
1.3 Mapa de destino en gástrula temprana 7
1.4 Principales vías de señalización durante la embriogénesis 7
 1.4.1 La familia TGF-β: Bmp y Nodal 8
1.4.2 Wnt: actividad materna y cigótica 9
1.5 Mecanismos morfogenéticos durante la embriogénesis 11
1.6 Identidad de estructuras dorsales y ventrales 12
1.7 Estrategias experimentales de genética reversa 13
 1.7.1 Disminución de función mediada por morfolinos 13
 1.7.2 Edición del genoma mediante el sistema CRISPR/Cas9 14
II. ANTECEDENTES 16
2.1 Las proteínas ZIMP y las proteínas PIAS 16
2.2 Expresión genética e interacciones de las proteínas ZIMP 17
III. JUSTIFICACIÓN 19
IV. HIPÓTESIS 20
V. OBJETIVOS 21
i
5.1 Objetivo general 21
5.2 Objetivos particulares 21
VI. RESULTADOS 22
6.1 zimp7 se expresa de forma generalizada durante la embriogénesis del pez
cebra
22
6.2 La pérdida de función de Zimp7 ocasiona anormalidades durante la
epibolia
23
6.3 Los morfantes de zimp7 presentan defectos morfológicos a las 30 hpf 24
6.4 Las mutaciones bialélicas en la región genómica de zimp7 ocasionan
defectos similares a los observados en los morfantes
26
6.5 La ganancia de función de Zimp7 provoca ventralizaciones moderadas 27
6.6 La desregulación de los niveles de Zimp7 afectan estructuras de la línea
media
29
6.7 La expresión de marcadores del mesodermo dorsal y ventral se afecta por
una desregulación de los niveles de Zimp7
31
6.8 La expresión anormal de marcadores del mesodermo axial en los
morfantes de zimp7 puede ser revertida co-inyectando el ARNm de zimp7
33
6.9 La inducción de los genes involucrados en el establecimiento del eje
dorsoventral es apropiada en los morfantes de zimp7
34
6.10 La pérdida de función de Zimp7 provoca defectos en el mesodermo
ventrolateraly neuroectodermo pero no en el endodermo
36
6.11 La vía Nodal funciona de forma normal en los morfantes de zimp7 y no
existe una interacción epistática con ninguno de sus componentes
38
6.12 La vía Bmp no exhibe cambios en ausencia de Zimp7 ni interaccionan
genéticamente
40
ii
6.13 Los genes activados por Wnt presentan una expresión reducida en los
morfantes de zimp7 y la ventralización ocasionada por la sobreexpresión de
vox/vent requiere a Zimp7. 42
VII. DISCUSIÓN 44
7.1 La expresión de zimp7 durante la embriogénesis 44
7.2 Fenotipos provocados por un desbalance en los niveles de Zimp7 45
7.3 La expresión genética durante la inducción y el mantenimiento del
organizador
46
7.4 Interacciones epistáticas entre Zimp7 y las vías Nodal, Bmp y Wnt 47
7.5 La ausencia de ZIMP7 en ratón 49
7.6 Embriogénesis y cáncer 49
VIII. CONCLUSIONES 51
IX. PERSPECTIVAS 52
X. METODOLOGIA 53
10.1 Mantenimiento de peces 53
10.2 Morfolinos utilizados 53
10.3 Clonación de la región codificante de zimp7 y síntesis de ARNm 54
10.4 Hibridación in situ y cuantificación de dominios de expresión genética 55
10.5 RT-PCR cuantitativo 56
10.6 Inmunodetección 57
10.7 Mutaciones en zimp7 mediadas por el sistema CRISPR/Cas9 58
XI. REFERENCIAS 59
iii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 El organizador de Spemann-Mangold 2
2 Desarrollo embrionario del pez cebra 6
3 Mapa de destino en el inicio de la gastrulación 8
4
Las vías Bmp, Nodal and Wnt y la interacción antagónica de sus
componentes
10
5
El patrón del embrión es dictado por la actividad combinada de
las vías de señalización Bmp, Nodal y Wnt
13
6 Estructura de la proteína Zimp7 17
7 La expresión de zimp7 durante el desarrollo del pez cebra 22
8
La pérdida de función de Zimp7 provoca alteraciones durante la
gastrulación
24
9
La pérdida de función de Zimp7 provoca alteraciones del
mesodermo axial
25
10 Mutagénesis inducida por el sistema CRISPR/Cas9 27
11
La ganancia de función de Zimp7 provoca alteraciones del
mesodermo axial 
28
12
La pérdida y ganancia de Zimp7 provocan efectos opuestos en
las estructuras de la línea media
30
13
La alteración de la expresión de zimp7 afecta a genes
involucrados en la determinación del mesodermo axial
32
14
La sobreexpresión de zimp7 inhibe la expresión de ntl en la
región dorsal.
33
iv
15
La coinyección del MO con el ARNm de zimp7 restablece los
niveles de expresión de marcadores de mesodermo dorsal 
34
16
Los morfantes de zimp7 presentan una inducción normal en los
genes activados durante el establecimiento del patrón
dorsoventral (4 hpf) 
35
17 Análisis de marcadores durante la gastrulación media 37
18 La vía Nodal no presenta interacción genética con Zimp7 39
19 La vía Bmp no presenta interacción genética con Zimp7 41
20
La disminución en la actividad de Zimp7 reduce la expresión de
eve1 en la gastrulación temprana y suprime la ventralización
mediada por un incremento de Vox y Vent
43
21 Modelo de la función de Zimp7 51
v
TABLA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Descripción Función
a.a. Aminoácido Subunidades de las proteínas
ADN Ácido desoxirribonucleico
Molécula polimérica,
portadora de la información
genética
ARN Ácido ribonucleico
Molécula polimérica con
diversas funciones celulares,
además de codificar
información genética
(ARNm) también posee
actividad catalítica
(ribosoma).
APC Adenomatous Polyposis Coli
Parte del complejo de
destrucción de β-catenina
BMP Bone Morphogenetic Protein Vía de señalización
Boz Bozozok Factor de transcripción
Chd Chordin Inhibidor secretado de Bmp
CSV Capa Sincicial del Vitelo Envoltura celular del embrión
Dkk1 Dickkopf-1 Antagonista de Wnt
Eve1 Even-skipped-1 Factor de transcripción
Flh Floating head Factor de transcripción
Fz Frizzled Receptor de Wnt
Gsc Goosecoid Factor de transcripción
GSK3-β Glycogen synthase Kinase 3-β
Parte del complejo de
destrucción de β-catenina
Lef Lymphoid enhancing factor Factor de transcripción
vi
LiCl Cloruro de Litio
Reactivo que dorsaliza a los
embriones al inhibir la
función de GSK3-β
MO Morfolino Oligonucleótido antisentido
Oep One-eyed pinhead Co-receptor de Nodal
Ntl No tail Factor de transcripción
pb Pares de bases
Unidades de longitud de una
cadena de ADN
RT-PCR
Reverse Transcriptase Polymerase
Chain Reaction
Técnica usada para generar y
amplificar ADN
complementario a de partir
de ARN 
Tcf T-cell factor Factor de transcripción
TGF-β Transforming Growth Factor-β
Superfamilia de cascadas de
señalización
UV Ultravioleta
Wnt
Fusión de los nombres originales de la
vía en mosca y ratón: wingless e int-1,
respectivamente
Vía de señalización
Zimp
Zinc finger-containing, Miz-1, PIAS-
like protein
Co-reguladores
transcripcionales
Zmiz
Zinc finger MIZ domain-containing
protein
Co-reguladores
transcripcionales
vii
RESUMEN
La proteína ZIMP7 y su homólogo ZIMP10 fueron inicialmente reportadas como co-
reguladores transcripcionales del receptor de andrógeno. Ambas poseen un dominio SP-
RING, conservado desde insectos hasta mamíferos que las relaciona con las familia de
proteínas PIAS, las cuales pueden participar como E3 ligasas de SUMO mediante este
dominio. Previamente, se ha reportado que en cultivos celulares, ZIMP7 interactúa con
componentes del complejo remodelador de la cromatina SWI/SNF, Brg1 y Baf57, así como
con el efector de la vía Wnt: β-catenina. 
Este trabajo analiza la función de Zimp7 durante el desarrollo embrionario del pez
cebra. Un desbalance en los niveles de Zimp7 mediante el uso de un morfolino o la
sobreexpresión de su ARNm ocasiona defectos morfológicos evidentes durante la
organogénesis, sobre todo en estructuras axiales como la notocorda. Estas anormalidades se
deben a defectos en la expresión de genes que dictan el patrón dorsoventral al inicio de la
gastrulación. En la región dorsal a bozozok, floating head y goosecoid; y en la región
ventral a vox, vent y eve1. Todos ellos componentes o blancos transcripcionales de las vías
de señalización Bmp, Nodal y Wnt. 
La sobreexpresión de blancos de la vía Wnt (vox y vent) ocasiona una pérdida de
estructuras como la notocorda y estructuras anteriores como el cerebro anterior. Estos
defectos morfológicos pueden ser revertidos en un nivel considerable si de manera paralela
se disminuye la actividad de Zimp7, lo que habla de una interacción genética entre la vía
Wnt y Zimp7. Nuestros resultados muestran que Zimp7 tiene una importante función
durante la embriogénesis al participar en la regulación de genes involucrados en el patrón
dorsoventral.
viii
I. INTRODUCCIÓN
1.1 La embriología de los vertebrados 
Durante el siglo XIX se sentaron las bases para el surgimiento de la Embriología moderna
con el establecimiento de la teoría celular1, la distinción fundamental entre las células
somáticas y las germinales, y la incorporación de las leyes de la herencia. Estos
acontecimientos permitieron reconocer que las células de un embrión surgen por medio de
la división celular de un cigoto, el cual es un producto de la fusión de los núcleos de dos
células germinales portadoras del material que transmite los caracteres genéticos (genotipo)
que dictan las características físicas en un individuo (fenotipo) (Wolpert et al., 2002). 
El gran auge de la Embriología experimental al inicio del siglo XX incluyó el
trabajo de la escuela de Freiburg, cuyo origen se debe a Hans Spemann. Sus estudios en
anfibios hicieron evidente la naturaleza inductora de la región dorsal del embrión. Durante
la etapa de gástrula, el lado dorsal del embrión puede ser reconocido por la presencia de
una invaginación conocida como labio dorsal del blastoporo. Cuando el embrión se dividió
en fragmentos ventrales y dorsales, la mitad que contenía el labio dorsal del blastoporo se
desarrolló en un embrión completo, mientrasque la mitad ventral no presentó órganos
axiales como la notocorda (la estructura anatómica distintiva de los cordados), es decir,
mantenía únicamente su identidad ventral. Además, junto con su estudiante Hilde Mangold,
llevó a cabo trasplantes del labio dorsal del blastoporo, los cuales generaron embriones con
una duplicación de ejes corporales. Esto les llevó a concluir que tal región es importante
para organizar a las células vecinas y dar origen a estructuras dorsales (Fig. 1). Tal región es
desde entonces conocida como el organizador de Spemann-Mangold (Spemann y Mangold,
1924). Un logro más de este grupo de científicos fue la extracción de sustancias inductoras,
la búsqueda de la naturaleza química del organizador produjo la introducción de métodos
1La teoría celular fue desarrollada por Schleiden y Schwann en la década de 1830. Establece que las células individuales 
constituyen la unidad fundamental de la vida, tanto en las plantas como en los animales, y que una célula sólo puede surgir
de otra célula (Lodish, 2003).
1
bioquímicos en la Embriología. Sin embargo, no fue sino hasta el surgimiento de la
Biología Molecular que se desentrañó la identidad de las moléculas secretadas para la
inducción (Fäßler, 1996). 
El organizador dorsal está presente en todos los vertebrados, corresponde al escudo
en teleósteos, al nodo de Hensen en el pollo y al nodo en el ratón. La información sobre el
mecanismo de especificación inicial es hasta ahora más detallada en anfibios: la simetría
del huevo se pierde por la entrada del espermatozoide y ocasiona una rotación del córtex
hacia el futuro lado dorsal del embrión (Vincent et al., 1986). Los embriones irradiados con
luz UV no llevan a cabo la rotación cortical y se ventralizan, tales anormalidades pueden
ser revertidas cuando se inyecta citoplasma de la zona marginal de embriones fertilizados,
lo que muestra que el tratamiento con luz UV destruye un factor citoplásmico esencial para
el establecimiento del eje dorsoventral (Grant y Wacaster, 1972). 
En etapas más tempranas del desarrollo la información dorsal está localizada en la
región inferior (vegetal) y dorsal del embrión, esto es correspondiente al denominado
centro Nieuwkoop, el cual libera señales que al difundirse inducen la actividad del
organizador de Spemann-Mangold (Nieuwkoop, 1973; Gerhart et al., 1989).
2
Figura 1. El organizador de Spemann-Mangold. El trasplante del labio del blastoporo dorsal de un embrión en etapa
de gástrula a la región ventral de otro embrión origina un eje completo en el embrión aceptor. Esta región presenta
propiedades inductoras y organizadoras (modificado de Wolpert, 2002). 
En las últimas dos décadas del siglo XX se describieron varias moléculas, aisladas
de cultivos celulares, que alteraban el desarrollo en Xenopus, tales como Activina
(Thomsen et al., 1990). Sin embargo, era desconocido si estas moléculas eran inductoras
naturales in vivo. La identificación de moléculas distribuidas de forma asimétrica en el
embrión y la naturaleza molecular del organizador dorsal comenzó con el descubrimiento
del gen goosecoid (gsc) (Blumberg et al., 1991). Este gen contiene un dominio homeobox
(homeosis box, porque codifica para una secuencia conservada de 60 aminoácidos conocida
como el homeodominio), característico de genes homeóticos descubiertos en Drosophila
melanogaster, con una función fundamental en la identidad de los segmentos corporales y
encontrados en todos los metazoarios. Las mutaciones en estos genes causan homeosis, una
transformación de una parte del cuerpo en otra (McGuinnis et al., 1984). 
gsc se expresa luego de la transición de la blástula media (etapa en que se da el
inicio de la transcripción cigótica), su expresión se pierde cuando los embriones son
tratados con luz UV, pues se impide la rotación cigótica y, en consecuencia, la formación
del centro Nieuwkoop. En contraste, la incubación de los embriones en una solución de
LiCl provoca una expansión de la señal codificada por gsc, debido a que esta molécula
provoca un aumento de la señal dorsalizante. La prueba concluyente de que gsc es un gen
con una función fundamental en el organizador es que la inyección del ARNm de gsc en la
región ventral (donde no se expresa de manera natural) ocasiona la formación de un nuevo
labio dorsal del blastoporo. En consecuencia, una duplicación de los ejes en el embrión es
provocada, de manera similar a lo que ocurre por el trasplante del organizador de Spemann-
Mangold (Cho et al., 1991). 
A finales de la década de los setenta del siglo XX, los investigadores Christiane
Nüsslein-Volhard y Eric Wieschaus llevaron a cabo una mutagénesis extensa para
identificar mutantes que afectan el desarrollo embrionario en Drosophila. Varios años
después, el grupo de Nüsslein-Volhard empezó a trabajar en mutaciones a gran escala en el
pez cebra para investigar si los mecanismos descubiertos en invertebrados eran análogos en
los cordados. Debido a que los embriones del pez cebra pueden ser almacenados en grandes
cantidades por su reducido tamaño, a la transparencia de los embriones, así como a un
3
desarrollo embrionario y ciclo reproductivo rápidos (relativos a otros vertebrados, como
Xenopus), este grupo de investigadores pudo obtener más de 1000 mutantes de diversos
procesos del desarrollo (epibolia y gastrulación) y formación de órganos (como notocorda,
somitas, cordón espinal y corazón). El resultado fue la publicación de treinta y ocho
artículos del grupo de Nüsslein-Volhard y otros más que describen nuevos genes con una
función en la embriogénesis de los vertebrados (Nüsslein-Volhard, 2012; Haffter et al.,
1996). Estos trabajos impulsaron enormemente al pez cebra como modelo, cuyo uso en el
laboratorio había comenzado una más de una década antes (Streisinger et al., 1981) y lo
establecieron de manera definitiva como un modelo de la Embriología, la investigación
biomédica y el estudio de la evolución (Parichy, 2015).
1.2 Embriogénesis del pez cebra
El embrión del pez cebra se encuentra rodeado de una envoltura conocida como
corion, en ella se localiza el micropilo, por el cual ocurre la entrada del espermatozoide
durante la fertilización y establece el polo animal del embrión. La fertilización inicia ondas
de calcio que estimulan la contracción del citoesqueleto de actina y constriñe el vitelo (polo
vegetal) del embrión de tal forma que el citoplasma es desplazado hacia el polo animal para
formar la primera célula (Leung et al., 1998). 
El embrión de pez cebra presenta una segmentación meroblástica discoidal, es decir,
la división celular ocurre sólo en el polo animal. Al inicio, cada división tiene una duración
de 15 a 20 minutos (Fig. 2, 4 células). Luego de varios ciclos de división se produce un
cúmulo de blastómeros sobre el vitelo (Fig. 2, Esfera). Durante estas divisiones, el volumen
del embrión permanece constante, solamente se produce un mayor número de células más
pequeñas en cada ciclo. Este conjunto de células es conocido como blastodermo (Kimmel
et al., 1995). 
Luego de diez divisiones, entre las etapas de 512 células y 1000 células, inicia la
transición de la blástula media: el ciclo celular se hace más largo, las divisiones se
asincronizan, la tasa de DNA respecto al citoplasma alcanza un umbral crítico, inicia la
4
motilidad celular e inicia la transcripción cigótica (Kane y Kimmel, 1993). 
El embrión contiene tres poblaciones celulares: la Capa Sincicial del Vitelo (CSV),
formada a partir de núcleos de blastómeros marginales que colapsan con la célula del vitelo
y forman un anillo alrededor del borde del blastodermo. Este conjunto de núcleos aportarán
factores determinantes en el establecimiento del eje dorsoventral (Kimmel y Law, 1985).
Además, existe una capa exterior de células aplanadas (llamada capa envolvente) queconstituyen una cubierta extraembrionaria que se pierde más tarde en la embriogénesis. Por
último, entre estas dos capas se encuentra una población de células grandes y esféricas,
denominada capa profunda. Estas son las células que contribuyen directamente a la
formación del embrión (Kimmel et al., 1995).
 La epibolia es el primer movimiento celular que ocurre durante la gastrulación:
dirigidas por la CSV, las células de la capa profunda del blastodermo se intercalan con las
células más superficiales y posteriormente se mueven en dirección vegetal sobre la
superficie del vitelo para recubrirlo. Esta expansión depende de una red de microtúbulos en
la célula del vitelo (Solnica-Krezel y Driever, 1994).
Aproximadamente a las 6 horas posfertilización (hpf) se da la aparición de la
estructura conocida como escudo, un abultamiento en la parte dorsal del blastodermo (Fig.
2, Escudo) equivalente al organizador de Spemann-Mangold en los anfibios. Tal estructura
constituye un rompimiento en la asimetría radial del embrión y se conforma por la
confluencia de células hacia la línea media desde la región ventrolateral del embrión
(proceso denominado convergencia). La formación del embrión también requiere de una
extensión anteroposterior, en el que las células se intercalan en la línea media y producen el
alargamiento del embrión. Paralelamente, se lleva a cabo la gastrulación, las futuras células
del endodermo y mesodermo (en esta etapa conocido como hipoblasto) ingresan en el
margen del blastodermo y se establecen debajo del ectodermo, proceso conocido como
involución (Fig. 2, Escudo) (revisado en Myers et al., 2002b).
Estos movimientos celulares dan origen al mesodermo axial (también conocido
como cordamesodermo), precursor de la notocorda. Las células adyacentes —que
constituyen el mesodermo paraxial— son las precursoras de las somitas. Las células de la
5
capa profunda que no llevan a cabo una ingresión forman el epiblasto y, posteriormente, el
ectodermo. Este grupo de células lleva a cabo movimientos de convergencia y extensión
para formar la placa neural (Gilbert, 2006). 
6
Figura 2. Desarrollo embrionario del pez cebra. Las diferentes etapas y hora aproximada en que los embriones
alcanzan el estadío indicado se muestra debajo de cada imagen. En el recuadro de la etapa “Escudo”, se muestran flech as
que indican los diferentes movimientos celulares: ingresión (verde), convergencia (azul), epibolia (rojo) y extensión
(amarillo). Excepto en la últimas dos, el lado dorsal se encuentra a la derecha (modificado de Haffter et al., 1996 y
Myers, et al., 2002b).
Polo animal 
Polo vegetal 
4 células 1 h Esfera 
v 
80% epibolia 8 1/3 h 1 somita 
tubo neural 
cerebro 
posterior 
anterior 
D 
4 h Escudo 6h 
D 
101/3 h 19 somitas 18 1/2 h 
29 h 
Polo animal 
Polo vegetal 
4 células 1 h Esfera 
v 
80% epibolia 8 1/3 h 1 somita 
tubo neural 
cerebro 
posterior 
anterior 
o 
4 h Escudo 6h 
D 
101/3 h 19 somitas 18 1/2 h 
29 h 
Al final de la epibolia, tanto el eje anteroposterior como el dorsoventral se han
establecido (Fig. 2, 1 somita). Posteriormente, ocurre la organogénesis: estructuras como
las somitas, el cerebro y el ojo comienzan a ser notorias (Fig. 2, 19 somitas). A las 30 hpf la
cola se ha prolongado, las somitas se han formado, la región cerebral se ha regionalizado y
estructuras de la línea media como la notocorda y la placa del piso son evidentes (Fig. 2, 29
hpf).
1.3 Mapa de destino en gástrula temprana
Un mapa de destino que demarca la posición de los precursores de diferentes tejidos
y órganos es aparente al inicio de la gastrulación (6 hpf). Las capas germinales están
arregladas a lo largo del eje animal-vegetal. El ectodermo está localizado en el polo animal;
el mesodermo y endodermo de manera más vegetal, en la zona marginal (ecuatorial) del
embrión. En el ectodermo se encuentran los precursores del cerebro y la epidermis. Los
precursores de distintos tipos celulares mesodermales se encuentran arreglados a lo largo
del eje dorsoventral: las células más dorsales dan origen a la notocorda y la placa precordal;
y las células que se encuentran más distantes del escudo (región ventral) darán origen a las
somitas y a las células hematopoyéticas. El endodermo dará origen a estructuras como el
intestino y la faringe (Fig. 3) (revisado en Schier y Talbot, 2005).
1.4 Principales vías de señalización durante la embriogénesis
Durante el desarrollo embrionario hay una gran cantidad de señales moleculares que
modifican el comportamiento celular. Para el caso del pez cebra, se han descrito
principalmente tres cascadas de señalización que operan simultáneamente en distintas
regiones del embrión para determinar la formación de los ejes corporales. Estas tres vías
son Bmp, Nodal y Wnt. 
7
1.4.1 La familia TGF-β: Bmp y Nodal
Bmp y Nodal son ligandos que activan la vía de señalización TGF-β. Los ligandos
TGF-β inician la señalización al ser reconocidos por los receptores en la superficie celular
tipo I y II que corresponden a cinasas de serina/treonina. Esto permite que el receptor II
fosforile al dominio cinasa del receptor I, que propaga la señal mediante la fosforilación de
las proteínas Smad. Existen dos tipos de proteínas Smad, las reguladas por el receptor (R-
Smad) y las Smad mediadoras (Co-Smad). Las R-Smad son directamente fosforiladas y
activadas por un receptor cinasa tipo I y llevan a cabo una homotrimerización y la
formación de complejos heteroméricos con la Co-Smad tipo 4 (Smad4). Este complejo de
proteínas Smad activadas se transloca al núcleo y, en conjunto con otros cofactores
nucleares, regulan la transcripción de genes blanco (Fig. 4A) (revisado en Shi y Massagué,
2003).
8
Figura 3. Mapa de destino en el inicio de la gastrulación. Las capas germinales se distribuyen a lo largo del eje
animal-vegetal: ectodermo, mesodermo y endodermo. Las células del mesodermo se diferencian de acuerdo a su
localización en el eje dorsoventral (D-V): las células dorsales darán origen a la notocorda, las células localizadas en la
región ventral, darán origen a las somitas. 
La vía Bmp es esencial para el establecimiento del eje dorsoventral del embrión de
pez cebra. Luego de la transición de la blástula media (2.75-3 hpf) se forma un gradiente
del heterodímero de las proteínas Bmp7/Bmp2b desde la zona ventral hacia la dorsal. Estas
proteínas son secretadas al espacio extracelular donde actúan como un ligando que activa la
vía (Fig. 4A) y promueve la transcripción de genes como even-skipped-like1 (eve1), vox y
vent, los cuales instruyen a las células a adoptar un destino ventral. Chordin, Follistatin y
Noggin son proteínas secretadas por las células del organizador, actúan como antagonista
de la vía Bmp al secuestrar al heterodímero Bmp2b/7 e impedir que se una al receptor
(revisado en Kondo, 2007).
Por su parte, la vía Nodal opera en la región dorsal, posterioriza la zona marginal y
se requiere en la formación del organizador dorsal. Esta vía se contrapone a los efectos
producidos por Bmp. Junto con el factor de transcripción Bozozok (Boz), Nodal activa a
chordin, noggin1, goosecoid y dickkopf1, genes que antagonizan las señales ventralizantes,
inicialmente de Bmp y más tarde de Wnt. Squint (Sqt) es un ligando secretado de Nodal.
Además, sqt es un blanco transcripcional de la activación de Nodal, al igual que el gen que
codifica al antagonista de esta vía, lefty1. Además de la unión del ligando a los receptores
tipo I y II, la señalización requiere la presencia de un co-receptor, conocido en pez cebra
como ECF-CFC (Fig. 4A) (revisado en Schier y Talbot, 2001). 
1.4.2 Wnt: actividad materna y cigótica
La vía Wnt canónica dependiente de β-catenina. El ligando Wnt (Wnt8) se une a los
receptores heterodiméricos Frizzled/LRP, quemedian la respuesta intracelular mediante la
activación de Dishevelled en el citosol de la célula. Dishevelled inestabiliza al complejo
que secuestra a β-catenina. Este complejo se encarga de ubiquitinar y marcar para
degradación en el proteosoma a β-catenina. El complejo está compuesto por varias
proteínas: Axin (proteína de andamiaje central), APC y GSK. Cuando β-catenina no se
degrada, se acumula y se transloca al núcleo. Ahí se une a miembros de la familia de
factores de unión al ADN Tcf/LEF1 y juntos reclutan activadores transcripcionales. La
9
proteína Dickkopf1 actúa como un antagonista en el espacio extracelular (Fig. 4A)
(revisado en Kimelman, 2006). 
La vía Wnt está activa en dos etapas del desarrollo y en regiones opuestas del
embrión. En la primera etapa, β-catenina es el factor materno que se localiza de forma
10
Figura 4. Las vías Bmp, Nodal and Wnt y la interacción antagónica de sus componentes. (A) Esquema de los
componentes de las vías. (B) Localización dorsal de β-catenina antes del inicio de la transcripción cigótica.
Posteriormente, la vía Wnt cigótica está activa principalmente en la región ventral y participa en las i nteracciones
antagónicas durante el establecimiento del patrón dorsoantero-ventroposterior (modificados de Kimelman, 2006 y
Kimmel et al., 1995). 
 
asimétrica más tempranamente, en los núcleos de la capa sincicial del vitelo y en los
blastómeros dorsales (Fig. 4B) (Schneider et al., 1996). Luego de la transición de la
blástula media, β-catenina activa la transcripción de varios genes: boz, chordin (chd),
dikkopf1 (dkk1) y sqt en la región dorsal (Kelly et al., 2000). Estos factores son
responsables de la identidad del organizador dorsal al actuar como antagonistas de la
identidad ventral que dictan las vías Bmp y Wnt. Bozozok es un represor transcripcional de
los genes bmp2b, wnt8, vox y vent. Chordin actúa en el espacio extracelular antagonizando
la activación de la vía Bmp (Fig. 4B) (revisado en Schier, 2001). Es decir, existen
interacciones de regulación cruzada entre represores transcripcionales dorsalizantes y
ventralizantes que actúan de forma antagónica. Esto crea una dinámica necesaria para la
embriogénesis. 
En la segunda etapa, Wnt cigótica es activada en la región ventral del embrión y
forma un gradiente que se sobrelapa con el de Bmp. Estas vías activan genes que
antagonizan con aquellos que se secretan en el organizador y que dan una identidad ventral
a la células como eve1, vox y vent. Los genes vox y vent son represores transcripcionales de
bozozok, chordin y dickopf1 (Fig. 4B) (Ramel y Lekven, 2004).
1.5 Mecanismos morfogenéticos durante la embriogénesis
Durante el desarrollo embrionario existe una estrecha relación entre la señalización
y los movimientos morfogenéticos (p. ej. migración, proliferación y muerte programada).
Se ha propuesto que el desarrollo embrionario se divida de acuerdo al orden en que la
señalización y los movimientos morfogenéticos se presenten durante la embriogénesis. Si
los eventos de señalización ocurren temprano en la embriogénesis y antes del inicio de los
movimientos morfogenéticos, se define como un desarrollo dependiente de mecanismos
morfoestáticos. En contraste, si la señalización celular y los movimientos morfogenéticos
ocurren de forma simultánea, se clasifica como una embriogénesis dependiente de
mecanismos morfodinámicos (Salazar-Ciudad, 2003). 
El desarrollo embrionario de los vertebrados se caracteriza por una señalización
11
extensiva que ocurre de forma concomitante con una gran cantidad de movimientos
celulares. Es decir, ocurren mecanismos morfodinámicos en contextos morfológicos
complejos. Por ejemplo, la gastrulación involucra movimientos celulares en el embrión
completo, que a menudo están asociados y continuados por una elongación del cuerpo
debido a una intercalación extensiva. Los patrones de expresión de múltiples moléculas
señalizadoras y sus receptores cambian con el tiempo y el espacio (Salazar-Ciudad, 2010). 
1.6 Identidad de estructuras dorsales y ventrales en el pez cebra
En el pez cebra, el desarrollo dorsal está estrechamente ligado al desarrollo anterior,
de tal forma que las estructuras anteriores derivan del escudo; y, de manera similar, las
estructuras posteriores surgen de la región ventral. Por ello, debido a que el lado dorsal
produce destinos axiales (notocorda) y anteriores (cabeza), mientras que el lado ventral
produce destinos no axiales (pronefros) y posteriores (cola), el eje equatorial del embrión
podría ser denominado como un eje dorsoanterior-ventroposterior (Kimelman, 2006). 
Además, recientemente se ha reportado que el margen (región del mesodermo y
endodermo, Fig. 3) del embrión durante la etapa de gástrula actúa como un organizador
global, dependiendo de la relación de señales Nodal/Bmp que reciba: una alta tasa de
Nodal/Bmp origina un organizador dorsal, mientras que una baja tasa Nodal/Bmp origina
células con identidad ventral que al ser trasplantadas generan estructuras posteriores
ectópicas. Las regiones intermedias originan estructuras del tronco (Fauny et al., 2009). Por
otra parte, la formación de la cabeza resulta de la inhibición conjunta de Nodal, Bmp y
Wnt, mientras que la formación de las somitas posteriores depende de la estimulación de
estas tres vías (Fig. 5) (Agathon et al., 2003). 
12
1.7 Estrategias experimentales de genética reversa
La secuenciación de genomas facilitó el surgimiento de técnicas de genética reversa,
que permiten estudiar la función biológica de un gen en específico al interferir con su
expresión endógena y evaluar las consecuencias fenotípicas. 
El uso morfolinos representó por muchos años la estrategia experimental más
popular para llevar a cabo una alteración en la expresión genética de manera transitoria en
el pez cebra. El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta más reciente que permite
introducir mutaciones de forma específica en cualquier región del genoma.
1.7.1 Disminución de función mediada por morfolinos
Los morfolinos (MO) son moléculas sintéticas antisentido compuestas de cadenas
de alrededor de 25 subunidades, similares al ADN y al ARN, excepto que tienen un anillo
13
Figura 5. El patrón del embrión es dictado por la actividad combinada de las vías de señalización Bmp, Nodal y
Wnt. Contribución de regiones embrionarias durante la gastrulación a las estructuras axiales y anteriores a las 24 hpf
(tomado de Agathon et al., 2003).
 
morfolino en lugar de un anillo de ribosa en sus bases. Se unen al ARNm por medio de un
apareamiento del tipo Watson-Crick y son usados para reducir la función genética al
impedir que se produzca una proteína funcional. Pueden ser diseñados para alterar el
procesamiento del ARNm (“splicing”), al reconocer el sitio de unión intrón/exón e impedir
que la maquinaria del “spliceosoma” actúe, o bien, para bloquear la traducción al unirse
cerca de la región de inicio de la traducción y evitar la unión del ribosoma (Bill et al.,
2009). Es importante señalar que el uso de cada variante tiene diferentes implicaciones en
la embriogénesis del pez cebra: debido a que los MO de “splicing” reconocen ARNm no
procesado, sólo afectan la expresión cigótica del gen de interés, ya que los ARNm maternos
se encuentran procesados y carecen de intrones. En contraste, el bloqueo de la traducción
con morfolinos dirigidos a la región cercana al ATG provocará también la alteración de
ARNm maternos, además de cigóticos (Morcos, 2007). 
1.7.2 Edición del genoma mediante el sistema CRISPR/Cas9
Hasta muy recientemente, obtener enzimas por medio de ingeniería genética que
realizaran modificaciones en el genoma (nucleasas) de maneraespecífica y eficiente era
una tarea complicada. La herramienta de edición del genoma —basada en el sistema de
resistencia de la bacteria Streptococcus pyogenes (group A Streptococcus)— conocida como
CRISPR (“Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats”) ha presentado
muchas ventajas respecto a métodos previos que dependen de un complicado ensamblaje de
secuencias codificantes para proteínas modulares que tienen la capacidad de unirse y
modificar secuencias en el genoma (p.ej. TALENs) (Sander y Joung, 2014). 
En contraste, el sistema CRISPR constituye una alternativa más simple ya que el
reconocimiento de la secuencia a modificar depende de la asociación de la nucleasa
“CRISPR-associated protein 9” (Cas9) con una cadena sencilla de ARN (conocida como
ARN guía, ARNg) complementaria a la secuencia blanco y que le confiere especificidad al
sistema. El ARNg puede ser modificado para reconocer cualquier región genómica siempre
y cuando estén presentes las bases NGG al final de la secuencia de interés. Este triplete de
14
bases es conocido como PAM (“Protospacer-Adjacent Motif”) y es requerido para una
unión eficiente con la nucleasa Cas9 y llevar a cabo un corte de doble cadena en el ADN. El
daño es posteriormente reparado por la maquinaria endógena de la célula llamada NHEJ
(“indel-forming Non-Homologous End Joining”). Al ser un sistema de reparación con
tendencia a cometer errores, introduce inserciones y deleciones (“indels”) en la secuencia
blanco. Estas mutaciones puede provocar a un cambio en el marco de lectura, y un “knock-
out” del gen (Cong et al., 2013). 
Con el sistema CRISPR/Cas9 es posible generar mutaciones en la línea germinal y
establecer una línea mutante para obtener embriones homocigotos para un alelo mutante y
así estudiar el fenotipo producido por la ausencia de función de un gen en particular.
Además, si la eficiencia de mutación es suficientemente alta, también es posible generar
mutaciones bialélicas en los individuos fundadores (F0) y observar las el fenotipo mutante
sin la necesidad de obtener una línea estable (Jao et al., 2013).
15
II. ANTECEDENTES
2.1 Las proteínas ZIMP y las proteínas PIAS
Las proteínas PIAS (PIAS1, PIAS3, PIASy y PIASx) fueron inicialmente descritas
como inhibidores de la vía STAT. Se sabe que actúan como co-reguladores
transcripcionales, pudiendo ser coactivadores o correpresores de la expresión genética de
sus blancos. Su actividad depende del blanco o de los reguladores transcripcionales con los
que interaccionen. Uno de los dominios estructurales que da identidad a las PIAS es
denominado SP-RING, que es un dedo de zinc muy similar a los dedos encontrados en una
algunas ligasas E3 de ubiquitina. Se ha sugerido que debido a este dominio las PIAS
podrían tener una actividad de E3 ligasas de SUMO, un péptido similar a la ubiquitina que
se une covalentemente a factores proteicos mediante el proceso de sumoilación. La
conjugación de este péptido altera la función de la proteína blanco mediante su
relocalización dentro del núcleo o su interacción con otras proteínas o el ADN. Además, las
proteínas PIAS pueden actuar por mecanismos independientes de la sumoilación ya que
poseen un dominio de unión a ADN, denominado SAP (Sharrocks, 2006). Se ha descrito
que estas proteínas son importantes para la regulación de diversos factores de transcripción
como SMAD (Long et al., 2003) y Gsc (Izzi et al., 2008). También se sabe que algunas de
estas proteínas tienen una función en el desarrollo embrionario de vertebrados. Por ejemplo,
XPIASy reprime a Smad2 en la inducción del mesodermo durante la embriogénesis de
Xenopus (Daniels et al., 2004). 
Las proteínas ZIMP7 y ZIMP10 (también conocidas como ZMIZ2 y 1,
respectivamente) se identificaron en humano mediante ensayos de doble híbrido en la
búsqueda de proteínas que interaccionaran con el receptor de andrógeno. Las proteínas
ZIMP poseen una señal de localización nuclear, un dominio SP-RING y regiones ricas en
prolinas (Zimp7 sólo posee una en el carboxilo terminal) (Fig. 6). El SP-RING se encuentra
dentro de una región conservada, llamada “eXtended SP-RING” (XSPRING) (Gutiérrez et
16
al., 2003), la cual se ha encontrado en proteínas de varias especies, desde insectos hasta
mamíferos. El ortólogo de los genes ZIMP en mosca, llamado tonalli (tna) se requiere para
el mantenimiento de la actividad de los genes homeóticos y también tiene una interacción
genética con componentes del complejo remodelador de la cromatina BRAHMA (Gutiérrez
et al., 2003). Ensayos in vitro, aportaron evidencia que las proteínas ZIMP también poseen
un dominio de transactivación fuerte en el carboxilo terminal, necesario para su actividad
como co-reguladores transcripcionales (Sharma et al., 2003; Huang et al., 2005). 
2.2 Expresión genética e interacciones de las proteínas ZIMP
En tejidos de humano hay una expresión diferencial entre estos dos genes: ZIMP7 se
expresa mayormente en el testículo y el corazón; en menor proporción en la próstata, el
ovario, el músculo esquelético y el páncreas (Huang et al., 2005); mientras que ZIMP10 se
expresa en el ovario, el páncreas y el bazo (Sharma et al., 2003). ZIMP7 y ZIMP10 son
proteínas nucleares, interaccionan con el receptor de andrógeno y regulan positivamente su
actividad; además, en cultivos celulares muestran interacción con componentes del
complejo SWI/SNF (Brg-1), co-localizan con SUMO en el núcleo de células epiteliales
prostáticas humanas y forman un complejo en los focos de replicación (Beliakoff y Sun,
2006). 
En ratón se ha descrito que la expresión de Zimp7 y Zimp10 se regula
dinámicamente desde el día embrionario 7.5 (E7.5) hasta la gestación media en el embrión
en desarrollo y se sobrepone en algunas regiones como el neuroepitelio, lo que indica una
17
Figura 6. Estructura la proteína Zimp7. Esquema de los dominios presentes en la proteína Zimp7: señal de
localización nuclear (SNL), el dominio SP-RING y un dominio en rico en prolinas en la región carboxilo terminal. 
 
posible redundancia funcional. Zimp7 presenta una expresión dinámica que se extiende del
extremo anterior al posterior conforme avanza el desarrollo (Rodriguez-Magadán et al.,
2008). Los embriones de ratón mutantes de Zimp10 mueren alrededor de E10.5 debido a
severos defectos en la organización de los vasos del saco vitelino, lo que apunta a que
desempeña una función esencial en el desarrollo del sistema vascular extraembrionario
(Beliakoff et al., 2008). 
ZIMP7 interacciona con PIAS3 y juntos regulan la transcripción mediada por el
receptor de andrógeno (Peng et al., 2010). Recientemente, se reportó que ZIMP7 potencia
la transcripción mediada por Wnt/β-catenina en células de mamífero. Los embriones
mutantes nulos de Zimp7 presentan una disminución en la expresión de blancos de β-
catenina como Axina2, CD44 y C-jun (Lee et al., 2013). 
El estudio de la función de Zimp7 en el pez cebra podría revelar su participación
como un nuevo factor involucrado en la regulación genética durante el durante el desarrollo
embrionario de los vertebrados.
18
III. JUSTIFICACIÓN
El desarrollo embrionario es un fenómeno sin paralelo en la naturaleza: ninguna otra
entidad conocida se construye a sí misma. La complejidad de los mecanismos moleculares
que este proceso exhibe es un reflejo de la larga historia evolutiva de los seres vivos, que ha
moldeado esta intrincada dinámica de interacciones. Conocer los componentes de las redes
de regulación genética que instruyen a las células a especializarse y organizarse
espacialmente en los tejidos que componen un organismo multicelular es necesario para la
comprensión de la embriogénesis. 
Los mecanismos moleculares que ocurren en procesos del desarrolloembrionario —
como la migración y la proliferación celular— tienen un estrecho paralelo con aquellos que
actúan en la progresión del cáncer: se necesita un aporte combinado y regulado de múltiples
vías de señalización durante la embriogénesis pero también para el funcionamiento correcto
de las células en los individuos adultos. De tal forma que el estudio de la Embriología tiene
el potencial de tener repercusiones en la terapia de esta enfermedad.
El gen Zimp7 ha sido descrito como un co-regulador de la transcripción y tiene un
patrón de expresión dinámico durante la embriogénesis del ratón. Su homólogo, Zimp10
desempeña una función importante durante la vasculogénesis del ratón. tna, el ortólogo en
mosca, participa en la especificación de los segmentos corporales durante la embriogénesis.
Por estar razones, Zimp7 podría estar involucrado en procesos esenciales del desarrollo
embrionario en vertebrados. Es importante llevar a cabo un análisis detallado sobre su
posible función en la embriogénesis. 
19
IV. HIPÓTESIS
Debido a que Zimp7 tiene una expresión abundante durante el desarrollo embrionario del
ratón, a la importancia de su ortólogo tna en la embriogénesis de la mosca y su función
como modulador transcripcional, Zimp7 puede ser un factor esencial para el desarrollo
embrionario del pez cebra. 
20
V. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
Estudiar la función de la proteína Zimp7 durante el desarrollo embrionario del pez cebra.
5.2 Objetivos particulares
-Analizar el perfil de expresión de zimp7 durante la embriogénesis del pez cebra.
-Estudiar las consecuencias morfológicas provocadas por la alteración de los niveles de
Zimp7 durante el proceso embrionario.
-De acuerdo a los fenotipos observados por una alteración en los niveles de la proteína
Zimp7, caracterizar los cambios en la expresión genética de factores involucrados en el
proceso embrionario que se observe afectado.
-Evaluar la posible conexión de Zimp7 con vías importantes durante la embriogénesis como
Wnt, BMP y Nodal.
21
VI. RESULTADOS
6.1 zimp7 se expresa de forma generalizada durante la embriogénesis del pez cebra
A pesar de que el genoma del pez cebra se encuentra duplicado, sólo existe una
copia de zimp7 en la base de datos Ensembl. zimp7 es un gen con 21 exones y cuyo marco
de lectura abierto consiste de 2667 pb, que codifican para una proteína de 888 a.a. (zmiz2-
201, ENSDART00000110166). 
22
Figura 7. La expresión de zimp7 durante el desarrollo embrionario del pez cebra. Detección de la expresión de
zimp7 mediante hibridación in situ. (A-E) vistas laterales, polo animal hacia arriba; (F) vista lateral con la región anterior
hacia arriba; (G) vista dorsal, región anterior hacia arriba; (H) región anterior orientada hacia la izquierda. La etapa está
indicada en la región inferior derecha de cada imagen. som=somitas, hpf=horas posfertilización. 
Para analizar la expresión de zimp7 durante la embriogénesis del pez cebra, se
generó una ribosonda antisentido para realizar una hibridación in situ (HIS) en diferentes
etapas del desarrollo. Se observó que este gen tiene una expresión generalizada durante el
desarrollo temprano del pez cebra, la cual empieza desde la etapa materna: se detecta en
etapas anteriores al inicio de la transcripción cigótica (Fig. 7A y B). Durante la
transcripción cigótica (512-1000 células) (Fig. 7C) y al inicio de la epibolia, la expresión de
zimp7 se observa en todo el blastodermo (Fig. 7D y E). Durante la somitogénesis, la
expresión es ubicua (Fig. 7F y G); más tarde, queda restringida en la región anterior (Fig.
7H). 
6.2 La pérdida de función de Zimp7 ocasiona anormalidades durante la epibolia
Para estudiar la función de Zimp7, se realizó una disminución de función mediante
la inyección de un morfolino que altera el procesamiento; en consecuencia, sólo afecta
ARNm cigóticos. Su secuencia es complementaria a la región entre el primer intrón y el
segundo exón (Fig. 8A), y se denominó MO zimp7-sp. 
Durante la gastrulación, los embriones inyectados con este morfolino —
comúnmente llamados morfantes, para diferenciarlos de mutantes— muestran un
alargamiento en la forma del vitelo en comparación con los embriones control. Además, se
aprecia un retraso en el desarrollo: al momento en que la mayoría de los embriones control
ya han completado la epibolia, los embriones inyectados con el MO zimp7-sp aún están
entre el 50 y 75% (Fig. 8 B). Este retraso y forma ovoide de los embriones han sido
descritos en estudios anteriores como una característica de embriones dorsalizados, es decir,
con un incremento en la identidad de estructuras dorsales (Mullins et al., 1996; Schmid et
al., 2000). La eficiencia y efectividad del uso de este morfolino fue evaluada por medio de
RT-PCR e inmunodetección (Fig. 8C-D). Cerca del 60% del ARNm detectado se encontró
alterado en su procesamiento y la cantidad de proteína disminuyó, aunque los anticuerpos
utilizados para su detección no presentaron un buen desempeño en muestras endógenas.
23
6.3 Los morfantes de zimp7 presentan defectos morfológicos a las 30 hpf
A las 30 hpf, en el grupo de morfantes de zimp7 se observó la presencia
predominante de embriones curvados ventralmente (denominado fenotipo intermedio) (Fig.
9B, G), así como un bajo porcentaje de embriones con un fenotipo más severo, con un
tronco reducido (Fig. 9C, G). Estas anormalidades son similares a las que en otros trabajos
se han clasificado como curly tail down, y se deben a deficiencias en la formación de
estructuras de la línea media como la notocorda (Brand et al., 1996).
24
Figura 8. La pérdida de función de Zimp7 provoca alteraciones durante la gastrulación. (A) En el esquema superior
se especifica del sitio de reconocimiento del MO en el ARNm de zimp7, entre el primer intrón y el segundo exón (línea
naranja). El esquema intermedio muestra el resultado de la unión del morfolino: la pérdida del segundo exón, un cambio
en la fase de lectura y la introducción de un codón de paro (barra roja). El esquema inferior muestra que en vez de la
proteína de 888 a.a. que normalmente se genera, un producto proteico de sólo 33 a.a. es traducido por la alteración del
procesamiento del ARNm. (B) Embriones inyectados con 8 ng del MO zimp7-sp presentan un alargamiento anormal y un
retraso luego a las 9 hpf en comparación con el control. (C) Detección de la alteración en el ARNm endógeno por la
acción del MO zimp7-sp mediante RT-PCR. Se observan dos bandas de menor tamaño que la que se produce en el control:
la de menor tamaño corresponde a la pérdida total del segundo exón, mientras que la banda intermedia refleja un pérdida
parcial del segundo exón por la presencia de un sitio críptico de splicing río abajo (diagrama de la derecha). (D)
Inmunodetección de la proteína de Zimp7 en morfantes: la disminución de una banda de 100 kD se aprecia en el carril
correspondiente a los embriones inyectados con el morfolino (recuadro interior). En la parte inferior se muestra la
detección de la proteína ERK2 como control de carga. 
Se ha reportado que las moléculas antisentido como los morfolinos pueden llegar a
inducir una muerte celular de manera inespecífica mediada por la proteína p53, la cual se
hace más evidente en la región anterior de los embriones (Robu et al., 2007). Para
confirmar que los fenotipos que observamos no se debían a este fenómeno, se coinyectó el
MO zimp7-sp con un morfolino diseñado para inactivar la función de la proteína p53, cuyo
25
Figura 9. La pérdida de función de Zimp7 provoca alteraciones del mesodermo axial. (A-F) Embriones de 30 hpf
inyectados con el morfolino indicado en la parte superior. Vistas laterales, región anterior a la izquierda. (A) Embrión
inyectado con 8 ng de MO Ctrl. (B-C) Embriones inyectados con 8 ng del MO zimp7-sp (intermedio y severo,
respectivamente).(D-E) La coinyección del MO zimp7-sp y el MO p53 (8 ng c/u) rescata la necrosis en la región anterior
pero no los defectos axiales. (F) La inyección del MO zimp7-ATG MO causa fenotipos similares. (G) Distribución de los
fenotipos observados a las 30 hpf luego de la inyección de los morfolinos especificados. El número de embriones
analizados se observa en el centro de la gráfica. 
uso ya se ha reportado ampliamente. Esto provocó una reducción en la necrosis de la región
cerebral pero no en la incidencia de anormalidades axiales ni tampoco afectó la distribución
de fenotipos a las 30 hpf respecto a la inyección del MO zimp7-sp por sí solo (Fig. 9D, E y
G).
Con el objetivo de aportar mayor evidencia a favor de la especificidad del fenotipo
en los morfantes de zimp7, se diseñó e inyectó un morfolino dirigido a la región cercana al
ATG (MO zimp7-ATG) que impide el inicio de la traducción del ARNm al bloquear la
unión del ribosoma. A las 30 hpf, ocasiona un fenotipo similar al observado con el
morfolino de splicing, aunque tiene una menor eficiencia (Fig. 9F-G). Además, este
morfolino afecta tanto al ARNm materno como al cigótico y era esperable un fenotipo más
severo que el observado con el MO de splicing. Sin embargo, su baja eficiencia impide
estudiar tal efecto. 
6.4 Las mutaciones bialélicas en la región genómica de zimp7 ocasionan defectos similares
a los observados en los morfantes
 Se llevó a cabo una mutación con el sistema CRISPR/Cas9 en embriones F0 para
corroborar que las mutaciones de zimp7 generaran un fenotipo similar a lo que se había
observado con el uso de los morfolinos. El 10% de los embriones inyectados con este
sistema presentaron un fenotipo similar al observado en los morfantes de zimp7 (Fig. 10B).
Estos embriones fueron colectados y su ADN genómico fue analizado para comprobar que
se hubiera llevado a cabo la mutación en la región esperada. Amplicones de la región
genómica adyacente a la secuencia blanco fueron analizados mediante una digestión con la
enzima T7 para evaluar el nivel de mutación respecto a aquellos embriones que no
presentaron anormalidades y un grupo control. Se encontró que los amplicones generados
del ADN genómico de embriones anormales eran digeridos preferencialmente por la
endonucleasa en comparación con los de embriones normales. Esto refleja una mayor
cantidad de mutaciones inducidas en la región genómica de zimp7 por el sistema
CRISPR/Cas9 en los embriones con daño morfológico (Fig. 10C). Al clonar y secuenciar
26
muestras de embriones anormales, se corroboró la presencia de deleciones que provocan un
desfase en el marco de lectura (Fig. 10D). Estos datos confirman lo observado con el uso de
los morfolinos: la falta de Zimp7 durante el desarrollo ocasiona defectos morfológicos
irreversibles. 
6.5 La ganancia de función de Zimp7 provoca ventralizaciones moderadas
Para investigar más sobre la función de Zimp7 en la embriogénesis, se realizaron
ensayos de sobreexpresión mediante la inyección de su ARNm. La ganancia de función de
Zimp7 ocasiona diversas anormalidades como ciclópea y pérdida de estructuras de la línea
media como la notocorda (Fig. 11). Estos defectos son similares a los reportados en
27
Figura 10. Mutagénesis inducida por el sistema CRISPR/Cas9. (A-B) Embriones de 30 hpf inyectados con el ARNm
de la nucleasa Cas9 y el ARNg que reconoce una región genómica que codifica para el tercer exón de zimp7. (A) Cerca
del 90% de los embriones inyectados presentaron una apariencia normal. (B) El 10% restante exhibieron anormalidades
morfológicas atribuibles a la mutación en zimp7 (n= 78). (C) LA digestión con la endonucleasa T7 (+) de productos de
PCR que amplifican una región flanqueante a la secuencia blanco (220 y 60 pb) revela una mayor presencia de mutación
en embriones alterados morfológicamente que en los normales. Productos sin digerir (-) de cada tratamiento se muestra
como referencia. Como control, la digestión de amplicones obtenidos de embriones inyectados con la nucleasa Cas9 y un
ARNg dirigido a la secuencia genómica de la tirosinasa no libera ningún producto (Ctrl). (D) Secuencias genómicas
obtenidas de embriones que presentaron un fenotipo alterado. En la línea superior se encuentra resaltada en amarillo la
secuencia blanco con la secuencia PAM en verde. Las filas siguientes son secuencias mutadas cerca del PAM de acuerdo
a lo esperado. El número de bases faltantes se muestra a la derecha (∆). Estas mutaciones introducen un cambio en el
marco abierto de lectura.
 
embriones deficientes en componentes de la vía Nodal (Feldman et al., 1998) y a los
mutantes de boz (Fekany et al., 1999). Es importante señalar que estas deformidades
morfológicas han sido ampliamente estudiadas tanto en Xenopus como en pez cebra y son
clasificadas como ventralizaciones moderadas, debidas a deficiencias axiales (Kao y
Elinson, 1988; Melby et al., 2000). Estos resultados indicaron que de manera consistente,
se observan defectos axiales tanto en la pérdida de función como en la sobreexpresión de
zimp7. 
28
Figura 11. La ganancia de función de zimp7 provoca alteraciones del mesodermo axial. (A) embriones normales
(azul); tipo III (morado), embriones con una tamaño reducido; tipo II (gris) embriones con ciclópea, una cola doblada y
un eje corporal acortado; tipo I (azul claro), embriones con defectos más severos: cola trunca y ciclópea. (B)
Distribución de los diferentes fenotipos provocados por la inyección del ARNm de zimp7. Existe una relación
directamente proporcional entre el porcentaje de embriones con fenotipo y la cantidad de picogramos de ARNm
inyectado (indicada debajo de cada gráfica). El número de embriones analizados se especifica en el centro.
6.6 La desregulación de los niveles de Zimp7 afectan estructuras de la línea media
La línea media del embrión está constituida por tres estructuras axiales: la
notocorda, el órgano que define a los cordados y contribuye a la formación de la columna
vertebral; la placa del piso, una estructura localizada inmediatamente sobre la notocorda y
que corresponde a la región ventral del tubo neural; y la hipocorda, que se localiza debajo
de la notocorda y es una estructura transitoria importante para el desarrollo de la aorta
(Cleaver y Krieg, 1998). Como se ha mencionado, estas estructuras son derivadas de un
conjunto de precursores localizados en el margen dorsal durante la gastrulación, dentro del
la región del organizador (Fig. 3).
Debido a que los embriones con niveles alterados de Zimp7 presentaron
anormalidades axiales, tanto en el caso de la pérdida como en la ganancia de función, se
procedió a analizar mediante HIS el estado de las estructuras de la línea media. Para tal
efecto, se utilizaron sondas antisentido para no tail (ntl), expresado en la notocorda; sonic
hedgehog (shh), expresado en la placa del piso; y collagen type II alpha 1a (col2a1a)
expresado en la hipocorda y placa del piso. 
Los morfantes de zimp7 presentaron una expresión expandida de ntl hacia la región
anterior (Fig. 12B, K). Además, el grosor de la placa del piso está notablemente
incrementado (Fig. 12D, E; barra en 12D', E', aumento del grosor de 43.9% respecto al
control, n=5, p<0.01 **), lo que indica una especificación incrementada de estos destinos
dorsales. No se observaron anormalidades evidentes en la formación de la hipocorda (Fig.
12H). 
De forma contraria, los embriones inyectados con el ARNm de zimp7 presentaron
una pérdida o desorganización tanto de la notocorda como de la placa del piso (Fig. 12C, F,
L). En contraste con los morfantes de zimp7, estos embriones sí exhiben alteraciones en la
formación de la hipocorda. La sobreexpresión de zimp7 provoca entonces una pérdida de la
especificación de destinos dorsales.29
30
Figura 12. La pérdida y ganancia de Zimp7 provocan efectos opuestos en las estructuras de la línea media. (A-I)
Vistas laterales, región anterior hacia la izquierda. Los reactivos inyectados se muestran en la parte superior, el marcador
examinado está especificado a la izquierda. Embriones de 24 hpf. D' y E' son imágenes magnificadas donde el
engrosamiento de la placa del piso es más evidente. (G) fp: floor plate (placa del piso); nc: notocorda; hp: hipocorda. (J-L)
Vistas a menor aumento de la expresión de ntl en A-C. Se observa una expresión incrementada en la región anterior de los
morfantes de zimp7 y una ausencia de su expresión en los embriones inyectados con el ARNm zimp7. 
En conjunto, estos resultados nos confirman que la disminución de actividad de
Zimp7 tiene efectos sobre estructuras axiales que son opuestos a los que se producen
cuando aumenta la actividad de Zimp7 y, además, sugieren que hay una alteración
temprana en la especificación de genes expresados en la región del organizador, ya que,
como se ha mencionado, las estructuras axiales derivan del organizador dorsal. 
6.7 La expresión de marcadores del mesodermo dorsal y ventral se afecta por una
desregulación de los niveles de Zimp7
Debido a que las anormalidades en estructuras de la línea media se han asociado con
defectos en la formación del organizador dorsal, la placa precordal y el mesodermo general,
se llevaron a cabo HIS de marcadores del mesodermo dorsal: boz, gsc, floating head (flh),
hatching gland (hgg). Los morfantes de zimp7 presentan un aumento significativo de estos
marcadores a las 6 hpf (Fig. 13B, D, G, V) y en la etapa de 3 somitas (Fig. 13S) . ntl, un
marcador global de mesodermo, no presenta cambios (Fig. 13P). De manera consistente, los
genes ventrales presentan cambios opuestos: vox y vent muestran reducción en su expresión
alrededor del margen (Fig. 13J, M y V), aún cuando se llega a observar expresión ectópica
en el ectodermo (asterisco en Fig. 13M). 
Los efectos de la sobreexpresión de zimp7 durante esta etapa son opuestos a los
presentes en los morfantes, tal como se había visto en embriones de 24 hpf: una regulación
negativa de gsc, flh, hgg y un aumento en el ángulo de expresión de vox y vent (Fig. 13E,
H, K, N, T, U y V). 
De manera interesante, la expresión de ntl se pierde en una región del margen. Al
analizar etapas del desarrollo más tardías (Fig. 14), esta región coincide con el dominio
dorsal, lo que explica que los embriones con ganancia de función de Zimp7 no presenten
una notocorda normal a las 24 hpf.
Estos datos confirman que las alteraciones morfológicas y de los marcadores
analizados a las 24 hpf se deben a una desregulación de la expresión genética durante el
inicio de la gastrulación (6 hpf). La presencia de efectos opuestos de los marcadores en
31
estas etapas del desarrollo es una evidencia a favor de la especificidad de los fenotipos
observados. 
 
32
Figura 13. La alteración de la expresión de zimp7 afecta a genes involucrados en la determinación del mesodermo
axial. Expresión de genes dorsales y ventrales en la etapa de escudo (A-N), 5 hpf (O-Q) y 3 somitas (R-T). Los reactivos
inyectados se muestran a la izquierda, el marcador examinado está especificado en la parte superior. boz, gsc y flh en
vista dorsal con el polo animal hacia arriba; vox, vent y ntl en vista animal con el lado dorsal hacia la derecha; hgg en
vista anterior con el lado dorsal hacia arriba. Las flechas en I-N indican el ángulo de expresión de los genes ventrales en
la región marginal. El asterisco indica la expresión ectópica de vent en el ectodermo (M). (U-V) Gráficas que muestran
los valores obtenidos de mediciones hechas para cada marcador. (U) Diferencias de expresión en el área de expresión de
genes dorsales en embriones con pérdida y ganancia de función de Zimp7, valores normalizados con los del grupo
control (línea horizontal). (V) Promedio del ángulo que mide la ausencia expresión dorsal de los genes ventrales en
embriones inyectados con el MO y el ARNm de zimp7 comparados con el grupo control en experimentos independientes.
El porcentaje de embriones con falta de expresión dorsal de ntl es 81 (n=21). La significancia estadística fue calculada
usando t-Student o U-Mann-Whitney de doble cola, dependiendo de la distribución. El número de embriones analizados
está indicado en la parte inferior de cada barra . Las barras representan la desviación estándar. *p<0.05; **p<0.01;
***p<0.001. 
 
6.8 La expresión anormal de marcadores del mesodermo axial en los morfantes de zimp7
puede ser revertida co-inyectando el ARNm de zimp7
Debido a que el uso de los morfolinos puede ocasionar efectos inespecíficos, el
control más confiable para demostrar la especificidad del fenotipo observado se obtiene
realizando un rescate del fenotipo, por medio la introducción del producto génico (ARN) a
la par del MO, lo que contrarresta el fenotipo de los morfantes (Eisen y Smith, 2008). Ya
que el MO zimp7-sp sólo reconoce ARNm no procesados, se utilizó el ARNm con el que se
llevó a cabo la sobreexpresión, pues sólo contiene la secuencia codificante y carece de
intrones. 
El rescate se realizó coinyectando el ARNm de zimp7 en dos diferentes
concentraciones (400 y 800 pg/embrión) y 8 ng del MO zimp7-sp. Los embriones fueron
colectados en dos diferentes etapas: escudo y 3 somitas para posteriormente realizar una
HIS de los marcadores de mesodermo precordal: gsc y hgg1, ya que estos habían mostrado
efectos antagónicos cuando fueron evaluados en la pérdida y ganancia de función de Zimp7
por separado. Como era esperado, la coinyección del ARNm y el MO provoca una
compensación en los niveles de ambos marcadores en comparación con el aumento que
provoca la sola inyección del MO zimp7-sp, y restablece una expresión más cercana a la
que el grupo control exhibe (Fig. 15). Esto demuestra la especificidad del fenotipo
33
Figura 14. La sobreexpresión de zimp7 inhibe la expresión de ntl en la región dorsal. La ganancia de función provoca
una pérdida de la expresión de ntl en la región del organizador en la etapa de escudo (A-B) y 90% de epibolia (C-D). (A,
C) Embriones control. (B, D) Embriones inyectados con el ARNm de zimp7. 
producido por el morfolino de zimp7. 
 
6.9 La inducción de los genes involucrados en el establecimiento del eje dorsoventral es
apropiada en los morfantes de zimp7
Existen diversas fases durante la formación del patrón dorsoventral. La primera
fase, conocida como inducción, ocurre después de la transición cigótica (3 hpf): un patrón
inicial se establece cuando el futuro mesodermo dorsal es inducido en un pequeño dominio
dorsal por la acción de β-catenina. En la región ventral, este patrón se forma por la acción
de los factores maternos Radar, Runx2 y Pou/Oct4. La segunda fase que es de
34
Figura 15. La coinyección del MO con el ARNm de zimp7 restablece los niveles de expresión de marcadores de
mesodermo dorsal. (A-B) Área de expresión de hgg1 y gsc evaluada mediante HIS de embriones inyectados con los
reactivos indicados en la parte inferior de la gráfica: (+) MO z7-sp=8ng; (+) ARNm z7=400 pg; (++) z7 ARNm z7=800
pg. Valores normalizados el grupo control (barra horizontal). La significancia estadística fue calculada usando t-Student o
U-Mann-Whitney de doble cola, dependiendo de la distribución. El número de embriones analizados está indicado en la
parte inferior de cada barra . Las barras representan la desviación estándar. **p<0.01; ***p<0.001. 
mantenimiento, está bajo el control del cigoto. En ella se redefine el patrón inicial y se
mantiene la expresión de aquellos genes activados durante la inducción en la gastrulación
temprana (6 hpf) (Flores et al., 2008). 
Con la intención de investigar si Zimp7 actúa tanto en el mantenimiento (6 hpf)
como en la inducción del patrón dorsoventral y con elfin de explorar si era posible detectar
cambios de expresión en la región dorsal antes que en la ventral o viceversa, se analizó la
posibilidad de que la expresión genética estuviera afectada en etapas más tempranas del
desarrollo. Se procedió a analizar la expresión de algunos de estos genes activados durante
el establecimiento del patrón dorsoventral, a las 4 hpf, mediante un RT-PCR cuantitativo. 
 
35
Figura 16. Los morfantes de zimp7 presentan una inducción normal en los genes activados durante el
establecimiento del patrón dorsoventral (4 hpf). PCR cuantitativo de genes inducidos a las 4 hpf durante el
establecimiento del organizador dorsal (sqt, boz y gsc) y sus antagonistas ventrales (vox y vent) en los morfantes de
zimp7. Valores normalizados con ef1alpha y respecto al grupo control (barra horizontal). Las barras representan la
desviación estándar de tres experimentos independientes. Se realizó una prueba t de una sola muestra comparando
contra un valor hipotético de 1, correspondiente a los valores normalizados del grupo control. No se encontró una
diferencia significativa. 
Los genes dorsales cuantificados incluyeron a boz y sqt, los blancos más tempranos
de la inducción del factor materno β-catenina, además de gsc y flh, cuya expresión es
estimulada por boz y sqt. Éste último es el ligando secretado de la vía Nodal, y constituye
un buen marcador de la actividad temprana de la vía. vox, vent y ved son marcadores
ventrales cuya expresión cigótica es promovida por el factor materno Runx2b y luego
mantenida por la señalización conjunta de Wnt y Bmp (Flores et al., 2008) (Ramel et al.,
2005). Nuestros datos sugieren que no hay una diferencia estadísticamente significativa en
la expresión de estos genes en los morfantes de zimp7 respecto al grupo control (Fig. 16).
Debido a esto, concluimos que Zimp7 no es requerido para el establecimiento del patrón
dorsoventral pero sí más tarde (6 hpf) para su mantenimiento. No fue posible observar una
expresión dorsoventral diferencial que permita suponer que Zimp7 actúa tempranamente en
alguna región del embrión de forma más temprana. Es probable que el efecto del MO
zimp7-sp comience a tener un efecto significativo en una etapa posterior del desarrollo (~5
hpf) y que, por lo tanto, no sea posible analizar un efecto tan temprano con esta
aproximación experimental. 
6.10 La pérdida de función de Zimp7 provoca defectos en el mesodermo ventrolateral y
neuroectodermo pero no en el endodermo. 
Como se describió en la introducción el mesodermo adquiere distintas identidades
dependiendo de su ubicación a lo largo del eje dorso-ventral. Por ello era importante
determinar qué consecuencia tenía la expansión del mesodermo axial sobre las identidades
del mesodermal lateral y ventral. Con esa finalidad, se analizó la expresión de eve1, un
marcador de mesodermo ventral que regula el destino de células progenitoras
mesodermales y un blanco transcripcional de la vía Wnt canónica, al igual que vox y vent.
La expresión de eve1 se encuentra reducida de manera significativa en los morfantes de
zimp7 (Fig. 17A-B, I). Esto refleja que la expansión de mesodermo dorsal provoca una
reducción de mesodermo ventral y que diferentes blancos de la vía Wnt se encuentran
afectados negativamente en ausencia de Zimp7. 
36
De manera contraria, el marcador de neuroectodermo otx2 (orthodenticle homeobox
2) presenta un incremento sustancial cuando hay pérdida de función de Zimp7 (Fig. 17C-D,
I). Tal observación es consistente con un aumento de mesodermo axial, debido a que éste es
responsable de la inducción del neuroectodermo. 
Para investigar si las tres capas germinales podrían estar afectadas por la
disminución de Zimp7, se procedió a analizar el estado del endodermo (perteneciente a la
capa profunda), mediante el marcador sox32 [SRY (sex determining region Y)-box 32]. Este
gen, se expresa también en un grupo de células en la parte dorsal del embrión conocido
como dorsal forerunner cells (DCFs, pertenecientes a la capa envolvente). Se observó que
la cantidad de células del endodermo se mantenía igual en morfantes de zimp7, pero se
encontraban retrasadas respecto a la población de DFC, en comparación con el control (Fig.
16E-F). Estos defectos fueron confirmados posteriormente mediante una tinción de núcleos
37
Figura 17. Análisis de marcadores durante la gastrulación media. (A-F) HIS embriones en etapa de 75% de epibolia.
(A-B) eve1 y (C-D) otx2, vista animal, lado dorsal hacia la derecha. (E-F) sox32 (el asterisco indica la ubicación de las
DFCs), vista lateral. (G-H) tinción de núcleos con sytox, vista lateral. Las barras en F y H indican el espacio entre las
células de la capa profunda y la envolvente. (I) Diferencias de expresión en el área de expresión de los marcadores
señalados en embriones con pérdida de función de Zimp7; valores normalizados con los del grupo control (línea
horizontal). La significancia estadística fue calculada usando t-Student o U-Mann-Whitney de doble cola, dependiendo
de la distribución de los datos. El número de embriones analizados está indicado en la parte inferior de cada barra. Las
barras representan la desviación estándar. ***p<0.001.
(Sytox): existe un mayor espacio entre la capa profunda (a la que pertenece el endodermo)
y la capa envolvente (que incluye a las DFCs) en los morfantes de zimp7 que en el control.
Además, es evidente una forma irregular en el frente de migración (Fig. 16G-H). 
6.11 La vía Nodal funciona de forma normal en los morfantes de zimp7 y no existe una
interacción epistática con ninguno de sus componentes
Como se explicó con anterioridad, la ganancia de función de zimp7 provoca una
proporción significativa de embriones cíclopes, una anormalidad que ha sido asociada con
defectos de Nodal (Gritsman et al., 1999), aunque también pueden ser provocadas por una
ausencia de Boz (Fekany et al., 1999) o un aumento de la actividad de Wnt (Lekven et al.,
2001). Inicialmente nos inclinamos por la hipótesis de una posible regulación negativa de
Nodal por parte de Zimp7. Otro argumento que apuntaba hacia esta hipótesis era que se ha
reportado que la expresión de ntl está regulada por la vía Nodal en la región dorsal del
embrión, mientras que Bmp y Wnt se encargan de activarlo en el resto del mesodermo. La
expresión axial de ntl es requerida para la formación de la notocorda, mientras que la
expresión no axial es necesaria para establecer el mesodermo ventroposterior (Harvey et
al., 2010). Embriones con mutaciones en el gen del co-receptor ECF-CFC (llamados one-
eyed pinhead, oep) muestran una ausencia de expresión de ntl en la región dorsal, en
consecuencia, carecen de notocorda (Gritsman et al., 1999). 
Debido a que ntl está ausente en la región dorsal de los embriones inyectados con el
ARNm de zimp7 (Fig. 14), se procedió a analizar el estado de la vía Nodal en los morfantes
de zimp7 mediante la inspección de la expresión de lft1. Nodal autorregula su actividad
espacialmente al activar transcripcionalmente tanto a su ligando como a su antagonista, por
lo que analizar la expresión de lft1 refleja de manera indirecta qué tan activa se encuentra la
vía. En la etapa de escudo (6 hpf) no se observaron diferencias significativas en los niveles
de expresión genética de este gen en morfantes de zimp7 en comparación con el control
(Fig. 18A). 
38
Con el objetivo se analizar una interacción de Zimp7 con Nodal, se realizaron
ensayos de interacción epistática, en los que una inducción exógena de Nodal fue
provocada y se intentó contrarrestar con una sobreexpresión de zimp7, bajo la lógica que
existe una represión por parte de Zimp7. Alternativamente, se probó si una disminución de
la actividad de Nodal era compensada por una disminución de Zimp7. Los fenotipos
provocados