Estudio-de-las-propiedades-mecanicas-y-polimorfismo-de-vp6-de-rotavirus-mediante-sonicacion

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
TESIS DE LICENCIATURA 
 
ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES MECÁNICAS Y POLIMORFISMO DE VP6 
DE ROTAVIRUS MEDIANTE ULTRASONICACIÓN 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
PRESENTA 
BEATRIZ IOATZIN RÍOS DE ANDA 
 
 
 MÉXICO, D.F. A 27 DE JULIO DE 2012 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: Profesor: JOSÉ GUILLERMO DE JESÚS AGUILAR 
 OSORIO 
VOCAL: Profesor: JOSÉ PEDRAZA CHAVERRI 
SECRETARIO: Profesor: LILIANA CARREÑO FUENTES 
1º SUPLENTE: Profesor: MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 
2° SUPLENTE: Profesor: ROCÍO GABRIELA TIRADO MENDOZA 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA, UNAM 
 
ASESOR DEL TEMA: 
M. en C. LILIANA CARREÑO FUENTES 
 
 
SUSTENTANTE (S): 
BEATRIZ IOATZIN RÍOS DE ANDA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el 
Departamento de Medicina Molecular y 
Bioprocesos del Instituto de Biotecnología de la 
Universidad Nacional Autónoma de México, 
bajo la asesoría de la M. en C. Liliana Carreño 
Fuentes en el grupo de investigación del Dr. O. 
Tonatiuh Ramírez Reivich. Durante la realización 
de este trabajo se contó con el apoyo 
económico del Consejo Nacional de Ciencia y 
Tecnología (CONACyT) Proyecto CB101847 y 
FS126793, y DGAPA-UNAM IN 224409 (abril-
diciembre 2011), así como con el Apoyo 
Alimentación y Hospedaje (enero-febrero 2012) 
otorgado por la Unidad de Docencia del 
Instituto de Biotecnología, UNAM. Se agradece 
el apoyo técnico de la M. en C. Vanessa 
Hernández y de la M. en C. Ana Ruth Pastor. 
 
Dedicatorias: 
 
 
 
 
A mis queridísimos papi y mami, por darme raíces sólidas sobre las cuales he 
podido crecer; por ser una presencia constante y activa en mi vida; por creer, 
aceptar, apoyar y tener fe en mí y mis locuras. Gracias por hacer hasta lo 
imposible para que yo cumpla mis sueños. Con su ejemplo instalaron en mí estas 
ganas de aprender y de ser mejor persona. 
Los quiero muchísimo. 
 
A mis personas favoritas: Agus y Ponis. Pocas cosas se comparan con el enorme 
orgullo de poder llamarlos mis hermanos. Son lo mejor de mi vida. Gracias por ser 
un ejemplo de amigos, personas y científicos; porque no sabemos qué significa 
estar lejos; porque me han protegido de todos los robots rosas malvados y porque 
sé que siempre habrá una isla de los Thunderbirds esperando a tres niños para 
crear los mejores recuerdos de sus vidas. 
Los quiero muchísimo. 
 
A mi abuelita. Tuve la enorme fortuna de que ilustraras mi infancia con libros y 
juegos. Llevo conmigo todas esas noches de cuentos. 
Te recuerdo y extraño todos los días. 
 
A mi mejor amiga Paola. Te has vuelto tan especial en mi vida que ya nada me 
sabe hasta que lo comparto contigo. 
Te quiero muchísimo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
"While I�m the kitchen cooking up a pot pie 
You�re just watching with your beautiful eyes 
And we all are singing our favorite tunes 
My pot of gold is my life with you" 
 
 
 
Agradecimientos: 
 
Sin intención de hacer distinciones, pero sí porque es la que más me emociona, todas las gracias 
del mundo a mi tutora, profesora y, especialmente, a mi amiga Liliana Carreño. Esta tesis y todo 
el trabajo desarrollado no tendrían pies ni cabeza sin ti. Gracias por compartir tu conocimiento, 
tu proyecto, tu entusiasmo, tu tiempo y tus ganas de aprender conmigo. Te debo todo lo que he 
crecido este tiempo y más. Gracias, mil gracias. 
 
A toda la familia Ríos, de Anda y Martínez, quienes siempre estuvieron al pendiente animándome 
y motivándome. Especialmente a mis primos Geovanni, Renato y Diana; y a mis tíos Gerardo, 
Paz, Sara, Martha, Chelo, Poncho y Jesús. 
 
A Inés, por todo lo que has hecho y haces por nosotros. Eres parte elemental de la familia. Te 
quiero mucho. 
 
A las mejores amigas del mundo: Andrea y Andrea, sin quienes habría dejado la facultad desde 
el primer semestre. Pops: te debo Davis y todo lo que para nosotras eso significa. Andrea: nadie 
mejor para los desayunos y las series. Ustedes fueron lo mejor de la carrera. 
 
A mi mejor amigo Charles. Te has vuelto a quien recurro para todo. Ser tu amiga ha sido de las 
más gratas sorpresas y me emociona saber que nos esperan muchas más juntos. 
 
A mis queridísimos amigos por las risas, todo lo que compartimos y el eterno apoyo. 
Especialmente a Chofs, Dany, Rots y Jairo. Los quiero mucho. 
 
A los amigos de Cuernavaca: Dany, Abi, Andrés I y II, Checa, Oco, Martín, LP, Jazmín y Víctor 
(¡gracias por la ayuda en estadística!). Hicieron mucho más divertida y placentera mi estancia. 
 
A todos mis profesores por la paciencia y por compartir su conocimiento. Especialmente a las 
QFBs Esther Morales e Isaura Carrera, quienes me recordaban con su ejemplo y entusiasmo por 
qué estudié esta carrera. 
 
A los Drs. Tonatiuh Ramírez y Laura Palomares, por la gran oportunidad y honor de pertenecer a 
su grupo y a sus proyectos, así como por el apoyo económico. 
 
Al grupo OTR: Karin, Vane, Ruth, Martha, Estrella, Ricardo, Esteban, Lilí, Mabel, Angélica, Oriana, 
William, Cuitláhuac, Itzcóatl, Gheorghe, Nahandi, Karim, Luis y Ramón, por el apoyo, ayuda, 
compañerismo, risas y amistad. Son todos muy especiales y ha sido un enorme placer compartir 
con ustedes el laboratorio. 
 
Al grupo EG por la ayuda. 
 
A los Drs. Juan Méndez y Adrián Martínez, así como a todo el personal del Centro de 
Nanociencias y Micro y Nanotecnologías del IPN, por las facilidades y la ayuda siempre 
brindada. 
 
Al apoyo técnico de Dra. Guadalupe Zavala y M. en C. Alba Lecona en el uso del microscopio 
electrónico de transmisión. 
 
Al presidente Dr. Guillermo Aguilar y al vocal Dr. José Pedraza por los aportes a la tesis, las 
correcciones y la buena disposición. 
 
 
Índice 
ÍNDICE 
1. RESUMEN 1 
 
2. ANTECEDENTES 
 2.1 Partículas Virales Multiméricas (PVM) 2 
 2.1.1 Producción de PVM en el sistema células de insecto 
 baculovirus 3 
 2.1.2 Propiedades de PVM 6 
 2.1.2.1 Propiedades Mecánicas 6 
 2.1.2.1.1 Obtención del módulo de Young 7 
 2.1.2.3 Polimorfismo de PVM 11 
 2.1.2.3.1 Sonicación 12 
 2.2 Proteína VP6 de rotavirus 14 
 2.2.1 Polimorfismo estructural de VP6 16
 2.2.2 VP6 como molde para nanomateriales 17 
 
3. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 20 
 
4. METODOLOGÍAS 
 4.1 Líneas celulares 21 
 4.2 Baculovirus recombinante 21 
 4.3 Cinéticas de producción 
 4.3.1 Cultivos celulares 21 
 4.4 Métodos analíticos 
 4.4.1 Determinación de concentración y viabilidad celular 21 
 4.4.2 Determinación del stock viral de baculovirus en 
 células Sf9 21 
4.4.3 Geles de poliacrilamida y Western blot 22 
4.4.4 Cuantificación de proteína 22 
 4.5 Purificación de VP6 22 
4.6 Estudio de las propiedades mecánicas de VP6 
 4.6.1 Longitud límite 23 
 4.6.2 Módulo de Young 23 
 4.7 Estudio del polimorfismo estructural de VP6 
 4.7.1 Reensamblaje de VP6 23 
4.7.2 Efecto de sonicación sobre macroestructurasde VP6 24 
 4.8 Técnicas de microscopía 
 4.8.1 Microscopía electrónica de transmisión 24
 4.8.2 Microscopía de fuerza atómica 24 
 4.9 Modelo estadístico 25 
 
 
Índice 
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 5.1 Producción del stock viral 26 
 5.2 Producción y Purificación de VP6 26 
 5.2.1 Primera etapa: centrifugación y ultrafiltración 27 
 5.2.2 Segunda etapa: intercambio aniónico 28 
 5.2.3 Tercera etapa: cromatografía líquida de permeación 
 en gel (FPL-GP) 28 
 5.3 Propiedades mecánicas de VP6 32 
 5.3.1 Longitud límite 32 
 5.3.2 Módulo de Young 40 
 5.3.2. 1 Módulo de Young de tubos correctamente 
 ensamblados 40 
 5.3.2.2 Módulo de Young de tubos rotos y tubos 
 reensamblados 45 
5.4 Polimorfismo de VP6 46 
 5.4.1 Polimorfismo de tubos de VP6 47
 5.4.2 Nuevos ensamblajes de trímeros de VP6 49
 
6. CONCLUSIONES 51 
 
7. PERSPECTIVAS 52 
 
8. BIBLIOGRAFÍA 53 
 
Resumen 
� 1
1. Resumen 
 
Está descrito que la proteína viral VP6 de rotavirus puede ensamblarse en 
estructuras tubulares y esféricas in vivo e in vitro. A partir del interés dentro 
del área nanotecnológica en el uso de los tubos de esta proteína, en este 
proyecto se desarrollaron metodologías de sonicación para conocer sus 
propiedades mecánicas y, además, para producir nuevas estructuras a partir 
de las existentes. Dos objetivos primordiales que tienen como finalidad 
caracterizar y conocer las posibilidades de manipulación de VP6. 
 
Para lograr lo anterior, se produjeron los nanotubos proteicos expresando la 
proteína VP6 al infectar células HighFive™ (Trichoplusia ni) con el 
baculovirus recombinante portador del gen de VP6 (cepa SA-11). Se logró la 
producción de 4 mg de VP6 a partir de medio litro de cultivo. 
 
Las propiedades mecánicas estudiadas incluyeron la longitud límite y el 
módulo de Young de los nanotubos de VP6. La primera permite conocer el 
tamaño mínimo que alcanzará un material después de ser sometido a 
esfuerzos de corte, mientras la segunda representa una medida de la fuerza 
estructural y resistencia a la deformación. Para conocer la longitud límite de 
los nanotubos se aplicaron hasta 180 s de ultrasonicación, encontrándose 
una disminución gradual de las longitudes conforme aumentaba el tiempo de 
sonicación. Se alcanzó una longitud mínima de 100-120 nm, provocada por 
cortes transversales que no deformaron la estructura tubular, según reveló 
la microscopía electrónica de transmisión. Esto pone de manifiesto que le 
ultrasonicación puede emplearse para manipular la longitud de los tubos. 
Para la determinación del módulo de Young se empleó el microscopio de 
fuerza atómica. Con él se lograron observar los tubos de VP6 en tercera 
dimensión. Se realizaron nanoindentaciones sobre ellos y utilizando los datos 
generados, se obtuvo un módulo de Young de hasta 0,4 GPa. 
 
Para el estudio de polimorfismo, los nanotubos de VP6 se sometieron a ciclos 
de ultrasonicación con diferentes amplitudes y pH, manteniendo constante la 
temperatura. Se observaron diferencias en el comportamiento de las 
macroestructuras (nanotubos) de VP6 con respecto al pH: a pH 7 fueron 
más resistentes, al encontrarse macroestructuras post-sonicación, mientras 
que a pH 5 la cantidad de éstas fue poca. En cuanto al polimorfismo, a pH 7 
pudo observarse que se formaron algunos espirales, mientras el resto de la 
proteína permaneció en forma de tubo o se desensambló a 1 y 2% de 
amplitud. El hallazgo de estructuras espirales mediante ultrasonicación pone 
de manifiesto que esta técnica es útil para inducir el polimorfismo de VP6. 
 
Como una estrategia paralela de manipulación de VP6 se desarrolló una 
nueva metodología de desemsamblaje y reensamblaje de las 
macroestruturas de VP6. Los tubos se desensamblaron utilizando CaCl2 y se 
procedió a reensamblarlos usando solamente diafiltración. El monitoreo ha 
permitido determinar la cinética del proceso y las condiciones óptimas para 
que se produzca el reensamblaje. 
Antecedentes 
 
� 2
2. Antecedentes 
 
2.1 Partículas virales multiméricas (PVM) 
 
Las partículas virales constan de los ácidos nucleicos (DNA o RNA) que 
codifican la información genética y en el conjunto de proteínas estructurales 
que forman la cápside viral para brindarle protección a los primeros. Gracias 
a las tecnologías recombinantes, es posible prescindir de los ácidos nucleicos 
virales, eliminando la capacidad infectiva de las partículas y escalando su 
producción. Estas nuevas partículas se conocen como partículas 
pseudovirales o partículas virales multiméricas (PVM) [4]. 
 
Las PVM son capaces de auto-ensamblarse formando estructuras idénticas a 
las cápsides virales o bien, icosaedros de diferentes tamaños o tubos [4]. 
 
Estas partículas han llamado la atención por diferentes razones: 
a. Rango de tamaños: 10 nm a varios micrones. 
b. Estructura monodispersa en tamaño y composición, parámetro que 
además puede ser genética o químicamente modificado. 
c. Distintas formas (icosaedros, tubos, hélices) y características 
estructurales y funcionales de acuerdo a diferentes condiciones 
ambientales (pH, concentración salina, temperatura), conservando una 
alta estabilidad. 
d. Capacidad de auto-ensamblaje in vitro e in vivo. 
e. Grandes áreas superficiales, lo que permite la unión de muchas copias 
de la misma o de diferentes moléculas sin impedimentos estéricos. 
f. Versatilidad de usos: como moldes para ensamblaje y nucleación de 
materiales, o para unión selectiva y presentación de diferentes 
moléculas, entre otras.[5] 
 
Debido a las razones anteriores, actualmente se utilizan dentro de la 
nanotecnología una gran cantidad de PVM, desde las provenientes de 
bacteriófagos hasta las de virus animales. 
 
La nanotecnología es un área multidisciplinaria de ciencias aplicadas y 
tecnológicas enfocadas al diseño, síntesis, caracterización y aplicación de 
materiales y dispositivos en la nanoescala [1]. El prefijo nano proviene del 
vocablo griego para “enano”, nanos, y actualmente lo empleamos para 
describir la billonésima parte (10-9) de una unidad de medición [2]. Aunque 
el término “nanotecnología” fue acuñado hacia 1974 por Norio Taniguchi, el 
verdadero auge no fue sino hasta los años ochenta con el desarrollo de 
tecnologías como la microscopía de barrido por tunelaje, el descubrimiento 
del fulereno y de los nanotubos de carbono, y la invención de los quantum 
dots [1]. 
 
Debido a que los sistemas biológicos están regidos por procesos y 
estructuras en la nano escala, ha surgido una rama de la nanotecnología 
involucrada en la explotación de biomateriales, biodispositivos o 
Antecedentes 
 
� 3
metodologías de estas dimensiones. El objeto de estudio de esta rama puede 
dividirse en dos enfoques: el primero de ellos es el uso de la nanotecnología 
para entender los sistemas biológicos, mientras el segundo es la fabricación 
de nuevos materiales y/o dispositivos a partir de biomateriales. Estos 
enfoques han dado origen a un nuevo concepto conocido como 
nanobiotecnología [1, 2]. 
 
Diversas biomoléculas se han empleado dentro de la nanobiotecnología entre 
ellas células completas –tanto procariotas como eucariotas -, proteínas, 
ácidos nucleicos e incluso partículas virales y las partículas virales 
multiméricas ya mencionadas [3]. Por ejemplo, Akin y colaboradores 
utilizaron exitosamente la bacteria Listeria monocytogenes como 
acarreadora de un plásmido con los genes que codifican para la proteína 
luciferasa embebidos en nanopartículas ancladas a la superficie bacteriana 
con el fin de expresarlos en células de ratón y así sugerir un modelo para 
diagnóstico, terapias genéticas o vacunas de DNA [6]. También han sido 
empleadas para tal fin las bacterias atenuadas y/o modificadas Salmonella, 
Shigella, Yersenia, Clostridium, Bifidobacteria y E. Coli tanto la no 
patogénica como la invasiva [7]. Por otro lado,el DNA es una molécula 
ampliamente empleada en el diseño de nuevos nanomateriales, entre ellos 
nanoalambres de oro, plata, cobre, paladio y platino [8], así como algunas 
otras estructuras ramificadas que permiten la construcción de nudos, 
catenanos, redes y cubos, entre otros [9]. Como ejemplo de PVM utilizadas 
en la nanotecnología, PVM del virus moteado clorótico del caupí (CCMV, por 
sus siglas en inglés) han sido empleadas como nanorreactores al 
reensamblar sus dímeros en presencia de la enzima peroxidasa de rábano, 
con lo que la enzima quedó embebida en la partícula viral. De esta forma, se 
evitó la desnaturalización de la primera, al quedar en un ambiente aislado y 
controlado, en el que se conservó la actividad enzimática. Esta construcción 
puede utilizarse para el análisis individual de enzimas o para llevarlas a 
sitios específicos de acción [10]. 
 
El uso de las diferentes partículas virales y PVM para fines terapéuticos o 
para usos tecnológicos a nivel nanométrico, depende fundamentalmente de 
su tamaño y sus características químicas y físicas. En estudios sobre las 
estructuras virales se demostró que son sistemas dinámicos que responden 
a cambios de pH [11] o fuerza iónica [2]. Esto representa una gran ventaja, 
pues las PVM pueden ser modificadas utilizando diferentes técnicas químicas, 
físicas y genéticas para darles un nuevo fin. 
 
 
 
2.1.1 Producción de PVM en el sistema células de insecto-baculovirus 
 
Su producción ha sido desarrollada a partir de tecnologías recombinantes. 
De estos sistemas, el más difundido es con la bacteria Escherichia coli. A 
pesar de su difusión y buenos resultados, este sistema tiene un gran 
inconveniente: carece de la maquinaria eucarionte que realice los cambios 
Antecedentes 
 
� 4
postraduccionales (glicosilación, fosforilación, amidación, carboximetilación, 
acilación) y correcto plegamiento de las proteínas, procesamientos 
necesarios para su actividad. Es por ello que han sido desarrollados sistemas 
recombinantes en células eucariontes, desde levaduras (YACS) y células de 
insecto, hasta células de mamífero y humanos [12-15, 18]. 
 
De los sistemas de expresión mencionados, el más popular para la expresión 
de PVM es el de célula de insecto-baculovirus. Esto se debe a importantes 
ventajas que incluyen: 
- Velocidad y simplicidad. Tanto la producción de baculovirus 
recombinantes como la producción de la proteína de interés son 
procesos cortos (alrededor de 5 días cada uno) y sencillos, en 
comparación con otros sistemas de expresión eucariontes. 
- Versatilidad. Se han podido producir hasta 500 diferentes proteínas 
funcionales; el baculovirus permite el empaquetamiento de genes de 
gran tamaño; y el sistema permite la expresión de múltiples proteínas 
recombinantes de forma simultánea utilizando un mismo o diferentes 
baculovirus, lo que permite la formación de cápsides virales completas. 
- Altos niveles de producción. La proteína recombinante puede alcanzar 
hasta el 50% de la proteína celular total, gracias al promotor bajo el 
que se encuentran. 
- Procesamiento postraduccional. Al tratarse de una célula eucarionte, 
este sistema es capaz de realizar procesamientos como N- y O-
glicosilación, fosforilación, carboximetilación, empaquetamiento, 
amidación, acilación, etcétera. 
- Seguridad. Los baculovirus cuentan con rango de células huésped 
estrecho que no incluye a células humanas. 
- Fácilmente escalable.[13-17] 
 
Este sistema utiliza a un baculovirus como vector de la proteína de interés y 
a células de insecto como hospederas/productoras de ésta [4, 13, 14, 18]. 
La diferencia entre la infección in vitro y la que ocurre naturalmente es que 
los genes que codifican para la proteína polihedrina (encargada de formar la 
matriz donde se encuentran embebidos los viriones) son sustituidos por los 
genes correspondientes a la proteína de interés. Estos genes se encuentran 
bajo el promotor de polihedrina y p10, promotores fuertes que se activan en 
la última de las fases de replicación viral [14-17]. La infección se divide en 
cuatro fases: 
1. Fase temprana inmediata (0-4 horas postinfección, h.p.i.). Empieza 
con la migración de los viriones al núcleo y el inicio de la transcripción 
del DNA del virus. 
2. Fase temprana (4-7 h.p.i.). Sustitución de la replicación celular por 
transcripción, traducción y replicación del virus. 
3. Fase tardía (7-20 h.p.i.). Continúa la replicación viral y se producen 
virus no ocluidos responsables de infecciones a células vecinas. 
4. Fase muy tardía (20-24 h.p.i). Se presenta la expresión de genes bajo 
los promotores polihedrina y p10 [14, 17]. 
 
Antecedentes 
 
� 5
Los baculovirus son un grupo diverso de virus con genoma de doble cadena 
circular súper enrollado, cuyo tamaño varía entre los 80 a 180 kilopares de 
bases (kpb) y que resultan infectivos para invertebrados. El genoma se 
encuentra empacado en viriones con forma de barra que miden 
aproximadamente 200 nm de largo y 20 nm de diámetro. Se han aislado 
más de 500 baculovirus que infectan particularmente a insectos del orden 
Lepidoptera y Dipterian. De todos ellos, el más utilizado es el virus 
multinuclearpoliedrosis de Autographa californica (AcMNPV) [14-18]. 
 
De igual forma, existen diferentes líneas celulares disponibles para este 
sistema, siendo las más empleadas las derivadas de Spodoptera frugiperda 
(Sf9 y Sf21) y Trichoplusia ni (High Five®). La elección de las cepas 
depende de lo que se desee producir [14-17]. De acuerdo con datos ya 
reportados, se obtienen mayores rendimientos en producción de proteína 
recombinante utilizando células High Five, por ello son las más empleadas 
para la obtención de la proteína, mientras que las células Sf9, que son más 
susceptibles a la infección por el baculovirus, se utilizan para la producción y 
título del stock viral [14, 15]. 
 
Los parámetros importantes que deben tomarse en cuenta para obtener 
buenos rendimientos por este sistema son, principalmente, la multiplicidad 
de infección (MDI), el tiempo de infección (TDI), el tiempo de cosecha y, 
como demostró Ortega, las condiciones del medio de cultivo [14-18]. 
 
La multiplicidad de infección se refiere al número de partículas infectivas por 
célula adicionadas al medio expresada en unidades formadoras de placa por 
célula (ufp/cél). Dependiendo de la magnitud del MDI, pueden llevarse a 
cabo dos tipos de infección: la sincrónica y la no sincrónica seguida de 
infecciones secundarias. Altas MDI aumentan la probabilidad de una gran y 
pronta infección de las células en cultivo (infección sincrónica) teniendo 
como resultado bajo crecimiento celular. Por otro lado, bajas MDI reducen la 
probabilidad de muchas células infectadas en la fase inicial (infección no 
sincrónica), por lo que el crecimiento celular continuará en la población no 
infectada, que eventualmente sufrirá esta suerte por los virus producidos por 
las células que sí fueron infectadas inicialmente (infección secundaria) [15, 
17, 18]. 
 
Por otro lado, el tiempo de infección es la concentración celular del cultivo al 
momento de la infección expresados en células por mililitro (cél/mL). Un 
tiempo de infección óptimo se caracteriza por unidades suficientes de 
nutrimentos, que impidan que se agote durante el cultivo, bajas 
concentraciones de productos de desecho propios del crecimiento celular y 
una adecuada producción proteica. Estas condiciones corresponden a la 
primera mitad de la fase exponencial de crecimiento [14, 15, 17, 20]. 
 
Finalmente, el tiempo de cosecha es un parámetro crítico pues resulta 
importante cosechar la proteína de interés antes de que sufra degradación 
por la liberación de proteasas de las células de insecto lisadas, ya que el 
Antecedentes 
 
� 6
proceso de infección es lítico. Típicamente, se cosecha una vez que la 
viabilidad celular se encuentra alrededor del 80%, sin embargo, esto 
dependerá de cada caso [18, 19]. 
 
En los apartados siguientes se abordarán las propiedades de las PVMimportantes para este proyecto. 
 
2.1.2 Propiedades de PVM 
 
Con el gran interés en el empleo de las PVM en diferentes áreas de la 
nanotecnología, surge la necesidad de conocer sus propiedades, que 
incluyen las propiedades químicas, físicas, biológicas, mecánicas y 
estructurales, entre otras. En este proyecto se estudian de manera 
particular, las propiedades mecánicas y estructurales de la proteína viral VP6 
de rotavirus, ya que el conocimiento de ambas resulta importante para 
determinar sus posibilidades de manipulación, así como su desempeño una 
vez que se han manipulado. Lo anterior servirá para diseñar estrategias de 
modificación para mejorarlos o adecuarlos a las necesidades requeridas [21-
23]. 
 
 
2.1.2.1 Propiedades Mecánicas 
 
Entre estas propiedades se incluyen las elásticas, inelásticas, la integridad 
estructural y las propiedades de fuerza. Las dos primeras permiten predecir 
la deformación elástica e inelástica al aplicar alguna carga sobre el material. 
Por otro lado, el conocimiento de la integridad estructural es fundamental, 
pues cualquier debilidad o fractura puede comprometer la confiabilidad del 
material. Finalmente, las propiedades de fuerza permiten predecir los límites 
de operación permisibles para los diferentes materiales. Entre las 
propiedades de fuerza encontramos parámetros como dureza, módulo 
elástico –también conocido como Módulo de Young –, fuerza de flexión y de 
fatiga, entre otras [24]. 
 
Para estructuras tubulares, una propiedad de utilidad resulta la longitud 
límite, es decir, la longitud más pequeña que puede presentar una 
estructura tubular tras algún tipo de manipulación. Este parámetro nos 
permite conocer los límites en las dimensiones de nanotubos [21]. Un 
método que ha permitido disminuir la longitud de nanotubos es la 
ultrasonicación. Se ha observado que es posible obtener poblaciones más 
cortas de tubos tras aplicar esta técnica [25, 26]. 
 
Con esto en mente, Huang y colaboradores [21] utilizaron la ultrasonicación 
para determinar la longitud límite de nanotubos de diferente naturaleza, 
incluyendo tubos proteicos (fibrillas de insulina, Fig. 1). Tras la aplicación de 
ondas sonoras, se alcanzó para cada muestra una longitud final constante, 
es decir, que ya no cambió al prolongar el tiempo de sonicación, la cual está 
relacionada con la naturaleza de los tubos y que fue comprobada mediante 
Antecedentes 
 
� 7
la fórmula matemática: 
 Llim � 7 x 10-4 d �E (1) 
 
Donde d es el diámetro del tubo y E es el módulo de Young. Esta relación 
fue obtenida a partir del modelaje de los cortes y el estrés producidos por 
los efectos de cavitación [21]. 
 
El módulo de Young es un parámetro comúnmente obtenido para cada 
material, pues es indicador de su resistencia y resulta necesario para 
cálculos que involucran el estrés provocado por la aplicación de fuerzas, 
cargas concentradas, movimientos restringidos, entre otros, así como para 
el diseño de diferentes componentes [27, 28]. 
 
Este parámetro típicamente es definido a partir de la ley de Hooke, que 
describe una proporcionalidad directa entre el esfuerzo aplicado a un 
material con la deformación de éste producto de la primera. Así, el módulo 
de Young corresponde al módulo de elasticidad para una tensión o 
compresión [29]. 
 
Este módulo está altamente relacionado con las energías de unión de los 
átomos, de tal forma que valores altos del módulo de Young indican que es 
necesario aplicar fuerzas igualmente altas para separar los átomos [27]. 
 
 
Fig. 1 Efecto de la aplicación de sonicación sobre fibrillas de insulina. Se presentó una reducción de al 
menos 10 veces en la longitud de los tubos no sonicados (1) tras los primeros 5 minutos de sonicación 
(2) y una disminución de aproximadamente la mitad en estas las longitudes tras 5 horas de sonicación 
(3). [21] 
 
Para estructuras en la nanoescala, este parámetro puede obtenerse 
utilizando el microscopio de fuerza atómica (AFM) [21-23, 31-34]. 
 
 
2.1.2.1.1 Obtención del módulo de Young 
 
Como ya se mencionó, el instrumento comúnmente empleado para 
determinar el módulo de Young es el microscopio de fuerza atómica (AFM). 
El AFM (por sus siglas en inglés, Atomic Force Microscope) es un instrumento 
capaz de analizar y caracterizar materiales a escala microscópica, con el que 
pueden alcanzarse descripciones topográficas de alta resolución desde los 
Antecedentes 
 
� 8
100 nm a 1 μm [30, 31]. Este microscopio fue diseñado en 1986 por Gerd 
Binning, como respuesta a las limitaciones que ofrecía el microscopio de 
barrido por tunelaje, con el que sólo podían describirse materiales que 
condujeran corriente de este tipo [30]. 
 
De esta forma se abrió la posibilidad de estudiar una amplia variedad de 
materiales como vidrios, metales, cerámicos, compuestos electrónicos, 
películas, y, particularmente, abrió la posibilidad de estudiar a organismos 
biológicos [30, 32]. 
 
En lo que respecta a este último punto, ha habido un gran auge en los 
estudios en el área biológica, pues el AFM permite no sólo la descripción 
topográfica de las muestras, sino también el monitoreo de proceso 
dinámicos de células vivas, organelos, proteínas, carbohidratos, DNA, 
etcétera, en soluciones fisiológicas de interés. Ha permitido además, la 
medición de las interacciones de fuerza entre moléculas y su manipulación 
[31, 34]. 
 
El principio en el funcionamiento de este instrumento se ilustra en la Fig. 2, 
donde se observa una viga (Fig. 2, 1) que cuenta en uno de sus extremos 
con una punta (Fig. 2, 2), que permite censar zonas de interés en la 
superficie de la muestra. Un sistema óptico que consta de un fotodiodo (Fig. 
2, 3) registra cambios tan pequeños como 0,1 nm en la posición de 
incidencia de la reflexión un rayo láser (Fig. 2, 4) que es dirigido al extremo 
de la viga donde se encuentra la punta. Cambios en la intensidad de luz 
detectada por el fotodiodo, debido a deflexión y/o torsión de la viga de 
acuerdo a la topografía de la muestra, son procesados por un transductor 
(Fig. 2, 5). Esta información se utiliza para generar imágenes en 3D 
mediante un software. Debajo de la muestra se encuentra un escáner 
piezoeléctrico que permite su movimiento y que es controlado por el 
componente eléctrico (Fig. 2, 6) [31, 32]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 2 Componentes del 
AFM. En el esquema puede 
observarse el circuito de 
retroalimentación [35]. 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
� 9
Las puntas son comúnmente fabricadas de nitruro de silicio y presentan un 
radio de alrededor de 10 nm y diferentes formas (piramidal, piramidal 
truncada, cilíndrica), además pueden estar funcionalizadas química o 
biológicamente. Ya que las imágenes y otros parámetros son obtenidos a 
partir de la interacción de la muestra con la punta, es de suma importancia 
la elección, cuidado y mantenimiento de ésta para obtener resultados 
confiables [31, 32]. 
 
El fotodiodo es un semiconductor que funciona como un detector, que censa 
los desplazamientos verticales y laterales provocados por la deflexión y 
torsión de la viga, respectivamente. El escáner está compuesto por 
cerámicas piezoeléctricas que logran el movimiento al expandirse en una 
dirección deseada en los ejes X, Y y Z, de acuerdo a la aplicación de voltaje. 
Este voltaje es controlado por retroalimentación electrónica del mismo 
equipo [31]. 
 
De acuerdo a lo que se desee obtener, el equipo cuenta con diferentes 
modos de operación, cuya elección también depende de la muestra y el 
ambiente en que se encuentre [31, 32], mismos que se encuentran 
resumidos en la Tabla No. 1. 
 
Tabla No. 1 Modos de operación de AFM 
Modo de 
operación 
Funcionamiento 
Contacto 
La punta se acerca a la muestra, experimentando fuerzas de 
atracción, causando deflexión en la viga. Si el acercamiento 
continúa, eventualmente la punta experimentará fuerzas de 
repulsión 
Altura 
constante 
La distancia entre la punta y la muestra se mantiene constante. 
Las únicas fuerzasexperimentada por la punta es la de 
atracción, lo que provoca deflexión en la viga sin que llegue a 
tocarse la muestra 
Fuerza 
constante 
La deflexión de la punta se mantiene constante por lo que lo 
único que se mueve es el escáner de acuerdo a la topografía de 
la muestra y a la retroalimentación del circuito 
No 
contacto 
La viga se mantiene en una amplitud constante de vibración 
cercana a su frecuencia de resonancia. La interacción punta-
muestra produce cambios en la amplitud, que son detectados y 
con ellos se construye la imagen 
“Tapping” Difiere del modo de no contacto únicamente en la frecuencia de oscilación, que en este caso es mayor 
 
 
Como se ha mencionado, además de la obtención de imágenes, el AFM 
permite la obtención de parámetros mecánicos entre los que se encuentra el 
módulo de Young. Éste se obtiene a partir de indentaciones realizadas con la 
punta del microscopio sobre la muestra [31-33]. 
Para realizarlas se requieren tres pasos: inmovilización de la muestra, 
Antecedentes 
 
� 10
realizar el escaneo de una partícula individual de la muestra para ubicar su 
centro, y, finalmente, realizar la indentación sobre este punto, para así 
obtener una curva fuerza-distancia y con ella obtener los parámetros 
deseados [33]. 
 
Lo anterior se ejemplifica en la Fig. 3, donde a-c muestran la 
nanoindentación, mientras d-f muestran las curvas obtenidas. 
 
Como se muestra en la figura inferior, para realizar la indentación, el 
piezoeléctrico se mueve únicamente en la dirección z. Mientras se acerca la 
punta a la muestra, no existe contacto entre ellas, por lo que la fuerza en la 
viga es cero (Fig. 3, a y d). Sin embargo, eventualmente la punta toca a la 
muestra y con ello empieza a flexionarse, cambiando la señal en el 
cuadrante del fotodiodo (Fig. 3 b línea punteada y e), que corresponde a 
la región linear, reversible de indentación. Si el movimiento en z continúa, 
tanto la deflexión de la viga como la indentación en la partícula aumentarán. 
En el caso de muestras biológicas que suelen ser frágiles, generalmente se 
presenta una ruptura de la estructura (Fig. 3 c y e), que corresponde a la 
región irreversible de indentación [32, 33]. 
 
 
Fig. 3 Esquematización de una indentación realizada sobre una partícula viral utilizando AFM y sus 
curvas de fuerza correspondientes [33]. 
 
El resultado directo arrojado por el equipo tras realizar una indentación es 
una curva de la señal del fotodiodo IPSD en función la posición del 
piezoeléctrico Zp. Para poder utilizar estas curvas, es necesario obtener a 
partir de ellas la relación fuerza-distancia, como la curva ilustrada en la Fig. 
3. Para ello, debe determinarse la constante de sensibilidad (�), parámetro 
Antecedentes 
 
� 11
que relaciona la señal en voltios registrada por el fotodiodo con la deflexión 
de la viga. La señal del fotodiodo puede ser convertida a la deflexión sufrida 
por la viga Zc al dividirse entre la constante de sensibilidad (Zc=IPSD/�). Una 
vez obtenida la deflexión y conociendo la constante de resorte de la viga kc, 
la primera puede convertirse a fuerza a partir de la ley de Hooke: 
 F = kcZc (2) 
Finalmente, es necesario restar la deflexión al movimiento del piezoeléctrico, 
que corresponde a la penetración de la punta en la muestra o indentación � 
[32, 36]. (� =Zp-Zc) 
 
Las curvas obtenidas dependen de la naturaleza de las muestras y de las 
interacciones que presente con la punta [36]. Una vez obtenida la curva 
Fuerza-Distancia, se requiere analizarlas bajo diferentes modelos que 
incluyan los parámetros deseados que mejor describan el comportamiento 
de la muestra, ya que existen diferentes aproximaciones para describir la 
naturaleza de las curvas obtenidas [22, 23, 32, 22, 37, 38]. 
 
 
2.1.1.3 Polimorfismo de PVM 
 
Se ha identificado una importante cantidad de proteínas virales que 
presentan polimorfismo estructural (que pueden ensamblarse en estructuras 
diferentes) dependiendo de las condiciones fisicoquímicas del medio en el 
que se encuentren o si se han producido mutaciones en la secuencia del gen 
que las codifica, conservando una alta estabilidad. Ejemplos de estas 
estructuras polimórficas se encuentran resumidos en la Tabla No. 2, donde 
se indica la proteína que presenta el polimorfismo, el virus al que pertenece, 
así como las nuevas estructuras que es capaz de formar y cómo fue inducido 
este cambio estructural. La Fig. 4 muestra ejemplos de dos de estas PVM 
polimórficas. 
 
Tabla No. 2 PVM polimórficas 
Proteína 
polimorfa 
Virus Forma 
Inducción 
polimorfismo 
Referencias 
VP6 Rotavirus 
Esferas y tubos de dos 
diámetros distintos 
Cambio en pH, fuerza 
iónica y adición de 
iones divalentes 
[11] 
VP1 Poliomavirus 
Icosaedros T=7, T=1 a 
diferentes 
concentraciones y 
estructuras filiformes 
Cambio en pH, fuerza 
iónica y adición de 
Ca2+. Existencia de 
cápsides octaédricas. 
[39] 
Proteína de 
cápside 
Virus mosaico 
del chícharo 
Cápside con extensión 
radial de 29 Å y con 
orificios de 20 Å 
Quelación (EDTA) y 
pH=7. 
[40] 
pVP2 y VP2 
Virus de la 
enfermedad 
infecciosa 
bursal 
pVP2: túbulos; VP2 
cápsides T=1 (FN=13) 
Mutaciones en 
diferentes residuos 
[41] 
 
 
Antecedentes 
 
� 12
T= número de triangulación; FN= forma nativa 
 
 a b c d 
 
 
 
 
 
 
 e f g 
 
 
 
 
Fig. 4. Polimorfismo estructural de PVM. Arriba: Poliomavirus a. pH 7,2 + CaCl2 0,5 mM b. pH 8,5 sin 
CaCl2 c. pH 7,2 + 2,0 (NH4)2SO4 mM d. pH 5,0 + 2,0 (NH4)2SO4 mM (escala: 200 nm) [39]. Abajo: 
Virus de la enfermedad infecciosa bursal e. FN T=1, diámetro 23 nm f. T=13, diámetro 65-70 nm g. 
Tubos, diámetro 45-60 nm [41]. 
 
Por otro lado, la sonicación es una técnica que ha demostrado que también 
puede provocar cambios estructurales ensamblajes proteicos [44], la cual se 
abordará a continuación. 
 
 
2.1.2.3.1 Sonicación 
 
Las oscilaciones acústicas a diferentes frecuencias se aplican ampliamente 
en la industria y en la ciencia tanto para la fabricación y modificación de 
materiales orgánicos como inorgánicos. La aplicación de estas oscilaciones a 
dichos materiales se conoce como sonicación y comúnmente se conoce como 
ultrasonicación a las frecuencias por arriba de 15-20 kHz. 
 
La propagación de estas ondas acústicas tiene como consecuencia la 
transferencia de energía y un cambio en el estado del medio al que se le 
aplican -así como a las partículas suspendidas en él. No obstante, estos 
eventos no provienen de la interacción directa de las ondas mencionadas y 
los solutos a nivel molecular, si no a los fenómenos de cavitación y 
emulsificación que se producen en el medio líquido y a la formación de 
especies reactivas del oxígeno cuando el medio líquido es agua. La 
Tabla No. 2 PVM polimórficas (continuación) 
Proteína 
polimorfa 
Virus Forma 
Inducción 
polimorfismo 
Referencias 
Proteína de 
cápside 
Virus de la 
necrosis del 
pepino 
De la FN T=3 a T=1 en 
el mutante 
Mutación en el dominio 
R de la proteína 
capsular. 
[42] 
Proteína de 
cápside 
Virus del 
mosaico del 
bromo 
Cápside de tamaño 10% 
menor a FN y morfología 
distinta en los canales 
Diferentes RNAs para 
empaquetamiento 
[43] 
Antecedentes 
 
� 13
cavitación es un fenómeno provocado por la formación, crecimiento y fuertes 
colisiones de burbujas que crean calor local intenso (�5000º C) y altas 
presiones (1000 atm), lo que provoca la ruptura y desnaturalización de las 
partículas en solución o suspensión. Por otro lado, la emulsificación crea 
dispersión microscópica de gas provocando la formación de microesferas. 
Finalmente, la degeneración del agua en H· y OH· producidas por cavitación 
provoca la formación de especies reactivas del oxígeno, como peróxido de 
hidrógeno (H2O2), hidroperóxido (HO2), y superóxido (O2·-), que pueden 
oxidar las muestras proteicas suspendidas en el medio [45, 46]. De hecho, 
la formación de estas especies, principalmenteO2·-, son las responsables de 
la obtención de microesferas proteicas [47]. 
 
Los efectos de la aplicación de energía ultrasónica sobre sistemas biológicos 
se describieron desde la segunda década del siglo pasado y desde entonces 
se ha utilizado esta tecnología para alterar las estructuras proteicas desde el 
encapsulamiento con fines terapéuticos, esterilización de instrumentos 
médicos hasta la formación de microesferas proteicas como agentes de eco-
contraste para ultrasonidos, que es el uso más difundido [45]. 
 
Sin embargo, no sólo pueden producirse microesferas. Como ya se 
mencionó, Stathopolus y colaboradores [44] realizaron un estudio cuyos 
resultados arrojaron que, tras el tratamiento ultrasónico de diferentes 
muestras proteicas, se obtuvo la formación de diferentes estructuras que 
van desde las ya conocidas microesferas a estucturas fibrilares y hasta 
algunas otras amorfas (Fig. 5). 
 
 
 
Fig. 5 Polimorfismo de hisactofilina tras 
80 ciclos de sonicación (5 pulsos de un 
segundo y un minuto de incubación por 
ciclo). Izquierda: agregados amorfos. 
Derecha: estructura fibrilar [44] (escala 
= 200 nm). 
 
 
 
 
Ya que existe un creciente interés de caracterizar y manipular a las PVM 
para determinar sus posibles aplicaciones en el área nanotecnológica, la 
ultrasonicación resulta una técnica que podría emplearse para tales fines, 
pues ha mostrado ser efectiva para la formación de nuevas estructuras 
proteicas, sin la necesidad de utilizar disolventes o sales que puedan 
provocar la desnaturalización de las proteínas, impidiendo así futuros 
rearreglos estructurales, la necesidad de eliminar estos componentes en 
pasos subsecuentes, o el empleo de agentes contaminantes. 
 
Para un sistema determinado, es necesario establecer las condiciones 
óptimas de ultrasonicación, por lo que todas las variables involucradas en 
Antecedentes 
 
� 14
este método deben ser tomadas en cuenta, pues todas ellas influyen en los 
resultados obtenidos por esta fuerza. Estos parámetros comprenden el 
tiempo de ultrasonicación y el modo de operación, la temperatura, el 
volumen y concentración de la muestra, el tipo de punta e inmersión del 
sonicador, la geometría del contenedor de la muestra y las propiedades del 
medio donde se encuentre ésta, disuelta o suspendida [48]. En la 
metodología desarrollada en este proyecto se decidió manipular la amplitud 
y tiempo de ultrasonicación, por ser los parámetros más influyentes del 
efecto de la ultrasonicación sobre los materiales, pues ambos se encuentran 
directamente relacionados con el tamaño de la burbuja de sonicación y con 
la cantidad de éstas que puedan formarse, respectivamente. 
 
 
2.2 Proteína VP6 de rotavirus 
 
En la Tabla No. 2, la primera de las proteínas presentadas es VP6. Esta 
proteína, con un peso molecular de 44 KDa, es la proteína estructural más 
abundante del rotavirus (Fig. 6), representando el 51% de la proteína total 
[14]. 
 
 
 
 
 Fig 6. Estructura de Rotavirus 
De color rojo se muestran las espículas de VP4, el color amarillo 
muestra la capa más externa formada por VP7, el azul representa 
la capa compuesta por VP6 mientras el verde la compuesta por 
VP2, finalmente, el anaranjado muestra el RNA y el complejo 
polimerasa [49]. 
 
 
 
 
 
El monómero cuenta con dos dominios, el B y el H (Fig. 7). El primero de 
ellos conforma la base y consiste en un conjunto de 8 � hélices derivados en 
dos segmentos de la cadena. El segundo dominio, en la parte superior de la 
molécula, se dobla presentando una topología tipo rollo �, formado por hojas 
�. Ambos dominios participan en los contactos que estabilizan el trímero 
(Fig. 8) [20, 49]. 
 
 
 
 
 Fig. 7 Dominios de VP6 
Rojo: dominio H; Dorado y azul: residuos 1-150 
(primer segmento, �a-�e) y 331-397 (segundo 
segmento, �f-�h), respectivamente, del dominio B 
[50] 
Antecedentes 
 
� 15
Este trímero es una molécula alargada en forma de torre con 95 Å de largo, 
con base triangular de 60 Å por cada lado, mientras un corte transversal de 
la parte superior permite observar una forma hexagonal de 45 Å de 
diámetro (Fig. 8). 
 
 A. B. C. 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 8 Trímero de VP6 A. Vista superior. B. Representación longitudinal. C. Vista de la base [52] 
El trímero presenta una cavidad en el centro de la base llena de solvente lo 
que restringe el área de contacto y sugiere residuos hidrofílicos en esta 
zona, donde interaccionan los dominios B de los monómeros; caso contrario 
a los contactos hidrofóbicos cercanos que persisten entre los dominios H, lo 
que sugiere menores energías de solvatación para la disociación de los 
dominios B. Además, presenta un ión Zn2+ localizado en el centro de la 
molécula tetracoordinado con el N� de la His153 (altamente conservada 
entre los rotavirus del grupo A) y un ion Cl-1. Esta última unión ayuda a 
compensar la acumulación de cargas positivas. Por otro lado, la presencia de 
cinco sitios de unión para iones Ca2+ ayuda al ensamblaje intra e 
intertrímeros al estar involucrados con el empaquetamiento de los trímeros 
[11, 50]. 
 
La unidad funcional estructural que forma la cápside es el trímero y las 
zonas de los contactos entre ellos son altamente negativas. Los contactos 
que presentan los trímeros pueden clasificarse de dos tipos: quasi 
equivalentes (Q) y no equivalentes (N), siendo el Q el temodinámicamente 
más favorable para la asociación entre trímeros [11, 50]. Las uniones entre 
los trímeros se muestran en la Fig. 9. La cápside presenta un número de 
triangulación T=13, obtenido a partir de la ecuación T= h2+ hk+ k2 de la 
teoría de cuasi-equivalencia descrita por Casper y Klung. Este parámetro 
representa el número de unidades triangulares que forman las caras del 
icosaedro, de acuerdo a la relación entre los hexámeros y pentámeros que la 
forman. Es decir, es un indicador del tamaño de la cápside. En la ecuación, h 
y k corresponden a las coordenadas entre el centro de un pentámero y el 
correspondiente del pentámero más cercano a él. En el caso de T=13, las 
coordenadas son (3,1). 
 
 
 
 
 
 
Antecedentes 
 
� 16
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 9 Trímeros de la capa intermedia y contacto entre ellos. A. Cinco trímeros independientes B. Vista 
lateral de la unión entre los trímeros. Insertos: potencial electrostático superficial del trímero de VP6 
Rojo: cargas negativas. Azul: cargas positivas [50]. 
 
2.2.1 Polimorfismo estructural de VP6 
 
Características importantes de esta proteína son su capacidad de 
autoensamblarse tanto in vivo como in vitro y el polimorfismo estructural 
que presenta en ausencia de las demás proteínas del virus y bajo distintas 
condiciones de pH, fuerza iónica y/o concentración de iones. De todas las 
condiciones fisicoquímicas mencionadas, el pH es el factor que más influye 
en las conformaciones que tomará dicha proteína (Fig. 10): 
- A pH mayores de 7 se forman partículas tubulares con un diámetro de 
alrededor de 45 nm y con una longitud de hasta 5 micrómetros (Fig. 
10 D). 
- A pH entre 5,5 y 7 se forman tubos con un diámetro mayor: 75 nm 
(Fig. 10 C). 
- A pH entre 3 y 5,5 se observan partículas esféricas de tamaño 
heterogéneo, aunque la mayoría muestra un diámetro de 75 nm (Fig. 
10 B). 
 
 
 (A) 
 
 (C) 
 
(D)
 
 
 
(B)
 
 
 
 
 
Fig. 10 Polimorfismo de VP6. Izquierda: diagrama de fases de VP6 bajo diferentes condiciones de pH 
y fuerza iónica. Derecha: caracterización de las estructuras encontradas por microscopía electrónica 
[11] (Escala = 0,1 μm). 
Antecedentes 
 
� 17
Todos ellos muestran una superficie pseudo-hexagonal de trímeros de VP6 
[11]. Cabe hacer mención que estas estructuras son parecidas en forma a 
las encontradas por Carrascosa y colaboradores para el birnavirus IBDV 
antes mencionado en la Tabla No. 2 y cuyo polimorfismo se muestra en la 
Fig. 4 [41]. 
 
Con base en loanterior, se infirió que el estado de protonación de VP6 
determina el tipo de ensamblaje, pudiendo afectar los contactos laterales 
entre los trímeros. Dichos contactos presentan carga negativa (Fig. 9 B), 
por lo que se requieren cargas positivas para contrarrestar fuerzas 
repulsivas y favorecer a los contactos Q. A bajos valores de pH, la 
protonación es capaz de compensar dichas cargas y dar origen a las formas 
estéricas (Fig. 10 B), sin embargo, conforme aumenta el pH (y con ello 
disminuye la concentración de cargas positivas), las cargas negativas no son 
compensadas, y se forman dos contactos Q para los tubos de 75 nm de 
diámetro y únicamente uno de ellos para los tubos de 45 nm. Los contactos 
restantes presentes en los trímeros son uno débil para los primeros, 
mientras uno débil y uno simple para los segundos [11]. 
 
Por otro lado, experimentos realizados por nuestro grupo de trabajo, 
encontraron que, al someter a VP6 a ultrasonicación, se obtuvieron espirales 
y tubos con extremos redondos, conformaciones de VP6 no descritas 
anteriormente (Fig. 11). Este hallazgo pone de manifiesto que la 
ultrasonicación puede emplearse como una nueva técnica para la 
manipulación de los ensamblajes de la proteína VP6, con miras en la 
obtención de nuevas macroestructuras que puedan ser aprovechadas como 
moldes o acarreadores dentro de la nanotecnología. 
 
 
 
 
 
 
 Fig. 11 Polimorfismo de VP6 tras sonicación 
Derecha: espirales. Izquierda: tubos con 
extremos redondos [datos no publicados]. 
 
 
 
 
 
 
2.2.2 VP6 como molde para nanomateriales 
 
 
Esferas y tubos de VP6 con las características antes mencionadas [11] han 
sido producidas con éxito mediante el sistema de expresión célula de 
insecto-baculovirus, obteniéndose rendimientos de hasta el 20 % y con una 
pureza del 98% [14, 20]. 
Antecedentes 
 
� 18
Cuando VP6 presenta una configuración tubular, los residuos expuestos se 
encuentran libres para interaccionar con el ambiente y otras especies 
químicas, tanto en la superficie como en la luz del tubo, por lo que puede ser 
funcionalizada y/o modificada químicamente. Además de esto, los tubos 
pueden alcanzar hasta cinco micrómetros de largo [20], preservando su 
diámetro en la escala nanométrica. Aunadas a las características de PVM, 
VP6 resulta una molécula de gran interés para su uso como molde para 
nanomateriales. 
 
Estudios sobre su funcionalización con los metales los plata, oro, platino y 
paladio han sido reportados. En ellos se encontró que los iones de dichos 
metales formaron nanopartículas metálicas sobre la superficie de VP6, las 
cuales fueron estables y no modificaron la estructura tubular de la proteína 
(Fig. 12). En este reporte se sugirió que la estabilización de los iones 
metálicos sobre la proteína se debe a la presencia de aminoácidos con alta 
afinidad a metales como asparagina, ácido glutámico e histidina, en la 
superficie externa de los tubos. 
 
Los tipos de funcionalizaciones obtenidas fueron la cobertura total o parcial 
de la superficie de los tubos (Fig. 12). El tipo de los depósitos metálicos 
obtenidos fue manipulado mediante el uso de diferentes precursores 
metálicos y a partir de cambios en su concentración; así como mediante 
diferentes agentes reductores. Lo anterior pone de manifiesto la versatilidad 
de materiales en composición y patrón de funcionalización que pueden 
obtenerse a partir de VP6 [20]. 
 
 
Fig. 12 Funcionalizaciones metálicas sobre nanotubos de VP6. A y B. Funcionalizaciones con oro 
(HAuCl4 1 M). C y D. Funcionalizaciones con platino (K2PtCl4 1M). Los agentes reductores fueron 
citrato de sodio para A y C, y borohidruro de sodio para B y D [51] (Escala = 50 nm). 
 
A pesar de que se conocen las conformaciones de VP6 bajo diferentes 
condiciones físico-químicas y que se sabe que la ultrasonicación puede 
provocar cambios en su estructura, se requieren estudios que busquen 
conocer la relación entre las diferentes variables involucradas en los efectos 
producidos por la ultrasonicación, así como diferentes valores de pH –por ser 
un parámetro fundamental en el polimorfismo estructural de VP6 –para 
proponer nuevas metodologías de manipulación de la estructura de dicha 
proteína, con el propósito de obtener nuevas estructuras que diversifiquen 
Antecedentes 
 
� 19
su uso dentro de la nanotecnología. 
 
Por otro lado, estudios sobre sus propiedades mecánicas tampoco han sido 
desarrollados. La determinación de parámetros como la longitud límite y el 
Módulo de Young resultan importantes para conocer los límites de 
manipulación de VP6 y así determinar sus posibles aplicaciones. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Hipótesis y Objetivos 
 
� 20
3. Hipótesis y Objetivos 
 
 
Hipótesis 
 
Los efectos producidos por la ultrasonicación sobre macroestructuras 
proteicas incluyen la disminución de la longitud cuando dichas estructuras 
son tubulares y cambios en los arreglos proteicos. Además, a partir de ella 
es posible describir las propiedades mecánicas de las estructuras. A partir de 
la aplicación de diferentes parámetros de sonicación, es posible estudiar las 
propiedades mecánicas de la proteína VP6 de rotavirus, así como inducir o 
dirigir la formación de nuevas conformaciones estructurales de dicha 
proteína. 
 
 
 
Objetivo general 
 
Determinar la longitud límite y el módulo de Young de los nanotubos de VP6 
de rotavirus tras someterlos a diferentes tiempos de ultrasonicación y 
mediante nanoindentaciones realizadas con el microscopio de fuerza 
atómica, respectivamente, así como estudiar el polimorfismo estructural de 
VP6 mediante la aplicación de diferentes amplitudes de ultrasonicación y 
valores de pH. 
 
 
Objetivos particulares 
- Producción y purificación de VP6. 
- Desarrollar de la metodología para la determinación de las propiedades 
mecánicas de VP6 mediante sonicación y microscopía de fuerza 
atómica. 
- Desarrollar de la metodología de sonicación para el estudio del 
polimorfismo proteico y su caracterización. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Metodologías 
 
� 21
4. Metodologías 
 
4.1 Líneas celulares: 
 
Las líneas celulares que se utilizaron fueron Sf9 (ATCCCRL-1711) 
(Spodoptera frugiperda) para la propagación y la cuantificación del título 
viral, y HighFive® (Invitrogen, USA) (Trichoplusia ni), para la producción de 
VP6, cultivadas en matraces Erlenmeyer utilizando 30 mL de medio libre de 
suero SF-900 II (Invitrogen, USA) y Ex-Cell 405 (Sigma-Aldrich, USA) 
respectivamente, a 110 rpm de agitación y a una temperatura de 26ºC. 
 
 
4.2 Baculovirus recombinante: 
 
Se empleó el baculovirus (AcMNPV) recombinante bacVP6 que contiene el 
gen que codifica para VP6 cepa SA-11, bajo el promotor de poliedrina. 
 
 
4.3 Cinéticas de producción: 
 
4.3.1 Cultivos celulares 
Para la producción de VP6 se emplearon las células HighFive® y se 
seleccionó una MDI= 1,0 ufp/cél del stock viral de baculovirus. Los cultivos 
contaban con una viabilidad superior al 95% en fase exponencial y una 
densidad de 1x106 células/mL al momento de la infección. Fueron tomadas 
muestras cada 24 h.p.i. (horas post-infección) para determinar 
concentración celular, viabilidad y concentración de VP6. El cultivo fue 
cosechado a las 96 h.p.i. y se obtuvo el sobrenadante centrifugando a 4,000 
xg por 10 min a 4ºC, que posteriormente fue sometido a las etapas de 
purificación. 
 
Para la producción del stock viral se infectaron 30 mL de células Sf9 a un 
TDI=0,5x106 céls/mL con una MDI= 0,1 ufp/cél. Se cosecharon y se obtuvo 
el sobrenadante como se indica para la producción de VP6. En este caso se 
almacenó el sobrenadante a 4ºC, se agregó 1% de suero fetal bovino, y se 
llevó a cabo la titulación viral. 
 
 
4.4 Métodos analíticos 
 
4.4.1 Determinación de concentración y viabilidad celular. 
Se determinó la concentración celular con un hematocitómetro, 
determinando la viabilidad con la técnica de tinción diferencial con azul de 
tripano.4.4.2 Determinación del stock viral de baculovirus en células Sf9 
Se siguió la técnica propuesta por Mena et al. [52], basada en la 
determinación de viabilidad celular mediante el uso de MTT, una sal de 
Metodologías 
 
� 22
tetrazolio que es convertida en formazán insoluble tras ser metabolizada por 
deshidrogenasas mitocondriales. Este formazán fue disuelto en DMSO y su 
concentración se determinó mediante absorbancia a 570 nm. A partir de 
ella, se realizan los cálculos utilizando el software Sigma Plot para conocer 
las unidades formadoras de placa/mL. 
 
4.4.3 Geles de poliacridamida y Western blot 
Para ambos se siguió la metodología descrita por Mena [14] y Plascencia 
[20] con el fin de determinar la pureza e identidad de la proteína 
recombinante en las muestras. Para determinar la pureza se utilizaron geles 
desnaturalizantes con un gel concentrador al 4% y uno separador al 12% de 
acrilamida. Se tomaron 12 μL de muestra y se adicionaron 4 μL de solución 
amortiguadora de lisis (250 mM Tris-Base pH 6,8, 10% SDS, 20% glicerol, 
20% �-mercaptoetanol y azul de bromofenol), se hirvieron por 5 minutos y 
se cargaron en el gel. Se corrieron a 150 V por 90 minutos. Para determinar 
la identidad de VP6, se transfirieron las proteínas a una membrana de 
polifluoruro de vinilideno, PVDF (Millipore, USA) en cámara húmeda por una 
hora a 150 V. Tras la transferencia, se bloquearon las membranas con una 
solución de leche sin grasa al 5 % en TBS por una hora y posteriormente, se 
incubaron con el suero policlonal de conejo anti-rotavirus cepa NCDV 
(producido por M.C. Ana Ruth Pastor en el Bioterio del IBt UNAM). 
Transcurrido una hora, el anticuerpo primario fue lavado cuatro veces con 
TBS más Tween al 1%. Posteriormente, se incubó la membrana por una 
hora con el anticuerpo secundario anti IgG de conejo conjugado con 
peroxidasa (Jackson Immunochemicals, USA) y se lavó cuatro veces con TBS 
+ Tween 1%. Las proteínas se identificaron adicionando una solución de 
carbazol al 25% en amortiguador de acetatos 5,5. 
 
 
4.4.4 Cuantificación de proteína 
La cuantificación, tanto de proteína total como de VP6, se realizó según 
indica Plascencia [20] usando los ensayos Bradford y ELISA, 
respectivamente. Para el primero se empleó la técnica de ensayo de 
Bradford (BIO-RAD, USA) en microplacas de 96 pozos, utilizando albúmina 
bovina (0-80 μg/mL) para la curva patrón. Para el segundo, se utilizó el kit 
ProSpect* Rotavirus Microplate (ThermoFisher Scientific, USA), un ensayo 
enzimático directo para detectar rotavirus del grupo A, empleando como 
estándar VP6 purificada (0.08-8 μg/100 μL), realizando el ensayo de acuerdo 
a las instrucciones del fabricante. 
 
 
4.5 Purificación de VP6 
Se llevó a cabo la metodología descrita por Mena [14], que consta de etapas 
continuas de ultrafiltración con membrana 100 kDa, empleando un sistema 
Amicon (Millipore, USA); cromatografía de intercambio aniónico en un 
sistema ÄKTAprime (GE Healthcare, Buchinghamshire, RU) utilizando 40 mL 
de la resina Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, USA) empacada en una 
Metodologías 
 
� 23
columna XK-16 (GE Healthcare, USA) y cromatografía líquida de permeación 
en gel (FPL-GP) empleando 400 mL de la resina HW-65F y un flujo de 2,0 
mL/min (TOSOH Corporation, Japón) empacada en una columna tipo XK-26, 
con un flujo de 2,5 mL/min. 
 
 
4.6 Estudio de las propiedades mecánicas de VP6 
 
4.6.1 Longitud límite 
Los lotes de proteína purificada y reensamblada se sometieron a diferentes 
tiempos de sonicación: 15, 30, 60, 90 y 180 segundos (Sonicator Q700, 
QSonica, USA) con una amplitud de sonicación de 2%, utilizando 10 μg de 
proteína total en 500 μL, manteniendo la temperatura del medio en 15 ºC. 
Los ensayos se realizaron por duplicado y la longitud se midió a partir de las 
fotografías obtenidas por microscopía electrónica utilizando el software 
ImageJ64 (NIH, USA). Las fotografías se obtuvieron siguiendo la 
metodología que se desarrolló durante este trabajo, la cual se encuentra 
descrita en la sección Resultados y análisis en el punto 5.3.1 Longitud límite. 
 
4.6.2 Módulo de Young 
Los lotes de proteína purificada y reensamblada se observaron utilizando el 
microscopio de fuerza atómica diMultimode (Veeco). Tras obtener las 
imágenes se realizaron varias indentaciones sobre el centro del tubo, a partir 
de las cuales se obtuvieron las curvas fuerza-distancia, que posteriormente 
fueron utilizadas para el cálculo del Módulo de Young. 
 
 
4.7 Estudio del polimorfismo estructural de VP6 
 
4.7.1 Reensamblaje de VP6 
La proteína recombinante obtenida se desensambló de acuerdo a la 
propuesta de Mena [9], utilizando CaCl2 300 mM y una concentración de VP6 
mayor a 200 μg/mL. El reensamblaje se realizó mediante un sistema Amicon 
de ultrafiltración con una membrana de 10 KDa y utilizando cromatografía 
líquida de alta resolución (Waters, USA) con una columna de exclusión por 
tamaño (Ultrahydrogel 500, Waters, USA) para identificar el momento de 
formación de macroestructuras de VP6, monitoreando mediante 
fluorescencia de triptófano y absorbancia a 280 nm. 
 
Una vez determinada la concentración de VP6 y de CaCl2 necesarias para el 
reensamblaje, se realizó un monitoreo más detallado utilizando dispersión 
estática de luz en el espectrofluorímetro LS-55 (Perkin-Elmer, UK) como 
describe Mena [14] tras agregar EGTA en una cubeta de cuarzo de 500 μL de 
volumen en agitación constante y con temperatura controlada a 27º C con 
un baño termostatado. Tanto el monocromador de excitación como el de 
emisión se colocaron en la misma longitud de onda (550 nm). 
 
 
Metodologías 
 
� 24
4.7.2 Efecto de sonicación sobre macroestructuras de VP6 
Las proteína VP6 purificada se incubó bajo pH 5 y 7. El cambio de 
amortiguador se realizó mediante ultrafiltración utilizando un sistema 
Amicon de 10 mL con una membrana de 10 KDa. Se les sometió a 9 
segundos totales de sonicación (Sonicator Q700, Misonix Sonicators, USA) a 
1 y 2% de amplitud, empleando 10 μg de proteína total en 500 μL, 
manteniendo la temperatura del medio en 15 ºC. 
 
Los cambios en estructura y/o tamaño se caracterizaron por microscopía 
electrónica de transmisión. 
 
 
4.8 Técnicas de microscopía 
 
4.8.1 Microscopía electrónica de transmisión 
Las observaciones se hicieron en microscopio electrónico Zeiss EM 900 
(Zeiss, Alemania), utilizando la técnica de tinción negativa descrita por Mena 
[14]. Se colocaron 10 μL de muestra sobre una rejilla de cobre de 200 mesh 
fomvar/carbón. Transcurridos 5 minutos, se retiró la gota con papel 
cromatográfico. Se colocaron 10 μL de solución de acetato de uranilo al 
2,5% por tres minutos, se absorbió la gota y se realizó un lavado colocando 
agua ultrapura por un minuto. 
 
4.8.2 Microscopía de fuerza atómica 
Los escaneos se realizaron utilizando el microscopio de fuerza atómica 
diMultimode operado con el controlador diNanoscope (Veeco, 2010). Las 
superficies empleadas fueron mica, óxido de silicio, vidrio, HOPG (grafito 
pirolítico altamente organizado). 
Para las funcionalizaciones de las superficies con silanos y glutaraldehído se 
siguieron los protocolos descritos por Howarter John y colaboradores [57] y 
Zhan-Hui Wang y colaboradores [56]. 
En el primero, se lavaron las superficies de mica o vidrio. Posteriormente se 
pusieron en contacto con una solución de 33% (3-Aminopropil)trietoxisilano 
(Sigma-Aldrich, USA) y 67% de etanol puro por 24 horas en un baño de 
agua a 62º C, seguido por lavados con etanol puro. 
En el segundo, las superficies fueron lavadas con una solución de peróxido 
de hidrógeno y ácido sulfúrico concentrado (1:3 v/v) por 30 min. 
Posteriormente se pusieron en contacto con una solución de 5% (3-
Aminopropil)trietoxisilano (Sigma-Aldrich, USA), 5% de agua y 90% de 
etanol puro por 1 hora y se lavaron con etanol. Finalmente, se pusieron en 
contacto en una solución al 2,5 % de glutaraldehído (Sigma Aldrich, USA) en 
amortiguador PBS por 2 h, seguido de lavados con PBS. 
 
Laspuntas utilizadas para el modo tapping fueron RTESP (Veeco) y para 
modo fuerza NP-10 (Veeco), ambas de nitruro de silicio. 
 
 
 
Metodologías 
 
� 25
4.9 Modelo estadístico 
 
Para determinar el valor de significancia entre los promedios de las 
longitudes de las diferentes muestras tras la sonicación, se realizó la prueba 
estadística t-student empleando un Script de R (R Development Core Team, 
Nueva Zelanda). El paquete de R empleado fue stats. Los valores con 
p<0,05 se consideraron significativos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Resultados y discusión 
 
� 26
5. Resultados y discusión 
5.1 Producción del stock viral 
 
La infección para producir nuevos stock virales fue monitoreada a partir de 
la concentración celular y la viabilidad. Una vez alcanzadas viabilidades 
menores al 80%, a las 96 h se procedió a cosechar el cultivo y a separar el 
sobrenadante del paquete celular (Fig. 13). Ya que el baculovirus es un 
virus lítico, se almacenó el sobrenadante y se desechó el pellet. 
 
Fig. 13. Cinética de crecimiento de células Sf9 tras la infección con el baculovirus BacVP6, para la 
producción de stocks virales (n=3). 
 
El stock viral fue titulado mediante la metodología diseñada por Mena, et. al. 
[52]. Los títulos se encontraron alrededor de los 107-108 pfu/mL, lo que es 
índice de un buen título viral y coincide con los niveles de producción 
reportados en el laboratorio [14]. 
 
 
 
5.2 Producción y purificación de VP6 
 
Una vez producido y titulado el stock viral, con él se infectaron 500 mL de 
cultivo de células HighFive® a un TDI de 1x106 céls/mL y con una MDI de 
1,0 pfu/mL. 
 
La cinética de infección se determinó mediante la medición de la 
concentración celular y viabilidad. Estos parámetros se utilizaron para 
determinar el momento de cosecha, que se llevó a cabo al tiempo 
postinfección en el que se alcanzaran viabilidades por debajo del 80% y se 
observaran células lisadas bajo el microscopio óptico. Ejemplo de las 
cinéticas se presenta en la Fig. 14, donde se observa que las células sólo 
crecieron las primeras 24 h.p.i., pues a las 48 h.p.i hay una disminución en 
la concentración de ellas, que coincide con una disminución en la viabilidad, 
Resultados y discusión 
 
� 27
que llegó alrededor del 60% a las 96 h.p.i. En este momento se cosechó el 
cultivo para evitar la degradación de VP6 por la liberación de proteasas, ya 
que está reportado que éstas pueden degradar a la proteína de interés. Este 
comportamiento coincide con lo reportado por Plascencia [20]. 
 
 
Fig. 14 Cinética de crecimiento de células H5 tras ser infectadas con el baculovirus BacVP6 para la 
producción de tubos de VP6 (n=3). 
 
El objetivo del proceso de purificación es la obtención de tubos de VP6 libres 
de contaminantes. Para ello, es necesario eliminar el resto de proteínas 
(virales, hospederas, medio agotado) y desechos celulares que se 
encuentran en el medio de cultivo, así como de VP6 no ensamblada. La 
metodología empleada incluye tres etapas: centrifugación y ultrafiltración, 
cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía líquida de 
permeación en gel, resumidas en la Fig. 15. 
 
Fig. 15. Resumen de las etapas de producción y purificación de VP6 
 
 
5.2.1 Primera etapa: centrifugación y ultrafiltración 
 
El caldo de cultivo se centrifugó como se indica en Materiales y Métodos, 
tras la adición de azida de sodio 0,1% para evitar el crecimiento bacteriano. 
Resultados y discusión 
 
� 28
Resulta importante, también, mantener la temperatura de centrifugación de 
4ºC, para evitar desnaturalización proteica. Una vez separado el paquete 
celular se obtuvo el sobrenadante, con el que se prosiguió la purificación. El 
paquete celular se desechó. 
 
El sobrenadante se concentró dos veces a través de un sistema de 
ultrafiltración, utilizando una membrana de celulosa regenerada con un corte 
de 100 KDa. Con ello se aprovecha la diferencia de tamaño entre las 
macroestructuras de VP6 con el resto de proteínas con tamaños menores a 
100 KDa que se encuentran en el caldo para separarlas. Además este paso 
permitió la concentración de la muestra. Se tomaron muestras del permeado 
para descartar la pérdida de proteína durante esta etapa. Para minimizar la 
deposición de las proteínas durante la filtración, se mantuvo la muestra en 
ligera agitación evitando dañar los tubos de VP6. Sin embargo existen 
pérdidas de proteína durante este proceso, debidas precisamente a la 
proteína adherida a la membrana. 
 
 
5.2.2 Segunda etapa: intercambio aniónico 
 
Después de la separación por tamaño, la muestra concentrada aún contiene 
contaminantes: baculovirus, y restos de DNA viral y hospedero, 
principalmente. Esta segunda etapa tiene como objetivo separar la proteína 
heteróloga de estas dos contaminantes (baculovirus y DNA), que presentan 
carga negativa y grupos fosfato que pueden interaccionar con la resina, 
respectivamente. 
 
En la cromatografía de intercambio aniónico se emplea la resina Q 
Sepharose Fast Flow con un flujo de 2,0 mL/min y 20 mL de muestra por 
inyección. El cromatograma resultante muestra dos picos de absorbancia 
(Fig. 16 A). El amortiguador de carga tiene un pH de 6,16, que 
corresponde al punto isoeléctrico teórico de VP6. De esta forma la proteína 
presenta carga neutra, inhabilitándola para interaccionar con la resina de 
carga positiva, por lo que eluye inmediatamente después del volumen 
muerto. De esta forma, la primera absorbancia registrada por el equipo 
corresponde a VP6. Por otro lado, bajo este mismo pH, la proteína gp64, con 
un punto isoeléctrico teórico de 5,5, presenta carga negativa, lo que le 
permite interaccionar con la resina y, con ello, ser separada de VP6. De igual 
forma, el DNA contaminante, es retenido en la columna gracias a la 
interacción de sus grupos fosfatos de carga negativa con la resina. Ambos 
eluyeron tras adicionar un amortiguador con alta fuerza iónica (Fig. 16 A), 
como cloruro de sodio 1M, lo que además regenera la carga de la columna. 
 
 
5.2.3 Tercera etapa: cromatografía líquida de permeación en gel (FPLC-GP) 
 
El primer pico de la etapa anterior contiene VP6 por lo que fue colectado, 
concentrado alrededor de 5 veces mediante un sistema de microfiltración 
Resultados y discusión 
 
� 29
(membrana 30 KDa) y sometido a la siguiente etapa cromatográfica. Esta 
muestra contiene VP6 tanto monomérico como trimérico y macroestructura. 
Al inyectar 30 mL de muestra con un flujo de 2,5 mL/min a la columna HW-
65F, se obtuvieron tres picos (Fig. 16 B). 
 
Basados en el principio de la filtración en gel, entre mayor tamaño presente 
el analito, menor interacción tendrá con la resina, al no poder acceder a los 
orificios que ésta presenta. De esta forma, las proteínas grandes 
presentarán un menor tiempo de retención, contrario a las proteínas 
pequeñas, que acceden a estos orificios, retardando su elución. 
 
La resina utilizada para FPLC-GP cuenta con un tamaño de poro de 200 nm, 
lo que permite separar macroestructuras de VP6 de sus respectivos 
monómeros (44 KDa) y trímeros (132 KDa) y otras proteínas de bajo peso 
molecular. De esta forma, el primer pico corresponde a tubos de VP6. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 16 A. Cromatograma correspondiente a cromatografía de intercambio aniónico B. Cromatograma 
correspondiente a cromatografía líquida de permeación en gel. 
Para corroborar la identidad de los picos eluídos de ambas etapas 
cromatográficas, se realizaron geles desnaturalizantes de poliacrilamida 
(PAGE-SDS) y western blot (Fig. 17). En el primero de ellos puede 
apreciarse cómo gp64 y VP6 están presentes en el caldo de cultivo 
concentrado (Fig. 17 carril 3 PAGE-SDS). Tras la primera etapa de 
cromatografía puede observarse la separación de ellas: el carril 
correspondiente al pico 1 de intercambio aniónico (Fig. 17 carril 5 PAGE-
SDS) muestra únicamente la presencia de VP6, mientras el carril 
correspondiente al pico 2(Fig. 17 carril 7 PAGE-SDS) muestra la presencia 
única de gp64. El western blot comprobó lo anterior al no haber señal de la 
proteína de interés en el carril correspondiente a este segundo pico (Fig. 17 
carril 7 Western Blot). Por otro lado, ambos ensayos muestran que para la 
segunda etapa cromatográfica, únicamente está presente VP6 en el pico 
Resultados y discusión 
 
� 30
colectado (Fig. 17 carriles 8, 9 y 10 PAGE-SDS y Western Blot), obteniendo 
esta proteína a una pureza mayor del 95%.
 
Estos datos son consistentes con lo reportado por Mena [14] y Plascencia 
[20]. 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
 
 
 
 75 KDa gp64 
 
 59 KDa VP6 
 
 
 
 
 
 
 
 
 75 KDa 
 VP6 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 17 Arriba. PAGE-SDS Abajo Western Blot 1) Marcador de peso molecular Dual Color, 2) Control 
positivo VP6, 3) Caldo de cultivo concentrado, 4) Permeado caldo de cultivo, 5) Pico 1 intercambio 
aniónico concentrado, 6) Permeado Pico 1 intercambio aniónico, 7) Pico 2 intercambio aniónico, 8) 
Pico 1 exclusión en gel, 9) Pico 2 exclusión en gel, 10) Pico 3 exclusión en gel 
 
Por otro lado, para comprobar el correcto ensamblaje de VP6 en tubos, el 
Pico 1 de la etapa de exclusión en gel fue visualizado bajo el microscopio de 
transmisión electrónica (TEM), empleando tinción negativa con acetato de 
uranilo. En la Fig. 18 pueden observarse tubos de hasta 5 micrómetros de 
largo, diámetro de alrededor de 80 nm y el arreglo hexagonal típico que 
forman los trímeros de VP6. Dimensiones y características antes reportadas 
[11, 14, 20]. 
 
 
Resultados y discusión 
 
� 31
 
Fig. 18. Micrografías con tinción negativa al microscopio electrónico de transmisión. Izquierda: 
macroestructuras purificadas de VP6. Derecha: acercamiento a tubo de VP6. 
 
El procedimiento muestra ser efectivo para la obtención de tubos de VP6 
puros. El análisis cuantitativo de proceso se muestra en la Tabla No. 3, en 
la que se observa un rendimiento final de alrededor del 3%. La cantidad de 
proteína purificada obtenida en estos ensayos se encuentra por debajo de lo 
reportado por Mena [14] hasta casi siete veces, lo mismo para el 
rendimiento. 
 
Tabla No. 3. Proteína total cuantificada en cada etapa de purificación y sus 
respectivos rendimientos 
Etapa Volumen VP6 (μg/mL) VP6 (mg) Rendimiento (%) 
Caldo de cultivo 
Concentrado 250 341 85,25 100 
Intercambio aniónico 
concentrado 110 106 11,66 13.68 
Exclusión en gel concentrado 45 55.6 2,50 2.93 
 
 
La baja producción puede deberse a que se empleó un medio de cultivo 
diferente al utilizado en los trabajos reportados por Mena y Plascencia [14, 
20] o a la edad del cultivo empleado. Este fue un problema que se presentó 
durante el desarrollo del proyecto, por lo que se requiere mejorar el proceso 
o realizar los estudios que permitan la identificación de mejores condiciones 
de producción. El bajo rendimiento, por otro lado, puede deberse al amplio 
uso de las resinas de intercambio aniónico con lo que pierden carga y con 
ello capacidad de separar las proteínas, ya que fue en esta etapa donde se 
presentó hasta un 85% de pérdida de proteína (Tabla No. 3), aunque la 
pérdida de proteína puede deberse también a las etapas de ultrafiltración 
Resultados y discusión 
 
� 32
debido a la adhesión de VP6 a la membrana. De igual forma se observan 
pérdidas durante la etapa de exclusión en gel, que pueden deberse a un 
incorrecto ensamblaje de VP6 o a algún daño sufrido durante la 
manipulación de la proteína en los pasos anteriores, con lo que se pueden 
dañar los tubos y obtener VP6 monomérica/trimérica que eluye en picos 
subsecuentes. Los resultados de la concentración de proteína total de las 
etapas de purificación, así como su rendimiento, se muestran en la Tabla 
No. 3. 
 
 
5.3 Propiedades mecánicas de VP6 
 
La descripción de las propiedades mecánicas de las nuevas nanoestructuras 
resulta fundamental para conocer sus características y, de acuerdo a ello, 
sus posibilidades de manipulación y desempeño [21]. Ya que VP6 es una 
molécula con potencial para su uso como molde para nuevos 
nanomateriales, es importante conocer dichas propiedades. 
 
 
5.3.1 Longitud límite 
 
Una de estas propiedades es la longitud límite, que, según Huang y 
colaboradores [21], se define como la longitud más pequeña que puede 
presentar una estructura tubular tras varios ciclos de ultrasonicación. De 
acuerdo con esto, para el caso de VP6 se aplicaron diferentes tiempos de 
ultrasonicación buscando hallar dicha longitud. 
 
Los primeros experimentos tuvieron como objetivo determinar la amplitud 
de ultrasonicación más adecuada. Para ello, se tomaron 500 μL de muestra 
con 10 μg totales de proteína y se sonicaron por 3 ciclos de 3 segundos 
manteniendo la temperatura constante a 15ºC a 1, 2, 4, 8, 12 y 20% de 
amplitud. Se midieron los tubos sonicados a cada amplitud y se tomó como 
referencia el efecto de cada amplitud sobre la población mayor a 1 000 nm. 
En la Fig. 19 se presentan los resultados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fig. 19. Efecto de la amplitud sobre la longitud de los tubos de VP6, tras 9 s de sonicación. 
Resultados y discusión 
 
� 33
Como se observa en la figura, a partir de amplitud 2% se presenta una 
disminución en el porcentaje de tubos con longitudes mayores a 1000 nm. 
La magnitud de esta disminución se mantiene similar en amplitudes 
mayores, por lo que se decidió emplear esta 2% de amplitud para los 
ensayos subsecuentes. 
 
Para obtener la longitud límite, se sonicaron los tubos por 15, 30, 60, 90 y 
180 s totales. En ellos se emplearon 10 μg totales de proteína en 500 μL y 
se sonicaron por 3 ciclos de 3 segundos manteniendo la temperatura 
constante. De acuerdo a la literatura, los ensayos de ultrasonicación se 
prolongan hasta las 5 h [21]. Ya que no contábamos con estudios similares 
para VP6, se decidió comenzar con tiempos cortos de ultrasonicación. 
 
Se tomaron fotografías de las muestras utilizando el TEM para determinar la 
longitud de los tubos control y sonicados. La rejilla donde se deposita la 
muestra cuenta con 200 mesh. Como una manera de homogenizar el 
muestreo de todos los ensayos, evitar la influencia del operador y optimizar 
los tiempos de observación, se desarrolló y aplicó un muestreo similar al que 
se realiza en la cámara de Neubauer (empleada para el conteo celular). El 
procedimiento consistió en localizar los mesh ubicados en las zonas superior 
e inferior derecha e izquierda, así como un mesh del centro. Dentro de cada 
uno de esos mesh seleccionados, se fotografiaron a su vez las zonas 
superior e inferior derecha e izquierda y la parte central (Fig. 20). Con esta 
metodología se obtuvieron en total 25 fotografías por ensayo, a una 
magnificación de 12K. Esto nos permitió contar más de 200 tubos por 
ensayo, número significativo de muestreo [21]. Además, nos permitió 
disminuir las horas de microscopía electrónica, optimizando los ensayos. 
 
 
 
 Rejilla TEM 
 
 
 
 
 
 
 
 Mesh 
 
 Cámara de Neubauer 
 
Fig. 20. Muestreo sobre la rejilla de microscopía electrónica de transmisión. En rojo se muestran las 
zonas de observación. 
 
Dentro de las muestras de VP6, contábamos con dos poblaciones de 
orígenes distintos: tubos purificados y tubos reensamblados. Estos últimos 
son utilizados en el grupo de trabajo, por lo que se incluyó su análisis en 
este proyecto. A su vez, dentro de la población de tubos purificados 
contamos con lotes que, tras ser vistos bajo el microscopio de transmisión 
electrónica presentaban diferentes características en cuanto a su ensamblaje 
Resultados y discusión 
 
� 34
por lo que, para su análisis, fueron agrupados en dos: tubos purificados 
correctamente ensamblados y tubos purificados mal ensamblados, a quienes 
se les incluyó en el estudio para evaluar el efecto de deficiencias en el 
ensamblaje sobre la longitud límite de los tubos. A los dos