Estudio-de-las-variantes-alelicas-rs1042642-y-rs2032582-en-el-gen-abcb1-y-de-la-variante-rs2231142-en-el-gen-abcg2-en-pacientes-pediatricos-con-diagnostico-de-leucemia-linfoblastica-aguda

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Que 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 FACULTAD DE QUÍMICA 
 
ESTUDIO DE LAS VARIANTES ALÉLICAS (RS1042642 Y RS2032582) 
EN EL GEN ABCB1 Y DE LA VARIANTE (RS2231142) EN EL GEN 
ABCG2 EN PACIENTES PEDIÁTRICOS CON DIAGNÓSTICO DE 
LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA 
 
 T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
 
 
 
 
P R E S E N T A 
 
 
 
 
BLANCA ERICKA BAUTISTA CADENA 
MÉXICO, D. F. 2016 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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JURADO ASIGNADO: 
 
PRESIDENTE: DRA. SOBEIDA SÁNCHEZ NIETO 
VOCAL: DR. SAMUEL CANIZALES QUINTEROS 
SECRETARIO: DRA. LUZ MARÍA TORRES ESPÍNDOLA 
1er. SUPLENTE: QFB. ALEJANDRO ZAMORANO CARRILLO 
2° SUPLENTE: DR. IGNACIO GONZÁLEZ SÁNCHEZ 
 
 
SITIO DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: 
LABORATORIO DE FARMACOLOGÍA, INSTITUTO NACIONAL DE PEDIATRÍA, TORRE DE INVESTIGACIÓN 
“JOAQUÍN CRAVIOTO” 
 
 
ASESOR DEL TEMA: 
Dra. Luz María Torres Espíndola 
SUPERVISOR TÉCNICO: 
Dr. Juan Luis Chávez Pacheco 
SUSTENTANTE: 
Blanca Ericka Bautista Cadena 
 
 
 3 
 
CONTENIDO 
ÍNDICE DE TABLAS ...........................................................................................................................................6 
ABREVIATURAS...................................................................................................................................................8 
RESUMEN ........................................................................................................................................................... 11 
1.ANTECEDENTES ........................................................................................................................................... 12 
1.1 Leucemia. ................................................................................................................................................... 12 
1.1.1 Leucemia aguda .................................................................................................................................. 12 
1.1.2 Leucemia crónica ................................................................................................................................ 13 
1.2 Epidemiología de la leucemia en México. ...................................................................................... 13 
1.3 Tratamiento para LLA en pacientes pediátricos. ........................................................................ 14 
1.4 Metotrexato ............................................................................................................................................... 16 
1.4.1 Mecanismo de acción ......................................................................................................................... 17 
1.4.2 Farmacogenética del metotrexato. ............................................................................................. 18 
1. 5 Transportadores de fármacos tipo ABC ........................................................................................ 19 
1.5.1 Gen ABCB1. ......................................................................................................................................... 21 
1.5.1.1 Proteína del gen ABCB1 ................................................................................................................ 22 
1.5.1.2 Polimorfismos del gen ABCB1 .................................................................................................... 23 
1.5.1.3 Impacto clínico de los polimorfismos C3435T (rs 1045642) y G2677T/A (rs 
2032582) ........................................................................................................................................................... 25 
1.5.1.3.1 Polimorfismo C3435T (rs 1045642)..................................................................................... 25 
1.5.1.3.2 Polimorfismo G2677T/A (rs 2032582) ................................................................................ 25 
1.5.2 Gen ABCG2 ............................................................................................................................................ 26 
1.5.2.1 Proteína del gen ABCG2 ............................................................................................................... 27 
1.5.2.2 Polimorfismos del gen ABCG2 .................................................................................................... 28 
1.5.2.3 Impacto clínico del polimorfismo C421A (rs 2231142). .................................................. 29 
2. HIPÓTESIS ................................................................................................................................................... 30 
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................................... 30 
3.1 General........................................................................................................................................................ 30 
3.2 Particulares ................................................................................................................................................ 30 
4. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................... 31 
5. DISEÑO EXPERIMENTAL ......................................................................................................................... 32 
5.1 Diseño del estudio .................................................................................................................................. 32 
 
 4 
 
5.2 Población de estudio .............................................................................................................................. 32 
5.2.1 Población objetivo ............................................................................................................................... 32 
5.3 Criterios de selección ............................................................................................................................ 32 
5.3.1 Criterios de inclusión ......................................................................................................................... 32 
5.3.2 Criterios de exclusión ................................................................................................................ 32 
5.3.3 Criterios de eliminación .................................................................................................................... 32 
6. METODOLOGÍA ........................................................................................................................................... 33 
6.1 Estrategia experimental ...................................................................................................................... 33 
6.2 Toma de muestra .................................................................................................................................... 34 
6.3 Separación de los leucocitos...............................................................................................................34 
6.4 Extracción de DNA a partir de sangre periférica para banco de DNA ................................ 34 
6.5 Cuantificación del DNA .......................................................................................................................... 35 
6.6 Genotipificación por sondas TaqMan® ........................................................................................... 36 
6.7 Cuantificación del Metotrexato mediante UPLC acoplado a masas. .................................... 38 
7. RESULTADOS .............................................................................................................................................. 39 
7.1 Características de la población de estudio .................................................................................... 39 
7.2 Frecuencias de las variantes alélicas en el gen ABCB1 ............................................................ 39 
7.3 Niveles de Metotrexato en sangre. .................................................................................................. 44 
7.3.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con los niveles de 
metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 46 
7.3.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 con los niveles 
de metotrexato en sangre. ......................................................................................................................... 48 
7.3.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) del gen ABCB1 con los niveles de 
metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 49 
7.3.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) del gen ABCG2 con los niveles de 
metotrexato en sangre. ................................................................................................................................ 50 
7.4 Niveles de Metotrexato en plasma................................................................................................... 51 
7.4.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con los niveles de 
metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 52 
7.4.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 con los niveles de 
metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 54 
7.4.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) en el gen ABCB1 con los niveles de 
metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 55 
 
 5 
 
7.4.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) en el gen ABCG2 con los niveles de 
metotrexato en plasma ................................................................................................................................ 56 
8. DISCUSIÓN .................................................................................................................................................. 57 
9. CONCLUSIÓN .............................................................................................................................................. 62 
10. ANEXOS ...................................................................................................................................................... 63 
11. REFERENCIAS ........................................................................................................................................... 67 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1.Tasa de mortalidad en la población menor de 20 años, por principales 
tumores malignos, según sexo. ................................................................... 14 
Tabla 2. Esquema de tratamiento para LLA conforme al grado de riesgo. ......... 15 
Tabla 3. Dosis administradas de metotrexato dependiendo el tipo de riesgo. .... 15 
Tabla 4. Efectos clínicos de los genes de la familia de transportadores ABC ..... 20 
Tabla 5. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2032582 y rs 
1045642. ................................................................................................. 24 
Tabla 6. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2231142 y rs 
2231137. ................................................................................................. 29 
Tabla 7. Sondas que se emplearon en la genotipificación para cada gen. ......... 36 
Tabla 8. Mezcla de reacción para el ensayo de discriminación alélica. .............. 37 
Tabla 9. Datos de la población de estudio. .................................................... 39 
Tabla 10. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 1045642. ............. 40 
Tabla 11. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582A. ........... 41 
Tabla 12. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582T. ........... 42 
Tabla 13. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2231142. ............. 43 
Tabla 14. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en 
los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). ................ 46 
Tabla 15.Concentración del MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de MTX 
en plasma. ............................................................................................... 51 
Tabla 16. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en 
los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). ................ 52 
Tabla 17. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCB1 polimorfismo rs 1045642, 
en distintas poblaciones. ............................................................................ 59 
Tabla 18. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCB1 polimorfismo rs 2032582 
T/A, en distintas poblaciones. ..................................................................... 60 
Tabla 19. Frecuencias alélicas y génicas del gen ABCG2 polimorfismo rs 2231142, 
en distintas poblaciones. ............................................................................ 61 
 
 
 7 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Estructura química del Metotrexato. ............................................... 16 
Figura 2. Mecanismo de acción del Metotrexato.. .......................................... 17 
Figura 3. Representación esquemática del cromosoma 7. ............................... 21 
Figura 4. Estructura del gen ABCB1. . .......................................................... 21 
Figura 5. Glicoproteína gp (P-gp). ............................................................... 22 
Figura 6. Representación esquemática del cromosoma 4. ............................... 26 
Figura 7. Estructura del gen ABCG2 y su proteína derivada.. .......................... 26 
Figura 8. Representación esquemática de la proteína del gen ABCG2. .............. 27 
Figura 9. Sondas TaqMan.. ......................................................................... 36 
Figura 10. Condiciones de la amplificación. .................................................. 37 
Figura 11. Curva de discriminación alélica del SNP rs 1045642. ...................... 40 
Figura 12. Curva de discriminación alélica del rs 2032582A. ........................... 41 
Figura 13.Curva de discriminación alélica del rs 2032582T.. ........................... 42 
Figura 14 Curva de discriminación alélica del rs 2231142.. ............................. 43 
Figura 15. Monitoreo de la concentración de MTX del paciente LAL 45. ............. 44Figura 16. Concentraciones de MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de 
MTX en sangre de 28 pacientes. .................................................................. 45 
Figura 17. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), 
del gen ABCB1 en sangre ........................................................................... 47 
Figura 18. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 
2032582A), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos........................................ 48 
Figura 19. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582 
T), del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. ................................................... 49 
Figura 20. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2231142), 
del gen ABCG2, en niveles sanguíneos.. ....................................................... 50 
Figura 21. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), 
del gen ABCB1, en niveles plasmáticos. ....................................................... 53 
Figura 22. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582A), 
del gen ABCB1, en niveles plasmáticos.. ...................................................... 54 
 
 8 
 
Figura 23. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 
2032582T), del gen ABCB1, en niveles plasmáticos. ...................................... 55 
Figura 24. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2231142), 
del gen ABCG2, en niveles plasmáticos. ....................................................... 56 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
 
ABREVIATURAS 
 
Cuando en esta tesis se haga referencia a las siguientes abreviaturas, se 
entenderá: 
 
 
 
µg Nanogramo 
µmol Micromol 
µL Microlitro 
°C Grado Celsius 
ABC Transportador de membrana dependiente de ATP 
Ala Alanina 
ATP Adenosín trifosfato 
BCRP Proteína de Resistencia a Cáncer de Mama 
CA California 
CONAPO Consejo Nacional de Población 
dbSNP Base de Datos de Polimorfismos de un Solo Nucleótido 
DHFR Dihidrofolato Reductasa 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
dUMP Desoxiuridinmonofosfato 
EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético 
FH2 Dihidrofolato 
FH4 Tetrahidrofolato 
FPGS Poliglutamato Sintetasa 
GGH Gamma Glutamil Hidrolasa 
Gln Glutamina 
h Horas 
HCT Hidrocortisona 
HMG-CoA 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A 
Ile Isoleucina 
IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social 
INEGI Instituto Nacional de Estadística y Geografía 
INP Instituto Nacional de Pediatría 
ISSSTE 
Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los 
Trabajadores del Estado 
kb Kilobase 
kDa Kilodalton 
L Litro 
L-Ap L-Asparagina 
LLA Leucemia Linfoblástica Aguda 
LLC Leucemia Linfocítica Crónica 
LMA Leucemia Mieloide Aguda 
LMC Leucemia Mieloide Crónica 
Lys Lisina 
 
 10 
 
MATE 
Transportador de Extrusión de Múltiples Antibióticos y 
Compuestos Tóxicos 
MGB Unión a Surco Menor 
min Minutos 
mL Mililitros 
MTHFR Metilentetrahidrofolato Reductasa 
MTX Metotrexato 
MXR Proteína Resistente a Mitoxantrona 
NCBI Centro Nacional para la Información Biotecnológica 
NFQ Inhibidor No Fluorescente 
nm Nanómetro 
OAT Transportadores de Aniones Orgánicos 
OMS Organización Mundial de la Salud 
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa 
P-gp o PGP Glicoproteína G 
RFC Transportador de Folato Reducido 
RNA Ácido ribonucleico 
RNAm Ácido ribonucleico mensajero 
Ser Serina 
SNC Sistema Nervioso Central 
SNP Polimorfismo de un solo Nucleótido 
Thr Treonina 
TIT Tratamiento Intratecal Triple 
TMP Timidinmonofosfato 
TTP Timidintrifosfato 
UPLC Cromatografía Líquida de Ultra Eficacia 
USA Estados Unidos de América 
UV/Vis Ultravioleta-Visible 
VIH Virus de Inmunodeficiencia Humana 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
 
 
RESUMEN 
 
Antecedentes. En México, la leucemia es una de las causas principales de 
morbilidad y mortalidad en población pediátrica y el tratamiento de esta 
enfermedad implica quimioterapia, inmunoterapia y agentes que modifican la 
respuesta biológica, de los cuales la quimioterapia es el más efectivo y siendo el 
metotrexato (MTX) el de mayor empleo en las fases de consolidación y 
mantenimiento durante el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA). Sin 
embargo, algunas células cancerosas generan resistencia a diferentes 
medicamentos, por lo que existe un impedimento a una respuesta exitosa a la 
quimioterapia, esta resistencia generalmente resulta de la expresión de bombas de 
flujo dependientes de ATP, siendo principalmente los transportadores ABCB1 MDR-
1) y ABCG2 (BCRP O MXR), que de manera normal tienen una función de 
protección contra metabolitos, xenobióticos; pero en los cánceres se encuentran 
sobre expresados. En este trabajo se investigaron los SNPs (rs 1045642 y rs 
2032582, del ABCB1 y el rs 2231142 del ABCG2) asociados con altos niveles del 
fármaco y sus frecuencias alélicas y genotípicas, así como la relación entre éstos y 
los niveles del MTX en sangre y plasma. 
 
Metodología. DNA genómico de 92 pacientes (1-19 años de edad) fue 
genotipificado identificando polimorfismos ABCB1 C3535T, G2677T/A y ABCG2 
C421A, mediante la técnica de discriminación alélica con el uso de sondas TaqMan 
de Applied Biosystems. Muestras de sangre de 28 pacientes, tomadas a las 2, 24 y 
36 h durante la quimioterapia, de las cuales se obtuvo el plasma para la 
cuantificación del MTX en ambas muestras, por medio de cromatografía líquida de 
ultra eficacia (UPLC) de fase reversa. La relación entre los polimorfismos y los 
niveles de MTX de ambos transportadores fueron analizados estadísticamente. 
 
Resultados. Las frecuencias que se encontraron en esta población, para el 
polimorfismo rs 1045642 el genotipo más frecuente fue el GA (53.1%); para el rs 
2031142A el genotipo de mayor frecuencia fue CC (44.6%); para el rs 2031142T 
el genotipo de mayor frecuencia fue CC (87.2%) del gen ABCB1 y para el 
polimorfismo estudiado rs 2231142 del gen ABCG2, el genotipo más frecuente es 
GG (46.8%). En la cuantificación del MTX en sangre la mediana de la concentración 
a las 2 h fue de 41.1 µmol/L (Q25 24.7-Q75 52.2), a las 24 h fue de 16.7 µmol/L (Q25 
2.6- Q75 23.4) y a las 36 h la mediana encontrada fue de 0.7 µmol/L (Q25 0.5-Q75 
1.5). Las medianas de la concentración de MTX en plasma a las 2 h fue de 54.4 
µmol/L (Q25 37.2-Q75 66.6), a las 24 h de 16.7 µmol /L (Q25 2.1- Q75 31.57) y a las 
36 h la mediana de la concentración de MTX fue de 1.04 µmol /L (Q25 0.56-Q75 
2.05). 
 
Conclusiones. No se encontró asociación entre el genotipo y los niveles de MTX 
en sangre ni en plasma en esta cohorte de pacientes analizada. 
 
 12 
 
 
 
1. ANTECEDENTES 
 
1.1 Leucemia. 
 
La leucemia se define como: un grupo heterogéneo de neoplasias malignas del 
sistema hematopoyético, que involucra la transformación de células progenitoras 
linfoides, y menos frecuentemente la transformación de progenitoras de las líneas 
celulares mieloides, de monocitos, eritroides y megacariocíticas. Las alteraciones 
que contribuyen a la transformación leucémica de las células hematopoyéticas 
madres afecta a los procesos regulatorios aumentando de forma ilimitada la 
capacidad de autorrenovación, lo que produce una pérdida del control de la 
proliferación normal, bloqueo en la diferenciación y resistencia a la muerte celular 
programada 1,2,3. 
 
La leucemia se clasifica en aguda (crece rápidamente) o crónica (crece lentamente), 
siendo más frecuente y la primer causa en niños y adolescentes (uno de cada tres 
casos) la leucemia linfocítica aguda (LLA) y en menor proporción la mieloide aguda 
4; las leucemias linfoblásticas agudas generalmente se presentan después del 
primer año de vida hasta la adolescencia 5. 
 
1.1.1 Leucemia aguda 
 
 
Los tipos principales de leucemia aguda son: 
 
 Leucemialinfocítica aguda (linfoblástica) (LLA) (acute lymphocytic leukemia, 
ALL): Alrededor de tres de cuatro leucemias en niños son LLA. Esta leucemia 
se origina de formas tempranas de linfocitos en la médula ósea. 
 Leucemia mieloide aguda (LMA) (acute myelogenous leukemia, AML): Este 
tipo de leucemia también llamada leucemia mieloide aguda, leucemia 
mielocítica aguda o leucemia no linfocítica aguda, representa la mayoría de 
los casos remanentes. La LMA se inicia a partir de las células mieloides que 
forman los glóbulos blancos (que no son linfocitos), los glóbulos rojos o las 
plaquetas. 
 Leucemia de linaje híbrido o mixto: En estas leucemias poco comunes, las 
células tienen características de la LLA y de la LMA. En niños, son 
generalmente tratadas como la LLA y usualmente responden a este 
tratamiento como la LLA. 4 
 
 
 13 
 
1.1.2 Leucemia crónica 
 
 
Este tipo de leucemia es más común en adultos que en niños, se desarrollan más 
lentamente que las agudas y se dividen en dos tipos: 
 
 Leucemia mieloide crónica (LMC) (chronic myelogenous leukemia, CML): 
Esta leucemia ocurre rara vez en niños. El tratamiento es similar al empleado 
en adultos. 
 Leucemia linfocítica crónica (LLC) (chronic lymphocytic leukemia, CLL): Esta 
leucemia se presenta muy pocas veces en los niños. 4 
 
1.2 Epidemiología de la leucemia en México. 
 
 
Por sexo y grupo de edad, se observa que las leucemias afectan más a los hombres 
que a las mujeres; es en los primeros años de vida cuando la brecha por sexo es 
más estrecha (52.5 y 47.5%, respectivamente), ésta se incrementa en cada uno 
de los grupos de edad hasta llegar a una diferencia de 28.4 puntos porcentuales en 
la población de 15 a 19 años 6. 
Si referimos sólo al grupo de edad de 0 a 14 años, la OMS reporta 1 691 defunciones 
en el 2012 con una tasa de mortalidad de 5.1 por cada 100 000 habitantes, siendo 
el sexo masculino el más afectado con una tasa de 5.5 y el femenino 4.8. Los tipos 
de cáncer con mayor tasa de mortalidad en este grupo de edad son leucemias, 
tumores de SNC y Linfoma no Hodking, en ese orden, sin diferencias significativas 
en la distribución por sexo 7. 
 
A pesar de los esfuerzos de las instituciones para diagnosticar y atender a las 
personas con cáncer, muchos mexicanos mueren por esta causa. En el Distrito 
Federal, en 2012, del total de defunciones de residentes habituales de la entidad, 
14.2% se debieron a algún tumor y de éstas, 94.3% por neoplasias (tumores) 
malignas. Del total de muertes de jóvenes menores de 20 años (2 mil 946), se 
tiene que 5.6% fallecieron por algún tumor, de los cuales 87.3% eran cancerosos, 
principalmente en órganos hematopoyéticos con una tasa de mortalidad de 3.0 
defunciones por cada 100 mil personas en esa edad, siendo más alta en los 
hombres que en las mujeres (3.7 y 2.3 por cada 100 mil personas de cada sexo, 
respectivamente Tabla 1); la segunda causa de muerte en esta población es por 
cáncer en encéfalo y otras partes del sistema nervioso central (uno de cada 100 
mil personas menores de 20 años) 6. 
 
 
 
 
 
 
 14 
 
Tabla 1.Tasa de mortalidad en la población menor de 20 años, por principales 
tumores malignos, según sexo. Fuente: INEGI (2014). Estadísticas de mortalidad. 
Base de datos 2012 y CONAPO (2014). Proyecciones de la población en México 
2010-2050. 
 
1.3 Tratamiento para LLA en pacientes pediátricos. 
 
En nuestro país, los gastos del tratamiento para cáncer infantil como la leucemia 
linfoblástica y mieloblástica aguda en pacientes que no son derechohabientes del 
IMSS o ISSSTE son absorbidos por el Seguro Popular mediante el Fondo de 
Protección para Gastos Catastróficos 8, el cual incluye la adquisición de 
medicamentos como predisona, ácido folínico, hidrocortisona, ciclofosfamida, L-
asparaginasa y antineoplásicos como citarabina, vincristina, 6-mercaptopurina y 
MTX; este último es el fármaco de mayor uso en la fase de consolidación para el 
tratamiento de la LLA (Protocolo de la Atención para Leucemia Linfoblástica).9 
 
En las LLA infantil se acostumbra a identificar 3 grupos pronósticos que además 
condicionarán el protocolo terapéutico a emplear: 
 Bajo riesgo (25-30% de los casos). Son paciente con edades comprendidas 
entre 1 y 9 años, con pocos leucocitos al diagnóstico, con fenotipo B común 
o pre-B, sin infiltración de sistema nervioso u otros territorios, sin 
alteraciones citogenéticas o moleculares y que responden bien al tratamiento 
de inducción. 
 Alto riesgo (12-15% de los casos). Son pacientes fuera de los rangos de edad 
mencionados, con alteraciones citogenéticas y/o moleculares que no 
responden adecuadamente al tratamiento de inducción. 
 Riesgo intermedio (55-60% de los casos). Todas las restantes, excepto en 
menores de 1 año y en pacientes con fenotipo B maduro que requieren de 
tratamientos diferenciados. 
 Muy alto riesgo, si tiene respuesta rápida o lenta los primero 7 días de terapia 
de inducción. 
De acuerdo a los “Protocolos técnicos cáncer en niños”, la LLA puede tratarse con 
diferentes esquemas de acuerdo al grado de riesgo (Tabla 2). Cada esquema de 
Principales tumores malignos Total Hombres Mujeres 
Órganos hematopoyéticos 3.0 3.7 2.3 
Encéfalo y otras partes del sistema nervioso 
central 
1.0 0.9 1.2 
Tejido linfático y afines 0.3 0.4 0.2 
Tumores malignos de los huesos y de los 
cartílagos articulares 
0.3 0.4 0.2 
Tumores malignos de los órganos genitales 
masculinos/femeninos 
0.2 0.4 0.1 
 
 15 
 
tratamiento comprende al menos cuatro segmentos durante el tratamiento: a) 
Inducción a la remisión, b) Consolidación, c) Mantenimiento de la quimioterapia y 
d) la fase final de cese electivo de la quimioterapia 10. 
 
Tabla 2. Esquema de tratamiento para LLA conforme al grado de riesgo. 
 
Bajo riesgo Riesgo habitual Alto riesgo Muy alto riesgo 
Vincristina Vincristina Vincristina Vincristina 
L-asparagina L-asparagina L-asparagina L-asparagina 
Prednisona Prednisona Prednisona 
METOTREXATO METOTREXATO METOTREXATO METOTREXATO 
6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina 6-Mercaptopurina 
Hidrocortisona Hidrocortisona Hidrocortisona Hidrocortisona 
Ara-C Ara-C Ara-C Ara-C 
Dexametasona Dexametasona Dexametasona Dexametasona 
Leucovorin Leucovorin Leucovorin Leucovorin 
 Ciclofosfamida Ciclofosfamida Ciclofosfamida 
 Doxorrubicina Doxorrubicina 
 Daunorrubicina Daunorrubicina 
 Etopósido Etopósido 
 6-Tioguanina 
 
De acuerdo con la Tabla 2, el MTX y la 6-mercaptopurina son fármacos de amplio 
uso en la quimioterapia y con predominancia en el éxito terapéutico; el MTX se 
administra en dosis dependientes del tipo de riesgo y de acuerdo a esquemas de 
varios fármacos 6-mercaptopurina, MTX, leucovorin, TITmetotrexato+HCT , Ara-
C,L-Ap Tabla 3.10 
 
 
Tabla 3. Dosis administradas de metotrexato dependiendo el tipo de riesgo. 
Tipo de riesgo Dosis Administración 
Muy bajo 2 g/m2 
4 sesiones (1 por 
semana) 
Riesgo habitual 2 g/m2 
3 sesiones (días 36,68 y 
94) 
Alto riesgo (pre-B) 2 g/m2 2 sesiones (días 47 y 54) 
Alto riesgo (pre-T) 5 g/m2 
4 sesiones(días 8,22,36 y 
50) 
Muy alto riesgo 5 g/m2 
4 sesiones (días 1 y 8 del 
curso MARAM y del 
VIMARAM) 
 
 16 
 
1.4 Metotrexato 
 
 
 
Es un antagonista del ácido fólico, introducido en 1950 como un fármaco en la 
quimioterapia contra el cáncer y sigue siendo de gran importancia en la terapia 
contra la Leucemia Linfoblástica Aguda 11. El compuesto (N-[4-[[(2,4-diamino-6-
pteridinil)metil] metil-amino] benzoil]-Lácido glutámico es un fármaco citotóxico 
del grupo de los antimetabolitos (Figura 1)12. 
 
Inhibidor reversible de la dihidrofolato reductasa (DHFR), necesaria para la 
conversión del ácido fólico a su forma activa el tetrahidrofolato (FH4), que sirve 
como donador de carbono para la síntesis de la timina in vivo, por lo que el MTX 
actúa como un potente inhibidor de la síntesis de DNA; clasificándose comoun 
agente específico de fase, eliminando células durante la fase S del ciclo celular 13. 
 
Es ampliamente utilizado para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda, 
cáncer de mama, de testículo y de pulmón, linfoma No-Hodgkin, linfosarcoma, 
osteosarcoma y en enfermedades como la artritis reumatoide, psoriasis, 
dermatomiositis y sarcoidosis10. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Estructura química del Metotrexato. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 17 
 
1.4.1 Mecanismo de acción 
 
 
El ingreso del MTX a la célula está mediado por la vía receptor de folatos y por el 
transportador de membrana RFC (Reduced Folate Carrier), debido a su similitud 
estructural. 
Cuando está en el interior de la célula es poliglutamizado por la enzima 
poliglutamato sintasa 14, tanto el MTX como el MTX poliglutamizado [MTX (Glu)n] 
inhiben a la enzima DHFR, evitando la formación del tetrahidrofolato (FH4) que 
impide la formación de purinas y en consecuencia la síntesis del DNA (Figura 2)15. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Mecanismo de acción del Metotrexato. Se observan los transportadores 
involucrados en la salida del fármaco, así como las enzimas involucradas. Dónde: 
Timidinmonofosfato (TMP), desoxiuridinmonofosfato (dUMP), dihidrofolato (FH2), 
timidintrifosfato (TTP) y metil tetrahidrofolato reductasa (MTHFR). 
 
 
 18 
 
 
 
 
1.4.2 Farmacogenética del metotrexato. 
 
 
La farmacogenética investiga la variabilidad genética interindividual en una 
secuencia de DNA de blancos de fármacos, enzimas, transportadores de fármacos 
o genes asociados a alguna enfermedad, expresión de RNA o en la traducción de 
proteínas de genes que afectan la respuesta de los medicamentos así como su 
seguridad 13. 
Múltiples transportadores y enzimas participan en el metabolismo del ácido fólico y 
muchos de ellos demuestran polimorfismos genéticos que pueden afectar el 
metabolismo y actividad del metotrexato 10; por lo que las diferencias en la 
secuencia de los genes, como las causadas por polimorfismos de un solo nucleótido 
(SNPs), pueden provocar cambios en la secuencia de aminoácidos. El cambio en la 
secuencia de la proteína puede alterar el efecto del fármaco y/o la actividad sobre 
éste, en consecuencia afectar la eficacia del tratamiento 16. 
 
Uno de los cambios con mayor frecuencia a nivel molecular son las variaciones 
puntuales en la secuencia, ya sean inserciones/deleciones o sustituciones de una 
sola base nitrogenada (Single Nucleotide Polymorphism, SNP). 
Los SNP´s que afectan la secuencia codificante de una proteína pueden modificar 
(llamados no sinónimos) o no (llamados sinónimos) la cadena de aminoácidos; son 
importantes los SNP´s localizados en regiones no codificantes, ya que tienen 
consecuencias en los procesos de splicing y/o en la unión de los factores de 
transcripción 17. 
 
 
En el caso del MTX se han realizado múltiples ensayos para describir la relevancia 
de polimorfismos en enzimas relacionadas a su efecto (MTHFR, DHFR, AICAR), así 
como en proteínas de transporte- excreción (RFC, transportadores del tipo ABC) y 
en enzimas del metabolismo del fármaco (FPGS y GGH). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 19 
 
 
 
1. 5 Transportadores de fármacos tipo ABC 
 
Los transportadores son proteínas integrales de membrana que median la 
translocación de sustancias químicas, fármacos y otras moléculas dentro y fuera 
de las células utilizando mecanismos activos y pasivos 18. Este tipo de 
transportadores se expresan en el hígado, intestino delgado, placenta y barrera 
hematoencefálica, donde juega un papel muy importante en la absorción, 
distribución y excreción. En el riñón del ser humano, estos transportadores se 
expresan en la membrana apical luminal de las células epiteliales del túbulo 
proximal. 19 
 
 
En los transportadores de salida se incluyen: la familia de transportadores de 
membrana dependiente de ATP (ATP-Binding Cassette, ABC) y la familia de 
transportadores de extrusión de múltiples antibióticos y compuestos tóxicos 
(Multidrug Toxin Extrusion Proteins, MATES). Son tres tipos de transportadores de 
entrada: los transportadores de aniones orgánicos (Organic Anion Transporters, 
OATs), los transportadores de cationes orgánicos (Organic Cation Transporters, 
OATPs) y transportadores de oligopéptidos. Además de sustancias fisiológicas, los 
fármacos también son sustratos para algunos transportadores y afectan en su 
absorción, su distribución en los tejidos y la eliminación de los fármacos, es decir, 
están implicados en la determinación de las concentraciones de los fármacos en 
plasma y tejidos periféricos, afectando así la eficacia y toxicidad de los fármacos 20. 
 
La familia de transportadores de membrana dependiente de ATP (ABC), forman un 
total de 49 proteínas en humanos, por lo que es la familia más grande de proteínas 
transmembranales que se unen al ATP y utilizan la energía para el transporte de 
diversas sustancias, se clasifican en siete familias (ABCA-ABCG) basadas en el 
dominio de unión a nucleótido y de dominios transmembranales 18, 20. 
 
Los transportadores ABC se han encontrado en barreras tisulares y órganos 
excretores, donde el flujo de sustancias de un órgano a otro es gracias a un 
gradiente de concentración, son conocidos como transportadores de resistencia a 
multi-fármacos (Multidrug Resistance Transporters MDRs o MDR1 o ABCB1) debido 
a que ayudan al flujo de quimioterapéuticos y otros fármacos a sus células blanco; 
se conocen 49 genes de los transportadores ABC, pero los que están involucrados 
en el transporte de fármacos son los ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCC3 y ABCG2; en 
la Tabla 4 se muestran las implicaciones clínicas de estos transportadores 21. 
 
 
 
 20 
 
Tabla 4. Efectos clínicos de los genes de la familia de transportadores ABC (Tabla 
modificada de Yiannakopoulou, 2013). 
 
 
 
 
 
 
 
Gen Genotipo 
Nucleótido 
afectado 
Fármaco 
afectado 
Efecto 
 
ABCB1 
TT C3435T Digoxina 
Disminución de 
concentraciones 
plasmáticas 
después de la 
administración oral 
TT C3435T Clopidogrel 
Disminución de 
biodisponibilidad 
con altos grados de 
efectos adversos 
cardiovasculares 
(muerte, infarto al 
miocardio, 
accidente 
cerebrovascular no 
fatal) 
CT y TT C3435T Taxano 
Neutropenia y 
neuropatía 
periférica 
ABCG2 
S/D 
R482G/T 
(líneas 
celulares) 
Antraciclinas, 
mitoxantrona, 
camptotecinas 
Niveles altos de 
resistencia debida 
a sobreexpresión 
del transportador. 
CA Gefitinib Diarrea 
ABCC11 G538A Metotrexato 
Eficacia 
quimioterapéutica, 
afecta la función y 
estabilidad de la 
síntesis de novo de 
la proteína 
ABCC2 
CC −24C>T Irinotecan Mielosupresión 
GG 
c.1774G>del 
c.1249G>A 
 
Diclofenaco Hepatotoxicidad 
 
 21 
 
1.5.1 Gen ABCB1. 
 
El gen ABCB1 de humano también conocido como proteína de permeabilidad o 
MDR122 está localizado en la región cromosómica 7q21.12 (Figuras 3 y 4), 
compuesto de 209,461 pares de bases 23, de 29 exones y el RNAm consiste en 
4872 pares de bases, que codifica para una proteína transportadora de membrana 
llamada P-glicoproteína, P-gp o PGP con peso de 170kDa y constituida de 1200 
aminoácidos. Pertenece a un grupo de genes que carecen de la caja TATA, dentro 
de la región proximal del promotor, por lo que inicia con la secuencia iniciadora 
(Inr) y está compuesto de una secuencia CCAAT (-82 a -73)24. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Representación esquemática del cromosoma 7. Brazo corto del 
cromosoma, posición 7q21.12. Fuente: NCBI-Map Viewer 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructura del gen ABCB1. (Tanabe M, et al 2001). Se muestran los 
polimorfismos de este gen, así como el exón donde se localizan. 
 
 
 22 
 
1.5.1.1 Proteína del gen ABCB1 
 
El gen ABCB1 codifica para la proteína transportadora dependiente deATP, P-
glicoproteína, P de permeabilidad, (PGP, p-gp); la cual es una glicoproteína 
integrante de la membrana plasmática de 170 kDa, perteneciente a la súper familia 
ABC, tiene dos miembros humanos (MDR1, MDR2/3) y tres miembros en roedores 
(mdr1,mdr2 y mdr3); se ha demostrado que las células MDR1 expresan el fenotipo 
de multirresistencia y la sobre expresión de MDR2/3 no está implicada en la 
resistencia celular 25. 
La secuencia de sus aminoácidos muestra la presencia de dos grupos de seis 
dominios transmembrana y dos sitios de unión al ATP mismos que lo hidrolizan 
sitio blanco de inhibidores (Figura 5) 25. La función de ABCB1 es secretar agentes 
tóxicos generados en la célula y cuando se sobre-expresa, actúa como una “bomba 
expulsora” de agentes quimioterapéuticos, que al retirar a los fármacos deja viva 
a la célula cancerígena.26 
 
La expresión de P-gp determina un fenotipo celular resistente a xenobióticos 
tóxicos y agentes quimioterapéuticos incluyendo las antraciclinas, alcaloides de la 
vinca, taxanos, etopósido, inhibidores de la tirosin cinasa, como el Imatinib, el 
Nilotinin y Dasatinib; inhibidores de la proteasa de VIH, así como inhibidores de la 
HMG-CoA .27,28 
En los humanos, se expresa en la membrana apical del epitelio mucoso del tracto 
gastrointestinal, en la membrana de los canales biliares de los hepatocitos y en la 
superficie apical de las células de los túbulos proximales del riñón. 20 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Glicoproteína gp (P-gp). Modelo bidimensional de 1280 aminoácidos, los 
círculos negros indican las mutaciones puntuales que alteran la especificidad del 
sustrato de la P-gp, las zonas azules el sitio de unión de ATP (Cascales M, 2012). 
Regiones de fotoafinidad: Zonas con moléculas biológicamente activas que se unen covalentemente a las enzimas o ligandos 
proteicos, la unión se realiza por activación con luz ultravioleta. Estas regiones son utilizadas para la identificación de los 
sitios de enlace en proteínas. 
 
 23 
 
1.5.1.2 Polimorfismos del gen ABCB1 
 
 
Se ha encontrado más de 76 SNP´s para el gen ABCB1, de ellos solo 47 llevan a 
un cambio en la composición de aminoácidos y los 29 que restan se consideran 
silenciosos. Los SNP´s con mayor relevancia clínica son C1236T (silencioso), 
G2677T/A (Ala893Ser/Thr) y C3435T (Ile 1145 Ile) 23 y otros polimorfismos afectan 
la función bien caracterizada de este gen. 
 
El SNP rs1045642, es un polimorfismo sinónimo (Ile) en el exón 27, también 
nombrado C3435T 28, con secuencia AAGAGAT [A/C/T] GTGAGGG, el cual 
modifica la expresión del gen para la proteína P-gp sin alterar la secuencia de esta 
(mutación puntual) 29, sin embargo altera los procesos de splicing (corte y 
empalme), proceso de regulación y traslocación del RNAm; así como el plegado de 
la proteína lo que lleva a la modificación de su especificidad. 30 
 
Simon T, et al. en el año 2009, sugirió que los individuos homocigotos TT para esta 
variante, cuando son tratados con clopidogrel, tienen niveles más bajos de 
metabolito activo del fármaco y en consecuencia presentan mayores reacciones 
adversas (P=0.009). 31 
 
 
El SNP rs 2032582, es un polimorfismo no sinónimo localizado en el exón 21, 
también nombrado G2677T/A, con secuencia CTAGAAGGT [G/C/T] GGGAAGGT, el 
SNP GCT codifica para Alanina, TCT para Serina y ACT para Treonina en el 
aminoácido 893 de la secuencia proteica, en esta última variante disminuye la 
actividad en comparación con 893 Ser, por lo que al igual que el C3435T, se 
relacionan con variaciones en la farmacocinética. 32 
 
 
El SNP rs 1128503, es un polimorfismo que no ocasiona un cambio de aminoácido 
(sinónimo) manteniendo el aminoácido glicina 33 localizado en el exón 12, también 
nombrado C1236T. Su efecto su asocia al afectar a la inserción de la gp-P en la 
membrana34; también a diversas manifestaciones clínicas, como es el caso de la 
epilepsia y leucemia mieloide aguda. 35 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 24 
 
 
 
 
 
La frecuencia génica reportada por la base HapMap (Tabla 5) para los polimorfismos 
C3435T (rs1045642) y G2677A (rs 2032582) de ABCB1: 
 
 
 
 
 
Tabla 5. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2032582 y rs 
1045642. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 rs 2032582 rs 1045642 
Origen étnico Alelo T Alelo C Alelo A Alelo G 
CEU (Europeo) 0.469 0.531 0.571 0.429 
MEX(Mexicanos 
en EU) 
0.430 0.570 0.460 0.540 
HCB (Este de 
Asia) 
0.589 0.411 0.402 0.598 
JPT (Japonés) 0.552 0.448 0.459 0.541 
MKK (Kenia, 
África) 
0.087 0.913 0.152 0.848 
ASW (Africanos 
en EU) 
0.094 0.906 0.202 0.798 
CHD (Chinos en 
EU) 
0.506 0.494 0.369 0.631 
GIH (Hindús en 
EU) 
0.653 0.347 0.597 0.403 
 
 25 
 
 
 
 
1.5.1.3 Impacto clínico de los polimorfismos C3435T (rs 1045642) y 
G2677T/A (rs 2032582) 
1.5.1.3.1 Polimorfismo C3435T (rs 1045642) 
 
Este polimorfismo (C3435T) es el más estudiado y sus frecuencias génicas difieren 
entre los distintos grupos étnicos, como por ejemplo, según lo descrito por Kishi S, 
et al, en el 2004, para el genotipo CC se reporta que está asociado (p= 0.16) con 
un incremento en la “clarificación” de etopósido en niños con LLA. 36 
Leal –Ugarte y cols., en el 2008, reportaron la frecuencia génica de este SNP para 
población pediátrica mexicana en 107 niños con LLA y 111 niños sanos, no se 
encontró asociación de genotipos con mayor riesgo de esta neoplasia (frecuencias: 
CC=0.17 vs 0.14; CT=0.61 vs 0.53 y TT=0.22 vs 0.33 en niños con LLA y sanos, 
respectivamente), no hubo diferencias significativas en frecuencias alélicas 
(p>0.176) y frecuencia genotípica (p>0.255), aunque no se determinó riesgo por 
toxicidad, niveles plasmáticos de antineoplásicos o variables de mejoría entre los 
16.37 
 
 1.5.1.3.2 Polimorfismo G2677T/A (rs 2032582) 
 
 
 
En estudios en población egipcia de 96 pacientes con leucemia mieloide crónica 
comparándolos con 90 pacientes sanos, bajo tratamiento con Imatinib, Elghannam 
D y colaboradores reportaron que hubo diferencia significativa en la frecuencia de 
los pacientes con resistencia y respuesta al fármaco (p=0.02), el genotipo TT se 
asoció con respuesta hematológica completa (p=0.01) y mejor respuesta 
(p<0.001), relacionado también con factor protector contra resistencia a Imatinib 
(p=0.008).38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 26 
 
1.5.2 Gen ABCG2 
 
ABCG2, también conocida como proteína de resistencia del cáncer de mama (Breast 
cancer resistance protein, BCRP) 17 o proteína resistente a mitoxantrona 
(Mitoxantrone-resistant protein, MXR) 39, es el segundo miembro de la familia G de 
los transportadores ABC. Se encuentra localizado en la región cromosómica 4q22 
(Figura 6) compuesto de 16 exones de más de 66 kb que codifica a una proteína 
de membrana con peso de 72 kDa y constituida de 655 aminoácidos. 38 
En la Figura 7, se muestra la estructura de este gen de humanos y de la proteína 
derivada del mismo (BCRP), mostrándose la ubicación de los polimorfismos más 
estudiados. 40 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Representación esquemática del cromosoma 4. Brazo corto del 
cromosoma, posición 4q22. Fuente: NCBI-Map Viewer. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Estructura del gen ABCG2 y su proteína derivada. (Staud y Pavek, 2005). 
Se muestra la región de unión de nucleótidos (NBD, Nucleotide Binding Domain) y 
las regiones transmembrana (TM, Transmembrane regions). 
 
 
 27 
 
1.5.2.1 Proteína del gen ABCG2 
 
El gen codifica para una proteína transmembranal de 72 kDa (similar a la proteína 
P-gp), que consta de seis dominios y un sitio de unión al ATP, funciona como un 
homodímero u homotetrámero para trasladar los sustratos de manera eficiente a 
través de la membrana celular (Figura 8). 41 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Representación esquemáticade la proteína del gen ABCG2. Modelo 
bidimensional, se muestra el sitio de glicosilación (Υ) y el sitio de unión al ATP. 
(Imagen modificada Sharom, 2008). 
 
 
Esta proteína tiene una función protectora de sustancias tóxicas, se expresa en 
células de órganos clave para la biodisponibilidad de fármacos y se ha sugerido que 
podría ejercer como mecanismo compensatorio ante el incremento de sustratos 
asociados al estrés oxidativo.42 La expresión de ABCG2 se correlaciona con el 
mantenimiento de la población en situación de pluripotencialidad, participando en 
la autorrenovación, así como en la regeneración de tejido dañado. 
 
En humanos sanos, se expresa en varios tejidos incluyendo placenta, cerebro, 
próstata, testículo, hígado, intestino delgado, colon, ovario, riñones y corazón.43 
Algunos sustratos de este transportador son antibióticos (nitrofurantoína, 
fluoroquinolonas), la vitamina B2, la biotina, el ácido úrico y los ácidos biliares.44 
 
Altos niveles de expresión de la proteína se ha asociado con la resistencia a agentes 
anticancerígenos, incluyendo antraciclinas, mitoxantrona y camptotecinas, MTX, 
topotecan, estatinas, entre otros y compuestos no terapéuticos como los 
flavonoides y porfirinas. 36 Se ha detectado su expresión en leucemias agudas y en 
tumores sólidos, como cáncer de pulmón.45 
 
 
 28 
 
1.5.2.2 Polimorfismos del gen ABCG2 
 
Se han descrito 80 variaciones naturales de la secuencia, siendo 26 de 
polimorfismos no sinónimos, 5 polimorfismos sinónimos (c.114T>C, c.369C>T, 
c.474C>T, c.1098G>A y c.1425A>G), 3 mutaciones sin sentido (Q126X, E334X y 
R575X) y una mutación en el marco de lectura (c.1515delC). Los SNPs más 
frecuentes en humanos se localizan en el exón 2 (G34A dando lugar a V12M) y en 
el exón 5 (C421A dando lugar a Q141K).46 
 
El SNP G34A (rs 2231137), se ha asociado con la susceptibilidad de linfomas de 
células B grandes difusas;47 este polimorfismo es del tipo no sinónimo y tiene una 
secuencia reportada de TTTTATCCCA GTG TCACAAGG, con cambio de Valina (GTG) 
a Metionina (ATG). 
 
El SNP C421A (rs 2231142) ha sido reportado generar una proteína de baja 
expresión y con baja actividad y se ha asociado con eventos adversos por MTX.48 
Este SNP en el exón 5 no sinónimo, tiene una secuencia AACTTA CAG TTCTCA con 
cambio de Glutamina (CAG) a Lisina (AAG) en el codón 141 (Q141K).49 
 
Otros SNPs descritos en pacientes japoneses, como el C376T (Q126Stop) en el 
cual la glutamina en posición 126 es sustituida por un codón de terminación 50 y el 
G1322A (S441N), pueden afectar la expresión y la localización celular del 
transportador 51 y éstos entre otros ( F208S, S248P y E334Stop) son caracterizados 
por presentar un transporte anormal de hematoporfirinas, lo que se sugiere que 
puede presentarse una mayor susceptibilidad a fototoxicidad inducida por porfirinas 
en individuos que presenten estos alelos. 52 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 29 
 
 La frecuencia génica reportada por la base HapMap (Tabla 6) para los SNPs de 
ABCG2, C421A (rs 2231142) y G34A (rs 2231137): 
Tabla 6. Frecuencia alélica reportada por HapMap para los SNPs rs 2231142 y rs 
2231137. 
 
 
1.5.2.3 Impacto clínico del polimorfismo C421A (rs 2231142). 
 
 
 
Suthandiram S y colaboradores, en el año 2014 evaluaron el impacto de este SNP 
con la toxicidad del MTX, en 71 pacientes asiáticos adultos con LLA o Linfoma no 
Hodgkin, midiendo niveles del MTX en plasma a las 48 h, pero no asociaron ninguna 
toxicidad, para los genotipos CA (p=0.922) y AA (0.591).53 
 
Mesallamy E y colaboradores, también en el 2014, determinaron los niveles 
plasmáticos de MTX a las 23, 42 y 68 h en niños egipcios con LLA, y no encontraron 
diferencia estadística entre la concentración plasmáticas con pacientes con y sin el 
SNP.54 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 rs 2231142 rs 2231137 
Origen étnico Alelo T Alelo C Alelo A Alelo G 
CEU (Europeo) 0.889 0.111 0.983 0.429 
MEX(Mexicanos en EU) 0.800 0.200 n.d n.d 
HCB (Este de Asia) 0.708 0.292 0.711 0.289 
JPT (Japonés) 0.657 0.343 0.807 0.193 
MKK (Kenia, África) 0.990 0.010 n.d n.d 
ASW (Africanos en EU) 0.962 0.038 n.d n.d 
CHD (Chinos en EU) 0.685 0.315 n.d n.d 
GIH (Hindús en EU) 0.938 0.062 n.d n.d 
 
 30 
 
 
2. HIPÓTESIS 
 
 
Los polimorfismos de los genes involucrados en el transporte, metabolismo así 
como los que participan en el bombeo del metotrexato al exterior celular modifican 
la concentración total (sangre) y sistémica (plasma) del fármaco. 
 
 
 
3. OBJETIVOS 
 
3.1 General 
 
 
Determinar la asociación de variantes alélicas de SNPs, en los genes ABCB1 (rs 
1045642 y rs 2032582) y ABCG2 (rs 2231142), con la concentración de 
metotrexato en población pediátrica con diagnóstico de leucemia linfoblástica 
aguda. 
 
3.2 Particulares 
 
 Seleccionar la población pediátrica con diagnóstico de leucemia linfoblástica 
aguda en fase consolidación y mantenimiento de la quimioterapia. 
 Recolectar los productos biológicos (sangre) para la obtención de DNA y para 
niveles de fármaco (plasma). 
 Determinar las frecuencias alélicas y genotípicas de las variantes en los 
genes de transporte de metotrexato (ABCB1 y ABCG2). 
 Correlacionar las variantes alélicas en los genes de interés con los niveles de 
metotrexato en sangre y plasma. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 31 
 
 
 
 
 
4. JUSTIFICACIÓN 
 
 
 
 
 
 
La población mexicana es muy diversa genéticamente, se sabe que en promedio la 
población mestizo-mexicana tiene 55.2% de ancestría genética amerindia, 41.8% 
de ancestría europea y 3.5% de ancestría africana. Conocer la frecuencia génica 
de SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido) por sus siglas en inglés en genes 
del metabolismo de metrotexato permitirá en un futuro poder realizar un tamizaje 
de aquellos pacientes que tengan polimorfismos en los genes que codifican para 
transportadores, enzimas y proteínas que participan en la distribución y 
metabolismo de fármacos antineoplásicos, estos SNPs pueden modificar la 
expresión de estas proteínas o su actividad biológica, por lo tanto las 
concentraciones plasmáticas del fármaco se verá afectada y en consecuencia se 
afectará la citotoxicidad del metotrexato. A los pacientes que se les determine el 
alelo de riesgo se les proporcionaría un tratamiento alternativo y como 
consecuencia generar en ellos una mayor y mejor calidad de vida. Esta 
investigación busca un impacto directo en fortalecer el esquema de quimioterapia 
individualizada buscando el uso del medicamento correcto para cada paciente 
correcto. Otro de los beneficios es disminuir la estancia intrahospitalaria del 
paciente por complicaciones, disminuyendo los costos de hospitalización que se 
generan por la presencia de toxicidad grave. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 32 
 
5. DISEÑO EXPERIMENTAL 
 
5.1 Diseño del estudio 
 
Es un estudio prospectivo, observacional y longitudinal. 
 5.2 Población de Estudio 
 
 5.2.1 Población objetivo 
 
Pacientes del servicio de Hemato-Oncología del Instituto Nacional de Pediatría, los 
cuales hayan sido diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda. 
5.3 Criterios de Selección 
 5.3.1 Criterios de inclusión 
 
 
Se incluirán pacientes del INP cursando Leucemia Linfoblástica Aguda en el rango 
de edad de 1 a 17 años, con tipo de riesgo definido por factores clínicos, 
morfológicos y moleculares. La quimioterapia debe incluir al MTX en la fase de 
consolidación. Para todos los pacientes se requerirá una Carta de Consentimiento 
Informado por parte de los padres y/o tutores, en el caso de pacientes mayores a 
10 años deberán firmar Carta de Asentimiento. 
 5.3.2 Criterios de exclusión 
 
 
Pacientes con falla renal, falla hepática, transfusión sanguínea previa al estudio, 
desnutrición de grado III y/o cualquier afección que pueda afectar la determinación 
de los niveles del fármaco.5.3.3 Criterios de eliminación 
 
Pacientes a quienes se les retire MTX de la quimioterapia, no acudan regularmente 
a su tratamiento (No apego al tratamiento: determinado por un porcentaje menor 
al 50% de administraciones efectivas), retiren voluntariamente su consentimiento 
y/o asentimiento para participar en el estudio y aquellos pacientes en los que no 
se obtenga la cantidad de muestras suficientes para el análisis de SNPs y/o de 
concentraciones del fármaco. 
 
 33 
 
 
 
 
 
6. METODOLOGÍA 
 
 
 
6.1 Estrategia experimental 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 34 
 
6.2 Toma de muestra 
 
 
Se tomaron muestras de sangre (3 mL) a los pacientes, antes de la administración 
de MTX (pre-dosis) para el análisis de su material genético, esto en base a los 
Protocolos Técnicos Cáncer en Niños. A partir de 1 mL de sangre se extrajo el DNA 
mediante el DNA Isolation Kit de QIAGEN, este DNA fue preservado hasta su 
estudio. 
 
6.3 Separación de los leucocitos 
 
Para separar la fracción de los leucocitos se requirió centrifugar la sangre a 3,500 
rpm por 20 min a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se 
observaron 3 diferentes fracciones: la capa clara superior (plasma); la capa 
intermedia (leucocitos) y la capa del fondo que contiene eritrocitos concentrados. 
De esta fracción (la capa intermedia), es posible obtener DNA en una cantidad 5 a 
10 veces mayor a la obtenida por una cantidad equivalente de sangre total. 
6.4 Extracción de DNA a partir de sangre periférica para banco de DNA 
 
 
Para la purificación de DNA se empleó el método descrito en el QIAamp DNA blood 
mini kit (QIAGEN™) el cual permite la purificación del contenido total del DNA 
genómico, mitocondrial y viral a partir de muestras de sangre total, plasma, suero, 
capa de leucocitos, linfocitos u otros fluidos biológicos. 
 
a) Al concentrado de leucocitos se añadieron 20 μL de proteasa (proteinasa K) 
en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y luego se añadieron 
200 μL de buffer AL (QIAGEN™). 
b) Se homogenizó durante 15 segundos aproximadamente en vórtex, para 
lograr una lisis eficiente es necesario asegurarse que el buffer AL sea 
mezclado perfectamente para obtener una solución homogénea. 
c) La muestra (leucocitos con buffer AL y proteinasa K) se incubó a 56 °C por 
10 min. 
d) Se adicionó 200 μL de etanol (96-100%) a la muestra. 
e) Se homogenizó de nuevo por pulso de 15 segundos en vórtex. 
f) Se aplicó cuidadosamente la muestra a la columna de QIAamp Mini spin (en 
un tubo de colección de 2 mL) sin mojar el borde. 
g) Se cerró la tapa y se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. Se descartó el 
filtrado. 
h) Se adicionó 500 μL de buffer AW1 (QIAGEN™), sin mojar el borde a la 
columna QIAamp Mini spin y se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. Se 
descartó el filtrado. 
 
 
 35 
 
i) Se adicionó 500 μL de buffer AW2 (QIAGEN™) sin mojar el borde y se 
centrifugó a 14,000 rpm durante 3 min., se descartó el filtrado. 
j) Se centrifugó a 14,000 rpm durante 1 min. para remover restos del buffer 
AW2 evitando así la contaminación de la muestra. 
k) Posteriormente se colocó la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL 
y se descartó el tubo de colección conteniendo el filtrado. 
l) Se adicionó 200 μL de buffer AE y se incubó a temperatura ambiente (15 – 
25 °C) durante 1 min, y después se centrifugó a 8,000 rpm durante 1 min. 
m) Para almacenar el DNA a largo plazo se recomienda eluir con buffer AE 
(QIAGEN™) y almacenar a -20°C. Una muestra de 200 μL de sangre total 
humana (aprox. 5 x 106 leucocitos/mL) típicamente rinde 6 μg de DNA en 
200 μL de agua (30 ng/ μL) con una proporción de A260/A280 entre 1.7 y 
1.9. El DNA será cuantificado para obtener una solución conteniendo 20 ng/ 
μL, la cual será empleada para los ensayos de genotipificación. 
 
6.5 Cuantificación del DNA 
 
Se cuantificó la concentración de DNA y se evaluó su pureza por espectrofotometría 
en el equipo EPOCH™ de Bio Tek y leyéndose los datos a través del Software 
para Análisis de Datos Gen5™. 
 
Debido a que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta (UV) por tener en su 
estructura bases aromáticas nitrogenadas a lo largo de la cadena de DNA, por lo 
cual cada base tiene su propio espectro, tienen un máximo de absorción a una 
longitud de onda de 260 nm. La presencia de proteínas en las preparaciones de 
DNA ocurre. El máximo de absorbancia de las proteínas es de 280 nm y se puede 
estimar el grado de impurezas aportadas por las proteínas a partir del cociente 
A260/280. 
 
El DNA de doble hebra en solución de alta pureza presenta una relación A260/280 
mayor o igual a 1.8 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
 
6.6 Genotipificación por sondas TaqMan® 
 
El análisis de los genotipos se llevó a cabo por medio del ensayo de discriminación 
alélica utilizando sondas TaqMan®, los dbSNP, la secuencia, las debidas 
sustituciones y cambios se muestran en la Tabla 7. 
 
Tabla 7. Sondas que se emplearon en la genotipificación para cada gen. 
 
Este ensayo se basa en la amplificación por PCR de un segmento del gen que 
contiene el polimorfismo de interés mediante oligonucleótidos y posterior 
discriminación alélica mediante sondas que poseen unido covalentemente un 
compuesto fluorescente (colorante reportero) y se emplean dos sondas: una que 
contenga uno de los dos tipos de colorantes, VIC, con un rango de emisión de 552 
nm, en el extremo 5’ para el alelo 1 y complementariedad y la otra sonda posee 
FAM, con una emisión máxima a 518 nm para el alelo 2 y su complementariedad. 
Ambas sondas contienen una molécula que es capaz de unirse al surco menor del 
DNA (Minor Groove Binder, MGB) y que aumenta la especificidad de unirse 
exclusivamente a su alelo, así como una molécula que inhibe la emisión de 
fluorescencia mientras la sonda permanece intacta (Non fluorescent quencher, 
NFQ), localizada en el extremo 3’ (Figura 9). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Sondas TaqMan. Representación del mecanismo de acción de la 
liberación de la fluorescencia. 
Gen dbSNP Secuencia 
Sondas 
Taqman 
Sustitución Cambio 
ABCB1 
rs104564
2 
TGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC(A/G
)ATCTCTTCCTGTGACACCACCCGGC 
C_7586657_20 C3435T Ile 1145 Ile 
rs 
2032582 
TATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG(C/A)
ACCTTCTAGTTCTTTCTTATCTTTC 
C11711720C30
C11711720D40 
G2677A 
Ala 893 
Ser/Tre 
ABCG2 
rs 
2231142 
GCAAGCCGAAGAGCTGCTGAGAACT(G/
T)TAAGTTTTCTCTCACCGTCAGAGTG 
C_1585416370 C421A Gln 141 Lis 
 
 37 
 
Durante la reacción de PCR los oligonucleótidos hibridan con una secuencia 
específica del templado de DNA. Si éste contiene la secuencia polimórfica, la sonda 
TaqMan también híbrida con su secuencia homóloga. Durante la PCR, la AmpliTaq 
Gold, que tiene actividad tanto de DNA polimerasa como de exonucleasa 5’-3’, es 
capaz de digerir la sonda marcada durante la amplificación y liberar el colorante 
fluorescente de la acción del inhibidor de la fluorescencia de tal manera que dadas 
las condiciones de astringencia utilizada durante la reacción, sólo la sonda 
específica para el polimorfismo presente será capaz de hibridar; por lo tanto, es 
posible diferenciar un alelo del otro con base en el tipo de fluorescencia emitida. 
 
Se cuantificó la fluorescencia de cada muestra en un equipo Step One, utilizando 
el software SDS 2.2.1 para discriminación alélica (Applied Biosystems Foster City, 
CA, USA). 
Los reactivos utilizados se muestran en la Tabla 7. La amplificación se realizó 
empleando las condiciones de la PCR, para el equipo Step One (Figura 10). 
 
Tabla 8. Mezcla de reacción para el ensayo de discriminación alélica. Volúmenes 
necesarios para la placa de 48 pozos. 
 
Reactivos 
Volumen 
necesario para 
1 reacción 
(μL) 
Volumen 
necesario 
para 48 
reacciones 
(μL) 
Master Mix 
(2x) 
5.0 264 
DNA 1 52.8 
Sonda 0.50 26.4 
Agua 3.5 184.80 
Total 10 528Figura 10. Condiciones de la amplificación. Tiempo de la rampa de 
temperaturas. 
 
 
 38 
 
6.7 Cuantificación del Metotrexato mediante UPLC acoplado a masas. 
 
La cuantificación de MTX total en sangre periférica y plasma se realizó mediante 
HPLC en fase reversa empleando la metodología validada por Barrera.55 Las 
muestras de sangre obtenidas de los pacientes que se encontraban recibiendo 
quimioterapia con MTX en fase de consolidación serán separadas en 2 alícuotas. La 
primera alícuota sé preservó en EDTA para evitar su coagulación (muestra de 
sangre total), la segunda alícuota será centrifugada a 3,000 rpm por 10 minutos 
para la obtención de plasma. 
 
Extracción. 
 
A un volumen de 180 μL de muestra (sangre o plasma) se adicionaron 20 μL de 
estándar de MTX en solución, en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se agitó en Vórtex 
por 1 min, posteriormente se agregó 50 μL de SDS para lisar los eritrocitos, se 
agitó por 1 min y se agregaron 250 μL de acetona como agente desnaturalizante, 
nuevamente se agitó por 5 min y posteriormente se centrifugó a 10,000 rpm por 
10 min; el sobrenadante se recolectó. Al sobrenadante se adicionó 400 μL de 
butanol y 500 μL de éter dietílico para llevar a cabo una segunda extracción. Se 
homogeneizó la mezcla por 5 min y se descartó el sobrenadante; se recuperó la 
fase acuosa (inferior) y se agregó solución salina hasta un volumen de 100 μL, se 
tomó la muestra resuspendida y se pasó al inserto del equipo UPLC agregando 10 
μL más de solución salina, para un volumen final de 110 μL. Para el plasma se 
tomaron los mismos volúmenes de muestra y estándar que en sangre, pero se 
omitirá la adición de SDS. 
 
Separación y detección. 
 
El sistema cromatográfico usado consiste en una bomba Waters modelo 515, un 
autoinyector Waters modelo 717 y un detector Water UV/Vis modelo 486. La 
separación se llevó a cabo a temperatura ambiente en una columna Gemini C18 
(Phenomenex) de 150 x 4.6 mm, 5 μm, con fase móvil de solución amortiguadora 
de fosfato dibásico de sodio monohidratado con una concentración de 0.05 M a un 
pH 4.85 y tetrahidrofurano (95:5 v/v) a una velocidad de flujo de 1.00 mL/min. El 
compuesto se detectó a 313 nm. 
 
Cuantificación. 
 
Para determinar la cantidad de MTX en las muestras analizadas se empleó una 
curva de calibración con concentraciones de 25, 50, 100, 250, 500, 750 y 1000 
ng/mL del fármaco. Para determinar parámetros como repetibilidad y 
reproducibilidad del ensayo se emplearon concentraciones control de 50, 250 y 750 
ng/mL. Se cuantificó el fármaco en las muestras por la relación de área bajo la 
curva del pico de MTX con respecto a la curva de calibración. La curva de calibración 
de seis puntos tuvo un coeficiente de correlación (r) igual o mayor a 0.99. 
 
 39 
 
7. RESULTADOS 
7.1 Características de la población de estudio 
 
Se analizaron 92 pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda, el 
promedio de edad fue de 8 años en el sexo masculino y 7 años en el sexo femenino, 
35 pacientes del género femenino (38 %) y 57 pacientes del género masculino 
(62 %), 72 pacientes (78 %) fueron de riesgo alto, 18 pacientes presentan riesgo 
habitual (20 %) y 2 pacientes de riesgo bajo (2 %), esto se resume en la Tabla 9. 
 
 
Tabla 9. Datos de la población de estudio. 
 
Variables n % 
Sexo 
Mujeres 
Hombres 
 
35 
57 
 
38 
62 
 
Edad promedio(años) 
Mínima 
Máxima 
 
 
8 
1 
16 
 
- 
- 
- 
Tipo de riesgo 
Alto: 72 
Habitual: 18 
Bajo: 2 
78 
20 
2 
 
 
7.2 Frecuencias de las variantes alélicas en el gen ABCB1 
 
Se analizaron 3 polimorfismos de un solo nucleótido en el gen ABCB1 (rs 1045642, 
rs 2032582A y rs 2032582T) en 92 muestras de DNA genómico provenientes de 
pacientes con el diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda, del servicio de 
oncología del Instituto Nacional de Pediatría. 
El análisis de los SNP se realizó por discriminación alélica en placas de 48 pozos se 
incluyeron un control negativo y un positivo (muestra con el genotipo conocido). 
 Para la variante rs 1045642 se encontró un 27.1 % para el genotipo GG, un 53.1 
% para el genotipo heterocigoto GA, y el genotipo homocigoto AA con un 19.8 %. 
El alelo G se encontró en un 53.6 %, y en un 46.4 % para el alelo A, como se 
muestra en la Tabla 10. Esta población se encuentra en Equilibrio Hardy-Weinberg. 
 
 
 
 40 
 
Tabla 10. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 1045642. 
 
La distribución de genotipos encontrados en el SNP rs 1045642 del gen ABCB1, se 
muestran en la Figura 11, los puntos rojos que corresponden a genotipos de 
homocigotos silvestres, los puntos verdes corresponden a genotipos heterocigotos, 
los puntos azules a los homocigotos mutados, mientras que las cruces negras 
corresponden a muestras que no amplificaron y los cuadros negros controles 
negativos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Curva de discriminación alélica del SNP rs 1045642. Se observan los 
genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y 
heterocigotos ( ), asimismo se muestran los controles negativos ( ) y las muestras 
que no amplificaron ( ). 
 Genotipo Alelo 
Gen/polimorfismo n GG GA AA n G A 
ABCB1/rs1045642 
96 
26 51 19 
192 
103 89 
(%) 27.1 53.1 19.8 53.60 46.4 
 
 41 
 
Respecto a la variante rs 2032582A se encontró un 44.6 % para el genotipo CC, 
un 41.3 % para el genotipo heterocigoto CA, y el genotipo homocigoto AA con un 
14.1 %. El alelo C se encontró en un 65.2 %, y en un 34.8 % para el alelo A, como 
se muestra en la Tabla 11. Esta población se encuentra en Equilibrio Hardy-
Weinberg. 
 Tabla 11. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582A. 
 
En la Figura 12 se muestra la distribución de genotipos realizada mediante 
discriminación alélica. Se encontró un mayor número de muestras que no 
amplificaron, las cuales posteriormente se volvieron a analizar y se determinó su 
genotipo, las muestras que no amplificaron en tres equipos distintos de PCR, fueron 
excluidas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 12. Curva de discriminación alélica del rs 2032582A. Se observan los 
genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y 
heterocigotos ( ), asimismo se muestran los controles negativos ( ) y las muestras 
que no amplificaron ( ). 
 Genotipo Alelo 
Gen/polimorfismo n CC CA AA n C A 
ABCB1/rs 2031582 A 
92 
41 38 13 
184 
120 64 
(%) 44.6 41.3 14.1 65.2 34.8 
 
 42 
 
Respecto a la variante rs 2032582T se encontró un 87.2 % para el genotipo CC, un 
5.3 % para el genotipo heterocigoto CT, y el genotipo homocigoto TT con un 7.4 
%. El alelo C se encontró en un 89.9 %, y en un 10.1 % para el alelo T, como se 
muestra en la Tabla 12. Esta población no se encuentra en Equilibrio Hardy-
Weinberg. 
Tabla 12. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2032582T. 
 
En la Figura 13, se muestra la distribución de genotipos realizada mediante 
discriminación alélica, de algunas de las muestras analizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13.Curva de discriminación alélica del rs 2032582T. Se observan los 
genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y 
heterocigotos ( ) y se muestran los controles negativos ( ). 
 Genotipo Alelo 
Gen/polimorfismo n CC CT TT n C T 
ABCB1/rs 2031582 T 
94 
82 5 7 
188 
169 19 
(%) 87.2 5.3 7.4 89.9 10.1 
 
 43 
 
En el caso del gen ABCG2 para la variante rs 2231142 se encontró un 46.8 % para 
el genotipo GG, un 45.7 % para el genotipo heterocigoto GT, y el genotipo 
homocigoto TT con un 8.5 %. El alelo C se encontró en un 69.7 % y en un 31.4 % 
el alelo T, como se muestra en la Tabla 13. Esta población se encuentra en Equilibrio 
Hardy-Weinberg. 
Tabla 13. Frecuencia alélica y genotípica para la variante rs 2231142. 
 
En la Figura 14,se muestra la distribución de genotipos realizada mediante 
discriminación alélica del rs 2231142 del gen ABCG2 de algunas muestras 
analizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 14 Curva de discriminación alélica del rs 2231142. Se observan los 
genotipos de los homocigotos silvestres ( ), homocigotos mutados ( ) y 
heterocigotos ( ), se muestran los controles negativos ( ) y las muestras que no 
amplificaron ( ). 
 Genotipo Alelo 
Gen/polimorfismo n GG GT TT n G T 
ABCG2/rs 
2231142 95 
44 43 8 
190 
131 59 
(%) 46.3 45.3 8.4 68.9 31.1 
 
 44 
 
7.3 Niveles de Metotrexato en sangre. 
 
 
La cuantificación del MTX se realizó en 45 pacientes, de los cuales en sólo 28 
pacientes se obtuvieron muestras completas de los tres tiempos (2 h, 24 h y 36 
h). Los cuales se monitorearon por medio de UPLC acoplado a espectrometría de 
masas en tándem. Los resultados de este monitoreo se muestran en la Figura 15 
de un paciente con las tres muestras en un lapso de 5 min y en Tabla 16 los datos 
de todos los pacientes. 
 
Esta cuantificación se realizó en dosis de 2 y 5 g/m2, pero no se obtuvieron 
muestras completas en pacientes con dosis de 5 g, por lo que el estudio se realizó 
con pacientes cuya dosis administrada era de 2 g/m2, en sangre y plasma. 
 
 
Figura 15. Monitoreo de la concentración de MTX del paciente LAL 45. 
 
 
 
 
 
 
 
 45 
 
 
 
 
Figura 16. Concentraciones de MTX a las 2, 24 y 36 h al inicio de la infusión de 
MTX en sangre de 28 pacientes. 
 
 
No. 
paciente 
Concentración 
a las 2 h 
(μmol/L) 
No. 
Paciente 
Concentración 
a las 24 h 
(μmol/L) 
No. 
Paciente 
Concentración 
a las 36 h 
(μmol/L) 
LAL-1 53.35 LAL-1 7 LAL-1 0.66 
LAL-2 29.07 LAL-2 12.22 LAL-2 0.37 
LAL-6 41.82 LAL-6 14.58 LAL-6 0.69 
LAL-8 38.17 LAL-8 9.39 LAL-8 1.00 
LAL-10 22.93 LAL-10 18.48 LAL-10 0.41 
LAL-11 33.73 LAL-11 2.92 LAL-11 1.27 
LAL-12 7.75 LAL-12 4.88 LAL-12 3.38 
LAL-14 6.91 LAL-14 0.43 LAL-14 0.22 
LAL-15 20.15 LAL-15 13.67 LAL-15 0.66 
LAL-16 41.02 LAL-16 0.27 LAL-16 0.15 
LAL-21 35.22 LAL-21 37.36 LAL-21 0.72 
LAL-23 44.43 LAL-23 22.75 LAL-23 2.03 
LAL-24 49.13 LAL-24 25.40 LAL-24 1.28 
LAL-25 37.70 LAL-25 0.90 LAL-25 0.67 
LAL-26 77.83 LAL-26 24.14 LAL-26 1.60 
LAL-27 41.22 LAL-27 0.90 LAL-27 0.28 
LAL-28 68.24 LAL-28 2.44 LAL-28 1.57 
LAL-30 23.29 LAL-30 16.16 LAL-30 0.51 
LAL-31 90.21 LAL-31 27.57 LAL-31 0.28 
LAL-37 42.96 LAL-37 0.96 LAL-37 0.69 
LAL-38 60.08 LAL-38 44.24 LAL-38 0.52 
LAL-39 4.56 LAL-39 4.02 LAL-39 2.87 
LAL-42 49.11 LAL-42 4.02 LAL-42 0.78 
LAL-45 54.79 LAL-45 51.08 LAL-45 21.28 
 
 
 
 
La mediana de la concentración de MTX en sangre a las 2 h fue de 41.1 µmol/L 
(Q25 24.7-Q75 52.2), a las 24 h fue de 16.7 µmol/L (Q25 2.6- Q75 23.4) y a las 36 h 
la mediana encontrada fue de 0.7 µmol/L (Q25 0.5-Q75 1.5). Claramente se observa 
una reducción del MTX en sangre en todos los pacientes. 
 
 
 46 
 
 
 
 
 
 
Tabla 14. Datos de las medianas y percentiles 25 y 75 de sangre y plasma, en 
los distintos tiempos de la obtención de la muestra (2, 24 y 36 h). 
 
 
Tiempo (h) Sangre 
(µmol/L) 
(Q25-Q75) Plasma 
(µmol/L) 
(Q25-Q75) 
 
2 
 
41.1 
 
24.7-52.2 
 
54.4 
 
37.2-66.6 
 
24 
 
13.6 
 
2.6-23.4 
 
16.7 
 
2.1-31.57 
 
36 
 
0.7 
 
0.5-1.5 
 
1.04 
 
0.56-2.05 
 
 
7.3.1 Asociación de la variante alélica (rs 1045642) en el gen ABCB1 con 
los niveles de metotrexato en sangre. 
 
 
 
Se han reportado estudios donde se asocian los niveles altos de fármacos 
antineoplásicos con un genotipo de riesgo, para población mexicana hay muy pocos 
trabajos encaminados a estudiar esta asociación y los pocos que ya se han 
reportado no han determinado una clara asociación; esto quizá pueda deberse al 
tamaño de muestra, a las variables estudiadas o a la estratificación. En este trabajo 
estudiamos una posible asociación entre variantes en genes que codifican para 
proteínas de transporte de MTX y sus niveles en 37 pacientes con diagnóstico de 
leucemia linfoblástica aguda. 
 
 
Se estudió el polimorfismo rs 1045642 del gen ABCB1 tomándose muestras a 
diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. A las 2 h (Figura 17 A) los pacientes 
que presentaron el genotipo de riesgo (AA) tuvieron niveles bajos de MTX (36.6924 
µmol/L), a las 24 h en el genotipo de riesgo se disminuyó la concentración de MTX 
(15.3332 µmol /L) y en el caso de las 36 h fue menor todos los genotipos, siendo 
el silvestre el que presenta una menor cantidad de fármaco de 0.6029 µmol /L 
(Figura 17 C). 
 
 
 47 
 
 
 
 
Figura 17. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 1045642), 
del gen ABCB1 en sangre. A. MTX 2 h, B a las 24 h y C a las 36 h; dónde se 
muestran los genotipos de riesgo (AA), el heterocigoto (AG) y el silvestre (GG). Y 
se muestra la comparación de niveles de MTX de acuerdo al genotipo de la variante 
rs 1045642 en ABCB1, en pacientes pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba 
de Kruskal Wallis no se observaron diferencias estadísticamente significativas (p = 
0.64). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 48 
 
7.3.2 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 A) en el gen ABCB1 
con los niveles de metotrexato en sangre. 
 
Se estudió el polimorfismo rs 2032582A del gen ABCB1, se tomaron muestras en 
diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Los resultados que se obtuvieron en 
sangre a las 2 h (Figura 18 A) fueron los siguientes: los pacientes que presentaron 
el genotipo de riesgo (AA) tuvieron niveles bajos de MTX (38.1657 µmol/L). A las 
24 h el genotipo de riesgo presentó una mayor concentración del MTX (25.4005 
µmol /L) con respecto a los otros genotipos y en el caso de las 36 h se observó una 
concentración mínima de MTX en todos los genotipos AA, AC y CC, siendo el 
genotipo de riesgo el que presenta una mayor cantidad de fármaco (C) teniendo 
un valor de la mediana de 1.1410 µmol /L. 
 
Figura 18. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582A), 
del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. Este gráfico muestra la comparación de 
niveles de MTX de acuerdo al genotipo de la variante rs 2032582A en ABCB1, en 
pacientes pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba de Kruskal Wallis no se 
observaron diferencias estadísticamente significativas (p =0.60). 
 
 49 
 
7.3.3 Asociación de la variante alélica (rs 2032582 T) del gen ABCB1 con 
los niveles de metotrexato en sangre. 
 
Se estudió el polimorfismo rs 2032582 del gen ABCB1, tomándose muestras en 
diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Para el genotipo de riesgo no hubo 
ningún paciente, por lo cual no existe comparación significativa entre los genotipos 
a las 2 h en sangre; el paciente que presentó el genotipo silvestre (CC), tuvo una 
mayor concentración del fármaco siendo el valor de su mediana de 41.2222 µmol/L 
y a las 24 h (Figura 19 B) con un valor de 14.5806 µmol/L y en el caso de las 36 
h (C) el genotipo silvestre es el que presenta una menor concentración siendo el 
valor de la mediana de 0.6767 µmol/L. 
 
 
 
Figura 19. Asociación de la concentración del MTX con el genotipo (rs 2032582 T), 
del gen ABCB1, en niveles sanguíneos. Se muestra la comparación de niveles de 
MTX de acuerdo al genotipo de la variante rs 2032582 en ABCB1, en pacientes 
pediátricos con LAL. De acuerdo a la prueba de U de Mann-Whitney no se 
observaron diferencias estadísticamente significativas (p =1.00). 
 
 50 
 
7.3.4 Asociación de la variante alélica (rs 2231142) del gen ABCG2 con 
los niveles de metotrexato en sangre. 
 
 
Se estudió el polimorfismo rs 2231142 del gen ABCB1, se tomaron muestras en 
diferentes tiempos: 2, 24, 36 h en sangre. Los resultados que se obtuvieron en 
sangre a las 2 h (Figura 20 A) fueron los siguientes: el genotipo de riesgo presentó 
una menor concentración siendo de 10 µmol/L siendo la